JP6977301B2 - Gene encoding mutant alkaline phosphatase - Google Patents
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Description
本発明は、遺伝子組換えアルカリホスファターゼを生産する方法に関する。 The present invention relates to a method for producing recombinant alkaline phosphatase.
アルカリホスファターゼは、抗原抗体反応などの検出系にホースラディッシュパーオキシダーゼと並んでよく利用される酵素である。種々の動物から単離されたアルカリホスファターゼの中で、ウシ小腸由来の酵素が比活性が高いことから主に使用されていた。また天然型のアルカリホスファターゼには高活性型（ＣＩＰＩＩ）と中活性型（ＣＩＰＩ）が存在することが知られているが、高活性なアルカリホスファターゼは子牛小腸からしか精製することができず、安定供給は課題の一つであった。 Alkaline phosphatase is an enzyme that is often used along with horseradish peroxidase in detection systems such as antigen-antibody reactions. Among the alkaline phosphatases isolated from various animals, the enzyme derived from bovine small intestine was mainly used because of its high specific activity. It is known that there are highly active (CIPII) and moderately active (CIPI) types of natural alkaline phosphatase, but highly active alkaline phosphatase can only be purified from the calf small intestine. Stable supply was one of the issues.
近年遺伝子工学技術を用い、ピキア酵母で高活性遺伝子組換えＡＬＰを生産する方法やＣＨＯ細胞で発現する方法が報告されている（特許文献１）。ピキア酵母で産業上利用できる程度の発現量は得られているが、天然型と比べて糖鎖の構造が同じでないなどの課題がのこる。 In recent years, a method for producing a highly active recombinant ALP in Pikia yeast and a method for expressing it in CHO cells have been reported using genetic engineering technology (Patent Document 1). Although the expression level of Pichia yeast has been obtained to be industrially usable, there are still problems such as the sugar chain structure is not the same as that of the natural type.
ピキア酵母で高活性アルカリホスファターゼを発現した報告例では、アルカリホスファターゼの４８７番目のアスパラギン酸までを発現させている（特許文献１）。また、ＣＨＯ細胞で発現させた報告例では４８０番目のアラニンまでを発現させている（特許文献２）。 In the reported example in which highly active alkaline phosphatase was expressed in Pikia yeast, up to the 487th aspartic acid of alkaline phosphatase was expressed (Patent Document 1). Moreover, in the reported example expressed in CHO cells, up to the 480th alanine is expressed (Patent Document 2).
天然型のアルカリホスファターゼ遺伝子の３’付近には、ＧＰＩアンカーをコードする配列が含まれている。つまり、天然型のアルカリホスファターゼ遺伝子全長を単純に遺伝子組み換え体として発現させた場合は、細胞膜上の膜たんぱく質として発現する。遺伝子組み換え体として発現させたアルカリホスファターゼを利用することを考えると、細胞から分泌発現させる方が、精製工程のことを考慮すると好ましい形態である。しかし、アルカリホスファターゼのどのアミノ酸をＣ末端にすれば、効率よい発現ができるかなどの情報はなかった。アルカリホスファターゼ遺伝子を短くしすぎると酵素活性が低下あるいは消失してしまい、長すぎるとＧＰＩアンカー領域を含むようになるため、アルカリホスファターゼが細胞膜上に残り、発現量の低下につながることが予想される。さらに、遺伝子組み換えタンパク質を高発現させるためには、できるだけ短いタンパク質として発現させる方がホスト細胞へのストレスが少なく発現量は向上する可能性もある。天然型から精製してきたアルカリホスファターゼを解析するとＣ末端は４８０番目のアミノ酸と報告されているが、遺伝子組み換え体として発現させる場合、天然型と同一部位が最適部位ではない可能性があり、どこが最適部位なのかは不明であった。また、ＣＩＰＩＩの全長遺伝子
はクローニングされておらず、シグナルペプチドの遺伝子配列と４８０番目以降の遺伝子
配列は不明であった。
A sequence encoding a GPI anchor is contained near 3'of the natural alkaline phosphatase gene. That is, when the full length of the natural alkaline phosphatase gene is simply expressed as a gene recombinant, it is expressed as a membrane protein on the cell membrane. Considering the use of alkaline phosphatase expressed as a genetically modified product, it is preferable to secrete and express it from cells in consideration of the purification step. However, there was no information on which amino acid of alkaline phosphatase should be used at the C-terminal for efficient expression. If the alkaline phosphatase gene is made too short, the enzyme activity will decrease or disappear, and if it is too long, it will contain the GPI anchor region, so it is expected that alkaline phosphatase will remain on the cell membrane and lead to a decrease in the expression level. .. Furthermore, in order to express the recombinant protein with high expression, it is possible that the expression as the shortest possible protein causes less stress on the host cells and the expression level may be improved. Analysis of alkaline phosphatase purified from the natural type reveals that the C-terminus is the 480th amino acid, but when expressed as a genetically modified product, the same site as the natural type may not be the optimal site, and which is the optimal site. It was unknown whether it was a site. Moreover, the full-length gene of CIPII was not cloned, and the gene sequence of the signal peptide and the gene sequence after the 480th position were unknown.
本発明の目的は、遺伝子組換えアルカリホスファターゼを動物細胞で高発現することが可能な遺伝子配列を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a gene sequence capable of highly expressing recombinant alkaline phosphatase in animal cells.
