JP7007539B2 - Ｎ－アシル化ホモセリンラクトン（ａｈｌ）ラクトナーゼ、それを用いた水処理剤及び水処理方法 - Google Patents

Description

本発明は、ＡＨＬラクトナーゼ、それを用いた水処理剤及び水処理方法に関する。

バイオフィルムは、細菌が物質固相表面に付着及び増殖して、多糖類などの高分子有機物を生産することにより形成される。バイオフィルムは、膜状の構造体であり、生物膜やスライムとも呼ばれる。

バイオフィルムは、冷却水系などの循環水系において、伝熱効率の低下や配管の目詰まりの要因となることが知られている。また、バイオフィルムは、製紙工程において生産性低下や品質の劣化などの障害（スライム障害）の要因となることが知られ、逆浸透膜（ＲＯ膜）を利用した水処理工程においてＲＯ膜のフラックスの低下の要因となることが知られている。

上記の循環水系、製紙工程、水処理工程など（以下、まとめて「水処理系」という）においてバイオフィルムに起因する上記の各問題を防止するために、様々な処置方法が考案されている。

それら様々な処置方法のうち、最も一般的なものは、殺菌剤や増殖抑制剤を用いて細菌の繁殖を防止する方法である。これら殺菌剤や増殖抑制剤を用いる方法では、従来、塩素、臭素ならびにその派生物、ＣｌＭＩＴ（５－クロロ－２－メチル－４－イソチアゾリン－３－オンと２－メチル－４－イソチアゾリン－３－オンの混合物）やＤＢＮＰＡ（２，２－ジブロモ－３－ニトリロプロピオンアミド）といった有機抗菌剤、オゾンや過酸化水素などの酸化性の殺菌剤が利用されている。その他、界面活性剤を利用した分散処理や剥離処理も行われており、これらの方法では、アルキルベンゼンスルホン酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテル類、ポリエチレンイミンなどが利用されている。

また近年、細胞間情報伝達物質がバイオフィルム形成のシグナルとして重要な役割を担っていることが明らかになり、細胞間情報伝達物質を分解してバイオフィルムの形成を抑制する技術開発も進んでいる。

細胞間情報伝達物質を分解してバイオフィルムの形成を抑制する技術として、グラム陰性細菌の中で幅広く使われている細胞間情報伝達物質であるＮ－アシル化ホモセリンラクトン（ＡＨＬ）に着目した技術が開示されている。

具体的には、例えば、水処理プロセスにおいて、磁気微粒子に固定化したＡＨＬ分解酵素を用いてバイオフィルムの形成を抑制する方法（非特許文献１）が開示されている。また、系内に導入したＡＨＬ分解菌が産生する酵素によりバイオフィルム形成を低減する技術はすでに実験室レベルで実証されている（特許文献１、非特許文献２）。
ＡＨＬ分解酵素は、ラクトン環を開裂するＡＨＬラクトナーゼと、アシル基を切断するアシラーゼに分類される。
公知のＡＨＬ分解酵素の多くは、ＡＨＬ分解菌がその菌体内に産生する菌体内酵素である。その菌体内酵素で分解されるＡＨＬは、ＡＨＬ分解菌の菌体内に浸透したＡＨＬに限定され、菌体外に存在するＡＨＬは分解されない。

ＡＨＬ分解菌が産生し菌体外に分泌する菌体外酵素であるＡＨＬラクトナーゼとして、Muricauda olearia由来のＡＨＬラクトナーゼが報告されている（非特許文献３）。このＡＨＬラクトナーゼは、作用最適温度が４０℃であり、熱処理後に残存する酵素活性（以下、残存活性ともいう）は、６０℃の熱処理後で３０％である。
酵素は蛋白質であることから、自然界では、微生物が産生する蛋白質分解酵素によって分解され易く、また、紫外線や熱、あるいは酸化剤等によって失活し易い。産業用途に用いる酵素としては、安定な構造を有するものが要望され、一般には熱に対する安定性（以下、耐熱性）がその指標とされる。
非特許文献３の上記ＡＨＬラクトナーゼは、産業用途に用いる酵素としては、耐熱性が不十分である。

