JP7017581B2 - Ｐａｕｆタンパク質に特異的に結合する抗体及びその用途 - Google Patents

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Description

本発明は、ＰＡＵＦ（Pancreatic adenocarcinoma upregulated factor）タンパク質に特異的に結合する抗体及びその用途に関する。
現在、臨床的に使用している抗癌剤は、化学療法剤と生物療法剤に分類することができる。過去活発に開発された化学療法剤は、癌細胞に毒性を示す薬剤であり、癌細胞だけでなく、正常な細胞にも毒性を示し、また、耐性を示すという問題があり、開発及び使用に限界を示している。そこで、最近では、人体の免疫機能を回復させたり、増加させて癌細胞の活動力を弱化させる生物療法剤がその代案として活発に開発されている。現在使用されたり、開発されている生物療法剤としては、サイトカイン類、モノクローナル抗体（monoclonal antibody）などの組換え抗体、核酸分子治療剤及び新生血管形成阻害剤などがある。
上述した生物療法剤の中でも、治療用モノクローナル抗体は、標的に対する反応特異性が高く、副作用が低いことが特徴である。抗体は、種々のメカニズムにより治療効果を示すが、該当抗原と特異的に結合してシグナル伝達を阻害したり、架橋結合（cross-linking）による細胞死滅を誘導することができ、また、生体内の免疫システムを活性化してその効果を示すこともできる。したがって、抗癌剤としてのモノクローナル抗体は、癌細胞を特異的に追跡し、その活性を抑制することはもちろん、免疫反応を起こして癌細胞を効果的に除去することができるため、癌治療の主流として位置づけられてきている。これに関連し、ラムシルマブ（ramucirumab）、リツキシマブ（rituximab）、トラスツズマブ（trastuzumab）などのモノクローナル抗体が開発され、胃癌、乳癌、肝臓癌などの治療に使用されている。
一方、ＰＡＵＦ（Pancreatic adenocarcinoma upregulated factor）タンパク質は、膵臓癌、卵巣癌、大腸癌、子宮頸癌などの癌細胞で過発現されて腫瘍の発達及び転移に関与するタンパク質であり、新たなパターンのリン酸化を通じてβ－カテニンを上方調節し、安定させて膵臓癌細胞の急速増殖に寄与すると言われている（Experimental ＆ Molecular Medicine, 2011, 43, 82-90（非特許文献１））。また、ＰＡＵＦタンパク質を標的とする低分子干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ－ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）は、膵臓癌細胞の移動、侵入及び腫瘍形成能力を減少させることが報告されることにより、癌の診断、治療などの標的としてＰＡＵＦタンパク質に対する関心が高まっており（Cancer Sci. 2009 May, 100(5):828-36.;Biochem Biophys Res Commun. 2014 Nov, 454(1):144-50.（非特許文献２））、これに関連し、抗ＰＡＵＦタンパク質ヒト抗体を含む膵臓癌診断及び治療用組成物が開発されている（韓国登録特許公報第１０－１０９８１８６号（特許文献１））。しかし、ＰＡＵＦタンパク質に対する結合力及び親和力を向上させるとともに、多様な種類の癌診断及び治療に優れた効果を有する抗体の開発が依然として必要であるのが現状である。
韓国登録特許公報第１０－１０９８１８６号
Experimental ＆ Molecular Medicine, 2011, 43, 82-90 Cancer Sci. 2009 May, 100(5):828-36.;Biochem Biophys Res Commun. 2014 Nov, 454(1):144-50.
本発明者らは、ＰＡＵＦタンパク質に特異的に結合し、多様な癌に対して優れた治療及び診断の効果を示し得る抗体を開発すべく鋭意努力研究した結果、抗ＰＡＵＦマウス抗体を基盤としたキメラ及びヒト化抗体を開発し、これらは、既存の抗ＰＡＵＦヒト抗体に比べてＰＡＵＦタンパク質にさらに高い親和度及び特異度を有し、膵臓癌または卵巣癌などに対してより優れた抗癌効果を示すことを確認し、本発明を完成した。
本発明の一つの目的は、ＰＡＵＦ（Pancreatic adenocarcinoma upregulated factor）タンパク質に結合する抗体を提供することにある。
本発明の他の一つの目的は、前記抗体をコードするポリヌクレオチドを提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、前記発現ベクターが導入された形質転換体を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、前記抗体を含む、癌の予防または治療用医薬組成物を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、前記抗体を個体に投与する段階を含む、癌の予防または治療方法を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、前記抗体を個体に投与する段階を含む、癌細胞の増殖、移動、または浸潤を抑制する方法を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、前記抗体に薬物が結合された、抗体－薬物結合体を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、前記抗体を含む、癌診断用組成物を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、前記組成物を含む、癌診断用キットを提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、前記抗体を用いて、癌が疑われる個体から分離された生物学的試料からＰＡＵＦタンパク質を抗原抗体反応を通じて検出する段階を含む、癌の診断方法を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、（ａ）癌細胞に癌の予防または治療候補物質を処理する段階；（ｂ）前記候補物質が処理された癌細胞において前記抗体を用いて、ＰＡＵＦタンパク質のレベルを測定する段階；及び（ｃ）前記段階（ｂ）のＰＡＵＦタンパク質のレベルが候補物質を処理していない癌細胞のものより減少する場合、前記（ａ）段階で処理した候補物質を癌の予防または治療物質として判断する段階を含む、癌の予防または治療物質のスクリーニング方法を提供することにある。
本発明の抗体は、ＰＡＵＦタンパク質に高い特異度及び親和度を有して結合し、癌細胞の増殖、移動、浸潤及び生体内の成長を抑制するため、ＰＡＵＦタンパク質が過発現されている癌のような疾患の診断及び治療の分野において有用に使用することができる。
抗ＰＡＵＦタンパク質マウス抗体である２Ｈ２または２０Ｃ５のＰＡＵＦタンパク質に対する親和度（Ａ）及び特異度（Ｂ）を示すグラフである。 ２Ｈ２または２０Ｃ５が既存の抗ＰＡＵＦタンパク質ヒト抗体であるＰＭＡｂ８３と異なるエピトープを有していることを示すグラフであり、ビオチン標識２Ｈ２競合ＥＬＩＳＡ（Biotin-labeled 2H2 Competitive ELISA）の結果に関する。 抗ＰＡＵＦタンパク質キメラ抗体であるｃＰＭＡｂ２２またはｃＰＭＡｂ２０５のＰＡＵＦタンパク質に対する特異度を示すグラフである。ヒト抗体であるＰＭＡｂ８３は比較群として使用した。 前記ｃＰＭＡｂ２２またはｃＰＭＡｂ２０５のＰＡＵＦタンパク質に対する親和度を示すグラフであり、ＥＬＩＳＡで分析した結果に関する。ヒト抗体であるＰＭＡｂ８３は比較群として使用した。 前記ｃＰＭＡｂ２２の癌細胞増殖抑制効果を示すグラフであり、ＷＳＴ－１増殖アッセイ（proliferation assay）の結果に関する。膵臓癌細胞株ＢｘＰＣ－３に対する効果を確認した。ＩｇＧは対照群、ＰＭＡｂ８３は比較群として使用した。 前記ｃＰＭＡｂ２２の癌細胞移動（migration）の抑制効果を示すグラフであり、移動アッセイ（migration assay）の結果に関する。膵臓癌細胞株ＣＦＰＡＣ－１及び膵臓癌の患者に由来する膵臓癌細胞ＡＭＣＰＡＣ０４に対する効果を確認した。ＰＭＡｂ８３は比較群として使用した。 前記ｃＰＭＡｂ２２の癌細胞浸潤（invasion）抑制効果を示すグラフであり、浸潤アッセイ（invasion assay）の結果に関する。膵臓癌細胞株ＣＦＰＡＣ－１及び膵臓癌患者由来の膵臓癌細胞ＡＭＣＰＡＣ０４に対する効果を確認した。ＰＭＡｂ８３は比較群として使用した。 本発明の一実施例に基づいて製造した、抗ＰＡＵＦタンパク質ヒト化抗体である２Ｈ２－ＶＨ１－ＶＬ１、２Ｈ２－ＶＨ１－ＶＬ２及び２Ｈ２－ＶＨ１－ＶＬ３のＰＡＵＦタンパク質に対する親和度を示すグラフであり、ＥＬＩＳＡで分析した結果に関する。キメラ抗体であるｃＰＭＡｂ２２及びヒト抗体であるＰＭＡｂ８３は比較群として使用した。 