JP7062861B2 - 規則に基づいたゲノムデザイン方法 - Google Patents
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Description
本願は、2016年6月15日に出願された米国仮特許出願第62/350,468号に対する優先権を主張するものであり、あらゆる目的のために、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、米国エネルギー省助成番号DE-FG02-02ER63445及び米国国防総省除税番号HR0011-13-1-0002の国庫助成により行われた。米国政府は本発明に関して一定の権利を有する。
本明細書に記載の態様は、概して、遺伝子操作、及び遺伝子改変された細胞及び/又は生物に関する。特に、本開示の1又は複数の態様は、規則、条件、パラメータ、又は特徴の所定のセットに基づくゲノムデザインに有用な方法及びコンピュータソフトウェアに関する。
57コドンゲノムのデザイン、合成、及び試験
ある態様によれば、本明細書には、根本的に再コード化された大腸菌をデザイン及び構築するための方法が記載される。遺伝子コドン別の目的で使う再コード化は、自然界では通常は見られない機能でゲノムを強化するための強力なアプローチである。基準遺伝コードの縮重により、同じアミノ酸が複数の同義コドンによってコードされることが可能になる。天然生物の間で64コドンのコードがほぼ普遍的であること(Crick、1963)は、コドン置換を合成生物の遺伝的単離のための強力な手段としている。例えば、大部分の生物は細胞タンパク質の翻訳のための共通の64コドンの鋳型に従うが、いくつかの原核生物ゲノム及び真核生物のゲノムに見られるこの普遍的なコードからの逸脱(Ambrogelly et al.、2007、Kano et al.、1991、Oba et al.、1991、Macino et al.、1979、Ling et al.、2015)により、拡大した遺伝コードを有する合成生物の探究が促進された。
DNAは、産業連携先であるGen9、SGI-DNA、Twist Biosciences、Genewiz、及びIDT DNAテクノロジーによって合成された。合成パイプラインは、合成誤り率及びQCの制約を考慮して、合成コスト及び所要時間を低減させることを主目的として開発された。Gen9がDNAの大部分を合成し、サイズが1.2~4.2kbの断片として3,960kbが提供された。追加の合成は、Twist Biosciences(1.4~2.0kbの範囲の断片として30kb)、IDT(1.0~1.7kbの範囲の断片として27kb)、及びGenewiz(12.4~3.0kbの範囲中の断片として26kb)によって提供された。追加の328kb(SGI-DNA)、36kb(Twist)、及び6kb(Gen9)が合成されたが、最終ゲノムセグメント合成においては使用されなかった。
全ての合成DNAを構築前にPCR増幅及び精製した。30μLのPCR反応物を以下のように調製した:1μLの希釈鋳型DNA(1~5ng/μLの範囲の1μL 合成鋳型DNA(synDNA)、9μLのTE緩衝液中に希釈)、2μLのプライマーミックス(10μMの各プライマー、50μLのTE緩衝液中に混合)、15μLの2xSeqAmp DNAポリメラーゼ(Clontech Laboratories, Inc.)、及び15μLのPCRグレードの水。PCRサイクルは、95℃:1分、98℃:10秒、60℃:15秒、68℃:2分、35サイクルであった。1%アガロースゲルを用いて1μLのPCR産物を分析した。2xKAPA-HiFi DNAポリメラーゼ(Kapa Biosystems)を用いて失敗したPCRの最適化を行った。30μLのPCR反応物を以下のように調製した:1μLの希釈鋳型DNA(同上)、2μLのプライマーミックス(同上)、15μLの2xKAPA-HiFi、及び12μLのPCRグレードの水。PCRサイクルは、95℃:1分、98℃:20秒、60℃:15秒、72℃:2分、30~35サイクルであった。PCR産物を2%E-gel Ex(Thermo Fisher Scientific Inc.)を用いてゲル精製した。
セグメント構築には、GeneArt High-Order Genetic Assembly System(Life Technologies)を改変して用いた。線状化のために使用する制限部位EcoRI及びBamHIを含むようにベクターpYES1Lを改変し、出芽酵母ウラシル選択マーカーをベクター骨格に付加した(「pYES1L-URA」と称する)。37℃で5時間、その後65℃で20分の酵素失活、20℃で30分のEnd Repair Module(NEB)処理により、両方の酵素を用いてベクター消化を行った。線状ベクターを精製し(Zymo DNA Clean&Concentrator)、使用前にDNAゲル上でサイズを確認した。各構築反応(10~15断片が各構築に使用される)について、増幅した合成断片(各400ng)を混合して精製し、次いで100ngの精製された線状ベクターpYES1L-URAを加えた。SAVANT DNA 120 SpeedVac濃縮器(Thermo Fisher Scientific Inc.)を使用してベクター/断片DNA混合物を約10μLの体積に濃縮した。
エレクトロコンピテント大腸菌TOP10(Thermo Fisher Scientific)を、BW38028(Conway et al.、2014)において実施されたセグメント19、22、23、43、44、47を除くすべてのセグメントについての全プロセスに使用した。トラブルシューティングにEcM2.1無処理菌株を使用した(EcM2.1は、MAGEに対して最適化された菌株である。大腸菌MG1655 mutS_mut dnaG_Q576A exoX_mut xonA_mut xseA_mut1255700::tolQRA Δ(ybhB-bioAB)::[λcI857 N(cro-ea59)::tetR-bla])(Gregg et al.、2014)。
