JP6970458B2 - アプタマー及びその使用 - Google Patents

Description

本発明は、アプタマー及びその使用に関する。より詳細には、本発明は、アプタマー、Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ １（ＦＧＦＲ１）シグナリング関連疾患の予防又は治療剤、細胞培養用組成物、細胞培養方法、Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ ２（ｂＦＧＦ）とＦＧＦＲ１との結合阻害方法、細胞の増殖抑制方法、ＦＧＦＲ１の活性化方法、細胞の増殖促進方法、及び、多能性幹細胞の多能性維持方法に関する。本願は、２０１７年１１月１１日に、米国に仮出願された米国特許第６２／５８４，７５５号明細書に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。

受容体シグナリングでは、細胞が細胞膜上の受容体でリガンドを受容すると、細胞内にシグナルが伝達され、細胞の分化や増殖等が制御されることが知られている。シグナル分子の受容により、細胞は周囲の環境や状況を検知できる。

線維芽細胞増殖因子（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ，ＦＧＦ）は増殖因子のひとつであり、チロシンキナーゼ型受容体を活性化して、細胞増殖や細胞分化の過程において重要な役割を果たしている（例えば、非特許文献１を参照）。なかでも、ｂＦＧＦは、ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ（ｉＰＳ細胞）等の多能性幹細胞を、その多能性と自己複製能を維持した状態で培養するために培地に添加される重要な因子の１つである。

Lemmon, M. A. and Schlessinger, J. Cell Signaling by Receptor Tyrosine Kinases. Cell 141, 1117-1134，2010.

しかしながら、ｂＦＧＦの製造には、動物細胞又は微生物を用いた発現系を利用する必要がある。このため、ｂＦＧＦは高価なものとなっている。また、リコンビナントタンパク質は、品質管理が煩雑である。そこで、ｂＦＧＦの機能を模倣することができる合成代替物の開発が求められている。このような背景のもと、本発明は、ｂＦＧＦの活性をアプタマーで模倣する技術を提供することを目的とする。

本発明は、以下の態様を含む。
［１］配列番号１に記載の塩基配列を含み、Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ １（ＦＧＦＲ１）に結合する活性を有するポリヌクレオチドからなる、アプタマー。
［２］配列番号１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドが少なくとも一部を形成するループ構造を有する、［１］に記載のアプタマー。
［３］前記ループ構造が塩基数２８〜４０のポリヌクレオチド鎖からなる、［２］に記載のアプタマー。
［４］前記ループ構造に連結する２本鎖ポリヌクレオチドからなるステム構造を有する、［２］又は［３］に記載のアプタマー。
［５］グアニン四重鎖構造を形成する、［１］〜［４］のいずれかに記載のアプタマー。
［６］［１］〜［５］のいずれかに記載のアプタマーが２つ以上連結された、ＦＧＦＲ１に結合してＦＧＦＲ１を活性化する活性を有する、アプタマー。
［７］［１］〜［５］のいずれかに記載のアプタマーがリンカーで連結され、前記リンカーの長さがポリヌクレオチド換算で８０塩基以下の長さである、［６］に記載のアプタマー。
［８］配列番号１１に記載の塩基配列、又は配列番号１１に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり且つＦＧＦＲ１に結合してＦＧＦＲ１を活性化する活性を有する、［６］又は［７］に記載のアプタマー。
［９］［１］〜［８］のいずれかに記載のアプタマーを有効成分として含有する、ＦＧＦＲ１シグナリング関連疾患の予防又は治療剤。
［１０］［１］〜［８］のいずれかに記載のアプタマーを有効成分として含有する、細胞培養用組成物。
［１１］［１］〜［８］のいずれかに記載のアプタマーを含む培地で、ＦＧＦＲ１陽性細胞を培養することを含む、細胞培養方法。
［１２］［１］〜［５］のいずれかに記載のアプタマーを、ＦＧＦＲ１陽性細胞と接触させることを含む、ｂＦＧＦと前記ＦＧＦＲ１との結合阻害方法。
［１３］［１］〜［５］のいずれかに記載のアプタマーを、ＦＧＦＲ１陽性細胞と接触させることを含む、前記細胞の増殖抑制方法。
［１４］［６］〜［８］のいずれかに記載のアプタマーを、ＦＧＦＲ１陽性細胞と接触させることを含む、前記ＦＧＦＲ１の活性化方法。
［１５］［６］〜［８］のいずれかに記載のアプタマーを、ＦＧＦＲ１陽性細胞と接触させることを含む、前記細胞の増殖促進方法。
［１６］［６］〜［８］のいずれかに記載のアプタマーを、ＦＧＦＲ１陽性多能性幹細胞と接触させることを含む、前記多能性幹細胞の多能性維持方法。

本発明によれば、ｂＦＧＦの活性をアプタマーで模倣する技術を提供することができる。

アプタマーの例を示す模式図である。 マルチ構造アプタマーの例を示す模式図である。 マルチ構造アプタマーの例を示す模式図である。 マルチ構造アプタマーの例を示す模式図である。 マルチ構造アプタマーの例を示す模式図である。 （ａ）及び（ｂ）は、リンカーが２本鎖ＤＮＡであるアプタマーの一例を示す模式図である。 複数のリンカーを含むマルチ構造アプタマーの一例を示す模式図である。 （ａ）及び（ｂ）は、アプタマー固定担体の一例を示す模式的である。 実験例２において、アプタマーの立体構造を解析した結果を示す模式図である。 実験例２において、アプタマーとＦＧＦＲ１−Ｆｃビーズとの結合を解析した結果を示すグラフである。 実験例３の結果を示す写真である。 （ａ）は、実験例４におけるフローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例４におけるＳＰＲ解析の結果を示すグラフである。 実験例５におけるフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。 （ａ）及び（ｂ）は、実験例６におけるＣＤスペクトル測定の結果を示すグラフである。 実験例７におけるＣＤスペクトル測定の結果を示すグラフである。 （ａ）及び（ｂ）は実験例８におけるフローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。 実験例９におけるＣＤスペクトル測定の結果を示すグラフである。 （ａ）は、実験例１０においてアプタマーの構造を予測した結果を示す図である。（ｂ）及び（ｃ）は、実験例１０においてＦＧＦＲ１の活性化を解析した結果を示す写真である。 実験例１１においてＦＧＦＲ１の活性化を解析した結果を示す写真である。 （ａ）は、実験例１２において、Ｏｃｔ−４及びＮａｎｏｇの発現量を、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）により解析した結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例１２において、細胞増殖を測定した結果を示すグラフである。 実験例１３における蛍光免疫染色の結果を示す写真である。 （ａ）及び（ｂ）は、実験例１４において作製したアプタマーの構造を示す模式図である。 （ａ）は、実験例１５において、ＦＧＦＲ１のリン酸化を測定した結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例１５において、Ｅｒｋ１／２のリン酸化を測定した結果を示す写真である。 （ａ）は、実験例１６において、ＳＳＥＡ−４タンパク質の発現を解析した結果を示すグラフである。（ｂ）は、（ａ）の結果を数値化したグラフである。

［アプタマー］
１実施形態において、本発明は、配列番号１に記載の塩基配列を含み、ＦＧＦＲ１に結合する活性を有するポリヌクレオチドからなる、アプタマーを提供する。

アプタマーとは、標的分子に結合可能な分子であり、核酸やペプチドからなるアプタマーが知られている。本実施形態のアプタマーは、ＦＧＦＲ１に結合する核酸アプタマーである。本実施形態のアプタマーは、ＦＧＦＲ１に結合して、ｂＦＧＦとＦＧＦＲ１との結合を阻害することが好ましい。

なお、ヒトＦＧＦＲ１タンパク質には複数のアイソフォームが存在し、ＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＰ＿０５６９３４．２、ＮＰ＿００１１６７５３４．１、ＮＰ＿００１３４１２９７．１、ＮＰ＿００１１６７５３７．１、ＮＰ＿００１３４１２９９．１等である。本実施形態のアプタマーが結合するＦＧＦＲ１としては、なかでもＮＣＢＩアクセッション番号がＮＰ＿０５６９３４．２であるＦＧＦＲ１が好ましい。

また、ヒトｂＦＧＦタンパク質にも複数のアイソフォームが存在し、ＮＣＢＩアクセッション番号はＮＰ＿００１３４８５９４．１、ＮＰ＿００１９９７．５等である。本実施形態のアプタマーがＦＧＦＲ１との結合を阻害するｂＦＧＦとしては、なかでもＮＣＢＩアクセッション番号がＮＰ＿００１３４８５９４．１であるｂＦＧＦが好ましい。

本明細書において、核酸は、ＤＮＡやＲＮＡ等の天然の核酸であってもよく、ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）やＢＮＡ（ｂｒｉｄｇｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）等の人工核酸であってもよく、核酸と同等の機能を有するものであれば、ＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）等のペプチド核酸に代表される核酸類縁体であってもよい。アプタマーを構成する核酸は、ＤＮＡとＬＮＡの組合せ等、複数種の核酸を組合せることが可能である。

ＦＧＦ受容体は、ＦＧＦと結合可能なタンパク質であり、ＦＧＦ受容体としては、受容体型チロシンキナーゼの一種のＦＧＦＲ１〜４が知られている。受容体型チロシンキナーゼは、細胞膜貫通型のタンパク質として知られ、細胞外側にリガンド結合ドメインを有し、細胞質側に細胞内ドメインを有する。リガンド結合ドメインはリガンドと結合可能である。細胞内ドメインは、キナーゼ活性を有する。

受容体型チロシンキナーゼは、リガンドの結合によって２量体を形成することが知られている。２量体が形成されると、２量体の細胞内ドメインのチロシン残基が互いにリン酸化される。本実施形態のアプタマーが結合するＦＧＦＲ１は、単量体であってもよく、２量体以上の複合体であってもよい。

図１に１実施形態に係るアプタマーの模式図を示す。アプタマー１は、ポリヌクレオチドからなり、配列番号１に示される塩基配列を含むポリヌクレオチド１０である。

実施例において後述するように、発明者らは、ＦＧＦＲ１への結合能を有するアプタマーをスクリーニングした。その結果、配列番号１に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチドが、ＦＧＦＲ１への結合能を有することを見出した。配列番号１に記載の塩基配列は、スクリーニングにより得られた、ＦＧＦＲ１への結合能を有する数十種類のアプタマーのコンセンサス配列である。

配列番号１に記載の塩基配列（５’−ｋｙｗｔｇｇｈｗｋｄｇｇａｔｇｇｙｒｋｇｇｋｙｔ−３’）において、ｋはｇ（グアニン）又はｔ（チミン）を表し、ｙはｃ（シトシン）又はｔ（チミン）を表し、ｗはａ（アデニン）又はｔ（チミン）を表し、ｄはａ（アデニン）、ｇ（グアニン）又はｔ（チミン）を表し、ｈはａ（アデニン）、ｃ（シトシン）又はｔ（チミン）を表す。また、配列番号１に記載の塩基配列は、任意の位置の塩基が１若しくは数個の挿入又は欠失したものであってもよい。ここで、１若しくは数個とは、１〜３個であってもよく、１〜２個であってもよく、１個であってもよい。

