JP6980419B2 - ＡＧＥｓ産生抑制剤 - Google Patents
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Description
本発明は、AGEs産生抑制剤に関する。より具体的には、マンゴーの抽出物を含むAGEs産生抑制剤、およびAGEs産生抑制用食品などに関する。
AGEs（Advanced Glycation End Products の略語）は、タンパク質の糖化反応により生成される産物の総称であり、最終糖化産物又は後期糖化生成物などと言われる。AGEsは、体内に蓄積し，糖尿病、動脈硬化、神経性疾患など、加齢性慢性疾患等に関わる様々な症状を引き起こす又は症状を悪化させると報告されており、特に老化との関与が指摘されている。AGEsの例としては、例えばNε-カルボキシメチルリシン（CML）、Nε-カルボキシエチルリシン（CEL）、アルグピリミジン、ペントシジン（英語版）、ピラリン、クロスリン、GA-ピリジン、Nω-カルボキシメチルアルギニン（CMA）、フロイルフラニルイミダゾール、グルコスパン等多くの物質や、その中間体が知られている。
AGEsは体外、体内の双方で生じ得る。したがって、AGEsの体内での産生を抑制することは、多くの疾患の治療や予防に有用である。そして、従来より、抗糖化作用を有する化合物として、「アミノグアニジン」が知られている（例えば、特許文献１など）。「アミノグアニジン」は、糖化反応系の中間体と結合することにより、糖化反応の進行を抑制し、AGEs産生を抑制することが報告されている。しかし、臨床試験において貧血、肝障害およびビタミンB6欠乏症などの副作用を引き起こす可能性が指摘され、抗糖化作用を期待できる医薬品としての実用化には至っていない。
このような背景から、新規かつ安全性の高いAGE産生抑制剤（最終糖化産物産生抑制剤）の開発が切望されている。
そこで、本願発明は新規かつ安全性の高いAGE産生抑制剤（最終糖化産物産生抑制剤）を提供することを目的とする。
上記課題を解決するため、本発明者は、鋭意研究の結果、マンゴーの抽出物にAGE産生抑制効果を見いだした。また、さらに研究を進め、マンゴーの葉抽出物に含有されるbenzophenone C-glycoside（ベンゾフェノンのＣ配糖体）、3-Glucosyl-2,4,4',6-tetrahydroxybenzophenone及びchlorophyll（クロロフィル）にAGE産生抑制効果を見いだして、本発明を完成させた。
そこで、本発明は、マンゴーの抽出物を含有するAGEs産生抑制用組成物、AGEs産生抑制用剤、AGEs産生抑制用食品からなる。また、抽出物は、有機溶媒による抽出物であることが好適である。また、これらは、特定保健用食品や機能性表示食品など、AGEs産生を抑制する旨が表示されている場合を含む。さらに、マンゴーの有機溶媒による抽出物、さらには葉の有機溶媒による抽出物であることが好適である。なお、本願において「食品」は飲食料品や経口用サプリメントを広く含み、固体だけではなく液体及び飲料形態等も含む。
さらに、本発明は、benzophenone C-glycoside、3-glucosyl-2,4,4',6-tetrahydroxybenzophenone又はchlorophyllを有効成分とするAGEs産生抑制用組成物、AGEs産生抑制用剤、AGEs産生抑制用食品からなる。benzophenone C-glycoside はβ-グルコシド、α-グルコシドを含み、3-glucosyl-2,4,4',6-tetrahydroxybenzophenoneは、β-グルコシド、α-グルコシド、C-グルコシド、O-グルコシドを含む。好ましくは、3-C-β-D-glucosyl-2,4,4',6-tetrahydroxybenzophenoneを有効成分とする。また、当該食品は、特定保健用食品や機能性表示食品など、AGEs産生を抑制する旨が表示されている場合を含む。
