JP7017347B2 - Medium for cellulose-degrading bacteria - Google Patents
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Description
本発明は、セルロース分解菌用培地に関する。 The present invention relates to a culture medium for cellulose-degrading bacteria.
セルラーゼは、セルロースを加水分解する酵素である。セルラーゼを有する菌類は、この酵素を利用して、セルロースをグルコースや、グルコースが複数分子結合した構造を有するオリゴ糖にまで分解し、これら分解物を栄養源として利用する。このような菌類を、本明細書においては、「セルロース分解菌」と称する。 Cellulase is an enzyme that hydrolyzes cellulose. Fungi having cellulase use this enzyme to decompose cellulose into glucose and oligosaccharides having a structure in which multiple molecules of glucose are bound, and these decomposition products are used as a nutrient source. Such fungi are referred to herein as "cellulose-degrading fungi".
一方、セルラーゼを用いてセルロースをグルコース等の最終産物へ分解する際の問題点としては、その分解速度が遅いことが挙げられる。すなわち、セルラーゼを用いたセルロースの分解は、現状、非常に非効率となっている。これは、セルロース分解菌においても同様である。 On the other hand, a problem in decomposing cellulose into a final product such as glucose using cellulase is that the decomposition rate is slow. That is, the decomposition of cellulose using cellulase is currently very inefficient. This also applies to cellulose-degrading bacteria.
例えば、セルロース分解菌の１種としてキノコが挙げられる。従来、キノコの栽培培地としては、セルロース源としておがくずやふすま等を含有する培地が利用されている。しかし、このような培地を用いてキノコを栽培する場合には、セルラーゼによるセルロースの分解速度が遅いために、キノコの栽培期間の短縮には限界があり、短期間でキノコを収穫できないという問題点があった。 For example, a mushroom is mentioned as one of the cellulose-degrading bacteria. Conventionally, as a cultivation medium for mushrooms, a medium containing sawdust, bran or the like as a cellulose source has been used. However, when mushrooms are cultivated using such a medium, there is a limit to shortening the cultivation period of mushrooms due to the slow decomposition rate of cellulose by cellulase, and there is a problem that mushrooms cannot be harvested in a short period of time. was there.
そこで、セルラーゼを用いてセルロースを最終産物へ分解するときの分解速度を向上させる方法の開発が望まれている。このような方法としては、天然型セルロースであるセルロースＩ型をアンモニア処理することにより、セルロースＩ型よりも結晶密度が低い低密度結晶性セルロースを得た後、セルラーゼを用いて、この低密度結晶性セルロースをグルコースへ分解する方法が開示されている（特許文献１参照）。 Therefore, it is desired to develop a method for improving the decomposition rate when decomposing cellulose into a final product using cellulase. As such a method, cellulose type I, which is a natural type cellulose, is treated with ammonia to obtain low-density crystalline cellulose having a lower crystal density than cellulose type I, and then this low-density crystal is obtained by using cellulase. A method for decomposing sex cellulose into glucose is disclosed (see Patent Document 1).
しかし、特許文献１で開示されている方法は、アンモニア処理という特殊な操作が必要であるという問題点があった。また、セルロース分解菌が低密度結晶性セルロースを効率的に分解できるか否かも定かではない。
そこで、セルロース分解菌において、セルロースの最終産物への分解速度を向上させることができる、汎用性が高い手段の開発が望まれていた。例えば、新規の培地を用いて、セルロース分解菌を生育させるだけで、このような目的を達成できれば、非常に有用である。
However, the method disclosed in Patent Document 1 has a problem that a special operation of ammonia treatment is required. It is also unclear whether cellulolytic bacteria can efficiently degrade low-density crystalline cellulose.
Therefore, it has been desired to develop a highly versatile means capable of improving the decomposition rate of cellulose into a final product in a cellulose-degrading bacterium. For example, it would be very useful if such a purpose could be achieved only by growing cellulose-degrading bacteria using a new medium.
そこで、本発明は、セルロース分解菌における、セルロースの最終産物への分解速度を向上させることができる、新規のセルロース分解菌用培地を提供することを課題とする。 Therefore, it is an object of the present invention to provide a novel medium for cellulolytic bacteria capable of improving the decomposition rate of cellulose into the final product in the cellulolytic bacteria.
本発明は、セルロースナノファイバーを含有する、セルロース分解菌用培地を提供する。
本発明のセルロース分解菌用培地においては、前記セルロース分解菌がキノコであることが好ましい。
The present invention provides a medium for cellulolytic bacteria containing cellulose nanofibers.
In the medium for cellulolytic bacteria of the present invention, it is preferable that the cellulolytic bacteria are mushrooms.
本発明によれば、セルロース分解菌における、セルロースの最終産物への分解速度を向上させることができる、新規のセルロース分解菌用培地が提供される。 INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, there is provided a novel medium for cellulolytic bacteria capable of improving the decomposition rate of cellulose into a final product in the cellulolytic bacteria.
＜＜セルロース分解菌用培地＞＞
本発明のセルロース分解菌用培地（本明細書においては、単に「培地」と称することがある）は、セルロースナノファイバー（本明細書においては、「ＣＮＦ」と称することがある）を含有する。
<< Medium for Cellulolytic Bacteria >>
The medium for cellulolytic bacteria of the present invention (sometimes referred to simply as "medium" in the present specification) contains cellulose nanofibers (sometimes referred to as "CNF" in the present specification).
