JP2020043814A - Alkaline phosphatases with no activity - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、無活性アルカリホスファターゼの作製方法とそれを使用した測定系に関する。 The present invention relates to a method for producing inactive alkaline phosphatase and a measurement system using the same.
アルカリホスファターゼは、抗原・抗体反応などの検出系にホースラディッシュパーオキシダーゼと並んでよく利用される酵素である。従来は動物の臓器から精製されたアルカリホスファターゼが利用されていたが、ロット間差などがあり均一な性能の物を入手することが難しかった。それらの課題を解決するために、遺伝子工学技術を用い、ピキア酵母で高活性遺伝子組換えＡＬＰを生産する方法（特許文献１）、ＣＨＯ細胞で発現する方法が報告されている（特許文献２）。 Alkaline phosphatase is an enzyme commonly used along with horseradish peroxidase in detection systems such as antigen-antibody reactions. Conventionally, alkaline phosphatase purified from animal organs has been used, but it has been difficult to obtain a product having uniform performance due to differences between lots. In order to solve these problems, a method for producing highly active recombinant ALP in Pichia yeast using genetic engineering technology (Patent Document 1) and a method for expressing it in CHO cells have been reported (Patent Document 2). .
ところで、ＥＬＩＳＡを構築する際に問題となる課題の一つが、ＥＬＩＳＡを構成する各種材料の水不溶性担体への非特異的吸着である。解決方法として、ウシ血清アルブミンやスキムミルクなど反応に直接関与しない物質を共存させることで低減できる場合が多いが、非特異的吸着を十分に抑えられない場合がある。そのような場合には次のような解決方法が採用される場合がある。例えばアルカリホスファターゼ自体の非特異的吸着が起こっている場合は、活性を消失させたアルカリホスファターゼを反応系に添加しておくことで、活性を有したアルカリホスファターゼの非特異的吸着を抑えることができる。そのような目的で使用するアルカリホスファターゼは、活性を有したアルカリホスファターゼと全く同じ構造を有している事が好ましい。 Incidentally, one of the problems to be solved when constructing an ELISA is non-specific adsorption of various materials constituting the ELISA to a water-insoluble carrier. As a solution, it can be often reduced by coexisting a substance not directly involved in the reaction, such as bovine serum albumin or skim milk, but non-specific adsorption may not be sufficiently suppressed. In such a case, the following solution may be adopted. For example, when non-specific adsorption of alkaline phosphatase itself is occurring, non-specific adsorption of active alkaline phosphatase can be suppressed by adding alkaline phosphatase whose activity has been eliminated to the reaction system. . The alkaline phosphatase used for such a purpose preferably has exactly the same structure as the active alkaline phosphatase.
これまでに、ピキア酵母で作製したアルカリホスファターゼの非特異的吸着を防止するために、無活性アルカリホスファターゼの作製を発現し測定系に利用する方法が報告されている。本発明では、動物細胞で作製したアルカリホスファターゼと同一の構造を有する、活性を消失させたアルカリホスファターゼ、および、非特異的吸着を低減させた測定系に関する。 So far, a method has been reported in which the production of inactive alkaline phosphatase is expressed and used in a measurement system in order to prevent nonspecific adsorption of alkaline phosphatase produced by Pichia yeast. The present invention relates to alkaline phosphatase having the same structure as alkaline phosphatase produced in animal cells and having lost activity, and a measurement system having reduced non-specific adsorption.
無活性アルカリホスファターゼを作製する方法は活性に関与するアミノ酸を他のアミノ酸に変異させる方法が採用できる。例えば非特許論文１によると、金属を配位しているアミノ酸に変異を導入することで、酵素活性が低下するとの報告がされている。また、特許論文３には、活性残基である９２番目のセリンをアラニン、グリシン、バリン、ロイシンに置換することで活性が低下化する報告がされている。しかしながら、それ以外の変異体やアミノ酸を欠失させた場合にどうなるかについては開示されていなかった。 As a method for producing inactive alkaline phosphatase, a method in which an amino acid involved in activity is mutated to another amino acid can be adopted. For example, Non-Patent Document 1 reports that introduction of a mutation into an amino acid that coordinates a metal reduces enzyme activity. Further, Patent Document 3 reports that the activity is reduced by substituting the active residue serine at position 92 with alanine, glycine, valine, or leucine. However, it did not disclose what would happen if other mutants or amino acids were deleted.
本発明の目的は、遺伝子組換え技術を用いて動物細胞で作製したアルカリホスファターゼの非特異的吸着を防止するために利用できる、無活性アルカリホスファターゼを提供することにある。 An object of the present invention is to provide an inactive alkaline phosphatase that can be used for preventing nonspecific adsorption of alkaline phosphatase produced in animal cells using a genetic recombination technique.