前記２Ｈ２－ＶＨ１－ＶＬ１、２Ｈ２－ＶＨ１－ＶＬ２及び２Ｈ２－ＶＨ１－ＶＬ３の生産収率を示すイメージであり、ウェスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）で分析した結果に関する。１は２Ｈ２－ＶＨ１－ＶＬ１、２は２Ｈ２－ＶＨ１－ＶＬ２、３は２Ｈ２－ＶＨ１－ＶＬ３、４は２Ｈ２－ＶＨ２－ＶＬ１、５は２Ｈ２－ＶＨ２－ＶＬ２、６は２Ｈ２－ＶＨ２－ＶＬ３、７は２Ｈ２－ＶＨ３－ＶＬ１、８は２Ｈ２－ＶＨ３－ＶＬ２、９は２Ｈ２－ＶＨ３－ＶＬ３、及び１０は２Ｈ２－ＶＨ４－ＶＬ４を意味し、Ａはタンパク質が含まれた培地を遠心分離していない状態、Ｂは遠心分離を通じて破砕物（debris）を除去し、０．２２μｍのフィルタを用いて濾過した状態、及びＣはＦｃタンパク質を意味する。Ｆｃタンパク質は対照群として使用した。 前記ヒト化抗体２Ｈ２－ＶＨ１－ＶＬ１、即ち、ｈＰＭＡｂ２２のＰＡＵＦタンパク質に対する特異度を示すグラフである。ヒト抗体であるＰＭＡｂ８３は比較群として使用した。 前記ｈＰＭＡｂ２２のＰＡＵＦタンパク質に対する親和度を示すグラフであり、ＳＰＲ（surface plasmon resonance）で分析した結果に関する。ヒト抗体であるＰＭＡｂ８３は比較群として使用した。 前記ｈＰＭＡｂ２２の抗ＰＡＵＦタンパク質ヒト抗体であるＰＭＡｂ８３と異なるエピトープを有していることを示すグラフであり、ビオチン標識ＰＭＡｂ８３競合ＥＬＩＳＡの結果に関する。 前記ｈＰＭＡｂ２２の癌細胞増殖抑制効果を示すグラフであり、ＷＳＴ－１増殖アッセイの結果に関する。膵臓癌細胞株ＣＦＰＡＣ－１に対する効果を確認した。ＩｇＧは対照群、ＰＭＡｂ８３は比較群として使用した。 前記ｈＰＭＡｂ２２の癌細胞移動抑制効果を示すグラフであり、移動アッセイの結果に関する。膵臓癌患者由来の膵臓癌細胞ＡＭＣＰＡＣ０６及び卵巣癌細胞株ＯＶＣＡＲ－５に対する効果を確認した。ＰＭＡｂ８３は比較群として使用した。 前記ｈＰＭＡｂ２２の癌細胞浸潤抑制効果を示すグラフであり、浸潤アッセイの結果に関する。膵臓癌患者由来の膵臓癌細胞ＡＭＣＰＡＣ０４またはＡＭＣＰＡＣ０６、及び卵巣癌細胞株ＯＶＣＡＲ－５に対する効果を確認した。ＰＭＡｂ８３は比較群として使用した。 前記ｈＰＭＡｂ２２の生体内（in vivo）の抗癌効果を示すグラフであり、抗体の投与により減少した腫瘍の体積及び重量を示す。ジェムザール（Gemzar;Gemcitabine）は比較群として使用した。
前記目的を達成するために、本発明の一つの態様は、ＰＡＵＦ（Pancreatic adenocarcinoma upregulated factor）タンパク質に結合する抗体を提供する。
本発明では、ＰＡＵＦタンパク質に特異的に結合する配列番号１の重鎖ＣＤＲ１；配列番号２または３９の重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号３、４または３０の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域及び配列番号５の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号６の軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号７または３１の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体を開発し、これらは既存のＰＡＵＦ抗体よりＰＡＵＦタンパク質に非常に高い親和度及び特異度を示し、膵臓癌、卵巣癌など多様な癌細胞の増殖、移動及び浸潤を抑制し、さらに、生体内に存在する癌の成長を抑制することを確認した。
本発明の用語、「ＰＡＵＦ（Pancreatic adenocarcinoma upregulated factor）タンパク質」とは、腫瘍の発達及び転移に関与するタンパク質を意味する。前記ＰＡＵＦタンパク質は膵臓癌、卵巣癌、大腸癌、子宮頸癌などの癌細胞で過発現されることが特徴であり、これにより、癌の診断、治療などの標的になり得ることが報告されている（Cancer Sci. 2009 May, 100(5):828-36.;Biochem Biophys Res Commun. 2014 Nov, 454(1):144-50.(非特許文献２)）。
本発明の用語、「抗体」とは、免疫学的に、特定の抗原と反応性を有する免疫グロブリン分子を含む、抗原を特異的に認識する受容体の役割をするタンパク質の分子を意味する。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、全（whole）抗体及び抗体断片を全て含み、また、キメラ抗体及び２価（bivalent）または二重特異性分子（例えば、二重特異性抗体）、ジアボディ（diabody）、トリアボディ（triabody）及びテトラボディ（tetrabody）を含む。併せて、ＦｃＲｎ（neonatal Fc receptor）に対する結合機能を有する短鎖抗体、スキャッブ、抗体不変領域の誘導体及びタンパク質スキャフォールドに基づいた人工抗体を含む。
前記全抗体は、２個の全長の軽鎖及び２個の全長の重鎖を有する構造であり、それぞれの軽鎖は、重鎖とジスルフィド結合（disulfide bond）で連結されている。前記全抗体はＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ及びＩｇＧを含め、ＩｇＧは亜型（subtype）であり、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む。
前記抗体断片は、抗原結合機能を有している断片を意味し、Ｆｃ、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、及びＦ（ａｂ’）２などを含む。前記ＦｃはＦｃ受容体と呼ばれる細胞表面受容体と相互作用する抗体の尾部を意味する。前記ＦｄはＦａｂ断片に含まれている重鎖部分を意味し、Ｆ（ａｂ’）２はＦｄ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦｖを含む断片を意味する。前記Ｆａｂは軽鎖及び重鎖の可変領域と軽鎖の不変領域及び重鎖の最初の不変領域（ＣＨ１ドメイン）を有する構造で１個の抗原結合部位を有する。Ｆａｂ’は重鎖ＣＨ１ドメインのＣ末端に１つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ）を有するという点でＦａｂと差異がある。Ｆ（ａｂ’）２抗体は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合をなしながら生成される。Ｆｖ（variable fragment）は、重鎖可変部位及び軽鎖可変部位のみを有している最小の抗体断片を意味する。ジスルフィドＦｖ（dsFv;disulfide-stabilized Fv antibody fragment）は、ジスルフィド結合で重鎖可変部位と軽鎖可変部位が連結されており、短鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、一般にペプチドリンカーを通じて重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域が共有結合で連結されている。このような抗体断片は、タンパク質加水分解酵素を利用して得ることができ（例えば、全抗体をパパインで制限切断するとＦａｂを得ることができ、ペプシンで切断するとＦ（ａｂ’）２断片を得ることができる）、好ましくは、遺伝子組換え技術を通じて作製することができる。
一般に、免疫グロブリンは、重鎖（heavy chain）及び軽鎖（light chain）を有し、それぞれの重鎖及び軽鎖は、不変領域（constant region）及び可変領域（variable region）を含む。軽鎖及び重鎖の可変領域は、相補性決定領域と呼ばれる３つの多変可能な領域（complementarity-determining region、以下「ＣＤＲ」と命名）及び４つの構造領域（framework region、以下「ＦＲ」と命名）を含む。各鎖のＣＤＲは、主に抗原のエピトープ（epitope）に結合する役割を果たし、典型的にＮ末端から開始して順次ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と命名される。また、各鎖のＦＲは、Ｎ末端から開始して順次にＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４と命名することができる。
本発明において、重鎖の可変領域は「ＶＨ」、軽鎖の可変領域は「ＶＬ」と命名することができ、重鎖のＣＤＲはそれぞれ「ＶＨ－ＣＤＲ１」、「ＶＨ－ＣＤＲ２」、「ＶＨ－ＣＤＲ３」と、軽鎖のＣＤＲはそれぞれ「ＶＬ－ＣＤＲ１」、「ＶＬ－ＣＤＲ２」、「ＶＬ－ＣＤＲ３」と、重鎖のＦＲはそれぞれ「ＶＨ－ＦＲ１」、「ＶＨ－ＦＲ２」、「ＶＨ－ＦＲ３」、「ＶＨ－ＦＲ４」と、軽鎖のＦＲは「ＶＬ－ＦＲ１」、「ＶＬ－ＦＲ２」、「ＶＬ－ＦＲ３」、「ＶＬ－ＦＲ４」と命名することができる。