耐熱性酵素として、Bacillus属細菌が菌体内に産生するＡＨＬラクトナーゼ（非特許文献４）や、Geobacillus caldoxylosilyticusが菌体内に産生するＡＨＬラクトナーゼ（非特許文献５）が知られている。これらの菌株は菌体内酵素であり、その酵素で分解されるＡＨＬはＡＨＬ分解菌の菌体内に浸透したＡＨＬに限定され、菌体外に存在するＡＨＬは分解されない。
さらには、耐熱性酵素として、Thermaerobacter marianensisが産生するＡＨＬラクトナーゼであって、蛋白質の分泌に必要なＮ末端シグナルペプチド様構造を有さないことから菌体内蛋白質とみられるものが報告されている（非特許文献６）。本菌株は７０℃を超える生育環境を必要とするため、通常の水処理プロセスでの利用は困難である。
以上のように、これまでに報告されているＡＨＬラクトナーゼの多くは菌体内酵素であり、産業用途に用いる酵素としては適さない。また、菌体外酵素として報告されているＡＨＬラクトナーゼも、耐熱性の観点から、産業用途に用いる酵素としては適さない。

特許５８５０４４１号明細書

Environmental Science & Technology,43巻、7403‐7409頁、2009年 Environmental Science & Technology, 47巻、836‐842頁、2013年 Applied Environmental Microbiology, 81巻、774‐782頁、2015年 Applied Environmental Microbiology, 78巻、1899‐1908頁、2012年 Bio science, Biotechnology, and Biochemistry, 75巻、1789‐1795頁、2011年 Journal of Bioscience and Bioengineering, 120巻 、1‐5頁、2015年

本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであり、本発明は、上記した従来技術の問題を解決し、菌体外に分泌され、かつ、産業用途に用いるのに適した耐熱性を備え、通常の水処理プロセスでの利用に適したＡＨＬラクトナーゼ、それを用いた水処理剤及び水処理方法の提供を目的とする。

上記のような問題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、本発明者らが分離して寄託済みのスフィンゴピクシス属細菌の産生するＡＨＬラクトナーゼにより、上記の目的を達成できることを見出し、本発明を完成させた。
本発明は、以下の［１］～［７］を提供する。
［１］Ｎ－アシル化ホモセリンラクトン（ＡＨＬ）ラクトナーゼを菌体外に分泌する細菌由来のＡＨＬラクトナーゼであって、５０℃、１０分間の熱処理後の残存活性が８０％以上である熱安定性を有するＡＨＬラクトナーゼ。ここで、「ＡＨＬラクトナーゼを菌体外に分泌する細菌由来のＡＨＬラクトナーゼ」には、ＡＨＬ分解菌が産生し菌体外に分泌したＡＨＬラクトナーゼの他に、ＡＨＬ分解菌の菌体からＡＨＬラクトナーゼ遺伝子を分離後、発現ベクターに連結して、大腸菌等の宿主に導入し、得られた組換え菌を用いて産生させたＡＨＬラクトナーゼも含まれる。
［２］前記細菌がスフィンゴピクシス属に属する、［１］に記載のＡＨＬラクトナーゼ。
［３］配列番号１に記載のアミノ酸配列との同一性が９０％以上のアミノ酸配列を有する、［１］又は［２］のＡＨＬラクトナーゼ。
［４］配列番号２に記載のアミノ酸配列との同一性が９０％以上のアミノ酸配列を有する、［１］又は［２］のＡＨＬラクトナーゼ。
［５］［１］～［４］の何れかに記載のＡＨＬラクトナーゼ又は当該ＡＨＬラクトナーゼを産生するＡＨＬ分解菌を含有する水処理剤。
［６］［５］に記載の水処理剤を用いる水処理方法。
［７］さらに水処理機器を併用する［６］に記載の水処理方法。

本発明によれば、菌体外に分泌され、かつ、産業用途に用いるのに適した耐熱性を備え、通常の水処理プロセスでの利用に適したＡＨＬラクトナーゼ、それを用いた水処理剤及び水処理方法を提供することができる。
当該ＡＨＬラクトナーゼあるいは当該ＡＨＬラクトナーゼを産生するＡＨＬ分解菌を水処理系内に導入することにより、水処理系内のＡＨＬを常時分解し、バイオフィルムによる障害を防止することができる。
当該ＡＨＬラクトナーゼを利用することにより、従前のＡＨＬラクトナーゼやＡＨＬ分解菌を用いる場合と比較して、安定的かつ効率的に、水処理系内のＡＨＬを分解することができる。

