JP7007914B2 - 腫瘍に対して直接阻害作用を有するインターフェロンの同定方法、及びその使用 - Google Patents
腫瘍に対して直接阻害作用を有するインターフェロンの同定方法、及びその使用 Download PDFInfo
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Description
定義
特に断りのない限り、本文に用いられる科学・技術用語は、当業者がそれらに与える意味又は当業者が通常に理解する意味を有する。
g)及び(k);(d)、(g)、(h)及び(i);(d)、(g)、(h)及び(j);(d)、(g)、(h)及び(k);(d)、(h)、(i)及び(j);(d)、(h)、(i)及び(k);(d)、(i)、(j)及び(k);(e)、(f)、(g)及び(h);(e)、(f)、(g)及び(i);(e)、(f)、(g)及び(j);(e)、(f)、(g)及び(k);(e)、(g)、(h)及び(i);(e)、(g)、(h)及び(j);(e)、(g)、(h)及び(k);(e)、(h)、(i)及び(j);(e)、(h)、(i)及び(k);(e)、(i)、(j)及び(k);(f)、(g)、(h)及び(i);(f)、(g)、(h)及び(j);(f)、(g)、(h)及び(k);(f)、(h)、(i)及び(j);(f)、(h)、(i)及び(k);(f)、(i)、(j)及び(k);(g)、(h)、(i)及び(j);(g)、(h)、(i)及び(k);(g)、(i)、(j)及び(k);(h)、(i)、(j)及び(k)、において実質的同等性を構築することを提供し、さらに好ましくは、本発明は、少なくとも5種の上記の活性、例えば、(a)、(b)、(c)、(d)及び(e);(a)、(b)、(c)、(d)及び(f);(a)、(b)、(c)、(d)及び(g);(a)、(b)、(c)、(d)及び(h);(a)、(b)、(c)、(d)及び(i);(a)、(b)、(c)、(d)及び(j);(a)、(b)、(c)、(d)及び(k);(a)、(c)、(d)、(e)及び(f);(a)、(c)、(d)、(e)及び(g);(a)、(c)、(d)、(e)及び(h);(a)、(c)、(d)、(e)及び(i);(a)、(c)、(d)、(e)及び(j);(a)、(c)、(d)、(e)及び(k);(a)、(d)、(e)、(f)及び(g);(a)、(d)、(e)、(f)及び(h);(a)、(d)、(e)、(f)及び(i);(a)、(d)、(e)、(f)及び(j);(a)、(d)、(e)、(f)及び(k);(a)、(e)、(f)、(g)及び(h);(a)、(e)、(f)、(g)及び(i);(a)、(e)、(f)、(g)及び(j);(a)、(e)、(f)、(g)及び(k);(a)、(f)、(g)、(h)及び(i);(a)、(f)、(g)、(h)及び(j);(a)、(f)、(g)、(h)及び(k);(b)、(c)、(d)、(e)及び(f);(b)、(c)、(d)、(e)及び(g);(b)、(c)、(d)、(e)及び(h);(b)、(c)、(d)、(e)及び(i);(b)、(c)、(d)、(e)及び(j);(b)、(c)、(d)、(e)及び(k);(b)、(d)、(e)、(f)及び(g);(b)、(d)、(e)、(f)及び(h);(b)、(d)、(e)、(f)及び(i);(b)、(d)、(e)、(f)及び(j);(b)、(d)、(e)、(f)及び(k);(b)、(e)、(f)、(g)及び(h);(b)、(e)、(f)、(g)及び(i);(b)、(e)、(f)、(g)及び(j);(b)、(e)、(f)、(g)及び(k);(b)、(f)、(g)、(h)及び(i);(b)、(f)、(g)、(h)及び(j);(b)、(f)、(g)、(h)及び(k);(c)、(d)、(e)、(f)及び(g);(c)、(d)、(e)、(f)及び(h);(c)、(d)、(e)、(f)及び(i);(c)、(d)、(e)、(f)及び(j);(c)、(d)、(e)、(f)及び(k);(c)、(e)、(f)、(g)及び(h);(c)、(e)、(f)、(g)及び(i);(c)、(e)、(f)、(g)及び(j);(c)、(e)、(f)、(g)及び(k);(c)、(f)、(g)、(h)及び(i);(c)、(f)、(g)、(h)及び(j);(c)、(f)、(g)、(h)及び(k);(d)、(e)、(f)、(g)及び(h);(d)、(e)、(f)、(g)及び(i);(d)、(e)、(f)、(g)及び(j);(d)、(e)、(f)、(g)及び(k);(d)、(f)、(g)、(h)及び(i);(d)、(f)、(g)、(h)及び(j);(d)、(f)、(g)、(h)及び(k);(f)、(g)、(h)、(i)及び(j);(f)、(g)、(h)、(i)及び(k);(g)、(h)、(i)、(j)及び(k)、において実質的同等性を構築することを提供し、さらに好ましくは、本発明は、少なくとも6種の上記の活性、例えば、(a)、(b)、(c)、(d)、(e)及び(f);(a)、(b)、(c)、(d)、(e)及び(