JP7038462B2 - ヒト化抗ｉｌ－１ｒ３抗体 - Google Patents

Description

本発明は、ヒト化抗ＩＬ－１Ｒ３抗体およびその使用に関する。

インターロイキン１受容体アクセサリータンパク質（ＩＬ１ＲＡＰ）（ＩＬ１Ｒ３とも呼ばれる）は、１型インターロイキン１受容体（ＩＬ１Ｒ１）の補助受容体であり、ＩＬ－１シグナル伝達の伝達に不可欠である。ＩＬ－１の結合により、ＩＬ－１Ｒ１は、ＩＬ－１ＲＡｃＰと会合して機能的シグナル伝達受容体複合体を形成し、その複合体がＮＦｋＢ活性を刺激する。

ＩＬ－３３、その受容体ＳＴ２およびＩＬ－１ＲＡｃＰも、ＮＦｋＢ活性化に対してＩＬ－１β／ＩＬ－１Ｒ１／ＩＬ－１ＲＡｃＰ複合体と類似の活性を持つ複合体（ＩＬ－３３／ＳＴ２／ＩＬ－１ＲＡｃＰ）を形成する。ＩＬ－３６（ＩＬ－３６α［ＩＬ－１Ｆ６］、ＩＬ－３６β［ＩＬ－１Ｆ８］およびＩＬ－３６γ［ＩＬ－１Ｆ９］）、それらの受容体ＩＬ－３６ＲおよびＩＬ－１ＲＡｃＰも、ＮＦｋＢ活性化に対してＩＬ－１β／ＩＬ－１Ｒ１／ＩＬ－１ＲＡｃＰ複合体と類似の活性を持つ複合体（ＩＬ－３６／Ｉｌ－３６Ｒ／ＩＬ－１ＲＡｃＰ）を形成する。

ヒトＮＦ－ｋＢは、炎症、免疫応答およびアポトーシスに関係するいくつかの遺伝子の発現の重要な調節因子である。したがって、ＮＦｋＢの機能不全は、自己免疫疾患、神経変性疾患、炎症およびがんを含めた様々な疾患の病理に関係する。例えば、骨関節炎（ＯＡ）の処置において、ＮＦ－ｋＢ経路は、重要な標的である。したがって、ヒトＩＬ－１Ｒ１／ＩＬ－１ＲＡｃＰ複合体のシグナル伝達活性を阻害することによってヒトＮＦｋＢ経路を調節する薬剤は、様々なヒト疾患に対する処置の可能性を示している。特に、高親和性中和抗体は、優れた治療的薬剤になろう。

１５年以上前から、ヒトＩＬ１ＲＡｃＰに対する機能的モノクローナル抗体を生成する試みが行われてきた。しかしながら、多くの試みは失敗し、既存の抗体は様々な欠点を今なお呈している。ＷＯ１９９６２３０６７は、マウスＩＬ－１受容体アクセサリータンパク質に特異的に結合するＩＬ－１ＲＡｃＰ抗体に関する。実施例１５および１６は、ＩＬ－１生物活性を中和する抗ヒトＩＬ－１ＲＡｃＰ抗体を生成する試みについて記述している。しかしながら、そのような抗体は、ＷＯ１９９６２３０６７および実施例１６によって提供されず、ＩＬ－１に誘導されるＩＬ－６のアッセイが、仮定的なだけであることを記述している。Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８；１６０：３１７０～３１７９においてＤｏ－Ｙｏｕｎｇ Ｙｏｏｎ Ｄ－ＹおよびＣｈａｒｌｅｓ Ａ．Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ ＣＡは、ＩＬ－１ベータ活性を阻害するが、結合を阻害しないマウスＩＬ－１ＲＡｃＰのドメインＩＩおよびＩＩＩに対するポリクローナル抗体について記述している。しかしながら、より高濃度のＩＬ－１ベータ（１０００ｐｇ／ｍｌ）で、このポリクローナル抗血清は、Ｄ１０Ｓ細胞の増殖を遮断しなかった。（Ｄ１０Ｓは、有糸分裂誘発因子の非存在下で、フェムトモル未満（アトモル）の濃度のＩＬ－１ベータまたはアルファで増殖するマウスＤ１０．Ｇ４．１ヘルパーＴ細胞のサブクローンである、参照Ｏｒｅｎｃｏｌｅ ＳＦおよびＤｉｎａｒｅｌｌｏ ＣＡ；Ｃｙｔｏｋｉｎｅ １（１９８９）１４～２２）。Ｊａｒａｓ Ｍ．ら、ＰＮＡＳ １０７（２０１０）１６２８０～１６２８５は、ＣＭＬ幹細胞を死滅させるためのウサギポリクローナル抗ＩＬ１ＲＡｃＰ抗体ＫＭＴ－１の使用について記述している。この抗体は、そのウサギＦｃ部分によって引き起こされるＩＬ１ＲＡｃＰ非依存的様式でＡＤＣＣを誘導する。Ｊａｒａｓらは、「潜在的な今後の治療的ＩＬ１ＲＡＰ－標的化抗体は、正常な造血細胞に対して低い毒性を示すと予想される」と予想している。マウスＩＬ－１ＲＡｃＰに対するポリクローナルウサギ抗体についても、Ｄｏ－Ｙｏｕｎｇ ＹｏｏｎおよびＣｈａｒｌｅｓ Ａ．Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４０巻、４号、２００７年７月、５６２～５７０に言及された。

ＷＯ２００２０６４６３０は、ＩＬ－１ＲＡｃＰおよびその使用にも関し、ＩＬ－１ＲＡｃＰに対する抗体については全く記述されていない。ＷＯ２００４０２２７１８およびＷＯ２００９１２０９０３は、ＣＳＦ１Ｒ、ＩＬ１３ＲＡ１、ＩＬ１ＲＡＰ、ＩＦＮＡＲ１、ＩＬ５Ｒ、ＩＮＳＲ、ＩＬ１ＲＬ１、ＬＴＫおよびＴＡＣＳＴＤ１に対する抗体が、最先端技術によって生成され得ると理論的に述べている。しかしながら、ここでも、ＩＬ－１ＲＡｃＰに対する抗体については、全く記述されていない。ＷＯ２０１１０２１０１４およびＷＯ２０１２０９８４０７（ＵＳ２０１４００１７１６７）は、ポリクローナルウサギ抗ヒトＩＬ－１ＲＡｃＰ抗血清ＫＭＴ－１およびその使用に関する（Ｊａｒａｓら２０１０を参照のこと）。ＷＯ２０１４１００７７２は、ＩＬ－１ＲＡｃＰに結合する抗ＩＬ－１ＲＡｃＰ抗体に関する。しかしながら、ＮＦｋＢ活性を刺激するいかなる機能的シグナル伝達受容体複合体（ＩＬ－１β／ＩＬ－１Ｒ１／ＩＬ－１ＲＡｃＰなど）の阻害に関しても、活性は全く記述されていない。ＵＳ６２８０９５５は、ＩＬ－１ＲＡｃＰおよびその使用に関するが、またＩＬ－１ＲＡｃＰに対する抗体については全く記述されていない。ＵＳ７３９０８８０は、ＩＬ１ＲＡｃＰのＮ末端断片について言及しているが、またＩＬ－１ＲＡｃＰに対する抗体については全く記述していない。

ＷＯ２００４１００９８７は、新生内膜過形成を処置するための医薬の調製におけるインターロイキン－ｌ（ＩＬ－１）アンタゴニストの使用および新生内膜過形成を処置するためのＩＬ－１アンタゴニストの使用に関する。そのようなアンタゴニストとして抗ＩＬ－１ＲＡｃＰ抗体が示唆されるが、さらに記述されていない。ＵＳ２００３０２６８０６は、ＩＬ－１に結合する抗体に関する。ＷＯ２００２０６４６３０は、ＩＬ－１アンタゴニストおよびＩＬ－１ＲＡｃＰタンパク質にも関する。ＩＬ－１ＲＡｃＰアンタゴニストをスクリーニングするためのＩＬ－１ＲＡｃＰの使用について言及されているが、そのような方法またはアンタゴニストは開示されていない。

これは、ＩＬ－１Ｒ３に対して高い親和性、高い特異性および強力な中和活性を持つモノクローナル抗体を同定することが非常に困難であったことを示す。本発明は、ＩＬ－１Ｒ３に高い親和性および特異性があり、強力なＩＬ－１Ｒ３中和活性があり、安定性が改善されたヒト化ＩＬ－１Ｒ３抗体を包含する。

本発明は、ＩＬ－１Ｒ３に特異的に結合するヒト化ＩｇＧ１_ＬＡＬＡ抗体もしくはその断片もしくは誘導体またはＩＬ－１Ｒ３結合特異性を付与するのに十分な前記抗体の少なくとも一部を含有するポリペプチドに関する。前記抗体は、ＩＬ－１Ｒ３に誘導されるＮＦｋＢ活性を阻害する。それは、ＩＬ－１アルファ、ＩＬ－１ベータ、ＩＬ－３３および／またはＩＬ－３６に刺激されるＮＦｋＢ活性も阻害する。

本発明はさらに、ＩＬ－１Ｒ３に媒介される疾患を処置するのに使用するための本発明による抗体に関する。

本発明は、患者に前記抗体の薬学的に有効な量を投与する工程を含む、患者においてＩＬ－１Ｒ３に媒介される疾患を処置する方法をさらに包含する。

本発明は、薬学的に許容される担体および治療有効量の前記抗体を含む医薬組成物も含む。

定義
本発明による用語「ウサギ」は、分類学上ウサギ目（ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｏｒｄｅｒ）のメンバーの動物を意味し、それはファミリー（ノウサギおよびウサギ）およびナキウサギ科（Ｏｃｈｏｔｏｎｉｄａｅ）（ナキウサギ）、好ましくはアナウサギ属（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ）を含む。

用語「抗体」は、全抗体および本発明による特性を示す限り、抗体断片を含むがそれに限定されない様々な形態の抗体構造を包含する。

本発明による用語「ウサギモノクローナル抗体」は、ウサギを免疫することによって産生され、前記ウサギの抗原産生細胞から単離されるモノクローナル抗体、ならびに本発明による特徴的な特性が保持される限り、さらに修飾されるような抗体、好ましくはヒト化抗体、キメラ抗体、その断片、またはさらに遺伝子操作および組換え産生された抗体を意味する。好ましくは、抗体は、前記ウサギのＢ細胞またはウサギハイブリドーマ細胞由来である。本発明による用語「抗体産生細胞」は、抗体を産生するウサギＢ細胞、好ましくはＢ細胞またはウサギハイブリドーマ細胞を意味する。

「天然の抗体」は、２つの同一の軽鎖（Ｌ）および２つの同一の重鎖（Ｈ）で構成される通常ヘテロ四量体の糖タンパク質である。各軽鎖は、１つの共有結合性ジスルフィド結合によって重鎖に連結され、一方でジスルフィド連結の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の間で変化する。各重鎖および軽鎖は、規則正しく間隔を置いて配置されている鎖内ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、一方の末端に可変ドメイン（ＶＨ）、続いていくつかの定常ドメインを有する。各軽鎖は、一方の末端に可変ドメイン（ＶＬ）および他方の末端に定常ドメインを有する。軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインと整列され、軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列される。特定のアミノ酸残基が、軽鎖と重鎖可変ドメインとの間にインターフェイスを形成すると考えられている。

ペプチドまたはポリペプチド配列に関して「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、必要に応じて最大のパーセント配列同一性を達成するためにギャップを導入した後に、配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮しない、特定のペプチドまたはポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージと定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定するための整列化は、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの一般公開されているコンピューターソフトウェアを使用して、当業者の範囲内にある様々な方法で達成され得る。

用語「ＶＬ（またはＶＨ）領域」は、ＶＬ（またはＶＨ）ドメインと同じ意味を有する。

本発明による用語「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合するヒト受容体を指す。ＦｃＲは、ＩｇＧ抗体に結合し、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体の対立遺伝子バリアントならびに選択的スプライシング形態を含めた受容体を含む。ＦｃγＲＩＩ受容体は、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害性受容体」）を含み、その細胞質ドメインにおいて主に異なる類似のアミノ酸配列を有する。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。阻害性受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシンベースの阻害性モチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する（Ｄａｅｒｏｎ，Ｍ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３～２３４（１９９７）の総説を参照のこと）。ＦｃＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）は、ＡＤＣＣを媒介する。ＦｃＲについては、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：４５７～９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌら、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４：２５～３４（１９９４）；およびｄｅ Ｈａａｓら、Ｊ．Ｌａｂ．ＣＨｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０～４１（１９９５）に概説されている。これらおよび他の全てのＦｃＲは、本明細書において用語「ＦｃＲ」に包含される。この用語は、胎児への母体ＩｇＧの移動に関与し（Ｇｕｙｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）およびＫｉｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））、より遅い異化、したがってより長い半減期を媒介する新生児受容体、ＦｃＲｎも含む。

本明細書では用語「抗体エフェクター機能」または「エフェクター機能」とは、ＩｇＧのＦｃエフェクタードメイン（例えば、免疫グロブリンのＦｃ領域）によって付与される機能を指す。そのような機能は、例えば、食細胞もしくは溶解活性を持つ免疫細胞のＦｃ受容体へのＦｃエフェクタードメインの結合または補体系の成分へのＦｃエフェクタードメインの結合によって生じ得る。典型的なエフェクター機能は、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰおよびＣＤＣである。

「抗体断片」とは、インタクトな抗体の一部を含み、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、それだけには限らないがＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；直鎖状抗体；一本鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；および抗体断片から形成される多重特異性抗体がある。

参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」とは、競合アッセイにおいてその抗原への参照抗体の結合を５０％以上遮断する、逆に言えば、競合アッセイにおいて参照抗体が、その抗原への抗体の結合を５０％以上遮断する抗体を指す。例示的な競合アッセイが、本明細書に提供される。

「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」および「ＡＤＣＣ」とは、ＦｃＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞（例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球およびマクロファージ）が、標的細胞に結合している抗体を認識し、その後標的細胞の溶解を引き起こす細胞に媒介される反応を指す。ＡＤＣＣを媒介するための初代細胞、ＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩだけを発現するが、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを発現する。

用語「抗体依存性細胞食作用」および「ＡＤＣＰ」とは、抗体被覆細胞が、免疫グロブリンＦｃ領域に結合する食免疫細胞（例えば、マクロファージ、好中球および樹状細胞）によって全体または一部のいずれかが内部移行される過程を指す。

「Ｃ１ｑ」は、免疫グロブリンのＦｃ領域に対する結合部位を含むポリペプチドである。Ｃ１ｑは、２つのセリンプロテアーゼであるＣ１ｒおよびＣ１ｓと一緒に補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）経路の第１成分である複合体Ｃ１を形成する。ヒトＣ１ｑは、例えばＱｕｉｄｅｌ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、 Ｃａｌｉｆから商業的に購入することができる。

抗体の「クラス」とは、重鎖によって保有される定常ドメインまたは定常領域の型を指す。５つの大きな抗体のクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭが存在し、これらのうちいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）例えば、ＩｇＧｉ、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡｉおよびＩｇＡ_２にさらに分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれａ、δ、ε、γおよびμと呼ばれる。

薬剤、例えば、医薬製剤の「有効量」とは、必要な投薬量および期間で、所望の治療的または予防的結果を達成するために有効な量を指す。

用語「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために本明細書において使用される。用語は、天然配列のＦｃ領域およびバリアントＦｃ領域を含む。本明細書において特に明記しない限り、Ｆｃ領域または定常領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１）に記載のＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ付番方式にしたがう。

「バリアントＦｃ領域」は、本明細書において定義した「アミノ酸修飾」の少なくとも１つによって「天然」または「野生型」配列のＦｃ領域と異なるアミノ酸配列を含む。本明細書では用語「Ｆｃバリアント」は、Ｆｃドメインに修飾を含むポリペプチドを指す。本発明のＦｃバリアントは、それらを構成するアミノ酸修飾により定義される。したがって、例えば、Ｐ３２９Ｇは、親Ｆｃポリペプチドと比較して３２９位にグリシンによるプロリンの置換があるＦｃバリアントであり、番号付けはＥＵインデックスにしたがう。野生型アミノ酸の同一性が、明らかでない可能性があり、その場合上述したバリアントは、Ｐ３２９Ｇとして呼ばれる。本発明で述べられる全ての位置について、番号付けは、ＥＵインデックスにしたがう。ＥＵインデックスまたはＫａｂａｔもしくはＥＵ番号付けスキームとしてのＥＵインデックスとは、ＥＵ抗体の番号付けを指す（Ｅｄｅｌｍａｎら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ６３（１９６９）７８～８５、参照により全体を本明細書に組み込む）。修飾は、付加、欠失または置換であり得る。置換は、天然に存在するアミノ酸および天然に存在しないアミノ酸を含み得る。バリアントは、非天然のアミノ酸を含み得る。例には、米国特許第６，５８６，２０７号；ＷＯ９８／４８０３２；ＷＯ０３／０７３２３８；ＵＳ２００４／０２１４９８８（Ａｌ）号；ＷＯ０５／３５７２７ Ａ２；ＷＯ０５／７４５２４ Ａ２；Ｃｈｉｎ，Ｊ．Ｗ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １２４（２００２）９０２６～９０２７；Ｃｈｉｎ，Ｊ．Ｗ．、およびＳｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ １１（２００２）１１３５～１１３７；Ｃｈｉｎ，Ｊ．Ｗ．ら、ＰＩＣＡＳ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ９９（２００２）１１０２０～１１０２４；およびＷａｎｇ，Ｌ．、およびＳｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．、Ｃｈｅｍ．（２００２）１～１０があり、全体を参照により組み込む。

