JP6935883B2 - 蛍光画像診断の前処理方法 - Google Patents

Description

本発明は，腫瘍マーカー等に反応して蛍光を発する蛍光診断薬を用いて蛍光画像診断を行う際の組織の前処理方法に関する。

がん手術の成功は早期かつ正確ながん細胞の位置の特定とその完全な除去に依存している。このため，手術中の腫瘍領域の可視化が求められており，腫瘍に特異的に反応する蛍光プローブも開発されている（非特許文献１〜８）。しかし，蛍光プローブをそのまま腫瘍領域に塗布するのみでは，早期に十分な蛍光強度が得られないこと，細胞がそもそも有している自家発光との区別が困難であること，及び蛍光の消失が早いことなどの問題があった。そのため，ｋｉｎｅｔｉｃ ｍａｐを用いたがん領域の特定方法（非特許文献９）や，切断，圧縮及び洗浄処理（非特許文献１０），ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｔｒａｌ ｏｐｅｎ−ａｉｒ法（非特許文献１１），及び細胞内タンパク質と架橋する蛍光プローブ（非特許文献１２）が研究されている。

Ｙａｓｕｔｅｒｕ Ｕｒａｎｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ；３（１１０）：１１０−１１９（２０１１） Ｙｏｉｃｈｉ Ｍｉｙａｔａら，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ；７：３６５４２（２０１７） Ｔａｋｅｓｈｉ Ｍｉｚｕｓｈｉｍａら，ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ；１６：４１１（２０１６） Ｙａｓｕｔｅｒｕ Ｕｒａｎｏ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ；１６：６０２−６０８（２０１２） Ｍａｋｏｔｏ Ｍｉｔｓｕｎａｇａら，Ｇｕｔ；６２：１１７９−１１８６（２０１３） Ｈｉｒｏａｋｉ Ｕｅｏら，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ；５：１２０８０（２０１５） Ｙｏｓｈｉａｋｉ Ｓｈｉｎｄｅｎら，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ；６：２７５２５（２０１６） Ｈａｒｕａｋｉ Ｈｉｎｏら，Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ；９：２０３−２１０（２０１６） Ｙｕｋｏ Ｎａｋａｍｕｒａら，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ；７（３２）：５１１２４−５１１３７（２０１６） Ｔｏｓｈｉｋｏ Ｈａｒａｄａら，Ｃｏｎｔｒａｓｔ Ｍｅｄｉａ Ｍｏ． Ｉｍａｇｉｎｇ（２０１６）ＤＯＩ：１０．１００２／ｃｍｍｉ．１７７５ Ａｌｉ Ｂｅｈｒｏｏｚら，Ｏｐｔｉｃｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ；４２（１５）：２９６４−２９６７（２０１７） Ｙｕｋｏ Ｎａｋａｍｕｒａら，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ；８（２４）：３９５１２−３９５２１（２０１７）

本発明者らは，蛍光プローブを用いた細胞塊又は組織の染色について検討を進めたところ，臨床において手術により摘出された組織やリンパ節が，明らかにがんであるにもかかわらず，蛍光プローブを接触させても非がん領域と区別可能な蛍光が観察されない場合があることを見出した。更に，本発明者らが検討を進めた結果，がん細胞塊に蛍光プローブを接触させた場合には，表面のがん細胞は迅速に蛍光発光する一方で，内部のがん細胞は発光までに時間がかかることを見出した。これにより，本発明者らは，従来の蛍光プローブを用いたがん細胞の検出方法では，細胞塊の表面に存在しない癌細胞を検出することが難しいという問題を新たに見出した。よって，本発明は，細胞塊の内部に存在する，蛍光プローブにより発光させようとする標的細胞を迅速に発光させる方法を提供することを目的とする。

本発明者らは，蛍光プローブにより蛍光発光させようとする標的細胞を含む細胞塊について，種々の処理を行い発光の改善について検討を行った結果，標的細胞を含む細胞塊内のカルシウムイオンを除去することにより，細胞塊内部まで迅速に発光させることができることを見出し，本発明を完成させた。本発明の処理方法は，細胞の種類及び蛍光プローブの種類を問わず，あらゆる接着細胞とあらゆる蛍光プローブでも利用可能な汎用的な方法である。

