JP7020694B2

JP7020694B2 - 攪拌方法

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Publication number: JP7020694B2
Application number: JP2019157779A
Authority: JP
Inventors: 慎眞田
Original assignee: 株式会社アクトラス
Priority date: 2019-08-30
Filing date: 2019-08-30
Publication date: 2022-02-16
Anticipated expiration: 2039-08-30
Also published as: US20210060505A1; JP2021035659A

Description

本発明は、被撹拌物を撹拌するための攪拌方法及び攪拌装置に関し、詳細には微量の薬液を好適に攪拌することができる攪拌方法に関する。

従来より、医療・バイオ分野において、試薬の反応促進のために、数μｌから数ｍｌの微量な薬液の撹拌技術が提案されている。比較的多量の液体では振盪器などで揺動して攪拌するが、微量試薬では、対流よりも表面張力が支配的となり、撹拌・混合せが困難となる。また薬液の飛散を抑制する必要がある。さらに被攪拌物の損傷も防止しなければならない。加えて温度変化による影響も考慮する必要がある。さらに、コンタミネーションの予防のために非接触での撹拌が求められているため、医療・バイオ分野における攪拌は難易度が極めて高い。

超音波による撹拌方法は、２０～４０ｋＨｚの超音波を照射することによって分子の運動が促進されて撹拌効果が認められるが、キャビテーションによる液温の上昇が起こり、被撹拌物の温度変化が生じる。また、超音波によって生じるキャビテーションにより、被撹拌物の飛散や被撹拌物への損傷が生じる場合もある。

そこで、数μｌの微量薬液の撹拌については、超音波による攪拌や、積層圧電アクチュエータによる液面波共振の励起による混合や高電圧印加による電界撹拌技術による撹拌が提案されている。

非特許文献１に記載された微小液滴の内部攪拌制御では、圧電素子により振動を発生させ、周波数を変えることにより、約５μｌの液滴の表面張力波との共振による撹拌をおこなう。

また、非特許文献２に記載された非接触電界撹拌技術では、約１５０μｌの薬液の上下を電極で挟んで矩形波パルス電圧を印加することで、水分子を励振させることで攪拌する。

松沢大樹ほか３名、小型自走機械群による超精密生産機械システム第７８報微小液滴の内部撹拌の制御について、精密工学会秋季大会学術講演論文集、２００３，５６７．中村竜太ほか７名、電界砥粒制御技術を応用した電界非接触微粒子撹拌技術の開発、精密工学会誌Ｖｏｌ．８０Ｎｏ．９２０１４．

ところで、近年のがん治療では、低侵襲・低負荷手術をおこなうために術中に細胞診断を実施し、進行度に応じて切除範囲が決められる。そこで、手術中に採取した細胞について、その場で試料を作成して、病理診断をおこない、その判定結果により手術方針が決められる。

現在、術中迅速病理診断は時間の制約上、５分以内に染色可能なHematoxylin Eosin染色（HE染色）が用いられており、細胞核をHematoxylinにより青色に、そのほかの部分をEosinにより紅色に染める。ところがHE染色では小さながん遺残やリンパ節微小転移が見逃されることがある。このがん遺残やリンパ節転移を見逃さずに縮小手術を施行するには免疫染色が必要である。しかし従来の免疫染色の方法では２時間以上を要するため、迅速に免疫染色を行う手法が必要である。その時間短縮のためには迅速な攪拌が必要となる。

しかしながら、極微量の液滴であれば、上述のような方法で攪拌できるものの、免疫染色のような微量の薬液を比較的大面積水面で撹拌したり、複数の薬液を同時に攪拌することについては、従来の方法では、十分な撹拌を効率的にすることはできなかった。

上記問題点を解決するため、本発明の課題は、例えば免疫染色のような微量の薬液を大面積水面で効率的に攪拌することができる攪拌方法を提供することにある。

上記課題を解決するため本発明の攪拌方法及び攪拌装置は、鉛直振動可能な振動装置と、薬液の自由液面を形成するとともに前記振動装置により鉛直振動が加振される保持部材と、前記振動装置の振幅及び周波数を制御する制御装置とを備え、前記振動装置が前記薬液の自由液面において前記制御装置により少なくとも振幅及び周波数のいずれかを制御することでファラデー液面波を発生させることを特徴とする。

このファラデー液面波は、定常波、時空間変調による波、カオスによる波、若しくはソリトン波からなるようにし、さらに、定常波、時空間変調、ソリトン、カオスの種類を変更させるように攪拌することも、望ましい。また、ファラデー液面波は、間欠的に発生させるようにしておよい。制御装置は、攪拌中に振動装置の振幅や周波数を変更させて攪拌することも望ましいが、振動装置の振動の周波数は、振動装置の共振周波数未満、又は共振数を超えた周波数で振動させることが望ましい。振動装置の振動の周波数は、４０～２００Ｈｚが好適である。

