JP7058857B2 - 毛髪タンパク質の水との相互作用測定方法 - Google Patents

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Description

本発明は毛髪タンパク質の水との相互作用測定方法に関し、詳しくは、赤外吸収分光法を用いた毛髪タンパク質の水との相互作用測定方法に関する。
水はキューティクルから毛髪内部へと浸透し、毛髪の物性や官能に影響を及ぼす。従来の毛髪の水分量測定法は重量測定や、膨潤度測定およびX線マイクロCTを用いた形態観察があるが、いずれも直接水を評価する方法ではなく、リアルタイムでの水浸透の測定は実現されていない(特許文献1、非特許文献1)。また、これまでに発明者らは、毛髪に重水を接触させることで、毛髪内部に存在する水と毛髪外部からの水とを判別できることを見出している(特許文献2)。
特許第5530588号公報 特願2016-111854号
竹原孝二,井上孝文,杉健太朗,竹内晃久,鈴木芳生,粧技誌,44,292-297,(2010)
顕微FT-IRを用いて、キューティクルから毛髪内部へ拡散する重水によって引き起こされる毛髪タンパク質のスペクトル変化を連続的に評価することで、毛髪内部への水拡散による毛髪タンパク質の水との相互作用を可視化する方法を見出そうとするものである。
本発明者は、これらの従来の問題点を解決するために鋭意検討した結果、毛髪の横断面切片を赤外光に透明なセルで挟んだ後に重水を接触させ、赤外吸収分光法によって測定するアミドII及びOD伸縮振動の信号強度を用いることにより、これまでの問題点を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
本願第一の発明は、毛髪の横断面切片を赤外光に透明なセルで挟んだ後に赤外吸収分光法によって前記被測定物質の赤外吸収スペクトルを測定する工程Iと、前記被測定物質に重水を接触させた後に赤外吸収分光法によって測定した赤外吸収スペクトルのうち、1440cm-1付近の重水素置換されたアミドIIの信号強度Axを測定する工程と、前記Axを得た波数における工程Iの信号強度A0を求める工程と、Ax-A0を計算する工程とを含むことを特徴とする水拡散による毛髪タンパク質の水との相互作用測定方法である。
本願第二の発明は、毛髪の横断面切片を赤外光に透明なセルで挟んだ後に赤外吸収分光法によって前記被測定物質の赤外吸収スペクトルを測定する工程Iと、前記被測定物質に重水を接触させた後に赤外吸収分光法によって測定した赤外吸収スペクトルのうち、1440cm-1付近の重水素置換されたアミドIIの信号強度Ax及び2520cm-1付近のOD伸縮振動の信号強度Bxを測定する工程と、前記Ax及びBxを得た波数における工程Iの信号強度A0及びB0を求める工程と、(Ax-A0)/(Bx-B0)を計算する工程とを含むことを特徴とする水拡散による毛髪タンパク質の水との相互作用測定方法
である。
本願第三の発明は、毛髪の横断面切片を赤外光に透明なセルで挟んだ後に赤外吸収分光法によって前記被測定物質の赤外吸収スペクトルを測定する工程Iと、前記被測定物質に重水を接触させた後に赤外吸収分光法によって測定した赤外吸収スペクトルのうち、1440cm-1付近の重水素置換されたアミドIIの信号強度Axを測定する工程と、前記Axを得た波数における工程Iの信号強度A0及び1540cm-1付近のアミドIIの信号強度C0を求める工程と、(Ax-A0)/C0を計算する工程とを含むことを特徴とする水拡散による毛髪タンパク質の水との相互作用測定方法である。
本願第四の発明は、毛髪の横断面切片を赤外光に透明なセルで挟んだ後に赤外吸収分光法によって前記被測定物質の赤外吸収スペクトルを測定する工程Iと、前記被測定物質に重水を接触させた後に赤外吸収分光法によって測定した赤外吸収スペクトルのうち、1540cm-1付近のアミドIIの信号強度Cxを測定する工程と、前記Cxを得た波数における工程Iの信号強度C0を求める工程と、(C0-Cx)/C0を計算する工程とを含むことを特徴とする水拡散による毛髪タンパク質の水との相互作用測定方法である。