本発明のＡＨＬラクトナーゼは、本発明者らが分離して寄託済みのスフィンゴピクシス属細菌であるスフィンゴピクシス属ＥＧ６株（以下、ＥＧ６株）又はスフィンゴピクシス属ＦＤ７株（以下、ＦＤ７株）により産生されて菌体外に分泌される菌体外酵素であるＡＨＬラクトナーゼとの同一性が９０％以上のアミノ酸配列を有する。
アミノ酸配列の同一性は、ラクトナーゼ遺伝子の塩基配列から蛋白質の一次構造（アミノ酸配列）を求め、相互比較することで判断することができる。相互比較は、一般的に容易に利用可能な配列比較プログラムの補助によって行うことができる。これらの市販のコンピュータプログラムは、２つ以上の配列の間の同一性（％）を計算し得る。

ＥＧ６株及びＦＤ７株は、２０１６年９月２３日付で、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託した。
受託番号は、以下の通り。
ＥＧ６株：ＮＩＴＥ Ｐ－０２３５５
ＦＤ７株：ＮＩＴＥ Ｐ－０２３５６

本発明のＡＨＬラクトナーゼは、ＥＧ６株及びＦＤ７株を、３０℃前後の温度条件、好ましくは２５～３０℃で、１/１０～１/５濃度のＴＢＳ培地やＬＢ培地で培養することにより、産生されて菌体外に分泌される。

例えば、ＥＧ６株及びＦＤ７株を水処理系に導入し、水処理系で増殖させることで、本発明のＡＨＬラクトナーゼが産生され分泌される環境を作ることができる。
ＥＧ６株及びＦＤ７株は、３０℃前後の生育環境、好ましくは２５～３０℃で効率よく増殖させることができる。
本発明のＡＨＬラクトナーゼの作用最適温度は６０℃であり、５０℃、１０分間の熱処理後の残存活性が８０％以上である熱安定性を有する。
水処理系に分泌されたＡＨＬラクトナーゼは、水処理系内のＡＨＬを分解してバイオフィルムによる障害を防止する。
ＥＧ６株及びＦＤ７株から菌体外に分泌されるＡＨＬラクトナーゼは水処理系内で拡散するため、従来のＡＨＬ分解菌がその菌体内に産生する菌体内酵素を利用した処理と比べて、効率の良い処理が可能となる。

ＥＧ６株及びＦＤ７株の培養液あるいは培養液上澄みを酵素液として利用することもできるし、さらに濃縮や精製を行い、より純化した酵素を標品として得ることもできる。

本発明のＡＨＬラクトナーゼは、ＥＧ６株及びＦＤ７株からＡＨＬラクトナーゼ遺伝子を分離し、適切な発現ベクターに連結して、大腸菌等の宿主に導入し、得られた組換え菌を用いて産生させることもできる。この場合、宿主の種類によっては、発現した酵素が必ずしも菌体外分泌を示さないケースもあるが、この場合は菌体内やペリプラズムから酵素を分取することができる。
従来のＡＨＬ分解菌がその菌体内に産生する菌体内酵素は、ＡＨＬ分解菌の菌体内に蓄積されるため産生量に限界があるが、本発明のＡＨＬラクトナーゼは、菌体内に蓄積されないため、菌体の細胞に負担がかからず、突然変異等の育種により酵素産生量を大きく増加させることも可能である。

ＡＨＬラクトナーゼが菌体内に存在するか、菌体外に存在するか（以下、ＡＨＬラクトナーゼの局在性ともいう）は、ＡＨＬラクトナーゼを産生する菌を液体培地中で培養した培養物を遠心分離或いはろ過によって、菌体と上澄みに分け、どちらの画分にＡＨＬラクトナーゼの酵素活性（以下、ＡＨＬラクトナーゼ活性ともいう）が存在するかを確認する従来手法で容易に調べることができる。

ＡＨＬラクトナーゼ活性は、ＡＨＬ分ラクトナーゼとＡＨＬ標準品を混合して反応させた後、その反応物の残留ＡＨＬ量から、ＡＨＬの分解速度を算出して評価することができる。
ＡＨＬ量の定量には、ＨＰＬＣを利用することができる（Applied Environmental Microbiology,76巻、2524-2530頁、2010年）。

また、ＡＨＬラクトナーゼ活性は、レポーター細菌と呼ばれるクロモバクテリウム・ビオラセウム（Chromobacterium violaceus）の遺伝子組み換え体（ＡＨＬ合成遺伝子破壊株）を利用した公知の方法によって評価することもできる。
具体的には、レポーター細菌を混合したＬＢ寒天培地にＡＨＬを含むペーパーディスクを置くと、ＡＨＬに応答してレポーター細菌は紫色色素（ビオラセイン）を生産することから、紫色の強度を指標としてＡＨＬの量を半定量することができる。未反応のＡＨＬが示す紫色色素の強度に対して、ＡＨＬラクトナーゼでの処理により色調がどれだけ低下したかを比較評価することで、分解性を半定量することができる。
こうしたレポーター細菌株としては、短鎖ＡＨＬ（Ｃ４～Ｃ８：アシル基の鎖長を示す）に応答するＣＶ０２６株（Microbiology誌、143巻、3703-3711頁、1997年）や長鎖ＡＨＬ（Ｃ８～Ｃ１８）に応答するＶＩＲ０７株（FEMS Microbiol. Lett.誌、279巻、124-130頁、2007年.）を利用することができる。

