JP2014528571A - 肝臓の生物学的数値を測定するための方法 - Google Patents

肝臓の生物学的数値を測定するための方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、肝臓における生物学的数値Ｖｂを測定するための方法に関し、前記方法は、以下の工程：・ａ／２８００cm−１から３０００cm−１までの少なくとも第１の波数範囲を有する赤外線放射を、前記肝臓のサンプルの１つ以上の部分（ｐｉ）に適用する工程、・ｂ／前記放射の強度を、それが１つ以上の部分ｐｉの各々を通過した後に検出し、そして検出された強度に関連したシグナルを発生させる工程、・ｃ／発生したシグナルを処理して、平均値Ｖａを計算する工程、・ｄ／前記の平均値Ｖａを標準と比較して、生物学的数値Ｖｂを得る工程を含む。

Description

発明の分野
本発明は、肝臓の生物学的数値を測定するための方法に関する。
発明の背景
脂肪肝疾患は、アルコール依存症、薬物摂取、小腸バイパス手術又はメタボリック症候群などの幅広い臨床容態を包含し、そしてまた頻繁に慢性Ｃ型肝炎にも関連している。メタボリック症候群における肥満、インシュリン抵抗性、糖尿病、高トリグリセリド血症、動脈性高血圧に関連していることが知られる非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）はおそらく、西洋諸国における慢性肝疾患の最も一般的な原因であろう。脂肪肝疾患はまた、肝移植の潜在的な長期の合併症である。
ＮＡＦＬＤの臨床学的組織学的範囲は、非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）及び脂肪性肝線維症を含む。臨床シリーズ、剖検、及び母集団の便宜的サンプルから得られた見積りは、西洋諸国の３０％に上る個体がＮＡＦＬＤを有し得ることを示唆する（Neuschwander-Tetri, 2003, Torres, 2008）。ＮＡＳＨに、母集団の５％〜７％が患っていると推定されている。ＮＡＳＨは、１５％に上る患者において肝硬変へと進行し得、肝不全及び肝細胞癌へと進行する潜在的なリスクを有する。従って、ＮＡＦＬＤは現在、西洋諸国において肝硬変の主要な原因として認識されている。
一方、脂肪症は可逆性であり、そしてその単純型では無害であると現在考えられているが、単純性脂肪症を有する何人かの患者はＮＡＳＨへと進行し得（Wong, 2010）、そして最も重要には、ＮＡＳＨを有する何人かの患者はまた、肝硬変の段階を迂回して肝細胞癌へと進行し得る。
脂肪症から脂肪性肝炎への発展に関与する機序は完全に解明されておらず、これにより個体レベルで疾患の予後を予測することは妨げられている。
ＮＡＦＬＤの公衆衛生上の大きな懸念にも関わらず、脂肪症の段階で留まっている患者から、ＮＡＳＨ及び線維症へと進行するであろう患者を初期の段階で同定することは現在不可能である。
従って、特に脂肪症のレベルを同定し、そして脂肪症が脂肪性肝炎へと発展するかどうかを予測するための、脂肪肝疾患における診断マーカー及び予後予測マーカーが緊急に必要とされる。
脂肪症のレベルの定量はまた、肝移植（ＬＴ）における主要な問題でもある。
実際に、主に移植片の品質が悪いために、特に脂肪症の存在のために、移植片が主に機能しない、又は移植片が遅延して機能する、かなりの数の肝移植の症例が存在する。
脂肪症は、肝同種移植片の機能に影響を及ぼす最も重要な因子の１つである。脂肪症は肝移植後に数週間以内に退行し得るが、早期の機能回復及び再生能は、大抵はより重度な虚血再灌流障害のために、脂肪症同種移植片では有意に損なわれている。
移植片の脂肪症は、初期の移植片の機能不全の原因であるだけでなく、長期におよぶ移植片のより不良な進展の原因でもある。ＨＣＶ肝硬変のために移植された患者では、移植片の生着率は、ドナー肝脂肪症に対して反比例し（脂肪症の非存在下ではＯＬＴから３年後に７２％に対して、中等度の脂肪症を有する場合では４３％）、そしてＨＣＶの再発は、中等度及び重度の脂肪症を有する肝臓のレシピエントにおいてはより頻繁でありより早期である。線維症の進展は、移植片の脂肪症が３０％より高い場合にはより高くなる（Briceno, 2009）。問題は、移植片の品質をコントロールするための客観的で定量可能なマーカーが存在しないことである。ドナーからの肝臓に対して実施された唯一のコントロールは、凍結切片の検査に基づく。組織学的切片における脂肪症のレベルの評価は、観察者に強く依存し、そして再現性のあるものではない（El Badry, 2009）。
肝移植の主な限界は移植片の不足であるため、脂肪症の定量はさらに一層重要である。この状況により、移植チームは、基準の拡大されたドナーから辺縁の移植片を使用した。これらの拡大された基準の１つは、脂肪症の存在である。
中等度の脂肪症（３０％〜６０％）を有する移植片の使用は、依然として困難な問題である。この群においては、主に機能しないという発生率は１５％に達し得、そして移植片の機能の遅延の割合は３５％に近い。拡大された基準の組合せのために、脂肪症の程度についての肝生検による定量は、できる限り正確であるべきである。
また、移植片の不足により、死亡したばかりの心停止ドナーから得られた臓器が使用される。心停止ドナーからの肝移植は、特定の標準化された戦略を意味する。近年、肝摘出及び心停止ドナーから移植の具体的なプロトコールが、Agency of the Biomedicineによって再結成されたフランス人移植医師によって起草された。このプロトコールでは、重要な基準、すなわち特に２０％未満の脂肪症を示す肝臓を選択することが推奨される生検の系統的で組織学的な検査が示唆された。この劇的な推奨は、通常の組織学的方法が、偏りのない脂肪症の評価を厳密に提供することができないことと対照的である。
実際に、今日、肝移植の前に移植片の品質を評価するために使用される通常の組織学的方法は単に定性的である。それらは、医師による脂肪封入物を含む肝細胞の組織切片の光学的評価に基づく。El Badry et al. (2009)は、この評価が、医師の解釈に非常に依存し、それ故に主観的であることを示した。