また、前記のような本発明の抗体が不変領域を含む場合、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ由来またはこれらの組み合わせ（combination）またはこれらの混成（ｈｙｂｒｉｄ）による不変領域を含むことができる。
本発明の用語、「組み合わせ（combination）」とは、二量体または多量体を形成するとき、同一起源短鎖免疫グロブリン不変領域を暗号化するポリペプチドが相違する起源の短鎖ポリペプチドと結合を形成することを意味する。その例として、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭの不変領域からなるグループから選択された２つ以上の不変領域から二量体または多量体を形成することができる。
本発明の用語、「ハイブリッド（hybrid）」とは、短鎖免疫グロブリン重鎖不変領域内に２つ以上の相違する起源の免疫グロブリン重鎖不変領域に該当する配列が存在することを意味し、その例としてＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４からなるグループから選択される１個～４個のドメインからなるドメインのハイブリッドが可能である。
また、本発明において抗体は、可変領域及び不変領域の由来が同一または異なっていてもよく、ＣＤＲ、これを除いた可変領域及び不変領域の由来が同一または異なっていてもよい。
本発明の用語、「ＰＡＵＦ（Pancreatic adenocarcinoma upregulated factor）タンパク質に特異的に結合する抗体」とは、ＰＡＵＦタンパク質に結合してＰＡＵＦタンパク質の活性を阻害する抗体を意味する。
具体的には、前記ＰＡＵＦタンパク質に特異的に結合する抗体は、マウス抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体であってもよい。
具体的には、本発明の抗体は、配列番号１の重鎖ＣＤＲ１；配列番号２または３９の重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号３、４または３０の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域及び配列番号５の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号６の軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号７または３１の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むことができるが、これらに限定されない。
また、本発明の抗体は、配列番号１７、２８、または３７のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域；及び配列番号１８、２９、または３８のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含むことができるが、これらに限定されない。
また、本発明の抗体は、配列番号８、１９、または３２の重鎖ＦＲ（Framework region）１；配列番号９または２０の重鎖ＦＲ２；配列番号１０、２１、または３３の重鎖ＦＲ３；及び配列番号１１、１２、２２、２３、または３４の重鎖ＦＲ４を含む重鎖可変領域及び配列番号１３、２４、または３５の軽鎖ＦＲ１；配列番号１４または２５の軽鎖ＦＲ２；配列番号１５または２６の軽鎖ＦＲ３；及び配列番号１６、２７または３６の軽鎖ＦＲ４を含む軽鎖可変領域を含むことができるが、これらに限定されない。
本発明の一例として、既存のＰＡＵＦ抗体に比べてＰＡＵＦタンパク質に対する親和度及び特異度が向上した本発明の抗体は、
具体的には、配列番号１の重鎖ＣＤＲ１；配列番号２または３９の重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域及び配列番号５の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号６の軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号７の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むか、
配列番号１の重鎖ＣＤＲ１；配列番号２または３９の重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号４の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域及び配列番号５の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号６の軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号７の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むか、または
配列番号８の重鎖ＦＲ１；配列番号９の重鎖ＦＲ２；配列番号１０の重鎖ＦＲ３；及び配列番号１１の重鎖ＦＲ４を含む重鎖可変領域及び配列番号１３の軽鎖ＦＲ１；配列番号１４の軽鎖ＦＲ２；配列番号１５の軽鎖ＦＲ３；及び配列番号１６の軽鎖ＦＲ４を含む軽鎖可変領域を含むか、
配列番号８の重鎖ＦＲ１；配列番号９の重鎖ＦＲ２；配列番号１０の重鎖ＦＲ３；及び配列番号１２の重鎖ＦＲ４を含む重鎖可変領域及び配列番号１３の軽鎖ＦＲ１；配列番号１４の軽鎖ＦＲ２；配列番号１５の軽鎖ＦＲ３；及び配列番号１６の軽鎖ＦＲ４を含む軽鎖可変領域を含むことができ、
より具体的には、配列番号１７のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号１８のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含むことができるが、これらに限定されない。
本発明の一実施例では、配列番号１７のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号１８のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗体を「２Ｈ２」または「ｃＰＭＡｂ２２」と命名した。
また、本発明の抗体は、
具体的には、配列番号１の重鎖ＣＤＲ１；配列番号２または３９の重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域及び配列番号５の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号６の軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号７の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むか、
配列番号１の重鎖ＣＤＲ１；配列番号２または３９の重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号４の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域及び配列番号５の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号６の軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号７の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むか、または
配列番号１９の重鎖ＦＲ１；配列番号２０の重鎖ＦＲ２；配列番号２１の重鎖ＦＲ３；及び配列番号２２の重鎖ＦＲ４を含む重鎖可変領域及び配列番号２４の軽鎖ＦＲ１；配列番号２５の軽鎖ＦＲ２；配列番号２６の軽鎖ＦＲ３；及び配列番号２７の軽鎖ＦＲ４を含む軽鎖可変領域を含むか、
配列番号１９の重鎖ＦＲ１；配列番号２０の重鎖ＦＲ２；配列番号２１の重鎖ＦＲ３；及び配列番号２３の重鎖ＦＲ４を含む重鎖可変領域及び配列番号２４の軽鎖ＦＲ１；配列番号２５の軽鎖ＦＲ２；配列番号２６の軽鎖ＦＲ３；及び配列番号２７の軽鎖ＦＲ４を含む軽鎖可変領域を含むことができ、
より具体的には、配列番号２８のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号２９のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含むことができるが、これらに限定されない。
本発明の一実施例では、配列番号２８のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号２９のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗体を「ｈＰＭＡｂ２２」と命名した。
また、本発明の抗体は、