振動装置は、振動条件により長さ方向へ伸縮するアクチュエータと、アクチュエータが固定支持される支点部と、アクチュエータの自由端と共に変位可能とされる力点部と、アクチュエータの自由端が長さ方向において変位する変位量よりも大きな変位量で前記長さ方向に対して直交する方向へ変位する作用点部と、作用点部、力点部及び支点部の各近傍にそれぞれ配置される複数のヒンジ部と、この各ヒンジ部の間を剛体態様で連結するリンク部とを備え、アクチュエータの自由端と共に力点部を振動条件で変位させ、各ヒンジ部とリンク部とにより形成される低次対偶のリンク機構の動きに基づき作用点部に接触させた被撹拌物を振動させるものが好適に使用できる。

特に、各ヒンジ部は、力点部の変位時において、アクチュエータの長さ方向へ変位する第１ヒンジ部と、アクチュエータの長さ方向に対して直交する方向へ変位する第２ヒンジ部とを含んで構成され、第２ヒンジ部を作用点部の近傍に配置したものが望ましい。

この攪拌方法は、薬液が、免疫染色のための薬液であるものに好適に使用することができる。

本発明によれば、微量の薬液を好適に撹拌することができる。

本実施形態の攪拌装置の斜視図。本実施形態の攪拌システムの模式図。本実施形態の振動装置の斜視図。本実施形態の振動装置の正面図。本実施形態のハニカムリンクの作用の説明図であって、（ａ）はリンク機構、（ｂ）はリンク機構の変位態様、（ｃ）はハニカムリンクの変形の説明図。本実施形態の電圧供給の説明図であって、（ａ）は機能ブロック、（ｂ）は供給する交流電圧の説明図。他の実施形態の上下方向に複数配置したハニカムリンクの正面図。（ａ）～（ｄ）ファラデー液面波の発生の原理図。本実施形態の周波数と振幅の関係を示すグラフ。本実施形態の各電圧における周波数と振幅の関係を示すグラフ。本実施形態の各周波数における電圧と振幅の関係を示すグラフ。本実施形態の周波数と振幅と電圧の関係を示す表。本実施形態の周波数と振幅とファラデー液面波の発生の関係を示すグラフ。（ａ）定常波、（ｂ）時空間変調、（ｃ）カオスを示すファラデー液面波を示す模式図。

（第１の実施形態）
以下、本発明の一実施形態である攪拌システム１と、これを用いた攪拌方法を説明する。

＜発明の概略＞
本実施形態は、免疫染色に用いる微量な薬液を、手を触れることなく、かつ飛散したり、熱や振動で変質させたりせずに、電界や磁界を発生させず、強い表面張力の影響下でも速やかに攪拌できる攪拌方法である。

＜攪拌システム１＞
この攪拌方法を実施する攪拌システム１は、図１に示すような薬液の自由液面を形成するスライドガラス３１及びガイド３２を備えた保持部材３を載置するステージ２８を備え、鉛直振動可能な振動装置２１を備えた攪拌装置２を備える。

また、図２に示すように振動装置２１の振幅及び周波数を制御するパーソナルコンピュータからなるＰＣ（制御装置）４を備える。
また、振動装置２１のピエゾ素子２２を駆動するためのピエゾドライバ（駆動装置）５と、このピエゾドライバ５の駆動を制御する信号を発生する信号発生器６と、攪拌装置２の振動を測定するレーザ変位計（測定装置）７と、このレーザ変位計７の信号を処理するロックインアンプ８とを備えている。

攪拌の目的である免疫染色（Immunostaining）は、抗体を用いて実験サンプル中の抗原のみを検出する手法である。抗体による抗原の認識反応は本来目に見えないものであるが、これを可視化し、特定の物質のみを検出するために発色反応を組み合わせたものである。特に手術中の免疫染色には迅速な判定が要求されるため、時間短縮のためには効率的な攪拌が必要となる。

攪拌に当たっては、無用なコンタミネーションが無いように非接触で攪拌する。微少量の液体では表面張力の支配力が大きいためこれに打ち勝たなければならないが、一方で、振動が激しすぎると液体が飛散するため飛散が生じないようにする必要もある。また、対象が生体由来のものであるため、激しい衝撃や、高い温度に曝されないようにする必要もある。本発明者は、このような厳しい要求に応えるためには、ファラデー液面波が好適に利用できることを見出した。

ＰＣ４は、所定の電圧及び周波数で振動装置２１を振動させるため、レーザ変位計７の測定結果をロックインアンプ８を介してフィードバックしながら、信号発生器６に制御信号を送信する。信号発生器６はピエゾドライバ５により振動装置２１のピエゾ素子２２を所定の周波数及び振幅で振動させ、保持部材３の液面に攪拌効果が高くなるように選択的にファラデー液面波を発生させる。

以下、この攪拌システム１と、これを用いた攪拌方法を詳細に説明する。
＜攪拌装置２＞
図１に示す攪拌装置２は、インシュレータ２９を備えたベース２７により支持される振動装置２１と、振動装置２１に支持されたステージ２８とから構成される。このステージ２８には、ガイド３２により保持された免疫染色のための薬液を保持したスライドガラス３１が複数セット載置され、同時に垂直振動が与えられる。なおこの攪拌装置２は、免疫染色の目的に限定されるものではないが、本実施形態では条件の厳しい免疫染色を例に説明するものである。例えば、培地を充填したシャーレ（ペトリディッシュ）内で培養した細胞を剥がし取るために振動を与えるようなものにも適応できる。