マンゴー（Mangifera indica）は、ウルシ科マンゴー属の常緑高木の植物であり、古くから主として果実が食用とされている。本発明で使用するマンゴーは、アーウィン種、アルフォンソ種、カラバオ種など、ウルシ科マンゴー属のマンゴーが全て含まれる。本願で利用するマンゴーは、特定の部位に限られず「果肉」「果皮」「花」「種子」「葉」のいずれにおいてもAGEs産生抑制効果を有する。そして、植物部位における利用の優先性や採取量、採取効率、利用効率等を考慮すると、「葉」は好適である。本発明において「葉」は、所謂葉部分を意味し、葉身全体又はその一部を使用することができるが、葉茎など他部分を含んでいても良い。また、マンゴーは常緑樹ではあるが、成熟した緑色以外の若葉についてもAGEs産生抑制効果が認められたため、いずれの時期の葉についても使用することができる。
本願発明の抽出溶媒としては、有機溶媒を用いることが好適である（有機溶媒を含んだ混合溶媒も含む。）。有機溶媒は、典型的にはメタノールやエタノールが挙げられるが、アセトン、ジエチルエーテル、酢酸エチル、ヘキサンなど、公知の有機溶媒を広く含む。benzophenone C-glycoside 又は3-Glucosyl-2,4,4',6-tetrahydroxybenzophenoneを抽出する場合にはエタノール又はメタノール、クロロフィルを抽出する場合には酢酸エチルやヘキサンを使用すると効率が良い。抽出温度や時間などは特に限定されないが、数時間以上抽出することが好ましい。また、抽出溶媒がメタノールである場合、抽出温度はたとえば１０〜７０℃、さらには室温（２０℃）〜５０℃前後程度であると好ましい。
本願発明のマンゴーの抽出物を含有する組成物は、一般的な処理手段に従って製造することができる。例えば、洗浄し、乾燥及び粉砕したマンゴーを使用することができる。この処理済みのマンゴー（いずれの部位も可能である）を有機溶媒で抽出し、液体として、またはその液体を乾燥させて、必要であれば添加物等を加えて、錠剤、散剤、顆粒剤、液剤、カプセル剤などとして、所望の態様にて組成物とすることが可能である。したがって、本願において「組成物」は液体及び個体のいずれの形態も含み、食用及び薬剤用のいずれをも少なくとも含む概念である。
具体的な態様としては、マンゴーの抽出物を、例えばマンゴー葉抽出物を茶飲料などとして、または抽出物を菓子や他の飲料中に含有させて、AGEs産生抑制用の食品（AGEs産生抑制効果のある表示をした特定保険用食品や機能性表示食品、サプリメント、健康食品）として提供することなどが可能である。さらに、抽出物を粉末状・錠型状・カプセル状などとし、AGEs産生抑制剤（医薬・医薬部外品等の薬剤など）として提供することも可能である。なお、抽出物を粉末・錠型・カプセル等や、食品・薬剤等とする工程は、他の素材や添加物の追加工程を含め、本願発明の効果を奏する限り、公知の様々な手段を採用することができるものであり、特に限定はされない。
さらに、benzophenone C-glycoside 及び3-glucosyl-2,4,4',6-tetrahydroxybenzophenone （特に3-C-β-D-glucosyl-2,4,4',6-tetrahydroxybenzophenone）又はchlorophyllは、いずれもマンゴー（特にマンゴー葉）から取得することが可能である。3-C-β-D-glucosyl-2,4,4',6-tetrahydroxybenzophenoneが特に有効であることから、類似した生理活性（J. Agric. Food Chem. 2011, 59, 11526-11533）を持つベンゾフェノンのC-配糖体にも同様の効果が想定される。また、3-C-β-D-glucosyl-2,4,4',6-tetrahydroxybenzophenoneは、別名として、(3-β-D-glucopyranosyl-2,4,6-trihydroxyphenyl)(4-hydroxyphenyl)methanone、又はiriflophenone 3-C-β-glycosideと呼ばれることがある。
Chlorophyll（クロロフィル）は、葉緑素としてマンゴー葉に含まれる成分であるが、他の植物にも含まれる成分であり、chlorophyll単体としても市販されている。