具体的には、配列番号１の重鎖ＣＤＲ１；配列番号２または３９の重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号３０の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域及び配列番号５の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号６の軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号３１の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むか、または
配列番号３２の重鎖ＦＲ１；配列番号９の重鎖ＦＲ２；配列番号３３の重鎖ＦＲ３；及び配列番号３４の重鎖ＦＲ４を含む重鎖可変領域及び配列番号３５の軽鎖ＦＲ１；配列番号１４の軽鎖ＦＲ２；配列番号１５の軽鎖ＦＲ３；及び配列番号３６の軽鎖ＦＲ４を含む軽鎖可変領域を含むことができ、
より具体的には、配列番号３７のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号３８のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含むことができるが、これらに限定されない。
本発明の一実施例では、配列番号３７のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号３８のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗体を「２０Ｃ５」または「ｃＰＭＡｂ２０５」と命名した。
本発明の具体的な一実施例では、ＰＡＵＦタンパク質に結合するマウス抗体２Ｈ２または２０Ｃ５、そのキメラ抗体ｃＰＭＡｂ２２またはｃＰＭＡｂ２０５、及びそのヒト化抗体ｈＰＭＡｂ２２を開発し、前記抗体は、従来のＰＡＵＦ抗体よりもＰＡＵＦタンパク質に高い特異度及び親和度で結合することを確認した（図１、３、４、８～１１）。また、前記抗体は、膵臓癌細胞株と膵臓癌患者に由来する膵臓癌細胞だけでなく、卵巣癌細胞株に対しても癌細胞の増殖、移動及び浸潤を抑制し、生体内に存在する膵臓癌の成長も抑制することができることを確認した。さらに、前記抗体の癌治療効果は、従来のＰＡＵＦタンパク質特異的ヒト抗体であるＰＭＡｂ８３と類似またはさらに優れることを確認した（図５～７、及び図１３～１６）。
これは、本発明のＰＡＵＦタンパク質に結合する抗体は、ＰＡＵＦタンパク質の認知が必要な分野、例えば、ＰＡＵＦタンパク質が過発現された疾患の診断または治療などに有用に使用できることを示唆するものである。
もう一つの態様は、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び前記発現ベクターが導入された形質転換体を提供する。
そのとき、前記抗体の説明については、前述した通りである。
本発明において、前記抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、特にこれに限定されないが、哺乳類細胞（例えば、ヒト、サル、ウサギ、ラット、ハムスター、マウス細胞など）、植物細胞、酵母細胞、昆虫細胞またはバクテリア細胞（例えば、大腸菌など）を含む真核または原核細胞において、前記ポリヌクレオチドを複製及び／または発現し得るベクターであってもよく、好ましくは宿主細胞において、前記ヌクレオチドが発現されるように、適切なプロモーターに作動可能に連結され、少なくとも一つの選別マーカーを含むベクターであってもよい。その例としてファージ、プラスミド、コスミド、ミニ染色体、ウイルスまたはレトロウイルスベクターなどに前記ポリヌクレオチドが導入された形態であってもよい。
前記抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、前記抗体の重鎖または軽鎖をコードするポリヌクレオチドをそれぞれ含む発現ベクターまたは重鎖または軽鎖をコードするポリヌクレオチドを全て含む発現ベクターであってもよい。
本発明において、前記発現ベクターが導入された形質転換体は、特に限定されないが、前記発現ベクターが導入されて形質転換された大腸菌、ストレプトマイセス、ネズミチフス菌などのバクテリア細胞；酵母細胞；ピキア・パストリスなどの菌類細胞；ショウジョウバエ、スポドプテラＳｆ９細胞などの昆虫細胞；ＣＨＯ（中国ハムスター卵巣細胞、chinese hamster ovary cells）、ＳＰ２／０（マウス骨髄腫）、ヒトリンパ芽球（human lymphoblastoid）、ＣＯＳ、ＮＳＯ（マウス骨髄腫）、２９３Ｔ、ボウメラノーマ細胞、ＨＴ－１０８０、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓細胞、baby hamster kidney cells）、ＨＥＫ（ヒト胚腎臓細胞、human embryonic kidney cells）、ＰＥＲＣ．６（ヒト網膜細胞）などの動物細胞；または植物細胞であってもよい。
本発明の用語、「導入」とは、前記抗体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞に伝達する方法を意味する。このような導入は、リン酸カルシウム－ＤＮＡ共沈殿法、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション法、ポリブレン媒介形質感染法、電気ショック法、微細注射法、リポソーム融合法、リポフェクタミン及び原形質体融合法などの当分野において公知となった種々の方法により行うことができる。また、形質導入は、感染（infection）を手段としてウイルス粒子を使用して目的物を細胞内に伝達させることを意味する。併せて、遺伝子のボンバードメント（bombardment）などによりベクターを宿主細胞内に導入することができる。本発明において、導入は形質転換と混用して使用される。
もう一つの態様は、前記抗体を含む、癌の予防または治療用医薬組成物を提供する。
前記抗体は、癌で過発現されたＰＡＵＦタンパク質に非常に高い親和度及び特異度を示し、膵臓癌、卵巣癌など多様な癌細胞の増殖、移動、浸潤を抑制し、さらに、生体内に存在する癌の成長を抑制することができるため、ＰＡＵＦタンパク質が過発現された疾患、例えば、癌の予防または治療効果を示すことができる。そのとき、前記抗体の説明については、前述した通りである。
本発明の用語、「癌」とは、身体組織の自律的な過剰成長により非正常的に増殖された塊であり、本発明の抗体により予防または治療し得る癌であれば、その種類に制限なく含むが、具体的な例として、膵臓癌、胃癌、大腸癌、胆道癌、食道癌、直腸癌、口腔癌、咽頭癌、喉頭癌、肺癌、結腸癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、前立腺癌、精巣癌、膀胱癌、腎臓癌、肝臓癌、骨癌、結合組織癌、皮膚癌、脳腫瘍、甲状腺癌、白血病、ホジキン（Hodgkin）疾患、リンパ腫、及び多発性骨髄腫血液癌であってもよい。
本発明の用語、「予防」とは、前記組成物の投与により癌の発症を抑制したり、遅延させる全ての行為を意味する。
本発明の用語、「治療」とは、前記組成物の投与により癌の症状が好転したり、有利に変更されるすべての行為を意味する。
前記医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含むことができ、前記担体は、非自然的担体（non-naturally occuring carrier）を含むことができる。
本発明の用語、「薬学的に許容可能な担体」とは、生物体を刺激せずに投与化合物の生物学的活性及び特性を阻害しない担体または希釈剤を意味する。液状溶液に製剤化される組成物に許容される薬学的担体としては、滅菌及び生体に適したものとして、生理食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、アルブミン注射溶液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール及びこれら成分の一つ以上の成分を混合して使用することができ、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び潤滑油を付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができる。