より具体的には、例えば、５’側から２番目の「ｙ」が欠失していてもよい。あるいは、５’側から８番目の「ｗ」が欠失していてもよい。あるいは、５’側から１７番目の「ｙ」と１８番目の「ｒ」との間に１塩基の挿入があってもよい。

更に具体的には、配列番号１に記載の塩基配列は、以下の配列番号２４〜３５のいずれかに記載の塩基配列であってもよい。実施例において後述するように、配列番号２４〜３５に記載の塩基配列を含むヌクレオチドは、配列番号１に示すコンセンサス配列を有するヌクレオチドであり、ＦＧＦＲ１に結合する活性を有することが確認されたものである。

5’-ttatggctggggatggtgtgggtt-3’（配列番号２４）
5’-ttatggcaggggatggtgtgggtt-3’（配列番号２５）
5’-gtttggtgtggatggcaggggct-3’（配列番号２６）
5’-ttatggtgtggatggctatgggct-3’（配列番号２７）
5’-ttatggtgtggatggctggggttt-3’（配列番号２８）
5’-tcatggtgtggatggcaggggct-3’（配列番号２９）
5’-ttttggtgtggatggcaggggcg-3’（配列番号３０）
5’-ttatggtgtggatggcaggggct-3’（配列番号３１）
5’-tatggtgtggatggcaggggct-3’（配列番号３２）
5’-tcatggagtggatggcaggggtt-3’（配列番号３３）
5’-tcatggtgtggatggcaggggtt-3’（配列番号３４）
5’-ttatggttaggatggtgtggttt-3’（配列番号３５）

本実施形態のアプタマーの塩基数は、例えば、２８〜４８塩基であってもよく、３３〜４３塩基であってもよく、３８塩基であってもよい。

本実施形態のアプタマーは、配列番号１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドが少なくとも一部を形成するループ構造を有することが好ましい。実施例において後述するように、配列番号１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドが少なくとも一部を形成するループ構造を有するアプタマーは、ＦＧＦＲ１に対する結合能が高い傾向にある。

本明細書中において、ループ構造とは、鎖状の化合物の１か所以上が互いに結合して形成された環状の構造をいう。例えば、ループ構造は、１本鎖核酸において、１組以上の相補的な塩基同士が塩基対を形成して形成された環状の構造であってもよい。ループ構造は、配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドが一部を形成していてもよく、配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドのみから形成されていてもよい。ループ構造を形成するための結合の手段は、塩基対の形成によるものに限られず、例えば、核酸の５’末端と３’末端とのライゲーションによるものや、その他任意の架橋構造によるものであってもよい。

配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドがループ構造の一部を形成している場合、ループ構造の残分は、アプタマーがＦＧＦＲ１に結合する活性を有する限りいかなる塩基配列を有していてもよい。

ループ構造の塩基数は、例えば、２８〜４０塩基であってもよく、２８〜３５塩基であってもよく、２８〜３０塩基であってもよい。

図１に示すように、アプタマー２は、ポリヌクレオチドからなり、配列番号１に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド１０が、少なくとも一部を形成するループ構造２０を有する。

本実施形態のアプタマーは、前記ループ構造に連結する２本鎖ポリヌクレオチドからなるステム構造を有することが好ましい。実施例において後述するように、上述したループ構造に連結する２本鎖ポリヌクレオチドからなるステム構造を有するアプタマーは、ＦＧＦＲ１に対する結合能が更に高い傾向にある。

本明細書中において、ステム構造とは、鎖状の化合物の２か所以上が互いに結合して形成された鎖状の構造をいう。例えば、ステム構造は、１本鎖核酸において、１組以上の相補的な塩基同士が塩基対を形成して形成された鎖状の構造であってもよい。ステム構造を形成するための結合の手段は、塩基対の形成によるものに限られず、その他任意の架橋構造によるものであってもよい。

ループ構造にステム構造が連結する形態は特に限定されず、ループ構造及びステム構造が一続きのポリヌクレオチドから形成された形態を例示できる。このような核酸の形態は、一般にステム・ループ構造と呼ばれる構造であり、ｔＲＮＡ等に見出される。ステム構造は、互いに相補的な塩基同士が対合して形成された２本鎖ポリヌクレオチドに代表される。

図１に示すように、アプタマー３は、ポリヌクレオチドからなり、配列番号１に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド１０が少なくとも一部を形成するループ構造２０と、ループ構造２０に連結する２本鎖ポリヌクレオチドからなるステム構造３０とを有する。

アプタマーが２本鎖ポリヌクレオチドからなるステム構造を有することにより、容易にループ構造を形成可能であり、ＦＧＦ受容体への結合能が向上する。

ステム構造は、２本鎖ポリヌクレオチドのみから構成されていてもよい。その場合、２本鎖ポリヌクレオチドを形成する片方の１本鎖ポリヌクレオチドは、塩基数２〜５０のポリヌクレオチド鎖であってよく、塩基数４〜３０のポリヌクレオチド鎖であってもよく、塩基数５〜１５のポリヌクレオチド鎖であってもよい。

本実施形態のアプタマーは、グアニン四重鎖構造を形成することが好ましい。実施例において後述するように、グアニン四重鎖構造を形成するアプタマーは、ＦＧＦＲ１に対する結合能が更に高い傾向にある。

グアニン四重鎖構造は、標的に結合能を有する核酸において確認される場合がある。グアニン四重鎖という名称のとおり、グアニン四重鎖構造は、４組のＧ配列により形成される特定の立体構造である（Nonaka Y., et al., Screening and improvement of an anti-VEGF DNA aptamer, Molecules, 15 (1), 215-225, 2010. を参照）。

グアニン四重鎖はそのトポロジーから「並行型」及び「逆並行型」に分類可能である。ここで、本実施形態のアプタマーが形成するグアニン四重鎖構造は、並行型であってもよく、逆並行型であってもよい。

ポリヌクレオチドがグアニン四重鎖構造を形成するかどうかは、公知の方法により確認することができる。並行型グアニン四重鎖構造の存在は、例えば、ＣＤスペクトル測定によって、２４５ｎｍ付近の負のピークと、２６５ｎｍ付近の正のピークが検出されることにより確認することができる。また、グアニン四重鎖構造の形成はＫ^＋イオンを要求するため、例えば、Ｋ^＋イオンを含む溶液中におけるポリヌクレオチドのＣＤスペクトル測定結果と、Ｋ^＋イオンを含まない溶液中におけるポリヌクレオチドのＣＤスペクトル測定結果とを比較することにより、グアニン四重鎖構造の存在を、より信頼性高く確認することができる。

本実施形態のアプタマーは、グアニン四重鎖構造を形成するという観点から、連続する２つ以上のＧの配列を４組以上含むものであることが好ましい。本実施形態のアプタマーがループ構造を有する場合、ループ構造を形成するポリヌクレオチドは、連続する２つ以上のＧの配列を４組以上含むものであることが好ましい。

本実施形態のアプタマーが有するポリヌクレオチドの塩基数は、５００塩基以下であってもよく、２５０塩基以下であってもよく、１５０塩基以下であってもよく、８０塩基以下であってもよく、７０塩基以下であってもよく、６０塩基以下であってもよく、５５塩基以下であってもよい。

また、本実施形態のアプタマーが有するポリヌクレオチドの塩基数は、２８塩基以上であってもよく、３５塩基以上であってもよく、４０塩基以上であってもよく、４５塩基以上であってもよい。

また、本実施形態のアプタマーが有するポリヌクレオチドの塩基数は、例えば、２８〜５００塩基であってもよく、３５〜２５０塩基であってもよく、４０〜１５０塩基であってもよく、４０〜１５０塩基であってもよく、４０〜８０塩基であってもよく、４０〜７０塩基であってもよく、４０〜６０塩基であってもよく、４５〜５５塩基であってもよい。

本実施形態のアプタマーは、ＦＧＦＲ１に結合する活性を有する限り、配列番号１に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドに、更にいかなる塩基配列を有するポリヌクレオチドが付加されたものであってもよい。また、本実施形態のアプタマーは、例えば生体内での安定性を高めるための種々の修飾や、色素等の標識が付加されていてもよい。

実施形態のアプタマーは、公知の手法により製造可能である。核酸合成の手法やその修飾の方法は、生命科学分野において広く用いられている。

［マルチ構造アプタマー］
１実施形態において、本発明は、上述したアプタマーが２つ以上連結され、ＦＧＦＲ１に結合してＦＧＦＲ１を活性化する活性を有する、アプタマーを提供する。

本実施形態のアプタマーは、上述したアプタマーを１単位として、２単位以上のアプタマーが連結されたマルチ構造を有するものである。本明細書において、２単位以上のアプタマーが連結されたアプタマーを「マルチ構造アプタマー」という場合がある。マルチ構造アプタマーとしては、例えば、１単位のアプタマーが２つ連結されたダイマーを例示することができる。なお、連結されたアプタマー同士は、互いに同一であってもよいし、異なっていてもよい。

マルチ構造アプタマーは、ループ構造に連結する２本鎖ポリヌクレオチドからなるステム構造を有することが好ましい。また、ループ構造が塩基数２８〜４０のポリヌクレオチド鎖からなるものであってもよい。また、マルチ構造アプタマーは、グアニン四重鎖構造を形成することが好ましい。したがって、マルチ構造アプタマーは連続する２つ以上のＧの塩基配列を４組以上含んでいることが好ましい。

図２は、マルチ構造アプタマーの例を示す模式図である。マルチ構造アプタマー４は、ポリヌクレオチドからなり、配列番号１に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド１０が２つ以上連結されたマルチ構造を有する。マルチ構造アプタマー４は、１単位のアプタマー１が、２つ連結されたものである。ポリヌクレオチド１０同士は同一の塩基配列を有するポリヌクレオチドであってもよい。又は、ポリヌクレオチド１０同士は、それぞれ異なる塩基配列を有するポリヌクレオチドであってもよい。

マルチ構造アプタマーは、ＦＧＦＲ１に結合して、ＦＧＦＲ１を活性化する活性を有する。ＦＧＦＲ１の活性化状態は、公知の検出方法により確認できる。ＦＧＦＲ１の活性化は、例えば、ＦＧＦＲ１のリン酸化を検出することで検出することができる。ＦＧＦＲ１のリン酸化は、ＦＧＦＲ１のリン酸化を特異的に検出可能な公知の抗体を用いて、検出すすることができる。

アプタマーが、ＦＧＦ受容体活性化作用を有するかどうかは、公知の検出方法により確認することができる。例えば、ＦＧＦ受容体を発現している細胞を含みアプタマーを含まない試料液Ｃと、ＦＧＦ受容体を発現している細胞及びアプタマーを含む試料液Ｄとを用意する。各試料液中で細胞を培養した後、試料液Ｃ処理と試料液Ｄ処理とで、ＦＧＦ受容体のリン酸化を示す値を比較すればよい。比較実験は比較可能な同条件のもと行われるものとする。試料液ＤにおけるＦＧＦ受容体のリン酸化を示す値が、試料液ＣにおけるＦＧＦ受容体のリン酸化を示す値と比べ、高い値であった場合、当該アプタマーが、ＦＧＦ受容体活性化作用を有すると判断できる。なお、アプタマーが、ＦＧＦＲ１活性化作用を有すると判断する方法は、上記方法に限られない。