pYES1L-URAプラスミドで形質転換されたTOP10細胞及びBW38028細胞(Conway et al.、2014)は、全てのパイプライン菌株遺伝子操作の対象であった。ベクターpYES1L-URA上の再コード化セグメントの平均コピー数は1.8プラスミド/ゲノムであることがわかった。
PCRオリゴヌクレオチド及びプライマーの完全な表を表3及び表4に見出すことができる。組換え又はSanger配列決定に使用するPCR産物を、製造業者の標準的プロトコルに従ってKapa 2G Fastポリメラーゼを用いて増幅した。既報の方法(Isaacs et al.、2011)に従って、KAPA2G Fast MultiplexPCRキットを用いた多重遺伝子型判定に多重対立遺伝子特異的PCR(mascPCR)を使用した。mascPCR用のプライマーは、この目的のために特別に構築された自動化ソフトウェアを使用して設計された。サンガー配列決定反応は、第三者(Genewiz)を通じて実施した。pKD78形質転換工程、カナマイシン欠失工程、attP-ゼオシン挿入工程、及びλ組込み工程の後にmascPCRスクリーニングを実施した。
λインテグラーゼを、再コード化セグメントプラスミドの大腸菌ゲノムへの組込みに使用した(Haldimann et al.、2001)。attP部位を、ゼオシン耐性マーカーと共に、lambda red組換えによってセグメントベクターに付加した。次いで、λインテグラーゼを42℃で6時間熱誘導し、細胞をスクリーニングのためのスペクチノマイシンプレート及びカナマイシンプレート上にプレーティングした。attP特異的プライマー及びattB特異的プライマー(attB-seq-f:CAG GGA TGC AAA ATA GTG TTG AG;attB-seqr:GA GAA GTC CGC GTG AGG;attP-f:GCGCTAATGCTCTGTTACAG;attP-r:GAAATCAAATAATGATTTTATTTT GACTGA)、並びに対立遺伝子特異的プライマー(表4)を用いてPCRスクリーニングを行い、正しいプラスミド組込みを有するクローンを同定した。
組み込み後にさらに検証ステップを実行して、細胞中に再コード化セグメントの他のコピーが残っていないことを確認した。染色体への組込みの前には、全ての再コード化セグメントプラスミドがλ組込みのためのattP部位を含んでいる。λ組込みによりattB部位へのゲノム組込み時にattP配列が改変されるので、組込まれていないプラスミドのみがインタクトなattP配列を保有する。SpCas9タンパク質が全てのエピソーム性(非組込み)セグメントプラスミドにおいて二本鎖切断を誘導するようなattP特異的Cas9標的化(図10C)(Esvelt et al.、2013)を用いて、プラスミドの残存コピーを除去した。次に、線状化された残りのプラスミドを消化し、得られた菌株はプラスミドを含まない。
菌株倍加時間は既報の通りに計算した(Lajoie et al.、2013b)。簡潔には、培養物を平底96ウェルプレート中で増殖させた(150μL LBL、34℃、300r.p.m.)。増殖キネティクス(OD600)を、365cpmで軌道振盪しながら、34℃で一晩、5分間隔で、Biotek Eonマイクロプレートリーダーでモニタリングした。倍加時間は、t=Δt×In(2)/mによって計算した。ここで、各時点でΔt=5分であり、mは、5つの連続する時点(20分間隔)の移動ウィンドウの線形回帰によって計算したln(OD600)の最大勾配である。分析はMatlab(登録商標)スクリプトを用いて実施した。
遺伝子欠失により親株と比較して倍加時間が減少した場合、適応度を低下させる再コード化遺伝子を決定した。これは、再コード化遺伝子がうまく発現されなかったことを示唆する。lambda red組換えを用いて各染色体遺伝子を徐々に欠失させ、各欠失後の倍加時間を測定することにより、低下遺伝子の位置を特定した(図12A及び図12B)。位置が特定されると、適応度を低下させる再コード化遺伝子はトラブルシューティングパイプラインを用いて対処される。
再コード化生物が関与する最も効果的な生物学的封じ込め戦略(Mandell et al.、2015)は、非標準アミノ酸に対応するように再設計された3種の遺伝子であるチロシルtRNAシンテターゼ(tyrS)、アデニル酸キナーゼ(adk)、及びビフェニルアラニルtRNAシンテターゼ(bipARS)を用いる。再コード化株の生物学的封じ込め能力をアッセイするために、それらの再設計された遺伝子が再コード化戦略と適合性があることを確認することが重要である。
Illustra Bacteria GenomicPrep Spin Kit(General Electrics)を用いて、1mLの一晩培養した培養物から細菌ゲノムDNAを精製し、Nextera DNA Library Prep(Illumina)又はNebNext Library Prep(New England Biolabs)を用いてライブラリーを構築した。ライブラリーは、PE250 V2キット(Illumina)と共にMiSeq装置(Illumina)を用いて配列決定した。
2つの異なるパイプラインを使ってゲノムを分析した。一倍体ゲノム分析を支持するBreseq(Deatherage、2014)を、1つの種類のセグメントのみを有する菌株(すなわち、再コード化又は再コード化されていない野生型)についてのSNP及び短い挿入欠失のコールに用いた。Breseqはデフォルトのパラメータで使用した。
RNAを、再コード化セグメントのエピソーム性コピー及び染色体セグメントの欠失を有する菌株から調製した。RNAは、RNAprotect(QIAGEN)を用いて安定化され、miRNeasyキット(QIAGEN)で抽出された。rRNA含有量は、riboZero rRNA Removal Kit(Illumina)を用いて減少させた。Truseq Stranded mRNA Library Kit(Illumina)を用いてRNAseqライブラリーを構築した。PE150 V2キット(Illumina)と共にMiSeq装置(Illumina)を用いてライブラリーを配列決定した。