＜振動装置２１＞
図３、図４に示すように振動装置２１は、振動条件により長さ方向（図４において左右に延びる水平方向）へ伸縮するアクチュエータであるピエゾ素子２２と、この伸縮を鉛直方向に増幅して振動として伝達するハニカムリンク２４とを備える。

＜ピエゾ素子２２＞
圧電素子であるピエゾ素子２２は、ピエゾドライバ５からの駆動電圧の印加に基づき、長さ方向に伸長する。印加を停止すると収縮する。間欠的に電圧を印加することで、所望の周波数の振動を生じさせることができる。ピエゾ素子２２の長さ方向の両端面には、超硬アルミ合金からなる略直方体形状をなす一対の連結ブロック２５が接合されている。各連結ブロック２５の両側面には、半円柱状をなす凸部２５ａが突設されている。そして、この凸部２５ａを介して所定長さのハニカムリンク２４がピエゾ素子２２の長さ方向に沿うように組み付けられており、ピエゾ素子２２が伸長すると、連結ブロック２５を介して、ハニカムリンク２４を長さ方向に伸長するように牽引する。電圧の印加を停止すれば、ピエゾ素子２２は元の長さに戻るとともに、ハニカムリンク２４は、その弾性で元の形状に戻る。

＜ハニカムリンク２４の構成＞
本実施形態では、図１に示すように、ハニカムリンク２４はベース２７上に設置されるとともに、ステージ２８を支持している。

図５（ａ）に示すように、ハニカムリンク２４は、リンク（節）とジョイント（関節）とからなるリンク機構で、ピエゾ素子２２の水平方向の伸縮を増幅してステージ２８の垂直振動に変換する機能を有する。なお、ハニカム状周期構造は、一般には正六角形セル又は正四角形セルからなる蜂の巣状構造を意味するが、本実施形態では、例示したリンク機構のような周期構造を有する多角形セル構造のものを意味する。

ハニカムリンク２４は、可撓性を有する材料（例えばチタン合金等）からなる長板状の板体で構成されており、その幅方向寸法及び長さ方向寸法は、ピエゾ素子２２と略同一（具体的には、長さ方向寸法のみ連結ブロック２５の分だけ長い）に形成されている。ピエゾ素子２２の両側の連結ブロック２５は固定されておらず（自由端）、ピエゾ素子２２は、電圧の印加時において移動（変位）自在となっている。

図４に示すように、ハニカムリンク２４には、長さ方向と直交する方向に貫通する孔部２６が形成されている。孔部２６は、一対の円孔２６ａと長孔２６ｂとからなる。各円孔２６ａは、ハニカムリンク２４の長さ方向の両端側（図４において左右端側）の各位置に配置される。また、長孔２６ｂは、板体の長さ方向に沿うように形成され、両円孔２６ａ間をつなぐ。なお、各円孔２６ａは、その直径が連結ブロック２５の半円柱状の凸部２５ａの弦の長さと同一寸法に形成されている。そして、これら各円孔２６ａに凸部２５ａが嵌合係止される。また、板体の長さ方向に沿う両側部（図２において上辺及び下辺）の略中央寄り部分には、長さ方向において対応する上下各位置に、二対の半円状の切欠部２６ｃが形成されている。なお、この切欠部２６ｃの直径は、円孔２６ａの直径と同等の長さである。

図５（ａ）に示すように、ハニカムリンク２４は、その下端に配置されベース２７に固定支持される支点部２４ａを備える。また、ピエゾ素子２２の両端部外側に配置され、ピエゾ素子２２の自由端と共に変位可能とされる力点部２４ｂを備える。また、ハニカムリンク２４の上端に配置されステージ２８を固定支持し、ピエゾ素子２２の自由端が長さ方向において変位する変位量よりも大きな変位量で長さ方向と直交する垂直方向へ変位する作用点部２４ｃとを備える。

ハニカムリンク２４は、リンク機構として支点部２４ａ、力点部２４ｂ及び作用点部２４ｃの各近傍にそれぞれ配置される複数のヒンジ部２４２ａ～ｈを備える。ヒンジ部２４２ａ～ｈは巾狭部を形成し弾性ヒンジによりジョイントとして機能する。リンク２４１ａ～ｈは幅広部を形成して、剛体態様でリンクとして機能するヒンジ部２４２ａ～ｈにより連結される。

以上のような構成で、ピエゾ素子２２の自由端と共に力点部２４ｂを振動条件で変位させ、各ヒンジ部２４２ａ～ｈとリンク２４１ａ～ｈとにより形成される低次対偶のリンク機構の動きに基づき作用点部に接触させたステージ２８を介して、ここに載置したスライドガラス３１を振動させる。

＜ＰＣ４、ピエゾドライバ５、信号発生器６、レーザ変位計７、ロックインアンプ８＞
本実施形態では、制御装置であるＰＣ４はDELL Vostr1520 AGILENT VEE（登録商標）を、駆動装置であるピエゾドライバ５は、MATSUSADA PIEZO DRIVER（登録商標）を、信号発生器６は、AGILENT 20Hz FUNCTION/ARBITRARY WAVE GENERATOR 33220A（登録商標）を用いている。