図２に示すように、マルチ構造アプタマー５は、配列番号１に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド１０が少なくとも一部を形成するループ構造２０が、２つ以上連結されたマルチループ構造を有する。このように、マルチ構造アプタマー５は、ループ構造２０を有する１単位のアプタマー２が、２つ連結されたものである。

マルチ構造アプタマーは、ループ構造に連結する２本鎖ポリヌクレオチドからなるステム構造を有することが好ましい。

図２に示すように、マルチ構造アプタマー６は、配列番号１に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド１０が少なくとも一部を形成するループ構造２０と、ループ構造２０に連結する２本鎖ポリヌクレオチドからなるステム構造３０とを有する構造が、２つ以上連結されたマルチループ構造を有する。

このように、マルチ構造アプタマー６は、ループ構造２０と、ステム構造３０とを有する１単位のアプタマー３が、２つ連結されたものである。分子内にステム構造を複数有する場合、各ステム構造を形成する塩基配列は互いに異なる配列としてもよい。分子内に２つ以上同一のステム構造を形成する塩基配列が存在する場合、相補鎖を形成する相手のヌクレオチド鎖が入れ替わる可能性がある。この点、各ステム構造を形成する塩基配列を互いに異なる配列とすることにより、相補鎖形成する相手のヌクレオチド鎖が入れ替わることが防止される。なお、完全に同一のステム構造や、完全に同一のアプタマー配列を連続させたマルチ構造アプタマーであっても、ＦＧＦＲ１活性化作用を発揮することができる。

図３、４にマルチ構造アプタマーの一例を模式的に示す。図３に示すマルチ構造アプタマー７は、１単位のアプタマー３が、並列に３つ以上連結されたものである。また、図４に示すマルチ構造アプタマー８ａ，８ｂは、１単位のアプタマー３が、放射状に３つ以上連結されたものである。

マルチ構造アプタマーを形成するポリヌクレオチドはＤＮＡであってもよい。また、マルチ構造アプタマーを構成するヌクレオチドは、少なくとも一部にＤＮＡを含むものであってもよく、ＤＮＡのみからなるものであってもよい。

マルチ構造アプタマーは、上述したアプタマーがリンカーによって連結され、前記リンカーの長さがポリヌクレオチド換算で８０塩基以下の長さであってもよい。

図５では、マルチ構造アプタマー６を例に、マルチ構造アプタマーのリンカーについて説明する。リンカー４０は、配列番号１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド１０が少なくとも一部を形成するループ構造の末端間の領域である。アプタマーがステム構造３０を有する場合、ステム構造もリンカーの一部に含めるものとする。すなわち、本明細書では、マルチ構造アプタマーを構成するループ構造とループ構造との間をつなぐ構造をリンカーとする。

リンカーの一部は１本鎖ＤＮＡから構成されていてもよい。あるいは、リンカーの全部が２本鎖ＤＮＡから構成されていてもよい。また、マルチ構造アプタマーが複数のリンカーを含む場合、一部のリンカーは１本鎖ＤＮＡ部分を含むものであり、一部のリンカーは２本鎖ＤＮＡから構成されたものであってもよい。

図６（ａ）及び（ｂ）は、リンカーの全部が２本鎖ＤＮＡであるアプタマーの一例を示す模式図である。図６（ａ）に示すように、マルチ構造アプタマー９ａは、配列番号１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド１０が少なくとも一部を形成するループ構造２０を２つ有している。そして、第１のループ構造２０と第２のループ構造２０が２本鎖ＤＮＡからなるリンカー４０で連結されている。

また、図６（ｂ）に示すように、マルチ構造アプタマー９ｂは、配列番号１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド１０が少なくとも一部を形成するループ構造２０を２つ有している。そして、第１のループ構造２０と第２のループ構造２０が２本鎖ＤＮＡからなるリンカー４０で連結されている。

また、図７は、複数のリンカーを含むマルチ構造アプタマーの一例を示す模式図である。図７に示すように、マルチ構造アプタマー１０は、配列番号１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド１０が少なくとも一部を形成するループ構造２０を４つ有している。そして、マルチ構造アプタマー１０は、複数のリンカー４０ａ、４０ｂ、４０ｃを含んでいる。リンカー４０ａ及びリンカー４０ｃは１本鎖ＤＮＡ部分を含むリンカーであり、リンカー４０ｂは２本鎖ＤＮＡのみから構成されたものである。また、リンカー４０ａ及びリンカー４０ｂはリンカーの一部を共有している。また、リンカー４０ｂ及びリンカー４０ｃはリンカーの一部を共有している。

マルチ構造アプタマーにおいて、リンカー１つあたりの長さは、ポリヌクレオチド換算で８０塩基以下の長さであることが好ましい。リンカーはポリヌクレオチド以外の材料で形成されていてもよい。例えば、ポリヌクレオチド以外の材料としては例えば、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ、ＰＥＧ）が挙げられる。リンカーがポリヌクレオチド以外の材料で形成されていている場合、リンカーの長さは、ポリヌクレオチドの長さを基準に算出するものとする。基準となるポリヌクレオチドの長さは、二重らせん構造のＤＮＡにおける塩基対間距離３．４オングストロームに基づいて算出するものとする。１オングストロームは、０．１ｎｍである。

リンカーの長さは、ポリヌクレオチド換算で０〜８０塩基の長さであってよく、５〜７０塩基の長さであってよく、１０〜６０塩基の長さであってよく、１５〜５０塩基の長さであってよく、１５〜３０塩基の長さであってよく、１６〜２０塩基の長さであってもよい。

マルチ構造アプタマーは、ポリヌクレオチドの塩基数が、１０００塩基以下であってもよく、７００塩基以下であってもよく、５００塩基以下であってもよく、２５０塩基以下であってもよく、１５０塩基以下であってもよく、１００塩基以下であってもよく、８０塩基以下であってもよく、６０塩基以下であってもよい。

マルチ構造アプタマーが有するポリヌクレオチドの塩基数は、５６塩基以上であってもよく、６０塩基以上であってもよく、８０塩基以上であってもよく、１００塩基以上であってもよく、２００塩基以上であってもよい。

マルチ構造アプタマーが有するポリヌクレオチドの塩基数は、例えば、５６〜１０００塩基であってもよく、６０〜７００塩基であってもよく、８０〜５００塩基であってもよく、９０〜２５０塩基であってもよく、９０〜１５０塩基であってもよく、９０〜１００塩基であってもよい。

マルチ構造アプタマーは、公知の手法により製造可能である。核酸合成の手法やその修飾の方法は、生命科学分野において広く用いられている。

マルチ構造アプタマーは、配列番号１１に記載の塩基配列からなるものであってもよい。実施例において後述するように、配列番号１１に記載の塩基配列からなるアプタマーは、ｂＦＧＦと同様の活性を有することが確認されている。

マルチ構造アプタマーは、配列番号１１に記載の塩基配列に対して変異を有していてもよい。具体的には、マルチ構造アプタマーは、配列番号１１に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり且つＦＧＦＲ１に結合してＦＧＦＲ１を活性化する活性を有するものであってもよい。

本明細書において、１若しくは数個とは、１〜１０個であってもよく、１〜５個であってもよく、１〜４個であってもよく、１〜３個であってもよく、１〜２個であってもよい。

［アプタマー固定担体］
１実施形態において、本発明は、上述したアプタマー又はマルチ構造アプタマーが、固相担体表面に固定化された、アプタマー固定担体を提供する。

固相担体の形状は特に限定されず、シート状、板状、粒子状、膜状等が挙げられる。また、固相担体の材料は、アプタマーを固定化可能な材料であれば特に限定されず、樹脂、シリカ、ガラス、金属等が例示できる。

図８（ａ）及び（ｂ）にアプタマー固定担体の形態の一例を模式的に示す。アプタマー固定担体１００は、シート状の固相担体１１０の表面に、アプタマー３が固定化されたものである。また、アプタマー固定担体１０１は、円柱状の固相担体１２０の表面に、アプタマー３が固定化されたものである。

［ＦＧＦＲ１シグナリング関連疾患の予防又は治療剤］
１実施形態において、本発明は、上述したアプタマー又はマルチ構造アプタマーを有効成分として含有する、ＦＧＦＲ１シグナリング関連疾患の予防又は治療剤を提供する。ここで、アプタマーとは単量体アプタマー（１単位のアプタマー）を意味し、マルチ構造アプタマーとは、２単位以上のアプタマーが連結されたアプタマーを意味する。

単量体アプタマーは、ＦＧＦＲ１に結合して、ｂＦＧＦとＦＧＦＲ１との結合を阻害する活性を有する。一方、マルチ構造アプタマーは、ＦＧＦＲ１に結合してＦＧＦＲ１を活性化する活性を有する。

本実施形態のアプタマーを生体に投与することにより、ＦＧＦＲ１シグナリングを制御することができる。その結果、ＦＧＦＲ１シグナリング関連疾患を予防又は治療することができる。ＦＧＦＲ１シグナリング関連疾患としては、癌、糖尿病等が挙げられる。また、本明細書では、ＦＧＦＲ１シグナリング関連疾患に、擦傷、切創等の傷も含めるものとする。

単量体アプタマーを患者に投与することにより、ＦＧＦＲ１シグナリングを抑制することができる。この結果、細胞増殖を抑制し、例えば癌を治療することができる。

また、マルチ構造アプタマーを傷口に適用することにより、ＦＧＦＲ１を活性化し、細胞増殖を促進することができる。この結果、傷を速やかに治療することができる。また、本実施形態の予防又は治療剤を美容目的に使用することもできる。

１実施形態において、本発明は、単量体アプタマー又はマルチ構造アプタマーの有効量を、治療を必要とする患者に投与する工程を備える、ＦＧＦＲ１シグナリング関連疾患の予防又は治療方法を提供する。

１実施形態において、本発明は、ＦＧＦＲ１シグナリング関連疾患の予防又は治療のための、単量体アプタマー又はマルチ構造アプタマーを提供する。

１実施形態において、本発明は、ＦＧＦＲ１シグナリング関連疾患の予防又は治療剤を製造するための単量体アプタマー又はマルチ構造アプタマーの使用を提供する。

本実施形態のＦＧＦＲ１シグナリング関連疾患の予防又は治療剤は、純粋な単量体アプタマー又はマルチ構造アプタマーの形態であってもよいし、適宜の薬理学的に許容される添加剤と混合した医薬組成物又は美容用組成物の形態であってもよい。医薬組成物又は美容用組成物は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤等の形態で経口的に投与するものであってもよいし、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、注射剤等の形態で非経口的に投与するものであってもよい。

これらの製剤は、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、乳化剤、安定剤、希釈剤、注射剤用溶剤等の添加剤を用いて、周知の方法で製造することができる。