さらに、この定性的アプローチは、ミクロ脂肪症の場合には、液胞の極めて小さなサイズは医師による検出が困難であるために適していない。
肝臓の脂肪症を定量的かつ客観的に評価する唯一の信頼できる方法は、移植片のサンプルから脂質を化学的に抽出し、そして質量分析計に連結させたガスクロマトグラフィーによって脂質の含量を定量することである（Rebouissou et al., 2007）。この方法は約２日間要するために長い。そのため、移植片へと進めるかどうかの外科医の決断を、肝移植片に由来する肝生検が組織学的検査のために病理学科に到着した時刻から最大１５分以内に下さなければならない、肝移植の場合には不適切である。
発明の要約
今回、出願人は、赤外線放射の使用が、肝臓における生物学的数値の定量的及び客観的評価を可能としたことを発見した。この評価は、この肝臓の、特にその移植能の迅速かつ信頼性のある診断を可能とする。
より正確には、本発明者らは、特定の波数範囲での肝臓のサンプルの赤外線シグナルは、肝臓の組成の生物学的数値を定量的に与えることができ、これにより、肝臓に関する正確で定量的なデータが得られ、従って、臨床的に関連性のある迅速な診断がなされることを発見した。
それ故、本発明の主題は、肝臓における生物学的数値Ｖｂを測定するための方法であり、前記方法は、以下の工程：
ａ／ ２８００cm−１から３０００cm−１までの少なくとも第１の波数範囲を有する赤外線放射を、前記肝臓のサンプルの１つ以上の部分ｐｉに適用する工程、
ｂ／ 前記放射の強度を、それが１つ以上の部分ｐｉの各々を通過した後に検出し、そして検出された強度に関連したシグナルを発生させる工程、
ｃ／ 発生したシグナルを処理して、平均値Ｖａを、
− １つ以上の部分ｐｉの各々について、第１の波数範囲に関連した第１の数値Ｖｗ１ｐｉを計算することによって、
又は
− 各々の部分ｐｉについて発生したシグナルの平均を計算して、平均シグナルを発生させることによって、
− 第１の波数範囲の平均シグナルに関連した第１の平均値Ｖｗ１ａを計算することによって、
及び平均値Ｖａを計算することによって、
計算する工程、
ｄ／ 前記の平均値Ｖａを標準と比較して、生物学的数値Ｖｂを得る工程
を含む。
本発明はまた、脂肪肝をin vitroにおいて診断するための方法に関し、前記方法は、以下の工程：
− 本発明の方法に従って生物学的数値Ｖｂを測定する工程、及び
− 生物学的数値Ｖｂを閾値と比較する工程
を含み、
ここで閾値を超える生物学的数値Ｖｂは、脂肪肝を示す。
本発明はまた、肝臓の脂肪症のレベルを決定するための方法であって、以下の工程：
− 本発明の方法に従って生物学的数値Ｖｂを測定する工程、及び
− 生物学的数値Ｖｂを閾値と比較する工程
を含み、ここで：
− 第１の閾値と第２の閾値との間の生物学的数値Ｖｂは、軽度の脂肪症を示し、
− 第２の閾値と第３の閾値との間の生物学的数値Ｖｂは、中等度の脂肪症を示し、
− 第３の閾値を超える生物学的数値Ｖｂは、重度の脂肪症を示す、
方法に関する。
好ましくは、第１の閾値は第２の閾値より低く、そして第２の閾値は第３の閾値より低い。
本発明はまた、脂肪性肝線維症、肝細胞癌又は肝硬変を予後予測するための方法であって、以下の工程：
− 本発明の方法に従って生物学的数値Ｖｂを測定する工程、及び
− 生物学的数値Ｖｂを閾値と比較する工程
を含み、
第１の閾値を超える生物学的数値Ｖｂは、脂肪性肝線維症を発症するリスクが高いことを示し、
第２の閾値を超える生物学的数値Ｖｂは、肝細胞癌を発症するリスクが高いことを示し、
第３の閾値を超える生物学的数値Ｖｂは、肝硬変を発症するリスクが高いことを示す、
方法に関する。
本発明はまた、肝臓が移植されるに適しているかどうかを決定するための方法であって、以下の工程：
− 本発明の方法に従って生物学的数値Ｖｂを測定する工程、及び
− 生物学的数値Ｖｂを閾値と比較する工程
を含み、
− 第１の閾値を下回る生物学的数値Ｖｂは、肝臓が、機能しないというリスクが低く移植するに適切であることを示し、
− 第１の閾値と第２の閾値の間の生物学的数値Ｖｂは、肝臓が、機能しないというリスクが中程度で移植するに適していることを示し、
− 第３の閾値を超える生物学的数値Ｖｂは、肝臓が移植に適していないことを示す、
方法に関する。
好ましくは、第１の閾値は、第２の閾値より低く、そして第２の閾値は第３の閾値より低いか又は等しい。
本発明はまた、サンプルの生物学的数値Ｖｂを測定するための装置であって：
− サンプルを赤外線放射に供するための場所、
− ２８００cm−１から３０００cm−１の第１の特定の波数範囲及び１４５０cm−１から１７１０cm−１の第２の特定の波数範囲を有する赤外線放射のビームを提供するための赤外線放射源
− それがサンプルを通過した後に第１及び第２の特定の波数範囲の放射の強度を検出するための検出器、及び
− 検出された強度に関連したシグナルを発生させるための手段
を含む、サンプルの生物学的数値Ｖｂを測定するための装置に関する。
発明の詳細な説明
本発明の方法
本発明は、肝臓における生物学的数値Ｖｂを測定するための方法であって、以下の工程：
ａ／ ２８００cm−１から３０００cm−１までの少なくとも第１の波数範囲を有する赤外線放射を、前記肝臓のサンプルの１つ以上の部分ｐｉに適用する工程、
ｂ／ 前記放射の強度を、それが１つ以上の部分ｐｉの各々を通過した後に検出し、そして検出された強度に関連したシグナルを発生させる工程、
ｃ／ 発生したシグナルを処理して、平均値Ｖａを、
− １つ以上の部分ｐｉの各々について、第１の波数範囲に関連した第１の数値Ｖｗ１ｐｉを計算することによって、
又は
− 各々の部分ｐｉについて発生したシグナルの平均を計算して、平均シグナルを発生させることによって、
− 第１の波数範囲の平均シグナルに関連した第１の平均値Ｖｗ１ａを計算することによって、
及び平均値Ｖａを計算することによって、
計算する工程
ｄ／ 前記の平均値Ｖａを標準と比較して、生物学的数値Ｖｂを得る工程
を含む、方法に関する。
肝臓のサンプル