また、測定装置であるレーザ変位計７は、KEYENCE LASER DISPLACEMENT METER LC-2400/LC-2440（登録商標）を、信号処理装置であるロックインアンプ８は、NF ELECTRONIC INSTRUMENS DIGITAL LOCK-IN AMPLIFIER LI5640（登録商標）を用いている。

＜攪拌装置２の作用＞
図６は、攪拌システム１のピエゾ素子２２への電圧供給を示す模式図である。（ａ）は機能ブロック、（ｂ）は、供給する交流電圧の説明図である。図６（ａ）に示すようにピエゾドライバ５からピエゾ素子２２に電圧が印加される。この電流は、ＰＣ４からの指示に従い信号発生器６によって生成され、図６（ｂ）に示すような正弦波の交流電流である。このため、制御は周波数と振幅が特定されることにより行われる。

図５（ａ）に示すように、電圧が印加された場合、ピエゾ素子２２が伸長して長さ方向へ変位すると、ハニカムリンク２４の力点部２４ｂに向けて作用力が加わる。そのため、力学的に、各ヒンジ部２４２ａ～ｈに、それぞれ所定の方向に作用力が働き、各方向に各ヒンジ部２４２ａ～ｈが変位することになる。その結果、ハニカムリンク２４の上端では２つの切欠部２６ｃと位置が対応する２つのヒンジ部２４２ｆ，２４２ｇの近傍部位（両ヒンジ部２４２ｆ，２４２ｇの略中間となる部位）が作用点部２４ｃとなる。そして、この作用点部２４ｃが、ハニカムリンク２４の長さ方向に対して直交する方向（鉛直方向）上へ変位する。同様に、ハニカムリンク２４の下辺側では、２つの切欠部２６ｃと位置対応する２つのヒンジ部２４２ｂ，２４２ｃの近傍部位（両ヒンジ部２４２ｂ，２４２ｃの略中間となる部位）が支点部２４ａとなり、力点部２４ｂから見れば鉛直下向き方向に変位する。ここで、支点部２４ａがステージ２８に固定されているため、ハニカムリンク２４の上端を鉛直方向（上方向）へ持ち上げる。すなわち、ハニカムリンク２４の変形は、いずれも作用点部２４ｃを鉛直上方向に変位させる作用となる。

図５（ｂ）に示すように、ハニカムリンク２４の上辺側においては、力点部２４ｂと共にリンク２４１が水平方向へ変位した場合、リンク２４１ｄに連結されたヒンジ部２４２ｅは変位量ｕだけ水平方向に変位する。ここで、ヒンジ部１５ｅ，１５ｆ間の水平方向（板体１３ａの長さ方向）の長さを「Ｌ１」、鉛直（板体１３ａの長さ方向と直交方向）の長さを「Ｌ２」とする。この場合、このヒンジ部２４２ｅにリンク２４１ｅを介して連結されたヒンジ部２４２ｆは、リンク２４１ｅが剛体態様の連結要素として機能し、両ヒンジ部２４２ｅ，２４２ｆ間の距離（長さ）を変化させないため、変位量ｖだけ鉛直方向に変位する。なお、この場合において、長さ方向の変位量ｕと幅（高さ）方向の変位量ｖとの比率（変位拡大率）は、ｖ／ｕ＝ｃｏｔθ１の式で表される。したがって、リンク２４１ｇが水平方向に対してなす角度（リンク機構の特性角θ１）を小さな鋭角（例えば７度程度等）に設定した場合、変位拡大率を増大することが可能となる。

その結果、図５（ｃ）に示すように、ハニカムリンク２４の下辺部においても、同様の変位が生じるが、支点部２４ａはベース２７に接地されている不動点であるので、ハニカムリンク２４の作用点部２４ｃはステージ２８を鉛直方向（上方向）へ持ち上げる。

＜ファラデー液面波の発生＞
本願では、容器の一様な鉛直振動加振による表面波の励起の現象を「ファラデー液面波」という。

図８（ａ）～（ｄ）は、ファラデー液面波の発生のメカニズムを説明する模式図である。図８（ａ）に示すように自由な液面を有した液体に対して、鉛直方向上向きに与える振動は、液体に対して一様に加速度が働く。しかしながら、図８（ｂ）に示すように一転して鉛直方向下向きに与える振動により、液体は重力加速度の影響が打ち消され、表面張力により高低差が生じる。ここで図８（ｃ）に示すようにさらに反転して鉛直方向上向きに与える振動により、液体は振動による加速度と重力加速度とが合成され、一旦水平面となるが、続いて図８（ｄ）に示すようにさらに反転して鉛直方向下向きに与える振動により、液体の慣性によりその波動が大きくなる。

ファラデー液面波は、ファラデー水面波、ファラデー表面波ともいわれるが、液体を満たした容器を鉛直振動外力により一様に加振するときに自由液面に生じるパラメトリック共鳴のことである。正弦的な加振を与えるので、外力は周波数と振幅で特徴づけられる。

周波数を固定した場合、振幅が分岐パラメータになり、加振を強くすると表面定常波が生じる。一般に、励起された波の振動数は加振振動数の半分であることが多い。
また、下限界を超えて加振すると、定常波、時空間変調、カオス、ソリトンなどの現象が生じ、これらは攪拌に有効に働く。いずれにしても、基本的に鉛直方向の振動であるので、飛沫は生じにくい。