賦形剤としては、有機系賦形剤、無機系賦形剤等が挙げられる。有機系賦形剤としては、白色ワセリン、流動パラフィン等の炭化水素類；乳糖、白糖等の糖誘導体；トウモロコシデンプン、馬鈴薯デンプン等のデンプン誘導体；結晶セルロース等のセルロース誘導体；アラビアゴム等が挙げられる。無機系賦形剤としては、硫酸カルシウム等の硫酸塩が挙げられる。

結合剤としては、上記の賦形剤、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール等が挙げられる。

崩壊剤としては、上記の賦形剤；クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム等のデンプン又はセルロースの誘導体；架橋ポリビニルピロリドン等が挙げられる。

滑沢剤としては、タルク；ステアリン酸；コロイドシリカ；ビーズワックス、ゲイロウ等のワックス類；硫酸ナトリウム等の硫酸塩；ラウリル硫酸ナトリウム等のラウリル硫酸塩；上記の賦形剤におけるデンプン誘導体等が挙げられる。

乳化剤としては、ベントナイト、ビーガム等のコロイド性粘土；ラウリル硫酸ナトリウム等の陰イオン界面活性剤；塩化ベンザルコニウム等の陽イオン界面活性剤；ポリオキシエチレンアルキルエーテル等の非イオン界面活性剤等が挙げられる。

安定剤としては、メチルパラベン、プロピルパラベン等のパラヒドロキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール等のアルコール類；フェノール、クレゾール等のフェノール類が挙げられる。

希釈剤としては、水、エタノール、プロピレングリコール等が挙げられる。注射剤用溶剤としては、水、エタノール、グリセリン等が挙げられる。

本実施形態の予防又は治療剤の投与量は、患者の症状等により差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり、例えば０．１〜１００ｍｇ程度の有効成分（アプタマー又はマルチ構造アプタマー）を投与することが挙げられる。

非経口的に投与する場合は、その投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法によっても異なるが、例えば軟膏剤の場合、１回あたり、例えば０．０１〜３０ｍｇ程度を１日１回〜数回患部に塗布することが挙げられる。

本実施形態の予防又は治療剤は、単量体アプタマー又はマルチ構造アプタマーを発現可能なベクターの状態であってもよい。

［細胞培養用組成物］
１実施形態において、本発明は、上述した単量体アプタマー又はマルチ構造アプタマーを有効成分として含有する、細胞培養用組成物を提供する。本実施形態の細胞培養用組成物は、培地であってもよいし、培地用添加剤であってもよい。

上述した単量体アプタマー又はマルチ構造アプタマーの存在下で細胞を培養することにより、細胞の分化、増殖等、ＦＧＦＲ１シグナリングに関わる各種の細胞の状態を制御することができる。

細胞培養用組成物は、単量体アプタマー又はマルチ構造アプタマーのほかにも、基本培地、血清等を含んでいてもよい。

細胞培養用組成物中に含まれるアプタマーの濃度は、使用目的によって適宜調整することができ、例えば、０．０１ｎＭ〜１０μＭであってもよいし、０．１ｎＭ〜５μＭであってもよいし、１ｎＭ〜５μＭであってもよいし、５０ｎＭ〜３μＭであってもよいし、１００ｎＭ〜２μＭであってもよい。なお、「Ｍ」は「ｍｏｌ／Ｌ」を表す。

［細胞培養方法］
１実施形態において、本発明は、上述した単量体アプタマー又はマルチ構造アプタマーを含む培地で、ＦＧＦＲ１陽性細胞を培養することを含む、細胞培養方法を提供する。単量体アプタマーの存在下でＦＧＦＲ１陽性細胞を培養すると、単量体アプタマーがＦＧＦＲ１に結合して、ｂＦＧＦとＦＧＦＲ１との結合が阻害される。その結果、細胞におけるＦＧＦＲ１シグナリングを抑制することができる。また、マルチ構造アプタマーの存在下でＦＧＦＲ１陽性細胞を培養すると、マルチ構造アプタマーがＦＧＦＲ１に結合し、細胞におけるＦＧＦＲ１シグナリングを活性化することができる。

［ｂＦＧＦと前記ＦＧＦＲ１との結合阻害方法］
１実施形態において、本発明は、上述した単量体アプタマーを、ＦＧＦＲ１陽性細胞と接触させることを含む、ｂＦＧＦと前記ＦＧＦＲ１との結合阻害方法を提供する。単量体アプタマーをＦＧＦＲ１陽性細胞と接触させると、単量体アプタマーがＦＧＦＲ１に結合して、ｂＦＧＦとＦＧＦＲ１との結合が阻害される。その結果、細胞におけるＦＧＦＲ１シグナリングを抑制することができる。

本明細書において、単量体アプタマー又はマルチ構造アプタマーとＦＧＦＲ１陽性細胞とを接触させる方法は、特に制限されず、種々の方法を用いることができる。例えば、単量体アプタマー又はマルチ構造アプタマーを含む培地中で細胞を培養することによって、単量体アプタマー又はマルチ構造アプタマーを細胞に接触させてもよいし、同一の液体中に単量体アプタマー又はマルチ構造アプタマー及び細胞を含有させることによって、単量体アプタマー又はマルチ構造アプタマーを細胞に接触させてもよいし、細胞に単量体アプタマー又はマルチ構造アプタマーを含む組成物を滴下することによって単量体アプタマー又はマルチ構造アプタマーを細胞に接触させてもよい。また、単量体アプタマー又はマルチ構造アプタマーとＦＧＦＲ１陽性細胞との接触は、インビボで行われてもよいし、インビトロで行われてもよい。

［ＦＧＦＲ１陽性細胞の増殖抑制方法］
１実施形態において、本発明は、上述した単量体アプタマーを、ＦＧＦＲ１陽性細胞と接触させることを含む、前記細胞の増殖抑制方法を提供する。単量体アプタマーをＦＧＦＲ１陽性細胞と接触させると、単量体アプタマーがＦＧＦＲ１に結合して、ｂＦＧＦとＦＧＦＲ１との結合が阻害される。その結果、細胞の増殖を抑制することができる。

アプタマーが細胞の増殖を抑制しているかどうかは、例えば、アプタマーが接触した細胞と、アプタマーが接触していない細胞を比較し、アプタマーが接触した細胞のほうが、細胞増殖の程度が小さい場合、アプタマーが細胞の増殖を抑制していると判断することができる。

［ＦＧＦＲ１の活性化方法］
１実施形態において、本発明は、上述したマルチ構造アプタマーを、ＦＧＦＲ１陽性細胞と接触させることを含む、前記ＦＧＦＲ１の活性化方法を提供する。マルチ構造アプタマーをＦＧＦＲ１陽性細胞と接触させると、マルチ構造アプタマーがＦＧＦＲ１に結合し、細胞におけるＦＧＦＲ１シグナリングを活性化することができる。

マルチ構造アプタマーがＦＧＦＲ１を活性化したか否かは、例えば、マルチ構造アプタマーが接触した細胞と、マルチ構造アプタマーが接触していない細胞を比較し、マルチ構造アプタマーが接触した細胞のほうが、ＦＧＦＲ１のリン酸化の程度が大きい場合、マルチ構造アプタマーがＦＧＦＲ１を活性化したと判断することができる。

［ＦＧＦＲ１陽性細胞の増殖促進方法］
１実施形態において、本発明は、上述したマルチ構造アプタマーを、ＦＧＦＲ１陽性細胞と接触させることを含む、前記細胞の増殖促進方法を提供する。マルチ構造アプタマーをＦＧＦＲ１陽性細胞と接触させると、マルチ構造アプタマーがＦＧＦＲ１に結合し、細胞におけるＦＧＦＲ１シグナリングを活性化することができる。その結果、細胞の増殖を促進することができる。

マルチ構造アプタマーが細胞の増殖を促進したか否かは、例えば、マルチ構造アプタマーが接触した細胞と、マルチ構造アプタマーが接触していない細胞を比較し、マルチ構造アプタマーが接触した細胞のほうが、細胞増殖の程度が大きい場合、マルチ構造アプタマーが細胞の増殖を促進したと判断することができる。

［多能性幹細胞の多能性維持方法］
１実施形態において、本発明は、上述したマルチ構造アプタマーを、ＦＧＦＲ１陽性多能性幹細胞と接触させることを含む、前記多能性幹細胞の多能性維持方法を提供する。ＦＧＦＲ１陽性多能性幹細胞としては、ｉＰＳ細胞、Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ（ＥＳ細胞）等の多能性幹細胞が挙げられる。

マルチ構造アプタマーが多能性幹細胞の多能性を維持しているか否かは、例えば、マルチ構造アプタマーが接触した細胞と、マルチ構造アプタマーが接触していない細胞を比較し、マルチ構造アプタマーが接触した細胞のほうが、多能性幹細胞マーカーの発現が高い場合、マルチ構造アプタマーが多能性幹細胞の多能性を維持したと判断することができる。多能性幹細胞マーカー遺伝子としては、例えば、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ−４、ＳＳＥＡ−１、ＳＯＸ２等が挙げられる。

［検出方法］
１実施形態において、本発明は、上述した単量体アプタマー又はマルチ構造アプタマーをＦＧＦＲ１に結合させることを含む、ＦＧＦＲ１の検出方法を提供する。ここで、単量体アプタマー又はマルチ構造アプタマーは標識物質で標識されていることが好ましい。その結果、標識物質を検出することにより、ＦＧＦＲ１を検出することができる。標識物質としては、例えば、色素、蛍光色素、ラジオアイソトープ、抗体、抗原、酵素等が挙げられる。

以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

［材料及び方法］
（材料）
化合物は、一般的な供給会社より購入し、更に精製することなく使用した。全てのＤＮＡサンプルはファスマック社より購入した。ＤＮＡのアニーリング（９５℃５分、０．１℃／分で２５℃又は室温まで冷却）はサーマルサイクラーにより行った。ダルベッコリン酸緩衝液（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ，ＤＰＢＳ）は富士フイルム和光純薬株式会社より購入した。組換え塩基性ＦＧＦ（＃１００−１８Ｂ）と組換えヒトＴＧＦ−β（＃１００−２１）はペプロテック社より購入した。組換えヒトＦＧＦＲ１−Ｆｃキメラタンパク質（＃６６１−ＦＲ）と組換えヒトＭｅｔ−Ｆｃキメラタンパク質（＃３５８−ＭＴ）はＲ＆Ｄシステムズ社より購入した。組換えＦＧＦＲ１細胞外ドメイン（＃７４２１−２０）はバイオビジョン社から購入した。蛍光画像は、ｓＣＭＯＳ ｃａｍｅｒａ（Ｚｙｌａ４．２、アンドール・テクノロジー社）を搭載した倒立顕微鏡（ＩＸ−８１、オリンパス株式会社）により取得した。吸光度と蛍光強度は、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ ｐｒｏ（テカン社）により測定した。