本発明の方法に使用される肝臓は、in vivoの肝臓又はex vivoの肝臓又は肝臓の一部であり得る。
肝臓は、動物から、特に哺乳動物から、例えば移植されるために取り出され得る。肝臓は好ましくはヒトの肝臓である。
サンプルは、肝臓の生検から提供され得る。
サンプルは、移植片の保存のための標準的な溶液中に、例えばウィスコンシン大学溶液中に保存され得る。
サンプルは好ましくは顕微鏡切片作製法によって調製することができる。
サンプルは固体サンプルであり、より好ましくは組織凍結切片であることが際立っている。
例えば、２０〜１００μm厚のフィルムが、サンプルを凍結することによって得られた肝臓の固体サンプルから調製される。
サンプルは、好ましくは１mm×１mmから５mm×５mm、より好ましくは３mm×３mmから５mm×５mm、最も好ましくは５mm×５mmのサイズ、及び２μm〜１０μm、より好ましくは４μm〜６μmの厚さを有する。
サンプルは直ちに使用されても、又は使用まで保存されていてもよい。
好ましくは、赤外分光光度計に入れられる前に、サンプルを室温で数分間乾燥する。
方法は非破壊的である。従って、サンプルはさらなる染色、免疫標識、分光測定法又は質量分析に使用することができる。
さらに、サンプルは不均一であってもよい。
例えば、測定しようとする生物学的数値が脂質のレベルである場合、脂質はサンプル全体に均一に分布していなくてもよい。
さらに、一旦生検が実施されると、サンプルを室温で僅か数分で調製することができる。
赤外分光法及びデータ処理
サンプルを赤外分光光度計に入れる。
本発明の方法に使用され得る赤外分光光度計は、例えばBruker Optics, Perkin Elmer, Thermo Scientific, Varian-Agilentから市販されている任意の赤外分光光度計であり得る。
特に、赤外分光光度計はＦＴＩＲ分光光度計であり得る。
本発明の方法を実施するためのサンプルは、通常ピクセルと呼ばれる１つ以上の部分に分けられる。
各部分は、赤外線放射が適用される領域に対応する。好ましい態様において、サンプルは同じサイズを有する部分に完全に分けられる。
各部分は、好ましくは２０μm×２０μmから１０００μm×１０００μm、より好ましくは５０μm×５０μmから５００μm×５００μm、最も好ましくは約５０μm×５０μmである。
部分の数及びサイズの選択は、所望の収集時間に依存する。
例えば、１００μm×１００μmの部分に分けられたサンプルは、５０μm×５０μmの部分へと分けられた同じサンプルよりも４倍速く分析されるだろう。
赤外線放射は第１の部分に適用される。
赤外線放射は、２８００cm−１から３０００cm−１までの第１の波数範囲を有する。
波数が言及されているが、等価な波長に言及してもよい。
例えば、２８００〜３０００cm−１及び１４５０〜１７１０cm−１の波数範囲は、それぞれ、３．５７〜３．３３μm及び６．８９〜５．８５μmの波長に対応する。
第１の部分を通過した後の放射の強度を検出し、そして検出された強度に関連したシグナルを発生させる。
例えば、シグナルは、波数に関する吸光度に対応するスペクトルであり得る。
第１の代替選択肢において、発生したシグナルを処理して平均値を計算する工程は、１つ以上の部分ｐｉの各々について、第１の波数範囲に関連した第１の数値Ｖｗ１ｐｉを計算する工程、及び平均値Ｖａを計算する工程を含む。
その後、シグナルを処理して、第１部分についての第１の数値（Ｖｗ１ｐｉ）を計算する。１つの特定の振動バンドの積分強度は、サンプルを通るＩＲビームの正確な経路が知られている限り、プローブ種の量に比例する（Beer-Lamber law in J. D. J. Ingle and S. R. Crouch, Spectrochemical Analysis, Prentice Hall, New Jersey (1988)）。
従って、各部分ｐｉについての第１の数値Ｖｗ１ｐｉの計算は、第１の波数範囲に対応するバンドの強度を積分し、これにより第１の波数範囲のスペクトルのピーク面積を決定することによって実施され得る。
強度及びピーク面積の測定は、基準に関連し得る。
サンプルの第１の部分に実施された工程は、サンプルの全ての他の部分に同じように繰り返され、これにより、各部分ｐｉについての１つの第１の数値Ｖｗ１ｐｉが計算される。
その後、サンプルの平均値Ｖａを、全ての部分の第１の数値に基づいて計算し得る。
好ましくは、全ての部分は同じサイズを有する。
好ましくは、異常値に対応する第１の数値Ｖｗ１ｐｉは除外される（生検中の人為現象、血管、肝臓傷害）。
従って、残りの第１の数値Ｖｗ１ｐｉの平均値を計算する。
この第１の代替選択肢の１つの態様において、ＶａはＶｗ１ｐｉの平均、又は正規化された（異常値のＶｗ１ｐｉが除外されている又はされていない）Ｖｗ１ｐｉの平均に等しくあり得る。
この平均値Ｖａを標準と比較して、生物学的数値Ｖｂを得る。
標準は、１つの数値、１セットの数値、標準曲線又は検量曲線であり得る。
好ましくは、標準は標準曲線又は検量曲線である。
例えば、生物学的数値Ｖｂが脂質のレベルである場合、標準は、これらの対照サンプルの抽出分析及び定量分析（例えばガスクロマトグラフィー−質量分析を使用して）によって得られた脂質の濃度に関する対照サンプルの平均値Ｖａの標準曲線である。
第２の代替選択肢において、発生したシグナルを処理して平均値Ｖａを計算する工程は、以下の工程
− 各部分ｐｉについての発生したシグナルの平均を計算して、平均シグナルを発生させる工程、
− 第１の波数範囲の平均シグナルに関連した第１の平均値Ｖｗ１ａを計算する工程、
及び
− 平均値Ｖａを計算する工程
を含む。
各部分ｐｉについての発生したシグナルを相加して、全シグナルを出し、これを部分の数で割る。
好ましくは、異常値に対応するｐｉについての発生したシグナルを除外する（生検中の人為現象、血管、肝臓傷害）。
その後、平均シグナルを処理して、第１の波数範囲の平均シグナルに関連した平均値Ｖｗ１ａを計算する。
平均シグナルの処理は、部分ｐｉの１つのシグナルについて実行されたのと同じ方法で実施される。