特に、免疫染色のような微量で深さが浅く、広い面積の薬液であると、表面張力の影響が大きく、かつ対流が起きにくい。このような場合に、ファラデー液面波であれば、広い面積を一様に加振すれば広範囲に同時に攪拌することができる。

本実施形態の攪拌システム１では、ＰＣ４が周波数及び電圧を制御することで、多数のスライドガラス３１上にガイド３２により貯留された免疫染色の薬液を同時にファラデー液面波により好適に攪拌できる。

＜ファラデー液面波の種類＞
パラメータとなる加振する周波数及び振幅の変化によりファラデー液面波には、定常波、時空間変調、ソリトン、カオスなどの種類がある。

「定常波」
本願において定常波（standing waveまたはstationary wave)とは、波長・周期(振動数または周波数)・振幅・速さ(速度の絶対値)が同じで進行方向が互いに逆向きの２つの波が重なり合うことによってできる、波形が進行せずその場に止まって振動しているようにみえる波動のことである。定在波ともいう。

図８（ａ）～（ｄ）に示すような、全く振動せず振幅が０になる点Ｎおよび振幅が最大になり変位が最も揺れ動く点Ａが現れる。前者を節(node)、後者を腹(anti-node)という。

鉛直加振による水面波の共鳴現象であるファラデー液面波において、種々の条件で、直線、正方形、六角形、三角形、準周期構造など、異なるパターンを持つ波動が励起されることが、最近の実験により明らかにされつつある。波形が安定しているため、液体の攪拌という見地からは、ファラデー液面波の中では効率が高いとは言えないが、飛沫を生じにくく攪拌対象に過度な衝撃を与えないというメリットもある。

「時空間変調」
本願において、「時空間変調」とは、時間とともにパターン形成した定常波の空間位置が変動していくファラデー液面波をいうこととする。

定常波と比較すると、空間移動を伴う分だけパターン形成よりも液体の攪拌の効率は良くなる。
「ソリトン」
ソリトンは、非線形方程式に従う孤立波で、次の条件を満たす安定したパルス状の波動のことである。（１）伝播している孤立波の形状、速度などが不変である。粒子の「慣性の法則」に相当する。（２）上の条件を満たす波同士が衝突した後でも、お互い安定に存在する。衝突する波は二つより多くてもよい。波の個別性を保持し、衝突前後の運動量保存する。

この２条件より、この孤立波は粒子性（粒子としての性質）を持つ。ソリトン同士が衝突しても孤立した波は崩れないため、より複雑な動きとなり、液体の攪拌としては、より効率が高くなる。なお、ソリトンは必ずしも発生するとは限らない。

「カオス」
カオスは、一見ランダムに見える波であるが、数的誤差により予測できないとされている複雑な様子を示す現象である。ここで言う予測できないとは、決してランダムということではない。基本的にパラメトリックな現象で、その振る舞いは決定論的法則に従う。しかしながら、積分法による解が得られないため、その未来（および過去）の振る舞いを知るには数値解析を用いざるを得ない。このようにカオスは薬液を満遍なく攪拌することになり、その結果、液体の攪拌においては、最も効果的にムラなく均一化することができる。

＜実験１：攪拌システム１における周波数と振幅の関係＞
ここで、図９は、電圧を一定（５００ｍＶ）にした場合の攪拌システム１における周波数（Ｈｚ）と、振幅（μｍ）との関係を示すグラフである。ここで、本願において「振幅（μｍ）」とは、全振幅（peak to peak）をいう。ここに示すように、周波数が２０Ｈｚから８０Ｈｚまでは、振幅が概ね４０～６０μｍであるが、周波数が８０Ｈｚを越すと、振幅が大きくなり、９０Ｈｚでは１３０μｍ、１００Ｈｚに近づくとおよそ４９０μｍほどのピークを示す。そして、ピークを越すと、１１０Ｈｚでは１００μｍほどに小さくなる。

これは、およそ１００Ｈｚ弱の周波数が、振動装置２１の固有の共振点であるからである。この固有の共振点では、ピエゾ素子２２の伸縮が、最も効率的に鉛直振動に変換されているといえるが、この共振点を外れると、一挙に効率が悪くなる。本実施形態の攪拌システム１の目的は、効率的に振動を生じさせるところではなく、所望のファラデー液面波を人為的に制御して再現することにあるので、この共振点付近のピークを除外して、振幅のフラットな部分を利用する。

つまり、本実施形態の攪拌システム１においては、周波数８０～１１０Ｈｚの共振周波数近傍の部分は、振幅の制御が困難として利用しないこととする。なお、グラフには示されていないが、１２０Ｈｚを上限とするものではなく、これを超えた周波数の範囲、例えば１００～２００Ｈｚも本実施形態の攪拌システム１において利用できる範囲である。もちろん、攪拌システム１により、この共振点は異なるため、利用できる周波数は、その撹拌システム固有の範囲となる。

＜実験２：攪拌システム１における各電圧と周波数と振幅の関係＞
図１０は、電圧を一定（１～５Ｖ）にした場合の攪拌システム１における周波数（Ｈｚ）と、振幅（μｍ）との関係を示すグラフである。電圧は、１、２、３、４、５Ｖとした。