RNAseq実験から得られたFASTQファイルを、デフォルトパラメータを用いてBWA(Li et al.、2009a)を用いてマッピングし、SAMTOOL(Li et al.、2009b)を用いて処理(インデックス付け、並べ替え)して、各サンプルについてのbamファイルを生成した。データの分析にはカスタムRスクリプトを使用した。GenomicFeaturesライブラリー(Bioconductor)を用いて読み取りを遺伝子に関連づけ、BioconductorのDESeqライブラリー(Anders et al.、2010)を用いて差次的発現分析を行った。絶対log2変化倍率が2より大きく、且つ調整されたp値が0.01より小さい遺伝子を、差次的に発現される遺伝子として分類した。具体的には、部分的に再コード化された菌株及びTOP10対照をRNASeqにより個々に分析した。各遺伝子の発現を、(再コード化された又は再コード化されていない)各サンプルにおいてDESeq2(Anders et al.、2010)を用いて他のすべてのサンプルにおける同一遺伝子の発現(5つの独立したセグメント)と比較して、全サンプルにわたる遺伝子発現の代表的範囲を得た。例えば、セグメント44におけるfolC遺伝子の発現レベルは、再コード化セグメント44(再コード化コピーのみ)、TOP10(野生型コピーのみ)、及び他のすべての部分的に再コード化された菌株(セグメント44は再コード化されていない、例えば、folC遺伝子の野生型コピーのみ)において測定された。
コドン選択の規則-大腸菌におけるレアアルギニンコドンの編集
いくつかの態様によれば、本明細書には、ゲノムデザインについての規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴のための実験による検証及び更新の方法が記載される。具体的には、レアアルギニンコドンであるAGA及びAGG(AGR)はコドン選択のケーススタディを示し、AGRは他の同義の代替コドン(CGN)とは異なる重要な転写及び翻訳特性をコードする。AGRコドンの123個の出現箇の全てが全ての必須遺伝子から除去されている大腸菌株が作られた。110個のAGRコドンは同義のCGUに置き換えられたが、残りの13個のAGRは生存可能な代替案を特定するために多様化を必要とした。成功した置換コドンは、場合によってはアミノ酸同一性を犠牲にして、局所的リボソーム結合部位様モチーフ及び局所的mRNA二次構造を保存する傾向があった。これらの観察に基づいて、代替コドンが生存可能である可能性が高いと考えられる多次元の「安全な置換ゾーン」(SRZ)に対して測定基準を実験により定義した。必須AGRに対する同義及び非同義の代替物をさらに評価するために、野生型対立遺伝子の多様な集団を枯渇させるためにCRISPR/Cas9に基づく方法を実施した。この方法により、全64種のコドン代替物の適応度の影響の包括的評価が可能になった。この方法を使用して、SRZの関連性は、14種の異なる遺伝子におけるコドン適応度を経時的に追跡することによって確認された。SRZの外側にあるコドンは、増殖集団から急速に枯渇する可能性があることが見出された。
使用した菌株及び培養方法
この研究に使用された菌株はEcM2.1に由来した(Escherichia coli MG1655 mutS_mut dnaG_Q576AexoX_mut xonA_mut xseA_mut 1255700::tolQRA Δ(ybhB-bioAB)::[λcI857 N(cro-ea59)::tetR-bla])(Carr et al.、2012)。液体培地は、溶原培地のLennox製剤(LBL:1%w/vバクトトリプトン、0.5%w/v酵母抽出物、0.5%w/v塩化ナトリウム)(Lennox、1955)、及び適切な選択剤であるカルベニシリン(50μg/mL)及びSDS(0.005%w/v)からなるものであった。tolC対向選択のために、14.4μgタンパク質/μLであると測定された自己精製物(Schwartz et al.、1971)を1:100希釈したコリシンE1(colE1)を使用し(Isaacs et al.、2011、Lajoie et al.、2013b)、バンコマイシンを64μg/mLで用いた。固体培養培地は、必要に応じて同濃度の抗生物質を含有する1.5%w/vのBacto Agar(Fisher)を含むオートクレーブ処理したLBLからなるものであった。ColE1寒天プレートを既報の通りに作製した(Gregg et al.、2014)。倍加時間は、34℃で一晩、365cpmで軌道振盪しながらBiotek Eonマイクロプレートリーダーで決定し、matlab scriptを使用して分析した。
組換え又はSanger配列決定に使用するPCR産物を、製造業者の標準的プロトコルに従ってKapa 2G Fastポリメラーゼを用いて増幅した。既報の方法に従って、KAPA2G Fast MultiplexPCRキットを用いてAGR置換事象の多重遺伝子型判定のために、多重対立遺伝子特異的PCR(mascPCR)を用いた(Isaacs et al.、2011、Mosberg et al.、2012)。サンガー配列決定反応は第三者(Genewiz)を通じて実施した。CRAMプラスミドは、PCR(Yaung et al.、2014)及びIDTからGblockで得られたCRISPR/PAM配列を用いて線状化したプラスミド骨格から、50℃で60分間の等温構築により構築した(Gisbon et al.、2009)。
λレッド再結合、MAGE、及びCoS-MAGEを前述のように実施した(Gregg et al.、2014、Wang et al.、2009)。一本鎖組換えでは、MAGEオリゴヌクレオチドを1μMで使用したが、多重選択組換えでは共選択オリゴヌクレオチドは0.2μMであり、全オリゴヌクレオチドプールは5μMであった(7~14オリゴヌクレオチド)。二本鎖PCR産物を組み換える場合(例えば、tolC挿入)、100ngの二本鎖PCR産物を用いた。CoS-MAGEをtolC選択と一緒に使用して標的AGRコドンを置換したため、tolC選択性能をモニタリングするために、各組換えを水のみで組換えた対照と対にした。各オリゴヌクレオチドセットの標準的なCoS-MAGEプロトコルは、tolCを挿入し、tolCを不活性化し、tolCを再活性化し、tolCを削除することであった。MascPCRスクリーニングは、tolCの挿入工程、不活性化工程、及び欠失工程で行われた。全てのλRed組換えの後に、3mLのLBL中での回復、続いて既報(Gregg et al.、2014)のようにして行ったSDS選択(tolC挿入、tolC活性化)又はColE1対向選択(tolC不活性化、tolC欠失)を行った。
