JP2014528571A - 肝臓の生物学的数値を測定するための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、肝臓の生物学的数値を測定するための方法に関する。
脂肪肝疾患は、アルコール依存症、薬物摂取、小腸バイパス手術又はメタボリック症候群などの幅広い臨床容態を包含し、そしてまた頻繁に慢性C型肝炎にも関連している。メタボリック症候群における肥満、インシュリン抵抗性、糖尿病、高トリグリセリド血症、動脈性高血圧に関連していることが知られる非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)はおそらく、西洋諸国における慢性肝疾患の最も一般的な原因であろう。脂肪肝疾患はまた、肝移植の潜在的な長期の合併症である。
今回、出願人は、赤外線放射の使用が、肝臓における生物学的数値の定量的及び客観的評価を可能としたことを発見した。この評価は、この肝臓の、特にその移植能の迅速かつ信頼性のある診断を可能とする。
a/ 2800cm−1から3000cm−1までの少なくとも第1の波数範囲を有する赤外線放射を、前記肝臓のサンプルの1つ以上の部分piに適用する工程、
b/ 前記放射の強度を、それが1つ以上の部分piの各々を通過した後に検出し、そして検出された強度に関連したシグナルを発生させる工程、
c/ 発生したシグナルを処理して、平均値Vaを、
− 1つ以上の部分piの各々について、第1の波数範囲に関連した第1の数値Vw1piを計算することによって、
又は
− 各々の部分piについて発生したシグナルの平均を計算して、平均シグナルを発生させることによって、
− 第1の波数範囲の平均シグナルに関連した第1の平均値Vw1aを計算することによって、
及び平均値Vaを計算することによって、
計算する工程、
d/ 前記の平均値Vaを標準と比較して、生物学的数値Vbを得る工程
を含む。
− 本発明の方法に従って生物学的数値Vbを測定する工程、及び
− 生物学的数値Vbを閾値と比較する工程
を含み、
ここで閾値を超える生物学的数値Vbは、脂肪肝を示す。
− 本発明の方法に従って生物学的数値Vbを測定する工程、及び
− 生物学的数値Vbを閾値と比較する工程
を含み、ここで:
− 第1の閾値と第2の閾値との間の生物学的数値Vbは、軽度の脂肪症を示し、
− 第2の閾値と第3の閾値との間の生物学的数値Vbは、中等度の脂肪症を示し、
− 第3の閾値を超える生物学的数値Vbは、重度の脂肪症を示す、
方法に関する。
− 本発明の方法に従って生物学的数値Vbを測定する工程、及び
− 生物学的数値Vbを閾値と比較する工程
を含み、
第1の閾値を超える生物学的数値Vbは、脂肪性肝線維症を発症するリスクが高いことを示し、
第2の閾値を超える生物学的数値Vbは、肝細胞癌を発症するリスクが高いことを示し、
第3の閾値を超える生物学的数値Vbは、肝硬変を発症するリスクが高いことを示す、
方法に関する。
− 本発明の方法に従って生物学的数値Vbを測定する工程、及び
− 生物学的数値Vbを閾値と比較する工程
を含み、
− 第1の閾値を下回る生物学的数値Vbは、肝臓が、機能しないというリスクが低く移植するに適切であることを示し、
− 第1の閾値と第2の閾値の間の生物学的数値Vbは、肝臓が、機能しないというリスクが中程度で移植するに適していることを示し、
− 第3の閾値を超える生物学的数値Vbは、肝臓が移植に適していないことを示す、
方法に関する。
− サンプルを赤外線放射に供するための場所、
− 2800cm−1から3000cm−1の第1の特定の波数範囲及び1450cm−1から1710cm−1の第2の特定の波数範囲を有する赤外線放射のビームを提供するための赤外線放射源
− それがサンプルを通過した後に第1及び第2の特定の波数範囲の放射の強度を検出するための検出器、及び
− 検出された強度に関連したシグナルを発生させるための手段
を含む、サンプルの生物学的数値Vbを測定するための装置に関する。
本発明の方法
本発明は、肝臓における生物学的数値Vbを測定するための方法であって、以下の工程:
a/ 2800cm−1から3000cm−1までの少なくとも第1の波数範囲を有する赤外線放射を、前記肝臓のサンプルの1つ以上の部分piに適用する工程、
b/ 前記放射の強度を、それが1つ以上の部分piの各々を通過した後に検出し、そして検出された強度に関連したシグナルを発生させる工程、