（ＦＧＦＲ１結合ＤＮＡアプタマー）
ＰＢＳ−Ｔ緩衝液（０．０２％ Ｔｗｅｅｎ ２０（ｗｔ／ｖｏｌ）を加えたＤＰＢＳ）中で、ＦＧＦＲ１−ＦｃをＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ（＃１０００４Ｄ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）と３０分間インキュベートした。ビーズのスラリー（１２．６μＬ；結合能は２０ｐｍｏｌ）を２０ｐｍｏｌのタンパク質を固定するために用いた。インキュベート後、ビーズをＰＢＳ−Ｔ緩衝液で３回洗浄し、セレクションに用いた。ヒトＭｅｔ−Ｆｃ固定ビーズを同様の手順で用意し、ネガティブセレクションに用いた。各セレクションに用いた組換えタンパク質の量は表１に要約した。

（ＦＧＦＲ１結合配列の分離）
配列番号２に表される１本鎖ＤＮＡの混合物（１本鎖ＤＮＡプール）を用意した。配列番号２中、Ｎは、ａ（アデニン）、ｔ（チミン）、ｇ（グアニン）、ｃ（シトシン）のいずれかである。１本鎖ＤＮＡプールをＤＰＢＳに溶解し、９５℃で５分間、解離させ、０．１℃／分でゆっくりと２５℃まで冷却した。リフォールディング後、０．０４％ Ｔｗｅｅｎ ２０（ｗｔ／ｖｏｌ）を含む、等量のＤＰＢＳを１本鎖ＤＮＡプールに加えた。１本鎖ＤＮＡプールをＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇと共に室温で３０分間インキュベートし、ビーズに結合した配列を除去した。５回、６回のセレクション中に、ヒトＭｅｔ−Ｆｃ固定ビーズを用いてネガティブセレクションも行った。上清をＦＧＦＲ１固定ビーズと室温で１０分〜３０分間インキュベートした。インキュベート後、ビーズをＰＢＳ−Ｔ緩衝液で洗浄した。ビーズと溶出バッファー（７Ｍ尿素を含む１００ｍＭ 酢酸ナトリウム、３ｍＭ ＥＤＴＡ）を９５℃で３分間インキュベートし、ＦＧＦＲ１結合配列を得た。溶出したＤＮＡはフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール溶液で抽出し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（＃ＵＦＣ５０１０９６）により限外濾過した。各セレクションの条件は表１に要約した。

（１本鎖ＤＮＡプール）
溶出したＤＮＡを、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼを用い、マニュアルにしたがって、ＰＣＲにより増幅させた。プライマーは、配列番号３に記載の塩基配列からなるプライマーと、配列番号４に記載の塩基配列からなるプライマーを用いた。ＰＣＲ後、反応混合液とストレプトアビジン磁性ビーズ（＃２１３４４、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を、緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中で、１０分間インキュベートした。１５０ｍＭ ＮａＯＨを含む溶液中でビーズを５分間インキュベートし、１本鎖ＤＮＡを得た。上清は１５０ｍＭ ＨＣｌで中和し、Ｇ−２５スピンカラムで脱塩した。１本鎖ＤＮＡはヌクレアーゼフリーの水でカラムから溶出し、次のセレクションに用いた。

（シーケンシング）
６回のセレクション後、回収したＤＮＡを未修飾のプライマーで増幅させた。ＰＣＲ産物をＴＡｒｇｅｔ Ｃｌｏｎｅｔｍ−Ｐｌｕｓ ｋｉｔ（ｓｈａ−ｐｕＴＡＫ−２０１、東洋紡株式会社）を用いてクローニングベクターに挿入した。標準的な大腸菌形質転換方法とクローニング方法にしたがって、ＤＮＡシーケンシングによってアプタマー候補配列を同定した。

（フローサイトメトリー）
各ビーズと細胞の蛍光強度は、フローサイトメトリー（Ｇｕａｖａ ｅａｓｙＣｙｔｅ、メルク社）を用いて測定した。

（ＦＧＦＲ１固定ビーズに結合したアプタマー）
ヒトＦＧＦＲ１−Ｆｃ（各サンプルについて１ｐｍｏｌ）とＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＧをＰＢＳ−Ｔ中で３０分間インキュベートした。インキュベート後、ビーズをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。２０ｐｍｏｌの５’−ＦＩＴＣ−修飾ＤＮＡとＦＧＦＲ１固定ビーズを５０μＬのＰＢＳ−Ｔ中で、３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後、ビーズをＰＢＳ−Ｔで洗浄し、フローサイトメトリーで解析した。未処理のビーズの蛍光強度に対する、アプタマーとインキュベートしたビーズの蛍光強度の増加分を、平均蛍光強度として示した。

（ＳＳＥＡ−４の発現）
４０９Ｂ２細胞をディッシュから剥がし、ＤＰＢＳで洗浄した。ＦＣＭ緩衝液（１％ＢＳＡを含むＤＰＢＳ）中で、細胞とＡｌｅｘａ４８８標識抗ＳＳＥＡ−４抗体（１：１００希釈、＃５３−８８４３、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を、氷上で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をＦＣＭ緩衝液で２回洗浄し、フローサイトメトリーで解析した。未処理の際簿の蛍光強度に対する、抗体染色した細胞の蛍光強度の増加分を、平均蛍光強度として示した。

（ＳＰＲ解析）
ＳＰＲ解析は、Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＳＡ（＃２９１０４９９２、ＧＥヘルスケア社）を用いて、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００（ＧＥヘルスケア社）により行った。５’−ビオチン化ＤＮＡをセンサーチップに固定した。様々な濃度のＦＧＦＲ１タンパク質（２．５，１０，２５，５０，１００ｎＭ）を、流速３０μＬ／分で固定したＤＮＡの表面に注入した（２５℃の流動緩衝液：０．２％ Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０を含むＤＰＢＳ、再生液：５０ｍＭ ＮａＯＨを含む１Ｍ ＮａＣｌ溶液、接触時間：１８０秒、解離時間：６００秒）。

（細胞培養）
ヒト横紋筋肉腫細胞株であるＡ２０４細胞は、１０％胎児牛血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ，ＦＢＳ）と１％ 抗マイコプラズマ抗生物質（＃１５２４０、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を含むＤＭＥＭ中で培養した。４０９Ｂ２細胞は、１％ペニシリン−ストレプトマイシン混合液（＃２６２５３−８４、ナカライテスク社）を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ（＃ＡＫ０２Ｎ、味の素株式会社）中で培養した。ｉＭａｔｒｉｘ−５１１（０．２５ μｇ／ｃｍ^２，＃８９２０１１、ニッピ社）を培養基質として用いた。全ての細胞は、３７℃の加湿した５％ＣＯ_２雰囲気中のインキュベータ内で培養した。

（ＥＬＩＳＡ解析）
解析は、ＰａｔｈＳｃａｎ（登録商標）Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＦＧＦ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ １（ｐａｎＴｙｒ） Ｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（＃１２９０９Ｃ、セルシグナリングテクノロジー社）を用いて、マニュアルのプロトコルにしたがって行った。３回の独立した実験を行い、平均値をエラーバー（ＳＤ）と共に示した。

（イムノブロット解析）
細胞破砕液は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ膜に転写した。ＰＶＤＦ膜を、４℃で一晩、一次抗体と反応させた後、室温で１時間、適当な二次抗体と反応させた。一次抗体として、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＲＫ１／２（＃４３７０），ＥＲＫ１／２ （＃４６９５），ｂｅｔａ−ａｃｔｉｎ（＃４９６７）をセルシグナリングテクノロジー社から購入した。二次抗体（Ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ／ＨＲＰ，Ｐ０４８８）はダコ社より購入した。膜はＩｍｍｕｎｏＳｔａｒ ＬＤ（＃２９６−６９９０１、 富士フイルム和光純薬株式会社）で検出した。

（ＦＧＦＲアゴニスト存在下のｈｉＰＳＣ細胞の多能性維持）
ｉＰＳ細胞の多能性維持に対する、ＦＧＦＲアゴニストの潜在的効果を評価するために、「ＡＢＴ培地」を作成し、基礎培地として実験に用いた。ＡＢＴ培地は、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎのｓｏｌｕｔｉｏｎ Ａ（４００ｍＬ）とｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｂ（１００ｍＬ）、組換えＴＧＦ−β（最終濃度２ｎｇ／ｍＬ）からなり、ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎは、ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ａ（４００ｍＬ）、ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｂ（１００ｍＬ）、ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃ（２ｍＬ）からなる。組換えｂＦＧＦの非存在下では、ＡＢＴ培地中で４０９Ｂ２ ｉＰＳ細胞の多能性は維持できないことが確認された。４０９Ｂ２細胞（２×１０^３細胞／ｃｍ^２）は、適当なＦＧＦＲアゴニスト、Ｙ−２７６３２（１０μＭ）、ｉＭａｔｒｉｘ−５１１（０．３μｇ／ｃｍ^２）を含むＡＢＴ培養液の入った培養シャーレ上に播種した。翌日、培地を、適当なＦＧＦＲアゴニストを含むＡＢＴ培地に交換した。培地を一日おきに交換して細胞を維持した。

（免疫染色イメージング）
４０９Ｂ２細胞はＤＰＢＳで２回洗浄し、室温で３０分間、４％パラホルムアルデヒドリン酸緩衝液で固定した。固定後、細胞はＤＰＢＳで３回洗浄し、室温で１５分、透過緩衝液（０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むＤＰＢＳ）中でインキュベートした。透過処理後、細胞をＤＰＢＳで３回洗浄し、室温で１５分間、ブロッキング緩衝液（３％ＢＳＡを含むＤＰＢＳ）中でインキュベートした。次に、細胞を、４℃で一晩、Ａｌｅｘａ４８８標識抗ＳＳＥＡ−４抗体（１：１００希釈、＃５３−８８４３，Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ）と反応させた。細胞は、ＤＰＢＳで３回洗浄し、蛍光イメージング観察の前に、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８（１：１０００、＃Ｈ３４１、同仁化学研究所）で染色した。

（ＲＴ−ｑＰＣＲ解析）
全ＲＮＡは、ＦａｓｔＧｅｎｅｔｍ ＲＮＡ Ｐｒｅｍｉｕｍ Ｋｉｔ（＃ＦＧ−８１０５０、日本ジェネティクス社）により精製した。精製したＲＮＡは、ｉＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（＃１７０８８９０、バイオラッド社）を用いて、マニュアルのプロトコルにしたがって、逆転写反応に供した。遺伝子発現量の定量においては、ＫＯＤ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（＃ＱＫＤ−２０１、東洋紡株式会社）を用いた。ＯＣＴ４の発現量の定量には、配列番号２０で表されるプライマーと、配列番号２１で表されるプライマーを用いた。ＲＰＬＰ０の発現量の定量には、配列番号２２で表されるプライマーと、配列番号２３で表されるプライマーを用いた。

（細胞増殖解析）
４０９Ｂ２細胞はＤＰＢＳで２回洗浄し、０．５ｍＭ ＥＤＴＡを含むＤＰＢＳによりシャーレから剥離した。細胞は、０．４％トリパンブルー溶液（＃２０７−１７０８１、富士フイルム和光純薬株式会社）で染色し、セルカウンターでカウントした。