本発明によれば、新規かつ安全性の高いAGE産生抑制剤（最終糖化産物産生抑制剤）を提供することが出来る。
アーウィン種マンゴーの葉（緑色葉）、果皮、種子、果肉および花エキス（抽出物）の取得
実験材料および被検体：実験材料は近畿大学附属農場湯浅農場にて栽培されているマンゴー（採取対象；250本、樹高；2 m、樹齢；18-26年）から採取したものを実験に供した。乾燥した実験材料をそれぞれクラッシュミルを用いて細切後、20倍量のメタノール（花のみ10倍量）に浸漬し、72時間室温抽出した。抽出溶媒は抽出を均一にさせるため24時間に1回数分程度撹拌し、合計72時間抽出を行った。抽出後、No.5 A濾紙（110 mm ADVANTEC）にて濾過し、残渣を除去した。得られたろ液を減圧下で溶媒を留去してエキスを得た。
なお、葉（緑色葉）、果皮、種子、果肉および花のエキス収率は、それぞれ23、23、6、63、23%であった。
実験材料および被検体：実験材料は近畿大学附属農場湯浅農場にて栽培されているマンゴー（採取対象；250本、樹高；2 m、樹齢；18-26年）から採取したものを実験に供した。乾燥した実験材料をそれぞれクラッシュミルを用いて細切後、20倍量のメタノール（花のみ10倍量）に浸漬し、72時間室温抽出した。抽出溶媒は抽出を均一にさせるため24時間に1回数分程度撹拌し、合計72時間抽出を行った。抽出後、No.5 A濾紙（110 mm ADVANTEC）にて濾過し、残渣を除去した。得られたろ液を減圧下で溶媒を留去してエキスを得た。
なお、葉（緑色葉）、果皮、種子、果肉および花のエキス収率は、それぞれ23、23、6、63、23%であった。
アーウィン種以外の品種（アルフォンソ種，エドワード種，トミーアトキンス種）のマンゴー葉（緑色葉）エキスの取得
いずれの葉（緑色葉）も近畿大学附属農場湯浅農場にて栽培されているマンゴーから採取したものを実験に供した。エキス収率は乾燥葉50 gに対して、上記アーウィン種葉と同じ抽出方法で取得した。エキス収率は、アルフォンソ種：16%、エドワード種：22%、トミーアトキンス種：20%であった。
いずれの葉（緑色葉）も近畿大学附属農場湯浅農場にて栽培されているマンゴーから採取したものを実験に供した。エキス収率は乾燥葉50 gに対して、上記アーウィン種葉と同じ抽出方法で取得した。エキス収率は、アルフォンソ種：16%、エドワード種：22%、トミーアトキンス種：20%であった。
AGE産生抑制試験
AGE産生抑制試験はShimodaらの方法に準じて行った。すなわち、被検体はDMSOに溶解した（DMSO最終濃度；10%）。2 mlチューブに被検液100μlおよび1/5M のリン酸緩衝液（PBS，pH 7.2）に溶解した10% D-glucoseと1% BSAの混合液900μlをそれぞれ加え，60℃，48時間インキュベートした溶液を黒色96wellプレートに移し，蛍光強度（励起波長 370nm/蛍光波長 460nm）をマルチラベルリーダー（PerkinElmer 2030 ARVO X4，PerkinElmer Life and Analytical Sciences）により測定した。混合液非添加群は混合液の代わりにPBSを用いた。AGE産生抑制率（%）は、以下の式により算出した。陽性対照薬としては、aminoguanidine hydrochloride（アミノグアニジン塩酸塩）を用いた。下記表１は、AGE産生を50%阻害するために必要な濃度（IC50値）である。
AGE産生抑制試験はShimodaらの方法に準じて行った。すなわち、被検体はDMSOに溶解した（DMSO最終濃度；10%）。2 mlチューブに被検液100μlおよび1/5M のリン酸緩衝液（PBS，pH 7.2）に溶解した10% D-glucoseと1% BSAの混合液900μlをそれぞれ加え，60℃，48時間インキュベートした溶液を黒色96wellプレートに移し，蛍光強度（励起波長 370nm/蛍光波長 460nm）をマルチラベルリーダー（PerkinElmer 2030 ARVO X4，PerkinElmer Life and Analytical Sciences）により測定した。混合液非添加群は混合液の代わりにPBSを用いた。AGE産生抑制率（%）は、以下の式により算出した。陽性対照薬としては、aminoguanidine hydrochloride（アミノグアニジン塩酸塩）を用いた。下記表１は、AGE産生を50%阻害するために必要な濃度（IC50値）である。