本発明の培地がＣＮＦを含有していることにより、本発明の培地をセルロース分解菌の生育に用いた場合、セルロース分解菌は、セルロースとしてこのＣＮＦを加水分解し、最終産物として、グルコースや、グルコースが複数分子結合した構造を有するオリゴ糖を生成する。このときのＣＮＦの分解速度は、ＣＮＦに該当しないセルロース（本明細書においては、「非ＣＮＦセルロース」と称することがある）を同様の条件で分解するときの分解速度よりも、顕著に速い。したがって、本発明の培地を用いてセルロース分解菌を生育させることにより、短期間でセルロース分解菌を大量に生育させることができる。さらにこの場合、本発明の培地を用いて、セルロース分解菌を生育させるだけでよく、本発明の培地を用いる点以外は、従来法と同様の方法でセルロース分解菌を生育させることが可能であり、特殊な操作が不要である。したがって、本発明の培地は汎用性が高い。
このように、本発明の培地は、セルロース分解菌の生育促進作用を有する。
Since the medium of the present invention contains CNF, when the medium of the present invention is used for the growth of cellulolytic bacteria, the cellulolytic bacteria hydrolyze this CNF as cellulose, and as a final product, glucose or Glucose produces oligosaccharides having a structure in which multiple molecules are bound. The decomposition rate of CNF at this time is significantly faster than the decomposition rate when decomposition of cellulose not corresponding to CNF (in this specification, it may be referred to as “non-CNF cellulose”) under the same conditions. Therefore, by growing the cellulose-degrading bacteria using the medium of the present invention, a large amount of the cellulose-degrading bacteria can be grown in a short period of time. Further, in this case, it is only necessary to grow the cellulose-degrading bacteria using the medium of the present invention, and it is possible to grow the cellulose-degrading bacteria by the same method as the conventional method except that the medium of the present invention is used. , No special operation is required. Therefore, the medium of the present invention is highly versatile.
As described above, the medium of the present invention has an action of promoting the growth of cellulose-degrading bacteria.
本発明の培地を用いることにより、セルロース分解菌におけるセルロースの分解速度が向上する理由は、定かではないが、ＣＮＦの結晶化度が低く、さらに、ＣＮＦのセルラーゼと接触可能な表面積が大きく、セルロース（ＣＮＦ）の分解反応が促進され易いからではないかと推測される。 The reason why the decomposition rate of cellulose in cellulose-degrading bacteria is improved by using the medium of the present invention is not clear, but the crystallinity of CNF is low, the surface area that can be contacted with CNF cellulase is large, and cellulose is used. It is presumed that this is because the decomposition reaction of (CNF) is easily promoted.
セルロース分解菌のセルロースの分解速度は、セルロース分解菌の生育量を１つの目安とすることができる。例えば、セルロース分解菌のセルロースの分解速度を比較する場合には、同じ生育時間でのセルロース分解菌の生育量を比較することで、分解速度の優劣を判断できる。 As for the decomposition rate of cellulose of the cellulose-degrading bacterium, the growth amount of the cellulose-degrading bacterium can be used as a guide. For example, when comparing the decomposition rate of cellulose of a cellulose-degrading bacterium, the superiority or inferiority of the decomposition rate can be determined by comparing the growth amount of the cellulose-degrading bacterium at the same growth time.
＜セルロース分解菌＞
本発明の培地の使用対象となるセルロース分解菌は、セルロースの加水分解酵素であるセルラーゼを有する菌類であり、セルラーゼを用いることによって、セルロースを最終産物であるグルコース又はオリゴ糖にまで分解する。セルロース分解菌は、通常、この最終産物を栄養源として利用する。
セルロース分解菌は、セルラーゼによってセルロース（ＣＮＦ）を加水分解して、単糖又はオリゴ糖を生成するという点において、共通の性質を有する。
<Cellulolytic bacteria>
The cellulose-degrading fungus to be used in the medium of the present invention is a fungus having cellulase, which is a cellulose hydrolase, and by using cellulase, cellulose is decomposed into glucose or oligosaccharide, which is the final product. Cellulolytic bacteria usually utilize this end product as a nutrient source.
Cellulose-degrading bacteria have a common property in that they hydrolyze cellulose (CNF) with cellulase to produce monosaccharides or oligosaccharides.
セルロース分解菌としては、例えば、細菌、真菌等に分類される菌類が挙げられる。細菌は微生物であるが、真菌には微生物以外に、子実体を形成するキノコも含まれる。すなわち、本発明の培地は、微生物の培養（生育）以外に、キノコの栽培（生育）にも利用できる。 Examples of the cellulose-degrading bacterium include fungi classified into bacteria, fungi and the like. Bacteria are microorganisms, but fungi include mushrooms that form fruiting bodies in addition to microorganisms. That is, the medium of the present invention can be used not only for culturing (growing) microorganisms but also for cultivating (growing) mushrooms.
セルロース分解菌のうち、細菌で好ましいものとしては、例えば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物等が挙げられる。
セルロース分解菌のうち、真菌で好ましいものとしては、例えば、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）等のトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属に属する微生物；クロストリジウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）等のクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属に属する微生物；マイタケ、ヒラタケ、エノキ、シイタケ等のキノコ等が挙げられる。
キノコは、それ自体の利用価値が高く、栽培期間の短縮によって短期間で収穫できることは重要である。すなわち、セルロース分解菌のうちキノコは、特に好ましいものの一例として挙げられる。
Among the cellulose-degrading bacteria, preferred bacteria include, for example, microorganisms belonging to the genus Bacillus.