必須遺伝子のAGRコドンは、123個の固有のAGRコドン(82個のAGA、41個のAGG)を含む共有セット(107個のコーディング領域)を明らかにする目的で2つの補足的な情報源(Baba et al.、2006、Hashimoto et al.、2005)に従って必須遺伝子アノテーションを相互参照することによって、発見された。optMAGE(Ellis et al.、2001、Wang et al.、2009)を用いて、各AGRをCGUに変換する90-merオリゴヌクレオチド(複製フォークのラギング鎖を標的とする)を設計した。AGR置換オリゴヌクレオチドの総数は、可能であれば複数の編集をコード化するようにオリゴヌクレオチドを設計し、オリゴヌクレオチドの5′末端及び3′末端に少なくとも20bpの相同性を維持することにより、119個まで削減された。次いで、所与のセット内の全ての標的の複製方向に対して最大で564,622bp上流で単一のマーカー(tolC)が挿入され得るように、染色体位置に基づいてオリゴヌクレオチドを複雑さが異なる(最小:7、最大:14)12個のMAGEオリゴセットにプールした。tolC挿入部位は、12個のプールのそれぞれについて、遺伝子間領域又は所与のプールについての距離基準を満たす非必須遺伝子のいずれかに同定された。12個のオリゴヌクレオチドプールそれぞれの記述については表5を参照。
抵抗性AGRは、変換プロセスの第3工程の後に選別された少なくとも96個のクローンのうちの1個でCGUに変換されなかったものとして定義された。次いで、抵抗性AGRコドンを、親株(EcM2.1)においてトラブルシューティングのためにトリアージした(図12A)。第一に、コドンの配列構成を、アノテーションの誤り又は重複遺伝子のための破壊されたRBSのようなデザインエラー又は潜在的な問題について調べた。ほとんどの場合、修正されたオリゴヌクレオチドは容易に設計及び試験可能であった。そのような明白な再設計が不可能であった場合は、AGRをCGN突然変異で置き換えることを試みた。AGRをCGNに置き換える試みにより組換え体が得られなかった場合、代償的な同義変異を、抵抗性AGRの周囲の3アミノ酸のウィンドウで試験した。必要に応じて、AGRからNNNへの変異をコードするオリゴヌクレオチドと再結合することにより、同義的ストリンジェンシーを緩和した。トラブルシューティングワークフローの各工程の後、2つの連続したCoS-MAGE組換えからの96クローンを、野生型遺伝子型にハイブリダイズするプライマーを用いた対立遺伝子特異的PCRを用いてスクリーニングした。野生型アンプリコンの産生に失敗した配列を、変換を確認するためにサンガー配列決定した。LBL中の全てのクローンの倍加時間を測定して、配列決定データを適応度データと対にし、最短の倍加時間を有する組換えクローンを選択した。倍加時間は、Biotekプレートリーダー(Eon又はH1のいずれか)で増殖曲線を得ることによって決定し、ウェブベースのオープンソースゲノム再配列決定ソフトウェアを使用して分析した。次にこの遺伝子型をMAGEを用いた菌株構築の最後に完全菌株に導入し、MASC-PCRスクリーニングによって確認した。
各配列についてのmRNA折り畳み及びRBS強度値を計算するためにカスタムPythonパイプラインを使用した。mRNAの折り畳みはUNAFold計算機(Markham et al.、2008に基づき、RBS強度はSalis計算機(Salis、2011)に基づいた。mRNAの折り畳みのためのパラメータは、温度(37℃)であり、使用されるウィンドウは平均して遺伝子の開始部位周辺の-30:+100ntから-15:+100ntの間であり、Goodman et al.、2013に基づいていた。RBS強度の唯一のパラメータはRBSとプロモーターの間の距離であり、Li et al.、2012に基づくと平均して目的のコドンの後の9~10ntである。データの可視化はカスタムMatlabコードを介して実行された。
剪断されたゲノムDNAは、Covaris E210中で130μLの精製されたゲノムDNAを剪断することによって得られた。全ゲノムライブラリー調製は既報のように実施した(Rohland et al.、2012)。簡潔には、130μLの精製ゲノムDNAをCovaris E210中で以下のプロトコルを用いて一晩剪断した。負荷サイクル:10%、強度:5、サイクル/バースト:200、時間:780秒/サンプル。アガロースゲル上でサンプルの剪断についてアッセイし、分布が許容される場合(ピーク分布約400nt)、既報(Rohland et al.、2012)に記載されているようにSPRI/逆SPRI精製によってサンプルをサイズ選択した。次に断片を平滑化し、p5/p7アダプターを連結し、続いてフィルイン(fill-in)及びギャップ(gap)修復(NEB)を行った。各サンプルを、SYBRグリーン及びKapa Hifiを用いてqPCR定量した。これを使用して、P5-solプライマー及びP7-solプライマーを使用してバーコード化のために得られたライブラリーを増幅するためのサイクル数を決定した。得られた個々のライブラリーをNanodropにより定量しプールした。得られたライブラリーをqPCR及びAgilent Tapestationで定量し、MiSeq 2×150で泳動した。データを分析して、ウェブベースのオープンソースゲノム再配列決定ツールであるMillstoneを使用して、AGR変換を確認し、オフターゲット突然変異を同定した。