どの電圧においても攪拌システム１の共振周波数に近づくほど振幅が増加していき、電圧が高いほど高い振幅が得られることがわかる。また電圧が高いほど、共振による振幅の増大が顕著に表れることも確認できる。

４０～６０Ｈｚでは５Ｖまで，７０Ｈｚでは４Ｖまで，８０Ｈｚでは３Ｖまでというように，各周波数において５００μｍ以上の振幅が測定できるように最大電圧を決め測定を行った。なお、５０Ｈｚにおいては実験装置の天板の共振周波数であるため、周辺の４５Ｈｚと５５Ｈｚを測定した．どの周波数においても電圧の増加と共に振幅は線形的に増加する．周波数が高いほど，同じ入力電圧において高い振幅が得られることがわかった。

＜実験３：攪拌システム１における各周波数と電圧と振幅の関係＞
図１１は、周波数を一定（４０～８０Ｈｚ）にした場合の攪拌システム１における電圧（Ｖ）と、振幅（μｍ）との関係を示すグラフである。周波数は、４０、４５、５５、６０、７０、８０Ｈｚとした。

どの電圧においても装置の共振周波数に近づくほど振幅が増加していき、電圧が高いほど高い振幅が得られることがわかる。また電圧が高いほど、共振による振幅の増大が顕著に表れることも確認できる。４０～６０Ｈｚでは５Ｖまで、７０Ｈｚでは４Ｖまで、８０Ｈｚでは３Ｖまでというように、各周波数において５００μｍ以上の振幅が測定できるように最大電圧を決め測定を行った。なお、５０Ｈｚにおいては実験装置のステージ２８の共振周波数であるため、周辺の４５Ｈｚと５５Ｈｚを測定した。どの周波数においても電圧の増加と共に振幅は線形的に増加する。周波数が高いほど，同じ入力電圧において高い振幅が得られることがわかった。

＜実験４：攪拌システム１における、各周波数（Ｈｚ）における目的とする振幅（μｍ）を得るための電圧（Ｖ）＞
図１２は、攪拌システム１における、各周波数（Ｈｚ）における目的とする振幅（μｍ）を得るための電圧（Ｖ）を示す表である。ファラデー液面波は、パラメータである鉛直振動の周波数（Ｈｚ）と振幅（μｍ）に基づいたパラメトリック共鳴である。このことから、ファラデー液面波を制御するため、実験１～実験３の結果に基づいて、攪拌システム１において、各周波数（４０～８０Ｈｚ）において、所望の振幅を得るための電圧を求めた。周波数は、上述の攪拌システム１のステージ２８の共振周波数を考慮して、４０、４５、５５、６０、７０、８０Ｈｚとした。

したがって、攪拌システム１において、ＰＣ４により、信号発生器６によりピエゾ素子２２を駆動する電力の周波数（Ｈｚ）と、所望の振幅（μｍ）に基づいて印加する電圧（Ｖ）をピエゾドライバ５に送信し、振動装置２１を制御する。これにより、保持部材３に保持された薬液の自由液面において、所望のファラデー液面波を発生させることができる。

例えば、周波数６０Ｈｚにおいて、３００μｍの振幅で定常波が発生することがわかっている場合は、２．７Ｖの電圧を印加すればよいことがわかる。
＜周波数（Ｈｚ）と振幅（μｍ）に基づいて発生するファラデー液面波の種類＞
図１３は、本実施形態の攪拌システム１において、周波数（Ｈｚ）と振幅（μｍ）に基づいて発生するファラデー液面波の種類を示すグラフである。

例えば、周波数が６０Ｈｚで、振幅がおよそ２４０μｍになるように電圧を印加すれば、図に示す（ａ）の位置となる。このゾーンでは、図１４（ａ）に示すような定常波が生じる。また、周波数が７０Ｈｚで、振幅がおよそ２７０μｍになるように電圧を印加すれば、図に示す（ｂ）の位置となる。このゾーンでは、図１４（ｂ）に示すような時空間変調が生じる。さらに、周波数が８０Ｈｚで、振幅がおよそ４６０μｍになるように電圧を印加すれば、図に示す（ｃ）の位置となる。このゾーンでは、図１４（ｃ）に示すようなカオスが生じる。

逆に、定常波を発生させたいときには、このグラフの定常波を生じる（ａ）のゾーンに入るように、周波数と、所望の振幅を得るための電圧を印加すればよい。
なお、ここでは、ソリトンについては、述べていないが、各ファラデー液面波の発生については、ガイド３２の形状や、微細なパラメータの相違により、変化するものであり、グラフからも理解されるように、リニアな関係とはならないため、その発生を予測することは困難である。但し、グラフに示すように同一条件であれば、所定のパラメータである周波数と、振幅を特定すれば再現は可能である。

（作用）
＜攪拌処理＞
図４に示すように、試料３０ｂを載置し、周囲をガイド３２で包囲したスライドガラス３１のガイド３２内に薬液３０を滴下する。このガイド３２は、免疫染色用の撥水性ペン、例えばＤＡＣＯペン（ＤＡＣＯ社の登録商標）で周囲に描く。このガイド３２内に貯留され自由液面を有したスライドガラス３１を、ステージ２８上に載置して固定することにより、振動装置２１の振動により攪拌される。スライドガラス３１は、物理的な固定ジグ、粘着、負圧などでステージ２８に固定する。