前記薬学的組成物は、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤及び坐剤からなる群から選択されるいずれか一つの剤形を有することができ、経口または非経口の種々の剤形であってもよい。製剤化する場合には、通常使用される充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して調製される。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、一つ以上の化合物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース（sucrose）またはラクトース（lactose）、ゼラチンなどを混ぜて調製される。また、単純な賦形剤以外にステアリン酸マグネシウム、タルクなどのような潤滑剤も使用される。経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、よく使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に種々の賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれてもよい。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁溶剤には、プロピレングリコール（propylene glycol）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどが使用されてもよい。坐剤の基剤としては、ウイテプゾール（witepsol）、マクロゴール、ツイン（tween）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使用されてもよい。
また、前記薬学的組成物は、薬学的に有効な量で投与することができる。
本発明において、用語、「薬学的に有効な量」とは、医学的治療に適用可能な合理的な利益／リスク比で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効容量レベルは、個体の種類及び重症度、年齢、性別、癌の種類、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出率、治療期間、同時に使用される薬物を含む要素及びその他の医学分野でよく知られている要素に応じて決定することができる。本発明の組成物は、個別の治療剤として投与するか、他の治療剤と併用して投与することができ、従来の治療剤とは、順次または同時に投与することができる。そして、単一または多重で投与することができる。前記要素を全て考慮し、副作用なしに最小限の量で最大の効果を得る量を投与することが重要であり、当業者により容易に決定することができる。
本発明の具体的な一実施例では、ＰＡＵＦタンパク質に高い特異度及び親和度で結合する抗体は、膵臓癌細胞株と膵臓癌患者に由来する膵臓癌細胞だけでなく、卵巣癌細胞株に対しても癌細胞の増殖、移動及び浸潤を抑制し、生体内に存在する膵臓癌の成長も抑制することができることを確認した。さらに、前記抗体の癌治療効果は、従来のＰＡＵＦタンパク質特異的ヒト抗体であるＰＭＡｂ８３と類似またはさらに優れることを確認した（図５～７、及び図１３～１６）。
これは、本発明のＰＡＵＦタンパク質に結合する抗体は、癌の予防または治療用途として有用に使用できることを示唆するものである。
もう一つの態様は、前記抗体を個体に投与する段階を含む、癌の予防または治療方法を提供する。
そのとき、前記抗体、癌、予防及び治療の説明については、前述した通りである。
本発明の用語、「個体」とは、癌が発症する可能性があるか、または発症したマウス、牛、豚、羊、鶏、犬、ヒトなどを含む哺乳動物、鳥類などを含み、本発明の医薬組成物の投与により癌が治療される個体は制限なく含む。
本発明の癌の予防または治療方法において、前記組成物を投与する投与経路及び投与方法は、特に制限されず、目的とする当該部位に前記組成物が到達することができる限り、任意の投与経路及び投与方法に従うことができる。
具体的には、前記組成物は、経口または非経口の多様な経路を通じて投与することができ、その投与経路の非限定的な例としては、口腔、直腸、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、経皮、鼻側内または吸入などを通じて投与されることが挙げられる。また、前記組成物は、活性物質が標的細胞に移動することができる任意の装置により投与することができる。
もう一つの態様は、本発明の抗体を個体に投与する段階を含む、癌細胞の増殖、移動または浸潤を抑制する方法を提供することである。
そのとき、前記抗体、個体及び癌の説明については、前述した通りである。
前記抗体は、癌で過発現されたＰＡＵＦタンパク質に非常に高い親和度及び特異度を示し、膵臓癌、卵巣癌など多様な癌細胞の増殖、移動及び浸潤を抑制し、さらに、生体内に存在する癌の成長を抑制することができるため、癌細胞の増殖、移動または浸潤を抑制する方法に有用に使用することができる。
もう一つの態様は、本発明の抗体に薬物が結合された、抗体－薬物結合体を提供する。
そのとき、前記抗体の説明については、前述した通りである。
本発明の用語、「抗体－薬物結合体」とは、抗体が有する標的特異性、血液循環中の毒性がないこと、及び薬物動態学的利点を利用して抗体に薬物を結合させた形態の物質を意味する。このような抗体－薬物結合体は、通常、モノクローナル抗体－リンカー－薬物、３つの構成要素を含め、抗体が標的とする細胞、特に癌細胞に薬物を提供して抗体による治療効果を上昇させることができる。
本発明の用語、「薬物」とは、抗体に直接または間接的に結合され、効果的に前記抗体が標的とする疾患の治療をもたらし得る物質を意味する。抗体と結合し得る薬物には、放射性核種、薬剤、リンホカイン、毒素、二重特異的抗体などを含む。また、前記した放射性核種には、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８６Ｒｅなどがあり、これに制限されない。また、前記薬剤または毒素の例として、エトポシド、テニポシド、アドリアマイシン、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン類、シス－白金及びシス－白金同族体、ブレオマイシン類、エスペラマイシン類、５－フルオロウラシル、メルファラン及びその他の窒素マスタードなどが挙げられるが、前記例により本願発明の抗体に結合し得る薬剤または毒素が制限されるものではない。
このような抗体－薬物結合体は、当業界において公知となった多様な抗体－薬物結合体の製造方法を通じて製造することができる。
もう一つの態様は、本発明の抗体を含む、癌診断用組成物を提供する。
そのとき、前記抗体及び癌の説明については、前述した通りである。
本発明の癌診断用組成物は、多様な種類の癌細胞で過発現されるＰＡＵＦタンパク質に特異的に結合する抗体を含むため、ＰＡＵＦタンパク質の発現有無や発現の程度と関連した疾患、例えば癌の診断に有用に使用することができる。
もう一つの態様は、前記組成物を含む、癌診断用キットを提供する。
そのとき、前記組成物及び癌の説明については、前述した通りである。
本発明の癌診断用キットは、分析方法に適した一種類またはそれ以上の異なる構成成分を有する組成物、溶液または装置をさらに含めて構成することができる。
もう一つの態様は、本発明の抗体を用いて癌が疑われる個体から分離された生物学的試料からＰＡＵＦタンパク質を抗原抗体反応を通じて検出する段階を含む、癌の診断方法を提供する。
そのとき、前記抗体、個体、ＰＡＵＦタンパク質及び癌の説明については、前述した通りである。
ＰＡＵＦタンパク質は、多様な種類の癌細胞で過発現されると知られているため、ＰＡＵＦタンパク質に高い特異度及び親和度で結合する本発明の抗体は、ＰＡＵＦタンパク質の発現有無や発現の程度と関連した疾患、例えば、癌の診断に有用に使用することができる。
前記癌の診断方法は、本発明のＰＡＵＦに特異的な抗体を癌が疑われる個体の分離された生物学的試料と反応させ、抗原抗体複合体の形成を検出することによりＰＡＵＦタンパク質を検出することができ、これにより、癌を診断することができる。
具体的には、（ａ）前記抗体を癌が疑われる個体の分離された生物学的試料に処理してＰＡＵＦタンパク質を抗原抗体反応を通じて検出する段階；（ｂ）前記（ａ）から検出されたＰＡＵＦタンパク質のレベルを対照群と比較し、対照群に比べてＰＡＵＦタンパク質のレベルが高ければ、癌患者と判定する段階を含む、癌の診断方法であってもよい。
本発明の用語、「生物学的試料」とは、組織、細胞、全血、血清、血漿、組織解剖試料（脳、皮膚、リンパ節、脊髄など）、細胞培養上澄み液、破裂された真核細胞及び細菌の発現系などが挙げられるが、これに限定されるものではない。これらの生物学的試料を操作したり、操作していない状態で、本発明の抗体と反応させてＰＡＵＦタンパク質の存在または癌の有無を確認することができる。
本発明の用語、「抗原抗体複合体」とは、試料中のＰＡＵＦタンパク質抗原とこれを認知する本発明の抗体の結合物を意味し、このような抗原抗体複合体の形成は、比色法（Colormetric method）、電気化学法（Electrochemical method）、蛍光法（Fluorimetric method）、発光法（Luminometric method）、粒子計数法（Particle counting method）、視覚的評価法（Visual assessment）またはシンチレーション計数法（Scintillation counting method）などの任意の方法で検出することができる。しかし、必ずしもこれらのみに限定されず、多様な応用と適用が可能である。