用語「Ｆｃ領域含有ポリペプチド」とは、Ｆｃ領域を含む抗体またはイムノアドヘシン（下の定義を参照のこと）などのポリペプチドを指す。

用語「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体について記述するために使用される。ＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）に結合するＦｃＲは、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体の対立遺伝子バリアントならびに選択的スプライシング形態を含めた受容体を含む。ＦｃγＲＩＩ受容体は、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害性受容体」）を含み、その細胞質ドメインにおいて主に異なる類似のアミノ酸配列を有する。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。阻害性受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシンベースの阻害性モチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する（Ｄａｅｒｏｎ，Ｍ．、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５（１９９７）２０３～２３４の総説を参照のこと）。ＦｃＲについては、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ９（１９９１）４５７～４９２；Ｃａｐｅｌら、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４（１９９４）２５～３４；およびＨａａｓら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６（１９９５）３３０～４１に概説されている。将来に同定されるものを含めて、他のＦｃＲは、本明細書において用語「ＦｃＲ」に包含される。用語は、胎児への母体ＩｇＧの移動に関与する新生児受容体、ＦｃＲｎも含む（Ｇｕｙｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７（１９７６）５８７およびＫｉｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４（１９９４）２４９）。

本明細書では、「ＩｇＧ Ｆｃリガンド」とは、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に結合して、Ｆｃ／Ｆｃリガンド複合体を形成するあらゆる生物由来の分子、好ましくはポリペプチドを意味する。Ｆｃリガンドには、それだけには限らないが、ＦｃγＲ、ＦｃγＲ、ＦｃγＲ、ＦｃＲｎ、Ｃｌｑ、Ｃ３、マンナン結合レクチン、マンノース受容体、ブドウ球菌プロテインＡ、連鎖球菌プロテインＧ、およびウイルスＦｃγＲがある。Ｆｃリガンドは、ＦｃγＲに相同なＦｃ受容体のファミリーであるＦｃ受容体ホモログ（ＦｃＲＨ）も含む。（Ｄａｖｉｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ １９０（２００２）１２３～１３６、全体を参照により組み込む）。Ｆｃリガンドは、Ｆｃに結合する未発見の分子を含み得る。特定のＩｇＧ Ｆｃリガンドは、ＦｃＲｎおよびＦｃガンマ受容体である。本明細書では、「Ｆｃリガンド」とは、抗体のＦｃ領域に結合して、Ｆｃ／Ｆｃリガンド複合体を形成するあらゆる生物由来の分子、好ましくはポリペプチドを意味する。

本明細書では、「Ｆｃガンマ受容体」、「ＦｃγＲ」または「ＦｃｇａｍｍａＲ」とは、ＩｇＧ抗体Ｆｃ領域に結合し、ＦｃγＲ遺伝子によってコードされているタンパク質ファミリーの任意のメンバーを意味する。ヒトにおいてこのファミリーは、アイソフォームＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲＩＢおよびＦｃγＲＩＣを含めたＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）；アイソフォームＦｃγＲＩＩＡ（アロタイプＨ１３１およびＲ１３１を含む）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＦｃγＲＩＩＢ－１およびＦｃγＲＩＩＢ－２を含む）、およびＦｃγＲＩＩｃを含めたＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）；ならびにアイソフォームＦｃγＲＩＩＩＡ（アロタイプＶＩ５８およびＦ１５８を含む）およびＦｃγＲＩＩＩｂ（アロタイプＦｃγＲＩＩＢ－ＮＡ１およびＦｃγＲＩＩＢ－ＮＡ２を含む）を含めたＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）（Ｊｅｆｆｅｒｉｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ８２（２００２）５７～６５、全体を参照により組み込む）、加えて未発見のあらゆるヒトＦｃγＲもしくはＦｃγＲアイソフォームまたはアロタイプを含むが、これに限定されない。ＦｃγＲは、ヒト、マウス、ラット、ウサギおよびサルを含むがこれに限定されない任意の生物由来であり得る。マウスＦｃγＲは、それだけには限らないが、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）およびＦｃγＲＩＩＩ－２（ＣＤ１６－２）、ならびに未発見のあらゆるマウスＦｃγＲもしくはＦｃγＲアイソフォームまたはアロタイプを含む。

本明細書では、「ＦｃＲｎ」または「新生児Ｆｃ受容体」とは、ＩｇＧ抗体Ｆｃ領域に結合し、ＦｃＲｎ遺伝子によって少なくとも一部コードされているタンパク質を意味する。ＦｃＲｎは、ヒト、マウス、ラット、ウサギおよびサルを含むがこれに限定されない任意の生物由来であり得る。当技術分野で公知のように、機能的ＦｃＲｎタンパク質は、しばしば重鎖および軽鎖と呼ばれる２つのポリペプチドを含む。軽鎖はベータ２－ミクログロブリンであり、重鎖はＦｃＲｎ遺伝子によってコードされる。特に明記しない限り本明細書において、ＦｃＲｎまたはＦｃＲｎタンパク質とは、ベータ２－ミクログロブリンとＦｃＲｎ重鎖の複合体を指す。

「イムノコンジュゲート」は、化学療法剤、薬物、成長阻害剤、毒素、別の抗体または放射性同位元素など、１つまたは複数の細胞傷害性薬剤にコンジュゲートされた抗体を意味する。

「抗体断片」は、完全長抗体の一部、好ましくはその可変領域または少なくともその抗原結合部位を含む。抗体断片の例には、ダイアボディ、Ｆａｂ断片および一本鎖抗体分子がある。ｓｃＦｖ抗体は、例えば、Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０３（１９９１）４６～８８に記述されている。

本明細書では用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」とは、単一のアミノ酸組成の抗体分子の調製物を指す。

用語「ヒト化抗体」または「抗体のヒト化バージョン」とは、ヒト可変領域が、本発明による抗体のＣＤＲを含むように修飾された抗体を指す。好ましい実施形態において、ＶＨおよびＶＬのＣＤＲをヒト抗体のフレームワーク領域に移植して、「ヒト化抗体」を調製する。例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２（１９８８）３２３～３２７；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４（１９８５）２６８～２７０を参照のこと。重鎖および軽鎖可変フレームワーク領域は、同じまたは異なるヒト抗体配列に由来し得る。ヒト抗体配列は、天然に存在するヒト抗体の配列であり得る。ヒト重鎖および軽鎖可変フレームワーク領域は、例えば、Ｌｅｆｒａｎｃ、Ｍ．－Ｐ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０００）補遺ＩＰ Ａ．１Ｐ．１～Ａ．１Ｐ．３７に挙げられており、ＩＭＧＴ、ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ）またはｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ－ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋを通してアクセスできる。

本明細書では用語「標的に対して特異的に結合する、または抗標的抗体」とは、ＥＬＩＳＡによって測定されるそれぞれの抗原（標的）への抗体の結合を指し、前記ＥＬＩＳＡは、固体支持体にそれぞれの抗原をコーティングすること、それぞれの抗原またはタンパク質と免疫複合体を形成できる条件下で前記抗体を添加すること、本発明による抗体に結合する二次抗体およびペルオキシダーゼに媒介される発色を使用して光学密度値（ＯＤ）を測定することにより前記免疫複合体を検出することとを好ましくは含む。

本発明による用語「抗原」とは、免疫化に使用される抗原またはそのタンパク質配列の一部として前記抗原を含むタンパク質のことを指す。例えば、免疫化の場合、タンパク質の細胞外ドメインの断片（例えば最初の２０アミノ酸）を使用することができ、検出／アッセイなどの場合、タンパク質または完全長タンパク質の細胞外ドメインを使用することができる。

本明細書において用語「特異的に結合する」または「特異的に認識される」は、抗体が、抗原にかなりの親和性を呈し、好ましくは、有意な交差反応性を呈しないことを意味する。

「かなりの」結合親和性は、少なくとも１０ｅｘｐ７Ｍ^－１、特に少なくとも１０ｅｘｐ８Ｍ^－１、さらに特に少なくとも１０ｅｘｐ９Ｍ^－１またはよりさらに特に少なくとも１０ｅｘｐ１０Ｍ^－１の親和性による結合を含む。

「有意な交差反応性を呈しない」抗体は、望ましくない他のタンパク質に目に見えて結合することがない抗体である。本発明によるエピトープに特異的な抗体は、例えば、ＩＬ－１Ｒ３上の他のエピトープと有意に交差反応することがない。特異的結合は、そのような結合を決定するための当業者に認識されている任意の手段、例えば競合結合アッセイ（例えばＥＬＩＳＡ）により決定することができる。

本明細書では全てのタンパク質用語は、ヒトタンパク質を指す。別の種由来のタンパク質を意味する場合、これは明確に言及される。

本明細書では用語「ＩＬ－１アルファ」とは、ヒトＩＬ－１を指す（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ０１５８３）。本明細書では用語「ＩＬ－１ベータ」とは、ヒトＩＬ－１ベータを指す（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ０１５８４）。ＩＬ－１は、ＩＬ－２放出、Ｂ細胞成熟および増殖ならびに線維芽細胞増殖因子活性を誘導することによって胸腺細胞増殖を刺激する。ＩＬ－１タンパク質は、炎症応答に関係し、内因性発熱物質として同定されている（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ）。

本明細書では用語「ＩＬ－３３」とは、ヒトＩＬ－３３（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｏ９５７６０）、ＩＬ１ＲＬ１／ＳＴ２受容体に結合し、それを通して、標的細胞においてＮＦカッパＢおよびＭＡＰＫシグナル伝達経路を次々に活性化するシグナル伝達するサイトカインのことを指す（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ）。

本明細書では用語「ＩＬ－３６」とは、ヒトＩＬ－３６アルファ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ９ＵＨＡ７、ＩＬ－３６ベータ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ９ＮＺＨ７）および／またはＩＬ－３６ガンマ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ９ＮＺＨ８）を指す。ＩＬ－３６は、ＩＬ１ＲＬ２／ＩＬ－３６Ｒ受容体に結合し、それを通して、炎症誘発性応答に関係する標的細胞においてＮＦカッパＢおよびＭＡＰＫシグナル伝達経路を次々に活性化するシグナル伝達するサイトカインである。ＩＬ－３６は、ケラチノサイト、樹状細胞ならびに間接的にＴ細胞に作用することによって皮膚炎症応答に関係して、組織浸潤、細胞成熟および細胞増殖を駆動すると思われる（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ）。

本明細書では用語「ＮＦｋＢ」とは、ヒト核因子ＮＦカッパＢのことを指し、それは、ｐ１０５サブユニット（Ｐ１９８３８）およびｐ１００サブユニット（Ｑ００６５３）からなる。

「ＮＦｋＢの阻害」は、ヒト細胞においてＮＦｋＢ依存的ルシフェラーゼ遺伝子発現の阻害として本発明によって測定される。そのような方法は、例えばＷｉｎｄｈｅｉｍ Ｍ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２８（２００８）１７８３～１７９１；Ｈｕａｎｇ Ｊ．らＰＮＡＳ ＵＳＡ ９４（１９９７）１２８２９～１２８３２；Ｘｉａｏｘｉａ Ｌ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ、Ｂｉｏｌ．１９（１９９９）４６４３～４６５２に記述されている。本明細書においてマウスＮＦｋＢを意味する場合、そのことは明確に言及される。

本明細書では「本発明による抗体の可変領域（またはドメイン）」（軽鎖の可変領域［ＶＬ］、重鎖の可変領域［ＶＨ］）は、抗体が抗原に結合するのに直接関係する軽および重鎖領域の対の各々を意味する。可変軽および重鎖領域は同じ全体構造を有し、各領域は、配列が広く保存され、３つの相補性決定領域、ＣＤＲによって接続されている４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含む。本発明による抗体は、ＶＨ領域およびＶＬ領域またはそれらの部分を含み、それらは、両方合わせてそれぞれの抗原への特異的結合に十分である。

本明細書において使用される場合、用語「抗体の抗原結合部分」とは、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。抗体の抗原結合部分は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基を好ましくは含む。ＣＤＲ配列は、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１）にしたがって定義される。この付番方式を使用して、実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変領域のＦＲもしくはＣＤＲの短縮または挿入に対応してより少ないもしくは追加のアミノ酸を含有することができる。

本明細書では句「非経口投与」および「非経口的に投与される」は、腸内および局所投与以外の投与の様式を意味し、通常注射により、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、真皮内、腹膜内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、脊椎内、硬膜外および胸骨内注射ならびに注入を含むが、これに限定されない。

本明細書では用語「がん」は、例えば、肺がん、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）がん、細気管支肺胞細胞肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部のがん、皮膚もしくは眼内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門部のがん、胃がん(stomach cancer)、胃部がん(gastric cancer)、大腸がん、乳がん、子宮がん、卵管の癌腫、子宮内膜の癌腫、頸部の癌腫、膣の癌腫、外陰部の癌腫、ホジキン病、食道のがん、小腸のがん、内分泌系のがん、甲状腺のがん、上皮小体のがん、副腎のがん、軟部組織の肉腫、尿道のがん、陰茎のがん、前立腺がん、膀胱のがん、腎臓もしくは尿管のがん、腎細胞癌、腎盂の癌腫、中皮腫、肝細胞がん、胆道がん、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、脊髄軸腫瘍、脳幹グリオーマ、多形性神経膠芽細胞腫、星状細胞腫、神経鞘腫、上衣細胞腫、髄芽細胞腫、髄膜腫、扁平上皮細胞癌腫、下垂体腺腫、リンパ腫、リンパ性白血病、上記がんのいずれかの難治性バージョン、または上記がんの１つまたは複数の組合せを含むものであり得る。

後段で詳述。 後段で詳述。 後段で詳述。 後段で詳述。 後段で詳述。 後段で詳述。 後段で詳述。 後段で詳述。 後段で詳述。 後段で詳述。 後段で詳述。 後段で詳述。 後段で詳述。 後段で詳述。 後段で詳述。 後段で詳述。

免疫化した哺乳動物に由来する抗体のヒト化は、ヒト治療薬として使用するための前記抗体を意味する場合、開発における品質特性として必要である。ヒト化の目的は、抗体の元の特徴（結合特異性、活性）をできるだけ保つ一方、ヒトに他の生物由来の非ヒト化抗体を導入する際に起こり得る免疫学的副作用を低減させることである。本発明は、ＣＤＲ移植の公知のヒト化戦略に基づく。ここで、多数の活性ヒト化抗体が並行して産生され、最上の候補がさらなるアセスメントのために選択された。

本出願の導入において概説したとおり、ＩＬ－１Ｒ３に対して高親和性、高特異性および強力な中和活性を持つモノクローナル抗体を同定することは非常に困難である。本発明は、ＩＬ－１Ｒ３に高い親和性および特異性があり、強力なＩＬ－１Ｒ３中和活性があり、安定性が改善されたヒト化ＩＬ－１Ｒ３抗体を包含する。

特に、本発明は、ＩＬ－１Ｒ３に特異的に結合するヒト化抗体またはＩＬ－１Ｒ３結合特異性を付与するのに十分な前記抗体の少なくとも一部を含有するその断片もしくは誘導体であって、
ａ）ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３を含む相補性決定領域を含む重鎖可変領域（ＶＨ）であって、
ＣＤＲ－Ｈ１領域が配列番号６９～８５の群から選択されるアミノ酸配列を含み、
ＣＤＲ－Ｈ２領域が配列番号８６～１０２の群から選択されるアミノ酸配列を含み、
ＣＤＲ－Ｈ３領域が配列番号１０３～１１９の群から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに
ｂ）ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３を含む相補性決定領域を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）であって、
ＣＤＲ－Ｌ１領域が配列番号１２０～１３６の群から選択されるアミノ酸配列を含み、
ＣＤＲ－Ｌ２領域が配列番号１３７～１５３の群から選択されるアミノ酸配列を含み、
ＣＤＲ－Ｌ３領域が配列番号１５４～１７０および１７５の群から選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む、ヒト化抗体またはその断片もしくは誘導体に関する。

一実施形態において、本発明の抗体は、ＣＤＲ－Ｌ３の２位に置換を含む。前記置換は、システインからセリンへの置換であり得る。

さらに、本発明は、ＩＬ－１Ｒ３に特異的に結合するヒト化抗体またはＩＬ－１Ｒ３結合特異性を付与するのに十分な前記抗体の少なくとも一部を含有するその断片もしくは誘導体を包含し、抗体は、配列番号１～３４および配列番号１７３のＶＨ領域からなる群から選択されるＶＨ領域と少なくとも６０％同一、好ましくは少なくとも７０％同一、より好ましくは少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも９０％同一である重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。