g);(a)、(b)、(c)、(d)、(e)及び(h);(a)、(b)、(c)、(d)、(e)及び(i);(a)、(b)、(c)、(d)、(e)及び(j);(a)、(b)、(c)、(d)、(e)及び(k);(a)、(c)、(d)、(e)、(f)及び(g);(a)、(c)、(d)、(e)、(f)及び(h);(a)、(c)、(d)、(e)、(f)及び(i);(a)、(c)、(d)、(e)、(f)及び(j);(a)、(c)、(d)、(e)、(f)及び(k);(a)、(d)、(e)、(f)、(g)及び(h);(a)、(d)、(e)、(f)、(g)及び(i);(a)、(d)、(e)、(f)、(g)及び(j);(a)、(d)、(e)、(f)、(g)及び(k);(a)、(e)、(f)、(g)、(h)及び(i);(a)、(e)、(f)、(g)、(h)及び(j);(a)、(e)、(f)、(g)、(h)及び(k);(b)、(c)、(d)、(e)、(f)及び(g);(b)、(c)、(d)、(e)、(f)及び(h);(b)、(c)、(d)、(e)、(f)及び(i);(b)、(c)、(d)、(e)、(f)及び(j);(b)、(c)、(d)、(e)、(f)及び(k);(b)、(d)、(e)、(f)、(g)及び(h);(b)、(d)、(e)、(f)、(g)及び(i);(b)、(d)、(e)、(f)、(g)及び(j);(b)、(d)、(e)、(f)、(g)及び(k);(b)、(e)、(f)、(g)、(h)及び(i);(b)、(e)、(f)、(g)、(h)及び(j);(b)、(e)、(f)、(g)、(h)及び(k);(c)、(d)、(e)、(f)、(g)及び(h);(c)、(d)、(e)、(f)、(g)及び(j);(c)、(d)、(e)、(f)、(g)及び(k);(c)、(d)、(e)、(f)、(g)及び(i);(c)、(d)、(e)、(f)、(g)及び(j);(c)、(d)、(e)、(f)、(g)及び(k);(c)、(e)、(f)、(g)、(h)及び(i);(c)、(e)、(f)、(g)、(h)及び(j);(c)、(e)、(f)、(g)、(h)及び(k);(d)、(e)、(f)、(g)、(h)及び(i);(d)、(e)、(f)、(g)、(h)及び(j);(d)、(e)、(f)、(g)、(h)及び(k)、において実質的同等性を構築することを提供し、さらに好ましくは、本発明は、少なくとも7種の上記の活性、例えば(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)及び(g);(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)及び(h);(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)及び(i);(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)及び(j);(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)及び(k);(a)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)及び(h);(a)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)及び(i);(a)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)及び(j);(a)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)及び(k);(a)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)及び(i);(a)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)及び(j);(a)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)及び(k);(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)及び(h);(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)及び(i);(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)及び(j);(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)及び(k);(b)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)及び(i);(b)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)及び(j);(b)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