前記抗原抗体複合体を検出するために、種々の標識体を使用することができる。具体的な例として、酵素、蛍光物、リガンド、発光物、微小粒子または放射性同位元素等を使用することができるが、これに限定されるものではない。そのとき、検出標識体として使用される酵素としては、アセチルコリンエステラーゼ、アルカリホスファターゼ、β－Ｄ－ガラクトシダーゼ、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、β－ラクタマーゼなどを含み、蛍光物としてはフルオレセイン、Ｅｕ３＋、Ｅｕ３ ＋キレートまたはクリプテートなどを含み、リガンドとしてはビオチン誘導体などを含み、発光物としてはアクリジニウムエステル、イソルミノール誘導体などを含み、微小粒子としてはコロイド金、着色されたラテックスなどを含み、放射性同位元素としては ５７Ｃｏ、３Ｈ、１２５Ｉ、１２５Ｉ－ボントン（Bonton）ハンター（Hunter）試薬などを含む。
もう一つの態様は、（ａ）癌細胞に癌の予防または治療候補物質を処理する段階；（ｂ）前記候補物質が処理された癌細胞において、本発明の抗体を用いて、ＰＡＵＦタンパク質のレベルを測定する段階；及び（ｃ）前記段階（ｂ）のＰＡＵＦタンパク質のレベルが候補物質を処理していない癌細胞のものより減少する場合、前記（ａ）段階で処理した候補物質を癌の予防または治療物質と判断する段階を含む、癌の予防または治療物質のスクリーニング方法を提供する。
そのとき、前記抗体、ＰＡＵＦタンパク質及び癌の説明については、前述した通りである。
本発明の用語、「癌の予防または治療候補物質」とは、癌を治療し得ると予想される物質であり、直接または間接的に癌を好転または改善させることができると予想される物質であれば制限なく使用可能であり、化合物、遺伝子またはタンパク質などの治療可能予想物質をすべて含む。
本発明において、癌細胞に癌の予防または治療候補物質を処理する前記（ａ）段階は、当業界において公知となった方法を使用して実行することができる。具体的な例として、癌細胞に前記候補物質を処理して共に培養するか、または癌細胞を含む生体内に投与することにより、前記候補物質を処理することができるが、これに限定されるものではなく、当業者であれば、本発明の目的に合う方法を使用することができる。
また、ＰＡＵＦタンパク質のレベルを測定する前記（ｂ）段階は、当業者に知られている如何なる方法でも使用可能である。具体的な例として、ウェスタンブロット（Western blot）、共免疫沈降アッセイ（Co-Immunoprecipitation assay）、ＥＬＩＳＡ（Enzyme Linked Immunosorbent Assay）、免疫組織染色（Immunostaining）及びフローサイトメトリー分析法（Flowcytometry analysis）などを使用することができるが、これに限定されるものではなく、当業者であれば、本発明の目的に合う方法を使用することができるだろう。
最後に、前記（ｃ）段階は、前記候補物質を癌の予防または治療物質として使用できるかどうかを判断する段階であり、ＰＡＵＦタンパク質は、癌細胞で過発現され、癌細胞の増殖、移動、浸潤、成長などを促進するため、ＰＡＵＦタンパク質のレベルを減少させる候補物質は、癌の予防または治療物質として使用することができる。
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳しく説明する。これら実施例は、単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれら実施例により制限されるものとは解釈されない。
実施例１．抗ＰＡＵＦタンパク質マウス抗体の発掘及び特性確認
実施例１－１．２Ｈ２及び２０Ｃ５の発掘
ＰＡＵＦタンパク質を標的とする抗体を開発するために、まずＰＵＡＦタンパク質に結合するマウスモノクローナル抗体を用いた。
具体的には、抗ＰＡＵＦタンパク質マウス抗体は、以下のような方法で発掘した。ＰＡＵＦタンパク質をマウスに注射した後、抗原ＰＡＵＦタンパク質に対する抗体が生成されると、マウスの脾臓からＢリンパ球を分離した。分離したＢリンパ球を高倍率に希釈してＰＡＵＦタンパク質がコーティングされている９６ウェルプレートに１つのＢリンパ球のみが入るようにした。その後、ＨＲＰが標識された抗マウス抗体を用いてＰＡＵＦタンパク質と結合するＢリンパ球をスクリーニングした。
その結果、２Ｈ２、４Ｅ６、１１Ｇ６及び２０Ｃ５の４種の抗ＰＡＵＦタンパク質マウスモノクローナル抗体を発掘することができ、その重鎖及び軽鎖可変領域、ＣＤＲ、及びＦＲ配列は下記表１及び２に記載した。


Figure 0007017581000001

Figure 0007017581000002
実施例１－２．ＰＵＡＦタンパク質に対する特異度の確認
前記実施例１－１で発掘した２Ｈ２、４Ｅ６、１１Ｇ６及び２０Ｃ５の４種の抗体中、ＰＵＡＦタンパク質に親和度が最も高い抗体を発掘するために、次のような方法を行った。
具体的には、抗原抗体の親和度をテストするために間接ＥＬＩＳＡ（Indirect ELISA）を行った。ＰＡＵＦをコーティングした免疫プレート（Immuno-plate）に２Ｈ２、４Ｅ６、１１Ｇ６及び２０Ｃ５の４種の抗体を濃度別に処理した後、ＨＲＰが標識された抗マウス抗体を用いてＯＤ値を測定した。そのとき、ＯＤ値が高いほどＰＡＵＦと抗体の親和力が高いことを意味する。また、ＰＡＵＦに対する結合親和性が高い抗ＰＡＵＦマウスモノクローナル抗体の他の抗原タンパク質との非特異的結合を測定するために、免疫プレートにＰＡＵＦと不特定の抗原をコーティングして間接ＥＬＩＳＡを行った。
その結果、図１のＡ及びＢで見られるように、他の抗体に比べて、２Ｈ２または２０Ｃ５の２種の抗体がＰＡＵＦタンパク質に、より高い親和度で結合し、また、ＰＵＡＦタンパク質に対して非常に高い特異度を有していることを確認した。
実施例１－３．エピトープ（epitope）の確認
前記実施例１－１で発掘した２Ｈ２または２０Ｃ５のエピトープを確認するために、まず、韓国登録特許公報第１０－１０９８１８６号（特許文献１）に公知となったＰＡＵＦ特異的なヒトモノクローナル抗体である８Ｆ３、即ち、ＰＭＡｂ８３と同一なエピトープを有するかを確認した。
具体的には、ビオチン標識２Ｈ２競合ＥＬＩＳＡ（Biotin-labeled 2H2 Competitive ELISA）を行った。 免疫プレートにＰＡＵＦをコーティングした後、ビオチンが標識された２Ｈ２とビオチンが標識されていない非標識抗体を１：０、１：５０、１：１００、１：２００の割合で入れた。２次抗体としては、ストレプトアビジン（streptavidin）－ＨＲＰを使用してそれぞれの抗体のＯＤ値を測定することによりエピトープを分析した。そのとき、２つの抗体が類似したエピトープを有する場合、非標識抗体の濃度が増加するにつれてＯＤ値が低くなるが、２つの抗体のエピトープが異なる場合、非標識抗体の濃度が増加してもＯＤ値は変化がない。
その結果、図２で見られるように、２Ｈ２または２０Ｃ５は類似したエピトープを認識し、ＰＭＡｂ８３と異なるエピトープを有することを確認した。
実施例２．抗ＰＡＵＦタンパク質キメラ抗体（chimeric antibodies）の製造及び特性の確認
実施例２－１．ｃＰＭＡｂ２２またはｃＰＭＡｂ２０５の製造
前記実施例１で発掘した２Ｈ２または２０Ｃ５マウス抗体の拒否反応を最小限に抑えるために、前記抗体の可変領域は維持し、不変領域のみヒト由来のタンパク質に変えたキメラ抗体を製造した。
具体的には、２Ｈ２または２０Ｃ５マウス抗体を生産するハイブリドーマ（hybridoma）細胞から全ｍＲＮＡを分離してｃＤＮＡを合成した。その後、ＰＣＲを通じて、各抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域（variable region）のみ増幅させてＤＮＡを得た。ＰＣＲを通じて得られた２Ｈ２または２０Ｃ５の可変領域をヒトの重鎖及び軽鎖の不変領域を有するベクターにクローニングした。ベクターにクローニングした２Ｈ２と２０Ｃ５をＤＮＡ電気泳動を通じて確認した後、配列を分析し、グループを分けた。同じ配列を有するクローンを除去した後、各抗体の重鎖及び軽鎖を選別した。選別された配列をＨＥＫ２９３細胞で発現させ、最終的に、マウスの可変領域とヒトの不変領域を有するキメラ抗体２種を作製した。
その結果、２Ｈ２のキメラ抗体であるｃＰＭＡｂ２２、または２０Ｃ５のキメラ抗体であるｃＰＭＡｂ２０５を製造することができた。また、その重鎖及び軽鎖可変領域、ＣＤＲ、及びＦＲ配列は、前記表１及び２に記載した２Ｈ２または２０Ｃ５と同一であることを確認した。
実施例２－２．ＰＵＡＦタンパク質に対する特異度の確認
前記実施例２－１で製造したｃＰＭＡｂ２２またはｃＰＭＡｂ２０５のＰＵＡＦタンパク質に対する特異度を確認するために、次のような方法を行った。
具体的には、間接ＥＬＩＳＡを行った。ＰＡＵＦ－Ｈｉｓタンパク質と多数の不特定の抗原タンパク質をコーティングした免疫プレートにキメラ抗体ｃＰＭＡｂ２２とｃＰＭＡｂ２０５及びヒト抗体ＰＭＡｂ８３を０、１、５μｇ／ｍｌで入れた後、２次抗体である抗ヒトカッパ軽鎖－ＨＲＰ（ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ｋａｐｐａ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ－ＨＲＰ）を使用してＯＤ値を測定した。