一実施形態において、ＩＬ－１Ｒ３に特異的に結合するヒト化抗体またはＩＬ－１Ｒ３結合特異性を付与するのに十分な前記抗体の少なくとも一部を含有するその断片もしくは誘導体は、本発明によるＶＨ配列の群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％配列同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）配列を含む。

ある特定の実施形態において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一性を有するＶＨ配列は、参照配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入または欠失を含有し、それによって、抗体は、本発明により、それぞれの抗原に特異的に結合する能力を保持する。

本発明は、ＩＬ－１Ｒ３に特異的に結合するヒト化抗体またはＩＬ－１Ｒ３結合特異性を付与するのに十分な前記抗体の少なくとも一部を含有するその断片もしくは誘導体にも関し、抗体は、配列番号３５～６８および１７４のＶＬ領域からなる群から選択されるＶＬ領域と少なくとも６０％同一、好ましくは少なくとも７０％同一、より好ましくは少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも９０％同一である軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。

別の実施形態において、ＩＬ－１Ｒ３に特異的に結合するヒト化抗体またはＩＬ－１Ｒ３結合特異性を付与するのに十分な前記抗体の少なくとも一部を含有するその断片もしくは誘導体は、本発明によるＶＬ配列のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％配列同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。

ある特定の実施形態において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一性を有するＶＬ配列は、参照配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入または欠失を含有し、それによって、抗体は、それぞれの抗原に特異的に結合する能力を保持する。

ある特定の実施形態において、合計１～１０アミノ酸が、前記ＶＬ配列において置換、挿入および／または欠失されている。ある特定の実施形態において、置換、挿入または欠失は、ＣＤＲの外側の領域（即ち、ＦＲ）において起こる。本発明は、当業者に公知の方法によって産生され得る親和性成熟された抗体も含む。Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９～７８３（１９９２）は、ＶＨおよびＶＬドメインシャフリングによる親和性成熟について記述している。ＣＤＲおよび／またはフレームワーク残基のランダムな突然変異誘発については：Ｂａｒｂａｓら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、ＵＳＡ ９１：３８０９～３８１３（１９９４）；Ｓｃｈｉｅｒら、Ｇｅｎｅ １６９：１４７～１５５（１９９５）；Ｙｅｌｔｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１ ５５：１９９４～２００４（１９９５）；Ｊａｃｋｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１ ５４（７）：３３１０～９（１９９５）；ならびにＨａｗｋｉｎｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９～８９６（１９９２）、およびＷＯ２０１０１０８１２７に記述されている。

ある特定の実施形態において、合計１～１０アミノ酸が、前記ＶＨまたはＶＬ配列の各々において置換、挿入および／または欠失されている。一実施形態において、本発明の抗体は、ＶＨまたはＶＬ配列の９０位に置換を含む。９０位のアミノ酸は、セリンによって置換されることが好ましい。この置換は、好ましくは軽鎖可変領域（ＶＬ）の９０位である。好ましい実施形態において、配列番号６２の９０位のシステインは、セリンによって置換される。しかしながら、本発明の抗体は、９０位のアミノ酸置換に限定されず、本発明の抗体の特性を保有する機能的抗体を生じる任意の置換、欠失または挿入を含み得る。したがって、本発明の抗体のＶＬおよびＶＨ配列は、異なる位置にさらなる突然変異を含み得る。

ある特定の実施形態において、置換、挿入または欠失は、ＣＤＲの外側の領域（即ち、ＦＲ）において起こる。

他の実施形態において、置換、挿入または欠失は、ＣＤＲ内の領域に起こる。好ましい一実施形態において、本発明の抗体は、ＣＤＲ－Ｌ３の２位に置換を含む。この置換は、システインからセリンであることが好ましい。一実施形態において、前記置換は、配列番号１６４にある。

本発明は、ＩＬ－１Ｒ３に特異的に結合するヒト化抗体またはＩＬ－１Ｒ３結合特異性を付与するのに十分な前記抗体の少なくとも一部を含有するその断片もしくは誘導体も包含し、抗体は、配列番号１～３４および１７３の群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。

好ましくは、重鎖可変領域（ＶＨ）配列は、配列番号１であり、あるいは、配列番号２、または配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、または配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、あるいは配列番号３４または１７３である。

さらに、本発明は、ＩＬ－１Ｒ３に特異的に結合するヒト化抗体またはＩＬ－１Ｒ３結合特異性を付与するのに十分な前記抗体の少なくとも一部を含有するその断片もしくは誘導体に関し、抗体は、配列番号３５～６８および１７４の群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。

さらにより好ましくは、軽鎖可変領域（ＶＬ）配列は、配列番号３５、または配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、あるいは、配列番号６８または１７４である。

ＩＬ－１Ｒ３に特異的に結合する本発明によるヒト化抗体またはＩＬ－１Ｒ３結合特異性を付与するのに十分な前記抗体の少なくとも一部を含有するその断片もしくは誘導体は、ＭＡＢ－１５－０１３９、ＭＡＢ－１５－０１０６、ＭＡＢ－１５－０１０８、ＭＡＢ－１５－０１１０、ＭＡＢ－１５－０１１７、ＭＡＢ－１５－０１２１、ＭＡＢ－１５－０１４０、ＭＡＢ－１５－０１１５、ＭＡＢ－１５－０１２５、ＭＡＢ－１５－０１１９、ＭＡＢ－１５－０１０９、ＭＡＢ－１５－００９７、ＭＡＢ－１５－０１３５、ＭＡＢ－１５－０１３３、ＭＡＢ－１５－０１０７、ＭＡＢ－１５－０１２８、ＭＡＢ－１５－０１１６、ＭＡＢ－１６－０００４、ＭＡＢ－１６－０００９、ＭＡＢ－１６－００２８、ＭＡＢ－１６－００３１、ＭＡＢ－１６－００４３、ＭＡＢ－１６－００４９、ＭＡＢ－１６－００４５、ＭＡＢ－１６－００４０、ＭＡＢ－１６－００３６、ＭＡＢ－１６－００４６、ＭＡＢ－１６－００３０、ＭＡＢ－１６－００２１、ＭＡＢ－１６－００１９、ＭＡＢ－１６－００１５、ＭＡＢ－１６－００２７、ＭＡＢ－１６－００４８、ＭＡＢ－１６－００４１、ＭＡＢ－１６－０１４９、ＭＡＢ－１６－０１５０からなる群から選択される抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域をそれぞれ含むＶＨ領域およびＶＬ領域も含む。

一実施形態において、ＩＬ－１Ｒ３に特異的に結合するヒト化抗体またはＩＬ－１Ｒ３結合特異性を付与するのに十分な前記抗体の少なくとも一部を含有するその断片もしくは誘導体は、配列番号１および３５または配列番号２および３６を含む。本発明による抗体は、配列番号３および３７、または配列番号４および３８、または配列番号５および３９、または配列番号６および４０、または配列番号７および４１、または配列番号８および４２、または配列番号９および４３、または配列番号１０および４４、または配列番号１１および４５、または配列番号１２および４６を含み得る。別法として本発明による抗体は、配列番号１３および４７、または配列番号１４および４８、または配列番号１５および４９、または配列番号１６および５０、または配列番号１７および５１、または配列番号１８および５２、または配列番号１９および５３、または配列番号２０および５４、または配列番号２１および５５、または配列番号２２および５６、または配列番号２３および５７、または配列番号２４および５８、または配列番号２５および５９、または配列番号２６および６０、または配列番号２７および６１を含む。

別法として、本発明による抗体は、配列番号２８および６２、または配列番号２９および６３、または配列番号３０および６４、または配列番号３１および６５、または配列番号３２および６６、または配列番号３３および６７、または配列番号３４および６８を含む。

最も好ましくは、ＩＬ－１Ｒ３に特異的に結合するヒト化抗体またはＩＬ－１Ｒ３結合特異性を付与するのに十分な前記抗体の少なくとも一部を含有するその断片もしくは誘導体は、定常領域配列ＣＲ－Ｈ（配列番号１７２）およびＣＲ－Ｌ（配列番号１７１）ならびに配列番号１～３４および１７３の群から選択されるＶＨ領域および配列番号３５～６８および１７４の群から選択されるＶＬ領域を含む。

ＩＬ－１Ｒ３に特異的に結合するヒト化抗体またはＩＬ－１Ｒ３結合特異性を付与するのに十分な前記抗体の少なくとも一部を含有するその断片もしくは誘導体は、定常領域配列ＣＲ－Ｈ（配列番号１７２）およびＣＲ－Ｌ（配列番号１７１）ならびにＭＡＢ－１５－０１３９、ＭＡＢ－１５－０１０６、ＭＡＢ－１５－０１０８、ＭＡＢ－１５－０１１０、ＭＡＢ－１５－０１１７、ＭＡＢ－１５－０１２１、ＭＡＢ－１５－０１４０、ＭＡＢ－１５－０１１５、ＭＡＢ－１５－０１２５、ＭＡＢ－１５－０１１９、ＭＡＢ－１５－０１０９、ＭＡＢ－１５－００９７、ＭＡＢ－１５－０１３５、ＭＡＢ－１５－０１３３、ＭＡＢ－１５－０１０７、ＭＡＢ－１５－０１２８、ＭＡＢ－１５－０１１６、ＭＡＢ－１６－０００４、ＭＡＢ－１６－０００９、ＭＡＢ－１６－００２８、ＭＡＢ－１６－００３１、ＭＡＢ－１６－００４３、ＭＡＢ－１６－００４９、ＭＡＢ－１６－００４５、ＭＡＢ－１６－００４０、ＭＡＢ－１６－００３６、ＭＡＢ－１６－００４６、ＭＡＢ－１６－００３０、ＭＡＢ－１６－００２１、ＭＡＢ－１６－００１９、ＭＡＢ－１６－００１５、ＭＡＢ－１６－００２７、ＭＡＢ－１６－００４８、ＭＡＢ－１６－００４１、ＭＡＢ－１６－０１４９およびＭＡＢ－１６－１５０からなる群から選択される抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域をそれぞれ含むＶＨ領域およびＶＬ領域も含む。

本発明による抗体の好ましい治療適用によると、本発明の抗体のエフェクター機能（ＡＤＣＣなど）は、低減または欠如している。先行技術の他の抗体、ＣＡＮ０４（例えばＷＯ２０１５／１３２６０２（Ａ１））などとは対照的に、本発明の抗体は、エフェクター機能の増大を呈さず、ＡＤＣＣを含まない。

好ましくは、本発明によるヒト化抗体は、Ｆｃγ－受容体シグナル伝達の低減を示すまたは全くない。

したがって、本発明は、ヒト化抗体にも関し、前記抗体は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域のＬ２３４ＡおよびＬ２３５ＡまたはヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域のＳ２２８ＰおよびＬ２３５Ｅで少なくともアミノ酸置換を含む。

本発明による一実施形態において、抗体はヒト化ＩｇＧ１_ＬＡＬＡ抗体である。

本発明による一実施形態において、ＩＬ－１Ｒ３に特異的に結合するヒト化抗体またはＩＬ－１Ｒ３結合特異性を付与するのに十分な前記抗体の少なくとも一部を含有するその断片もしくは誘導体は、ＩＬ－１Ｒ３に誘導されるＮＦｋＢ活性を阻害する。

別の実施形態において、ＩＬ－１Ｒ３に特異的に結合するヒト化抗体またはＩＬ－１Ｒ３結合特異性を付与するのに十分な前記抗体の少なくとも一部を含有するその断片もしくは誘導体は、抗体ＭＡＢ－１５－０１３９、ＭＡＢ－１５－０１０６、ＭＡＢ－１５－０１０８、ＭＡＢ－１５－０１１０、ＭＡＢ－１５－０１１７、ＭＡＢ－１５－０１２１、ＭＡＢ－１５－０１４０、ＭＡＢ－１５－０１１５、ＭＡＢ－１５－０１２５、ＭＡＢ－１５－０１１９、ＭＡＢ－１５－０１０９、ＭＡＢ－１５－００９７、ＭＡＢ－１５－０１３５、ＭＡＢ－１５－０１３３、ＭＡＢ－１５－０１０７、ＭＡＢ－１５－０１２８、ＭＡＢ－１５－０１１６、ＭＡＢ－１６－０００４、ＭＡＢ－１６－０００９、ＭＡＢ－１６－００２８、ＭＡＢ－１６－００３１、ＭＡＢ－１６－００４３、ＭＡＢ－１６－００４９、ＭＡＢ－１６－００４５、ＭＡＢ－１６－００４０、ＭＡＢ－１６－００３６、ＭＡＢ－１６－００４６、ＭＡＢ－１６－００３０、ＭＡＢ－１６－００２１、ＭＡＢ－１６－００１９、ＭＡＢ－１６－００１５、ＭＡＢ－１６－００２７、ＭＡＢ－１６－００４８、ＭＡＢ－１６－００４１、ＭＡＢ－１６－０１４９およびＭＡＢ－１６－１５０の群から選択される抗体と同じエピトープに結合する。

本発明による抗体は、標的に対する結合に関しては、非常に強力な利点を有する。それらは、それらの抗原、ＩＬ１Ｒ３に強い結合能力を呈するが、他の受容体には呈しない。抗体の結合特性が、生化学的酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および細胞結合分析（フローサイトメトリー）において研究され、図２、６および７に例示される。

本発明による好ましい抗体は、３０ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは２０ｎｇ／ｍｌ未満の最大半数有効濃度（ＥＣ５０）を示す。他の実施形態において、それらは、１５ｎｇ／ｍｌ未満、１０ｎｇ／ｍｌまたは５ｎｇ／ｍｌ未満のＥＣ５０を示す。本発明による好ましい抗体は、生化学的ＥＬＩＳＡ実験において、１６．３ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０を示す（参照、図７）。

本発明による抗体はまた、異なる細胞株においてヒトＩＬ１Ｒ３が発現される実験において、それらの抗原に対して非常に強い結合を示す一方、その抗体は、ヒトＩＬ１Ｒ３を発現していない細胞株に結合しない（例えばＮＩＨ－３Ｔ３、参照、図５）。

ＩＬ１Ｒ３高発現細胞株ＳＫ－ＭＥＬ－３０（参照、図６、実施例８）において、抗体は、好ましくは４００ｎｇ／ｍｌ未満、より好ましくは３５０ｎｇ／ｍｌ未満、または３１０ｎｇ／ｍｌ未満のＥＣ５０を呈する。

本発明によって包含される好ましい一実施形態において、本発明による抗体は、ＩＬ－１アルファおよび／またはＩＬ－１ベータに刺激されるＮＦｋＢ活性を阻害する。図３、４および８は、本発明による抗体の強い阻害活性を例示する。

一実施形態において、ＩＬ－１Ｒ３に特異的に結合するヒト化抗体またはＩＬ－１Ｒ３結合特異性を付与するのに十分な前記抗体の少なくとも一部を含有するその断片もしくは誘導体は、ＩＬ－１アルファに刺激されるＮＦｋＢ活性を阻害する。

別の実施形態において、ＩＬ－１Ｒ３に特異的に結合するヒト化抗体またはＩＬ－１Ｒ３結合特異性を付与するのに十分な前記抗体の少なくとも一部を含有するその断片もしくは誘導体は、ＩＬ－１ベータに刺激されるＮＦｋＢ活性を阻害する。

本発明による抗体は、ＨＥＫ２９３Ｔ／１７－ＦＲ細胞において１００ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは９５ｎｇ／ｍｌ未満、８５ｎｇ／ｍｌ、７５ｎｇ／ｍｌ、６５ｎｇ／ｍｌ、５５ｎｇ／ｍｌ、４５ｎｇ／ｍｌ、３５ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌおよび最も好ましくは１５ｎｇ／ｍｌ未満のＥＣ５０でＩＬ－１ベータに刺激されるＮＦｋＢ活性を阻害することが好ましい（例えば、参照、図３）。

本発明による抗体は、Ａ５４９－ＮＦｋＢ－ＲＥ－Ｌｕｃ細胞において１０００ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは５００ｎｇ／ｍｌ未満、３００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌおよび最も好ましくは１００ｎｇ／ｍｌ未満のＥＣ５０でＩＬ－１アルファに刺激されるＮＦｋＢ活性を阻害することがさらに好ましい（例えば、参照、図８）。

本発明による抗体は、Ａ５４９－ＮＦｋＢ－ＲＥ－Ｌｕｃ細胞において７００ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは６００ｎｇ／ｍｌ未満、３００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌおよび最も好ましくは５０ｎｇ／ｍｌ未満のＥＣ５０でＩＬ－１ベータに刺激されるＮＦｋＢ活性を阻害することがさらに好ましい（例えば、参照、図８）。

本発明は、ヒト化抗体も包含し、前記抗体は、ＩＬ－１β／ＩＬ－１Ｒ１／ＩＬ－１ＲＡｃＰ、ＩＬ－１α／ＩＬ－１Ｒ１／ＩＬ－１ＲＡｃＰ、ＩＬ－３３／ＳＴ２／ＩＬ－１ＲＡｃＰおよび／またはＩＬ－３６／Ｉｌ－３６Ｒ／ＩＬ－１ＲＡｃＰからなる群から選択される複合体によって刺激されるＮＦｋＢ活性を阻害する。