本発明者は上記課題について鋭意検討した結果、本発明に到達した。即ち本発明は以下のとおりである。
（１）変異型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子であって、下記（Ａ）又は（Ｂ）から選択される、遺伝子：
（Ａ）配列番号２に記載の遺伝子配列の５８〜１４８８番目に記載の遺伝子配列を含むことを特徴とする、変異型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子、
（Ｂ）配列番号２に記載の遺伝子配列の５８〜１４８８番目に記載の遺伝子配列と８０％以上の相同性を有する、変異型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子。
（２）変異型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子であって、下記（Ａ）又は（Ｂ）から選択される、遺伝子：
（Ａ）配列番号２に記載の遺伝子配列の５８〜１４９１番目に記載の遺伝子配列を含むことを特徴とする、変異型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子、
（Ｂ）配列番号２に記載の遺伝子配列の５８〜１４９１番目に記載の遺伝子配列と８０％以上の相同性を有する、変異型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子。
（３）変異型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子であって、下記（Ａ）又は（Ｂ）から選択される、遺伝子：
（Ａ）配列番号２に記載の遺伝子配列の５８〜１４９４番目に記載の遺伝子配列を含むことを特徴とする、変異型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子、
（Ｂ）配列番号２に記載の遺伝子配列の５８〜１４９４番目に記載の遺伝子配列と８０％以上の相同性を有する、変異型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子。
（４）（１）〜（３）いずれかに記載の遺伝子がコードするアミノ酸配列からなることを特徴とする、変異型アルカリホスファターゼ。
（５）（１）〜（３）いずれかに記載の遺伝子がコードするアミノ酸を発現させる工程を含むことを特徴とする、変異型アルカリホスファターゼの製造方法。
The present inventor has arrived at the present invention as a result of diligent studies on the above problems. That is, the present invention is as follows.
(1) A gene encoding a mutant alkaline phosphatase, which is selected from the following (A) or (B):
(A) A gene encoding a mutant alkaline phosphatase, which comprises the gene sequence set forth in positions 58 to 1488 of the gene sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
(B) A gene encoding a mutant alkaline phosphatase having 80% or more homology with the gene sequence set forth in positions 58 to 1488 of the gene sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
(2) A gene encoding a mutant alkaline phosphatase, which is selected from the following (A) or (B):
(A) A gene encoding a mutant alkaline phosphatase, which comprises the gene sequence set forth in positions 58 to 1491 of the gene sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
(B) A gene encoding a mutant alkaline phosphatase having 80% or more homology with the gene sequence set forth in positions 58 to 1491 of the gene sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
(3) A gene encoding a mutant alkaline phosphatase, which is selected from the following (A) or (B):
(A) A gene encoding a mutant alkaline phosphatase, which comprises the gene sequence set forth in positions 58 to 1494 of the gene sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
(B) A gene encoding a mutant alkaline phosphatase having 80% or more homology with the gene sequence set forth in positions 58 to 1494 of the gene sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
(4) A mutant alkaline phosphatase comprising the amino acid sequence encoded by the gene according to any one of (1) to (3).
(5) A method for producing a mutant alkaline phosphatase, which comprises a step of expressing an amino acid encoded by the gene according to any one of (1) to (3).
以下に本発明をさらに詳細に説明する。 The present invention will be described in more detail below.
変異型アルカリホスファターゼのアミノ酸配列１番目〜４８０番目までに相当する遺伝子配列は特許文献２に従い合成し、それ以降の遺伝子配列はＢｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、２９０、５０３；（１９９３）に記載されているＣＩＰＩのアミノ酸配列４８１番目以降に相当する遺伝子配列に従い合成し、−１９番目〜−１番目に相当するシグナルペプチドの配列もＣＩＰＩのシグナルペプチドのアミノ酸配列に相当する遺伝子配列に従い合成し、全５３３アミノ酸（ＣＩＰＩＩ−ＣＩＰＩ ｃｈｉｍｅｒａ ｐｒｏｔｅｉｎ）に相当する遺伝子（ＣＩＰＩＩ−ＣＩＰＩ ｃｈｉｍｅｒａ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を合成した。この遺伝子を鋳型として、Ｃ末端からアミノ酸を一個ずつ短くしていったものを発現させ、４７０番目のアミノ酸残基まで短くした変異体を作製した。変異体遺伝子の作製は通常行われている遺伝子組換え技術を利用することができる。
The gene sequences corresponding to the
上記各種変異体を遺伝子組み換えタンパク質として発現させるホスト・ベクター系や、その培養方法は特に限定されない。たとえば動物細胞用発現体として発現させるベクターとして、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０８、６７３；１９９０に示されるような発現ベクターを使い、ＣＨＯ細胞をホストとして用いることができる。また、ホストとして使用する動物細胞は、ＣＯＳ細胞、ミエローマ細胞、ＨＥＫ２９３細胞などを例示することができるが、それらに限定されるものではない。もちろん、付与される糖鎖の構造が天然型と異なっていたり、糖鎖欠損体であっても良い場合は、大腸菌や酵母、バチルスなどの細菌でも製造することは可能であり、無細胞タンパク質合成系で生産することも可能である。 The host vector system for expressing the above-mentioned various mutants as a recombinant protein and the culturing method thereof are not particularly limited. For example, as a vector to be expressed as an expressor for animal cells, J. Biochem. , 108, 673; CHO cells can be used as hosts using expression vectors as shown in 1990. The animal cells used as a host can include, but are not limited to, COS cells, myeloma cells, HEK293 cells, and the like. Of course, if the structure of the added sugar chain is different from that of the natural type, or if it may be a sugar chain deficiency, it can be produced by bacteria such as Escherichia coli, yeast, and Bacillus, and cell-free protein synthesis. It is also possible to produce in a system.