従って、平均シグナルについて、第１の波数範囲に対応するバンドの強度は、これにより、第１の波数範囲のスペクトルのピークの面積を決定する。
その後、サンプルの平均値Ｖａを、第１の波数範囲Ｖｗ１ａの平均値に基づいて計算し得る。
この代替選択肢は、計算の数を減らし、そして生物学的数値をより速く測定することを可能とする。
本発明の実施の好ましい条件において、赤外線放射は、１４５０cm−１〜１７１０cm−１の第２の波数範囲をさらに有する。
これらの好ましい条件において、発生したシグナルを処理して平均値Ｖａを計算する工程は、さらに、以下の工程：
− １つ以上の部分ｐｉの各々について、第１の選択肢における第２の波数範囲に関連した第２の数値Ｖｗ２ｐｉを計算する工程、
又は
− 各部分ｐｉについて発生したシグナルの平均を計算して、平均シグナルを出す工程、
− 第２の選択肢において、第２の波数範囲の平均シグナルに関連した第２の平均値Ｖｗ２ａを計算する工程
を含む。
平均値ＶａはＶｗ１／Ｖｗ２の平均比である。
第１の代替選択肢における第２の数値Ｖｗ２ｐｉの計算は、第１の波数範囲の第１の数値Ｖｗ１ｐｉのために実施したのと同じ方法で第２の波数範囲において実施される。
従って、各部分ｐｉについての第２の数値Ｖｗ２ｐｉの計算は、第２の波数範囲に対応するバンドの強度を積分し、これにより第２の波数範囲のスペクトルのピーク面積を決定することによって実施され得る。
その後、これらの好ましい条件において、Ｖｗ１／Ｖｗ２の平均比を計算する。
１つの態様において、Ｖｗ１／Ｖｗ２の平均比は、サンプルの各部分ｐｉについて計算された個々のＶｗ１ｐｉ／Ｖｗ２ｐｉの比の算術平均である。
あるいは、別の態様において、平均比は、第１の平均値（サンプルの各部分ｐｉについての個々のＶｗ１ｐｉの算術平均）を第２の平均値（サンプルの個々のＶｗ２ｐｉの算術平均）で割ることによって計算される。
第２の代替選択肢において、第２の平均値Ｖｗ２ａの計算は、第１の波数範囲の第１の平均値Ｖｗ１ａについて実行されたのと同じ方法で第２の波数範囲において実施される。
その後、これらの好ましい条件において、Ｖｗ１／Ｖｗ２の平均比が計算される。この第２の代替選択肢において、Ｖｗ１／Ｖｗ２の平均比はＶｗ１ａ／Ｖｗ２ａ比である。
１つの態様において、第２の波数範囲は１４５０〜１５７５cm−１である。この波数範囲はアミドＩＩに関連する。
別の態様において、第２の波数範囲は１６６０cm−１〜１７１０cm−１である。この波数範囲はアミドＩに関連する。
別の態様において、第２の波数範囲は、１６６０cm−１から１７１０cm−１と共に、１４５０cm−１から１５７５cm−１である。１つの態様において、生物学的数値Ｖｂは脂質のレベルであり、そして好ましくはトリグリセリドのレベルである。
実際に、この理論によって固めたくはないが、２８００cm−１から３０００cm−１の波数範囲は、化学官能基−ＣＨ３及び−ＣＨ２に割り当てられ、これは脂質の長炭素鎖の寄与に主に関連する。
従って、この波数でのサンプルの分析は、サンプルの脂質レベル、特にトリグリセリドのレベルの測定を可能とする。
本発明者らは、この波数範囲は、脂質レベル、特にトリグリセリドレベルの測定に特に関連していることを示した。実際に、本発明者らは、この波数範囲での赤外線分析に基づいて計算されたサンプルの平均値は、脂質の抽出及びクロマトグラフィーアッセイによって測定されたこのサンプルの脂質レベルと、実験章で証明された非常に良好な相関係数で直接的に相関していることを示した。
さらに、本発明の方法は、高い塩分を有するサンプルの使用を可能とする。
肝疾患の診断又は予後
本発明による方法は非常に価値ある品質を有する。
それらは、脂質レベル、より特定するとトリグリセリドレベルなどの肝臓の生物学的数値Ｖｂの評価を可能とする。
それ故、それらは、特に数多くの肝疾患を診断又は予後予測するために使用され得る。
特に、本発明の方法は、脂肪肝をin vitroで診断するために使用され得る。
この目的を達成するために、肝臓の生物学的数値Ｖｂ、好ましくは脂質レベルは、本発明に従って測定され、そしてそれは閾値と比較される。
閾値より高い生物学的数値Ｖｂは、脂肪肝を示す。脂肪肝は、好ましくは、脂肪症の肝臓、例えばＮＡＳＨを有する肝臓、脂肪性肝線維症を有する肝臓、肝細胞癌及び肝硬変を有する肝臓である。
本発明の方法はまた、肝臓の脂肪症のレベルを決定するために使用され得る。
この目的を達成するために、肝臓の生物学的数値Ｖｂ、好ましくは脂質のレベルは、本発明に従って測定され、そしてそれを標準と比較する。
標準は、脂肪症の肝臓の生検から測定された脂質の濃度、特にトリグリセリドの濃度であり得る。
標準はまた、肝移植片の生検から測定された脂質の濃度、特にトリグリセリドの濃度であり得る。
それから、生物学的数値Ｖｂ、好ましくは脂質のレベルを、いくつかの閾値と比較し、そして第１の閾値と第２の閾値との間の生物学的数値Ｖｂは軽度の脂肪症を示し、第２の閾値と第３の閾値との間の生物学的数値Ｖｂは中等度の脂肪症を示し、第３の閾値を上回る生物学的数値Ｖｂは重度の脂肪症を示す。
本発明による方法の別の使用は、脂肪性肝線維症、肝細胞癌又は肝硬変を予後予測するためである。
この目的を達成するために、肝臓の生物学的数値Ｖｂ、好ましくは脂質のレベルは、本発明に従って測定され、そしてそれを閾値と比較する。
第１の閾値を超える生物学的数値Ｖｂは、脂肪性肝線維症を発症するリスクが高いことを示す。
第２の閾値を超える生物学的数値Ｖｂは、肝細胞癌を発症するリスクが高いことを示す。
第３の閾値を超える生物学的数値Ｖｂは、肝硬変を発症するリスクが高いことを示す。
本発明による方法はまた、肝臓が移植するに適しているかどうかを決定するために使用され得る。
この目的を達成するために、提供されたサンプルは肝移植片のサンプルであり、そして肝臓の生物学的数値Ｖｂ、好ましくは脂質のレベルは、本発明に従って測定され、そしてそれを閾値と比較する。
第１の閾値を下回る生物学的数値Ｖｂは、肝臓が、機能しないというリスクが低く移植するに適切であることを示す。
第１の閾値と第２の閾値の間の生物学的数値Ｖｂは、肝臓が、機能しないというリスクが中程度で移植するに適していることを示す。