さらに、Ａ５４９－ＮＦｋＢ－ＲＥ－Ｌｕｃ細胞溶解物において、本発明によるヒト化抗体は、１０μｇ／ｍｌ（ウサギＩｇＧアイソタイプは、分子量１５０ＫＤを有する）の濃度で、０．１ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ－１アルファ、ヒトＩＬ－１ベータ、ＩＬ－３３および／もしくはＩＬ－３６（分子量は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔを参照のこと）で刺激したＮＦｋＢ発現を、本発明による前記抗体を含まない同じアッセイに対して５０％以上、好ましくは７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上阻害する（Ｓｔｅａｄｙ－Ｇｌｏ（商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ；Ｐｒｏｍｅｇａ；カタログ番号Ｅ２５１０）。

一実施形態において、本発明によるヒト化抗体は、ＨＥＫ ２９３Ｔ／１７細胞（ＮＦ－ｋＢレポーター遺伝子の制御下にあるルシフェラーゼをトランスフェクトしたＨＥＫ ２９３Ｔ／１７－ＦＲ細胞）、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ－ＩＬ３３（商標）細胞（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）またはＨＥＫ－２９３／１７－ＩＦ細胞においてＩＬ－１アルファ、ＩＬ－１ベータ、ＩＬ－３３および／またはＩＬ－３６それぞれに刺激されるルシフェラーゼ活性を阻害する。

好ましくは、前記ＩＬ－１アルファに刺激されるルシフェラーゼ活性は、５０％以上、好ましくは７０％以上、好ましくは８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上阻害される。好ましくは、前記ＩＬ－１アルファに刺激されるルシフェラーゼ活性は、９５％阻害される。

好ましくは、前記ＩＬ－１ベータに刺激されるルシフェラーゼ活性は、５０％以上、好ましくは７０％以上、好ましくは８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上阻害される。好ましくは、前記ＩＬ－１ベータに刺激されるルシフェラーゼ活性は、９５％阻害される。

好ましくは、前記ＩＬ－３３に刺激されるルシフェラーゼ活性は、５０％以上、好ましくは７０％以上、好ましくは８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上阻害される。好ましくは、前記ＩＬ－３３に刺激されるルシフェラーゼ活性は、９５％阻害される。

好ましくは、前記ＩＬ－３６に刺激されるルシフェラーゼ活性は、５０％以上、好ましくは７０％以上、好ましくは８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上阻害される。好ましくは、前記ＩＬ－３６に刺激されるルシフェラーゼ活性は、９５％阻害される。

さらに、本発明による抗体は、ヒトＩＬ－１ａおよびＩＬ－１ｂに媒介されるＩＬ－６放出を阻害し、ポリクローナル抗体より優れている。この強力な阻害活性は、図９に示され、例示される。これらの実験において、ＥＣ５０値は、ヒト化抗ＩＬ－１Ｒ３ ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ抗体が、ヤギ抗ヒトＩＬ１－Ｒ３ポリクローナル抗体ＡＦ６７６（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）より優れていることを実証する。本発明の好ましい実施形態において、抗体は、２５００ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは１５００ｎｇ／ｍｌ未満、１０００ｎｇ／ｍｌ未満、６００ｎｇ／ｍｌ未満、４００ｎｇ／ｍｌ未満または３００ｎｇ／ｍｌ未満のＥＣ５０でヒトＩＬ－ａに媒介されるＩＬ－６放出を阻害する。本発明の抗体は、５００ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは４００ｎｇ／ｍｌ未満、３００ｎｇ／ｍｌ未満、２００ｎｇ／ｍｌ未満または１５０ｎｇ／ｍｌ未満のＥＣ５０でヒトＩＬ－１ｂに媒介されるＩＬ－６放出を阻害することが好ましい。

本発明による別の実施形態において、抗体は、ヒトＩＬ－３３に媒介されるＮｆｋＢシグナル伝達を阻害する。図１０は、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ－ＩＬ３３（商標）細胞における本発明により選択された抗体の阻害活性を例示し、ポリクローナル抗体に対する優位性を実証する。本発明の好ましい実施形態において、抗体は、２００００ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは１８０００ｎｇ／ｍｌ未満、３０００ｎｇ／ｍｌ未満、１０００ｎｇ／ｍｌ未満、５００ｎｇ／ｍｌ未満、または４００ｎｇ／ｍｌ未満のＥＣ５０でヒトＩＬ－３３に媒介されるＮｆｋＢシグナル伝達を阻害する。

本発明の抗体は、ヒトＩＬ－３６に媒介されるＮｆｋＢシグナル伝達も阻害し得る（図１１）。好ましくは、それらは、１００ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは５０ｎｇ／ｍｌ未満、４０ｎｇ／ｍｌ未満、３０ｎｇ／ｍｌ未満、２０ｎｇ／ｍｌ未満または１５ｎｇ／ｍＬ未満のＥＣ５０でヒトＩＬ－３６に媒介されるＮｆｋＢシグナル伝達を阻害する。

際立って、本発明者らは、本発明による抗体が、異なる様々な刺激に媒介されるサイトカイン放出を阻害することを見出した。例えば、抗体はＩＬ－１ａ、ＩＬ－３３およびＩＬ－３６ａに媒介されるサイトカイン放出を阻害する。選択された抗体の結果は、図１２に示される。例えば、抗体ＭＡＢ－１６－００３０は、３つ全ての刺激に媒介されるサイトカイン放出を阻害し、一方でＩＬ－１Ｒａは、ＩＬ－１ａに媒介されるサイトカイン放出だけに影響を及ぼす。

急性または慢性炎症に関連する疾患は、同時もしくは連続的いずれかの複数のサイトカインの作用によって維持されまたは確立する。ＩＬ－１ａおよびＩＬ－３３など初期の「アラーミン」は、ＩＬ－１ｂおよびＩＬ－３６を含めた他のサイトカインを起動して、強い炎症性環境を確立することができる。したがって、複数のサイトカインに媒介されるシグナル伝達の同時阻害は、炎症過程の有効な制御を与える。ＩＬ１Ｒ３受容体の遮断によって複数のサイトカインシグナル伝達を阻害することが、本発明の抗体の鍵となる態様である。

免疫細胞への抗体の結合は、例えばアポトーシスシグナル伝達経路の直接的な誘導、過剰なサイトカイン放出または抗体エフェクター機能に媒介される抗体依存性細胞傷害抗体（ＡＤＣＣ）の刺激による細胞枯渇および有害効果をもたらし得る。

したがって、本発明の抗体が、アポトーシスシグナル伝達経路の直接的な誘導、過剰なサイトカイン放出または抗体エフェクター機能に媒介される抗体依存性細胞傷害の刺激に媒介される免疫細胞枯渇を誘導しないことが、本発明の抗体のさらなる一態様である。

重要なことに、本発明による抗体は、免疫細胞の生存率に影響を及ぼさない。例えば、本発明による抗体は、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の生存率に影響を及ぼさず、ＰＢＭＣにおけるＩＬ－６放出を誘導しない（参照、図１３）。

本発明による抗体は、上記の異なる細胞株においてだけでなくドナー由来のＰＭＢＣまたは全血細胞においてもサイトカイン放出の機能的活性化を阻害する。本発明による抗体は、異なる特定または複合刺激に媒介されるサイトカイン放出を阻害する。例えば、本発明による抗体は、ＬＰＳ、熱不活化カンジダアルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、ＩＬ－１２／ＩＬ－３３または抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体で刺激されるＰＢＭＣの活性化を阻害する（参照、図１４および１５）。

また、一実施形態において、本発明によるヒト化抗ＩＬ－１Ｒ３ ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ抗体は、混合リンパ球反応においてＩＦＮｇ、ＩＬ－６、ＴＮＦ－ａ、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７およびＩＬ－１０の放出を阻害することができる（参照、図１６）。

さらに、本発明による抗体は、標的、ＩＬ１Ｒ３の異常調節が根本的な理由である疾患の処置に特に有用である。

したがって、本発明はさらに、ＩＬ－１Ｒ３に媒介される疾患を処置するのに使用するための、ＩＬ－１Ｒ３に特異的に結合するヒト化抗体またはＩＬ－１Ｒ３結合特異性を付与するのに十分な前記抗体の少なくとも一部を含有するその断片もしくは誘導体に関する。

本発明は、患者に本発明による抗体またはその誘導体もしくは断片の薬学的に有効な量を投与する工程を含む、患者においてＩＬ－１Ｒ３に媒介される疾患を処置する方法も包含する。

本発明は、本発明による、薬学的に許容される担体、および治療有効量の、ＩＬ－１Ｒ３に特異的に結合するヒト化抗体またはＩＬ－１Ｒ３結合特異性を付与するのに十分な前記抗体の少なくとも一部を含有するその断片もしくは誘導体を含む医薬組成物にも関する。

本明細書では、「医薬用担体」は、生理的に適合性がある溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、等のいずれか及び全てを含む。好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮投与（例えば注射または注入による）に適している。

本発明の組成物は、当業者に公知の様々な方法によって投与され得る。当業者に認識されるであろうように、投与の経路および／または様式は、所望の結果によって変化することになる。特定の投与経路によって本発明の化合物を投与するために、化合物を、不活化を防止する材料でコーティングする、または化合物を、その材料と同時投与する必要がある場合がある。例えば、化合物は、適当な担体、例えば、リポソームまたは希釈剤中で対象に投与され得る。薬学的に許容される希釈剤には、生理食塩水および水性緩衝液がある。医薬用担体は、無菌の注射可能な溶液または分散液の即時調製用の滅菌水溶液もしくは分散液および無菌粉末を含む。薬学的に活性な物質に対するそのような媒質および薬剤の使用は、当業者に公知である。

本明細書では句「非経口投与」および「非経口的に投与される」は、腸内および局所投与以外の投与の様式を意味し、通常注射により、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、真皮内、腹膜内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、脊椎内、硬膜外および胸骨内注射ならびに注入を含むが、これに限定されない。

これらの組成物は、防腐剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤などのアジュバントを含有することができる。微生物の存在の防止は、上記殺菌手順と様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などを含めることの両方によって確実にできる。組成物に例えば糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を含めることが望ましい場合もある。加えて、注射可能な医薬品形態の持続的吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなど吸収を遅延させる薬剤を含めることによってもたらすことができる。選択される投与経路に関係なく、適切な水和形態で使用され得る本発明の化合物および／または本発明の医薬組成物は、当業技術者に公知の従来の方法によって薬学的に許容される剤形に製剤化される。本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投薬量レベルは、患者にとって有毒であることなく、特定の患者、組成物および投与の様式に関して所望の治療応答を達成するのに有効な活性成分の量を得るために変化させることができる。選択される投薬量レベルは、用いられる本発明の特定の組成物の活性、投与経路、投与の時間、用いられる特定の化合物の排出率、処置期間、用いられる特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物および／または材料、年齢、性別、体重、症状、全体的な健康および処置される患者の以前の病歴、ならびに医術において周知の因子などを含めた様々な薬物動態学的因子に依存することになる。

本発明の一態様は、本出願において定義される、がんの処置に使用するための本発明による医薬組成物である。

本発明の別の態様は、患者に本発明による医薬組成物を投与する工程を含む、患者においてＩＬ－１Ｒ３に媒介される疾患を処置する方法である。

そのようなＩＬ－１Ｒ３に媒介される疾患には、がんを挙げることができる。がんにおける否定的な予後および進行が、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６レベルの増大および／またはＩＬ－１Ｒ３発現の増大と関連することが、文献に記述されている。

本明細書では用語「がん」は、例えば、肺がん、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）がん、細気管支肺胞細胞肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部のがん、皮膚もしくは眼内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門部のがん、胃がん、胃部がん、大腸がん、乳がん、子宮がん、卵管の癌腫、子宮内膜の癌腫、頸部の癌腫、膣の癌腫、外陰部の癌腫、ホジキン病、食道のがん、小腸のがん、内分泌系のがん、甲状腺のがん、上皮小体のがん、副腎のがん、軟部組織の肉腫、尿道のがん、陰茎のがん、前立腺がん、膀胱のがん、腎臓もしくは尿管のがん、腎細胞がん、腎盂の癌腫、中皮腫、肝細胞がん、胆道がん、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、脊髄軸腫瘍、脳幹グリオーマ、多形性神経膠芽細胞腫、星状細胞腫、神経鞘腫、上衣細胞腫、髄芽細胞腫、髄膜腫、扁平上皮細胞癌腫、下垂体腺腫、リンパ腫、リンパ性白血病、上記がんのいずれかの難治性バージョン、または上記がんの１つもしくは複数の組合せを含むものであり得る。好ましくはそのようながんは、白血病、乳がん、大腸がん、肺がんまたは膵臓がんである。最も好ましくは、がんは白血病である。

一実施形態において、ＩＬ－１Ｒ３に媒介される疾患は、白血病、乳がん、大腸がん、肺がん、膵臓がん、肝臓がん、非小細胞肺がん、結腸直腸がん、胃がん、胃部がん、エストロゲン受容体陽性乳がん、頭頸部扁平上皮細胞癌腫、中皮腫、胆嚢がん、卵巣がん、膀胱がん、前立腺がん、甲状腺がん、ホジキン病、ＭＡＬＴリンパ腫、唾液腺がんまたは黒色腫からなる群から選択される。

いくつかの腫瘍は、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６などの炎症性サイトカインを分泌する腫瘍微小環境細胞によって引き起こされるまたは促進される。いくつかの例において、そのようなサイトカインの発現は、腫瘍抵抗性の形成をもたらす。サイトカイン阻害剤と抗がん化合物の併用は、そのような処置の奏効率を有意に改善する、または腫瘍抵抗性を打破することができる。これは、サイトカインに誘導されるシグナル伝達の阻害の広域スペクトルが達成されるので、本発明によって提供される。がん徴候におけるそのような活性は、がん細胞の直接的な枯渇活性によって達成されるものではないが、ＩＬ１Ｒ３シグナル伝達経路をモジュレートすることによってがん関連炎症を阻害する。本発明の抗体は、がん関連慢性炎症の有効な阻害を可能にするので非常に好ましい活性プロファイルを提供し、同時に、抗体エフェクター機能を呈さず、したがってＩＬ－１Ｒ３を発現する標的細胞の生存率に影響を及ぼさないので望ましくない副作用を回避する。

したがって、本発明の一実施形態において、抗体または医薬組成物は、患者の処置に使用され、患者は、固形腫瘍などの腫瘍を含み、細胞傷害性、細胞増殖抑制または標的化／免疫治療に不十分な応答または腫瘍抵抗性を示す。

本発明の一態様において、発明によるヒト化抗体および／または医薬組成物は、１つもしくは複数の細胞傷害性、細胞増殖抑制または標的化抗がん化合物と組み合わせたがんの処置に使用するためのものを意味する。サイトカイン阻害剤および細胞傷害性、細胞増殖抑制または標的化抗がん化合物の使用は、そのような処置の奏効率を有意に改善する、または腫瘍抵抗性を打破することができる。

本発明のそのような態様において、がんは、膵臓がん、肝臓がん、肺がん（アスベスト、感染症、喫煙、二酸化ケイ素によって引き起こされる炎症に関連する）、非小細胞肺がん、結腸直腸がん／大腸炎関連がん（炎症性腸疾患に関連する）、胃がん、胃部がん、慢性胃炎関連胃部がん、エストロゲン受容体陽性乳がん、頭頸部扁平上皮細胞癌腫、中皮腫、胆嚢がん（胆嚢結石関連慢性胆嚢炎関連）、卵巣がん、膀胱がん、前立腺がん、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）感染症関連前立腺がん、甲状腺がん、ホジキン病、ＭＡＬＴリンパ腫、唾液腺がん、黒色腫、子宮内膜症関連子宮内膜癌腫、バレット食道炎に関連する食道がんからなる群から好ましくは選択される。

本発明の方法の一態様において、本発明によるＩＬ１Ｒ３抗体または医薬組成物は、１つもしくは複数の細胞傷害性、細胞増殖抑制または標的化抗がん剤と同時に投与される。別の態様において、抗体または医薬組成物は、１つもしくは複数の細胞傷害性、細胞増殖抑制または標的化抗がん剤と共に順次投与される。

後者の場合、抗体は、１つもしくは複数の細胞傷害性、細胞増殖抑制または標的化抗がん薬剤による処置後に投与されることが好ましい。

本発明による細胞傷害性または細胞増殖抑制剤は、タキサン、アントラサイクリン、アルキル化剤、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、キナーゼ阻害剤、ヌクレオチド類似体、ペプチド抗生物質、プラチナ製剤およびチェックポイント阻害剤であり得る。

好ましくは、標的化抗がん剤は、セツキシマブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、パニツムマブなどの抗ＥＧＦＲ化合物およびトラスツズマブ、ａｄｏ－トラスツズマブエムタンシン、ペルツズマブなどの抗ＨＥＲ２化合物のうちの１つ、またはその組合せから選択した。