本願第五の発明は、本願第一の発明~本願第四の発明に記載の赤外光に透明なセルがダイヤモンドセルであることを特徴とする水拡散による毛髪タンパク質の水との相互作用測定方法である。
本願第六の発明は、本願第一の発明~本願第五の発明に記載の重水を接触させる工程がセル間に液体の重水を注水することを特徴とする水拡散による毛髪タンパク質の水との相互作用測定方法である。
本発明によれば、顕微FT-IRを用いて、キューティクルから毛髪内部へ拡散する重水によって引き起こされる毛髪タンパク質のスペクトル変化を連続的に評価することで、毛髪内部への水拡散による毛髪タンパク質の水との相互作用を可視化できる。
キューティクル最表面より20μm内側の10μm×10μmのエリア2箇所(S及びT)における、重水接触後の1440cm-1付近の重水素置換されたアミドIIの各計測時における信号強度Axと計測開始時における信号強度A0の差 Ax-A0の経時変化を示すグラフである。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の水拡散による毛髪タンパク質の水との相互作用測定方法は、毛髪の横断面切片を赤外光に透明なセルで挟んだ後に赤外吸収分光法によって前記被測定物質の赤外吸収スペクトルを測定する工程Iを含む。ここで、毛髪の横断面切片は、毛髪を樹脂包埋、中空樹脂内への挿入固定などの固定処理を行った後にミクロトームなどで作成することができ、その切片の厚さは0.5~15μm、望ましくは4~8μmである。0.5μmより薄い場合には赤外吸収スペクトルの信号強度が弱くなったり測定時の積算時間が長くなったりノイズが強くなりやすく望ましくない。15μmより厚い場合には赤外吸収スペクトルの信号強度が強くなりすぎ定量性に問題が生じやすい。毛髪の横断面切片の両断面が平行になるように作成することがセルと毛髪の横断面との密着を適切に行う上で望ましく、そのためにはミクロトームを用いて作成することが望ましい。
また、赤外光に透明なセルとしては、ダイヤモンドセル、石英セルやフッ化カルシウムセルなどがある。ダイヤモンドセルが広く普及しており取り扱いにも優れていることから望ましい。
前記被測定物質に重水を接触させた後に赤外吸収分光法による赤外吸収スペクトルを測定する工程を含む。毛髪と重水との接触は、毛髪の横断面切片の横断面をセルに均一に接するように挟んだ後に、そのセル間に液体の重水を注入する方法、重水蒸気下に毛髪を放置する方法などがあり、キューティクル面から選択的に重水を拡散させることができる。さらに、そのセル間を水蒸気濃度既知の空気とする方法もあり、重水と接触した後の毛髪の横断面切片の飽和重水蒸気圧よりも低い水蒸気圧の空気とすることで、毛髪内部からキューティクル面に向かって重水を拡散させることができる。
上記工程を経て毛髪の横断面切片について測定した赤外吸収スペクトルのうち、1440cm-1付近の重水素置換されたアミドIIの信号強度Axを測定する。赤外吸収分光法としては、透過法により測定する方法が好ましい。装置としては顕微FT-IRが一般的に良く用いられる。
更に、前記Axを得た波数における工程Iの信号強度A0を求める工程と、Ax-A0を計算する工程とを含む。この工程により、1440cm-1付近の重水素置換されたアミドIIの信号強度に含まれるバックグラウンドを補正することができる。
本発明の水拡散による毛髪タンパク質の水との相互作用測定方法によれば、毛髪が重水に接触した直後から経時的な測定が可能であり、また、同一毛髪について重水を接触させた場合の変化、重水浸透後に重水を含まない環境に接触させた場合の重水脱離変化など繰り返し処理した時についても測定することが可能である。
上記工程を経て毛髪の横断面切片について測定した赤外吸収スペクトルのうち、1440cm-1付近の重水素置換されたアミドIIの信号強度Ax及び2520cm-1付近のOD伸縮振動の信号強度Bxを測定する工程と、前記Ax及びBxを得た波数における工程Iの信号強度A0及びB0を求める工程と、(Ax-A0)/(Bx-B0)を計算する工程とを含む。このことにより、重水の拡散と重水素置換が起こった毛髪タンパク質の関係を指標化することができる。