攪拌は、例えば、定常波など一定のファラデー液面波が生じる状態を維持して、所定時間攪拌するようにしてもよい。また、ファラデー液面波と静止状態を相互に繰り返し、間欠的に攪拌してもよい。さらに、定常波、時空間変調、カオス、ソリトンなどのファラデー液面波の種類を変化させることで、攪拌の効率を高めることもできる。同じ波の種類の範囲で周波数や振幅を変化させてもよい。なお、振幅は、薬液の深さによっても、適当な振幅があり、例えば、本実施形態の免疫染色の場合には、２００～４００μｍが適当であり、これを超えると薬液の飛散などを生じる場合があるが、その他の攪拌を目的とする場合では、適当な振幅は異なる。また、周波数も薬液３０の深さ等に応じて、適宜選択する。

＜実験の結論＞
以上説明した通り、実験の結果、周波数及び振幅を制御することで、所望のファラデー液面波を発生させることができることが分かった。そして、ファラデー液面波を発生させることで、免疫染色のような微量の薬液を大面積水面で効率的に攪拌することができることが分かった。

（効果）本実施形態の攪拌システム１を用いた攪拌方法によれば、以下のような効果を得ることができる。
（１）免疫染色のような微量の薬液を効率的に短時間で攪拌することができる。

（２）ファラデー液面波により、微量で水深が極めて小さい薬液でも、表面張力に抗して、非接触で薬液を攪拌することができる。非接触のため、無用なコンタミネーションを抑制できる。

（３）ファラデー液面波は、鉛直方向の運動が基本であるので、適切な振幅のファラデー液面波により攪拌することで、微量の薬液であっても、飛散させることなく、短時間の間に効率よく攪拌することができる。

（４）超音波のようなキャビテーションによる発熱や振動により、生体などのデリケートな試料でも、これを損なうことを抑制できる。
（５）電界を掛けず、磁界もかけないため、電界や磁界により影響を受けるような試料でも問題を生じることがない。

（６）攪拌システム１では、周波数と振幅を制御することで、所望のファラデー液面波を発生させることができる。このため、対象となる試料により、ファラデー液面波を定常波、時空間変調、カオス、ソリトンとすることができる。

（７）また、ファラデー液面波を発生させたり、発生させない静止状態にしたりすることで、試料の保護など目的に沿って、制御することができる。
（８）さらに、発生させるファラデー波を変更することで、試料により最も効率的な攪拌を選択することもできる。

（９）本実施形態の攪拌装置２のステージ２８には、多数のスライドガラスを載置して、同時に攪拌することができる。そのため、術中迅速病理診断において、多数の試料を短時間で判定することができる。

（１０）また、大きな面積を有するシャーレ内の細胞培養なども、本実施形態の攪拌方法によれば細胞を損なわず、かつ容易に剥離することができる。
（１１）ファラデー液面波は、ＰＣ４により条件を設定し、この設定を信号発生器６に送信してピエゾドライバ５を制御する制御信号を発生し、ピエゾドライバ５はこの制御信号に基づいてピエゾ素子２２を駆動する。このため、容易に薬液に対する振動を制御できる。

（１２）ステージ２８の鉛直振動は、レーザ変位計７により看視され、ロックインアンプ８を介してＰＣ４にフィードバックされる。このため、正確にステージ２８の周波数や振幅を制御できる。また、このフィードバックに基づいて、制御信号のキャリブレーションを行えば、フィードバックなしで正確に制御することができる。

（１３）振動の発生は積層したピエゾ素子２２により発生させているので、応答性に優れ精密な制御をすることができる。また、強力な駆動力で、小さなピエゾ素子２２でも大きなステージ２８に対して加振することができる。その結果、コンパクトな振動装置２１でありながら、ステージ２８上の大量のスライドガラス３１上の薬液を攪拌したり、大きなシャーレ内の試料に振動を与えたりすることができる。

（１４）ピエゾ素子２２の変位は小さいものであるが、ハニカムリンク２４は、この変位を増幅して大きな振動に変換することができる。
（別例）
本実施形態は、以下のように変更して実施することができる。

○ハニカムリンク２４は、実施例に示した構成に限定されるものではなく、他の構成とすることができる。例えば、図７は、ハニカムリンク２４の別例を示す。図７に示すように、ハニカムリンク２４は、１つのハニカムリンクの作用点部２４ｃに、別のハニカムリンク２４の支点部２４ａを連結して積層し、一体にしている。これを６層重ねた構成としている。そしてこれらの配置されたピエゾ素子２２に同時に電圧を印加することで、実施形態に示した１層のハニカムリンク２４の６倍の鉛直方向の振幅を得ることができる。

○また、図７に示すように、これらを水平方向に連結して同時に制御することで、大きなステージ２８に大きな面積の薬液、あるいは多数の試料を載置することができる。
○ヒンジ部２４２ａ～ｈは、円孔２６ａや切欠部２６ｃにより、巾狭部が形成されることで弾性ヒンジとして機能しているが、その形状は限定されない。例えば、図１に示すハニカムリンク２４のように、切欠部を矩形にしてもよい。