Among the cellulose-degrading bacteria, those preferred as fungi are, for example, microorganisms belonging to the genus Trichoderma such as Trichoderma reesei; and Clostridium belonging to the genus Clostridium such as Clostridium thermocellum. ; Mushrooms such as Maitake, Hiratake, Enoki, and Shiitake can be mentioned.
It is important that mushrooms have high utility value in their own right and can be harvested in a short period of time by shortening the cultivation period. That is, among the cellulose-degrading bacteria, mushrooms are mentioned as an example of particularly preferable ones.
＜セルロースナノファイバー（ＣＮＦ）＞
本発明の培地が含有するＣＮＦは、特に限定されず、公知のものでよい。
ＣＮＦとして、より具体的には、例えば、セルロース若しくはその誘導体で、繊維幅が３～２００ｎｍのミクロフィブリル又はミクロフィブリル集合体となっているものが挙げられる。
<Cellulose Nanofiber (CNF)>
The CNF contained in the medium of the present invention is not particularly limited and may be known.
More specifically, the CNF includes, for example, cellulose or a derivative thereof, which is a microfibril or an aggregate of microfibrils having a fiber width of 3 to 200 nm.
ＣＮＦとしては、例えば、解繊セルロースナノファイバー（解繊ＣＮＦ）、ＴＥＭＰＯ酸化セルロースナノファイバー（ＴＥＭＰＯ酸化ＣＮＦ）等が挙げられる。
解繊ＣＮＦは、水等の分散媒中で、セルロースナノファイバー前駆体（ＣＮＦ前駆体）に対して解繊処理を行うことにより、セルロースナノファイバー分散液（ＣＮＦ分散液）を得る工程を有する製造方法で製造されたＣＮＦである。
ＴＥＭＰＯ酸化ＣＮＦは、２，２，６，６－テトラメチル－１－ピペリジニルオキシ，ラジカル（ＴＥＭＰＯ）触媒によるセルロースの化学変性法で得られたＣＮＦである。
Examples of the CNF include defibrated cellulose nanofibers (defibrated CNF) and TEMPO oxidized cellulose nanofibers (TEMPO oxidized CNF).
The defibrated CNF is manufactured by having a step of obtaining a cellulose nanofiber dispersion liquid (CNF dispersion liquid) by performing a defibration treatment on a cellulose nanofiber precursor (CNF precursor) in a dispersion medium such as water. CNF manufactured by the method.
TEMPO Oxidized CNF is a CNF obtained by a chemical denaturation method of cellulose catalyzed by 2,2,6,6-tetramethyl-1-piperidinyloxy, radical (TEMPO).
前記ＣＮＦ前駆体は、解繊処理が施されていないセルロース類であり、例えば、ミクロフィブリルの集合体で構成される。
ＣＮＦ前駆体としては、例えば、酸化セルロース、すなわちセルロースの酸化処理により、セルロース分子中のグルコピラノース環の少なくとも一部にカルボキシ基が導入されたもの、を用いてもよい。
The CNF precursor is a cellulose that has not been defibrated, and is composed of, for example, an aggregate of microfibrils.
As the CNF precursor, for example, cellulose oxide, that is, one in which a carboxy group is introduced into at least a part of the glucopyranose ring in the cellulose molecule by the oxidation treatment of cellulose may be used.
ＣＮＦ前駆体を得るためのセルロース源（セルロースを含む原料）は、セルロースを含むものであれば特に限定されず、セルロース自体であってもよい。
セルロース源としては、例えば、セルロースＩの結晶構造を有する天然由来のセルロースを含むものが挙げられ、より具体的には、例えば、各種木材パルプ、非木材パルプ、バクテリアセルロース、古紙パルプ、コットン、バロニアセルロース、ホヤセルロース等が挙げられる。
セルロース粉末、微結晶セルロース粉末等の各種市販品も、セルロース源として使用できる。
The cellulose source (raw material containing cellulose) for obtaining the CNF precursor is not particularly limited as long as it contains cellulose, and may be cellulose itself.
Examples of the cellulose source include those containing naturally-derived cellulose having a crystalline structure of cellulose I, and more specifically, for example, various wood pulps, non-wood pulps, bacterial celluloses, waste paper pulps, cottons, and baronia. Examples thereof include cellulose and squirrel cellulose.
Various commercially available products such as cellulose powder and microcrystalline cellulose powder can also be used as a cellulose source.
ＣＮＦ前駆体の解繊処理の方法は、特に限定されない。具体的な解繊処理の方法としては、例えば、超音波ホモジナイザー、低圧ホモジナイザー、高圧ホモジナイザー、対向衝突型ホモジナイザー、超高圧ホモジナイザー、ボールミル、遊星ミル、高速回転ミキサー、磨砕用グラインダー等を用いた、機械的解繊処理法が挙げられる（本明細書においては、特に機械的解繊処理法を行うことにより得られたＣＮＦを「機械解繊ＣＮＦ」と称する）。
ＣＮＦ前駆体の解繊処理により得られた処理物が、ＣＮＦであることは、例えば、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を用いて、前記処理物の繊維を観察することにより確認できる。
The method for defibrating the CNF precursor is not particularly limited. As a specific defibration treatment method, for example, an ultrasonic homogenizer, a low-pressure homogenizer, a high-pressure homogenizer, a counter-collision homogenizer, an ultra-high pressure homogenizer, a ball mill, a planetary mill, a high-speed rotary mixer, a grinding machine, or the like was used. Examples thereof include a mechanical defibration treatment method (in this specification, a CNF obtained by performing a mechanical defibration treatment method is referred to as “mechanical defibration CNF”).