第３の閾値を超える生物学的数値Ｖｂは、肝臓が移植に適していないことを示す。
６０％を上回る脂肪症レベルを有する肝臓は、移植するのに適していない。
３０％〜６０％の脂肪症レベルを有する肝臓は、移植するのに適しているが、機能しないというリスクを提示する。
３０％を下回る脂肪症レベルを有する肝臓は、移植に適し、そして機能しないというリスクが低い。
これらの種々の適用のために、本発明の方法は、組織学的方法又は定性分光測定法などの定性法と合わせて、より完全な診断又は予後予測を提供することができる。
本発明による生物学的数値Ｖｂの評価は、定量的で客観的であり、そして医師の解釈に依存しない。本発明の方法は迅速である。それは生物学的数値Ｖｂを測定するのに１５分間未満しかかからず、それに対し化合物の抽出及びクロマトグラフィーによる分析による生物学的数値Ｖｂの測定には２日間かかり得る。
肝臓が移植するに適しているかどうかを決定する迅速性は重要である。実際に、ドナーからの肝移植片は僅か１５時間しか利用できない。この期間には、輸送及び調製の時間も含まれる。それ故、肝臓を移植する決断は、非常に迅速に行わなければならない。それは病院においてさえ実行するのが容易であり、そして高価ではない。従来のＩＲ分光測定器を使用することもできる。
前記方法は、移植片を調製するための条件、特に保存液の塩分濃度に適合している。
本発明の方法は非常に感度が高い。
この方法の感度は、約１０−４Ｍ又は１０−１２ｇの分子である。
本発明による方法の波数範囲では、僅かな分散しかなく、これは近赤外線分光測定法のような他の波数範囲とは対照的である。
さらに、多くの化学官能基の組合せも全くない。
本発明者らは、脂肪症のレベルは、脂肪症のレベルが高い又は低いかどうか、本発明の方法に従って測定された生物学的数値Ｖｂとよく相関していることを示した。
ミクロ脂肪症における液胞のサイズが小さいために、ミクロ脂肪症は、組織学的方法を用いては悪いと診断されないことが多い。
本発明の方法は定量的方法であるため、結果は液胞のサイズに依存しない。
従って、前記方法は、大きな液胞を示すマクロ脂肪症の場合、並びに、ミクロ脂肪症の場合によく適応している。
さらに、１４５０cm−１〜１７１０cm−１の波数範囲は、タンパク質中のアミド、特にペプチド結合の振動に対応するアミドＩ及びアミドＩＩのエネルギードメインに割り当てられ、そして結果として、タンパク質のレベルに関連している。
本発明者らは、脂質に関連した第１の数値／タンパク質の関連した第２の数値の比の計算により、強度が正規化され、従って、サンプル厚の局所的ばらつきに関連したばらつきが回避されることを示した。
本発明の装置
本発明者らはさらに、上のプロセスを実施するための新たな装置を設計した。
それ故、本発明はまた、サンプルの生物学的数値Ｖｂを測定するための装置に関し、これは
− サンプルを赤外線放射に供するための場所、
− １４５０cm−１〜３０００cm−１の波数範囲を有する赤外線放射のビームを提供するための赤外線源、
− それがサンプルを通過した後、２８００cm−１から３０００cm−１の第１の特定の波数範囲及び１４５０cm−１から１７１０cm−１の第２の特定の波数範囲の放射の強度を検出するための検出器、及び
− 検出された強度に関連したシグナルを発生させるための手段
を含む。
サンプルを赤外線放射に供するための場所は、固体サンプルに適している。
１つの態様において、サンプルを赤外線放射に供するための場所はさらに、サンプルに放射が行なわれる領域を調整するためのマスクを含む。
この態様において、好ましくは、１回のみの放射がマスクされていない領域に与えられるので、対象の２つの周波数領域について１回のみ収集される。
あるいは、赤外線は、第１の特定の波数範囲及び第２の特定の波数範囲に制限される。
１つの態様において、特定の第２の波数範囲は１４５０cm−１から１５７５cm−１である。
別の態様において、第２の波数範囲は１６６０cm−１から１７１０cm−１である。
別の態様において、第２の波数範囲は、１６６０cm−１から１７１０cm−１と共に、１４５０cm−１から１５７５cm−１である。
赤外線を特定の波数範囲に限定することは、バンドバスフィルタにより行なうことができる。
検出器は、例えば、マルチチャネル検出器、液体窒素で冷却された検出器又は室温検出器であり得る。
本発明の装置はさらに、干渉計を含み得る。
本発明による装置は、特定の制限された波数だけを使用し、全ての赤外線波数範囲を使用しない。従って、より生産が容易になり、より安価である。
干渉計を使用する場合、生産がより容易であり、より安価である、小さな干渉計が必要とされるだけである。
本発明を実施するために好ましい条件下では、本発明による装置はさらに：
Ｖｗ１／Ｖｗ２比を標準と比較して、生物学的数値Ｖｂを得るための、
− 標準、及び
− 発生したシグナルを処理して計算するためのプロセッサ：
− 特定の第１の波数範囲を使用することによって得られた第１の数値Ｖｗ１、
− 特定の第２の波数範囲を使用することによって得られた第２の数値Ｖｗ２、及び
− Ｖｗ１／Ｖｗ２比
を含む。
好ましい態様において、本発明の装置は、巨視的分析に適している。
通常のＩＲ装置は巨視的分析に適している。この目的のために、これらの装置を顕微鏡に連結させて、対象の特定の領域を標的化する。一般的に、この領域は形態学的基準に応答する。これらの装置は、サンプル全体を分析せず、微視的な部分のみを分析する。
本発明者らは、驚くべきことに、本発明の方法のお陰で、サンプルの分析を巨視的レベルで実施し得、そしてサンプルの生物学的数値を定量的に測定することを可能とするのがこの巨視的分析であることを発見した。
この態様において、本発明の装置は顕微鏡に連結していない。
専用の反射セットアップを任意の市販のフーリエ変換分光光度計に挿入する。
さらに、装置は、１００μm×１００μmから１mm×１mm、より好ましくは５００μm×５００μmから１mm×１mm、最も好ましくは１mm×１mmのサイズを有するマクロビームと呼ばれるビームを含み得る。
マクロビームは、必要な開口部によって制限され得る。