c/ 発生したシグナルを処理して、平均値Vaを、
− 1つ以上の部分piの各々について、第1の波数範囲に関連した第1の数値Vw1piを計算することによって、
又は
− 各々の部分piについて発生したシグナルの平均を計算して、平均シグナルを発生させることによって、
− 第1の波数範囲の平均シグナルに関連した第1の平均値Vw1aを計算することによって、
及び平均値Vaを計算することによって、
計算する工程
d/ 前記の平均値Vaを標準と比較して、生物学的数値Vbを得る工程
を含む、方法に関する。
本発明の方法に使用される肝臓は、in vivoの肝臓又はex vivoの肝臓又は肝臓の一部であり得る。
サンプルを赤外分光光度計に入れる。
− 各部分piについての発生したシグナルの平均を計算して、平均シグナルを発生させる工程、
− 第1の波数範囲の平均シグナルに関連した第1の平均値Vw1aを計算する工程、
及び
− 平均値Vaを計算する工程
を含む。
− 1つ以上の部分piの各々について、第1の選択肢における第2の波数範囲に関連した第2の数値Vw2piを計算する工程、
又は
− 各部分piについて発生したシグナルの平均を計算して、平均シグナルを出す工程、
− 第2の選択肢において、第2の波数範囲の平均シグナルに関連した第2の平均値Vw2aを計算する工程
を含む。
本発明による方法は非常に価値ある品質を有する。
本発明者らはさらに、上のプロセスを実施するための新たな装置を設計した。
− サンプルを赤外線放射に供するための場所、
− 1450cm−1〜3000cm−1の波数範囲を有する赤外線放射のビームを提供するための赤外線源、
− それがサンプルを通過した後、2800cm−1から3000cm−1の第1の特定の波数範囲及び1450cm−1から1710cm−1の第2の特定の波数範囲の放射の強度を検出するための検出器、及び
− 検出された強度に関連したシグナルを発生させるための手段
を含む。
Vw1/Vw2比を標準と比較して、生物学的数値Vbを得るための、
− 標準、及び
− 発生したシグナルを処理して計算するためのプロセッサ:
− 特定の第1の波数範囲を使用することによって得られた第1の数値Vw1、
− 特定の第2の波数範囲を使用することによって得られた第2の数値Vw2、及び
− Vw1/Vw2比
を含む。
材料及び方法
患者及び肝臓サンプル
肝臓標本を、Centre de Ressources Biologiques Paris-Sud, Paris-Sud XI University, Franceから入手した。組織サンプルは、27個の肝臓摘出標本の非腫瘍部分から得られた。全ての患者について、1日のアルコール消費量は、男性については30gより少なく、女性については20gより少なかった。B型肝炎ウイルス(HBV)又はC型肝炎ウイルス(HCV)による感染、遺伝性ヘモクロマトーシス、自己免疫肝疾患、ウィルソン病は除外された。通常の病理学的な評価のために、組織をホルマリンで固定し、そして腫瘍から遠い非腫瘍性の肝臓の1つの標本を、液体窒素中で直ちに瞬間凍結させ、そして使用するまで−80℃で保存した。
リピドミクス分析を、プラットフォームMetaToul at IFR150 (Toulouse, France)で実施した。肝臓生検(5〜10mg)を2mlのメタノール/5mM EGTA(2:1v/v)中でFAST−PREP(登録商標)(MP Biochemicals)を用いてホモジナイズした。0.5mgに相当する組織を蒸発させ、乾燥ペレットを0.25mlのNaOH(0.1M)中に一晩かけて溶解し、そしてタンパク質をBio−Radアッセイで測定した。
連続切片は1〜5mmであり、そしてCM3050−Sクライオスタット(Leica Microsystemes SAS, France)を用いて−20℃で4〜6μmの厚さに切断し、そして即時の組織学的制御のためにスライドガラス上に、そしてFTIR顕微分光法のためにmirrlR金コートスライドガラス(Tientascience, Indianapolis, IN)上に交互に沈着させた。
赤外顕微分光法をIN10MX顕微鏡(ThermoFisher scientific)で実施した。
実施例1
肝脂肪症の組織学的推定は、脂質含量とあまり相関していない。