The fact that the treated product obtained by the defibration treatment of the CNF precursor is CNF can be confirmed by observing the fibers of the treated product using, for example, an atomic force microscope (AFM).
前記培地が含有するＣＮＦは、１種のみでもよいし、２種以上でもよく、２種以上である場合、それらの組み合わせ及び比率は、任意に調節できる。 The CNF contained in the medium may be only one kind, may be two or more kinds, and when there are two or more kinds, the combination and ratio thereof can be arbitrarily adjusted.
前記培地のＣＮＦの含有量は、セルロース分解菌の生育が良好となるように適宜調節すればよく、特に限定されない。
なかでも、前記培地のＣＮＦの含有量は、０．０１～２質量％であることが好ましく、０．１～１．８質量％であることがより好ましく、０．２～１．６質量％であることがさらに好ましく、０．３～１．４質量％であることが特に好ましい。ＣＮＦの前記含有量が前記下限値以上であることで、セルロース分解菌における、ＣＮＦの分解速度が、より向上する。また、ＣＮＦの前記含有量が前記上限値以下であることで、ＣＮＦの過剰使用がより抑制される。
The content of CNF in the medium may be appropriately adjusted so that the growth of cellulose-degrading bacteria is good, and is not particularly limited.
Among them, the CNF content of the medium is preferably 0.01 to 2% by mass, more preferably 0.1 to 1.8% by mass, and 0.2 to 1.6% by mass. Is more preferable, and 0.3 to 1.4% by mass is particularly preferable. When the content of CNF is at least the lower limit, the decomposition rate of CNF in the cellulolytic bacteria is further improved. Further, when the content of CNF is not more than the upper limit value, excessive use of CNF is further suppressed.
＜他の成分＞
前記培地は、ＣＮＦ以外に、セルロース分解菌の生育に必要な他の成分を含有する。
前記他の成分は特に限定されず、セルロース分解菌の種類やＣＮＦの種類等に応じて、適宜選択できる。
前記他の成分は、例えば、有機成分及び無機成分のいずれであってもよい。
<Other ingredients>
In addition to CNF, the medium contains other components necessary for the growth of cellulose-degrading bacteria.
The other components are not particularly limited, and can be appropriately selected depending on the type of cellulose-degrading bacteria, the type of CNF, and the like.
The other component may be, for example, either an organic component or an inorganic component.
前記培地が含有する前記他の成分は、１種のみでもよいし、２種以上でもよく、２種以上である場合、それらの組み合わせ及び比率は、任意に調節できる。 The other components contained in the medium may be only one kind, two or more kinds, and when two or more kinds, the combination and ratio thereof can be arbitrarily adjusted.
前記培地は、前記他の成分で構成された公知の培地に、ＣＮＦが添加されたものであってもよい。
ＣＮＦの添加対象である公知の培地としては、例えば、トリプチックソイブロス（Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ）、ポテトデキストロース寒天培地（Ｐｏｔｅｔｏ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ Ａｇｅｒ）等が挙げられ、さらに、これら公知の培地に、別途、公知の培地の構成成分が添加されたものも挙げられる。
The medium may be a known medium composed of the other components with CNF added.
Examples of the known medium to which CNF is added include Tryptic Soy Broth, Potato Dextrose Agar, and the like. Further, these known media are separately known. Examples include those to which the constituents of the medium have been added.
前記培地は、液状及び固形状のいずれであってもよい。
前記培地が液状である場合、ＣＮＦは培地中で偏在していてもよいが、均一に分散していることが好ましい。
前記培地が固形状である場合、ＣＮＦは培地中に偏在していてもよいし、均一に分散していてもよいが、偏在している場合には、培地の植菌（菌の接種）を行う面とその近傍領域に偏在していることが好ましい。
The medium may be either liquid or solid.
When the medium is liquid, the CNF may be unevenly distributed in the medium, but it is preferably uniformly dispersed.
When the medium is solid, CNF may be unevenly distributed in the medium or may be uniformly dispersed, but when the medium is unevenly distributed, inoculation of the medium (inoculation of bacteria) is performed. It is preferable that the surface to be inoculated and the region in the vicinity thereof are unevenly distributed.
＜＜セルロース分解菌用培地の製造方法＞＞
前記培地は、ＣＮＦと、前記他の成分と、を配合することで製造でき、例えば、公知の培地にＣＮＦを添加することでも製造できる。
ＣＮＦは、例えば、取り出し若しくは精製によって、純品となっている状態で配合又は添加してもよいし、ＣＮＦの製造時に、ＣＮＦ以外の成分との混合物の状態となっているものを、そのまま配合又は添加してもよい。ＣＮＦとＣＮＦ以外の成分との前記混合物としては、例えば、ＣＮＦ前駆体に対して解繊処理を行って得られたＣＮＦ分散液（解繊ＣＮＦの分散液）等が挙げられる。
<< Manufacturing method for culture medium for cellulose-degrading bacteria >>
The medium can be produced by blending CNF and the other components, and can be produced, for example, by adding CNF to a known medium.
The CNF may be blended or added in a pure product state by, for example, removal or purification, or a mixture of components other than CNF may be blended as it is at the time of manufacturing the CNF. Alternatively, it may be added. Examples of the mixture of CNF and components other than CNF include a CNF dispersion obtained by subjecting a CNF precursor to a defibration treatment (dispersion of defibrated CNF).