組換えアルカリホスファターゼを生産するための培養方法も、それぞれのホスト・ベクター系で最適な方法で培養すればよく、培養時間、溶存酸素濃度、ｐＨや各種培地成分をタンパク質の発現量が最適になるように調整することで生産することができる。 The culture method for producing recombinant alkaline phosphatase may be the optimum method for each host vector system, and the culture time, dissolved oxygen concentration, pH and various medium components are optimized for protein expression. It can be produced by adjusting the above.
また遺伝子組換えアルカリホスファターゼを生産するホスト細胞の作り方も特に限定されず、通常使用されているホスト・ベクターの組み合わせで発現細胞を作製することができる。 Further, the method for producing a host cell that produces recombinant alkaline phosphatase is not particularly limited, and an expression cell can be produced by a combination of a commonly used host vector.
［培養上清中の遺伝子組換えアルカリホスファターゼ量の測定］
培養上清中に発現した遺伝子組換えアルカリホスファターゼの定量系を構築した。２種類の抗アルカリホスファターゼ抗体（ＡＰＡ０５．３、ＡＰＡ０３．２）を用い培養上清中のアルカリホスファターゼの検出を行った。今回は上記に示す２種類のモノクローナル抗体を使用したが、本抗体に限定されるものではなく、他のモノクローナル抗体やポリクローナル抗体を用いることも可能である。まず、ＡＰＡ０５．３をＥＬＩＳＡプレートに固定化し、スキムミルクでブロッキングした後、遺伝子組み換え体として発現したアルカリホスファターゼを含む培養上清を反応させた。この時に培養上清中の遺伝子組換えアルカリホスファターゼが固相の抗体に捕捉される。その後、ホースラディッシュパーオキシダーゼで標識したＡＰＡ０３．２を反応させ、十分に洗浄後、固相に結合したＨＲＰ量を検出することで、培養上清中に存在していた遺伝子組換えアルカリホスファターゼの量を比較した。
[Measurement of recombinant alkaline phosphatase in culture supernatant]
A quantitative system for recombinant alkaline phosphatase expressed in the culture supernatant was constructed. Alkaline phosphatase was detected in the culture supernatant using two types of anti-alkaline phosphatase antibodies (APA05.3., APA03.2). This time, the two types of monoclonal antibodies shown above were used, but the present invention is not limited to this antibody, and other monoclonal antibodies and polyclonal antibodies can also be used. First, APA05.3 was immobilized on an ELISA plate, blocked with skim milk, and then reacted with a culture supernatant containing alkaline phosphatase expressed as a genetically modified product. At this time, the recombinant alkaline phosphatase in the culture supernatant is captured by the solid-phase antibody. Then, APA03.2 labeled with horseradish peroxidase was reacted, and after thorough washing, the amount of HRP bound to the solid phase was detected to detect the amount of recombinant alkaline phosphatase present in the culture supernatant. Was compared.
［培養上清中の遺伝子組換えアルカリホスファターゼ活性の測定］
ＡＰＡ０５．３をＥＬＩＳＡプレートに固定化し、スキムミルクでブロッキングした後、遺伝子組み換え体として発現したアルカリホスファターゼを含む培養上清を反応させた。この時に培養上清中の遺伝子組換えアルカリホスファターゼが固相の抗体に捕捉される。その後十分に洗浄したのちに、アルカリホスファターゼの酵素活性を測定した。
[Measurement of recombinant alkaline phosphatase activity in culture supernatant]
APA05.3 was immobilized on an ELISA plate, blocked with skim milk, and then reacted with a culture supernatant containing alkaline phosphatase expressed as a recombinant. At this time, the recombinant alkaline phosphatase in the culture supernatant is captured by the solid-phase antibody. After thorough washing, the enzymatic activity of alkaline phosphatase was measured.
［比活性の比較］
前述した方法で、培養上清中に存在するアルカリホスファターゼの量とアルカリホスファターゼの活性を測定することで、酵素の比活性を比較することができる。ここでは横軸にアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を、縦軸にＡＬＰ量を取る（図１）。ＡＬＰの比活性が同じであれば、斜めのライン上にプロットされるが、比活性が向上しているのであれば斜めの線から右側にシフトし、比活性が低下しているのであれば、左にシフトすることとなる。
[Comparison of specific activity]
By measuring the amount of alkaline phosphatase present in the culture supernatant and the activity of alkaline phosphatase by the method described above, the specific activity of the enzyme can be compared. Here, the horizontal axis represents alkaline phosphatase (ALP) activity, and the vertical axis represents the amount of ALP (FIG. 1). If the specific activity of ALP is the same, it is plotted on the diagonal line, but if the specific activity is improved, it shifts from the diagonal line to the right side, and if the specific activity is decreased, it is plotted. It will shift to the left.
今回の培養上清を上記方法で評価した。なお、データーのばらつきを考慮して、それぞれ５点ずつ測定しプロットした（図２〜６）。その結果、各種変異体のデーターをプロットしたが、すべて同じ傾きの直線状に並んだことから、今回作製した変異型アルカリホスファターゼは、Ｃ末端の切断位置により比活性は変化しないことが示された。 The culture supernatant of this time was evaluated by the above method. In consideration of the variation in the data, 5 points were measured and plotted (FIGS. 2 to 6). As a result, the data of various mutants were plotted, and all of them were arranged in a straight line with the same slope, indicating that the specific activity of the mutant alkaline phosphatase prepared this time does not change depending on the C-terminal cleavage position. ..