その結果、図３で見られるように、ｃＰＭＡｂ２２またはｃＰＭＡｂ２０５はＰＵＡＦタンパク質に対して非常に高い特異度を有しており、特に、既存の抗ＰＡＵＦヒト抗体であるＰＭＡｂ８３より高いことを確認した。
実施例２－３．ＰＵＡＦタンパク質に対する親和度の確認
前記実施例２－１で製造したｃＰＭＡｂ２２またはｃＰＭＡｂ２０５のＰＵＡＦタンパク質に対する親和度を確認するために、次のような方法を行った。
具体的には、間接ＥＬＩＳＡを行った。免疫プレートにＰＡＵＦ－Ｈｉｓをコーティングした後、各抗体を濃度別に処理し、二次抗体としては、ヒトの不変領域を認識する抗ヒトＦｃ－ＨＲＰを使用して分析した。そのとき、各抗体の濃度が増加するにつれてＯＤ値は増加することになる。
その結果、図４で見られるように、ｃＰＭＡｂ２２またはｃＰＭＡｂ２０５はＰＵＡＦタンパク質に対して非常に高い親和力を有しており、特に、既存の抗ＰＡＵＦヒト抗体であるＰＭＡｂ８３より高いことを確認した。
実施例２－４．癌細胞の増殖（proliferation）抑制効果の確認
前記実施例２－１で製造したキメラ抗体ｃＰＭＡｂ２２の癌に対する治療効果を確認するために、膵臓癌細胞株ＢｘＰＣ－３に対する増殖抑制効果を確認した。
具体的には、ＷＳＴ－１増殖アッセイ（proliferation assay)を行った。ＰＡＵＦの独自の発現量が高いＢｘＰＣ－３細胞株を９６ウェルプレートに３×１０３ずつ入れた後、ＩｇＧとキメラ抗体ｃＰＭＡｂ２２とヒト抗体ＰＭＡｂ８３を１５μｇ／ｍｌずつ２日に一回処理した。その後、ＷＳＴ－１を処理して４５０ｎｍで吸光度を測定した。
その結果、図５で見られるように、ＩｇＧ対照群の抗体を処理したグループに比べて、ｃＰＭＡｂ２２を処理したグループがＢｘＰＣ－３細胞の増殖抑制能がより良いことを確認した。
前記結果を通じてｃＰＭＡｂ２２は、優れた癌細胞増殖抑制効果を示したため、癌の予防または治療物質として有用に使用されるものであることが分かった。
実施例２－５．癌細胞の移動（migration）抑制効果の確認
前記実施例２－１で製造したキメラ抗体ｃＰＭＡｂ２２の癌に対する治療効果を確認するために、膵臓癌細胞株ＣＦＰＡＣ－１及び膵臓癌の患者に由来する膵臓癌細胞ＡＭＣＰＡＣ０４の移動抑制効果を確認した。
具体的には、トランスウェル（Transwell）を利用した移動アッセイ（migration assay）を行った。膵臓癌細胞株ＣＦＰＡＣ－１の場合、トランスウェルの上部区画（upper compartment）には血清が含まれていない培地を用いて、各細胞を５×１０４ずつ入れ、ＩｇＧとｃＰＭＡｂ２２及びＰＭＡｂ８３を１５μｇ／ｍｌで処理した。下部区画（Lower compartment）には、血清を含む培地を入れた、２４時間後、各細胞の移動を観察した。また、膵臓癌患者に由来する膵臓癌細胞ＡＭＣＰＡＣ０４は上部区画には血清が含まれていない培地を用いて、各細胞を６×１０４ずつ入れ、ＩｇＧとｃＰＭＡｂ２２及びＰＭＡｂ８３を１０μｇ／ｍｌで処理した。下部区画には、血清を含む培地を入れ、２０時間後、細胞の移動を観察した。
その結果、図６で見られるように、ＩｇＧ対照群の抗体を処理したグループに比べて、ｃＰＭＡｂ２２を処理したグループは、膵臓癌細胞株または患者由来の膵臓癌の移動程度が著しく減少することを確認した。特に、これはＰＭＡｂ８３を処理したグループに比べても、より低いことを確認した。
前記結果を通じてｃＰＭＡｂ２２は、既存の抗ＰＡＵＦヒト抗体であるＰＭＡｂ８３より優れた癌細胞の移動抑制効果を示したため、癌の予防または治療物質として有用に使用されるものであることが分かった。
実施例２－６．癌細胞の浸潤（invasion）抑制効果の確認
前記実施例２－１で製造したキメラ抗体ｃＰＭＡｂ２２の癌に対する治療効果を確認するために、膵臓癌細胞株ＣＦＰＡＣ－１及び膵臓癌患者に由来する膵臓癌細胞であるＡＭＣＰＡＣ０４に対する浸潤抑制効果を確認した。
具体的には、トランスウェルを用いた浸潤アッセイ（invasion assay）を行った。そのとき、トランスウェルに細胞外基質を人為的に模写するマトリゲル（matrigel）をコーティングし、各抗体により変化する膵臓癌細胞株の浸潤能を観察した。膵臓癌細胞株ＣＦＰＡＣ－１の場合、トランスウェルの上部区画には血清が含まれていない培地を用いて、各細胞を７×１０４ずつ入れ、ＩｇＧとｃＰＭＡｂ２２及びＰＭＡｂ８３を１５μｇ／ｍｌで処理した。下部区画には、血清を含む培地を入れ、２４時間後、各細胞の浸潤を観察した。また、膵臓癌患者に由来する膵臓癌細胞ＡＭＣＰＡＣ０４は上部区画に血清が含まれていない培地を用いて、各細胞を６×１０４ずつ入れ、ＩｇＧとｃＰＭＡｂ２２及びＰＭＡｂ８３を１０μｇ／ｍｌで処理した。下部区画には、血清が含まれた培地を入れ、２０時間後に細胞の浸潤を観察した。
その結果、図７で見られるように、ＩｇＧ対照群の抗体を処理したグループに比べて、ｃＰＭＡｂ２２を処理したグループは、膵臓癌細胞株または患者由来膵臓癌の浸潤程度が著しく減少することを確認した。特に、これはＰＭＡｂ８３を処理したグループに比べても、より低いことを確認した。
前記結果を通じてｃＰＭＡｂ２２は、既存の抗ＰＡＵＦヒト抗体であるＰＭＡｂ８３より優れた癌細胞浸潤抑制効果を示したため、癌の予防または治療物質として有用に使用されるものであることが分かった。
実施例３．抗ＰＡＵＦタンパク質ヒト化抗体（humanized antibodies）の製造及び特性の確認
実施例３－１．ｈＰＭＡｂ２２の製造
前記実施例１で発掘した２Ｈ２マウス抗体及び前記実施例２で製造したｃＰＭＡｂ２２キメラ抗体の拒否反応を最小限に抑えるために、２Ｈ２及びｃＰＭＡｂ２２のＣＤＲ（マウス由来）は維持し、ＣＤＲを除いた可変領域及び不変領域はヒト由来のタンパク質に変えたヒト化抗体を製造した。
具体的には、ＣＤＲ ｇｒａｆｔｉｎｇを通じて２Ｈ２－ＶＨ１／ＶＬ１、２Ｈ２－ＶＨ１／ＶＬ２、２Ｈ２－ＶＨ１／ＶＬ３の３種のヒト化抗体を製造し、これらの親和度及び生産収率を確認した。ヒト化抗体の発現量を測定するために、それぞれ５ｍｌのレベルで３つの重鎖ＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ３と３つの軽鎖ＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ３を互いに交差組立（cross assembling）させてＨＥＫ２９３細胞に形質注入した。その後、６日後に抗体のタンパク質が含まれた培地を収穫して培養液を得、ウェスタンブロットを通じて発現率を測定した。また、これら抗体の親和度の分析のために、間接ＥＬＩＳＡを行った。免疫プレートにＰＡＵＦ－Ｈｉｓをコーティングした後、各抗体を濃度別処理し、二次抗体としては、ヒト抗体の不変領域を認識する抗ヒトＦｃ－ＨＲＰを使用してＯＤ値を測定した。
その結果、図８で見られるように、他のヒト化抗体に比べて、２Ｈ２－ＶＨ１／ＶＬ１抗体がＰＵＡＦタンパク質に対して最も高い親和度を有しており、これはキメラ抗体であるｃＰＭＡｂ２２、または既存の抗ＰＡＵＦヒト抗体であるＰＭＡｂ８３よりも高いことを確認した。
併せて、図９で見られるように、２Ｈ２－ＶＨ１／ＶＬ１抗体の生産収率は１６５．５ｍｇ／Ｌであり、２８．２５ｍｇ／Ｌまたは４２．０ｍｇ／Ｌの収率を有する２Ｈ２－ＶＨ１／ＶＬ２または２Ｈ２－ＶＨ１／ＶＬ３よりも非常に高いことを確認した。
前記結果を通じてＰＵＡＦタンパク質に対して最も高い親和度を有し、最も高い収率を有する前記２Ｈ２－ＶＨ１／ＶＬ１抗体を、本発明に係る２Ｈ２及びｃＰＭＡｂ２２のヒト化抗体として選別して「ｈＰＭＡｂ２２」と命名し、その配列は下記表３に記載した。
Figure 0007017581000003
実施例３－２．ＰＵＡＦタンパク質に対する特異度の確認
前記実施例３－１で製造したヒト化抗体ｈＰＭＡｂ２２のＰＵＡＦタンパク質に対する特異度を確認するために、前記実施例２－２による方法を行った。
その結果、図１０で見られるように、ｈＰＭＡｂ２２はＰＵＡＦタンパク質に対して非常に高い特異度を有しており、特に、既存の抗ＰＡＵＦヒト抗体であるＰＭＡｂ８３より高いことを確認した。
実施例３－３．ＰＵＡＦタンパク質に対する親和度の確認
前記実施例３－１で製造したヒト化抗体ｈＰＭＡｂ２２のＰＵＡＦタンパク質に対する親和度を確認するために、次のような方法を行った。
具体的には、ＳＰＲ方法を用いて抗原抗体の結合力を測定した。金属薄膜の表面に抗原ＰＡＵＦを固定させた後、抗体を濃度別に希釈して金属表面を通るようにした。抗原と抗体が結合する時間と解離する時間を測定し、各抗原抗体の結合親和性を測定した。
その結果、図１１で見られるように、ＰＡＭｂ８３の場合、１．１６９×１０－９Ｍ、ｈＰＭＡｂ２２は０．１９３８×１０－９ＭのＫｄ値を示すことを確認した。前記結果を通じてｈＰＭＡｂ２２はＰＵＡＦタンパク質に対して非常に高い親和度を有しており、特に、既存の抗ＰＡＵＦヒト抗体であるＰＭＡｂ８３より高いことが分かった。
実施例３－４．エピトープの確認