＜＜セルロース分解菌の生育方法＞＞
前記培地は、セルロース分解菌の生育（培養、栽培）に使用できる。
前記培地を用いたセルロース分解菌の生育は、前記培地を用いる点以外は、公知の方法と同じ方法で行うことができる。すなわち、前記培地の使用方法は、公知の培地の使用方法と同じであってもよい。
<< Growth method of cellulose-degrading bacteria >>
The medium can be used for the growth (culture, cultivation) of cellulose-degrading bacteria.
The growth of the cellulose-degrading bacterium using the medium can be carried out by the same method as a known method except that the medium is used. That is, the method of using the medium may be the same as the method of using a known medium.
例えば、前記培地の使用時には、滅菌後の前記培地に、必要に応じて前培養を行ったセルロース分解菌を接種し、この接種後のセルロース分解菌を前記培地中又は前記培地上で生育させればよい。 For example, when the medium is used, the sterilized medium is inoculated with pre-cultured cellulose-degrading bacteria as necessary, and the post-inoculation cellulose-degrading bacteria can be grown in or on the medium. Just do it.
前記培地が液状である場合には、セルロース分解菌の生育時には、前記培地を静置してもよいし、振とう（例えば、振とう培養）してもよい。
前記培地が固形状である場合には、セルロース分解菌の生育時には、前記培地を静置しておけばよい。
When the medium is liquid, the medium may be allowed to stand or shake (for example, shake culture) when the cellulose-degrading bacterium grows.
When the medium is in a solid state, the medium may be left to stand when the cellulose-degrading bacteria grow.
セルロース分解菌の生育時の温度は、セルロース分解菌の種類に応じて適宜選択すればよく、特に限定されない。
通常、セルロース分解菌の生育時の温度は、１８～６０℃であることが好ましく、２０～４５℃であることがより好ましい。
The temperature at which the cellulose-degrading bacteria grow may be appropriately selected according to the type of the cellulose-degrading bacteria, and is not particularly limited.
Usually, the temperature at the time of growth of the cellulose-degrading bacterium is preferably 18 to 60 ° C, more preferably 20 to 45 ° C.
セルロース分解菌の生育時間は、セルロース分解菌の種類や、上述の温度等に応じて適宜選択すればよく、特に限定されない。
通常、セルロース分解菌の生育時間は、１２時間以上であることが好ましく、１日以上であることがより好ましい。また、セルロース分解菌の生育時間は、例えば、１０日以下とすることができるが、上限値はこれに限定されない。
The growth time of the cellulose-degrading bacterium may be appropriately selected according to the type of the cellulose-degrading bacterium, the above-mentioned temperature, and the like, and is not particularly limited.
Usually, the growth time of the cellulose-degrading bacterium is preferably 12 hours or more, and more preferably 1 day or more. The growth time of the cellulolytic bacteria can be, for example, 10 days or less, but the upper limit is not limited to this.
以下、具体的実施例により、本発明についてより詳細に説明する。ただし、本発明は、以下に示す実施例に、何ら限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to specific examples. However, the present invention is not limited to the examples shown below.
［実施例１］
＜セルロース分解菌用培地の製造＞
トリプチックソイブロス（Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ）に蒸留水を加え、濃度を通常の１／１０としたものを基礎培地として用いた。このように、希釈したトリプチックソイブロスを用いた理由は、栄養源の含有量を少なくして、セルロース分解菌の培養時における、セルロースの影響を判り易くするためである。
前記基礎培地を１２１℃で１５分加熱処理（オートクレーブ）し、この加熱処理後の基礎培地に、機械解繊ＣＮＦの水分散液を添加した。このときの水分散液の添加量は、最終的に得られたセルロース分解菌用培地の機械解繊ＣＮＦの含有量が１質量％となるように調節した。また、機械解繊ＣＮＦの水分散液としては、スギノマシン社製「ＷＭａ－１００２」を用いた。
以上により、機械解繊ＣＮＦの含有量が１質量％である、液状のセルロース分解菌用培地を得た。
[Example 1]
<Manufacturing of medium for cellulose-degrading bacteria>
Distilled water was added to Triptic Soy Broth, and the concentration was reduced to 1/10 of the usual concentration, which was used as the basal medium. The reason for using the diluted tryptic soy broth as described above is to reduce the content of the nutrient source and make it easier to understand the influence of cellulose during the culture of the cellulose-degrading bacterium.
The basal medium was heat-treated (autoclaved) at 121 ° C. for 15 minutes, and an aqueous dispersion of mechanical defibration CNF was added to the basal medium after the heat treatment. The amount of the aqueous dispersion added at this time was adjusted so that the content of the mechanically defibrated CNF in the finally obtained medium for cellulose-degrading bacteria was 1% by mass. Further, as the aqueous dispersion of the mechanical defibration CNF, "WMa-1002" manufactured by Sugino Machine Limited was used.
From the above, a liquid medium for cellulolytic bacteria having a content of mechanical defibration CNF of 1% by mass was obtained.
＜セルロース分解菌の培養＞
（試験菌液の作製）
細菌として、バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．） ＮＢＲＣ１０１２２２株を用い、この細菌をトリプチックソイ寒天培地（Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ａｇｅｒ）で前培養した。
次いで、この前培養後の細菌を生理食塩水に加え、この生理食塩水中の胞子数が１．０×１０６個／ｍＬである懸濁液を作製して、試験菌液（１）とした。
<Culturing of cellulose-degrading bacteria>
(Preparation of test bacterial solution)
As a bacterium, Bacillus sp. NBRC101222 strain was used, and this bacterium was precultured on a Triptic Soy Age medium.