標的化抗がん剤は、チェックポイント阻害剤であることがさらに好ましい。これらは、それだけには限らないが：ペムブロリズマブおよびニボルマブなどの抗ＰＤ１化合物、およびアテゾリズマブ、アベルマブおよびデュルバルマブなどの抗ＰＤＬ１化合物、ならびにイピリムマブおよびトレメリムマブなどの抗ＣＴＬＡ－４化合物であり得る。

実施例
以下の実施例を図表と組み合わせて使用して、本発明を例証する。

Ｂ細胞上清におけるＰ０１３＿０３（ヒトＩＬ－１Ｒ３）特異的抗体の決定
アッセイ原理：
ＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｐ ３８４ウェルマイクロタイタープレートを、Ｐ０１３＿０３でコーティングする。ブロッキング過程後、Ｂ細胞上清由来特異的抗体は、抗原に結合し、次いで、ＰＯＤ標識抗体によって検出される。サンプルを、１：２希釈で試験する。

材料：
プレート：３８４ウェルＮｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート；カタログ番号４６４７１８
タンパク質：Ｐ０１３－０３（濃度１．５ｍｇ／ｍｌ；アッセイ濃度０．５μｇ／ｍｌ）
標準Ａｂ：Ｐ０１３－０２（濃度１ｍｇ／ｍｌ；開始アッセイ濃度２μｇ／ｍｌ）
検出Ａｂ：抗ウサギＩｇＧ、ペルオキシダーゼに連結された種特異的全抗体（ロバ由来）（ＥＣＬ）；ＧＥ；カタログ番号ＮＡ９３４０；アッセイ希釈：１：５０００
ＰＢＳ：Ｂｕｆｆｅｒｓ ｉｎ ａ Ｂｏｘ，Ｐｒｅｍｉｘｅｄ ＰＢＳ Ｂｕｆｆｅｒ；Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ番号１１６６６７８９００１
ＢＳＡ：ウシ血清由来ウシ血清アルブミン画分Ｖ；Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ番号１０７３５０８６００１
Ｔｗｅｅｎ２０：Ｔｗｅｅｎ２０；Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ；カタログ番号９１２７．２
ＴＭＢ：ＴＭＢ溶液；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ番号ＳＢ０２
ＨＣｌ：１Ｍ Ｔｉｔｒｉｐｕｒ塩酸；Ｍｅｒｃｋ；カタログ番号１０９０５７１０００
ＥＬＩＳＡ緩衝液：ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ
洗浄緩衝液：ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ
ブロッキング緩衝液：ＰＢＳ、２％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ
サンプル：Ｅｌｉｓａ緩衝液中に１：２希釈

手順：
１．３８４ウェルＮＵＮＣ ＭａｘｉｓｏｒｐプレートにＰＢＳ中のＰ０１３－０３（０．５μｇ／ｍｌ） １２．５μＬを添加し、室温で１時間インキュベートする。
２．洗浄緩衝液９０μｌで３回洗浄する。
３．各ウェルにブロッキング緩衝液９０μＬを添加し、室温で１時間インキュベートする。
４．洗浄緩衝液で３回洗浄する。
５．Ｅｌｉｓａ緩衝液に１：２希釈の標準抗体または１：２希釈したサンプル１２．５μＬを添加し、室温で１時間インキュベートする。
６．洗浄緩衝液で３回洗浄する。
７．Ｅｌｉｓａ緩衝液中の１：５０００ ＰＯＤ抗体１２．５μＬを添加し、室温で１時間インキュベートする。
８．洗浄緩衝液で６回洗浄する。
９．ＴＭＢ １５μＬを添加する。
１０．十分な発色後にＨＣｌ １５μＬを添加する。
１１．４５０ｎｍ／６２０ｎｍで、吸光度を読み取る。

ルシフェラーゼレポーター実験による、Ｐ０１３－受容体を阻害するＰ０１３特異的抗体の同定
アッセイ原理：
ＮＦ－ｋＢ－ＲＥホタルルシフェラーゼレポーターを発現する２９３Ｔ／１７－ＦＲ細胞を、ポリ－Ｄ－リジン－細胞培養プレートに播種する。Ｐ０１３の刺激後、２９３Ｔ／１７－ＦＲ溶解物を、Ｓｔｅａｄｙ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを使用して、活性化されたＮＦ－ｋＢについて試験する。機能的抗体を含む上清は、Ｐ０１３に結合し、ＮＦ－ｋＢ活性化を阻害し、それは低いシグナルで示される。サンプルを、Ｐ０１３溶液中に１：２希釈で試験する。

材料：
プレート：細胞プレート：３８４ウェルＰＤＬ Ｃｏｓｔａｒ細胞培養プレート；カタログ番号３８４４
アッセイプレート：３８４ウェルｌｕｍｉｔｒａｃ白色プレート；Ｃｏｒｎｉｎｇ；カタログ番号３５７２
細胞：２９３Ｔ／１７－ＦＲ；アッセイ濃度２５０，０００個細胞／ｍｌ
細胞継代がより高いほど、シグナルはより低い！
タンパク質：Ｐ０１３＿０５（濃度０．０３ｍｇ／ｍｌ；アッセイ濃度１１５ｐｇ／ｍｌ；作業濃度２３０ｐｇ／ｍｌ）
標準Ａｂ：Ｐ０１３＿０６（濃度０．２ｍｇ／ｍｌ；開始作業濃度６μｇ／ｍｌ）
キット：Ｓｔｅａｄｙ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ；Ｐｒｏｍｅｇａ；カタログ番号Ｅ２５１０
細胞培地：ＤＭＥＭ培地；ＰＡＮ Ｂｉｏｔｅｃｈ；カタログ番号Ｐ０４－０４５１０
ＦＣＳ：ウシ胎仔血清、ＨｙＣｌｏｎｅ；Ｔｈｅｒｍｏ；カタログ番号Ｓｔ３００７０．０３
２９３Ｔ／１７－ＦＲ培地：ＤＭＥＭ培地、１０％ＦＣＳ、（＋２０μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢ、培養のためのみ）
馴化Ｂ細胞培地（ＭＡＢ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）
サンプル：ＤＭＥＭ培地＋１０％ＦＣＳ中にＰ０１３＿０５を含む１：２希釈

手順：
１．細胞培養手順：毎月曜日（播種：５×１０^６個細胞／Ｔ１７５フラスコ）および金曜日（播種：３×１０^６個細胞／Ｔ１７５フラスコ）にトリプシン／ＥＤＴＡを使用して（室温で３０秒間のみインキュベートする）コンフルエント２９３Ｔ／１７－ＦＲ細胞を分割する。
２．３８４ウェルＰＤＬプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ カタログ＃３８４４）にＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ ２５μＬ中の細胞（０．２５×１０^６個細胞／ｍｌ）を播種し、３７℃および５％ＣＯ_２で終夜インキュベートする。
３．培地を吸引し、馴化培地中に１：３希釈のサンプルもしくはＰ０１３＿０６を１２．５μｌ添加し、または馴化培地のみを添加し、３７℃および５％ＣＯ_２で３０分間インキュベートする（プログラム：３ Ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓａｍｐｌｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ）
４．ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ中のＰ０１３＿０５ １２．５μｌを添加し、３７℃および５％ＣＯ_２で５時間インキュベートする（プログラム：４＿Ａｄｄ Ｐ０１３＿０５）。
５．培養細胞を１０分間室温に平衡化する。
６．Ｓｔｅａｄｙ－Ｇｌｏ試薬２５μｌを添加し、ピペットで数回混合する（プログラム：６＿Ｓｔｅａｄｙ Ｇｌｏ）
７．３８４ウェルｌｕｍｉｔｒａｃ白色プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ＃３５７２）に、上清４５μｌを移動する前に５分間待つ（プログラム：７＿Ｔｒａｎｓｆｅｒ ４５μｌ）
８．Ｔｅｃａｎ Ｒｅａｄｅｒで発光を測定する：積分時間：０．５秒

Ｂ細胞上清中のｈｕＩＬ１ＲａＰ、ｍｓＩＬ１ＲａＰ、ＣＤ１３４およびＣＤ１３７特異的抗体の決定
アッセイ原理：
ＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｐ ３８４ウェルマイクロタイタープレートを、標的タンパク質でコーティングする。ブロッキング過程後、Ｂ細胞上清由来特異的抗体は、標的に結合し、次いで、ＰＯＤ標識抗体によって検出される。

材料：
プレート：３８４ウェルＮｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート；カタログ番号４６４７１８
タンパク質：
切断したｈｕＩＬ１ＲａＰ（Ｐ０２６＿１２；濃度０．９６ｍｇ／ｍＬ；アッセイ濃度０．２５μｇ／ｍＬ）
切断したｍｕＩＬ１ＲａＰ（Ｐ０２６＿１３；濃度０．９３ｍｇ／ｍＬ；アッセイ濃度０．２５μｇ／ｍＬ）
切断したＣＤ１３４（Ｐ０２６＿１４；濃度０．５１ｍｇ／ｍＬ；アッセイ濃度０．２５μｇ／ｍＬ）
切断したＣＤ１３７（Ｐ０２６＿１５；バッチ２；濃度１．１ｍｇ／ｍＬ；アッセイ濃度１μｇ／ｍＬ）
標準Ａｂ：
ヒトＩＬ－１ ＲＡｃＰ／ＩＬ－１ Ｒ３抗体（Ｐ０１３＿６／Ｐ０２６＿０８；濃度０．２ｍｇ／ｍＬまたは０．３９９ｍｇ／ｍＬ；開始アッセイ濃度２μｇ／ｍＬ；ｈｕＩＬ１ＲａＰおよびｍｓＩＬ１ＲａＰに使用される）
ＭＡＢ－１４－０２８３（濃度０．６ｍｇ／ｍＬ；開始アッセイ濃度２μｇ／ｍＬ；ＣＤ１３４に使用される）
ＭＡＢ－１４－０２８５（濃度１ｍｇ／ｍＬ；開始アッセイ濃度２μｇ／ｍＬ；ＣＤ１３７に使用される）
検出Ａｂ：
サンプル：抗ウサギＩｇＧ、ペルオキシダーゼに連結された種特異的Ｆａｂ_２断片（ロバ由来）（ＥＣＬ）；ＧＥ；カタログ番号ＮＡ９３４０；アッセイ希釈：ＥＬＩＳＡ緩衝液中に１：５０００
ＭＡｂ－１４－０２８３およびＭＡｂ－０２８５の場合：抗ヒトＩｇＧ、ペルオキシダーゼに連結された種特異的Ｆａｂ_２断片（ヤギ由来）（ＨＲＰ）；ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ；カタログ番号ＳＴＡＲ１２６Ｐ；アッセイ希釈：ＥＬＩＳＡ緩衝液中に１：５０００
ｈｕＩＬ１ＲａＰおよびｍｓＩＬ１ＲａＰの場合：ペルオキシダーゼコンジュゲートされたＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅロバ抗ヤギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）；Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ；カタログ番号７０５－０３５－００３；アッセイ希釈：ＥＬＩＳＡ緩衝液中に１：５０００
ＰＢＳ：Ｂｕｆｆｅｒｓ ｉｎ ａ Ｂｏｘ，Ｐｒｅｍｉｘｅｄ ＰＢＳ Ｂｕｆｆｅｒ，１０ｘ；Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ番号１１６６６７８９００１
ＢＳＡ：ウシ血清由来ウシ血清アルブミン画分Ｖ；Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ番号１０７３５０８６００１
Ｔｗｅｅｎ２０：Ｔｗｅｅｎ２０；Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ；カタログ番号９１２７．２
ＴＭＢ：ＴＭＢ溶液；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ番号ＳＢ０２
ＨＣｌ：１Ｍ Ｔｉｔｒｉｐｕｒ塩酸；Ｍｅｒｃｋ；カタログ番号１０９０５７１０００
ＥＬＩＳＡ緩衝液：ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ
洗浄緩衝液：ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ
ブロッキング緩衝液：ＰＢＳ、２％ ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ
サンプル：ＥＬＩＳＡ緩衝液中に１：４希釈

手順：
１．３８４ウェルＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートに、ＰＢＳ中に希釈した０．２５μｇ／ｍＬまたは１μｇ／ｍＬタンパク質１２．５μＬを添加し、室温で１時間インキュベートする。
２．洗浄緩衝液９０μＬで３回洗浄する。
３．各ウェルにブロッキング緩衝液９０μＬを添加し、室温で１時間インキュベートする。
４．洗浄緩衝液９０μＬで３回洗浄する。プレートは、アルミホイルで密閉した乾燥状態で、－２０℃で６週間まで保存することができる。
５．１：２希釈工程の標準抗体またはサンプル（ＥＬＩＳＡ緩衝液に希釈した）１２．５μＬを添加し、室温で１時間インキュベートする。
６．洗浄緩衝液９０μＬで３回洗浄する。
７．ＥＬＩＳＡ緩衝液中の１：５０００ ＰＯＤ抗体１２．５μＬを添加し、室温で１時間インキュベートする。
８．洗浄緩衝液９０μＬで６回洗浄する。
９．ＴＭＢ １５μＬを添加する。
１０．１５分間の発色後にＨＣｌ １５μＬを添加する。
１１．４５０ｎｍ／６２０ｎｍで、吸光度を読み取る。

ＩＬ－１（α／β）による刺激後のＡ５４９－ＮＦκＢ－ＲＥ－Ｌｕｃを安定にトランスフェクトした細胞のＮＦκＢ発現の阻害
アッセイ原理：
Ａ５４９－ＮＦκＢ－ＲＥ－Ｌｕｃを安定にトランスフェクトした細胞（Ｓｉｇｎｏｓｉｓ）を、３８４ウェルプレートにピペットで移し、終夜インキュベートする。２日目に、抗ＩＬ１Ｒ３抗体を、Ａ５４９－ＮＦｋＢ－ＲＥ－Ｌｕｃを安定にトランスフェクトした細胞に結合させ、次いで、その細胞を、ＩＬ－１（αまたはβ）の添加によって刺激する。これは、ＮＦκＢシグナル伝達経路の活性化によるルシフェラーゼ遺伝子の転写をもたらし、細胞溶解およびルシフェリンの添加によって測定することができる。抗体が、ＮＦｋＢ経路の活性化を阻害し、したがって発光シグナルを低下させ得るかどうかを試験する。

材料：
プレート：３８４ウェルローフランジ白色平底ポリスチレンＴＣ処理無菌マイクロプレート；Ｃｏｒｎｉｎｇ；カタログ番号３５７０
タンパク質：
ＩＬ－１α（Ｐ０２６＿０９）；組換えヒトＩＬ－１アルファ／ＩＬ－１Ｆ１；１０μｇ／ｍＬ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号２００－ＬＡ－００２
ＩＬ－１β（Ｐ０２６＿１０）；組換えヒトＩＬ－１ベータ／ＩＬ－１Ｆ２；２５μｇ／ｍＬ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号２００－ＬＢ－００５
標準Ａｂ：ＭＡＢ－１５－０１１５；ＭＡＢ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＧｍｂＨ；２．５１ｍｇ／ｍｌ；作業濃度１０μｇ／ｍｌ
細胞：Ａ５４９－ＮＦκＢ－ＲＥ－Ｌｕｃを安定にトランスフェクトした細胞；Ｓｉｇｎｏｓｉｓ；カタログ番号ＳＬ－００１４
培地：ＤＭＥＭ；ＰＡＮ；カタログ番号Ｐ０４－０４５１０
ＦＣＳ：ウシ胎仔血清Ｓｏｕｔｈ Ａｆｒｉｃａ Ｌｏｗ ＩｇＧ；Ｐａｎ；カタログ番号１５５２－Ｐ１２０９０９
Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ：１０，０００Ｕペニシリン／ｍｌ；１０ｍｇストレプトマイシン／ｍｌ；ＰＡＮ Ｂｉｏｔｅｃｈ；カタログ番号Ｐ０６－０７１００
剥離剤：トリプシン－ＥＤＴＡ １ｘ；Ｐａｎ；カタログ番号Ｐ１０－０２３１００（Ｔ１７５の場合４ｍＬ／Ｔ７５の場合２ｍＬ；およそ８分３７℃）
細胞培地：ＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ
検出キット：Ｓｔｅａｄｙ－Ｇｌｏ（商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ；Ｐｒｏｍｅｇａ；カタログ番号Ｅ２５１０