酵素の耐熱性は、熱処理した後の残存活性を指標として求めることができる。本明細書では、５０℃、１０分間の熱処理後に８０％以上の酵素活性が残存する酵素を耐熱性酵素と定義する。

以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

（ＡＨＬラクトナーゼの局在性評価）
実施例１では、ＥＧ６株を１/５濃度のＴＢＳ培地で３０℃の条件下２４時間培養した。
実施例２では、ＦＤ７株を１/５濃度のＴＢＳ培地で３０℃の条件下２４時間培養した。
比較例１では、Bacills sp.を１/５濃度のＴＢＳ培地で３０℃の条件下２４時間培養した。
比較例２では、Solibacillus silvestris.を１/５濃度のＴＢＳ培地で３０℃の条件下２４時間培養した。
比較例３では、Chryseobacterium sp.を１/５濃度のＴＢＳ培地で３０℃の条件下２４時間培養した。
比較例４では、菌を無添加とした。
培養液は１５，０００×ｇ 、１０分間の遠心分離を行い、菌体と培養上清に分画した。菌体はもとの培養液と等量となるようにＰＢＳ緩衝液に懸濁し、超音波破砕によって菌体抽出液を得た。
各画分のＡＨＬラクトナーゼ活性を、レポーター細菌を用いたアッセイにより評価した結果を表１に示す。
前記のように、ＡＨＬがＡＨＬラクトナーゼによって分解されるとクロモバクテリウムの色素生産性が低くなり呈色が弱くなる。

表１に示すように、実施例１及び実施例２では、菌体外のＡＨＬラクトナーゼ活性が高いことが確認された。
比較例１～３では、菌体外のＡＨＬラクトナーゼ活性は殆ど認められず、菌体抽出液にＡＨＬラクトナーゼ活性が認められ、菌体内酵素であることが確認された。

（ＡＨＬラクトナーゼ一次構造の決定）
ＥＧ６株及びＦＤ７株からＡＨＬラクトナーゼ遺伝子をクローニングし、得られた遺伝子の塩基配列を基に、ＡＨＬラクトナーゼの一次構造を決定した。
さらに上記比較例１～３で用いた３種類のＡＨＬラクトナーゼを含めて、一次構造の比較を行った。比較結果を表２に示す。

表２に示すように、ＥＧ６株由来のＡＨＬラクトナーゼとＦＤ７株由来のＡＨＬラクトナーゼは一次構造の比較において、８１％の同一性を示すことが確認された。
このように、ＥＧ６株由来のＡＨＬラクトナーゼとＦＤ７株由来のＡＨＬラクトナーゼは一次構造が非常に似ていたのに対し、他の３種類のＡＨＬラクトナーゼは、ＥＧ６株由来のＡＨＬラクトナーゼ及びＦＤ７株由来のＡＨＬラクトナーゼとの同一性が３０％以下と低く、一次構造が大きく異なることが確認された。

（ＡＨＬラクトナーゼの耐熱性）
ＡＨＬラクトナーゼＣ末端に６個のヒスチジン残基（His-tag）を付加するように設計されたＤＮＡプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により合成したＥＧ６株（実施例１）及びＦＤ７株（実施例２）由来のＡＨＬラクトナーゼ遺伝子を、融合蛋白質発現ベクターpMAL-c2X（ニューイングランドバイオラボ社）に連結し、それぞれ大腸菌DH5αに導入した。得られた培養液より調整した菌体抽出液より、His60 Ni Gravity Column Purification Kit（タカラバイオ社）を用いて、His-tag付加ＡＨＬラクトナーゼ蛋白質をＳＤＳ－ＰＡＧＥで単一蛋白質として分取した。
Bacills sp.（比較例１）、Solibacillus silvestris.（比較例２）、Chryseobacterium sp. （比較例３）由来のラクトナーゼは、ＡＨＬラクトナーゼ遺伝子をＰＣＲ合成しpMAL-c2Xに連結し、それぞれ大腸菌DH5αに導入した。各培養液より調整した菌体抽出液より、MBPTrapキット（ＧＥヘルスケア社）を用いて、マルトース結合蛋白－ＡＨＬラクトナーゼ融合蛋白質をＳＤＳ－ＰＡＧＥで単一蛋白質として分取した。
なお、発現に用いた各遺伝子は全て塩基配列を解読し、元株の染色体由来の遺伝子配列と同一であることを確認して利用した。
得られた酵素水溶液は、５０℃若しくは６０℃で１０分間熱処理した後、急冷した。
熱処理した酵素水溶液は２ｍＭのＣ８－ホモセリンラクトン（ＡＨＬの1種。以下、Ｃ８－ＨＳＬ）と３０℃の温度条件で３分間反応させ、残留するＣ８－ＨＳＬ濃度をＨＰＬＣ（Mightysil PR-18GPカラム）で算出し、残存活性を定量した。定量結果を表３に示す。