Next, the bacteria after the pre-culture were added to a physiological saline solution to prepare a suspension having a spore count of 1.0 × 10 6 cells / mL in the physiological saline solution, which was used as the test bacterial solution (1). ..
（セルロース分解菌の培養）
上記で得られたセルロース分解菌用培地に、試験菌液（１）を接種し、３５℃で２４時間振とう培養した。このときの試験菌液（１）の接種量は、セルロース分解菌用培地１００ｍＬあたり０．１ｍＬとした。
(Culture of cellulose-degrading bacteria)
The culture medium for cellulose-degrading bacteria obtained above was inoculated with the test bacterial solution (1) and cultured at 35 ° C. with shaking for 24 hours. The inoculation amount of the test bacterial solution (1) at this time was 0.1 mL per 100 mL of the culture medium for cellulose-degrading bacteria.
＜生菌数の測定（評価）＞
培養終了後、セルロース分解菌用培地中の前記細菌の生菌数を測定した。より具体的には、培養終了後のセルロース分解菌用培地を、滅菌済み生理食塩水で希釈し、この希釈液をトリプチックソイ寒天培地で、３５℃で４８時間培養した。そして、この培養後に発育した集落の数を測定して、この測定値を前記生菌数とした。
<Measurement (evaluation) of viable cell count>
After the culture was completed, the viable cell count of the bacteria in the culture medium for cellulose-degrading bacteria was measured. More specifically, the medium for cellulose-degrading bacteria after the completion of the culture was diluted with sterilized physiological saline, and the diluted solution was cultured on a triptic soy agar medium at 35 ° C. for 48 hours. Then, the number of colonies that grew after this culture was measured, and this measured value was used as the viable cell count.
ここまでの、細菌の培養と、生菌数の測定と、を３回行い、３つの測定値の平均値を生菌数として採用した。結果を表１に示す。 The culturing of the bacteria and the measurement of the viable cell count up to this point were performed three times, and the average value of the three measured values was adopted as the viable cell count. The results are shown in Table 1.
＜セルロース分解菌用培地の製造、セルロース分解菌の培養、生菌数の測定＞
［実施例２］
上述の機械解繊ＣＮＦの水分散液に代えて、ＴＥＭＰＯ酸化ＣＮＦの水分散液を用いた点以外は、実施例１の場合と同じ方法で、ＴＥＭＰＯ酸化ＣＮＦの含有量が１質量％である、液状のセルロース分解菌用培地を製造し、細菌を培養して、細菌の生菌数を測定した。ＴＥＭＰＯ酸化ＣＮＦの水分散液としては、第一工業製薬社製「レオクリスタ」を用いた。結果を表１に示す。
<Manufacturing of culture medium for cellulose-degrading bacteria, culture of cellulose-degrading bacteria, measurement of viable cell count>
[Example 2]
The content of TEMPO-oxidized CNF is 1% by mass in the same manner as in Example 1 except that the aqueous dispersion of TEMPO-oxidized CNF is used instead of the above-mentioned aqueous dispersion of mechanically defibrated CNF. , A liquid medium for cellulose-degrading bacteria was prepared, bacteria were cultured, and the viable cell count of the bacteria was measured. As the aqueous dispersion of TEMPO oxide CNF, "Leocrysta" manufactured by Dai-ichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd. was used. The results are shown in Table 1.
［比較例１］
上述の機械解繊ＣＮＦの水分散液に代えて、ＣＮＦに該当しないセルロース（非ＣＮＦセルロース）（和光純薬工業社製「セルロース」）を用いた点以外は、実施例１の場合と同じ方法で、非ＣＮＦセルロースの含有量が１質量％である、比較用の液状のセルロース分解菌用培地を製造し、細菌を培養して、細菌の生菌数を測定した。結果を表１に示す。
[Comparative Example 1]
The same method as in Example 1 except that cellulose (non-CNF cellulose) (“cellulose” manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) that does not correspond to CNF was used instead of the above-mentioned aqueous dispersion of mechanical defibration CNF. Then, a liquid medium for cellulolytic bacteria for comparison, in which the content of non-CNF cellulose was 1% by mass, was prepared, bacteria were cultured, and the viable cell count of the bacteria was measured. The results are shown in Table 1.
［実施例３］
＜セルロース分解菌用培地の製造＞
ポテトデキストロース寒天培地（Ｐｏｔｅｔｏ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ Ａｇｅｒ）に蒸留水を加え、濃度を通常の１／１０としたものに、さらに寒天を添加したものを基礎培地として用いた。このときの寒天の添加量は、培地中の寒天の合計濃度が１．５質量％となるように調節した。なお、上記のように、希釈したポテトデキストロース寒天培地を用いた理由は、栄養源の含有量を少なくして、セルロース分解菌の培養時における、セルロースの影響を判り易くするためである。
前記基礎培地を１２１℃で１５分加熱処理（オートクレーブ）し、この加熱処理後の基礎培地に、機械解繊ＣＮＦの水分散液を添加した。このときの水分散液の添加量は、最終的に得られたセルロース分解菌用培地の機械解繊ＣＮＦの含有量が１質量％となるように調節した。また、機械解繊ＣＮＦの水分散液としては、実施例１で用いたものと同じものを用いた。
以上により、機械解繊ＣＮＦの含有量が１質量％である、固形状のセルロース分解菌用培地を得た。
[Example 3]
<Manufacturing of medium for cellulose-degrading bacteria>
Distilled water was added to a potato glucose agar medium (Poteto Glucose Age) to make the concentration 1/10 of the usual concentration, and a medium to which agar was further added was used as a basal medium. The amount of agar added at this time was adjusted so that the total concentration of agar in the medium was 1.5% by mass. As described above, the reason for using the diluted potato dextrose agar medium is to reduce the content of the nutrient source so that the influence of cellulose on the culture of the cellulose-degrading bacterium can be easily understood.