手順：
１．細胞培地中でＡ５４９－ＮＦκＢ－ＲＥ－Ｌｕｃを安定にトランスフェクトした細胞を培養する（１．７Ｅ＋０４個細胞／ｃｍ^２で３日間；２．２８Ｅ＋０４個細胞／ｃｍ^２で２日間）。継代１０回を超えない！
２．ウェル当たり培地２５μＬ中のＡ５４９－ＮＦκＢ－ＲＥ－Ｌｕｃを安定にトランスフェクトした細胞４００００個（濃度＝１．６×１０^６個細胞／ｍＬ）を、白色の細胞培養処理された平底３８４ウェルプレートに播く。３７℃／５％ＣＯ_２で終夜インキュベートする。
３．ＣｙＢｉｏピペット操作ロボット（プログラム：フォルダＰ０２６／ＮＦｋＢ内の「Ｍｅｄｉｕｍ ｒｅｍｏｖａｌ ａｎｄ ｓａｍｐｌｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ」）を使用して、プレートから培地を吸引し、培地中のサンプルまたは標準１０μＬをプレートに添加する。３７℃／５％ＣＯ_２で１時間インキュベートする。
４．ＣｙＢｉｏピペット操作ロボット（プログラム：フォルダＰ０２６／ＮＦκＢ内にある「Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｆｒｏｍ ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ」）を使用して、培地中のＩＬ－１（αまたはβ）（作業濃度０．２ｎｇ／ｍＬ；アッセイ濃度０．１ｎｇ／ｍＬ）１０μＬをプレートに添加し、３７℃／５％ＣＯ_２で５時間インキュベートする。
工程４を実行する前に、Ｓｔｅａｄｙ－ＧｌｏプロトコールにしたがってＳｔｅａｄｙ－Ｇｌｏ緩衝液にＳｔｅａｄｙ－Ｇｌｏ基質を溶解し、この溶液およびアッセイプレートを室温に平衡化する。
５．Ｓｔｅａｄｙ－Ｇｌｏミックス２０μＬを添加し、十分に混合して、適当な細胞溶解を保証する。室温で１０分インキュベートする。
６．積分時間５００ｍｓに設定したマイクロプレートリーダー（プログラム：Ｌｕｍｉｎｅｓｚｅｎｚ－３８４）を使用して、各ウェルの相対的発光単位を決定する。

ＩＬ－１（α／β）による刺激後のＡ５４９細胞のＩＬ－６分泌
アッセイ原理：
Ａ５４９細胞を、３８４ウェルプレート中にピペットで移し、抗ＩＬ１Ｒ３抗体とインキュベートする。その後、細胞を、ＩＬ－１（αまたはβ）で刺激し、アッセイ培地中にＩＬ－６を分泌させる。ＩＬ－６の量を、ＩＬ－６ ＥＬＩＳＡによって測定する。

材料：
アッセイキット：ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡヒトＩＬ－６；カタログ番号ＤＹ２０６－０５（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）；ＤｕｏＳｅｔは、ヒトＩＬ－６捕捉抗体（パーツ８４０１１３）、ヒトＩＬ－６検出抗体（パーツ８４０１１４）、ヒトＩＬ－６（パーツ８４０１１５）およびストレプトアビジン－ＨＲＰ（パーツ８９３９７５５）からなる
プレート：３８４ウェル透明細胞培養処理プレート；Ｃｏｒｎｉｎｇ；カタログ番号３７０１ ３８４ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレート；Ｎｕｎｃ；カタログ番号４６４７１８
ＰＰ－プレート：１２０μＬ ３８４ディープウェル「ダイヤモンド」プレート、透明；Ａｘｙｇｅｎ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）；カタログ番号Ｐ－３８４－１２０ＳＱ－Ｃ
タンパク質：
ＩＬ－１α；組換えヒトＩＬ－１アルファ／ＩＬ－１Ｆ１；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号２００－ＬＡ－００２
ＩＬ－１β；組換えヒトＩＬ－１ベータ／ＩＬ－１Ｆ２；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号２００－ＬＢ－００５
ｒｈＩＬ１－ｒａ／ＩＬ－１Ｆ３；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号２８０－ＲＡ－０１０
標準Ａｂ：ヒトＩＬ－１ＲＡｃＰ／ＩＬ－１Ｒ３抗体；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号ＡＦ６７６またはＡＦ６７６－ＳＰ
培地：ＤＭＥＭ；ＰＡＮ；カタログ番号Ｐ０４－０４５１０
ＦＣＳ：ウシ胎仔血清Ｓｏｕｔｈ Ａｆｒｉｃａ Ｌｏｗ ＩｇＧ；Ｐａｎ；カタログ番号１５５２－Ｐ１２０９０９
Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ：１０，０００Ｕペニシリン／ｍｌ；１０ｍｇストレプトマイシン／ｍｌ；ＰＡＮ Ｂｉｏｔｅｃｈ；カタログ番号Ｐ０６－０７１００
ＰＢＳ：Ｂｕｆｆｅｒｓ ｉｎ ａ Ｂｏｘ，Ｐｒｅｍｉｘｅｄ ＰＢＳ Ｂｕｆｆｅｒ，１０ｘ；Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ番号１１６６６７８９００１
ＢＳＡ：ウシ血清由来ウシ血清アルブミン画分Ｖ；Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ番号１０７３５０８６００１
Ｔｗｅｅｎ２０：Ｔｗｅｅｎ２０；Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ；カタログ番号９１２７．２
ＴＭＢ：ＴＭＢ溶液；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ番号ＳＢ０２
ＨＣｌ：１Ｍ Ｔｉｔｒｉｐｕｒ塩酸；Ｍｅｒｃｋ；カタログ番号１０９０５７１０００
ＥＬＩＳＡ緩衝液：ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ
洗浄緩衝液：ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ
ブロッキング緩衝液：ＰＢＳ、２％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ
細胞培地：ＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ

手順：
細胞刺激
１．ウェル当たり培地２５μＬ中のＡ５４９細胞６，０００個（濃度＝２．４×１０^５個細胞／ｍＬ）を、細胞培養プレートに播く。３７℃／５％ＣＯ_２で終夜インキュベートする。
２． プレートから培地を吸引し、培地中のサンプルまたは標準１２．５μＬをプレートに添加する。３７℃／５％ＣＯ_２で３時間インキュベートする。
３．ＩＬ－１（αまたはβ）１２．５μＬをプレートに添加し（作業濃度０．２ｎｇ／ｍＬ；アッセイ濃度０．１ｎｇ／ｍＬ）、３７℃／５％ＣＯ_２で４８時間インキュベートする。
４．培地を吸引し、コーティングおよびブロッキングされたＥｌｉｓａプレートに移動させる（工程９）。別法として、上清を、ＰＰ－プレート中で、－８０℃で１週間まで保存することができる。

Ｅｌｉｓａプレート調製
５．捕捉抗体をＰＢＳ中に２μｇ／ｍＬの濃度に希釈する。１ウェル当たり１２．５μＬの希釈した捕捉抗体で３８４ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレートを直ちにコーティングする。プレートを密閉し、室温で１時間インキュベートする。
６．各ウェルを吸引し、洗浄緩衝液で洗浄し、その過程を２回繰り返して、合計３回洗浄する。自動洗浄機を使用して各ウェルを洗浄緩衝液（９０μＬ）で満たすことにより洗浄する。各工程において液体を完全に除去することが、優れた成績のために必須である。最後の洗浄後、プレートを吸引することによってまたは逆さにし、きれいな紙タオルに吸い取らせることによって少しの残りの洗浄緩衝液も除去する。
７．各ウェルにブロッキング緩衝液９０μＬを添加することによってプレートをブロッキングする。室温で最低１時間インキュベートする。
８．工程６のように吸引／洗浄を繰り返す。これでプレートは、サンプル添加の用意ができている。コーティングし、ブロッキングしたプレートは、乾燥状態で、－２０℃で１か月間まで保存することができる。

アッセイ手順
９．ウェル当たり、ＥＬＩＳＡ緩衝液（ＥＢ）に希釈した高純度サンプルまたはＩＬ－６標準１２．５μＬを添加する。カバーをかけ、室温で１時間インキュベートする。
１０．Ｅｌｉｓａプレート調製の工程６のように吸引／洗浄を繰り返す。
１１．各ウェルにＥＢに希釈した検出抗体１２．５μＬを添加する。カバーをかけ、室温で１時間インキュベートする。
１２．Ｅｌｉｓａプレート調製の工程６のように吸引／洗浄を繰り返す。
１３．各ウェルへＥｌｉｓａ緩衝液に１：４０希釈したストレプトアビジン－ＨＲＰ １２．５μＬを添加する。プレートにカバーをし、室温で２０分間インキュベートする。直射光にプレートを置くことを避ける。
１４．Ｅｌｉｓａプレート調製の工程６のように吸引／洗浄を繰り返す。
１５．各ウェルに基質溶液（ＴＭＢ）１５μＬを添加する。室温で２０分間インキュベートする。
１６．各ウェルに停止溶液（ＨＣｌ、１Ｍ）１５μＬを添加する。プレートを穏やかにたたいて、完全な混合を確実にする。
１７．４５０ｎｍに設定したマイクロプレートリーダーを使用して各ウェルの光学密度を直ちに決定する。波長修正が利用可能な場合、５４０ｎｍまたは５７０ｎｍに設定する（プログラム：ＴＭＢ ｓｔｏｐ ３８４ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ）。修正せずに４５０ｎｍで直接行った読み取りは、より高いおよびより低い精度になり得る。

競合アッセイによるｈｕＩＬ１ＲａＰ特異的抗体の結合特徴の決定
アッセイ原理：
ＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｐ ３８４ウェルマイクロタイタープレートを、参照抗体Ｃａｎ０４でコーティングする。この時間の間に、Ｈｉｓタグ標的タンパク質を、試験する二次抗体および抗ＨＩＳ－ＰＯＤ抗体とプレインキュベートする。その後、このプレインキュベーションミックスを、アッセイプレートに添加し、十分な発色時間後に、４５０ｎｍ／６２０ｎｍで吸光度を測定する。

材料：
プレート：３８４ウェルＮｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート；カタログ番号４６４７１８
コーティングＡｂ：Ｃａｎ０４（Ｍａｂ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＧｍｂＨ；ＣＥＰ Ａｂ番号１８４；濃度１ｍｇ／ｍｌ；アッセイ濃度１００ｎｇ／ｍｌ）
タンパク質：ｈｕＩＬ１ＲａＰ－Ｈｉｓタンパク質（Ｐ０２６＿０１；Ｆｕｓｉｏｎ＿１＿Ｃｈａｉｎ＿Ａホモ二量体ｈｕＩＬ１ＲａＰ－Ｈｉｓタグ；ＧｅｎｅＡｒｔ；濃度３ｍｇ／ｍｌ；アッセイ濃度６２．５ｎｇ／ｍｌ）
標準Ａｂ：Ｃａｎ０４（参照：「コーティングＡｂ」；開始作業濃度３μｇ／ｍｌ）
陰性対照：Ｈｅｒ２抗体（Ｌｉｆｅｓｐａｎ；カタログ番号ＬＳ－Ｃ９５８０８／２６３５８；濃度２２５μｇ／ｍＬ；開始作業濃度３μｇ／ｍｌ）
検出Ａｂ：抗Ｈｉｓ ＰＯＤ抗体（モノクローナル抗ポリヒスチジンペルオキシダーゼコンジュゲート；Ｓｉｇｍａ；カタログ番号Ａ７０５８；濃度７．５ｍｇ／ｍｌ；アッセイ濃度：３．３３μｇ／ｍｌ）
ＰＢＳ：Ｂｕｆｆｅｒｓ ｉｎ ａ Ｂｏｘ，Ｐｒｅｍｉｘｅｄ ＰＢＳ Ｂｕｆｆｅｒ，１０ｘ；Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ番号１１６６６７８９００１
ＢＳＡ：ウシ血清由来ウシ血清アルブミン画分Ｖ；Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ番号１０７３５０８６００１
Ｔｗｅｅｎ２０：Ｔｗｅｅｎ２０；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；カタログ番号Ｐ１３７９
ＴＭＢ：ＴＭＢ溶液；Ｍｅｒｃｋ；カタログ番号ＣＬ０７
ＨＣｌ：１Ｍ Ｔｉｔｒｉｐｕｒ塩酸；Ｍｅｒｃｋ；カタログ番号１０９０５７１０００
ＥＬＩＳＡ緩衝液：ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ
洗浄緩衝液：ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ
ブロッキング緩衝液：ＰＢＳ、２％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ

手順：
１２．プレインキュベーションミックスを調製し、室温で２時間インキュベートする。
ａ．プレインキュベーション（３８４ウェルプレート中）
ｉ．ＥＬＩＳＡ緩衝液中の二次抗体希釈系列（希釈１：２；開始作業濃度３μｇ／ｍｌ）またはブランク１０μｌを、
ｉｉ．Ｈｉｓタグタンパク質（アッセイ濃度６２．５ｎｇ／ｍｌ）１０μｌ、および
ｉｉｉ．抗Ｈｉｓ ＰＯＤ抗体（アッセイ濃度３．３３μｇ／ｍｌ）１０μｌと混合し、室温で１時間インキュベートする。
１３．その間に、ＰＢＳ中のコーティング抗体（Ｃａｎ０４；アッセイ濃度１００ｎｇ／ｍｌ）２０μＬでＮｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートをコーティングし、室温で１時間インキュベートする。
１４．洗浄緩衝液９０μｌで３回洗浄する。
１５．ブロッキング緩衝液９０μｌにより室温で１時間ブロッキングする。
１６．洗浄緩衝液で３回洗浄する。
１７．ＥＬＩＳＡ緩衝液中のプレインキュベーションミックス２０μｌを室温で１時間添加する。
１８．洗浄緩衝液で６回洗浄する。
１９．ＴＭＢ ２５μＬを添加する。
２０．十分な発色後ＨＣｌ ２５μＬを添加する。
２１．４５０ｎｍ／６２０ｎｍで吸光度を読み取る。

ＩＬ１２カウンタースクリーン
アッセイ原理：
ＩＬ１２結合を、カウンタースクリーンとして使用する。ＨＥＲタンパク質を、ＩＬ１２タンパク質のようにリンカー、ｈｕＦｃおよびＨｉｓでタグ付けする（ＨＥＲ１は、Ｈｉｓ－Ｔａｇを持たない）。タグに結合する抗体は、両方のアッセイにおいて陽性であるが、抗原特異的抗体は、ＨＥＲタンパク質にだけ結合し、ＩＬ１２に結合しない。

材料：
プレート：３８４ウェルＮｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート；カタログ番号４６４７１８
タンパク質：組換えヒトＩＬ－１２ Ｒβ１ Ｆｃキメラ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号８３９－Ｂ１；アッセイ濃度０．５μｇ／ｍＬ
標準Ａｂ：ＩＬ－１２Ｒベータ１抗体；ＧｅｎｅＴｅｘ；カタログ番号ＧＴＸ１０３９１７；１ｍｇ／ｍＬ；開始アッセイ濃度５００ｎｇ／ｍＬ（その後１：２希釈）
検出Ａｂ：抗ウサギＩｇＧ、ペルオキシダーゼに連結された種特異的Ｆａｂ_２断片（ロバ由来）（ＥＣＬ）；ＧＥ；カタログ番号ＮＡ９３４０；アッセイ希釈：１：５０００
サンプル：ＥＬＩＳＡ緩衝液中の希釈は、計画によって決まる（高濃縮されたＩｇＧの場合、１：２希釈が推奨される）

手順：
１．３８４ウェルＮＵＮＣ ＭａｘｉｓｏｒｐプレートにＰＢＳ中の０．５μｇ／ｍＬ ＨＥＲタンパク質１２．５μＬを添加し、室温で１時間インキュベートする。
２．洗浄緩衝液で３回洗浄する。
３．各ウェルにブロッキング緩衝液９０μＬを添加し、室温で１時間インキュベートする。
４．洗浄緩衝液で３回洗浄する。プレートを、アルミホイルで密閉して－２０℃で数週間凍結できる。
５．ＥＬＩＳＡ緩衝液に１：２希釈の標準抗体または希釈したサンプル１２．５μＬを添加し、室温で１時間インキュベートする。（凍結プレートは、サンプル適用の直前に解凍されるべきである）。
６．洗浄緩衝液で３回洗浄する。
７．ＥＬＩＳＡ緩衝液中の１：５０００ ＰＯＤ抗体１２．５μＬを添加し、室温で１時間インキュベートする。
８．洗浄緩衝液で６回洗浄する。
９．ＴＭＢ １５μＬを添加する。
１０．十分な発色後にＨＣｌ １５μＬを添加する（計画よって決まる；他のアッセイより短くないＩＬ１２アッセイ）。
１１．４５０ｎｍ／６２０ｎｍで、吸光度を読み取る。

細胞結合分析
Ａ５４９およびＮＩＨ－３Ｔ３細胞を、ＤＭＥＭ＋１０％ ＦＣＳ中で培養した。ＨＥＫ－２９３細胞を、ＤＭＥＭ＋１５％ＦＣＳ中でおよびＳＫ－ＭＥＬ－３０をＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ中で培養した。細胞を、Ａｃｃｕｍａｘ（Ｓｉｇｍａ）を使用して採取し、ＰＢＳで洗浄し、染色緩衝液（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に再懸濁した。染色緩衝液中で抗ＩＬ－１Ｒ３抗体を、濃度１０μｇ／ｍｌ、４℃で３０分間、細胞とインキュベートした。ＳＫ－ＭＥＬ－３０細胞結合分析のＥＣ５０のために、細胞を、２０μｇ／ｍｌで開始する１：２希釈系列とインキュベートした。細胞を、染色緩衝液で洗浄し、Ａｌｅｘａ－４８８標識したヤギ抗ヒト二次抗体（Ｄｉａｎｏｖａ）と４℃で３０分間インキュベートした。細胞を、染色緩衝液で洗浄し、１：１００希釈したＤＲＡＱ７（Ａｂｃａｍ）死細胞染色を含有する緩衝液に再懸濁した。細胞を、ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６ Ｓａｍｐｌｅｒフローサイトメーターを使用して分析した。フィッティング曲線およびＥＣ５０算出を、Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）およびＸＬｆｉｔ（ＩＤＢＳ）を使用して行った。