)及び(k);(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)及び(i);(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)及び(j);(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)及び(k)、において実質的同等性を構築することを提供し、さらに好ましくは、本発明は、少なくとも8種の上記の活性、例えば(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)及び(h);(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)及び(i);(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)及び(j);(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)及び(k);(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)及び(i);(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)及び(j);(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)及び(k);(a)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)及び(i);(a)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)及び(j);(a)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)及び(k);(a)、(b)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)及び(i);(a)、(b)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)及び(j);(a)、(b)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)及び(k);(a)、(b)、(c)、(e)、(f)、(g)、(h)及び(i);(a)、(b)、(c)、(e)、(f)、(g)、(h)及び(j);(a)、(b)、(c)、(e)、(f)、(g)、(h)及び(k);(a)、(b)、(c)、(d)、(f)、(g)、(h)及び(i);(a)、(b)、(c)、(d)、(f)、(g)、(h)及び(j);(a)、(b)、(c)、(d)、(f)、(g)、(h)及び(k);(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(g)、(h)及び(i);(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(g)、(h)及び(j);(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(g)、(h)及び(k);(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(h)及び(i);(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(h)及び(j);(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(h)及び(k);(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)及び(i);(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)及び(j);(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)及び(k)、において実質的同等性を構築することを提供し、さらに好ましくは、本発明は、少なくとも9種、10種、又はあらゆる11種の上記の活性、例えば(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)及び(k)、において実質的同等性を構築することを提供する。
ヒト肝臓癌SMMC-7721をモデルとして本研究を行い、インビボシステムでヒト肝臓癌に対するrSIFN-coの活性と効力を実証した。テスト物であるrSIFN-coの活性を、マイトマイシンC(「MMC」)の活性と比較した。rSIFN-coは無色の液体であり、濃度が1mg/mlであり、四川輝陽生命工程股分有限公司(中国成都)より提供された。テスト物を希釈せずに用いた。解凍して注射に用いるまで4℃で貯蔵した。マイトマイシンC(「MMC」)、ロット505 AGB、濃度2mg/バイアルはKyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd.(日本)より提供された。MMCを注射時に生理食塩水で希釈した。
