JP6985130B2 - ホスホジエステラーゼ阻害用組成物 - Google Patents
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Description
cAMPやcGMPはセカンドメッセンジャーであり、ホスホジエステラーゼはその酵素活性のバランスによってその濃度を調節し、シグナル伝達に重要な役割を担っていると考えられている。cAMPホスホジエステラーゼ阻害剤として公知の医薬品は、テオフィリン、パパベリン、カフェインなどがある。これらの医薬品は、細胞内カルシウム濃度をあげ、心筋収縮力をあげるため、心疾患の治療に処方される。
肥満の原因たる白色脂肪細胞にあっては、ノルアドレナリンがβ3受容体に結合すると、ATP結合タンパク質を介してアデニル酸シクラーゼが活性化され、ATPがcAMPへ変換され、脂肪分解につながる。cAMPはホスホジエステラーゼによって分解されるため、脂肪分解のためには、ホスホジエステラーゼの働きを抑える必要がある。ホスホジエステラーゼの阻害は、脂肪の分解を促進し、肥満を改善するといわれている。
いわゆる勃起は、性的刺激によって遊離した一酸化窒素(NO)により、陰茎海綿体平滑筋内でグアニル酸シクラーゼが活性化され、GMPがcGMPに変換されることで陰茎海綿体平滑筋が弛緩して海綿体洞内に血液が貯留することで起こる。しかし、ホスホジエステラーゼによってcGMPが分解されると勃起機能不全(ED)となるため、EDを抑制するためにはホスホジエステラーゼの働きを抑える必要がある。
天然物由来のホスホジエステラーゼ阻害物質として、マンゴージンジャー抽出物(特許文献1)、テンニンカ抽出物(特許文献2)、ヒマラヤンラズベリー(特許文献3)、キンモクセイ抽出物(特許文献4)、有色素米抽出物(特許文献5)、藤茶抽出物(特許文献6)などが注目されている。
本発明は、この知見に基づきなされたものであって、新たなホスホジエステラーゼ阻害用組成物を提供することを課題とする。
(1)アンペロプシン及び/又はカテキンを含有するホスホジエステラーゼ阻害用組成物。
(2)アンペロプシン1質量部に対しカテキンが1.0〜2.5質量部の比率で含有されている(1)に記載のホスホジエステラーゼ阻害用組成物。
(3)ホスホジエステラーゼがcAMPホスホジエステラーゼである(1)又は(2)に記載のホスホジエステラーゼ阻害用組成物。
(4)アンペロプシンが藤茶由来である(1)〜(3)のいずれかに記載のホスホジエステラーゼ阻害用組成物。
(5)カテキンが緑茶由来である(1)〜(4)のいずれかに記載のホスホジエステラーゼ阻害用組成物。
また、アンペロプシンの原料である藤茶エキスとカテキンの原料である緑茶エキスを配合して調製した飲食品やサプリメントは、アンペロプシンとカテキンを含有する飲食品やサプリメントとなる。したがってアンペロプシンとカテキンを含有する飲食品やサプリメントを日常的に飲用することでホスホジエステラーゼ阻害による心疾患改善、肥満改善、ED改善などの効果を期待できる。
すなわち、乾燥させた藤茶の枝葉部を含水エタノールで抽出した抽出物を濃縮し、例えば多孔性樹脂(DIAION HP−20)を用いたカラムクロマトグラフィーにかけ、80容量%含水メタノールで溶出される分画にアンペロプシンが得られる。これを逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィーや再結晶により、更に精製することができる。精製されたアンペロプシンは、試薬としても販売されており、これを用いることもできる。
乾燥した藤茶の葉又は茎の粉砕物又は粉末を抽出原料とし、水又は親水性有機溶媒若しくはこれらの混合溶媒に投入し、室温乃至溶媒の沸点以下の温度で任意の装置を用いて抽出することにより得ることができる。
また、これら親水性有機溶媒と水との混合溶媒などを用いることができる。なお、水と親水性有機溶媒との混合系溶媒を使用する場合には、低級アルコールの場合は水10質量部に対して30〜90質量部、低級脂肪族ケトンの場合は水10質量部に対して10〜40質量部、多価アルコールの場合は水10質量部に対して10〜90質量部添加することが好ましい。