○さらに、実施形態では、８つのヒンジ部２４２ａ～ｈと、８つのリンク２４１ａ～ｈから構成されているが、ピエゾ素子２２の伸縮が、増幅されて鉛直方向の振動に変換される限りその数や配置は限定されるものではない。

○実施形態では、ステージ２８を介して薬液を攪拌したが、ステージ２８を省略して、ハニカムリンク２４の作用点部２４ｃに直接載置するような構成でもよい。
○圧電素子は、ピエゾ素子を例にして説明したが、ピエゾ素子に限定されるものではない。

○振動装置は、実施形態ではハニカムリンク２４を例に説明したが、これに限定されるものではなく、ファラデー液面波を生じさせることができれば、例えば、ボイスコイルのようなものを用いても本発明の実施は可能である。

○実施形態では、攪拌の対象を免疫染色を例に説明したが、攪拌対象はこれに限定されるものではない。例えば、ファラデー液面波を用いて、粉末を液体に溶解させるような場合や、振動により剥離をさせるようなものでもよい。

○さらに、ファラデー波は、ファラデー液面波に限定されず、粉体同士の攪拌にも応用できる。
○本実施形態及び以下の変更例は、技術的に矛盾しない範囲で互いに組み合わせて実施することができる。

○その他、当業者においては、本願発明を逸脱しない範囲で、その構成を付与し、削除し、変更することができることは言うまでもない。

１…攪拌システム、２…攪拌装置、３…保持部材、４…ＰＣ（制御装置）、５…ピエゾドライバ（駆動装置）、６…信号発生器、７…レーザ変位計（測定装置）、８…ロックインアンプ（信号処理装置）、２１…振動装置、１１…ピエゾ素子（圧電素子）、２４…ハニカムリンク、２４ａ…支点部、２４ｂ…力点部、２４ｃ…作用点部、２４１ａ～ｈ…リンク、２４２ａ～ｈ…ヒンジ部（ジョイント）、２５…連結ブロック、２５ａ…凸部、２６…孔部、２６ａ…円孔、２６ｂ…長孔、２６ｃ…切欠部、２７…ベース（基台）、２８…ステージ（載置台）、２９…インシュレータ、３０…薬液、３０ａ…自由液面、３０ｂ…試料、３１…スライドガラス、３２…ガイド。

Claims

鉛直振動可能な振動装置と、
薬液の自由液面を形成するとともに前記振動装置により鉛直振動が加振される保持部材と、
前記振動装置の振幅及び周波数を制御する制御装置とを備え、
前記振動装置が前記薬液の自由液面において前記制御装置により少なくとも振幅及び周波数が制御されることで、前記振動装置の共振周波数未満、又は共振周波数を超えた周波数の共振周波数以外で前記振動装置を振動させ、目的とする定常波、時空間変調による波、カオスによる波、若しくはソリトン波からなるファラデー液面波のいずれかを選択して発生させることを特徴とする攪拌方法。
前記制御装置が予め設定された振幅及び周波数の組み合わせを参照して、前記制御装置により振幅及び周波数を制御して目的とする定常波、時空間変調による波、カオスによる波、若しくはソリトン波からなるファラデー液面波のいずれかを選択することを特徴とする請求項１に記載の攪拌方法。
前記ファラデー液面波は、定常波、時空間変調、ソリトン、カオスの種類を変更させるように生じさせることを特徴とする請求項１に記載の攪拌方法。
前記ファラデー液面波は、間欠的に発生させることを特徴とする請求項１～３のいずれか一項に記載の攪拌方法。
前記制御装置は、攪拌中に前記振動装置の少なくとも振幅及び周波数のいずれかを変更させて攪拌することを特徴とする請求項１～４のうちのいずれか一項に記載の攪拌方法。
前記振動装置は、
振動条件により長さ方向へ伸縮するアクチュエータと、
前記アクチュエータが固定支持される支点部と、
前記アクチュエータの自由端と共に変位可能とされる力点部と、
前記アクチュエータの自由端が長さ方向において変位する変位量よりも大きな変位量で前記長さ方向に対して直交する方向へ変位する作用点部と、
前記作用点部、前記力点部及び前記支点部の各近傍にそれぞれ配置される複数のヒンジ部と、前記各ヒンジ部の間を剛体態様で連結するリンク部とを備え、
前記アクチュエータの自由端と共に前記力点部を前記振動条件で変位させ、
前記各ヒンジ部と前記リンク部とにより形成される低次対偶のリンク機構の動きに基づき前記作用点部に接触させた被攪拌物を振動させることを特徴とする請求項１～５のうちいずれか一項に記載の攪拌方法。
前記各ヒンジ部は、前記力点部の変位時において、前記アクチュエータの長さ方向へ変位する第１ヒンジ部と、前記アクチュエータの長さ方向に対して直交する方向へ変位する第２ヒンジ部とを含んで構成され、前記第２ヒンジ部を前記作用点部の近傍に配置したことを特徴とする請求項６に記載の攪拌方法。
前記振動装置の振動の周波数は、４０～２００Ｈｚであることを特徴とする請求項７に記載の攪拌方法。
前記薬液が、免疫染色のための薬液であることを特徴とする請求項１～８のうちいずれか一項に記載の攪拌方法。