前記実施例３－１で製造したｈＰＭＡｂ２２のエピトープを確認するために、まず既存の抗ＰＡＵＦヒト抗体であるＰＭＡｂ８３とエピトープが同一かを前記実施例１～３に基づいて確認した。
その結果、図１２で見られるように、ｈＰＭＡｂ２２はＰＭＡｂ８３と異なるエピトープを有することを確認した。
実施例３－５．癌細胞の増殖抑制効果の確認
前記実施例３－１で製造したヒト化抗体ｈＰＭＡｂ２２の癌に対する治療効果を確認するために、膵臓癌細胞株ＣＦＰＡＣ－１に対する増殖抑制効果を、前記実施例２－４に係る方法で確認した。
その結果、図１３で見られるように、ＩｇＧ対照群の抗体を処理したグループに比べて、ｈＰＭＡｂ２２を処理したグループがＣＦＰＡＣ－１細胞の増殖抑制能がより良いことを確認した。
前記結果を通じてｈＰＭＡｂ２２は、優れた癌細胞増殖抑制効果を示したため、癌の予防または治療物質として有用に使用されるものであることが分かった。
実施例３－６．癌細胞の移動抑制効果の確認
前記実施例３－１で製造したヒト化抗体ｈＰＭＡｂ２２の癌に対する治療効果を確認するために、膵臓癌患者に由来する膵臓癌細胞ＡＭＣＰＡＣ０６及び卵巣癌細胞株ＯＶＣＡＲ－５に対する移動抑制効果を、前記実施例２－５による方法で確認した。
その結果、図１４で見られるように、ＩｇＧ対照群の抗体を処理したグループに比べて、ｈＰＭＡｂ２２を処理したグループは、膵臓癌細胞株、患者由来の膵臓癌、または卵巣癌細胞株の移動度が著しく減少することを確認した。特に、これはＰＭＡｂ８３を処理したグループに比べても、より低いことを確認した。
前記結果を通じてｈＰＭＡｂ２２は、既存の抗ＰＡＵＦヒト抗体であるＰＭＡｂ８３より優れた癌細胞の移動抑制効果を示したため、癌の予防または治療物質として有用に使用されるものであることが分かった。
実施例３－７．癌細胞の浸潤抑制効果の確認
前記実施例３－１で製造したヒト化抗体ｈＰＭＡｂ２２の癌に対する治療効果を確認するために、膵臓癌患者に由来する膵臓癌細胞ＡＭＣＰＡＣ０４またはＡＭＣＰＡＣ０６及び卵巣癌細胞株ＯＶＣＡＲ－５に対する浸潤抑制効果を、実施例２－６による方法で確認した。
その結果、図１５で見られるように、ＩｇＧ対照群の抗体を処理したグループに比べて、ｈＰＭＡｂ２２を処理したグループは、膵臓癌細胞株、患者由来の膵臓癌、または卵巣癌細胞株の浸潤程度が著しく減少することを確認した。特に、これはＰＭＡｂ８３を処理したグループに比べても、より低いことを確認した。
前記結果を通じてｈＰＭＡｂ２２は、既存の抗ＰＡＵＦヒト抗体であるＰＭＡｂ８３より優れた癌細胞浸潤抑制効果を示すため、これは癌の予防または治療物質として有用に使用されるものであることが分かった。
実施例３－８．生体内（in vivo）抗癌効果の確認
前記実施例３－５～３－７を通じてＰＡＵＦタンパク質に特異的なヒト化抗体ｈＰＭＡｂ２２は試験管内（in vitro）で癌細胞の増殖、移動及び浸潤を抑制することを確認することにより、生体内（in vivo）でも同一な抗癌効果を示すかを確認した。
具体的には、膵管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma）患者の癌組織をＮＳＧマウスに移植してＰＤＸ（patient-derived xenograft）マウスモデルを作製した。ＰＤＸマウスモデルから摘出した癌組織をヌードマウスの右脚皮下に移植し、約３週間後に、腫瘍の大きさが８０～１２０ｍｍ３に形成されたマウスを選別してグループを分けた。薬物投与は尾静脈にし、ＩｇＧ及びｈＰＭＡｂ２２は１０ｍｇ／ｋｇで、１週に２回ずつ、合計４週間投与し、陽性対照群であるジェムザール（Gemzar;Gemcitabine）は５０ｍｇ／ｋｇで一回投与した。そのとき、１週に２回ずつキャリパーを使用して腫瘍のサイズを測定し、マウスの体重も測定して腫瘍の薬物に対する反応性を確認した。３１日目で実験を終了し、腫瘍を摘出した後、各腫瘍の重量を測定して比較した。
その結果、図１６で見られるように、対照群の抗体を投与したグループに比べて、ｈＰＭＡｂ２２を投与したグループは、癌細胞の成長が３０％以上減少することを確認した。特に、前記成長抑制効果は抗癌剤として使用されているジェムザールを投与したグループよりも優れていることを確認した。
前記結果を通じてｈＰＭＡｂ２２は既存の抗癌剤であるジェムザールより優れた生体内癌の成長抑制効果を示すため、これは癌の予防または治療物質として有用に使用されるものであることが分かった。
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明の範囲は前記詳細な説明よりは、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導かれるあらゆる変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈すべきである。

Claims (14)

  1. 配列番号１の重鎖ＣＤＲ１；配列番号２または３９の重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号３、４または３０の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域及び
    配列番号５の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号６の軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号７または３１の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む、ＰＡＵＦ（Pancreatic adenocarcinoma upregulated factor）タンパク質に結合する抗体。
  2. 前記抗体の重鎖可変領域は、配列番号８、１９、または３２の重鎖ＦＲ１；配列番号９または２０の重鎖ＦＲ２；配列番号１０、２１、または３３の重鎖ＦＲ３；及び配列番号１１、１２、２２、２３、または３４の重鎖ＦＲ４を含み、
    前記抗体の軽鎖可変領域は、配列番号１３、２４、または３５の軽鎖ＦＲ１；配列番号１４または２５の軽鎖ＦＲ２；配列番号１５または２６の軽鎖ＦＲ３；及び配列番号１６、２７または３６の軽鎖ＦＲ４を含む、請求項１に記載の抗体。
  3. 前記重鎖可変領域は、配列番号１７、２８、または３７のアミノ酸配列からなり；
    前記軽鎖可変領域は、配列番号１８、２９、または３８のアミノ酸配列からなるものである、請求項１に記載の抗体。
  4. 請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
  5. 請求項４に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  6. 請求項５に記載の発現ベクターが導入された形質転換体。
  7. 請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体を含む、癌の予防または治療用医薬組成物。
  8. 請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体をヒト以外の個体に投与する段階を含む、癌の予防または治療方法。
  9. 請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体をヒト以外の個体に投与する段階を含む、癌細胞の増殖、移動、または浸潤を抑制する方法。
  10. 請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体に薬物が結合された、抗体－薬物結合体。
  11. 請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体を含む、癌診断用組成物。
  12. 請求項１１に記載の組成物を含む、癌診断用キット。
  13. 請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体を用いて、癌が疑われる個体の分離された生物学的試料からＰＡＵＦ（Pancreatic adenocarcinoma upregulated factor）タンパク質を抗原抗体反応を通じて検出する段階を含む、癌の診断のための情報を提供する方法。
  14. （ａ）個体から分離された癌細胞に癌の予防または治療候補物質を処理する段階；
    （ｂ）前記候補物質が処理された癌細胞において、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体を用いて、ＰＡＵＦ（Pancreatic adenocarcinoma upregulated factor）タンパク質のレベルを測定する段階；及び
    （ｃ）前記段階（ｂ）のＰＡＵＦタンパク質のレベルが候補物質を処理していない癌細胞のものより減少する場合、前記（ａ）段階で処理した候補物質を癌の予防または治療物質と判断する段階を含む、癌の予防または治療物質のスクリーニング方法。
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