CRISPR/Cas9を使用して、所望のAGRコドン変化の隣の未改変標的部位で染色体を選択的に切断することによって野生型親遺伝子型を枯渇させた。標的部位は、標化されるAGRコドンに近接して近いGeneiousの内蔵標的部位ファインダーを使用して決定した。AGRコドンの上流50bp未満であり、同義変化で破壊される可能性がある部位を選択した。複数の部位がこれらの基準を満たす場合、ゲノムの他の部分と最低レベルの配列類似性を有する部位が選択された。翻訳開始部位の後の最初の30ntにAGRコドンを有する24個の遺伝子の全てについて、約130bpの長さのオリゴを設計した。これらのオリゴは、AGR位置にNNNランダムコドン、及びAGRコドンの少なくとも50nt下流にあるCRISPR標的部位における複数の(最大6つまでの)同義変化の両方を組み込んでいた。これによりCRISPR標的部位を破壊すると同時にAGR遺伝子座が改変され、親の遺伝子型が削除された後の遺伝子座のランダム化を確実にする。Cas9発現プラスミドDsCas9を有する親株EcM2.1において組換えを実施した。24個の遺伝子のそれぞれについて、1μM濃度の特異的突然変異誘発オリゴを用いて5サイクルのMAGEを実施した。ガイドを有するCRISPRリピートスペーサープラスミドを選択された部位を標的とするように設計し、最後の組換えサイクル後に多様化プールのそれぞれにエレクトロポレーションした。1時間の回復後、DsCas9プラスミド及びリピートスペーサープラスミドの両方を選択し、24のAGRコドンのそれぞれについて3つの並行した系統で144時間継代した。2時間の選択の後、24時間毎に、サンプルを採取して細胞を選択培地中で1/100に希釈した。
ゲノム工学ツールキット及び多遺伝子座検証実験
本明細書に記載の方法は、ゲノム全体にわたってコドンを再割り当てするためのソフトウェアライブラリであるGenome Engineering Toolkit(GETK)を利用する。GETKソフトウェアは、再コード化遺伝子及び全ゲノムの設計及び合成を支援する(図36A)。前記ソフトウェアは生物物理学的制約を考慮に入れて、最善のコドン再割り当てを選択し、再設計された生物が障害されるか又は生存不能になるリスクを最小限にする。本明細書に記載のソフトウェアコード化方法を使用して、ゲノム全体にわたる位置を再コード化し、本明細書に記載の方法によって特定されるコドン選択により設計例外の危険性が低減されることが実証された。
235コドン競合実験のための標的は、3つの96ウェルプレートにまとめられた。
必須遺伝子の5′末端付近、すなわち開始コドンに対して(-30、+100)塩基付近に存在する95個のコドンを選択した。以下のフィルターによって記述されるように、予測される最低スコアが少なくとも1つのフィルターの閾値を超える位置(RBS又はmRNAのフォールディング予測が不良)を考慮した。
RBS_log_ratio:3.3=1+math.log_e(10)
mRNA_positive_ratio:1.1=10%偏差
max_internal_RBS_score:4.1=3.3+96ウェルプレート未満にするためには若干多め
単一の変化の中から、90塩基対のオリゴヌクレオチドサイズ内で他のものに隣接して起こるものを組み合わせて、隣接オリゴのすべての組み合わせを試験した新しい一連のサブ実験とした。そのようなターゲットは62個あった。
最終的な66個のサブ実験は、許可された非同義置換の原因として系統発生的保存を試験するために設計された。ガンマプロテオバクテリアの7種の菌株をアラインメントし、大腸菌に対する非同義の変異を有するコドンが同定された。必須遺伝子の5′末端付近及び必須遺伝子の中央部を標的として試験した。5′標的を保存するため、以下に記述されるように、予測される悪いスコアが存在する系統発生的保存上のデータにおいて観察された非同義変化からサブセットを選択した。
競合試験には、EcM2.1無処理菌株を使用した(EcM2.1は、大腸菌MG1655 mutS_mut dnaG_Q576A exoX_mut xonA_mut xseA_mut 1255700::tolQRA Δ(ybhB-bioAB)::[λcI857 N(cro-ea59)::tetR-bla]であり、MAGEに対して最適化された菌株である)。
EcM2.1株を用いた組み換え実験を、以前に記載されたように、全ての異なる競合実験について同じ条件で行った。実験に応じて、全オリゴプールを最大5μMに調整した。
各集団をIllumina P5プライマー及びP7プライマーで増幅及びバーコード化し、プールし、PE-150キットを用いてMiSeq又はNextSeqにより配列決定した。読み取りを基準ゲノムに逆多重化し、各コドンの頻度を各サブ実験について計算した。
各サブ実験について、各コドンの相対頻度を計算した。次いで、画分を最初の時点での画分に対して正規化した。次に、各コドンについて、適応度は、対数関数を全ての時点にわたってコドン画分に適合させ、減衰定数を測定適応度として採用することによって推論された。mRNA構造の偏差及びRBS強度の偏差はGETKを用いて計算され、スコアは実験により測定された適応度と比較された。
本明細書においては参考文献を著者別で明示するが、完全な引用を以下に示す。引用された各参考文献の開示は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
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本開示に係る態様は以下の態様も含む。
<1> 計算プラットフォームによって実行されるゲノムのデザイン方法であって、
計算プラットフォームにおける入力として、既知のゲノムに関するデータ及び前記既知のゲノムにおいて置換される対立遺伝子のリストを受け取ること、
前記対立遺伝子のリストに基づいて、前記計算プラットフォームによって、前記既知のゲノムにおける各対立遺伝子の存在を検出すること、
前記計算プラットフォームによって、前記既知のゲノムから各対立遺伝子の存在を除去すること、
前記計算プラットフォームによって、前記既知のゲノムにおける各対立遺伝子の存在を置換するための複数の対立遺伝子選択肢を決定すること、
前記計算プラットフォームによって、前記既知のゲノムに基づいてゲノムデザインのための複数の代替遺伝子配列を生成すること、ここでそれぞれの代替遺伝子配列は前記複数の対立遺伝子選択肢から選択されるそれぞれ異なる対立遺伝子選択肢を含む、