よって，本発明は，以下に関する：
（１） 標的細胞を蛍光発光させる方法であって，
当該標的細胞を含む細胞塊又は組織内のカルシウムイオンを除去すること，及び
当該標的細胞と接触することにより又は当該標的細胞の内部に取り込まれることにより蛍光を発する蛍光プローブを，当該細胞塊又は組織に接触させることを含む方法。
（２） 標的細胞塊の内部を蛍光発光させる方法，又は細胞塊若しくは組織の内部に存在する標的細胞を蛍光発光させる方法である，（１）に記載の方法。
（３） 標的細胞の存在する領域を決定する方法であって，
当該標的細胞が存在すると思われる細胞塊又は組織内のカルシウムイオンを除去すること，
当該標的細胞と接触することにより又は当該標的細胞の内部に取り込まれることにより蛍光を発する蛍光プローブを，当該標的細胞が存在すると思われる細胞塊又は組織に接触させること，及び，
前記蛍光プローブによる蛍光発光が観察された領域を前記標的細胞が存在する領域であると決定することを含む方法。
（４） 前記標的細胞と接触すること又はその内部に取り込まれることにより蛍光を発する蛍光プローブが，該標的細胞が含有する物質と反応することにより蛍光を発するか，又は該標的細胞のｐＨなどの物性により蛍光を発するか，又は，該標的細胞が低酸素であることにより蛍光を発する蛍光プローブである，（１）〜（３）のいずれか１項に記載の方法。
（５） 前記標的細胞が含有する物質が，酵素，イオン，一酸化窒素，又は活性酸素種である，（１）〜（４）のいずれか１項に記載の方法。
（６） 前記酵素が，グリコシダーゼ，プロテアーゼ，又はペプチダーゼである，（５）に記載の方法。
（７） 前記酵素が，細胞膜表面に存在する酵素である，（５）又は（６）に記載の方法。
（８） 前記イオンがカルシウムイオン又は金属イオンである，（５）に記載の方法。
（９） 前記カルシウムイオンの除去が，金属イオンキレート剤を含有する緩衝液又はカルシウム非含有緩衝液中に該標的細胞を含む細胞塊又は組織を浸漬させることにより行われる，（１）〜（８）のいずれか１項に記載の方法。
（１０） 前記浸漬が，３０秒〜３０分間行われることを特徴とする，（９）に記載の方法。
（１１） 前記蛍光プローブとの接触工程がｐＨ６〜８の条件下で行われる，（１）〜（１０）のいずれか１項に記載の方法。
（１２） 前記標的細胞が，がん細胞又は腫瘍細胞である，（１）〜（１１）のいずれか１項に記載の方法。
（１３） がんが固形癌である，（１２）に記載の方法。
（１４） 標的細胞を非標的細胞から識別可能な強度の蛍光を標的細胞から発光させる方法である，（１）〜（１３）のいずれか１項に記載の方法。
（１５） 前記蛍光プローブが，ｇＧｌｕ−ＨＭＲＧ，Ｌｅｕ−ＨＭＲＧ，ＥＰ−ＨＭＲＧ又はＦｅＲｈｏＮｏｘ−１である，（１）〜（１４）のいずれか１項に記載の方法。
（１６） ｅｘ ｖｉｖｏで行われる，（１）〜（１５）のいずれか１項に記載の方法。
（１７） 生体内の標的細胞に対して行われる，（１）〜（１６）のいずれか１項に記載の方法。
（１８） がん細胞又は腫瘍細胞と非がん細胞又は非腫瘍細胞とを区別する方法であって，（１２）に記載の方法により，がん細胞又は腫瘍細胞を蛍光発光させること，及び，蛍光を発光している細胞をがん細胞又は腫瘍細胞と決定し，蛍光を発光していない細胞を非がん細胞又は非腫瘍細胞と決定することにより，がん細胞又は腫瘍細胞と非がん細胞又は非腫瘍細胞とを区別することを含む方法。
（１９） がん又は腫瘍の診断方法であって，
被験者由来の細胞塊サンプル又は組織サンプル中のカルシウムイオンを除去すること；
がん細胞若しくは腫瘍細胞と接触することにより又はがん細胞若しくは腫瘍細胞の内部に取り込まれることにより蛍光を発する蛍光プローブを，当該サンプルに接触させること；及び，
当該サンプル中に蛍光を発光している細胞が存在する場合，該被験者をがん又は腫瘍に罹患していると診断することを含む方法。

本発明の標的細胞を蛍光発光させる方法は，細胞塊や組織の内部に存在する標的細胞を発光させることができることから，臨床サンプルなどの必ずしも表面に標的細胞が存在しない可能性のあるサンプル中の標的細胞の検出に用いることができる。