抑制率（%）＝1−（C−D）／（A−B）×100
A：混合液（glucoseとBSA）添加、DMSO添加群（60℃，48時間インキュベート）の測定値、
B：混合液添加、DMSO添加群（4℃，48時間インキュベート）の測定値、
C：混合液添加および被検液添加群の測定値、
D；混合液非添加，被検液添加群の測定値。
A：混合液（glucoseとBSA）添加、DMSO添加群（60℃，48時間インキュベート）の測定値、
B：混合液添加、DMSO添加群（4℃，48時間インキュベート）の測定値、
C：混合液添加および被検液添加群の測定値、
D；混合液非添加，被検液添加群の測定値。
以上の結果から、種・部位の相違にもかかわらず、マンゴーの果皮、種子、果肉、花、及び葉のいずれについても、顕著なAGE産生抑制作用を示した。これらのうち、種子や果皮も好適だが、採取量・採取効率や商用利用の優先度などを総合的に考慮すると、一般的に食用にされていない葉が最も実用的であると考えられる。そこで、葉について見ると、若い暗赤褐色葉エキス、若い黄色葉エキス、成熟した緑色葉のいずれも顕著なAGE産生抑制作用を示した。マンゴーは常緑果樹植物のため、同時期にこれら３種類の葉を収穫することができる利点がある。ただし、マンゴー葉は萌芽してからおよそ１ヶ月程度で成熟した緑色葉となるために、成熟した葉を使用することが実用的であると想定される。
そこで、活性を有し、かつ素材確保が容易な成熟した緑色の葉がAGE産生抑制作用を有する素材として有望であると考え、成熟した緑色の葉からAGE産生抑制作用を指標に有効成分を探索した。その結果、3-C-β-D-glucosyl- 2,4,4',6-tetrahydroxybenzophenoneおよびchlorophyllを有効成分のひとつとして同定した。
3-C-β-D-glucosyl-2,4,4',6-tetrahydroxybenzophenoneの単離とクロロフィルの同定、およびAGE産生抑制作用
葉エキス（緑色葉）を粗分画するため、葉エキスをオープンカラムクロマトグラフィーに供した。充填剤にはシリカゲル（Wakogel C-100, Wako）を使用した。試料（葉エキス；5.4g）に対して20倍量の充填剤を用意し、クロロホルムを用いて湿式充填法によりオープンカラムクロマト管（φφの充填剤を用意し）に充填した。次に、メタノール抽出物を10倍量の充填剤に吸着させるため、少量のメタノールに溶解し吸着用充填剤と混合した。メタノールを除くため、ロータリーエバポレーターを用い減圧留去した。乾燥後の充填剤をクロロホルムに懸濁しカラムに供した。溶出溶媒はオープンカラムクロマト管に充填した充填剤の体積に対して5倍量の溶媒を用い、クロロホルム：メタノール＝10：0 , 30：1, 10：1, 5：1, 0：10の順に溶出を行った。
葉エキス（緑色葉）を粗分画するため、葉エキスをオープンカラムクロマトグラフィーに供した。充填剤にはシリカゲル（Wakogel C-100, Wako）を使用した。試料（葉エキス；5.4g）に対して20倍量の充填剤を用意し、クロロホルムを用いて湿式充填法によりオープンカラムクロマト管（φφの充填剤を用意し）に充填した。次に、メタノール抽出物を10倍量の充填剤に吸着させるため、少量のメタノールに溶解し吸着用充填剤と混合した。メタノールを除くため、ロータリーエバポレーターを用い減圧留去した。乾燥後の充填剤をクロロホルムに懸濁しカラムに供した。溶出溶媒はオープンカラムクロマト管に充填した充填剤の体積に対して5倍量の溶媒を用い、クロロホルム：メタノール＝10：0 , 30：1, 10：1, 5：1, 0：10の順に溶出を行った。