［発現量の比較］
全５１４アミノ酸を発現したアルカリホスファターゼから、Ｃ末端をＮ末端側に向かって短くしてゆくに従い、培養上清中の活性が増加してゆく傾向にあることが分かった。発現量は、Ｃ末端のアミノ酸番号が５１４番目から４７７番目までは少しずつ増加してゆき、それ以上短くすると急激に発現量が低下することが分かった。培養上清中の活性がなくなる原因として考えられることは、タンパクとして発現しているが活性が無くなった場合と、タンパク質として発現すらしなくなる場合が考えられる。今回培養上清中の酵素活性が消失している培養上清を解析すると、培養上清中にアルカリホスファターゼ自体が存在していないことが明らかとなった。これらのことから、４７７アミノ酸より短くなるとタンパク質として発現できなくなることが分かった。遺伝子組換え体として動物細胞で発現させる場合は、４７７番目以上のアミノ酸が必要である。よって、１〜４７７番目のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列、即ち配列番号２に記載の遺伝子配列の５８〜１４８８番目の遺伝子配列が、今回の変異体を作製するためには必須であり、更に配列番号２に記載の遺伝子配列の５８〜１４９１番目の遺伝子（アミノ酸配列１〜４７８番目に相当）又は５８〜１４９４番目の遺伝子（アミノ酸配列１〜４７９番目に相当）であってもよい。また、上記配列（配列番号２に記載の遺伝子配列の５８〜１４８８番目の遺伝子配列、５８〜１４９１番目の遺伝子配列、又は５８〜１４９４番目の遺伝子配列）と相同性を有する相同遺伝子も使用することができる。ここで、相同性とは、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。
[Comparison of expression level]
From the alkaline phosphatase expressing all 514 amino acids, it was found that the activity in the culture supernatant tends to increase as the C-terminal is shortened toward the N-terminal side. It was found that the expression level gradually increased from the 514th to the 477th amino acid number at the C-terminal, and that the expression level decreased sharply when the amino acid number was shortened further. The cause of the loss of activity in the culture supernatant may be the case where it is expressed as a protein but the activity is lost, or the case where it is not even expressed as a protein. Analysis of the culture supernatant in which the enzyme activity in the culture supernatant has disappeared revealed that alkaline phosphatase itself was not present in the culture supernatant. From these facts, it was found that when it is shorter than 477 amino acids, it cannot be expressed as a protein. When expressed in animal cells as a genetically modified organism, the 477th or higher amino acid is required. Therefore, the gene sequence encoding the amino acid sequence of
本発明で示した配列を使用することで、高活性アルカリホスファターゼを効率よく生産することができる。 By using the sequence shown in the present invention, highly active alkaline phosphatase can be efficiently produced.
［実施例１］ キメラ遺伝子と各種変異体をコードする遺伝子の作製
特許文献２に示されたＣＩＰＩＩの配列とＢｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、２９０、５０３；（１９９３）に記載されているＣＩＰＩの配列から、ＣＩＰＩＩとＣＩＰＩのキメラタンパク質（ＣＩＰＩＩ−ＣＩＰＩ ｃｈｉｍｅｒａ ｐｒｏｔｅｉｎ、配列番号１）を設計し、それをコードする遺伝子（ＣＩＰＩＩ−ＣＩＰＩ ｃｈｉｍｅｒａ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ、配列番号２）を合成した。配列番号１にはシグナルペプチドに相当する１９アミノ酸（配列番号１の−１９〜−１位）を含むため、分泌発現した際は配列番号１の１位のアミノ酸のＬがタンパク質のＮ末端となる。つまり、分泌発現した際の４８０番目のアミノ酸であるＡは、配列番号１では４８０番目のＡとなり、そこまではＣＩＰＩＩの配列であり、それより後の配列はＣＩＰＩの配列であり、全長５１４個のアミノ酸配列とした。なお、配列番号２のＣ末端は終止コドンを含んでいる。この配列を、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０８、６７３；１９９０の中で使用されているｐＥＣＥ−ｄｈｆｒベクターに導入した。そのベクターをＡＬＰの全長を発現する発現ベクターとした（ＡＬＰ−５１４）。
[Example 1] Preparation of a gene encoding a chimeric gene and various mutants The sequence of CIPII shown in
その後、ＡＬＰ−５１４を鋳型として用い、ＫＯＤ−ＰＬＵＳ−ＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ（東洋紡績社製）により、終止コドンの上流のアミノ酸を順次欠失させた変異体を作製した。それぞれの変異体の名前は（ＡＬＰ−数字）で示し、発現したタンパク質のＮ末端のＬを１とした時の、Ｃ末端のアミノ酸番号を記載した。 Then, using ALP-514 as a template, a mutant in which the amino acid upstream of the stop codon was sequentially deleted was prepared by KOD-PLUS-Mutagenesis Kit (manufactured by Toyobo Co., Ltd.). The name of each mutant is indicated by (ALP-number), and the amino acid number at the C-terminal is described when the L at the N-terminal of the expressed protein is 1.