表３に示すように、ＥＧ６株（実施例１）由来のＡＨＬラクトナーゼでは、５０℃で１０分間の熱処理後に８０％以上の残存活性が確認され、６０℃で１０分間の熱処理後も８０％以上の残存活性が確認された。
ＦＤ７株（実施例２）由来のＡＨＬラクトナーゼでは、５０℃で１０分間の熱処理後に８０％以上の残存活性が確認された。
Solibacillus silvestris.（比較例２）、Chryseobacterium sp. （比較例３）由来のＡＨＬラクトナーゼは、何れの温度条件でも残存活性が低く、耐熱性に劣ることが確認された。
Bacills sp.（比較例１）由来のＡＨＬラクトナーゼでは、５０℃で１０分間の熱処理後に８０％以上の残存活性を示し、ＦＤ７株同等の耐熱性を有することが示されたが、表１に示したように、Bacills sp.（比較例１）由来のＡＨＬラクトナーゼは、菌体内酵素であるため、水処理系内で使用した場合に水処理系内に拡散させることができず、菌体外酵素を用いた場合のような効率の良い処理を行うことはできない。

（ＡＨＬラクトナーゼの作用最適温度）
ＥＧ６株（実施例１）、ＦＤ７株（実施例２）、Bacills sp.（比較例１）、Solibacillus silvestris.（比較例２）、Chryseobacterium sp. （比較例３）由来のＡＨＬラクトナーゼの作用最適温度を求めた。
２０℃、３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃の各温度条件で、５分間、Ｃ８－ＨＳＬを分解して、上述の方法でＨＰＬＣにより、Ｃ８－ＨＳＬ濃度を求めてＡＨＬラクトナーゼ活性を調べて、ＡＨＬラクトナーゼの作用最適温度を評価した。評価結果を表４に示す。

表４に示すように、ＥＧ６株（実施例１）、ＦＤ７株（実施例２）由来のＡＨＬラクトナーゼは作用最適温度が６０℃であることが確認された。
Bacills sp.（比較例１）、Solibacillus silvestris.（比較例２）、Chryseobacterium sp. （比較例３）由来のＡＨＬラクトナーゼの作用最適温度は、それぞれ、４０℃、５０℃、４０℃であり、ＥＧ６株（実施例１）、ＦＤ７株（実施例２）由来のＡＨＬラクトナーゼは、熱に対して安定な酵素であることが確認された。

本発明は、例えば、冷却水系などの循環水系、或いは製紙工程、或いは逆浸透膜（ＲＯ膜）を利用した水処理工程において、バイオフィルムの形成を抑制するために利用することができる。

Claims (5)

1. Ｎ－アシル化ホモセリンラクトン（ＡＨＬ）ラクトナーゼを菌体外に分泌する細菌由来のＡＨＬラクトナーゼであって、５０℃、１０分間の熱処理後の残存活性が８０％以上である熱安定性を有するＡＨＬラクトナーゼであって、
   配列番号１又は配列番号２に記載のアミノ酸配列との同一性が９０％以上のアミノ酸配列を有する、ＡＨＬラクトナーゼ。
2. 前記細菌がスフィンゴピクシス属に属する、請求項１に記載のＡＨＬラクトナーゼ。
3. 請求項１又は２に記載のＡＨＬラクトナーゼ又は当該ＡＨＬラクトナーゼを産生するＡＨＬ分解菌を含有する水処理剤。
4. 請求項３に記載の水処理剤を用いる水処理方法。
5. さらに水処理機器を併用する請求項４に記載の水処理方法。