本発明者は上記課題について鋭意検討した結果、本発明に到達した。即ち本発明は以下の態様を包含する。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列の９２番目のアミノ酸であるセリンを欠失させるか、別のアミノ酸に置換したアミノ酸配列を含み、野生型のアルカリホスファターゼと比較して活性が低下した無活性アルカリホスファターゼ。
（２）前記別のアミノ酸が、アスパラギン酸またはイソロイシンである、（１）に記載の無活性アルカリホスファターゼ。
（３）（１）または（２）に記載の無活性アルカリホスファターゼの突然変異体を作製する方法。
（４）（１）または（２）に記載の無活性アルカリホスファターゼを免疫測定系に添加して、アルカリホスファターゼの非特異的吸着を低減させることを特徴とする測定系。
The inventor of the present invention has earnestly studied the above-mentioned problems, and has reached the present invention. That is, the present invention includes the following embodiments.
(1) It contains an amino acid sequence in which serine which is the 92nd amino acid of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 has been deleted or substituted with another amino acid, and has an activity lower than that of wild-type alkaline phosphatase Active alkaline phosphatase.
(2) The inactive alkaline phosphatase according to (1), wherein the another amino acid is aspartic acid or isoleucine.
(3) A method for producing a mutant of the inactive alkaline phosphatase according to (1) or (2).
(4) A measurement system characterized by adding the inactive alkaline phosphatase according to (1) or (2) to an immunoassay system to reduce nonspecific adsorption of alkaline phosphatase.
以下に本発明をさらに詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
アルカリホスファターゼの非特異的吸着に起因するバックグラウンドの向上を抑えるためには、測定系で使用しているアルカリホスファターゼと同様な構造を有しているが、活性だけが消失した無活性アルカリホスファターゼを添加することが有効である。そのためには、活性型アルカリホスファターゼと同じホスト−ベクター系で作製した、無活性アルカリホスファターゼを添加することが好ましい。 In order to suppress the background improvement due to non-specific adsorption of alkaline phosphatase, an inactive alkaline phosphatase having the same structure as the alkaline phosphatase used in the measurement system, but having lost only the activity, is used. It is effective to add. For that purpose, it is preferable to add an inactive alkaline phosphatase prepared in the same host-vector system as the activated alkaline phosphatase.
なお「活性が消失した」「無活性」とは、本明細書中においては、野生型のアルカリホスファターゼと比較して活性が１０００分の１以下であることを意味し、１５００分の１以下が好ましく、２０００分の１以下がより好ましい。 In addition, "the activity has disappeared" and "inactivity" in this specification mean that the activity is 1/1000 or less as compared with that of wild-type alkaline phosphatase, and 1/500 or less. It is preferably at most 1/2000 or less.
特許文献４に記載されている変異型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子を用いた製造方法と同じホスト−ベクター系を用い、９２番目のセリンを欠失させたもの、イソロイシンに置換したもの、アスパラギン酸に置換したものを、アラニンに置換したものを作製した。変異の導入方法は、特殊な作業は必要なく、一般的に知られている方法で行えばよい。 Using the same host-vector system as the production method using the gene encoding the mutant alkaline phosphatase described in Patent Document 4, the one in which the 92nd serine is deleted, the one in which isoleucine is substituted, the one in which aspartic acid is used The substituted product was replaced with alanine. The method for introducing the mutation does not require any special operation, and may be performed by a generally known method.
さらに本特許では４８０番目のアミノ酸までをコードしたアルカリホスファターゼ遺伝子を使用したが、それに限定されるものではない。 Further, in this patent, an alkaline phosphatase gene encoding up to the 480th amino acid was used, but the present invention is not limited thereto.
本特許では、発現させたアルカリホスファターゼの検出を容易にするために、上記アルカリホスファターゼのＣ末端に特許文献５に開示されているタグペプチド（ＣＫＶＬＲＲＨ）を連結させたアルカリホスファターゼを作製したが、無活性アルカリホスファターゼを生産する場合は、本タグペプチドは除去することは可能である。 In this patent, in order to facilitate detection of the expressed alkaline phosphatase, an alkaline phosphatase was prepared in which the tag peptide (CKVLRRRH) disclosed in Patent Document 5 was linked to the C-terminal of the alkaline phosphatase. When producing active alkaline phosphatase, the present tag peptide can be removed.