［実施例２］一過性発現による各種変異体の発現
定法により各種変異体がクローニングされたプラスミドを精製し、ＣＨＯ−Ｋ１細胞にリポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用い、取扱説明書に従い遺伝子を導入した。遺伝子を導入してから３日後に培養上清を回収し、以下の実験に使用した。なお実験のばらつきを考慮して、遺伝子導入は一つのプラスミドに対して同じ条件で５点行い、その後それぞれの培養上清を、実施例３と実施例４に示す方法で解析し、図２から６にプロットした。つまり、一つの変異体につき５点のデーターをプロットしている。
[Example 2] Expression of various mutants by transient expression A plasmid in which various mutants have been cloned is purified by a conventional method, and Lipofectamine 2000 (manufactured by Invitrogen) is used for CHO-K1 cells according to the instruction manual. The gene was introduced. The culture supernatant was collected 3 days after the gene was introduced and used in the following experiments. In consideration of the variation in the experiment, gene transfer was performed for one plasmid at 5 points under the same conditions, and then the respective culture supernatants were analyzed by the methods shown in Examples 3 and 4, from FIG. Plotted at 6. That is, 5 points of data are plotted for each mutant.
［実施例３］ＥＬＩＳＡによる、培養上清中に発現したアルカリホスファターゼ量の比較
ウシ小腸より精製したアルカリホスファターゼを免疫抗原として、定法によりウシ小腸由来アルカリホスファターゼ認識抗体を単離した。それらの中から、ウシ小腸アルカリホスファターゼの異なるエピトープを認識し、サンドイッチアッセイが構築できる２種類の抗体（ＡＰＡ０５．３、ＡＰＡ０３．２）を使用した。固相化用緩衝液（１２ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３、３８ｍＭ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）で、抗アルカリホスファターゼ抗体（ＡＰＡ０５．３）を１μｇ／ｍｌとなるように希釈し、１００マイクロリットルを９６ウエルのＥＬＩＳＡプレートに添加した。これを１時間室温でインキュベートし、ＡＰＡ０５．３をＥＬＩＳＡプレートに固相化した。該ＥＬＩＳＡプレートを洗浄用緩衝液（２０ｍＭ トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した後、１％スキムミルクを含むＰＢＳを添加し、１時間室温でインキュベートすることで該ＥＬＩＳＡプレートをブロッキングした。その後、実施例２で作製した各種変異体が発現した培養上清を、０．１％スキムミルクを含むＰＢＳで１０倍希釈したものを添加し一時間反応させた。洗浄用緩衝液で洗浄後、ＨＲＰ標識した抗アルカリホスファターゼ抗体（ＡＰＡ０３．２）を１，０００倍希釈したものを、１時間反応させた。ＨＲＰ標識は、同仁化学社製のＨＲＰ標識試薬（ＬＫ−１１）を説明書通りに使用した。室温で１時間反応させた後，該ＥＬＩＳＡプレートを洗浄用緩衝液で３回洗浄し、ＳｕｒｅＢｌｕｅ／ＴＭＢ（セラケア ライフサイエンシーズ社製）を添加し、説明書通りに反応させ、該ＥＬＩＳＡプレートの吸光度（４５０ｎｍ）をプレートリーダーで測定した。
[Example 3] Comparison of the amount of alkaline phosphatase expressed in the culture supernatant by ELISA An alkaline phosphatase-recognizing antibody derived from bovine small intestine was isolated by a conventional method using alkaline phosphatase purified from bovine small intestine as an immune antigen. Among them, two types of antibodies (APA05.3 and APA03.2) capable of recognizing different epitopes of bovine small intestinal alkaline phosphatase and constructing a sandwich assay were used. Dilute the anti-alkaline phosphatase antibody (APA05.3) to 1 μg / ml with immobilization buffer (12 mM Na 2 CO 3 , 38 mM NaHCO 3, pH 9.6) and add 100 microliters to 96 wells. Added to the ELISA plate. This was incubated for 1 hour at room temperature and APA05.3 was immobilized on an ELISA plate. The ELISA plate was washed 3 times with wash buffer (20 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethane, 150 mM sodium chloride, 0.1% Tween 20), then PBS containing 1% skim milk was added and incubated for 1 hour at room temperature. This blocked the ELISA plate. Then, the culture supernatant expressing the various mutants prepared in Example 2 was diluted 10-fold with PBS containing 0.1% skim milk and reacted for 1 hour. After washing with a washing buffer, a 1,000-fold diluted HRP-labeled anti-alkaline phosphatase antibody (APA03.2) was reacted for 1 hour. For the HRP label, an HRP labeling reagent (LK-11) manufactured by Dojin Chemical Co., Ltd. was used as instructed. After reacting at room temperature for 1 hour, the ELISA plate was washed 3 times with a washing buffer, SureBlue / TMB (manufactured by Ceracare Life Sciences) was added, and the reaction was performed according to the instructions. (450 nm) was measured with a plate reader.
［実施例４］ＥＬＩＳＡによる、培養上清中に発現したアルカリホスファターゼ活性の比較
固相化用緩衝液（１２ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３、３８ｍＭ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）で、抗アルカリホスファターゼ抗体（ＡＰＡ０５．３）を１μｇ／ｍｌとなるように希釈し、１００マイクロリットルを９６ウエルのＥＬＩＳＡプレートに添加した。これを１時間室温でインキュベートし、ＡＰＡ０５．３をＥＬＩＳＡプレートに固相化した。該ＥＬＩＳＡプレートを洗浄用緩衝液（２０ｍＭ トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した後、１％スキムミルクを含むＰＢＳを添加し、１時間室温でインキュベートすることで該ＥＬＩＳＡプレートをブロッキングした。その後、実施例２で作製した各種変異体が発現した培養上清を、０．１％スキムミルクを含むＰＢＳで１０倍希釈したものを添加し一時間反応させた。
[Example 4] According to ELISA, comparing immobilization buffer of the expressed alkaline phosphatase activity in the culture supernatant (12mM Na 2 CO 3, 38mM NaHCO 3, pH9.6) , the anti-alkaline phosphatase antibody (APA05. 3) was diluted to 1 μg / ml and 100 microliters were added to a 96-well ELISA plate. This was incubated for 1 hour at room temperature and APA05.3 was immobilized on an ELISA plate. The ELISA plate was washed 3 times with wash buffer (20 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethane, 150 mM sodium chloride, 0.1% Tween 20), then PBS containing 1% skim milk was added and incubated for 1 hour at room temperature. This blocked the ELISA plate. Then, the culture supernatant expressing the various mutants prepared in Example 2 was diluted 10-fold with PBS containing 0.1% skim milk and reacted for 1 hour.