［実験例１］
（ＦＧＦＲ１に結合するＤＮＡアプタマーのスクリーニング）
ランダムな配列を有する１本鎖ＤＮＡプールの中から、ＰＣＲとアフィニティ精製により、ＦＧＦＲ１に結合する１本鎖ＤＮＡを濃縮し、クローニングした。

まず、配列番号２に示される、４０塩基のランダムな配列を含む１本鎖ＤＮＡのプールを用意した。このプールとＦＧＦＲ１を固定したビーズを接触させて、ＦＧＦＲ１に結合するＤＮＡを選別した。続いて、選別したＤＮＡを、ＰＣＲにより増幅させた。ＰＣＲにおいては、配列番号３で表されるＤＮＡの５’末端をＦＩＴＣにより標識したプライマーと、配列番号４で表されるＤＮＡの５’末端をビオチンにより標識したプライマーを用いた。これらの工程を６回繰り返して、ＦＧＦＲ１に結合するＤＮＡを濃縮した。

次に、濃縮したＤＮＡプールとＦＧＦＲ１陽性細胞と接触させて、ＦＧＦＲ１に結合するＤＮＡを選別した。続いて、選別したＤＮＡをＰＣＲにより増幅させた。これらの工程を７回繰り返して、ＦＧＦＲ１に結合するＤＮＡを濃縮した。

続いて濃縮したＤＮＡをベクターにクローニングし、挿入したＤＮＡの配列をシーケンシングにより解析した。その結果、配列番号３６〜５０に記載の塩基配列からなるアプタマーを含む、数十種類のアプタマーが得られた。

配列番号３６〜５０に記載の塩基配列からなるアプタマーをアラインメントした結果、これらのアプタマーは、部分配列として配列番号２４〜３５に記載の塩基配列を含むことが明らかとなった。更に、配列番号２４〜３５に記載の塩基配列は、配列番号１に記載の塩基配列をコンセンサス配列とすることが特定された。

スクリーニングの結果得られたアプタマーのうち、配列番号５に塩基配列を示すアプタマーに着目して以下の検討を行った。なお、配列番号５に記載の塩基配列は、配列番号３８に記載の塩基配列の５’側及び３’側に、アプタマー増幅用のプライマー（配列番号３、４）の塩基配列が結合したものである。

［実験例２］
（ＦＧＦＲ１に結合するＤＮＡアプタマーの部位）
実験例１において得られた全長８４塩基のＤＮＡアプタマー（配列番号５）から、ＦＧＦＲ１に結合する部位を同定した。

配列番号５に塩基配列を示す全長８４塩基のＤＮＡアプタマーの立体構造を解析したところ、２つのループ構造が連結されていると推測された。この構造を図９に示す。立体構造の解析には、Ｍｆｏｌｄソフトウエアを用いた（Zuker M., Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction, Nucleic Acids Res., 31(13), 3406-3415, 2003. を参照）。

その結果、ループ構造と、ループ構造に連結されたステム構造が見出された。ステム構造とループ構造以外の配列は、実験例１において用いたプライマーの配列である。ループをｌｏｏｐ３０（Ｌ３０）、ステムとループからなる構造をｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ３８（ＳＬ３８）と名付けた。Ｌ３０の塩基配列は配列番号６で表され、ＳＬ３８の塩基配列は配列番号７で表される。

全長８４塩基、ＳＬ３８、Ｌ３０、及び、ＳＬ３８の逆の配列であるＳＬ３８Ｒｅｖの、５’末端をＦＩＴＣで標識したＤＮＡを合成した。ＳＬ３８Ｒｅｖの配列は、配列番号８で表される配列である。これらの配列とＦＧＦＲ１−Ｆｃとの結合を、フローサイトメトリーで解析した。結果を図１０に示す。

図１０は、各ＤＮＡとＦＧＦＲ１−Ｆｃビーズとの結合を、フローサイトメトリーにより解析した結果を示すグラフである。図１０中、グラフの縦軸は、蛍光強度の平均値を示す。また、「Ｆｕｌｌ８４」は全長８４塩基のＤＮＡの結果であることを示し、「ＳＬ３８」はＳＬ３８の結果であることを示し、「Ｌ３０」はＬ３０の結果であることを示し、「ＳＬ３８Ｒｅｖ」はＳＬ３８Ｒｅｖの結果であることを示す。

その結果、全長８４塩基、ＳＬ３８、Ｌ３０は、ＦＧＦＲ１に結合することが明らかになった。３種のＤＮＡの中でも、ＳＬ３８がＦＧＦＲ１に最も強く結合した。

［実験例３］
（ステム構造と安定性）
アプタマーの安定性における、ステム配列の役割を解析した。ＳＬ３８は、ループ構造に、ＡとＴからなる４塩基のステム構造が連結していると予測された。ＳＬ３８の安定性を高めるために、ステム構造の塩基配列をＣ又はＧに改変した、ＳＬ３８．２を合成した。ＳＬ３８．２の塩基配列を、配列番号９に示す。

続いて、ＳＬ３８とＳＬ３８．２を、１０％ウシ胎児血清に入れてインキュベートし、ヌクレアーゼに対する抵抗性を解析した。インキュベート後のサンプルをポリアクリルアミドゲル電気泳動により展開した。

図１１は、ＳＬ３８又はＳＬ３８．２を血清に入れ、１時間〜４時間後のＤＮＡを解析した結果を示す写真である。その結果、ＳＬ３８は分解したが、ＳＬ３８．２は４時間後も分解しないことが明らかになった。この結果から、ＳＬ３８よりもＳＬ３８．２の方がヌクレアーゼに対して高い抵抗性を有することが明らかになった。

［実験例４］
（ＳＬ３８．２とＦＧＦＲ１の結合）
ＳＬ３８．２とＦＧＦＲ１の結合力を、フローサイトメトリー及び表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、ＳＰＲ）により解析した。

５’末端をＦＩＴＣで標識した、ＳＬ３８及びＳＬ３８．２を用意した。また、ＦＧＦＲ１−Ｆｃをビーズに固定した。標識したＳＬ３８又はＳＬ３８．２と、ＦＧＦＲ１−Ｆｃの結合力を、フローサイトメトリーで解析した。結果を図１２（ａ）に示す。図１２（ａ）中、「Ｖｅｈｉｃｌｅ」は陰性対照の結果である。

その結果、ＦＧＦＲ１に対し、ＳＬ３８．２はＳＬ３８と同程度の結合力を有することが明らかになった。ヌクレアーゼに対する安定性を考慮すると、ＳＬ３８．２はＳＬ３８よりも優れたアプタマーであると考えられた。

次に、ＳＬ３８．２を固定したセンサーチップに対して、ＦＧＦＲ１の細胞外ドメインを含む溶液を流し、ＳＰＲのシグナルを解析した。図１２（ｂ）は、ＳＬ３８．２とＦＧＦＲ１細胞外ドメイン（ＦＧＦＲ１＿ＥＣＤ）の結合力の解析結果を示すグラフである。

その結果、ＳＬ３８．２とＦＧＦＲ１細胞外ドメインの解離定数は、１３ｎＭであった。ＳＬ３８．２とｂＦＧＦの結合力の解析結果を表２に示した。ｂＦＧＦのデータは、Ibrahimi O. A., Kinetic model for FGF, FGFR, and proteoglycan signal transduction complex assembly, Biochemistry, 43 (16), 4724-4730, 2004. による。その結果、ＳＬ３８．２は、ＦＧＦＲ１細胞外ドメインに対し、ｂＦＧＦと同等の結合力を有することが明らかになった。

［実験例５］
（ＳＬ３８．２とＦＧＦＲ１〜４の結合）
ＳＬ３８．２とＦＧＦＲ１〜４の結合特異性を、フローサイトメトリーで解析した。具体的には、まず、５’末端をＦＩＴＣで標識したＳＬ３８．２を用意した。また、ＦＧＦＲ１−Ｆｃ、ＦＧＦＲ２−Ｆｃ、ＦＧＦＲ３−Ｆｃ、ＦＧＦＲ４−Ｆｃを、それぞれビーズに固定した。続いて、標識したＳＬ３８．２と、各ＦＧＦＲ−Ｆｃ固定ビーズの結合力を、フローサイトメトリーで解析した。

図１３は、標識ＳＬ３８．２と、各ＦＧＦＲ固定ビーズとの結合力を解析した結果を示すグラフである。その結果、ＳＬ３８．２は、ＦＧＦＲ１〜４のうち、ＦＧＦＲ１と特異的に結合することが明らかになった。

［実験例６］
（グアニン四重鎖構造形成におけるステム構造の役割）
ＣＤスペクトル測定によって、ＳＬ３８とＳＬ３８．２のグアニン四重鎖構造を解析した。グアニン四重鎖はそのトポロジーから「並行型」「逆並行型」に分類可能である。並行型グアニン四重鎖構造の存在は、ＣＤスペクトル測定によって、２４５ｎｍ付近の負のピークと、２６５ｎｍ付近の正のピークが検出されることにより確認できる。また、グアニン四重鎖構造の形成はＫ^＋イオンを要求するので、Ｋ^＋イオンを含む溶液中でのポリヌクレオチドと、Ｋ^＋イオンを含まない溶液中でのポリヌクレオチドに対する、ＣＤスペクトル測定結果を比較することで、グアニン四重鎖構造の確認を、より信頼性高く行うことができる。

まず、ＣＤスペクトル測定によって、ＳＬ３８のグアニン四重鎖構造を解析した。図１４（ａ）は、Ｋ^＋イオン非存在下と、Ｋ^＋イオン存在下でそれぞれ測定した、ＳＬ３８のＣＤスペクトルである。

その結果、ＳＬ３８は、Ｋ^＋イオンの添加によって、スペクトルが変化することが明らかになった。この結果から、ＳＬ３８は逆並行型グアニン四重鎖構造を有することが明らかになった。

ＣＤスペクトル測定によって、ＳＬ３８とＳＬ３８．２のグアニン四重鎖構造を比較した。結果を図１４（ｂ）に示す。その結果、ＳＬ３８とＳＬ３８．２は、Ｋ^＋イオンの添加によって、スペクトルが変化することが明らかになった。この結果は、ＳＬ３８とＳＬ３８．２は共に、逆並行型グアニン四重鎖構造を有することを示している。

［実験例７］
（グアニン四重鎖構造形成におけるＧ−ｒｉｃｈループの役割）
Ｇ−ｒｉｃｈループの塩基配列を改変し、グアニン四重鎖構造形成における、Ｇ−ｒｉｃｈループの役割を解析した。

ＳＬ３８は、５’末端から、１４〜１５番目、１８〜２１番目、２４〜２５番目、２９〜３１番目にグアニンを有する。これら４か所は、グアニンの含有率が高い、Ｇ−ｒｉｃｈループである。

ＳＬ３８の５’末端から１４番目のグアニンをチミンに変異させた「Ｇ１４Ｔ」を作製した。また、ＳＬ３８の５’末端から２４番目のグアニンをチミンに変異させた、「Ｇ２４Ｔ」を作製した。これらについて、ＣＤスペクトルを解析した。その結果を図１５に示す。