Hela細胞をモデルとして本研究を行い、rSIFN-coのヒト子宮頚腫瘍治療に対する活性と効力を実証した。結果より、rSIFN-coが活性を有し、ヒト子宮頚癌細胞の生長を効果的に阻害したことを示す。特に説明したこと以外、実施例1のように該研究を行った。まず、実施例1と類似する方法で、ヌードマウスに5×106個のHela細胞を皮膚下接種して、生長良好な異種移植物をヌードマウス中で2回継代し、ヒト子宮頚癌異種移植物を構築して調製した。その後、1.5mm3の断片を作って、s.c.方式でテスト動物に移植した。動物の体重は投与初期の時、平均が19±2gであった。実施例1に比べて、用いられる動物がいずれも雌性であった。各処理群の投与量や投与方案は実施例1と類似し、相違点は0日目で処理を開始してからの1と13日目にMMCを注射し、且つ研究を処理開始後に28日間続けた。
HT-29をモデルとして本研究を行い、rSIFN-coのヒト結腸癌治療に対する活性と効力を実証した。結果より、rSIFN-coが活性を有し、ヒト結腸癌細胞の生長を効果的に阻害したことを示す。特に説明したこと以外、実施例1のように該研究を行った。まず、実施例1と類似する方法で、ヌードマウスに5×106個のHT-29細胞を皮膚下接種して、生長良好な異種移植物をヌードマウス中で2回継代し、ヒト結腸癌異種移植物を構築して調製した。その後、1.5mm3の断片を作って、s.c.方式でテスト動物に移植した。動物の体重は投与初期の時、平均が20±2gであった。実施例1に比べて、この研究に用いられる動物がいずれも雌性であった。各処理群の投与量や投与方案は実施例1に記載した通りであり、相違点は1日目と10日目に群3に対してMMCを投与し、且つ別途に群7を増加したことにあり、群7において、各マウスを体積が0.15mlで投与量が0.15mg/マウスのIFNα-2bで処理し、rSIFN-co処理群と同様に1日おきに行い、処理を計4週間実施した。濃度が1.41mg/mlのIFNα-2bは輝陽生命工程股分有限公司により提供された。結果を表4と図3中に示す。
SPC-A4をモデルとして本研究を行い、rSIFN-coのヒト肺癌治療に対する活性と効力を実証した。結果より、rSIFN-coがヒト肺腫瘍生長に対して顕著な阻害を示し、且つrSIFN-coがIFNα-2bよりも遥かに効果的であった。特に説明したこと以外、実施例3のように該研究を行った。まず、実施例1と類似する方法で、テスト動物に注射するヒト異種移植物を構築して調製し、相違点はヌードマウスに2.5×106個のSPC-A4細胞を皮膚下(s.c.)接種して、生長良好な腫瘍をヌードマウス中で2回継代することであった。その後、1.5mm3の断片を作って、s.c.方式でテスト動物に移植した。動物の体重は投与初期の時、平均が22±2gであった。実施例3に比べて、該研究に用いられる動物がいずれも雌性であり、且つ該研究は21日間の処理を行った。各処理群の投与量や投与方案は実施例3に記載した通りであり、相違点は1と6日目に群3に対してMMCを投与することにある。結果を表5と図4に示す。
細胞培養と試薬。ヒト肺癌細胞系(A549、H1299、H460、Calu-1)、ヒト肝臓癌細胞系(SMMC-7721、Huh-7、CL-1)、ヒト子宮頚癌細胞系(Hela)、ヒト乳癌細胞系(MDA-MB-231)、ヒト前立腺癌細胞系(PANC-1)及びヒト結腸癌細胞系(SW620、HT29、SW480)はShanghai Cell Collection(中国上海)から購入された。以上の細胞系はいずれもShanghai Cell Collectionによる対応する完全生長培地で5%CO2と37℃において培養され、該完全生長培地は10%熱失活胎児牛血清(Biochrom,Germany)を含有し、4mMグルタミン、50U/mlペニシリン及び50mg/mlストレプトマイシンが補充された。完全生長培地は、A549に対してF-12K(ロットGNM21127;杭州吉諾生物医薬技術有限公司)、SW620とMDA-MB-231に対してL-15(ロット41300-039,GIBCO)、SMMC-7721、Hela、Huh-7、CL-1及びPANC-1に対してDMEM(ロットC11995,GIBCO)、H460、H1299及びSW480に対してRMPI-1640(ロットC11875,GIBCO)、HT-29に対してMacro5a(ロットM4892,Sigma)、Calu-1に対してDMEM+10%FBSであった。