サンプル操作はより簡単となり、そして顕微鏡モードでの数分間ではなく数秒間しかかからないようになるだろう。サンプルは、サンプルホールダーである金属でコーティングされたスライドガラス上に沈着させる必要がある。
シグナルの全ての処理は装置によって実施されるので、あらゆる資格のない個人による操作は容易である。
装置はまた、プロセッサによって計算された数値及び標準値などの記憶装置を含み得る。
従って、装置は、サンプルの一部分についての第１の数値及び第２の数値を記憶し得、その後、プロセッサはこれらの数値を使用して、平均値を計算し得る。
本発明は以下の図面及び実施例によってさらに説明されるだろう。
図１は、種々のサンプルの脂肪症及び脂質含量の組織学的推定を示す。ＨＥＳ後の染色された組織切片において推定された脂肪症を、トリグリセリド（ＴＧ）濃度の関数としてプロットした。Ａ）大滴性脂肪症。Ｂ）大滴性及び小滴性脂肪症。 図１は、種々のサンプルの脂肪症及び脂質含量の組織学的推定を示す。ＨＥＳ後の染色された組織切片において推定された脂肪症を、トリグリセリド（ＴＧ）濃度の関数としてプロットした。Ａ）大滴性脂肪症。Ｂ）大滴性及び小滴性脂肪症。 図２は、[（２８００〜３１００）／（１４８５〜１５９５）]によるＩＲスペクトルを示す。 図３は、種々のサンプルについてＴＧの濃度の関数としてプロットされたＩＲスペクトルから計算された脂質／タンパク質の比を示す。得られた曲線は標準として使用され得る。 図４は、「平均率」（ＡＲ）法と「平均スペクトル」（ＡＳ）法との間の比較を示す。
実施例
材料及び方法
患者及び肝臓サンプル
肝臓標本を、Centre de Ressources Biologiques Paris-Sud, Paris-Sud XI University, Franceから入手した。組織サンプルは、２７個の肝臓摘出標本の非腫瘍部分から得られた。全ての患者について、１日のアルコール消費量は、男性については３０ｇより少なく、女性については２０ｇより少なかった。Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）又はＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）による感染、遺伝性ヘモクロマトーシス、自己免疫肝疾患、ウィルソン病は除外された。通常の病理学的な評価のために、組織をホルマリンで固定し、そして腫瘍から遠い非腫瘍性の肝臓の１つの標本を、液体窒素中で直ちに瞬間凍結させ、そして使用するまで−８０℃で保存した。
６人の患者については、肝臓は組織学的に正常であった。２１人の他の患者については、顕微鏡分析により、肝細胞の風船化も実質炎症も類洞周囲肝線維症もマロリー・ヒアリンも全く伴うことのない、軽度の大滴性及び小滴性脂肪症が判明した。
赤外線分光法による評価のために、生検を液体窒素中で直ちに凍結させ、そして−８０℃で保存した。
脂質のプロファイリング
リピドミクス分析を、プラットフォームMetaToul at IFR150 (Toulouse, France)で実施した。肝臓生検（５〜１０mg）を２mlのメタノール／５mM ＥＧＴＡ（２：１ｖ／ｖ）中でＦＡＳＴ−ＰＲＥＰ（登録商標）（MP Biochemicals）を用いてホモジナイズした。０．５mgに相当する組織を蒸発させ、乾燥ペレットを０．２５mlのＮａＯＨ（０．１Ｍ）中に一晩かけて溶解し、そしてタンパク質をＢｉｏ−Ｒａｄアッセイで測定した。
トリグリセリド（ＴＧ）アッセイを、Rebouissou et al., 2007に記載の通りに実施した。簡潔に言えば、１mgに相当する組織に対応する脂質を、内部標準として１５μgのグリセリルトリヘプタデカノエートの存在下、ジクロロメタン／メタノール／水（２．５：２．５：２．１、ｖ／ｖ／ｖ）（Bligh及びDyer, 1959）中でBligh及びDyerに従って抽出した。ジクロロメタン相を蒸発して乾燥させ、そして２０μlの酢酸エチルに溶解した。１μlの脂質抽出物を、ガス液体クロマトグラフィーによって、ＦＯＣＵＳ Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎシステムで、ゼブロン−１Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）に取り付けたシリカキャピラリーカラム（５ｍ×０．３２mmの内径、０．５μmのフィルム厚）（Barrans et al., 1994）を使用して分析した。オーブン温度は、１分あたり５℃の割合で２００℃〜３５０℃までにプログラミングされ、そしてキャリアガスは水素であった（０．５バール）。インジェクター及び検出器はそれぞれ３１５℃及び３４５℃であった。
組織切片
連続切片は１〜５mmであり、そしてＣＭ３０５０−Ｓクライオスタット（Leica Microsystemes SAS, France）を用いて−２０℃で４〜６μmの厚さに切断し、そして即時の組織学的制御のためにスライドガラス上に、そしてＦＴＩＲ顕微分光法のためにｍｉｒｒｌＲ金コートスライドガラス（Tientascience, Indianapolis, IN）上に交互に沈着させた。
組織学的検査のための切片を、ヘマトキシリンエオシンサフラン（ＨＥＳ）を用いて染色した。ＦＴＩＲ顕微分光法のための切片を、室温で数分間乾燥させた。
ＦＴＩＲ顕微分光法及びデータ処理
赤外顕微分光法をＩＮ１０ＭＸ顕微鏡（ThermoFisher scientific）で実施した。
全てのスペクトルを、５０μm×５０μmの開口部を使用して超高速モードによって収集した。
スペクトルを、１ピクセルあたり１スペクトルで、１６cm−１の解像度で４０００〜８００cm−１の中赤外域で収集した。
ＩＲスペクトル及び化学画像のデータ分析を、ＯＭＮＩＣソフトウェア（登録商標）（ThermoFisher scientific）を使用して実施した。
結果
実施例１
肝脂肪症の組織学的推定は、脂質含量とあまり相関していない。