前記計算プラットフォームによって、各規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴についてのスコアをそれぞれの代替遺伝子配列に割り当てることによって、それぞれの代替遺伝子配列に対して複数の規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴を当てはめて、それによりそれぞれの代替遺伝子配列に当てはめられた前記複数の規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴についてのスコアを得ること、
前記計算プラットフォームによって、前記複数の規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴についてのスコアの加重された組み合わせに基づいてそれぞれの代替遺伝子配列をスコア付けすること、及び
前記計算プラットフォームによって、前記加重スコア付けに基づいて、前記ゲノムデザインとして少なくとも1つの代替遺伝子配列を選択すること
を含む、前記方法。
<2> 前記既知のゲノム配列が野生型の大腸菌ゲノムを含む、<1>に記載の方法。
<3> 前記既知のゲノム配列が、以前に進化させたか又は遺伝子操作された株又は生物から得られる、<1>に記載の方法。
<4> 非必須遺伝子及び非コード配列のうち少なくとも一方について、含まれる全ての前記非必須遺伝子及び/又は非コード配列を前記既知のゲノムから除去することをさらに含む、<1>に記載の方法。
<5> 前記複数の対立遺伝子選択肢が、相互に排他的な対立遺伝子選択肢を含む、<1>に記載の方法。
<6> 前記複数の規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴が、
前記ゲノムデザインにおいて1又は複数のリボソーム結合部位(RBS)様モチーフを保存すること、
前記ゲノムデザインのための禁止制限酵素サイトを除去すること、
前記既知のゲノムにおける遺伝子の5´mRNA二次構造を保存すること、
前記既知のゲノムにおけるRNA二次構造を保存すること、
前記ゲノムデザインにおける調節モチーフを保存すること
前記ゲノムデザインにおける既知の配列モチーフを保存すること
前記ゲノムデザインのための系統発生的保存を適用すること、及び
前記ゲノムデザインのためのGC要件を満たすこと
のうち少なくとも1つを含む、<1>に記載の方法。
<7> 前記各規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴についてのスコアを割り当てることが、各規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴を前記代替遺伝子配列及び元の対立遺伝子を有する参照遺伝子配列に適用することに基づく、<1>に記載の方法。
<8> 実験によるデータに基づいて、又は各スコアに対する加重の手動指定に基づいて、前記ゲノムデザインをスコア付けするための加重された組み合わせにおける各スコアに対する加重を調整することをさらに含む、<1>に記載の方法。
<9> 前記スコア付けが、スコアが高いほど前記複数の規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴からの偏差が少ないことを示すスコアの割り当てにさらに基づく、<1>に記載の方法。
<10> 前記スコア付けが、スコアが低いほど前記複数の規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴からの偏差が少ないことを示すスコアの割り当てにさらに基づく、<1>に記載の方法。
<11> 前記ゲノムデザインとして少なくとも1つの代替遺伝子配列を選択することが、どの代替遺伝子配列が所定の閾値を超える加重スコアを含むかを同定することに基づいて複数の代替遺伝子配列を選択することをさらに含む、<1>に記載の方法。
<12> どの代替遺伝子配列が所定の閾値を上回る加重スコアを含むかを同定したら、前記同定された代替遺伝子配列を個々に又は混合されたものとして実験により試験することをさらに含む、<11>に記載の方法。
<13> 前記計算プラットフォームによって、前記ゲノムデザインを連続する複数のセグメントに分割することにより合成可能なDNAを同定することをさらに含み、各セグメントは所定の数の塩基を含む、<1>に記載の方法。
<14> 前記ゲノムデザインが、基準遺伝コードからの若干の改変を伴う遺伝コード、根本的に再定義された遺伝コード、新規の遺伝コード、又はコドンが非標準アミノ酸に対応する遺伝コードのうちの1つを含む、<1>に記載の方法。
<15> ゲノムデザインにおける規則を更新する方法であって、
ゲノムデザインの1又は複数の特徴を少なくとも1つの細胞に導入すること、
ゲノム生存率を同定し、前記少なくとも1つの細胞に導入された前記1又は複数の特徴の表現型を評価するために、アッセイによって前記少なくとも1つの細胞の前記1又は複数の特徴を試験すること、
前記試験に基づいて、前記少なくとも1つの細胞に導入された前記1又は複数の特徴が、前記ゲノムデザインのための1又は複数の所定の規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴によれば実行可能又は不合格であると予測されると判定すること、及び
前記判定に基づいてゲノムデザインのための前記所定の規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴を更新することを含む、前記方法。
<16> 前記所定の規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴を更新することが、統計的技術及び機械学習アルゴリズムにさらに基づく、<15>に記載の方法。
<17> 前記ゲノムデザインの1又は複数の特徴を、DNA切断を用いて前記少なくとも1つの細胞に導入し、野生型遺伝子型に対して選択すること及び相同組換えを促進することの少なくとも1つを行う、<15>に記載の方法。
<18> 前記ゲノムデザインの前記1又は複数の特徴が、リコンビナーゼ又はインテグラーゼを用いて前記少なくとも1つの細胞に導入される、<15>に記載の方法。