脂肪症の顕著な特徴は、肝細胞内で小胞の形成をもたらすトリアシルグリセロール(TAG)の細胞内蓄積である。それ故、脂肪症の推定は、H&E染色後の組織切片における、脂肪症細胞の数及び脂肪症の小胞のサイズの組織学的検査に基づく。この推定は、脂肪症のレベルを示すと考えられる。しかしながら、脂肪症の組織学的推定と実際の脂質含量との間の相関は研究されていない。脂質含有物は、0〜90%の水準の種々のレベルの大滴性及び小滴性脂肪症を示す27個のヒト肝生検から抽出された。トリグリセリド(TG)は、質量分析計に連結されたガスクロマトグラフィー(GC−MS)を使用してリピドミクス分析によって定量された。脂肪症の比率は、TGの濃度の関数としてプロットされた(図1)。研究は、最初に、大滴性脂肪症に焦点を当てた。脂肪症の組織学的推定と、各患者について隣接生検で得られたTG濃度との間に重要な相違が観察された。例えば、5%などの低脂肪症が、25〜658nmol/mgの水準の非常に幅広い脂質含量に相当すると観察された。また、300〜400nmol/kgなどの所与の濃度のTGについては、脂肪症の推定において巨大なばらつきが観察された。実際に、この範囲のTG濃度ではマクロ脂肪症は5%から40%であると推定された。興味深いことに、5%のマクロ脂肪症を有する最も高い脂質含量を示す患者もまた、75%の高いレベルのミクロ脂肪症を示すと観察され、このことは、ミクロ脂肪症は、劇的に脂質含量に寄与し得ることを実証する。従って、研究はさらに、マクロ及びミクロ脂肪症を合わせた脂肪症の完全な推定に焦点を当てた。また、脂肪症の組織学的推定とTG濃度との間に重要な相違が観察された。
組織切片の脂質含量に直接的に対処できるかは、赤外顕微分光法を使用して調査された。従って、赤外顕微分光法の収集は、種々のレベルの脂肪症を示すヒト肝生検からの組織切片で実施された。連続組織切片を、凍結生検を使用して実施した。HES染色のために使用した組織切片もあり、分光測定実験のために使用した組織切片もあった。IRスペクトルの収集は、50μm×50μmの開口部サイズを使用して1秒間の収集時間を要して実現した。マルチアレイ検出器の使用は、単一の検出器を使用するよりも16倍速い作業を可能とした。この機器構成により、全組織切片を非常に短時間に調べられる。組織切片のサイズは1〜5mmの水準であった。従って、10000個以下のスペクトルに対応する1mm2から5mm2の走査は、常に、10分未満で実施された。
2つの態様の比較
本発明に従って脂質含量を測定するための方法の2つの態様を比較した。
本出願全体を通して、種々の参考文献が、本発明が属する技術分野の最新技術を記載する。これらの参考文献の開示は、本開示への参照により本明細書に組み入れられる。
Claims (15)
- 肝臓における生物学的数値Vbを測定するための方法であって、以下の工程:
a/ 2800cm−1から3000cm−1までの少なくとも第1の波数範囲を有する赤外線放射を、前記肝臓のサンプルの1つ以上の部分piに適用する工程、
b/ 前記放射の強度を、それが1つ以上の部分piの各々を通過した後に検出し、そして検出された強度に関連したシグナルを発生させる工程、
c/ 発生したシグナルを処理して、平均値Vaを、
− 1つ以上の部分piの各々について、第1の波数範囲に関連した第1の数値Vw1piを計算することによって、
又は
− 各々の部分piについて発生したシグナルの平均を計算して、平均シグナルを発生させることによって、
− 第1の波数範囲の平均シグナルに関連した第1の平均値Vw1aを計算することによって、
及び平均値Vaを計算することによって、
計算する工程、
d/ 前記の平均値Vaを標準と比較して、生物学的数値Vbを得る工程
を含む、方法。 - 発生したシグナルを処理して平均値を計算する工程が、
− 1つ以上の部分piの各々について、第1の波数範囲に関連した第1の数値Vw1piを計算する工程、及び
− 平均値Vaを計算する工程
を含む、請求項1記載の方法。 - 発生したシグナルを処理して平均値を計算する工程が、
− 各々の部分piについて発生したシグナルの平均を計算して、平均シグナルを発生させる工程、
− 第1の波数範囲の平均シグナルに関連した第1の平均値Vw1aを計算する工程、
及び平均値Vaを計算する工程
を含む、請求項1記載の方法。 - − 赤外線放射が、1450cm−1から1710cm−1までの第2の波数範囲をさらに有し、そして