rSIFN-coが細胞生存率を減少させる能力を実証するために、A549とSW620腫瘍細胞(100μlの完全培地中の2×103個の細胞をウェル毎に入れる)を96ウェルプレートに入れ、それぞれ10μg/mlのrSIFN-co又はIFNα-2bで1~6日間処理した。標準MTT法(3-(4,5-ジメチル-2-チアゾリル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド検測,Sigma,St.Louis,MO)により、細胞生存率を評価した。該検測について、各ウェルに約20μlのMTT(4mg/ml)を加える。細胞を37℃で4時間インキュベートする。その後、丁寧に各ウェルの上澄み液を除去してから、各ウェルに同体積(150μl)のジメチルスルホキシド(DMSO)を加えてクレードル上で徹底的に15分間混合した。Thermo Scientificプレートリーダー(Thermo Fisher Scientific Inc.,Lowell,MA)を用いて595nmにおいて96ウェルプレートの吸光度を読み取る。相対細胞生存率は以下のように算出される:細胞生存率=(処理群(OD595)-空白(OD595))/(コントロール群(OD595)-空白(OD595))×100%。
NIH実験動物の管理と使用ガイドにより該実験を行った。4~5週齢の雌性BALB/cヌードマウスは上海実験動物センター(中国上海)より得られた。約5×106個のA549細胞を各マウスに皮膚下注射して異種移植腫瘍を移入した。動物をランダムに3群(各群8匹のマウス)に分け、PBS(1XPBS,pH7.2-7.4)、各マウス100μg/100μlのrSIFN-co又は各マウス100μg/100μlのIFNα-2bで一日おきに腫瘍内処理を計12回行った。3日間毎に一回腫瘍を測定し、腫瘍体積は以下のように算出される:腫瘍体積(mm3)=(長さ×幅2)/2。結果を図16に示す。データは平均値±SD(n=8)として表される。結果より、PBS処理群に比べて、rSIFN-coは移入した腫瘍の生長をほとんど完全に阻害できることを実証した(p<0.0001)。しかし、IFNα-2bは腫瘍生長に対する顕著な阻害を示さなかった。結果より、インビボで腫瘍生長を阻害する面では、rSIFN-coはIFNα-2bよりも有効であることを実証した。
Matrigel(BD Corporation,Cat#:356234)を4℃冷蔵庫で氷の上で徹夜解凍し、24ウェルプレートを-20℃で徹夜冷凍した。その後、150μlの1.0mg/mlのMatrigelで冷凍した24ウェルプレートの各ウェルを塗布した。その後、Matrigelが塗布された24ウェルプレートを37℃で20-30分間インキュベートした。肺癌細胞A549をトリプシン化してカウントする。Matrigelが塗布されたウェルに、2%Matrigel及び10mcg/mlのIFNα-2b又はrSIFN-coを含有する又はコントロールとしてのインターフェロンを含有しない馴化培地(Conditioned medium)における約5×103個の細胞を接種した。これら細胞を37℃で少なくとも約8日間インキュベートする。3日間毎に一回約200μlの上記の馴化培地を添加し、培地が乾かすのを防止する。4日目又は8日目に、写真を撮ってコロニーのサイズと偽足形成を観察した。実験は3群並行して行った。
β-カテニン/TCF転写レポーターシステムテスト。rSIFN-coのWnt/β-カテニンシグナル伝達に対するインビトロ作用を測定した。癌細胞を96ウェルプレートに入れ(ウェル毎に1×104個の細胞)、12時間インキュベートし、そして100ngTOPFlash(Millipore Corporation,Billerica,MA,USA)で瞬時トランスフェクションを行った。トランスフェクション効率を標準化するために、細胞を1ngのSV40プロモーターに駆動される内部コントロールレポーターウミシイタケルシフェラーゼpRL-SV40(Promega,Madison,WI,USA)でコトランスフェクションし、そして10mcg/mlインターフェロンrSIFN-co又はIFNα-2bで6時間処理する又はトランスフェクションした後に処理せずにコントロール(Mock)とする。インターフェロンで24時間処理した後、メーカーのマニュアル(Cat#:E1960,Promega)に従って、デュアルルシフェラーゼエッセイシステムキットでルシフェラーゼ検測を行った。相対ルシフェラーゼ活性はホタルルシフェラーゼ活性/ウミシイタケルシフェラーゼ活性の比率として表される。実験は3群並行して行った。
癌細胞A549とSw480を約85%の集密度まで培養して6ウェルプレートに入れた。細胞をそれぞれ10mcg/ml IFNα-2b又はrSIFN-coで24時間、48時間又は72時間処理し、又は処理せずにコントロール(Mock)とした。処理後、細胞を収集してウエスタンブロットし、その特異性抗体でβ-カテニンの蛋白レベルを検測し、GAPDHを内因性ローディングコントロールとする。実験は3群並行して繰り返した。
肺癌A549細胞を6ウェルプレートに接種し、それぞれ10μg/mlのIFNα-2b又はrSIFN-coで処理し、又は処理せずにコントロール(Mock)とした。24時間処理した後、TRIZOL試薬で細胞全mRNAを分離し、cDNAを合成し、4種のWntシグナル伝達下流遺伝子Axin2、CD24、サバイビン及びID2の特異性プライマーでさらにqPCRを行った。実験は3群並行して行い、Mock群で標準化した。