The basal medium was heat-treated (autoclaved) at 121 ° C. for 15 minutes, and an aqueous dispersion of mechanical defibration CNF was added to the basal medium after the heat treatment. The amount of the aqueous dispersion added at this time was adjusted so that the content of the mechanically defibrated CNF in the finally obtained medium for cellulose-degrading bacteria was 1% by mass. Further, as the aqueous dispersion of the mechanical defibration CNF, the same one used in Example 1 was used.
From the above, a solid medium for cellulolytic bacteria having a content of mechanically defibrated CNF of 1% by mass was obtained.
＜セルロース分解菌の培養＞
（試験菌液の作製）
真菌として、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ） ＮＢＲＣ３１３２６株を用い、この真菌をポテトデキストロース寒天培地（Ｐｏｔｅｔｏ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ Ａｇｅｒ）で前培養した。
次いで、この前培養後の真菌を生理食塩水に加え、この生理食塩水中の真菌数が２．０×１０４ｃｆｕ／ｍＬである懸濁液を作製して、試験菌液（２）とした。
<Culturing of cellulose-degrading bacteria>
(Preparation of test bacterial solution)
As a fungus, Trichoderma reesei strain NBRC31326 was used, and the fungus was precultured on Poteto Dextrose Agar.
Next, the fungus after this pre-culture was added to a physiological saline solution to prepare a suspension having a fungal count of 2.0 × 10 4 cfu / mL in the physiological saline solution, which was used as the test bacterial solution (2). ..
得られた試験菌液（２）を、直径１０ｍｍのペーパーディスクに浸み込ませた。次いで、このペーパーディスクを、上記で得られたセルロース分解菌用培地の表面のうち、中央の領域に載置することで、試験菌液（２）を接種した。次いで、２５℃で７日間静置培養した。 The obtained test bacterial solution (2) was impregnated into a paper disc having a diameter of 10 mm. Next, the paper disc was placed in the central region of the surface of the culture medium for cellulose-degrading bacteria obtained above to inoculate the test bacterial solution (2). Then, the cells were statically cultured at 25 ° C. for 7 days.
＜セルロース分解菌の増殖度合いの評価＞
培養終了後、セルロース分解菌用培地上における、真菌の発育集落の大きさと、菌糸又は胞子の増殖度合いと、を確認し、真菌の増殖度合いを評価した。この真菌の増殖度合いは、後述する比較例２での真菌の増殖度合いを基準として、下記基準に従って評価した。（評価基準）
Ａ：真菌の増殖度合いが比較例２よりも顕著に高い。
Ｂ：真菌の増殖度合いが、Ａよりも劣るが、比較例２よりも高い。
Ｃ：真菌の増殖度合いが比較例２と同等以下である。
<Evaluation of the degree of growth of cellulose-degrading bacteria>
After completion of the culture, the size of the growth colony of the fungus and the growth degree of hyphae or spores on the culture medium for degrading fungi were confirmed, and the growth degree of the fungus was evaluated. The degree of growth of this fungus was evaluated according to the following criteria based on the degree of growth of the fungus in Comparative Example 2 described later. (Evaluation criteria)
A: The degree of fungal growth is significantly higher than that of Comparative Example 2.
B: The degree of fungal growth is inferior to that of A, but higher than that of Comparative Example 2.
C: The degree of fungal growth is equal to or less than that of Comparative Example 2.
ここまでの、真菌の培養と、真菌の増殖度合いの評価と、を３回行い、３つの評価結果を平均化して、その平均化した結果を最終的な評価結果として採用した。結果を表１に示す。 The fungal culture and the evaluation of the degree of fungal growth up to this point were performed three times, the three evaluation results were averaged, and the averaged result was adopted as the final evaluation result. The results are shown in Table 1.
［実施例４］
＜セルロース分解菌用培地の製造、セルロース分解菌の培養、セルロース分解菌の増殖度合いの評価＞
上述の機械解繊ＣＮＦの水分散液に代えて、ＴＥＭＰＯ酸化ＣＮＦの水分散液を用いた点以外は、実施例３の場合と同じ方法で、ＴＥＭＰＯ酸化ＣＮＦの含有量が１質量％である、固形状のセルロース分解菌用培地を製造し、真菌を培養して、真菌の増殖度合いを評価した。ＴＥＭＰＯ酸化ＣＮＦの水分散液としては、実施例２で用いたものと同じものを用いた。結果を表１に示す。
[Example 4]
<Manufacturing of culture medium for cellulose-degrading bacteria, culture of cellulose-degrading bacteria, evaluation of growth degree of cellulose-degrading bacteria>
The content of TEMPO-oxidized CNF is 1% by mass in the same manner as in Example 3 except that the aqueous dispersion of TEMPO-oxidized CNF is used instead of the above-mentioned aqueous dispersion of mechanically defibrated CNF. , A solid medium for cellulose-degrading bacteria was prepared, and the fungus was cultured to evaluate the degree of growth of the fungus. As the aqueous dispersion of TEMPO oxide CNF, the same one used in Example 2 was used. The results are shown in Table 1.