− 発生したシグナルを処理して平均値Vaを計算する工程がさらに、
− 1つ以上の部分piの各々について、第2の波数範囲に関連した第2の数値Vw2piを計算する工程、
又は
− 各部分piについて発生したシグナルの平均を計算して、平均シグナルを発生させる工程、
− 第2の波数範囲の平均シグナルに関連した第2の平均値Vw2aを計算する工程
を含み、
そして平均値Vaは、Vw1/Vw2の平均比である、
請求項1〜3のいずれか記載の方法。 - 発生したシグナルを処理して平均値Vaを計算する工程が、
− 1つ以上の部分piの各々について、第2の波数範囲に関連した第2の数値Vw2piを計算する工程
を含む、請求項4記載の方法。 - 発生したシグナルを処理して平均値Vaを計算する工程が、
− 各部分piについて発生したシグナルの平均を計算して、平均シグナルを発生させる工程、
− 第2の波数範囲の平均シグナルに関連した第2の平均値Vw2aを計算する工程
を含む、請求項4記載の方法。 - 第2の波数範囲が1450cm−1から1575cm−1である、請求項1〜6のいずれか記載の方法。
- 第2の波数範囲が1660cm−1から1710cm−1である、請求項1〜6のいずれか記載の方法。
- 脂肪肝をin vitroにおいて診断するための方法であって、以下の工程:
− 請求項1〜8のいずれか記載の方法に従って生物学的数値Vbを測定する工程、及び
− 生物学的数値Vbを閾値と比較する工程
を含み、ここで閾値を超える生物学的数値Vbは脂肪肝を示す、
方法。 - 肝臓の脂肪症のレベルを決定するための方法であって、以下の工程:
− 請求項1〜8のいずれか記載の方法に従って生物学的数値Vbを測定する工程、及び
− 生物学的数値Vbを閾値と比較する工程
を含み、ここで:
− 第1の閾値と第2の閾値の間の生物学的数値Vbは、軽度の脂肪症を示し、
− 第2の閾値と第3の閾値の間の生物学的数値Vbは、中等度の脂肪症を示し、
− 第3の閾値を超える生物学的数値Vbは重度の脂肪症を示す、
方法。 - 脂肪性肝線維症、肝細胞癌又は肝硬変を予後予測するための方法であって、以下の工程: − 請求項1〜8のいずれか記載の方法に従って生物学的数値Vbを測定する工程、及び
− 生物学的数値Vbを閾値と比較する工程
を含み、ここで:
第1の閾値を超える生物学的数値Vbは、脂肪性肝線維症を発症するリスクが高いことを示し、
第2の閾値を超える生物学的数値Vbは、肝細胞癌を発症するリスクが高いことを示し、
第3の閾値を超える生物学的数値Vbは、肝硬変を発症するリスクが高いことを示す、
方法。 - 肝臓が移植されるに適しているかどうかを決定するための方法であって、以下の工程:
− 請求項1〜8のいずれか記載の方法に従って生物学的数値Vbを測定する工程、及び
− 生物学的数値Vbを閾値と比較する工程
を含み、ここで:
− 第1の閾値を下回る生物学的数値Vbは、肝臓が、機能しないというリスクが低く移植するに適切であることを示し、
− 第1の閾値と第2の閾値の間の生物学的数値Vbは、肝臓が、機能しないというリスクが中程度で移植するに適していることを示し、
− 第3の閾値を超える生物学的数値Vbは、肝臓が移植に適していないことを示す、
方法。 - 生物学的数値Vbが脂質のレベルである、請求項1〜12のいずれか記載の方法。
- サンプルの生物学的数値Vbを測定するための装置であって:
− サンプルを赤外線放射に供するための場所、
− 1450cm−1から3000cm−1の波数範囲を有する赤外線放射のビームを提供するための赤外線放射源、
− 2800cm−1から3000cm−1の第1の特定の波数範囲及び1450cm−1から1710cm−1の第2の特定の波数範囲の前記放射の強度を、それがサンプルを通過した後に検出するための検出器、及び
− 検出された強度に関連したシグナルを発生させるための手段
を含む、装置。 - Vw1/VW2比を標準と比較して、生物学的数値Vbを得るための、
− 標準、及び
− 発生したシグナルを処理して
− 特定の第1の波数範囲を使用することによって得られた第1の数値Vw1、
− 特定の第2の波数範囲を使用することによって得られた第2の数値Vw2、及び
− Vw1/Vw2比
を計算するためのプロセッサ
をさらに含む、請求項14記載の装置。
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