抽出溶媒を満たした処理槽に、藤茶の乾燥・粉砕物を投入し、必要に応じて時々撹拌しながら、30分〜2時間静置して可溶性成分を溶出した後、ろ過して固形物を除去し、この抽出液から抽出溶媒を留去し、乾燥することにより抽出物が得られる。抽出溶媒量は、抽出原料の通常5〜15倍量(質量比)であることが好ましく、抽出条件は、抽出溶媒として水を用いた場合には、通常50〜95℃で1〜4時間程度である。また、抽出溶媒として水とエタノールとの混合溶媒を用いる場合には、通常40〜80℃で30分〜4時間程度である。
得られた抽出液から抽出溶媒を留去するとペースト状の濃縮物が得られる。更に乾燥すれば、固形の抽出物が得られる。本発明においては、アンペロプシンの含有量が10質量%以上、好ましくは20質量%以上であれば、上記抽出液又はその濃縮液の状態であっても良い。これらは、活性炭処理、吸着樹脂処理、イオン交換樹脂、液―液向流分配などの方法により精製してから用いても構わない。
したがって、上記の藤茶から抽出しアンペロプシンの濃度を高めた抽出物も本発明の組成物として使用可能である。
・試料溶液の調整
HPLC法で調整したメンブランフィルターろ過前に試料溶液(24μg/ml)を30%メタノール(0.5%アスコルビン酸含有)にて正確に5倍希釈し、0.2μmのメンブランフィルターろ過したものを標準溶液とする。
試料約30mgを精秤し、30%メタノール(0.5%アスコルビン酸含有)を加えて超音波にて溶解し、正確に50mLとする。この溶液1mLを30%メタノール(0.5%アスコルビン酸含有)にて25mLに正確に希釈し、0.45μmのメンブランフィルターでろ過したものを試料溶液とする(24μg/ml)。
HPLC法で調整した8μg/ml標準溶液を30%メタノール(0.5%アスコルビン酸含有)にて正確に5倍希釈し、1.6μg/ml標準溶液を調整する。これを30%メタノール(0.5%アスコルビン酸含有)にて正確に5倍希釈し、0.32μg/ml標準溶液を調整する。8μg/ml標準溶液、1.6μg/ml標準溶液、0.32μg/ml標準溶液を0.2μmのフィルターろ過し、標準溶液とする。
標準品10.00mgを精秤し、メタノール(0.5%アスコルビン酸含有)を適量加えて超音波処理して溶解し、メタノール(0.5%アスコルビン酸含有)を加えて正確に25mLとする。その溶液を5mlとり12.5%メタノール(0.5%アスコルビン酸含有)を加えて正確に25mlとする。その溶液を4mlとり30%メタノール(0.5%アスコルビン酸含有)を加えて正確に20mlとし、16μg/mL標準溶液を調整する。これを正確に2倍希釈し、8μg/ml標準溶液とする。これを正確に2倍希釈し、4μg/ml標準溶液とした。0.45μmのメンブランフィルターでろ過したものを標準溶液とする。
LC装置:ACQUITY UPLC (Waters)
MS装置:TOD(Waters)
カラム:ACQUITY UPLC BEH C18(1.7μm, 100x2.1 mm i.d., Waters)
カラム温度:40 ℃
移動相:A) 0.1% formic acid/Ultra Pure Water,
B) 0.1% formic acid/MeCN
10%B溶液で、7分間イソクラティック分析。その後カラム洗浄のため、2分間かけてリニアで90%B溶液まで上げ、0.5分で10%B溶液にリニアで戻し、4分間10%B溶液で再安定化させてから次の分析を実施する。
流速:0.4 mL/min
注入量:2.0 μL
検出器:UV 290 nm, MS(M.w. 319.0434)
MS条件:Polarity ES-(capillary voltage 1.8 kV, sampling cone 40 V, extraction cone 4.0 kV, cone Voltage: 20 V, source temp. 150℃, desolvation temp. 400℃, cone gas flow 50 L/h, desolvation gas flow 1000 L/h, Mass scan range: 100-1000 Da, Scan time: 0.2 sec-1.