洗浄用緩衝液で洗浄後、４−ＭＵＰ溶液（１Ｍ ジエタノールアミン、０．５ｍＭ 塩化マグネシウム、１ｍＭ ４−メチルウンベリフェリルりん酸（４−ＭＵＰ））を添加し、３０分間室温でインキュベートした。該ＥＬＩＳＡプレートの蛍光強度（励起波長３６０ｎｍ、発光波長４６５ｎｍ）をプレートリーダーで測定した。 After washing with a washing buffer, a 4-MUP solution (1M diethanolamine, 0.5 mM magnesium chloride, 1 mM 4-methylumbelliferyl phosphate (4-MUP)) was added, and the mixture was incubated at room temperature for 30 minutes. The fluorescence intensity of the ELISA plate (excitation wavelength 360 nm, emission wavelength 465 nm) was measured with a plate reader.
［実施例５］変異体の比活性の相関性
実施例３で得られた値を縦軸に、実施例４で得られた値を横軸にグラフ上にプロットした。たとえば図２では、１０種類の変異体をそれぞれ５クローンずつ実施例３と４の方法で測定した結果をプロットしたものである。なお、実験日が変わると縦軸と横軸の値が多少変化し、傾きが変化するため図間の直接の比較はできない。そのため、それぞれのグラフ間で共通のクローンを複数測定することで、すべてのクローンでの相関性を考察した。
[Example 5] Correlation of specific activity of mutants The values obtained in Example 3 are plotted on the vertical axis and the values obtained in Example 4 are plotted on the horizontal axis. For example, FIG. 2 is a plot of the results of measuring 5 clones of each of 10 types of mutants by the methods of Examples 3 and 4. When the experiment date changes, the values on the vertical and horizontal axes change slightly, and the slope changes, so direct comparison between figures is not possible. Therefore, we considered the correlation among all clones by measuring multiple clones that are common to each graph.
図２から図６に示すグラフで、ＡＬＰ−５１１、ＡＬＰ−５０９，ＡＬＰ−５０６〜４７０のデーターをプロットしている。各種変異体の５点のプロットは、ほぼ同一の部分にプロットされていることから、実験誤差は少ないことがわかる。さらに、変異体間の関係も、それぞれのグラフで一直線上に並んでおり、相関性が高くプロットされていることから、各種変異体間の比活性の差はないと判断できた。 The graphs shown in FIGS. 2 to 6 plot the data of ALP-511, ALP-509, and ALP-506 to 470. Since the plots of 5 points of various mutants are plotted in almost the same part, it can be seen that the experimental error is small. Furthermore, the relationships between the mutants were also aligned in a straight line in each graph, and the correlation was highly plotted. Therefore, it was judged that there was no difference in the specific activity between the various mutants.
［実施例６］変異体の発現量の比較
すべての変異体のプラスミドを２６０ｎｍの吸光度を測定することにより定量し、９６ウエルプレートで生育した同数のＣＨＯ細胞に実施例２で示す方法で導入した。その後、実施例４に示す方法で、培養上清中の活性を測定した。その結果をまとめて図７に示した。なお複数のデーターがプロットされているクローンもある。横軸は、変異体のＣ末端のアミノ酸番号を示し、縦軸は得られた蛍光強度を示す。このグラフから、アミノ酸番号５１４番目から４７７番目までは培養上清中のＡＬＰ活性が増加してゆくが、４７６番目まで短くすると急激に活性が低下してしまい、更に短くするとほとんど活性が見られなくなってしまう事が明らかとなった。さらに、図４でも明らかなように、４７０番台前半のクローンは、発現量も低下していることが明らかとなった。つまり活性の低下は、酵素活性部位への影響ではなく、そもそもタンパク質として発現できていないことによることが明確となった。
[Example 6] Comparison of expression levels of mutants All mutant plasmids were quantified by measuring the absorbance at 260 nm and introduced into the same number of CHO cells grown on 96-well plates by the method shown in Example 2. .. Then, the activity in the culture supernatant was measured by the method shown in Example 4. The results are summarized in FIG. 7. Some clones have multiple data plotted. The horizontal axis shows the amino acid number of the C-terminal of the mutant, and the vertical axis shows the obtained fluorescence intensity. From this graph, the ALP activity in the culture supernatant increases from the 514th to the 477th amino acid numbers, but when it is shortened to the 476th, the activity decreases sharply, and when it is further shortened, almost no activity is observed. It became clear that it would end up. Furthermore, as is clear from FIG. 4, it was revealed that the expression level of the clones in the first half of the 470 series was also decreased. In other words, it was clarified that the decrease in activity was not due to the effect on the active site of the enzyme, but to the fact that it could not be expressed as a protein in the first place.