rSIFN-coのLRP6/FZD6に対する調節を研究した。実施例9に行われた通り、qPCRにより本実施例を実施した。癌細胞A549、H460、SW620及びHT-29を6ウェルプレートに接種し、10μg/mlのIFNα-2b又はrSIFN-coで処理する又は処理せずにコントロール(Mock)とした。24時間処理した後、TRIZOL試薬で細胞全mRNAを分離し、LRP6とFZD6の特異性プライマーを用いてcDNAに対してqPCRを行う。使用されるプライマーは、LRP6センスプライマー:5’-TGAAGAACCAGCACCACAGG-3’(配列番号4)とアンチセンスプライマー:5’-CATAACCAAGAGGCACAGAAGC-3’(配列番号5)、及びFZD6センスプライマー:5’-GCGGAGTGAAGGAAGGATTAGTC-3’(配列番号6)とアンチセンスプライマー:5’-TGAACAAGCAGAGATGTGGAACC-3’(配列番号7)である。実験は3群並行して行い、mockコントロール群で正規化した。結果は、LRP6又はFZD6のGAPDHに対する相対mRNAレベルとして記録された。
本研究ではrSIFN-coの腫瘍阻害遺伝子に対するアップレギュレーション作用を実証した。癌細胞A549、H460、SW620及びHT-29を6ウェルプレートに接種し、10mcg/mlのIFNα-2b又はrSIFN-coで処理する又は処理せずにMockコントロールとする。24時間処理した後、TRIZOL試薬で細胞全mRNAを分離し、cDNAを合成し、DKK3、KLF4とBATF2の特異性プライマーを用いてさらにqPCRを行った。BATF2に対して、センスプライマー5’-CAGAGCAGGGAGCACAAACC-3’(配列番号16)とアンチセンスプライマー5’-TGAGCAGAGGAGAGCAGAGG-3’(配列番号17)を使用し、DKK3に対して、センスプライマー5’-GGAGCCTGACTGAAGAGATGG-3’(配列番号18)とアンチセンスプライマー5’-ACGCCTAAAGCACACACCTG-3’(配列番号19)を使用し、KLF4に対して、センスプライマー5’-CCTTCAACCTGGCGGACATCAAC-3’(配列番号20)とアンチセンスプライマー5’-GGCTGCTGCGGCGGAATG-3’(配列番号21)を使用した。
IFNα-2b又はrSIFN-coで24時間処理(未処理のコントロール(Mock)に比べる)した後、肺癌A549細胞と結腸癌SW620細胞が微孔膜を通して転移する能力を確定することで、rSIFN-coの腫瘍細胞転移を阻害する能力を実証した。24ウェルプレートにおいて8μm細胞培養インサート式セル(Becton-Dickinson Biosciences,NJ,USA)で細胞転移テストを行う。FBSを含有しない温熱(37℃)炭酸水素塩類培地をインサート式セルの内部及びウェルの底部に加え、加湿された組織培養インキュベーターにおいて37℃、5% CO2雰囲気で約2時間復水した。復水した後、注意深く培地を除去した。その後、500μlのFBSを含有しない培地に混合懸濁する調製細胞(10μg/ml IFNα-2b又は10μg/ml rSIFN-coで処理した後、又は完全に処理していない)を0.5×104細胞/インサート式セルの密度でインサート式セルのフィルターの上部に接種した。24ウェルプレートの下室に500μlの10%FBS含有完全培地を入れた。通常な培養条件で37℃において24時間過ぎた後、室膜上部の非転移細胞を綿棒で除去した。培養セルの下部を4%パラホルムアルデヒドで固定して2%クリスタルバイオレットで染色する。3群の並行ウェルのそれぞれにおいて、細胞が入れている室膜の反対側における転移細胞数をカウントする。各実験を少なくとも2回繰り返し、毎回3群の並行ウェルを使用した。
本研究は、rSIFN-coは細胞アポトーシス経路以外の経路により腫瘍細胞生存率を減少させる作用を果たすことを示すために行われた。腫瘍細胞A549とSW620を6ウェルプレートに入れ、徹夜インキュベートしてから10mcg/mlのIFNα-2b又は10mcg/mlのrSIFN-co又は5FUで24時間又は48時間処理する、又は処理しない(Mockコントロールとする)。その後、ウエスタンブロットにより細胞アポトーシス関連の分子標記物をモニターする。使用される一次抗体は、マウスモノクローナルβ-チューブリン抗体(1:2000,Cat#:CW0098A)とマウスモノクローナルGAPDH抗体(1:2000,Cat#:CW0100A)(Kangwei Biotechnology,China);マウスモノクローナルPARP抗体(1:1000,Cat#:sc-2007,Santa Cruz Biotechnology,Inc.);ウサギモノクローナル-プロカスパーゼ-3抗体(1:1000,Cat#:9665)とウサギポリクローナル切断したカスパーゼ-3抗体(1:1000,Cat#:9661)(Cell Signaling Technology,USA);ヤギポリクローナルプロカスパーゼ-8抗体(1:1000,Cat#:sc-6136,Santa Cruz Biotechnology,Inc.);ウサギモノクローナル切断したカスパーゼ-8抗体(1:1000,Cat#:9496)(Cell Signaling Technology,USA)であった。