また、上記工程を経て毛髪の横断面切片について測定した赤外吸収スペクトルのうち、1440cm-1付近の重水素置換されたアミドIIの信号強度Axを測定する工程と、前記Axを得た波数における工程Iの信号強度A0及び1540cm-1付近のアミドIIの信号強度C0を求める工程と、(Ax-A0)/C0を計算する工程とを含む。
毛髪が重水と接触する前にその毛髪タンパク質の代表的なアミドIIの信号強度C0を測定することができ、その後に前記被測定物質に重水を接触させ水素・重水素交換されることにより新たに得られる1440cm-1付近の重水素置換されたアミドIIの信号強度Axを測定し、前記同様にバックグラウンド補正した後に、(Ax-A0)/C0を算出することで、被測定毛髪のタンパク質の量を基準とした水素・重水素交換後のタンパク質の量を評価することができる。
毛髪の横断面切片の厚みの不均一さを相殺した水浸透による毛髪タンパク質の水分との相互作用の量的評価に適している。また、毛髪の横断面切片中のタンパク質の局在を考慮した水拡散による毛髪タンパク質の水との相互作用の量的評価に適している。
また、上記工程を経て毛髪の横断面切片について測定した赤外吸収スペクトルのうち、1540cm-1付近のアミドIIの信号強度Cxを測定する工程と、前記Cxを得た波数における工程Iの信号強度C0を求める工程と、(C0-Cx)/C0を計算する工程とを含む。
毛髪が重水と接触する前にその毛髪タンパク質の代表的なアミドIIの信号強度C0を測定することができ、その後に前記被測定物質に重水を接触させ後でも水素・重水素交換されない1540cm-1付近のアミドIIの信号強度Cxを測定し、(C0-Cx)/C0を算出することで、被測定毛髪のタンパク質の量を基準とした水素・重水素交換の起こったタンパク質の量を評価することができる。
以下に、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれによってなんら限定されるものではない。
健康な人毛黒髪の毛束(30cm,2g)を8質量%ラウレス硫酸ナトリウム水溶液で洗浄後、任意に選んだ毛髪についてカール半径を求め、その半径が2cm以下の毛髪をうねり毛として試験に供した。
次に、上記うねり毛をアクリル系UV硬化樹脂にて包埋し、工業用回転式ミクロトームを用いて厚さ6.0μmの平滑な毛髪の横断面切片を作成した。
上記うねり毛の横断面切片を、ダイヤモンドセル上に設置し、実体顕微鏡で確認しながら、ダイヤモンドセル間に挟み込んだ。さらにそのセル間に重水を注入した後、この毛髪切片を顕微FT-IR(サーモサイエンティフィック社製のNicolet iN10)を用い次の条件で、キューティクル最表面より20μm内側の任意の2箇所(S及びT)における重水接触前後の1440cm-1付近の重水素置換されたアミドIIの信号強度及び2520cm-1付近のOD伸縮振動の信号強度を測定した。
<測定条件>
測定手法;ポイントマッピング、波数;4000~800cm-1、積算回数;512、分解能;8cm-1、エリア;キューティクル最表面より20μm内側の10μm×10μmのエリア、アパーチャー幅;10μm
その結果のうち、キューティクル最表面より20μm内側の10μm×10μmのエリア2箇所(S及びT)における、重水接触後の1440cm-1付近の重水素置換されたアミドIIの各計測時における信号強度Axと、計測開始時における1440cm-1付近の重水素置換されたアミドIIの信号強度A0の差 Ax-A0の変化を表1に例示する。
Figure 0007058857000001

また、上記2箇所において重水接触前後の1440cm-1付近の重水素置換されたアミドIIの各計測時における信号強度Axと計測開始時における1440cm-1付近の重水素置換されたアミドIIの信号強度A0、および2520cm-1付近のOD伸縮振動の各計測時における信号強度Bxと計測開始時における2520cm-1付近のOD伸縮振動の信号強度B0から、各計測時間における(Ax-A0)/(Bx-B0)を算出し、表2に例示する。