上記各種変異体を遺伝子組み換えタンパク質として発現させるホスト・ベクター系や、その培養方法は特に限定されない。たとえば動物細胞用発現体として発現させるベクターとして、非特許文献２に示された発現ベクターを使い、ＣＨＯ細胞をホストとして用いることができる。また、ホストとして使用する動物細胞は、ＣＯＳ細胞、ミエローマ細胞、ＨＥＫ２９３細胞などを例示することができるが、それらに限定されるものではない。もちろん、付与される糖鎖の構造が天然型と異なったり、糖鎖欠損体であってもよい場合は、大腸菌や酵母、バチルスなどの細菌でも製造することは可能であり、無細胞タンパク質合成系で生産することも可能である。ただし、活性型アルカリホスファターゼを発現させたホスト−ベクター系と同じ組み合わせを使用することが、糖鎖の付与のされ方などの、翻訳後修飾が同一となるため特に好ましい。 The host-vector system for expressing the above-mentioned various mutants as a recombinant protein and the culture method thereof are not particularly limited. For example, as a vector to be expressed as an animal cell expression body, an expression vector described in Non-Patent Document 2 can be used, and CHO cells can be used as a host. In addition, animal cells used as a host include, but are not limited to, COS cells, myeloma cells, HEK293 cells, and the like. Of course, when the structure of the sugar chain to be provided is different from the natural type or may be a sugar chain-deficient body, it can be produced even by a bacterium such as Escherichia coli, yeast, or Bacillus. It is also possible to produce with. However, it is particularly preferable to use the same combination as that of the host-vector system in which active alkaline phosphatase is expressed, since the post-translational modification such as the manner of imparting a sugar chain becomes the same.
組換えアルカリホスファターゼを生産するための培養方法は、それぞれのホスト・ベクター系で最適な方法で培養すればよく、培養時間、溶存酸素濃度、ｐＨや各種培地成分をタンパク質の発現量が最適になるように調整することで生産することができる。 The cultivation method for producing recombinant alkaline phosphatase should be cultivation by the optimal method in each host vector system, and the cultivation time, dissolved oxygen concentration, pH, and the expression amount of various media components will be optimized. It can be produced by adjusting as follows.
本発明で示した無活性アルカリホスファターゼを使用することで、アルカリホスファターゼの非特異的な吸着を低減することができる。 By using the inactive alkaline phosphatase shown in the present invention, non-specific adsorption of alkaline phosphatase can be reduced.
［実施例１］ タグ配列付のアルカリホスファターゼ遺伝子および変異体遺伝子の作製
特許文献４に示されたアルカリホスファターゼの遺伝子の４８０番目のアミノ酸までをコードする遺伝子配列を、非特許文献２で使用されているｐＥＣＥ−ｄｈｆｒベクターに導入した。そのベクターをＡＬＰ―４８０とした。
Example 1 Preparation of Alkaline Phosphatase Gene and Mutant Gene with Tag Sequence The gene sequence encoding up to the 480th amino acid of the alkaline phosphatase gene shown in Patent Document 4 was used in Non-patent Document 2. Into the pECE-dhfr vector. The vector was designated as ALP-480.
その後、ＡＬＰ−４８０を鋳型として用い、ＫＯＤ−ＰＬＵＳ−ＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ（東洋紡績社製）により、アルカリホスファターゼの活性残基である９２番目のセリンの変異体を作製した。それぞれの変異体の名前は、９２番目のセリンを欠失させたものをＳ９２ｄ、イソロイシンに置換したものをＳ９２Ｉ、アスパラギン酸に置換したものをＳ９２Ｄ、アラニンに置換したものをＳ９２Ａで示した。 Thereafter, using ALP-480 as a template, a mutant of serine at position 92, which is an active residue of alkaline phosphatase, was prepared by KOD-PLUS-Mutagenesis Kit (manufactured by Toyobo Co., Ltd.). The names of the mutants are shown as S92d when serine at position 92 is deleted, S92I when it is substituted with isoleucine, S92D when it is substituted with aspartic acid, and S92A when it is substituted with alanine.
［実施例２］一過性発現による各種変異体の発現
実施例１で得られた発現ベクターを、ＣＨＯ−Ｋ１細胞にリポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用い、取扱説明書に従い遺伝子を導入した。遺伝子を導入してから３日後に培養上清を回収し、以下の実験に使用した。
[Example 2] Expression of various mutants by transient expression The expression vector obtained in Example 1 was introduced into CHO-K1 cells using Lipofectamine 2000 (manufactured by Invitrogen) to introduce genes according to the instruction manual. did. Three days after the gene was introduced, the culture supernatant was collected and used for the following experiments.