<19> 前記ゲノムデザインの前記1又は複数の特徴を前記少なくとも1つの細胞に導入することが、前記ゲノムデザインに基づいて部分ゲノム又は全ゲノムを合成することをさらに含む、<15>に記載の方法。
<20> キネティックプレートリーダーを用いた増殖アッセイによって前記1又は複数の特徴を試験すること、をさらに含む、<15>に記載の方法。
<21> タンパク質産生を試験するためのアッセイによって前記1又は複数の特徴を試験することをさらに含む、<15>に記載の方法。
<22> ゲノムデザインのための前記1又は複数の所定の規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴が、表現型のパラメータ及び遺伝子型のパラメータの1又は複数を含む、<15>に記載の方法。
<23> 所定の時点で前記細胞の集団の代表的な部分を配列決定することによって前記1又は複数の特徴を試験することをさらに含む、<15>に記載の方法。
<24> ゲノムデザインを試験するためのコンピュータにより実行される方法であって、
既知のゲノム配列及び計算プラットフォームによって生成されたゲノムデザインの全部又は一部を取得すること、
前記ゲノムデザインにおける1又は複数の特徴は、所定の規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴のセットについて不合格であると決定すること、
所定のデザイン目的を達成して生存可能性を高める前記ゲノムデザインに対する改変を予測すること、及び
改良されたゲノムデザインを生成するために前記予測された改変を試験することを含む、前記方法。
<25> 前記決定工程が、前記ゲノムデザインにおける個々の変異を並行して試験することをさらに含む、<24>に記載の方法。
<26> 前記決定工程が、前記計算プラットフォームで前記既知のゲノム配列のサンプルを分析することをさらに含む、<24>に記載の方法。
<27> 前記ゲノムデザインについての前記予測された改変が混合されたものとして試験される、<24>に記載の方法。
<28> 前記ゲノムデザインのための前記予測された改変が遺伝的多様性及び選択を用いて試験される、<24>に記載の方法。
<29> 前記所定の規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴のセットが、1又は複数の表現型及び遺伝子型のパラメータを含む、<24>に記載の方法。
<30> 再コード化されたゲノムを含む遺伝子操作生物であって、1つの特定のセンスコドンが、鋳型ゲノム中のある1つの遺伝子又は非コードモチーフ内における全ての出現箇所で代替コドンに変更されている、前記遺伝子操作生物。
<31> 前記遺伝子が、タンパク質配列をコードする必須遺伝子又は非必須遺伝子である、<30>に記載の遺伝子操作生物。
<32> 特定のセンスコドンは非コードモチーフと重複する出現箇所を有する、<30>に記載の遺伝子操作生物。
<33> 前記非コードモチーフが、リボソーム結合部位モチーフ、mRNA二次構造、内部リボソーム休止部位モチーフ、又はプロモーターである、<30>に記載の遺伝子操作生物。
<34> 前記タンパク質配列が保存されている、<31>に記載の遺伝子操作生物。
<35> 前記非コードモチーフが保存されている、<30>に記載の遺伝子操作生物。
<36> 前記特定のセンスコドンが、AGG、AGA、AGC、AGU、UUG、及びUUAからなる群より選択される、<30>に記載の遺伝子操作生物。
<37> 前記遺伝子操作生物が大腸菌である、<30>に記載の遺伝子操作生物。
<38> 前記遺伝子操作生物がウイルス抵抗性であるか又は生物学的に封じ込められている、<30>に記載の遺伝子操作生物。
<39> 前記特定のセンスコドンに対する同族tRNAが前記鋳型ゲノムから除去されている、<30>に記載の遺伝子操作生物。
<40> 前記特定のセンスコドンに対する同族tRNAが前記再コード化されたゲノムには存在しない、<30>に記載の遺伝子操作生物。
<41> 前記特定のセンスコドンが、前記遺伝子操作生物内に配置され、非標準アミノ酸に再割り当てされている、<30>に記載の遺伝子操作生物。
<42> 前記代替コドンが同義コドンである、<30>に記載の遺伝子操作生物。
<43> 前記代替コドンが非同義コドンである、<30>に記載の遺伝子操作生物。
<44> 再コード化されたゲノムを含む遺伝子操作生物であって、1つの特定のセンスコドンが、鋳型ゲノム中の複数の遺伝子又は非コードモチーフ内における全ての出現箇所で代替コドンに変更されている、前記遺伝子操作生物。
<45> 鋳型ゲノム中の1つの特定のセンスコドンが、ゲノム全体で代替コドンに変更されている再コード化されたゲノムを含む、遺伝子操作生物。
<46> 再コード化されたゲノムを含む遺伝子操作生物であって、複数の特定のセンスコドンが、鋳型ゲノム中のある1つの必須遺伝子内における全ての出現箇所で代替コドンに変更されている、前記遺伝子操作生物。
<47> 再コード化されたゲノムを含む遺伝子操作生物であって、複数の特定のセンスコドンが、鋳型ゲノム中の複数の必須遺伝子内における全ての出現箇所で代替コドンに変更されている、前記遺伝子操作生物。
<48> 再コード化されたゲノムを含む遺伝子操作生物であって、鋳型ゲノム中の複数の特定のセンスコドンがゲノム全体で代替コドンに変更されている、前記遺伝子操作生物。
<49> <1>に記載の方法によってデザインされた再コード化されたゲノムを含む、遺伝子操作生物。
<50> 再コード化されたゲノムを含む遺伝子操作生物であって、ある1つの特定のセンスコドンの複数の出現箇所が複数の代替コドンに変更されて、前記特定のセンスコドンに対する同族tRNAを前記遺伝子操作生物から除去可能となっている、前記遺伝子操作生物。
<51> 再コード化されたゲノムを含む遺伝子操作生物であって、ある1つの特定のセンスコドンの複数の出現箇所が複数の代替コドンに変更されて、前記特定のセンスコドンの翻訳機能を変更可能となっている、前記遺伝子操作生物。