該実験は、rSIFN-coはIFNα-2bと同様にJAK/STATシグナル伝達経路を利用することを示すために行われた。本研究において、A549細胞とHela細胞とをそれぞれ3.3cmの皿に入れ、37℃で徹夜インキュベートし、そしてそれぞれ10μg/mlのIFNα-2b又はrSIFN-coで0、5、15、30、60、120及び240分間処理した。処理後、細胞を収集し、細胞蛋白を抽出してSDS-PAGEアガロースにロッドし、ウエスタンブロット分析を行うことにより、STAT1(Tyr701)、STAT2(Tyr690)及びSTAT3(Tyr705)のリン酸化を観察する。GAPDHをロッディングコントロールとした。
表面プラズモン共鳴技術に基づき、Biacore T100蛋白質相互作用アレイシステム(General Electric HealthCare Co.)を使用してIFNα-2bとrSIFN-coのIFNAR1-EC(Cata:13222-H08H, Sino Biological Inc)又はIFNAR2-EC(Cata: 10359-H08H, Sino Biological Inc) への結合親和性を測定した。受容体サブユニットを固定するために、20μg/mlのIFNAR1-ECサブユニット及び50μg/mlのIFNAR2-ECサブユニットをそれぞれCM5センサチップとともにインキュベートし、蛋白質中のアミノ基を介してチップのカルボキシル化デキストラン表面に結合させた。そして、2種のテストするインターフェロンを異なる濃度でリガンドに垂直注射し、IFNα-2b/IFNAR1結合は100~3,000nMの範囲にあり、rSIFN-co/IFNAR1結合は50~1,000nMの範囲にあり、IFNα-2b/IFNAR2結合及びrSIFN-co/IFNAR2結合は3.125~80nMという別の範囲にあり、IFNs/IFNAR2結合期間中、再生された2M NaCl緩衝液を加えて5秒間の再活性化手順を継続させた。メーカーのマニュアルに従ってデータを分析した。式KD=kd/ka (d:解離;a:結合)に基づいてレート定数から解離定数KDを確定した。
本研究では、A549とHela細胞を徹夜インキュベートした。培地において10倍連続希釈した(1、10及び100ng/ml,最終の測定濃度)B18R組換え蛋白(ワクシニアウイルスでコードされた中和I型インターフェロン受容体,I型インターフェロン阻害剤とも呼ばれる,Cat#:14-8185,eBioscience,Inc)を調製したとともに、室温で一定量(1ng/ml,最終の測定濃度)の各種IFN蛋白(IFNα-2bとrSIFN-co)を1時間混合した。B18R/IFN複合物で上記2種の細胞を処理して30分間インキュベートした。そして、細胞溶解物を集め、ウエスタンブロットによってSTAT1(Tyr701)、STAT2(Tyr690)及びSTAT3(Tyr705)のリン酸化を検出した。GAPDH及びアクチンをロッディングコントロールとした。
Claims (15)
- テストインターフェロンの組換え高効率複合インターフェロン(rSIFN-co)に対する相対効力を確定又は比較する、またはテストインターフェロンとrSIFN-coとの間の同等性を構築する方法において、
(1)前記テストインターフェロンとrSIFN-coを提供することと、及び
(2)同じ特定な条件で、インビトロで、前記テストインターフェロンとrSIFN-coにより、それぞれ以下の活性
(i)HT-29細胞におけるLRP6及びFZD6の発現に対するダウンレギュレーション;および
(ii)IFNα-2bよりも高いIFNAR1への結合親和性、及びIFNα-2bよりも低いIFNAR2への結合親和性;
を測定することとを含み、
統計学的に有意であるように(i)の所定の活性およびテストインターフェロンによる(ii)の所定の活性を有するのは、前記テストインターフェロンおよびrSIFN-coが同じ効力を有することか、又は前記テストインターフェロンおよびrSIFN-coが同等であることを示す、
方法。 - ステップ(2)において、以下のいずれか1種または多種の活性
(iii)いずれか1種又は多種の担癌マウスモデル体内の癌細胞生長に対する阻害;
(iv)癌細胞生存率の減少;
(v)癌細胞転移に対する阻害;
(vi)癌細胞におけるβ-カテニン/TCFの転写活性に対する阻害;
(vii)癌細胞におけるAxin2、CD24、サバイビン及びID2のうちいずれか1種又は多種の発現に対する阻害;
(viii)癌細胞における偽足形成に対する阻害;
(ix)癌細胞におけるβ-カテニン発現に対する阻害;
(x)癌細胞におけるDKK-3、KLF-4及びBATF2のうちいずれか1種又は多種の発現に対するアップレギュレーション;および