［実施例７］
実施例４では、培養上清中に発現したアルカリホスファターゼの活性を、抗アルカリホスファターゼ抗体（ＡＰＡ０５．３）で捕捉して測定した。ここで使用した抗体のエピトープが、変異体を作製する際にアミノ酸を欠失させた領域ではない事の確認を行った。ＡＬＰ−４７０、４７５、４８０、４８５、４９０の変異体遺伝子を、実施例２に示す方法でＣＨＯ−Ｋ１細胞に導入し、培養上清を回収した。培養上清を、実施例４に示す方法で活性を測定した結果を図８の右側に示した。このグラフは、抗アルカリホスファターゼ抗体で固相に捕捉したアルカリホスファターゼの活性を示している。
[Example 7]
In Example 4, the activity of alkaline phosphatase expressed in the culture supernatant was measured by capturing it with an anti-alkaline phosphatase antibody (APA05.3). It was confirmed that the epitope of the antibody used here was not the region in which the amino acid was deleted when the mutant was prepared. The mutant genes of ALP-470, 475, 480, 485, and 490 were introduced into CHO-K1 cells by the method shown in Example 2, and the culture supernatant was collected. The results of measuring the activity of the culture supernatant by the method shown in Example 4 are shown on the right side of FIG. This graph shows the activity of alkaline phosphatase captured in the solid phase with an anti-alkaline phosphatase antibody.
それとは別に、培養上清をＰＢＳで１０倍希釈した溶液１０マイクロリットルを、４−ＭＵＰ溶液（１Ｍ ジエタノールアミン、０．５ｍＭ 塩化マグネシウム、１ｍＭ ４−ＭＵＰ）９０マイクロリットルに添加し、３０分間室温でインキュベートしたのちに、蛍光強度（励起波長３６０ｎｍ、発光波長４６５ｎｍ）をプレートリーダーで測定した結果を図８の左側に示した。このグラフは、培養上清中に発現したアルカリホスファターゼ活性を示している。 Separately, 10 microliters of a 10-fold diluted culture supernatant with PBS was added to 90 microliters of a 4-MUP solution (1 M diethanolamine, 0.5 mM magnesium chloride, 1 mM 4-MUP) at room temperature for 30 minutes. After incubating, the results of measuring the fluorescence intensity (excitation wavelength 360 nm, emission wavelength 465 nm) with a plate reader are shown on the left side of FIG. This graph shows the alkaline phosphatase activity expressed in the culture supernatant.
両グラフが同じような傾向を示していることから、抗アルカリホスファターゼの捕捉に使った抗体の認識部位は、変異導入部位にはないことが確認された。
［実施例８］変異体の精製
ＡＬＰ−４７９の発現ベクターを常法によりラットミエローマＹＢ２／０に導入し、安定生産クローンＡＬＰ−４７９（ＹＢ２／０）を得た。その後本細胞を、内径１５０ｍｍの細胞培養用ディッシュの１０％子牛胎児血清（ＦＢＳ）を含むＥ−ＲＤＦ培地（極東製薬） ３０ｍｌに継代し１０日間培養した。培養液を４℃、２５００ｒｐｍ、２０分間遠心して細胞を除き、培養上清を回収した。
Since both graphs show similar tendencies, it was confirmed that the recognition site of the antibody used to capture the anti-alkaline phosphatase was not at the mutation introduction site.
[Example 8] Purification of mutant ALP-479 expression vector was introduced into rat myeloma YB2 / 0 by a conventional method to obtain a stable production clone ALP-479 (YB2 / 0). Then, the cells were subcultured in 30 ml of E-RDF medium (Far East Pharmaceutical Co., Ltd.) containing 10% fetal bovine serum (FBS) in a cell culture dish having an inner diameter of 150 mm and cultured for 10 days. The culture broth was centrifuged at 4 ° C. and 2500 rpm for 20 minutes to remove cells, and the culture supernatant was collected.
培養上清２００ｍｌに硫酸アンモニウムを５５％飽和となるよう添加し、４℃で０．５時間放置、その後４℃、８０００ｒｐｍ、２０分の遠心分離により、沈殿画分として硫安塩析物を得た。沈殿画分をＰＢＳで溶解し、硫酸アンモニウム濃度を１Ｍとした後、Ｐｈｅｎｙｌ−５ＰＷカラム（７．５ｍｍ×７．５ｃｍ、東ソー株式会社）を接続した高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて分離した。Ｐｈｅｎｙｌ−５ＰＷカラムカラムクロマトグラフィーは、１Ｍ硫酸アンモニウムを含むＰＢＳを平衡化緩衝液とし、流速１ｍｌ／分の硫安濃度１Ｍから０Ｍまでの６０分のリニアグラジエント溶出を行った。そのときのクロマトグラムを図９に示す。 Ammonium sulfate was added to 200 ml of the culture supernatant so as to be 55% saturated, left at 4 ° C. for 0.5 hours, and then centrifuged at 4 ° C. at 8000 rpm for 20 minutes to obtain a ammonium sulfate salted out product as a precipitate fraction. The precipitate fraction was dissolved in PBS to adjust the ammonium sulfate concentration to 1 M, and then separated by high performance liquid chromatography (HPLC) connected to a Phenyl-5PW column (7.5 mm × 7.5 cm, Tosoh Corporation). In Phenyl-5PW column column chromatography, PBS containing 1 M ammonium sulfate was used as an equilibration buffer, and linear gradient elution was performed for 60 minutes from a ammonium sulfate concentration of 1 M to 0 M at a flow rate of 1 ml / min. The chromatogram at that time is shown in FIG.