脂肪症の顕著な特徴は、肝細胞内で小胞の形成をもたらすトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の細胞内蓄積である。それ故、脂肪症の推定は、Ｈ＆Ｅ染色後の組織切片における、脂肪症細胞の数及び脂肪症の小胞のサイズの組織学的検査に基づく。この推定は、脂肪症のレベルを示すと考えられる。しかしながら、脂肪症の組織学的推定と実際の脂質含量との間の相関は研究されていない。脂質含有物は、０〜９０％の水準の種々のレベルの大滴性及び小滴性脂肪症を示す２７個のヒト肝生検から抽出された。トリグリセリド（ＴＧ）は、質量分析計に連結されたガスクロマトグラフィー（ＧＣ−ＭＳ）を使用してリピドミクス分析によって定量された。脂肪症の比率は、ＴＧの濃度の関数としてプロットされた（図１）。研究は、最初に、大滴性脂肪症に焦点を当てた。脂肪症の組織学的推定と、各患者について隣接生検で得られたＴＧ濃度との間に重要な相違が観察された。例えば、５％などの低脂肪症が、２５〜６５８nmol/mgの水準の非常に幅広い脂質含量に相当すると観察された。また、３００〜４００nmol/kgなどの所与の濃度のＴＧについては、脂肪症の推定において巨大なばらつきが観察された。実際に、この範囲のＴＧ濃度ではマクロ脂肪症は５％から４０％であると推定された。興味深いことに、５％のマクロ脂肪症を有する最も高い脂質含量を示す患者もまた、７５％の高いレベルのミクロ脂肪症を示すと観察され、このことは、ミクロ脂肪症は、劇的に脂質含量に寄与し得ることを実証する。従って、研究はさらに、マクロ及びミクロ脂肪症を合わせた脂肪症の完全な推定に焦点を当てた。また、脂肪症の組織学的推定とＴＧ濃度との間に重要な相違が観察された。
結果を以下の表１に示す。
これらの観察は、脂肪症の組織学的推定は、脂質含量とあまり相関していないことを実証する。
赤外分光法による脂質含量の定量的評価
組織切片の脂質含量に直接的に対処できるかは、赤外顕微分光法を使用して調査された。従って、赤外顕微分光法の収集は、種々のレベルの脂肪症を示すヒト肝生検からの組織切片で実施された。連続組織切片を、凍結生検を使用して実施した。ＨＥＳ染色のために使用した組織切片もあり、分光測定実験のために使用した組織切片もあった。ＩＲスペクトルの収集は、５０μm×５０μmの開口部サイズを使用して１秒間の収集時間を要して実現した。マルチアレイ検出器の使用は、単一の検出器を使用するよりも１６倍速い作業を可能とした。この機器構成により、全組織切片を非常に短時間に調べられる。組織切片のサイズは１〜５mmの水準であった。従って、１００００個以下のスペクトルに対応する１mm２から５mm２の走査は、常に、１０分未満で実施された。
−ＣＨ３及び−ＣＨ２（３０００〜２８００cm−１）、オレフィン（Ｃ＝Ｃ、３０００〜３０６０cm−１）及びエステルシグナル（Ｃ＝Ｏ、１７４０cm−１）の相対強度などの大きな変化が脂質周波数領域に観察され、これは脂肪症のレベルと共に有意に増加したが、それぞれ１６５０及び１５４０cm−１に中央に置かれたアミドＩ及びアミドＩＩバンドによって特徴づけられたタンパク質に対応するバンドは類似していた（図２）。
タンパク質に関連した脂質の量はさらに、大きな肝臓切片マップの各ＩＲスペクトルについて脂質／タンパク質の比[（２８００〜３１００）／（１４８５〜１５９５cm−１）]を計算することによって調査された。この計算により、あらゆる１つのピクセルに対する強度が正規化され、従って、組織切片の厚さの局所的変動に関連したばらつきが回避される。脂質／タンパク質の平均比はさらに、分析した全てのピクセルの平均から得られた。ＦＴＩＲ分光法によって測定された組織サンプル内の脂質含量間の関連を計算し、そして脂質抽出及び定量後に得られたＴＧの相対量と比較した。各サンプルについての平均値を、リピドミクス分析から得られたＴＧ値の関数としてプロットした。
結果を以下の表１に示す。
脂質／タンパク質の比の間の線形性に顕著な傾向があり、相関係数ｒ２＝０．９２である（図３）。観察された線形性は、ＩＲ分光法が、脂肪症に関する診断のための効率的な診断ツールとなる大きな見込みを有する。
実施例２
２つの態様の比較
本発明に従って脂質含量を測定するための方法の２つの態様を比較した。
最初の態様は、上の実施例に記載された方法である。この方法では、各ピクセルについての脂質／タンパク質の比を計算する。ピクセルは５０μm×５０μmである。それ故、５００μm×５００μmの切片を分析するために、１００個のピクセルを使用し、そして１００個の脂質／タンパク質の比を計算する。その後、脂質／タンパク質の平均比をさらに、分析した全てのピクセルの平均から得る。この方法は、以下において「平均比」（ＡＲ）法と呼ばれる。
第２の方法において、１００個のピクセルの平均スペクトルを計算する。脂質／タンパク質の比を、平均スペクトルに基づいて計算する。
この方法は、以下において「平均スペクトル」（ＡＳ）法と呼ばれる。
実施例１で分析した患者間の１９人の脂肪症患者を分析した。
研究は、組織切片上の４つの独立した領域を選択することによって各患者について個々に実施した。
患者は、そのトリグリセリド（ＴＧ）レベルに依存して３つの群に分類された。
類似の生物学的数値が、態様を使用して得られる（図４参照）。それ故、装置は、５００μm×５００μmのピクセルで組織切片を分析することができ、ＩＲスペクトルの迅速な収集及び脂質含量の測定が可能となる。
参考文献
本出願全体を通して、種々の参考文献が、本発明が属する技術分野の最新技術を記載する。これらの参考文献の開示は、本開示への参照により本明細書に組み入れられる。

Claims (15)

  1. 肝臓における生物学的数値Ｖｂを測定するための方法であって、以下の工程：
    ａ／ ２８００cm−１から３０００cm−１までの少なくとも第１の波数範囲を有する赤外線放射を、前記肝臓のサンプルの１つ以上の部分ｐｉに適用する工程、
    ｂ／ 前記放射の強度を、それが１つ以上の部分ｐｉの各々を通過した後に検出し、そして検出された強度に関連したシグナルを発生させる工程、
    ｃ／ 発生したシグナルを処理して、平均値Ｖａを、
    − １つ以上の部分ｐｉの各々について、第１の波数範囲に関連した第１の数値Ｖｗ１ｐｉを計算することによって、
    又は