(xi)癌細胞p-STAT発現に対するアップレギュレーションにおける、IFNα-2bよりも低いB18R阻害に対する感受性;
を測定することをさらに含み、
活性(iv)~(xi)がインビトロ条件で測定され、統計学的に有意であるように(i)の所定の活性およびテストインターフェロンによる(ii)の所定の活性を、統計学的に有意であるように(iii)、(iv)、(v)、(vi)及び(vii)のうち所定のいずれか1種、又は2種、又は3種、又は4種、又は5種の活性と組み合わせて有するのは、及び/又は前記テストインターフェロンが、(viii)、(ix)、(x)及び(xi)のうち所定のいずれか1種又は多種の活性を有するのは、前記テストインターフェロンおよびrSIFN-coが同じ効力を有することか、又は前記テストインターフェロンおよびrSIFN-coが同等であることをさらに示す、
請求項1に記載の方法。 - 1種又は多種の前記活性を測定するために用いられる癌細胞は、肺癌細胞、結腸癌細胞、子宮頚癌細胞、肝臓癌細胞、乳癌細胞及び前立腺癌細胞のうちいずれか1種又は多種を含む、請求項1または2に記載の方法。
- 1種又は多種の前記活性を測定するために用いられる癌細胞は、A549細胞、Hela細胞、CL-1細胞、Huh-7細胞、SW480細胞、MDA-MB-231細胞、Calu-1細胞、SMMC-7721細胞、PANC-1細胞、SW620細胞、SPC-A4細胞、H1299細胞、H460細胞及びHT-29細胞のうちいずれか1種又は多種を含む、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。
- 活性(ii)の測定において、IFNα-2bに比べて、テストインターフェロンが少なくとも2倍、好ましくは、少なくとも3倍、より好ましくは、少なくとも4倍、さらに好ましくは、少なくとも4.5倍とより高いIFNAR1への結合親和性を有する場合、前記テストインターフェロン及びrSIFN-coは同じ効力を有する又は同等であるとみなされる、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。
- 活性(ii)の測定において、IFNα-2bに比べて、テストインターフェロンが少なくとも5倍、好ましくは、少なくとも7倍、より好ましくは、少なくとも9倍、さらに好ましくは、少なくとも11倍とより低いIFNAR2への結合親和性を有する場合、前記テストインターフェロン及びrSIFN-coは同じ効力を有する又は同等であるとみなされる、請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。
- 活性(ii)の測定において、解離定数(KD)を測定することで、IFNα-2b、テストインターフェロン及び/又はrSIFN-coのIFNAR1及び/又はIFNAR2への結合親和性を確定する、請求項1~6のいずれか1項に記載の方法。
- 活性(xi)を測定するために用いられる癌細胞は、A549細胞及びHela細胞のうちいずれか1種又は多種を含む、請求項2~7のいずれか1項に記載の方法。
- 活性(xi)の測定において、癌細胞に接触する前に、IFNα-2b、テストインターフェロン及び/又はrSIFN-coを5ng/ml~20ng/ml、好ましくは10ng/mlのB18Rとともにインキュベートする、請求項8に記載の方法。
- 活性(xi)の測定において、IFNα-2bに比べて、癌細胞p-STAT発現に対するアップレギュレーションにおけるテストインターフェロンが、より低いB18R阻害に対する感受性を有する場合、前記テストインターフェロン及びrSIFN-coは同じ効力を有する又は同等であるとみなされる、請求項8又は9に記載の方法。
- 活性(xi)の測定において、ウエスタンブロットを利用してp-STAT発現に対するアップレギュレーションを測定する、請求項2~10のいずれか1項に記載の方法。
- 統計学的に有意であるとは、コントロールに比べて、p値≦0.05、又は≦0.01、又は≦0.005、又は≦0.001、又は≦0.0005、又は≦0.0001である、請求項1~11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記コントロールは、テストインターフェロン又はrSIFN-coで処理されず、又は生理食塩水若しくはPBSで処理され、又はIFNα-2bで処理され、又は未処理のコントロール(Mock)である、請求項12に記載の方法。
- 前記テストインターフェロンとrSIFN-coは同じアミノ酸配列(配列番号1)を有し、且つ同じヌクレオチド配列(配列番号2)にコードされている、請求項1~13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記テストインターフェロンとrSIFN-coは同じ比活性を有する、請求項1~14のいずれか1項に記載の方法。
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