［実施例３］培養上清中に発現したアルカリホスファターゼ活性の比較
アミコンウルトラ０．５ｍｌ（３０Ｋ）（ミリポア社製）を用いることで、培養上清を１０倍に濃縮した。濃縮した溶液１０マイクロリットルを、４−ＭＵＰ溶液（１Ｍ ジエタノールアミン、０．５ｍＭ 塩化マグネシウム、１ｍＭ ４−ＭＵＰ）９０マイクロリットルに添加し、３０分間室温でインキュベートしたのちに、蛍光強度（励起波長３６０ｎｍ、発光波長４６５ｎｍ）をプレートリーダーで測定した。得られた結果を図１に示し、縦軸のスケールを拡大したものを図２に示した。図中Ｐｏｓｉは変異を導入していないＡＬＰ−４８０を細胞に導入した培養上清、Ｎｅｇａは、トランスフェクションを行う際に遺伝子を導入しなかった培養上清（ネガティブコントロール）の、ＰＢＳは培養上清の代わりにＰＢＳを使用した結果である。以上の結果から、今回作製したアルカリホスファターゼの活性は、ネガティブコントロールと同程度のシグナルしか得られていなかった。
Example 3 Comparison of Alkaline Phosphatase Activity Expressed in Culture Supernatant The culture supernatant was concentrated 10-fold by using Amicon Ultra 0.5 ml (30K) (Millipore). 10 microliters of the concentrated solution was added to 90 microliters of a 4-MUP solution (1 M diethanolamine, 0.5 mM magnesium chloride, 1 mM 4-MUP) and incubated for 30 minutes at room temperature, and then the fluorescence intensity (excitation wavelength: 360 nm, Emission wavelength 465 nm) was measured with a plate reader. The obtained result is shown in FIG. 1, and the scale on the vertical axis is enlarged in FIG. In the figure, Posi is a culture supernatant in which ALP-480 without mutation was introduced into cells, Nega is a culture supernatant in which no gene was introduced during transfection (negative control), and PBS was a culture supernatant. This is the result of using PBS instead of Qing. From the above results, the activity of the alkaline phosphatase prepared this time only showed a signal equivalent to that of the negative control.
［実施例４］変異を導入していないアルカリホスファターゼに対する変異体の活性見積もり
変異体の活性とネガティブコントロールとの差は、Ｓ９２Ａ，Ｓ９２Ｄ，Ｓ９２Ｉ、Ｓ９２ｄそれぞれ、１４、１、９、４となった。変異を導入していないアルカリホスファターゼの活性とネガティブコントロールとの差は３７，７５５であるため、変異体の活性は、変異を導入していないアルカリホスファターゼの活性と比較して、Ｓ９２Ａ，Ｓ９２Ｄ，Ｓ９２Ｉ、Ｓ９２ｄそれぞれ、２，６９７分の１、３７，７５５分の１、４，１９５分の１、９，４３９分の１であった。
[Example 4] Estimation of activity of mutant against alkaline phosphatase into which no mutation was introduced The difference between the activity of the mutant and the negative control was 14, 1, 9, and 4, respectively, for S92A, S92D, S92I, and S92d. . Since the difference between the activity of the alkaline phosphatase not introducing the mutation and the negative control is 37,755, the activity of the mutant is higher than that of the alkaline phosphatase not introducing the mutation in comparison with the activities of S92A, S92D, S92I. , S92d were 1/2697, 1 / 37,755, 4,1 / 195, and 9,439, respectively.
［実施例５］ウエスタンブロッティング法による、培養上清中に発現したアルカリホスファターゼの確認
培養上清中に含まれるアルカリホスファターゼを、ウエスタンブロッティング法で確認した。まず培養上清７マイクロリットルを、定法に従い、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行いＰＶＤＦ膜に転写した。転写後のＰＶＤＦ膜を、５％スキムミルクを含むＴＢＳ中で、４℃で一晩放置することによりブロッキングした。その後、定法でアルカリホスファターゼ標識したタグペプチドを認識する抗体（特許文献５中に記載のＢＣ２３−１１）を、０．５ｕｇ／ｍｌとなるように５％スキムミルクを含むＴＢＳで希釈した溶液と室温で２時間反応した。その後、ＰＶＤＦ膜をＴＢＳ−Ｔで４回洗浄し、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（ロシュ社製、１１６８１４５１００１）で発色させた。その結果、変異体は変異を導入していないＡＬＰ−４８０と同程度の量は培養上清中に発現していることが確認された。
[Example 5] Confirmation of alkaline phosphatase expressed in culture supernatant by western blotting method Alkaline phosphatase contained in the culture supernatant was confirmed by western blotting method. First, 7 microliters of the culture supernatant was subjected to 5% polyacrylamide gel electrophoresis according to a standard method and transferred to a PVDF membrane. The PVDF membrane after the transfer was blocked by leaving it at 4 ° C. overnight in TBS containing 5% skim milk. Thereafter, an antibody (BC23-11 described in Patent Literature 5) recognizing a tag peptide labeled with alkaline phosphatase by a conventional method was diluted with a solution diluted with TBS containing 5% skim milk to a concentration of 0.5 ug / ml at room temperature. The reaction was performed for 2 hours. Thereafter, the PVDF membrane was washed four times with TBS-T and developed with NBT / BCIP (11681451001 manufactured by Roche). As a result, it was confirmed that the mutant was expressed in the culture supernatant in the same amount as ALP-480 in which no mutation was introduced.
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