    − 各々の部分ｐｉについて発生したシグナルの平均を計算して、平均シグナルを発生させることによって、
    − 第１の波数範囲の平均シグナルに関連した第１の平均値Ｖｗ１ａを計算することによって、
    及び平均値Ｖａを計算することによって、
    計算する工程、
    ｄ／ 前記の平均値Ｖａを標準と比較して、生物学的数値Ｖｂを得る工程
    を含む、方法。
  2. 発生したシグナルを処理して平均値を計算する工程が、
    − １つ以上の部分ｐｉの各々について、第１の波数範囲に関連した第１の数値Ｖｗ１ｐｉを計算する工程、及び
    − 平均値Ｖａを計算する工程
    を含む、請求項１記載の方法。
  3. 発生したシグナルを処理して平均値を計算する工程が、
    − 各々の部分ｐｉについて発生したシグナルの平均を計算して、平均シグナルを発生させる工程、
    − 第１の波数範囲の平均シグナルに関連した第１の平均値Ｖｗ１ａを計算する工程、
    及び平均値Ｖａを計算する工程
    を含む、請求項１記載の方法。
  4. − 赤外線放射が、１４５０cm−１から１７１０cm−１までの第２の波数範囲をさらに有し、そして
    − 発生したシグナルを処理して平均値Ｖａを計算する工程がさらに、
    − １つ以上の部分ｐｉの各々について、第２の波数範囲に関連した第２の数値Ｖｗ２ｐｉを計算する工程、
    又は
    − 各部分ｐｉについて発生したシグナルの平均を計算して、平均シグナルを発生させる工程、
    − 第２の波数範囲の平均シグナルに関連した第２の平均値Ｖｗ２ａを計算する工程
    を含み、
    そして平均値Ｖａは、Ｖｗ１／Ｖｗ２の平均比である、
    請求項１〜３のいずれか記載の方法。
  5. 発生したシグナルを処理して平均値Ｖａを計算する工程が、
    − １つ以上の部分ｐｉの各々について、第２の波数範囲に関連した第２の数値Ｖｗ２ｐｉを計算する工程
    を含む、請求項４記載の方法。
  6. 発生したシグナルを処理して平均値Ｖａを計算する工程が、
    − 各部分ｐｉについて発生したシグナルの平均を計算して、平均シグナルを発生させる工程、
    − 第２の波数範囲の平均シグナルに関連した第２の平均値Ｖｗ２ａを計算する工程
    を含む、請求項４記載の方法。
  7. 第２の波数範囲が１４５０cm−１から１５７５cm−１である、請求項１〜６のいずれか記載の方法。
  8. 第２の波数範囲が１６６０cm−１から１７１０cm−１である、請求項１〜６のいずれか記載の方法。
  9. 脂肪肝をin vitroにおいて診断するための方法であって、以下の工程：
    − 請求項１〜８のいずれか記載の方法に従って生物学的数値Ｖｂを測定する工程、及び
    − 生物学的数値Ｖｂを閾値と比較する工程
    を含み、ここで閾値を超える生物学的数値Ｖｂは脂肪肝を示す、
    方法。
  10. 肝臓の脂肪症のレベルを決定するための方法であって、以下の工程：
    − 請求項１〜８のいずれか記載の方法に従って生物学的数値Ｖｂを測定する工程、及び
    − 生物学的数値Ｖｂを閾値と比較する工程
    を含み、ここで：
    − 第１の閾値と第２の閾値の間の生物学的数値Ｖｂは、軽度の脂肪症を示し、
    − 第２の閾値と第３の閾値の間の生物学的数値Ｖｂは、中等度の脂肪症を示し、
    − 第３の閾値を超える生物学的数値Ｖｂは重度の脂肪症を示す、
    方法。
  11. 脂肪性肝線維症、肝細胞癌又は肝硬変を予後予測するための方法であって、以下の工程： − 請求項１〜８のいずれか記載の方法に従って生物学的数値Ｖｂを測定する工程、及び
    − 生物学的数値Ｖｂを閾値と比較する工程
    を含み、ここで：
    第１の閾値を超える生物学的数値Ｖｂは、脂肪性肝線維症を発症するリスクが高いことを示し、
    第２の閾値を超える生物学的数値Ｖｂは、肝細胞癌を発症するリスクが高いことを示し、
    第３の閾値を超える生物学的数値Ｖｂは、肝硬変を発症するリスクが高いことを示す、
    方法。
  12. 肝臓が移植されるに適しているかどうかを決定するための方法であって、以下の工程：
    − 請求項１〜８のいずれか記載の方法に従って生物学的数値Ｖｂを測定する工程、及び
    − 生物学的数値Ｖｂを閾値と比較する工程
    を含み、ここで：
    − 第１の閾値を下回る生物学的数値Ｖｂは、肝臓が、機能しないというリスクが低く移植するに適切であることを示し、
    − 第１の閾値と第２の閾値の間の生物学的数値Ｖｂは、肝臓が、機能しないというリスクが中程度で移植するに適していることを示し、
    − 第３の閾値を超える生物学的数値Ｖｂは、肝臓が移植に適していないことを示す、
    方法。
  13. 生物学的数値Ｖｂが脂質のレベルである、請求項１〜１２のいずれか記載の方法。
  14. サンプルの生物学的数値Ｖｂを測定するための装置であって：
    − サンプルを赤外線放射に供するための場所、
    − １４５０cm−１から３０００cm−１の波数範囲を有する赤外線放射のビームを提供するための赤外線放射源、
    − ２８００cm−１から３０００cm−１の第１の特定の波数範囲及び１４５０cm−１から１７１０cm−１の第２の特定の波数範囲の前記放射の強度を、それがサンプルを通過した後に検出するための検出器、及び
    − 検出された強度に関連したシグナルを発生させるための手段
    を含む、装置。
  15. Ｖｗ１／ＶＷ２比を標準と比較して、生物学的数値Ｖｂを得るための、
    − 標準、及び
    − 発生したシグナルを処理して
    − 特定の第１の波数範囲を使用することによって得られた第１の数値Ｖｗ１、
    − 特定の第２の波数範囲を使用することによって得られた第２の数値Ｖｗ２、及び
    − Ｖｗ１／Ｖｗ２比
    を計算するためのプロセッサ
    をさらに含む、請求項１４記載の装置。
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