図１５は、Ｋ^＋イオン非存在下と、Ｋ^＋イオン存在下で測定した、Ｇ１４ＴとＧ２４ＴのＣＤスペクトルである。その結果、Ｇ１４ＴとＧ２４Ｔはグアニン四重鎖構造を有さないことが明らかになった。この結果から、ＳＬ３８の５’末端から１４番目と２４番目のグアニンは、グアニン四重鎖構造の形成に必要であることが明らかになった。

［実験例８］
（ＳＬ３８とＦＧＦＲ１の結合におけるグアニン四重鎖構造の役割）
グアニン四重鎖構造を形成しない、Ｇ１４Ｔ又はＧ２４Ｔと、ＦＧＦＲ１の結合力を解析し、ＳＬ３８とＦＧＦＲ１の結合におけるグアニン四重鎖構造の役割を検討した。

ＳＬ３８、ＳＬ３８の逆の配列であるＳＬ３８Ｒｅｖ、Ｇ１４Ｔ、Ｇ２４Ｔの５’末端をＦＩＴＣで標識したＤＮＡを作製した。また、ＦＧＦＲ１−Ｆｃをビーズに固定した。続いて、標識したＤＮＡと、ＦＧＦＲ１−Ｆｃ固定ビーズの結合力を、フローサイトメトリーで解析した。結果を図１６（ａ）及び（ｂ）に示す。

図１６（ａ）は、各ＤＮＡとＦＧＦＲ１−Ｆｃビーズの結合を、フローサイトメトリーにより解析した結果を示すグラフである。図１６（ａ）中、「Ｖｅｈｉｃｌｅ」は陰性対照の結果であることを示す。図１６（ｂ）は、蛍光強度の平均値を示すグラフである。その結果、Ｇ１４ＴとＧ２４ＴはＦＧＦＲ１に結合しないことが明らかになった。

この結果から、ＦＧＦＲ１に対する結合において、ＳＬ３８の１４番目と２４番目のグアニンが重要であることが明らかになった。また、ＦＧＦＲ１に対する結合力の有無は、グアニン四重鎖構造の有無と相関することが明らかになった。

［実験例９］
（熱安定性におけるステム構造の役割）
ＳＬ３８及びＳＬ３８．２の融解温度を算出し、熱安定性におけるステム構造の役割を解析した。具体的には、ＳＬ３８とＳＬ３８．２について、１０℃〜７０℃まで温度を変化させ、２９５ｎｍにおけるＣＤスペクトルを計測した。結果を図１７に示す。図１７は、各温度下で、ＳＬ３８及びＳＬ３８．２の２９５ｎｍにおけるＣＤスペクトルを計測した結果を示すグラフである。

その結果、ＳＬ３８の融解温度は３９℃であり、ＳＬ３８．２の融解温度は４７℃であることが明らかになった。この結果から、ステム構造を変異させて、アデニンとチミンの結合を、より結合力の強いグアニンとシトシンの結合に置き換えることにより、アプタマー構造の熱安定性が高まることが明らかになった。

［実験例１０］
（タンデムに結合させたアプタマー）
タンデムに結合させたアプタマーによる、ＦＧＦＲ１の活性化について解析した。ＦＧＦＲ１は、ｂＦＧＦと結合すると二量体化して、活性化することが知られている。タンデムに連結したアプタマーが、ＦＧＦＲ１を二量体化し、活性化させるか否かを検討した。ＳＬ３８．２をタンデムに連結させた、ＳＬ３８．２＿ｄｉｍｅｒの予測構造を図１８（ａ）に示す。

ステム・ループ構造を有するアプタマーである、ＳＬ３８とＳＬ３８．２を合成した。ＳＬ３８の配列は、配列番号７で表される配列である。また、ＳＬ３８をタンデムに結合させたＳＬ３８＿ｄｉｍｅｒ、ＳＬ３８．２をタンデムに結合させたＳＬ３８．２＿ｄｉｍｅｒを用意した。ＳＬ３８＿ｄｉｍｅｒの配列は配列番号１０で示される配列であり、ＳＬ３８．２＿ｄｉｍｅｒの配列は配列番号１１で示される配列である。

２ｎＭ ｂＦＧＦ、２００ｎＭ ＳＬ３８、２００ｎＭ ＳＬ３８．２、５０ｎＭ又は１００ｎＭ ＳＬ３８＿ｄｉｍｅｒ、５０ｎＭ又は１００ｎＭ ＳＬ３８．２＿ｄｉｍｅｒを、それぞれ、Ａ２０４細胞と接触させた後、Ａ２０４細胞の破砕物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより展開した。続いて、抗ＦＧＦＲ１抗体、抗リン酸化ＦＧＦＲ１抗体を用いて、イムノブロット解析を行った。結果を図１８（ｂ）に示す。

その結果、ＳＬ３８＿ｄｉｍｅｒ又はＳＬ３８．２＿ｄｉｍｅｒはＦＧＦＲ１をリン酸化したが、ＳＬ３８又はＳＬ３８．２はＦＧＦＲ１をリン酸化しなかった。この結果から、タンデムに結合させたアプタマーは、ＦＧＦＲ１を強く活性化することが明らかになった。

続いて、ＳＬ３８．２＿ｄｉｍｅｒの逆の塩基配列を有するＲｅｖ−ＳＬ３８．２＿ｄｉｍｅｒを作製した。Ｒｅｖ−ＳＬ３８．２＿ｄｉｍｅｒの塩基配列を配列番号１２に示す。続いて、２ｎＭ ｂＦＧＦ、１０、５０、１００及び５００ｎＭ ＳＬ３８．２＿ｄｉｍｅｒ、並びに５００ｎＭ Ｒｅｖ−ＳＬ３８．２＿ｄｉｍｅｒを、それぞれＡ２０４細胞と接触させた後、Ａ２０４細胞の破砕物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより展開した。

続いて、抗ＦＧＦＲ１抗体、抗リン酸化ＦＧＦＲ１抗体、抗リン酸化Ａｋｔ抗体、抗リン酸化Ｅｒｋ１／２抗体を用いて、イムノブロット解析を行った。図１８（ｃ）は、ｂＦＧＦ、ＳＬ３８．２＿ｄｉｍｅｒ、Ｒｅｖ−ＳＬ３８．２＿ｄｉｍｅｒによるＦＧＦＲ、Ａｋｔ、Ｅｒｋ１／２のリン酸化を解析した結果である。

その結果、１０ｎＭ ＳＬ３８．２＿ｄｉｍｅｒは、２ｎＭ ｂＦＧＦと同程度に、ＦＧＦＲ１、Ａｋｔ、Ｅｒｋ１／２をリン酸化することが明らかになった。

以上の結果から、単量体のＳＬ３８、ＳＬ３８．２はＦＧＦＲ１に結合するがＦＧＦＲ１を活性化することができないことが明らかとなった。一方、ＳＬ３８、ＳＬ３８．２を２量体化したＳＬ３８＿ｄｉｍｅｒ、ＳＬ３８．２＿ｄｉｍｅｒはＦＧＦＲ１を活性化することが明らかとなった。

［実験例１１］
（タンデムに結合させたアプタマーによるＦＧＦＲ１経路の活性化）
ＳＬ３８．２＿ｄｉｍｅｒによる、ＦＧＦＲ、下流のＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路及びＭＡＰＫ経路の活性化について、解析した。

Ａ２０４細胞と、２ｎＭ ｂＦＧＦ又は５０ｎＭ ＳＬ３８．２＿ｄｉｍｅｒを接触させて、１、５、１０、１５、３０分後に細胞を回収した。続いて、各細胞の破砕物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとイムノブロットにより解析した。

図１９は、Ａ２０４細胞と、ｂＦＧＦ又はＳＬ３８．２＿ｄｉｍｅｒを接触させ、各時間後に、ＦＧＦＲ１、Ａｋｔ、Ｅｒｋ１／２のリン酸化を解析した結果である。図１９中、「Ｖｅｈｉｃｌｅ」は陰性対照の結果である。その結果、ｂＦＧＦは、刺激して１分〜３０分後まで継続して、ＦＧＦＲをリン酸化することが確認された。一方、ＳＬ３８．２＿ｄｉｍｅｒにより刺激した場合、刺激して１分後に比較して、刺激して５分〜３０分後には、ＦＧＦＲ１のリン酸化が減弱することが明らかになった。

［実験例１２］
（タンデムに結合させたアプタマーによるヒトｉＰＳ細胞の多能性維持）
ＳＬ３８．２＿ｄｉｍｅｒ刺激したヒトｉＰＳ細胞における、多能性マーカーの発現量を解析した。多能性マーカーとしては、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ−４を検討した。

ヒトｉＰＳ細胞（４０９Ｂ２細胞）を、３ｎＭ ｂＦＧＦ、５００ｎＭ ＳＬ３８．２＿ｄｉｍｅｒ、５００ｎＭ Ｒｅｖ−ＳＬ３８．２＿ｄｉｍｅｒにより刺激し、Ｏｃｔ−４及びＮａｎｏｇの発現量を、ＲＴ−ｑＰＣＲにより解析した。

図２０（ａ）は、刺激後のＯｃｔ−４及びＮａｎｏｇの発現量を、ＲＴ−ｑＰＣＲにより解析し、ハウスキーピング遺伝子であるＲＰＬＰ０で規格化した結果を示すグラフである。図２０（ａ）中、「Ｖｅｈｉｃｌｅ」は陰性対照の結果を示す。その結果、ｂＦＧＦと同様に、ＳＬ３８．２＿ｄｉｍｅｒは、多能性マーカー遺伝子の発現を維持する効果を有することが明らかになった。

続いて、ｂＦＧＦ、ＳＬ３８．２＿ｄｉｍｅｒ、Ｒｅｖ−ＳＬ３８．２＿ｄｉｍｅｒによる刺激が細胞増殖に与える影響を解析した。具体的には、ヒトｉＰＳ細胞（４０９Ｂ２細胞）を、３ｎＭ ｂＦＧＦ、５００ｎＭ ＳＬ３８．２＿ｄｉｍｅｒ、５００ｎＭ Ｒｅｖ−ＳＬ３８．２＿ｄｉｍｅｒにより刺激した後、細胞数をカウントした。

結果を図２０（ｂ）は細胞数を測定した結果を示すグラフである。その結果、ＳＬ３８．２＿ｄｉｍｅｒによる刺激は、ｂＦＧＦと同程度にｉＰＳ細胞の増殖を促進することが明らかになった。

［実験例１３］
ヒトｉＰＳ細胞をＳＬ３８．２＿ｄｉｍｅｒ刺激し、多能性マーカーであるＳＳＥＡ−４タンパク質の発現量の変化を解析した。

ヒトｉＰＳ細胞（４０９Ｂ２細胞）を、３ｎＭ ｂＦＧＦ、５００ｎＭ ＳＬ３８．２＿ｄｉｍｅｒ、５００ｎＭ Ｒｅｖ−ＳＬ３８．２＿ｄｉｍｅｒにより刺激し、ＳＳＥＡ−４タンパク質の発現量を蛍光免疫染色により解析した。