はじめに溶出されたクロロホルム：メタノール＝10：0溶出画分（フラクションＩ）にAGE産生抑制作用が認められた。フラクションＩは深緑色を呈していたことから、葉の緑色素成分が含有することが推察された。葉の緑色素成分として知られるクロロフィルをPorraらの方法（1989）により測定した結果、葉エキス中に4.34 mg/g含有することが明らかとなったことから、下記の市販試薬（東京化成工業株式会社にて購入）を用いて評価したところ、クロロフィルにAGE産生抑制作用が認められた（IC50；41μg/ml）。このことから、葉エキスの有効成分のひとつであることが明らかとなった。
クロロホルム：メタノール＝30：1, 10：1, 5：1, 0：10溶出画分（フラクションII）にもAGE産生抑制作用が認められたことから、本画分を単離するため分取HPLCに供した。分取HPLC分析にはシステムにLC-10Aシステム、分取カラムには逆相系カラム(Inertsil ODS-3 JET Column 20×50mm, GL Sciences)を用い、カラムオーブンを40℃に設定し分析した。溶媒は15 %アセトニトリル水溶液を用い、流量は9.0ml/minで溶出した。検出はSPD-10A(SHIMADZU)を用いてUV 254nmの吸光度により行った。この条件において、3-C-β-D-glucosyl-2,4,4',6-tetrahydroxybenzophenoneは保持時間17分に溶出した。
3-C-β-D-Glucosyl-2,4,4',6-tetrahydroxybenzophenoneの同定は、Severiらの報告（2009）にある1Hおよび13C-NMR並びにマススペクトルに一致したことにより支持された。また、3-C-β-D-glucosyl-2,4,4',6-tetrahydroxybenzophenone含量は、205.9±7.6mg/gであった。
3-C-β-D-Glucosyl-2,4,4',6-tetrahydroxybenzophenoneの同定は、Severiらの報告（2009）にある1Hおよび13C-NMR並びにマススペクトルに一致したことにより支持された。また、3-C-β-D-glucosyl-2,4,4',6-tetrahydroxybenzophenone含量は、205.9±7.6mg/gであった。
この3-C-β-D-glucosyl-2,4,4',6-tetrahydroxybenzophenoneを上記と同様の方法で試験したところ、顕著なAGE産生抑制作用が認められた（表２：IC50；85 μg/ml）。3-C-β-D-glucosyl-2,4,4',6-tetrahydroxybenzophenoneに強い活性が認められることから、benzophenone C-glycosideのβ-グルコシド及び3-Glucosyl-2,4,4',6-tetrahydroxybenzophenoneのC-グルコシドだけでなく、類似する構成及び活性を有する3-glucosyl-2,4,4',6-tetrahydroxybenzophenoneのα-グルコシド及びO-グルコシド、benzophenone C-glycosideのα-グルコシドにも十分な活性があると想定される。また、植物中の採取可能収量と収集率、効果を考慮すれば、市場においてAGE産生抑制用組成物の十分な供給を行うことが可能である。
以上により、自然由来で新規かつ安全性が高く、実用性の高いAGE産生抑制剤を提供することが可能である。
Claims (2)
- AGEs産生抑制剤の製造のための、マンゴー葉から単離された、3-Glucosyl-2,4,4',6-tetrahydroxybenzophenoneの使用。
- 前記3-Glucosyl-2,4,4',6-tetrahydroxybenzophenoneが、3-C-β-D-Glucosyl-2,4,4',6-tetrahydroxybenzophenoneであることを特徴とする、請求項１の使用。
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- 2017-06-13 JP JP2017115595A patent/JP6980419B2/ja active Active
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