生化学的ヒト－ＩＬ－１Ｒ３ ＥＬＩＳＡ
Ｎｕｎｃ ３８４ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレートを、ＰＢＳ中に０．２５μｇ／ｍｌの濃度の組換えＦｃタグ付きｈＩＬ－１Ｒ３（Ｓｅｒ２１－Ｇｌｕ３５９）で、室温で６０分間コーティングした。プレートを、洗浄緩衝液（ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ）で３回洗浄し、ＰＢＳ、０．２％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎで、室温で６０分間ブロッキングした。洗浄緩衝液で３回洗浄した後、抗体を、６～０．０３μｇ／ｍｌの範囲（１：３希釈系列）の濃度でＥＬＩＳＡ緩衝液（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ）に添加し、室温で６０分間インキュベートした。プレートを、洗浄緩衝液で３回洗浄し、続いてＥＬＩＳＡ緩衝液中に１：５０００希釈した抗ヒトＩｇＧペルオキシダーゼ連結、種特異的Ｆ（ａｂ）２断片（ヤギ、ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ）と室温で６０分間インキュベーションした。ＴＭＢ基質溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１５μｌ／ウェル）を添加する前に、プレートを洗浄緩衝液で６回洗浄した。５分間インキュベーションした後、停止溶液（１Ｍ ＨＣｌ、１５μｌ／ウェル）を添加し、吸光度（４５０ｎｍ／６２０ｎｍ）を、Ｔｅｃａｎ Ｍ１０００プレートリーダーを使用して測定した。フィッティング曲線およびＥＣ５０算出を、Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）およびＸＬｆｉｔ（ＩＤＢＳ）を使用して行った。

ＩＬ－１αおよびＩＬ－１β機能的中和アッセイ
Ａ－５４９－ＮＦκＢ－ＲＥ－Ｌｕｃ（Ｓｉｇｎｏｓｉｓ）を、培地２５μＬ中に４０，０００個細胞／ウェルの細胞密度で３８４ウェル白色平底ポリスチレン組織培養処理マイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種する前に、ＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ中で５日間培養した。細胞を、３７℃／５％ＣＯ_２で終夜インキュベートした。培地を、吸引によって除去し、モノクローナルまたはポリクローナル（ヤギ抗ヒトＩＬ－１Ｒ３、ＡＦ６７６、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）抗体を、培地１０μｌ容積中に様々な濃度で添加し、３７℃／５％ＣＯ_２で６０分間インキュベートした。組換えヒトＩＬ－１αまたはＩＬ－１β（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）タンパク質を、０．１ｎｇ／ｍｌの終濃度になるように培地１０μｌに添加し、プレートを、３７℃／５％ＣＯ_２で５時間インキュベートした。Ｓｔｅａｄｙ－Ｇｌｏ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）溶液２０μｌを、各ウェルに添加し、十分に混合し、プレートを、Ｔｅｃａｎ Ｍ１０００プレートリーダーを使用して発光を測定する前に室温で１０分間インキュベートした。フィッティング曲線およびＥＣ５０算出を、Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）およびＸＬｆｉｔ（ＩＤＢＳ）を使用して行った。

ＩＬ－１αおよびＩＬ－１β機能的中和アッセイ－Ａ－５４９ ＩＬ６－放出アッセイ
Ａ５４９細胞を、ＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐの培地２５μＬ中に６０００個細胞／ウェルの密度で３８４ウェル透明細胞培養処理プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種した。細胞を、３７℃／５％ＣＯ_２で終夜インキュベートした。培地を、吸引によって除去し、モノクローナルまたはポリクローナル（ヤギ抗ヒトＩＬ－１Ｒ３、ＡＦ６７６、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）抗体を、培地１２．５μｌ容積中に様々な濃度で添加し、３７℃／５％ＣＯ_２で３時間インキュベートした。組換えヒトＩＬ－１αまたはＩＬ－１β（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）タンパク質を、０．１ｎｇ／ｍｌの終濃度になるように培地１２．５μｌに添加し、プレートを、３７℃／５％ＣＯ_２で４８時間インキュベートした。細胞上清中の分泌されたヒトＩＬ－６レベルを、製造業者の説明書にしたがってＤｕｏＳｅｔヒトＩＬ－６ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＤＹ２０６－０５）を使用して測定した。フィッティング曲線およびＥＣ５０算出を、Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）およびＸＬｆｉｔ（ＩＤＢＳ）を使用して行った。

ＩＬ－３３機能的中和アッセイ
ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－３３細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を、培地１５μｌ中に２５，０００個細胞／ウェルの細胞密度で３８４ウェル透明、平底、細胞培養処理マイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種する前に、ＤＭＥＭ、１０％ ＦＣＳ中で５日間培養した。様々な濃度のモノクローナルまたはポリクローナル（ヤギ抗ヒトＩＬ－１Ｒ３、ＡＦ６７６、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）抗体を、培地５μｌ容積に添加し、プレートを、３７℃／５％ＣＯ_２で６０分間インキュベートした。組換えヒトＩＬ－３３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）タンパク質を、５ｎｇ／ｍｌの終濃度になるように培地５μｌに添加し、プレートを、３７℃／５％ＣＯ_２で終夜インキュベートした。細胞上清５μｌを、２ｘＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ試薬（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）２０μｌを含有する透明、平底ポリスチレンＮＢＳ（商標）マイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に移した。プレートを、３７℃で４５分間インキュベートし、Ｔｅｃａｎ Ｍ１０００プレートリーダーを使用して６５５ｎｍで光学密度を測定した。フィッティング曲線およびＥＣ５０算出を、Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）およびＸＬｆｉｔ（ＩＤＢＳ）を使用して行った。

ＩＬ－３６機能的中和アッセイ
ＨＥＫ２９３／１７－ＩＦ細胞（ＭＡＢ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＧｍｂＨ）を、培地２０μｌ中に３０，０００個細胞／ウェルの細胞密度で３８４ウェル白色、平底、細胞培養処理プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種する前に、ＤＭＥＭ、１０％ ＦＣＳ、２０μｇ／ｍｌハイグロマイシン中で５日間培養した。細胞を、３７℃／５％ＣＯ_２で終夜インキュベートした。培地を吸引によって除去し、様々な濃度のモノクローナルまたはポリクローナル（ヤギ抗ヒトＩＬ－１Ｒ３、ＡＦ６７６、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）抗体を、培地１０μｌ容積中に添加した。プレートを、３７℃／５％ＣＯ_２で６０分間インキュベートした。組換えヒトＩＬ－３６ｇ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）タンパク質を、１５ｎｇ／ｍｌの終濃度になるように培地１０μｌに添加し、プレートを、３７℃／５％ＣＯ_２で５時間インキュベートした。Ｓｔｅａｄｙ－Ｇｌｏ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）溶液２０μｌを、各ウェルに添加し、十分に混合し、プレートを、Ｔｅｃａｎ Ｍ１０００プレートリーダーを使用して発光を読み取る前に室温で１０分間インキュベートした。フィッティング曲線およびＥＣ５０算出を、Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）およびＸＬｆｉｔ（ＩＤＢＳ）を使用して行った。

ＩＬ－１α、ＩＬ－３３およびＩＬ－３６αの中和
抗ＩＬ－１Ｒ３抗体の機能を、ＩＬ－１α、ＩＬ－３３またはＩＬ－３６αのいずれかを用いて異なる３つの細胞株において試験して、シグナル伝達に関してＩＬ－１Ｒ３に依存的な３つのＩＬ－１受容体（ＩＬ－１Ｒ１、Ｒ４またはＲ６）に関係するシグナル伝達経路に対する影響を決定した。

ヒト上皮肺細胞株Ａ５４９を、自己炎症性疾患などＩＬ－１依存的疾患のモデルとしてＩＬ－１αで刺激した。細胞株を、完全Ｆ－１２Ｋ培地（１０％ ＦＣＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）中で、Ｔ７５フラスコ（３７℃、５％ＣＯ_２）で培養し、平均２回／週分割した（アッセイ前に継代１５回を超えない）。Ａ５４９細胞を、９６平底プレートに播種し（５０，０００個／ウェル）、ＭＡＢ－１６－００３０（２０μｇ／ｍＬ～１μｇ／ｍＬ）またはＩＬ－１Ｒａ（１０μｇ／ｍＬ）と１時間プレインキュベートする前に、３時間休ませた。次いで、上清を採取する前に、細胞を、組換えヒトＩＬ－１α（５０ｐｇ／ｍＬ、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）で２４時間刺激し、ＩＬ－６産生についてアッセイした（Ｄｕｏｓｅｔ ＥＬＩＳＡ、ＲｎＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ）。

ヒト肥満細胞株（ＨＭＣ－１）を、ＩＬ－８産生のＩＬ－３３依存的誘導について調査した。細胞株を、完全イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ、１０％ＦＣＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）中で、Ｔ７５フラスコ（３７℃、５％ＣＯ_２）で培養し、平均３回／週分割した（２×１０^６個／ｍＬを上回る細胞密度を有さず、アッセイ前に継代１５回を超えない）。ＨＭＣ－１細胞を、９６平底プレートに播種し（３０，０００個／ウェル）、ＭＡＢ－１６－００３０（２０μｇ／ｍＬ～１μｇ／ｍＬ）またはＩＬ－１Ｒａ（１０μｇ／ｍＬ）と１時間プレインキュベートする前に、３時間休ませた。次いで、上清を採取する前に、細胞を、組換えヒトＩＬ－３３（２０ｎｇ／ｍＬ、ＲｎＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で２４時間刺激し、ＩＬ－８産生についてアッセイした（Ｄｕｏｓｅｔ ＥＬＩＳＡ、ＲｎＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ）。

ＩＬ－３６シグナル伝達に対する影響を、ヒトケラチノサイト細胞株（ＨａＣａＴ）を使用して調査した。細胞株を、完全ＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）中で、Ｔ７５フラスコ（３７℃、５％ＣＯ_２）で培養し、平均３回／週分割し、アッセイ前に継代１５回を超えない。ＨａＣａＴ細胞を、９６平底プレートに播種し（５０，０００個／ウェル）、ＭＡＢ－１６－００３０（２０μｇ／ｍＬ～１μｇ／ｍＬ）またはＩＬ－１Ｒａ（１０μｇ／ｍＬ）と１時間プレインキュベートする前に、３時間休ませた。次いで、上清を採取する前に、細胞を、組換えヒトＩＬ－３６α（５０ｎｇ／ｍＬ、ＲｎＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で２４時間刺激し、ＩＬ－８産生についてアッセイした（Ｄｕｏｓｅｔ ＥＬＩＳＡ、ＲｎＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ）。

ＰＢＭＣの生存率およびＩＬ－６放出
健康なドナー３名の刺激していないＰＢＭＣ（５００，０００個／ウェル）の生存率に対する抗ｈＩＬ－１Ｒ３抗体ＭＡＢ－１６－００３０の影響を、従来通りのＭＴＴ低減アッセイを使用して試験した。簡潔には、ＰＢＭＣ（２００μＬ）を、培地単独またはＭＡＢ－１６－００３０（２０μｇ／ｍＬ）のいずれかとインキュベートした。２４時間、３日間および５日間の後に、ＰＢＭＣを、ＥＬＩＳＡリーダーで、５７０ｎＭで吸光度を測定する前に、ＭＴＴ（２０μＬ）と２時間インキュベートした。吸光度とＭＴＴを変換する生存可能な細胞との間の公知の直線性を使用して、生存可能な細胞の数を、培地単独を１００％に設定した対照として使用して算出した。ＭＴＴ分析と同日に、同じ条件下でインキュベートした同一ドナー由来のＰＢＭＣの上清を採取し、その後ＩＬ－６産生についてアッセイして（Ｄｕｏｓｅｔ ＥＬＩＳＡ、ＲｎＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＭＡＢ－１６－００３０単独のあらゆる可能性がある刺激効果を評価した。

ＰＢＭＣの機能的遮断
健康なドナーから新たに単離したＰＢＭＣを使用して、多様な抗原で刺激したヒト細胞に対するＭＡＢ－１６－００３０の影響を評価した。全ての刺激について、実験を、５０，００００個ＰＢＭＣ／ウェルを使用して実施し、合計容積２００μＬで刺激した。細胞を播種し、刺激前に培地単独、ＭＡＢ－１６－００３０（２０～０．１μｇ／ｍＬ）またはＩＬ－１Ｒａ（１０μｇ／ｍＬ）のいずれかと１時間インキュベートした。以下の刺激を使用した；ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍＬ、２４時間、ＲＰＭＩ ＦＣＳを含まない）、抗ヒトＣＤ３／ＣＤ２８（１．２５μｇ／ｍＬ；０．５μｇ／ｍＬ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）３日間、ＲＰＭＩ １０％ＦＣＳ）、ＩＬ－１２／－３３（２ｎｇ／ｍＬ；２０ｎｇ／ｍＬ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ；ＲｎＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ））、３日間、ＲＰＭＩ １０％ ＦＣＳ）、または熱不活化カンジダアルビカンス（０．５×１０^６個／ｍＬ、５日間、ＲＰＭＩ １０％ＦＣＳ）。刺激後に上清を採取し、製造業者のプロトコールにしたがってＤｕｏｓｅｔ ＥＬＩＳＡ（ＲｎＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してサイトカイン産生についてアッセイした。

全血における免疫細胞の機能的遮断
熱不活化カンジダアルビカンスを使用して、全血を刺激した。健康なドナーから新たに採取した血液（ＥＤＴＡチューブ）を、微量遠心チューブに分注し（２５０μＬ／チューブ）、カンジダアルビカンス（０．５×１０^６個／ｍＬ）による刺激の前に、最終容量１ｍＬになるように培地単独（ＲＰＭＩ、ＦＣＳを含まない）、ＭＡＢ－１６－００３０（２０～０．１μｇ／ｍＬ）またはＩＬ－１Ｒａ（１０μｇ／ｍＬ）のいずれかと１時間プレインキュベートした。インキュベーション（３７℃、５％ＣＯ_２）２４時間後に上清を採取し、ＥＬＩＳＡ（Ｄｕｏｓｅｔ、ＲｎＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ）によってサイトカイン産生についてアッセイした。

混合リンパ球反応（ＭＬＲ）
健康な、適合しないドナー由来のＰＢＭＣを、培地単独、ＭＡＢ－１６－００３０（２０～１μｇ／ｍＬ）またはＩＬ－１Ｒａ（１０μｇ／ｍＬ）のいずれかと比１：１に混合し（２５０，０００個／ドナー）、５日間インキュベートした（ＲＰＭＩ、１０％ＦＣＳ）。サイトカイン産生を、製造業者のプロトコールにしたがってＱｕａｎｓｙｓマルチプレックスプラットホームを使用してアッセイした。

［図面の簡単な説明］

［図１］配列（１文字コードのアミノ酸）
可変領域（ＶＲ）の完全な配列：
重鎖：完全なＶＨ：配列番号１～３４および配列番号１７３
軽鎖：完全なＶＬ：配列番号３５～６８および配列番号１７４
相補性決定領域（ＣＤＲ）：
重鎖：
ＣＤＲＨ１：配列番号６９～８５
ＣＤＲＨ２：配列番号８６～１０２
ＣＤＲＨ３：配列番号１０３～１１９
軽鎖：
ＣＤＲＬ１：配列番号１２０～１３６
ＣＤＲＬ２：配列番号１３７～１５３
ＣＤＲＬ３：配列番号１５４～１７０および１７５
定常領域（ＣＲ）：
軽鎖：ＣＲ－Ｌ：配列番号１７１
重鎖：ＣＲ－Ｈ：配列番号１７２
以下の図において、ＡＦ６７６は、以下のリンクから購入した市販のポリクローナル抗体調製物である：
https://www.rndsystems.com/products/human-il-1-racp-il-1-r3-antibody_af676

［図２］ヒトＩＬ－１Ｒ３ ＥＬＩＳＡ
３８４マイクロタイタープレートを、ＩＬ－１Ｒ３のヒト細胞外ドメインを表すヒトＩｌ－１Ｒ３タンパク質でコーティングした（０．５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１時間）。徹底的な洗浄工程に続くブロッキング工程の後、抗体を添加し（ウェル当たり１２．５μｌ）、室温で１時間インキュベートした。結合していない抗体を、徹底的に洗い流した。結合している抗体の量を、ペルオキシダーゼ標識した抗ヒト検出抗体と共にマイクロタイタープレートをインキュベートする（室温で１時間）ことによって同定した。ペルオキシダーゼ反応を、ＴＭＢを添加することによって開始し、４５０ｎｍ／６２０ｎｍで吸光度を測定した。
ヒトＩＬ－１Ｒ３に特異的な結合を確実にするために、同一の特徴を持つＩＬ１２タンパク質を使用するカウンタースクリーンを並行して実行した。アッセイの設定は、上記と同一であった。ヒトＩＬ－１Ｒ３に結合するが、ＩＬ１２に結合しないＢ細胞上清は、活性であると考えられてきた。