［比較例２］
上述の機械解繊ＣＮＦの水分散液に代えて、ＣＮＦに該当しないセルロース（非ＣＮＦセルロース）を用いた点以外は、実施例３の場合と同じ方法で、非ＣＮＦセルロースの含有量が１質量％である、比較用の固形状のセルロース分解菌用培地を製造し、真菌を培養して、真菌の増殖度合いを評価した。非ＣＮＦセルロースとしては、比較例１で用いたものと同じものを用いた。結果を表１に示す。
[Comparative Example 2]
The content of non-CNF cellulose is 1 mass by the same method as in Example 3 except that cellulose (non-CNF cellulose) that does not correspond to CNF is used instead of the above-mentioned aqueous dispersion of mechanically defibrated CNF. %, A solid medium for cellulolytic bacteria for comparison was prepared, and the fungi were cultured to evaluate the degree of growth of the fungi. As the non-CNF cellulose, the same one used in Comparative Example 1 was used. The results are shown in Table 1.
上記結果から明らかなように、実施例１～２及び比較例１において、互いに異なるのは、セルロース分解菌用培地の製造に用いた上述の添加材料のみであるが、実施例１～２は、比較例１よりも生菌数が顕著に多かった。より具体的には、実施例１での生菌数は比較例１での生菌数の約２８６倍であり、実施例２での生菌数は比較例１での生菌数の約２２９倍であった。すなわち、実施例１～２では、比較例１よりも細菌の培養速度が顕著に速くなっていた。これは、セルロース分解菌用培地の含有成分として、ＣＮＦを用いることによって、非ＣＮＦセルロースを用いた場合よりも、細菌におけるセルロースの分解速度が顕著に向上したことを示していた。 As is clear from the above results, in Examples 1 and 2 and Comparative Example 1, only the above-mentioned additive materials used for producing the culture medium for cellulose-degrading bacteria are different from each other, but Examples 1 and 2 are different from each other. The viable cell count was significantly higher than that of Comparative Example 1. More specifically, the viable cell count in Example 1 is about 286 times the viable cell count in Comparative Example 1, and the viable cell count in Example 2 is about 229 of the viable cell count in Comparative Example 1. It was double. That is, in Examples 1 and 2, the bacterial culture rate was significantly faster than that in Comparative Example 1. This showed that the use of CNF as a component of the culture medium for cellulose-degrading bacteria markedly improved the decomposition rate of cellulose in bacteria as compared with the case of using non-CNF cellulose.
また、実施例３～４及び比較例２においても、互いに異なるのは、セルロース分解菌用培地の製造に用いた上述の添加材料のみであるが、実施例３～４は、比較例２よりも真菌の増殖度合いが明らかに高かった。特に実施例４は、真菌の増殖度合いが際立って高かった。これは、セルロース分解菌用培地の含有成分として、ＣＮＦを用いることによって、非ＣＮＦセルロースを用いた場合よりも、真菌におけるセルロースの分解速度が向上したことを示していた。 Further, also in Examples 3 to 4 and Comparative Example 2, only the above-mentioned additive materials used for producing the culture medium for cellulose-degrading fungi are different from each other, but Examples 3 to 4 are more different than Comparative Example 2. The growth rate of the fungus was clearly high. In particular, in Example 4, the degree of fungal growth was remarkably high. This showed that the use of CNF as a component of the culture medium for cellulose-degrading bacteria improved the decomposition rate of cellulose in fungi as compared with the case of using non-CNF cellulose.
このように、セルロース分解菌用培地の種類と、セルロース分解菌の種類と、が異なっても、培地の含有成分としてＣＮＦを用いることによって、セルロース分解菌におけるセルロースの分解速度の向上が可能であることを確認できた。しかも、この場合には、セルロースの分解速度の向上を実現するために、前記セルロース分解菌用培地を用いてセルロース分解菌を培養するだけでよく、特殊な操作が不要であって、汎用性が高いという利点を有している。 As described above, even if the type of the culture medium for cellulose-degrading bacteria and the type of cellulose-degrading bacteria are different, it is possible to improve the decomposition rate of cellulose in the cellulose-degrading bacteria by using CNF as a component contained in the medium. I was able to confirm that. Moreover, in this case, in order to improve the decomposition rate of cellulose, it is only necessary to culture the cellulose-degrading bacteria using the culture medium for cellulose-degrading bacteria, and no special operation is required, which makes it versatile. It has the advantage of being expensive.
本発明は、セルロース分解菌の生育に利用可能である。 The present invention can be used for the growth of cellulose-degrading bacteria.
Claims (1)
前記セルロース分解菌用培地が、固形状であり、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属に属する微生物の培養用である、セルロース分解菌用培地。 A medium for cellulose-degrading bacteria containing TEMPO-oxidized cellulose nanofibers.
The culture medium for cellulose-degrading bacteria is a solid medium for culturing microorganisms belonging to the genus Trichoderma .
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| WO2005083056A1 (en) | 2004-03-02 | 2005-09-09 | Independent Administrative Institution, Japan Agency For Marine-Earth Science And Technology | Solid cellulosic culture medium and process for producing the same |
| JP2015500658A (en) | 2011-12-22 | 2015-01-08 | ユー ピー エム キュンメネ コーポレーション | Matrix and composition for microbial culture of Gram positive bacteria |
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| Title |
|---|
| Water Research，2016年，93，p. 230－241 |
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