<52> 再コード化されたゲノムを含む遺伝子操作生物であって、ある1つの特定のセンスコドンの複数の出現箇所が複数の代替コドンに変更されて、前記特定のセンスコドンの翻訳機能を除去可能となっている、前記遺伝子操作生物。
Claims (12)
- 計算プラットフォームによって実行されるゲノムのデザイン方法であって、
計算プラットフォームにおける入力として、既知のゲノムに関する配列データ及び前記既知のゲノムにおいて置換される対立遺伝子のリストを受け取ること、
前記対立遺伝子のリストに基づいて、前記計算プラットフォームによって、前記既知のゲノムにおける各対立遺伝子の存在を検出すること、
前記計算プラットフォームによって、前記既知のゲノムから各対立遺伝子の存在を除去すること、
前記計算プラットフォームによって、前記既知のゲノムにおける各対立遺伝子の存在を置換するための複数の対立遺伝子選択肢を決定すること、
前記計算プラットフォームによって、前記既知のゲノムに基づいてゲノムデザインのための複数の代替遺伝子配列を生成すること、ここでそれぞれの代替遺伝子配列は前記複数の対立遺伝子選択肢から選択されるそれぞれ異なる対立遺伝子選択肢を含む、
前記計算プラットフォームによって、各規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴についてのスコアをそれぞれの代替遺伝子配列に割り当てることによって、それぞれの代替遺伝子配列に対して複数の規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴を当てはめて、それによりそれぞれの代替遺伝子配列に当てはめられた前記複数の規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴についてのスコアを得ること、
前記計算プラットフォームによって、前記複数の規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴についてのスコアの加重された組み合わせに基づいてそれぞれの代替遺伝子配列をスコア付けすること、及び
前記計算プラットフォームによって、前記加重スコア付けに基づいて、前記ゲノムデザインとして少なくとも1つの代替遺伝子配列を選択すること
を含み、
前記複数の規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴が、
前記ゲノムデザインにおいて1又は複数のリボソーム結合部位(RBS)様モチーフを保存すること、
前記ゲノムデザインのための禁止制限酵素サイトを除去すること、
前記既知のゲノムにおける遺伝子にコードされるmRNAの5´mRNA二次構造を保存すること、
前記既知のゲノムにコードされるRNAのRNA二次構造を保存すること、
前記ゲノムデザインにおける調節モチーフを保存すること
前記ゲノムデザインのための系統発生的保存を適用すること、及び
前記ゲノムデザインのためのGC要件を満たすこと
のうち少なくとも1つを含む、
前記方法。 - 前記既知のゲノムが野生型の大腸菌ゲノムを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記既知のゲノムが、以前に進化させたか又は遺伝子操作された株又は生物から得られる、請求項1に記載の方法。
- 非必須遺伝子及び非コード配列のうち少なくとも一方について、含まれる全ての前記非必須遺伝子及び/又は非コード配列を前記既知のゲノムから除去することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記各規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴についてのスコアを割り当てることが、各規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴を前記代替遺伝子配列及び元の対立遺伝子を有する参照遺伝子配列に適用することに基づく、請求項1に記載の方法。
- 実験によるデータに基づいて、又は各スコアに対する加重の手動指定に基づいて、前記ゲノムデザインをスコア付けするための加重された組み合わせにおける各スコアに対する加重を調整することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記スコア付けが、スコアが高いほど前記複数の規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴からの偏差が少ないことを示すスコアの割り当てにさらに基づく、請求項1に記載の方法。
- 前記スコア付けが、スコアが低いほど前記複数の規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴からの偏差が少ないことを示すスコアの割り当てにさらに基づく、請求項1に記載の方法。
- 前記ゲノムデザインとして少なくとも1つの代替遺伝子配列を選択することが、どの代替遺伝子配列が所定の閾値を超える加重スコアを含むかを同定することに基づいて複数の代替遺伝子配列を選択することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- どの代替遺伝子配列が所定の閾値を上回る加重スコアを含むかを同定したら、前記同定された代替遺伝子配列を個々に又は混合されたものとして少なくとも1つの細胞に導入し、前記少なくとも1つの細胞の生存率を試験することをさらに含む、請求項9に記載の方法。
- それぞれの代替遺伝子配列をスコア付けした後に、前記方法は、前記計算プラットフォームによって、前記ゲノムデザインを連続する複数のセグメントに分割することにより合成可能なDNAを同定することをさらに含み、各セグメントは所定の数の塩基を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ゲノムデザインが、基準遺伝コードからの若干の改変を伴う遺伝コード、根本的に再定義された遺伝コード、新規の遺伝コード、又はコドンが非標準アミノ酸に対応する遺伝コードのうちの1つを含む、請求項1に記載の方法。
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