図２１は、蛍光免疫染色の結果を示す写真である。図２１中、「ＰＨ ｉｍａｇｅ」は位相差顕微鏡写真の結果であることを示し、「Ｎｕｃｌｅｉ（Ｈｏｅｃｈｓｔ）」はＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で核を染色した結果であることを示し、「ＳＳＥＡ−４」は蛍光免疫染色によりＳＳＥＡ−４タンパク質の発現を検出した結果であることを示す。また、「Ｖｅｈｉｃｌｅ」は陰性対照の結果であることを示す。

その結果、ＳＬ３８．２＿ｄｉｍｅｒによる刺激は、ｂＦＧＦと同程度に、ＳＳＥＡ−４タンパク質の発現を促進することが明らかになった。この結果は、ＳＬ３８．２＿ｄｉｍｅｒをｂＦＧＦの代替物として使用できることを更に支持するものである。

［実験例１４］
（二量体ＤＮＡアプタマーの合成）
様々な結合様式の二量体ＤＮＡアプタマーを合成した。具体的には、アプタマー同士を連結するリンカーが１本鎖ＤＮＡであるアプタマーと、アプタマー同士を連結するリンカーが２本鎖ＤＮＡであるアプタマーを合成した。

図２２（ａ）は、プタマー同士を連結するリンカーが２本鎖ＤＮＡであるアプタマーである、ＤＰ２０及びＤＰ０の構造を示す模式図である。ＤＰ２０は、配列番号１３で表されるＤＰ＿Ａと、配列番号１４で表されるＤＰ＿Ｂがハイブリダイズしたものであり、アプタマー同士を連結するリンカーが２本鎖ＤＮＡである二量体ＤＮＡアプタマーである。ＤＰ＿Ａは、ＳＬ３８．２の塩基配列の３’末端に、配列番号１５で表されるリンカー配列が連結した塩基配列を有する。ＤＰ＿Ｂは、ＳＬ３８．２の塩基配列の３’末端に、配列番号１６で表されるリンカー配列が連結した塩基配列を有する。

また、ＤＰ０は、配列番号１３で表されるＤＰ＿Ａと、配列番号１７で表されるＤＰ＿Ｃがハイブリダイズしたものであり、アプタマー同士を連結するリンカーが２本鎖ＤＮＡである二量体ＤＮＡアプタマーである。ＤＰ＿Ｃは、ＳＬ３８．２の塩基配列の５’末端に、配列番号１８で表されるリンカー配列が連結した塩基配列を有する。また、ＤＰ＿Ｃにおけるステム配列は、ＤＰ＿Ａのステム配列とのハイブリダイズを抑制するためにＤＰ＿Ａとは異なる塩基配列に置き換えた。

図２２（ｂ）は、プタマー同士を連結するリンカーが１本鎖ＤＮＡであるアプタマーである、ＳＬ３８．２＿ｄｉｍｅｒ及びＳＬ３８．２＿ｄｉｍｅｒ２０の構造を示す模式図である。

ＳＬ３８．２＿ｄｉｍｅｒ２０の塩基配列は、配列番号１９に表される配列である。ＳＬ３８．２＿ｄｉｍｅｒ２０は、２つのＳＬ３８．２が２０個のｔ（チミン）が連続したリンカーで連結された塩基配列を有している。

ＳＬ３８．２＿ｄｉｍｅｒの２個のループ構造は近接しているが、ＳＬ３８．２＿ｄｉｍｅｒ２０の２個のループ構造はＳＬ３８．２＿ｄｉｍｅｒよりも離れている。また、ＤＰ０の２個のループ構造は近接しているが、ＤＰ２０の２個のループ構造はＤＰ０よりも離れている。

［実験例１５］
（二量体ＤＮＡアプタマーによるＦＧＦＲ１経路の活性化）
二量体ＤＮＡアプタマーによる、ＦＧＦＲ１経路の活性化について解析した。具体的には、それぞれ５００ｎＭの、ＳＬ３８．２＿ｄｉｍｅｒ、Ｒｅｖ−Ｌ３８．２＿ｄｉｍｅｒ、ＳＬ３８．２＿ｄｉｍｅｒ２０、ＤＰ２０、ＤＰ０、及び２ｎＭのｂＦＧＦをＡ２０４細胞に接触させた。

続いて、５分後に、各細胞を破砕し、細胞破砕液を得た。ＦＧＦＲ１のリン酸化は、ＰａｔｈＳｃａｎ（登録商標）ｐｈｏｓｐｈｏ−ＦＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １（ｐａｎＴｙｒ） ｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡキットにより解析した。

図２３（ａ）は、ＦＧＦＲ１のリン酸化を測定した結果を示すグラフである。図２３（ａ）中、「ｖｅｈｉｃｌｅ」は陰性対照である。

その結果、ＳＬ３８．２＿ｄｉｍｅｒ、ＳＬ３８．２＿ｄｉｍｅｒ２０、ＤＰ２０、ＤＰ０は、ｂＦＧＦと同様に、ＦＧＦＲ１のリン酸化を促進することが明らかになった。この結果から、ＳＬ３８．２＿ｄｉｍｅｒ、ＳＬ３８．２＿ｄｉｍｅｒ２０、ＤＰ２０、ＤＰ０は、ＦＧＦＲ１を活性化することが明らかになった。

次に、それぞれ５００ｎＭの、ＳＬ３８．２＿ｄｉｍｅｒ、Ｒｅｖ−Ｌ３８．２＿ｄｉｍｅｒ、ＳＬ３８．２＿ｄｉｍｅｒ２０、ＤＰ２０、ＤＰ０、及び２ｎＭのｂＦＧＦをＡ２０４細胞に接触させ、Ｅｒｋ１／２のリン酸化について解析した。

図２３（ｂ）は解析結果を示す写真である。その結果、ＳＬ３８．２＿ｄｉｍｅｒ、ＳＬ３８．２＿ｄｉｍｅｒ２０、ＤＰ２０、ＤＰ０は、ｂＦＧＦと同様に、Ｅｒｋ１／２のリン酸化を促進することが明らかになった。この結果から、ＳＬ３８．２＿ｄｉｍｅｒ、ＳＬ３８．２＿ｄｉｍｅｒ２０、ＤＰ２０、ＤＰ０は、Ｅｒｋ１／２を活性化することが明らかになった。

［実験例１６］
（二量体ＤＮＡアプタマーの刺激によるｉＰＳ細胞の多能性維持）
二量体ＤＮＡアプタマーの刺激による、ｉＰＳ細胞における、多能性マーカーの発現を解析した。

それぞれ５００ｎＭの、ＳＬ３８．２＿ｄｉｍｅｒ、Ｒｅｖ−Ｌ３８．２＿ｄｉｍｅｒ、ＳＬ３８．２＿ｄｉｍｅｒ２０、ＤＰ２０、ＤＰ０、及び３ｎＭのｂＦＧＦを含む培地でｉＰＳ細胞（４０９Ｂ２細胞）を７日間培養した。培地は、培養開始後１、３、５日目に交換した。続いて、Ａｌｅｘａ４８８標識抗ＳＳＥＡ−４抗体によりｉＰＳ細胞を染色し、ＳＳＥＡ−４タンパク質の発現をフローサイトメトリーで解析した。

図２４（ａ）は、ＳＳＥＡ−４タンパク質の発現を解析した結果を示すグラフである。図２４（ａ）中、横軸は蛍光強度を示し、縦軸は細胞数を示す。また、図２４（ｂ）は、図２４（ａ）の各細胞における蛍光強度の平均値を示すグラフである。図２４（ａ）及び（ｂ）中、「Ｖｅｈｉｃｌｅ」は陰性対照の結果を示す。

その結果、ＳＬ３８．２＿ｄｉｍｅｒを培地に添加した場合、ｂＦＧＦを培地に添加した場合と同程度にＳＳＥＡ−４タンパク質が発現することが明らかになった。一方、Ｒｅｖ−Ｌ３８．２＿ｄｉｍｅｒ、ＳＬ３８．２＿ｄｉｍｅｒ２０、ＤＰ２０、ＤＰ０を培地に添加した場合、ＳＳＥＡ−４タンパク質の発現量は、対照群と同等であった。

この結果は、ＳＬ３８．２＿ｄｉｍｅｒ、ＳＬ３８．２＿ｄｉｍｅｒ２０、ＤＰ２０、ＤＰ０は、ｂＦＧＦと同様に、ＦＧＦＲ１経路を活性化することができるものの、ｉＰＳ細胞の多能性を維持する活性はＳＬ３８．２＿ｄｉｍｅｒが最も高いことを示す。

本発明によれば、ｂＦＧＦの活性をアプタマーで模倣する技術を提供することができる。

１，２，３…アプタマー、４，５，６，７，８ａ，８ｂ，９ａ，９ｂ，１０…マルチ構造アプタマー、１０…ポリヌクレオチド、２０…ループ構造、３０…ステム構造、４０，４０ａ，４０ｂ，４０ｃ…リンカー、１００，１０１…アプタマー固定担体、１１０，１２０…固相担体。

Claims (11)

1. 配列番号５、６、７若しくは９に記載の塩基配列を含み、Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ １（ＦＧＦＲ１）に結合する活性を有するポリヌクレオチド、又は、配列番号５、６、７若しくは９に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列を含み且つＦＧＦＲ１に結合する活性を有するポリヌクレオチドからなる、アプタマー。
2. グアニン四重鎖構造を形成する、請求項１に記載のアプタマー。
3. 請求項１又は２に記載のアプタマーが２つ以上連結された、ＦＧＦＲ１に結合してＦＧＦＲ１を活性化する活性を有する、アプタマー。
4. 請求項１又は２に記載のアプタマーがリンカーで連結され、前記リンカーの長さがポリヌクレオチド換算で８０塩基以下の長さである、請求項３に記載のアプタマー。
5. 配列番号１１に記載の塩基配列からなるか、又は配列番号１１に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり且つＦＧＦＲ１に結合してＦＧＦＲ１を活性化する活性を有する、請求項３又は４に記載のアプタマー。
6. 請求項３〜５のいずれか一項に記載のアプタマーを有効成分として含有する、ＦＧＦＲ１シグナリング関連疾患の予防又は治療剤。
7. 請求項３〜５のいずれか一項に記載のアプタマーを有効成分として含有する、細胞培養用組成物。
8. 請求項３〜５のいずれか一項に記載のアプタマーを含む培地で、ＦＧＦＲ１陽性細胞を培養することを含む、細胞培養方法。
9. 請求項３〜５のいずれか一項に記載のアプタマーを、インビトロでＦＧＦＲ１陽性細胞と接触させることを含む、前記ＦＧＦＲ１の活性化方法。
10. 請求項３〜５のいずれか一項に記載のアプタマーを、インビトロでＦＧＦＲ１陽性細胞と接触させることを含む、前記細胞の増殖促進方法。
11. 請求項３〜５のいずれか一項に記載のアプタマーを、ＦＧＦＲ１陽性多能性幹細胞と接触させることを含む、前記多能性幹細胞の多能性維持方法。

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