［図３］ＨＥＫ２９３レポーターアッセイ
ＨＥＫ２９３Ｔ／１７－ＦＲ細胞に、ｐＧＬ４．３２［ｌｕｃ２Ｐ／ＮＦ－κＢ－ＲＥ／Ｈｙｇｒｏ］ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）を安定にトランスフェクトし、３８４ウェルＰＤＬ Ｃｏｓｔａｒ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅプレートに播種し、続いて抗体と３０分インキュベーションした。次いで、ＮＦ－ｋＢ活性を製造業者のプロトコールにしたがってＳｔｅａｄｙ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して決定する前に、細胞を、ＩＬ－１βで５時間刺激した。

［図４］Ａ５４９安定細胞株を使用するＮＦκＢルシフェラーゼレポーターアッセイ
Ａ５４９－ＮＦｋＢ－ＲＥ－Ｌｕｃを安定にトランスフェクトした細胞（Ｓｉｇｎｏｓｉｓから購入した）を、３日間培養した（１．７Ｅ＋０４細胞／ｃｍ^３）。３８４ウェルローフランジ白色平底ポリスチレンＴＣ処理マイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を、ウェル当たり４×１０^４個細胞で満たした。１０時間の培養期間後に、細胞を抗体と１時間インキュベートし、その後細胞をＩＬ－１β １０μｌでさらに５時間刺激した。ＮＦｋＢモジュレーションを、Ｓｔｅａｄｙ－Ｇｌｏ（商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で、刺激していない細胞に対する各ウェルの相対的発光単位を決定することによって測定した。

［図５］細胞結合分析：ＩＬ－１Ｒ３発現細胞に対する結合
ヒト化抗ＩＬ－１Ｒ３ ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ抗体を、フローサイトメトリーを使用して異なるＩＬ－１Ｒ３受容体密度を持つ細胞株への結合について試験した。ヒト化抗ＩＬ－１Ｒ３ ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ抗体は、ＩＬ－１Ｒ３低および高発現細胞株に結合する。抗体は、マウスＮＩＨ－３Ｔ３細胞に結合しない。実験は、実施例８に記述される方法にしたがって実施した。

［図６］細胞結合分析：ヒトＩＬ－１Ｒ３高発現細胞株ＳＫ－ＭＥＬ－３０に対する細胞結合
ヒト化抗ＩＬ－１Ｒ３ ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ抗体のＥＣ５０細胞結合値を、フローサイトメトリーを使用してＩＬ－１Ｒ３高発現細胞株ＳＫ－ＭＥＬ－３０への結合によって決定した。ヒト化抗ＩＬ－１Ｒ３ ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ抗体ＭＡＢ－１６－００３０およびＭＡＢ－１６－０１４９は、それぞれ３０７および３０６ｎｇ／ｍｌの細胞結合を示す。実験は、実施例８に記述される方法にしたがって実施した。

［図７］ヒト－ＩＬ－１Ｒ３生化学的ＥＬＩＳＡ
組換えヒトＩＬ－１Ｒ３タンパク質に対するヒト化抗ＩＬ－１Ｒ３ ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ抗体の結合を、生化学的ＥＬＩＳＡで試験した。例示した抗体は、それぞれ１６．３ｎｇ／ｍｌおよび２９．１ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０結合値を示す。実験は、実施例９に記述される方法にしたがって実施した。

［図８］Ａ５４９－ＮＦｋＢ－ＲＥ－Ｌｕｃ細胞におけるヒトＩＬ－１ａおよびＩＬ－１ｂに媒介されるＮｆＫＢシグナル伝達の阻害
ＩＬ－１ａおよびＩＬ－１ｂの機能的中和を、それぞれ０．１ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－１ａおよびＩＬ－１ｂで刺激したＡ５４９－ＮＦｋＢ－ＲＥ－Ｌｕｃ細胞を使用して細胞ベースの遺伝子レポーターアッセイで試験した。ヒト化抗ＩＬ－１Ｒ３ ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ抗体は、ヤギ抗ヒトＩＬ１－Ｒ３ポリクローナル抗体ＡＦ６７６（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）のものより優れたＥＣ５０値を示す。実験は、実施例１０に記述される方法にしたがって実施した。

［図９］ＩＬ－１αおよびＩＬ－１β機能的中和アッセイ－Ａ－５４９細胞による、ヒトＩＬ－１ａおよびＩＬ－１ｂに媒介されるＩＬ－６放出の阻害
ヒト化抗ＩＬ－１Ｒ３ ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ抗体による、ＩＬ－１ａおよびＩＬ－１ｂに媒介されるＩＬ－６の細胞放出の中和を、Ａ－５４９細胞を使用して試験した。ＥＣ５０値は、ヒト化抗ＩＬ－１Ｒ３ ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ抗体が、ヤギ抗ヒトＩＬ１－Ｒ３ポリクローナル抗体ＡＦ６７６（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）のものより優れていることを実証する。実験は、実施例１１に記述される方法にしたがって実施した。

［図１０］ＩＬ－３３機能的中和アッセイ－ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ－ＩＬ３３（商標）細胞におけるヒトＩＬ－３３に媒介されるＮｆｋＢ－シグナル伝達の阻害
ヒト化抗ＩＬ－１Ｒ３ ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ抗体による、ＩＬ－３３に媒介される細胞シグナル伝達の中和を、ＩＬ－３３に刺激される遺伝子レポーターＨＥＫ－Ｂｌｕｅ－ＩＬ３３（商標）細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を使用して試験した。ＥＣ５０値は、ヒト化抗ＩＬ－１Ｒ３ ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ抗体が、ヤギ抗ヒトＩＬ１－Ｒ３ポリクローナル抗体ＡＦ６７６（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）のものより優れていることを実証する。実験は、実施例１２に記述される方法にしたがって実施した。

［図１１］ＩＬ－３６機能的中和アッセイ－ＨＥＫ－２９３／１７－ＩＦ細胞におけるヒトＩＬ－３６に媒介されるＮｆｋＢ－シグナル伝達の阻害
ヒト化抗ＩＬ－１Ｒ３ ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ抗体による、ＩＬ－３６に媒介される細胞シグナル伝達の中和を、ＩＬ－３６ｇに刺激される遺伝子レポーターＨＥＫ－２９３／１７－ＩＦ細胞を使用して試験した。典型的なヒト化抗ＩＬ－１Ｒ３ ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ抗体は、ヤギ抗ヒトＩＬ１－Ｒ３ポリクローナル抗体ＡＦ６７６（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）のものより優れたＥＣ５０値を示す。実験は、実施例１３に記述される方法にしたがって実施した。

［図１２］ＩＬ－１ａ、ＩＬ－３３およびＩＬ－３６ａに媒介される細胞のサイトカイン放出の中和
ＩＬ－１ａ、ＩＬ－３３およびＩＬ－３６ａに媒介される細胞のサイトカイン放出の中和を、特定のＩＬ－１ａ、ＩＬ－３３およびＩＬ－３６ａ依存的な細胞系を使用して試験した。本発明による代表的なヒト化抗ＩＬ－１Ｒ３ ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ抗体（ＭＡＢ－１６－００３０）によるサイトカイン放出の阻害を試験し、ＩＬ－１Ｒａと比較した。本発明による抗体は、３つ全ての刺激に媒介されるサイトカイン放出を阻害し得るが、ＩＬ－１Ｒａは、ＩＬ－１ａに媒介されるサイトカイン放出にのみ影響を及ぼした。実験は、実施例１４に記述される方法にしたがって実施した。

［図１３］ヒト化抗ＩＬ－１Ｒ３ ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ抗体で処理した刺激していないＰＢＭＣの生存率およびＩＬ－６放出
免疫細胞への抗体の結合は、例えばアポトーシスシグナル伝達経路の直接的な誘導、過剰なサイトカイン放出の刺激または抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）による細胞枯渇および有害効果をもたらし得る。ヒト化抗ＩＬ－１Ｒ３ ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ抗体が、ＰＢＭＣの生存率に直接影響を及ぼすことを排除するために、３名のドナーのＰＢＭＣの生存率およびＩＬ－６放出を、異なる濃度の本発明による代表的なヒト化抗ＩＬ－１Ｒ３ ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ抗体（ＭＡＢ－１６－００３０）と１、３および５日間インキュベーションした後に、調査した。生存率もＩＬ－６放出も、ＭＡＢ－１６－００３０による影響を受けなかった。これらの結果は、ヒト化抗ＩＬ－１Ｒ３ ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ抗体が、付随的な細胞枯渇および細胞有害効果を誘導することなく免疫細胞に対するＩＬ－１Ｒ３機能を遮断することを支持する。実験は、実施例１５に記述される方法にしたがって実施した。

［図１４］異なる刺激で活性化されるＰＢＭＣの機能的遮断
ヒト化抗ＩＬ－１Ｒ３ ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ抗体が、特定または複合刺激で刺激されたＰＢＭＣの活性化を阻害するかどうか試験するために、１０名のドナーのＰＢＭＣを、ＬＰＳ、熱不活化カンジダアルビカンス、ＩＬ－１２／ＩＬ－３３または抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体で刺激した。本発明による代表的なヒト化抗ＩＬ－１Ｒ３ ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ抗体は、試験した全ての刺激によって媒介されるサイトカイン放出を阻害することができた。実験は、実施例１６に記述される方法にしたがって実施した。

［図１５］カンジダアルビカンスで活性化した全血における免疫細胞の機能的遮断
ヒト化抗ＩＬ－１Ｒ３ ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ抗体が、全血における免疫細胞の活性化を阻害するかどうか試験するために、８名のドナーの全血を、熱不活化カンジダアルビカンスで刺激した。図に示した本発明による代表的なヒト化抗ＩＬ－１Ｒ３ ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ抗体は、カンジダに誘導されるＩＬ－６サイトカイン放出を阻害することができた。実験は、実施例１７に記述される方法にしたがって実施した。

［図１６］混合リンパ球反応（ＭＬＲ）におけるサイトカイン放出の遮断
多様なサイトカインの放出を遮断するヒト化抗ＩＬ－１Ｒ３ ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ抗体の能力を、健康な、適合しないドナーのＰＢＭＣを使用して混合リンパ球反応（ＭＬＲ）で試験した。図に示した本発明による代表的なヒト化抗ＩＬ－１Ｒ３ ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ抗体は、ＩＦＮｇ、ＩＬ－６、ＴＮＦ－ａ、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７およびＩＬ－１０の放出を阻害することができた。実験は、実施例１８に記述される方法にしたがって実施した。

Claims (17)

1. ＩＬ－１Ｒ３に特異的に結合するヒト化抗体またはその抗原結合断片であって、
   以下：
   （１）配列番号７７に記載のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号９４に記載のＣＤＲ－Ｈ２、配列番号１１１に記載のＣＤＲ－Ｈ３、配列番号１２８に記載のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１４５に記載のＣＤＲ－Ｌ２および配列番号１６２に記載のＣＤＲ－Ｌ３、
   （２）配列番号７９に記載のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号９６に記載のＣＤＲ－Ｈ２、配列番号１１３に記載のＣＤＲ－Ｈ３、配列番号１３０に記載のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１４７に記載のＣＤＲ－Ｌ２および配列番号１７５に記載のＣＤＲ－Ｌ３、ならびに
   （３）配列番号８１に記載のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号９８に記載のＣＤＲ－Ｈ２、配列番号１１５に記載のＣＤＲ－Ｈ３、配列番号１３２に記載のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１４９に記載のＣＤＲ－Ｌ２および配列番号１６６に記載のＣＤＲ－Ｌ３
   からなる群から選択される３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲ
   を含む、ヒト化抗体またはその抗原結合断片。
2. 請求項１に記載のヒト化抗体またはその抗原結合断片であって、抗体またはその抗原結合断片が、以下：
   （１）配列番号２６に記載の重鎖可変（ＶＨ）領域、
   （２）配列番号２８に記載のＶＨ領域、および
   （３）配列番号３０に記載のＶＨ領域
   からなる群から選択されるＶＨ領域と少なくとも９０％同一であるＶＨ領域を含む、ヒト化抗体またはその抗原結合断片。
3. 請求項１または２に記載のヒト化抗体またはその抗原結合断片であって、抗体またはその抗原結合断片が、以下：
   （１）配列番号６０に記載の軽鎖可変（ＶＬ）領域、
   （２）配列番号１７４に記載のＶＬ領域、および
   （３）配列番号６４に記載のＶＬ領域
   からなる群から選択されるＶＬ領域と少なくとも９０％同一であるＶＬ領域を含む、ヒト化抗体またはその抗原結合断片。
4. 請求項２に記載のヒト化抗体またはその抗原結合断片であって、抗体またはその抗原結合断片が、以下：
   （１）配列番号２６に記載の重鎖可変（ＶＨ）領域、
   （２）配列番号２８に記載のＶＨ領域、および
   （３）配列番号３０に記載のＶＨ領域
   からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨ領域を含む、ヒト化抗体またはその抗原結合断片。
5. 請求項３に記載のヒト化抗体またはその抗原結合断片であって、抗体またはその抗原結合断片が、以下：
   （１）配列番号６０に記載の軽鎖可変（ＶＬ）領域、
   （２）配列番号１７４に記載のＶＬ領域、および
   （３）配列番号６４に記載のＶＬ領域
   からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む、ヒト化抗体またはその抗原結合断片。
6. 前記抗体またはその抗原結合断片が、ＩＬ－１Ｒ３に誘導されるＮＦｋＢ活性を阻害する、請求項１～５のいずれかに記載のヒト化抗体またはその抗原結合断片。
7. 前記抗体またはその抗原結合断片が、ＩＬ－１アルファ、ＩＬ－１ベータ、ＩＬ－３３およびＩＬ－３６に刺激されるＮＦｋＢ活性を阻害する、請求項１～６のいずれかに記載のヒト化抗体またはその抗原結合断片。
8. 前記抗体またはその抗原結合断片が、ＩＬ－１β／ＩＬ－１Ｒ１／ＩＬ－１ＲＡｃＰ、ＩＬ－１α／ＩＬ－１Ｒ１／ＩＬ－１ＲＡｃＰ ＩＬ－３３／ＳＴ２／ＩＬ－１ＲＡｃＰ、および／またはＩＬ－３６／Ｉｌ－３６Ｒ／ＩＬ－１ＲＡｃＰからなる群から選択される複合体によって刺激されるＮＦｋＢ活性を阻害する、請求項１～７のいずれかに記載のヒト化抗体またはその抗原結合断片。
9. Ａ５４９－ＮＦｋＢ－ＲＥ－Ｌｕｃ細胞溶解物において、前記抗体またはその抗原結合断片が、１０μｇ／ｍｌの濃度で、０．１ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ－１アルファ、ヒトＩＬ－１ベータ、ＩＬ－３３および／またはＩＬ－３６で刺激したＮＦｋＢ発現を、前記抗体またはその抗原結合断片を含まない同じアッセイに対して５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上阻害する、請求項１～８のいずれかに記載のヒト化抗体またはその抗原結合断片。
10. 前記抗体またはその抗原結合断片が、ＮＦ－ｋＢレポーター遺伝子の制御下にあるルシフェラーゼをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞においてＩＬ－１アルファ、ＩＬ－１ベータ、ＩＬ－３３およびＩＬ－３６それぞれに刺激されるルシフェラーゼ活性を阻害する、請求項１～９のいずれかに記載のヒト化抗体またはその抗原結合断片。
11. 前記抗体またはその抗原結合断片が、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域のＬ２３４ＡおよびＬ２３５ＡまたはヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域のＳ２２８ＰおよびＬ２３５Ｅで少なくともアミノ酸置換を含む、請求項１～１０のいずれかに記載のヒト化抗体またはその抗原結合断片。
12. ＩＬ－１Ｒ３に媒介される疾患を処置するのに使用するための、請求項１～１１のいずれかに記載のヒト化抗体またはその抗原結合断片。
13. ＩＬ－１Ｒ３に媒介される疾患が、肺がん、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）がん、細気管支肺
    胞細胞肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部のがん、皮膚もしくは眼内黒色腫、卵巣がん、直腸がん、肛門部のがん、胃がん、胃部がん、大腸がん、乳がんおよび子宮がんからなる群から選択される、請求項１２に記載のヒト化抗体またはその抗原結合断片。
14. 薬学的に許容される担体および治療有効量の請求項１～１３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む、医薬組成物。
15. ＩＬ－１Ｒ３に媒介される疾患を処置するのに使用するための、請求項１４に記載の医薬組成物。
16. ＩＬ－１Ｒ３に媒介される疾患が、肺がん、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）がん、細気管支肺胞細胞肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部のがん、皮膚もしくは眼内黒色腫、卵巣がん、直腸がん、肛門部のがん、胃がん、胃部がん、大腸がん、乳がんおよび子宮がんからなる群から選択される、請求項１４または１５に記載の医薬組成物。
17. １つもしくは複数の細胞傷害性、細胞増殖抑制または標的化抗がん化合物と組み合わせたがんの処置に使用するための、請求項１から１３のいずれか一項に記載のヒト化抗体もしくはその抗原結合断片または請求項１４から１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。

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