MRM condition:precursor ion>production:318.83>192.90
検出感度の点からPolarity ES-を使用した。
オートサンプラー:5℃
標準品成績書に記載の純度(HPLC純度・水分値)で補正し算出する。
高濃度の緑茶カテキンを得るためには、まず、茶葉からカテキン類を抽出して得られた茶葉抽出液を乾燥し、カテキン類を30〜98質量%含有する粉末を調製する。このような粉末の調製方法は公知の方法によって得ることができ、特開昭59−219384号公報、特開昭60−13780号公報、特開昭61−130285号公報等に開示されている。
このような粉末は、例えば、茶葉を熱水で抽出して得られた抽出物を酢酸エチル等の有機溶媒で分画して乾燥することにより、エピガロカテキンガレート、ガロカテキンガレート、エピカテキンガレート、カテキンガレート、エピガロカテキン、ガロカテキン、エピカテキン、(+)カテキン等のカテキン類を30〜98質量%含有する粉末を得ることができる。このような粉末として、例えば、商品名「PF−TP90」、商品名「ファーマフーズおいしいカテキンPF−TP80」(いずれも株式会社ファーマフーズ製)等の市販のものを用いることもできる。緑茶カテキン中の総カテキン含量は、酒石酸鉄を発色剤として用いた公知の比色定量法により測定することができる。また、各カテキン類の組成を詳細に測定するためには、逆相高速液体クロマトグラフィーで測定し、定量することができる。
(HPLC分析条件)
分析装置:島津SCL−10A高速液体クロマト装置(島津製作所製)
カラム:Shimpach VP ODS(150×4.6mmI.D.)
移動相:メタノール/0.05%リン酸水溶液=20/80
カラム温度:40℃
検出波長:280nm
総カテキン量は、HPLCによって分離されるカテキン、ガロカテキン、カテキンガレート、ガロカテキンガレート、エピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキンガレート及びエピガロカテキンガレートの標準品を用いた検量線法で得られる構成成分の合計値で表すことができる。
カテキンとアンペロプシンは、共存することで相乗的に作用して、ホスホジエステラーゼを阻害する作用効果を発揮する。
またホスホジエステラーゼ阻害用のサプリメント剤や健康食品、飲料として利用することができる。
1.試験方法
(1)試験試料
アンペロプシンとして市販の「藤茶エキスパウダー」(丸善製薬株式会社製:アンペロプシン30%含有)、カテキンとして、市販の「緑茶抽出物PF−TP90F」(株式会社ファーマフーズ製:カテキン70%含有)を試験用試料として用いた。
試験用試料は、蒸留水を用いて1000μg/mlに希釈後、これをさらに所望の試験濃度に希釈した。
ホスホジエステラーゼの阻害活性は、市販の「PDE Activity Assay Kit(Colorimetric)Abcam社」を使用して測定する。測定はキットのプロトコルに則して、希釈調製した(1)試験試料、(2)PDE Assay Buffer、(3)3’,5’−cAMP(1mM)をPDE Assay Bufferを用いて0.5mMに希釈調製した基質溶液、(4)5’−Nucleotidase(5kU/μL)、(5)PDE EnzymeをPDE Assay Bufferを用いて4mU/μLに調整した溶液の5種類を下記表1のようにキット中の96−well Clear Microplate(1/2 volume)に分注した。また、コントロールには、試験試料の代わりにPDE Assay Bufferを分注した。
下記計算式によりホスホジエステラーゼ阻害率を求めた。
阻害率(%)=(1−試験試料の吸光度/コントロールの吸光度)×100
(1)アンペロプシン、カテキンの濃度とホスホジエステラーゼ阻害活性
下記表2に示す濃度範囲でアンペロプシン及びカテキンは濃度依存的にホスホジエステラーゼ阻害効果を有することが確認できた。
アンペロプシン単独、カテキン単独、アンペロプシンとカテキン併用によるホスホジエステラーゼ阻害効果を測定した結果を下記の表3に示す。
Claims (4)
- アンペロプシン1質量部に対しカテキンが1.0〜2.5質量部の比率で含有されているホスホジエステラーゼ阻害用組成物。
- ホスホジエステラーゼがcAMPホスホジエステラーゼである請求項1に記載のホスホジエステラーゼ阻害用組成物。
- アンペロプシンが藤茶由来である請求項1又は2に記載のホスホジエステラーゼ阻害用組成物。
- カテキンが緑茶由来である請求項1〜3のいずれかに記載のホスホジエステラーゼ阻害用組成物。
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