Figure 0007058857000002

水の浸透が進行しているにもかかわらず、場所によって毛髪タンパク質が水から受ける影響に差が存在することも明らかにすることができた。
重水接触後の1440cm-1付近の重水素置換されたアミドIIの各計測時における信号強度Axと計測開始時における1440cm-1付近の重水素置換されたアミドIIの信号強度A0、および1540cm-1付近のアミドIIの各計測時における信号強度Cxと計測開始時における1540cm-1付近のアミドIIの信号強度C0から、各計測時間における(Ax-A0)/C0および(C0-Cx)/C0を算出し、表3に例示する。
Figure 0007058857000003
本発明の毛髪の水分浸透測定方法により、毛髪の横断面切片中のタンパク質の局在を考慮した水の影響の量的な比較が可能となった。

Claims (6)

  1. 毛髪の横断面切片を赤外光に透明なセルで挟んで被測定物質を調製する工程と、
    赤外吸収分光法によって前記被測定物質の赤外吸収スペクトルを測定する工程Iと、
    前記被測定物質に重水を接触させた後に赤外吸収分光法によって測定した赤外吸収スペクトルのうち、1440cm-1付近の重水素置換されたアミドII信号強度Axを測定する工程と、
    前記Axを得た波数における工程Iの信号強度A0を求める工程と、
    Ax-A0を計算する工程
    とを含むことを特徴とする水拡散による毛髪タンパク質の水との相互作用測定方法。
  2. 毛髪の横断面切片を赤外光に透明なセルで挟んで被測定物質を調製する工程と、
    赤外吸収分光法によって前記被測定物質の赤外吸収スペクトルを測定する工程Iと、
    前記被測定物質に重水を接触させた後に赤外吸収分光法によって測定した赤外吸収スペクトルのうち、1440cm-1付近の重水素置換されたアミドiiの信号強度Ax及び2520cm-1付近のOD伸縮振動の信号強度Bxを測定する工程と、
    前記Ax及びBxを得た波数における工程Iの信号強度A0及びB0を求める工程と、
    (Ax-A0)/(Bx-B0)を計算する工程
    とを含むことを特徴とする水拡散による毛髪タンパク質の水との相互作用測定方法。
  3. 毛髪の横断面切片を赤外光に透明なセルで挟んで被測定物質を調製する工程と、
    赤外吸収分光法によって前記被測定物質の赤外吸収スペクトルを測定する工程Iと、
    前記被測定物質に重水を接触させた後に赤外吸収分光法によって測定した赤外吸収スペクトルのうち、1440cm-1付近の重水素置換されたアミドiiの信号強度Axを測定する工程と、
    前記Axを得た波数における工程Iの信号強度A0及び1540cm-1付近のアミドiiの信号強度C0を求める工程と、
    (Ax-A0)/C0を計算する工程
    とを含むことを特徴とする水拡散による毛髪タンパク質の水との相互作用測定方法。
  4. 毛髪の横断面切片を赤外光に透明なセルで挟んで被測定物質を調製する工程と、
    赤外吸収分光法によって前記被測定物質の赤外吸収スペクトルを測定する工程Iと、
    前記被測定物質に重水を接触させた後に赤外吸収分光法によって測定した赤外吸収スペクトルのうち、1540cm-1付近のアミドIIの信号強度Cxを測定する工程と、
    前記Cxを得た波数における工程Iの信号強度C0を求める工程と、
    (C0-Cx)/C0を計算する工程
    とを含むことを特徴とする水拡散による毛髪タンパク質の水との相互作用測定方法。
  5. 前記赤外光に透明なセルがダイヤモンドセルであることを特徴とする請求項1-4のいずれか1項に記載の水拡散による毛髪タンパク質の水との相互作用測定方法。
  6. 前記重水を接触させる工程がセル間に液体の重水を注水することを特徴とする請求項1~5のいずれか1項に記載の水拡散による毛髪タンパク質の水との相互作用測定方法。
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