各溶出フラクションを分取し、パラニトロフェニルフォスフェート（ＰＮＰＰ）を基質とする０．１Ｍグリシン緩衝液ｐＨ９．６におけるＡＬＰの活性測定を行った。それにより、ＡＬＰの溶出位置を確認、即ちＡＬＰ活性があった範囲を図９中に下線で示した。 Each elution fraction was fractionated, and the activity of ALP in 0.1 M glycine buffer pH 9.6 using paranitrophenyl phosphate (PNPP) as a substrate was measured. As a result, the elution position of ALP was confirmed, that is, the range in which ALP activity was present is underlined in FIG.
上記活性があった範囲からフラクション１２〜１５を回収し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５（分画分子量３０ＫＤａ、４℃ ５０００ｒｐｍ×１０分）で遠心膜濃縮し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５緩衝液で平衡化させた。その後、同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−５ＰＷ（７．５ｍｍ×７．５ｃｍ、東ソー株式会社）に供給した後、塩化ナトリウム濃度を０Ｍから０．５Ｍまでの６０分のリニアグラジエント溶出を行なった。１分ごとにフラクションを試験管に分取し、各溶出フラクションにつき２８０ｎｍの吸光度（Ａ２８０）とＰＮＰＰ法による活性（Ａ４０５）を測定した。結果を図１０に示す。この結果得られた比活性（Ａ４０５／Ａ２８０）の高いフラクションに、高純度のＡＬＰが含まれる。前記比活性の高い、フラクションＮｏ．１７および１８を回収し、該フラクションにアジ化ナトリウムを０．１％、ＭｇＣｌ２を１ｍＭ、ＺｎＣｌ２を０．０１ｍＭとなるように添加した。タンパク質濃度は、１ｍｇ／ｍｌのＡＬＰのＡ２８０の吸光度を０．７６としたとき、０．８ｍｇ／ｍｌであった。
［実施例９］精製した変異体の純度と比活性の確認
精製した変異体の純度を確認するために、常法に従いＳＤＳ−ＰＡＧＥにより純度を確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのコントロールとして、市販の高活性ウシ小腸アルカリフォスファターゼＡＬＰＩ−１３Ｇ（Ｌｏｔ １７０６ＡＡ、Ｂｉｏｚｙｍｅ社）も同時に泳動した。この結果から、両者とも純度は９８％以上と見積もれた（図１１）。
Fractions 12-15 were recovered from the above active range, concentrated in a centrifuge membrane at Amazon Ultra-15 (molecular weight cut off 30 kDa, 4 ° C. 5000 rpm x 10 minutes), and equilibrated with 20 mM Tris-HCl pH 7.5 buffer. I let you. Then, after feeding to DEAE-5PW (7.5 mm × 7.5 cm, Tosoh Corporation) equilibrated with the same buffer, linear gradient elution of sodium chloride concentration from 0 M to 0.5 M was performed for 60 minutes. .. Fractions were dispensed into test tubes every minute and the absorbance at 280 nm (A280) and activity by the PNPP method (A405) were measured for each eluted fraction. The results are shown in FIG. The high fraction with high specific activity (A405 / A280) obtained as a result contains high-purity ALP. Fraction No. with high specific activity. 17 and 18 were recovered, and sodium azide was added to the fraction to 0.1%, MgCl2 to 1 mM, and ZnCl2 to 0.01 mM. The protein concentration was 0.8 mg / ml when the absorbance of A280 of 1 mg / ml ALP was 0.76.
[Example 9] Confirmation of purity and specific activity of the purified mutant In order to confirm the purity of the purified mutant, the purity was confirmed by SDS-PAGE according to a conventional method. As a control of SDS-PAGE, a commercially available highly active bovine small intestinal alkaline phosphatase ALPI-13G (Lot 1706AA, Biozyme) was also electrophoresed at the same time. From this result, the purity of both was estimated to be 98% or more (Fig. 11).
両ＡＬＰの比活性をＰＮＰＰ法にて比較したところ、Ａ２８０をベースとした蛋白質量あたりの活性としてＡＬＰＩ−１３Ｇの９６％を示し、十分高い活性を有することが確認された。 When the specific activities of both ALPs were compared by the PNPP method, 96% of ALPI-13G was shown as the activity per protein mass based on A280, and it was confirmed that the activity was sufficiently high.
Claims (5)
配列番号２に記載の遺伝子配列の５８〜１４８８番目に記載の遺伝子配列からなることを特徴とする、変異型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子。 A gene encoding the mutant alkaline phosphatase,
Characterized by comprising the gene sequence described in 58-1488 th gene sequence depicted in SEQ ID NO: 2, encoding a mutant alkaline phosphatase gene.
配列番号２に記載の遺伝子配列の５８〜１４９１番目に記載の遺伝子配列からなることを特徴とする、変異型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子。 A gene encoding the mutant alkaline phosphatase,
Characterized by comprising the gene sequence described in 58-1491 th gene sequence depicted in SEQ ID NO: 2, encoding a mutant alkaline phosphatase gene.
配列番号２に記載の遺伝子配列の５８〜１４９４番目に記載の遺伝子配列からなることを特徴とする、変異型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子。 A gene encoding the mutant alkaline phosphatase,
Characterized by comprising the gene sequence described in 58-1494 th gene sequence depicted in SEQ ID NO: 2, encoding a mutant alkaline phosphatase gene.
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