臨床がん検体におけるＰＢＳ（−）前処理の効果。乳がん手術に伴い切除されたリンパ節検体を０分，１分，５分，１０分または成行時間の間ＰＢＳ（−）に浸漬する前処理の後，５０μＭのｇＧｌｕ−ＨＭＲＧ溶液に浸漬直後から，１０分間の蛍光増加。同検体の病理診断にてがん転移ありと診断されたものは黒丸で，がん転移が認められなかったものは白三角で示す。 がん由来培養細胞塊（スフェロイド）におけるＰＢＳ（−）前処理の効果。ＨｅＬａ細胞のスフェロイドをＨＢＳＳで洗浄後ＨＢＳＳに溶解した１μＭのｇＧｌｕ−ＨＭＲＧ溶液に浸漬（上）およびＰＢＳ（−）に１０分間浸漬する前処理の後，ＰＢＳ（−）に溶解した１μＭのｇＧｌｕ−ＨＭＲＧ溶液に浸漬（下）したものの，蛍光強度の時間変化。 ＰＢＳ（−）が細胞接着に及ぼす影響。ＰＢＳ（−）前処理なしのスフェロイド（左）と１０分間のＰＢＳ（−）浸漬による前処理したスフェロイドを１μＭのｇＧｌｕ−ＨＭＲＧ溶液に浸漬した直後の細胞透過光像。上段は全体像，下段は細胞塊辺縁部の拡大像を示す。 スフェロイドへの試薬の浸透及び反応を解析した方法の模式図。図５〜図１０に示すＤｅｐｔｈが例えば２００μｍの場合，蛍光顕微鏡で得られた画像の蛍光強度のうち，この図に示すように外周から２００μｍの円周を内側，そこから外側１００μｍの円周を外側とした白抜きの領域の蛍光強度を求めた。 ＰＢＳ（−）前処理によるスフェロイドへの試薬の浸透及び反応の変化。前処理なしでＨＢＳＳに溶解した５０μＭ ｇＧｌｕ−ＨＭＲＧ溶液に浸漬５分後（黒三角）およびＰＢＳ（−）に１０分間浸漬する前処理の後，ＰＢＳ（−）に溶解した５０μＭ ｇＧｌｕ−ＨＭＲＧ溶液に浸漬５分後（黒丸）のＨｅＬａ細胞スフェロイドの蛍光強度分布。 前処理溶液の組成による前処理効果の違い。Ａ５４９細胞スフェロイドをＰＢＳ−（黒丸），ＰＢＳ＋（黒ひし形），ＰＢＳ＋Ｃａ（＊），ＰＢＳ＋Ｍｇ（黒四角）の各溶液に１０分間浸漬したのち，各溶液に溶解した ５０μＭ ｇＧｌｕ−ＨＭＲＧ溶液に浸漬５分後の蛍光強度分布。 前処理溶液の組成による前処理効果の違い。Ａ５４９細胞スフェロイドをＰＢＳ−（黒丸），ＰＢＳ＋（黒ひし形），生理食塩水（白四角，＊）に１０分間浸漬したのち，ＰＢＳ−（黒丸，＊），ＰＢＳ＋（黒ひし形），生理食塩水（白四角）の各溶液に溶解した ５０μＭ ｇＧｌｕ−ＨＭＲＧ溶液に浸漬５分後の蛍光強度分布。 前処理の有無および前処理溶液の組成による試薬の浸透・反応の違い。ＨｅＬａ細胞スフェロイドを，前処理しないもの（黒三角），およびＰＢＳ−（黒丸），ＰＢＳ＋（黒ひし形），ＰＢＳ−ＥＤＴＡ（白ひし形）の各溶液に１０分間浸漬したのち，ＰＢＳ−（黒三角，黒丸），ＰＢＳ＋（黒ひし形），ＰＢＳ−ＥＤＴＡ（白ひし形）の各溶液に溶解した ５０μＭ ｇＧｌｕ−ＨＭＲＧ溶液に浸漬５分後の蛍光強度分布。 前処理の有無および前処理溶液の組成による試薬の浸透・反応の違い。Ａ５４９細胞スフェロイドを前処理しないもの（黒三角），およびＰＢＳ−（黒丸），ＰＢＳ＋（黒ひし形），ＰＢＳ−ＥＤＴＡ（白ひし形）の各溶液に１０分間浸漬したのち，ＰＢＳ−（黒三角，黒丸），ＰＢＳ＋（黒ひし形），ＰＢＳ−ＥＤＴＡ（白ひし形）の各溶液に溶解した ５０μＭ ｇＧｌｕ−ＨＭＲＧ溶液に浸漬５分後の蛍光強度分布。 前処理溶液の組成による前処理効果の違い。Ａ５４９細胞スフェロイドをＰＢＳ−（黒丸），ＰＢＳ＋（黒ひし形），ＰＢＳ＋Ｃａ（＊），ＰＢＳ＋ＥＤＴＡ（白丸）の各溶液に１０分間浸漬したのち，各溶液に溶解した ５μＭ ＦｅＲｈｏＮｏｘｇ−１溶液に浸漬５分後の蛍光強度分布。

一態様において，本発明は，標的細胞を蛍光発光させる方法であって，
当該標的細胞を含む細胞塊又は組織内のカルシウムイオンを除去すること，及び
当該標的細胞と接触することにより又は当該標的細胞の内部に取り込まれることにより蛍光を発する蛍光プローブを，当該細胞塊又は組織に接触させることを含む方法に関する。好ましくは，本発明は，前記工程を有する，標的細胞塊の内部を蛍光発光させる方法，又は細胞塊若しくは組織の内部に存在する標的細胞を蛍光発光させる方法である。

別の態様において，本発明は，標的細胞の存在する領域を決定する方法であって，
当該標的細胞が存在すると思われる細胞塊又は組織内のカルシウムイオンを除去すること，
当該標的細胞と接触することにより又は当該標的細胞の内部に取り込まれることにより蛍光を発する蛍光プローブを，当該標的細胞が存在すると思われる細胞塊又は組織に接触させること，及び，
前記蛍光プローブによる蛍光発光が観察された領域を前記標的細胞が存在する領域であると決定することを含む方法に関する。

別の態様において，本発明は，標的細胞の存否を決定する方法であって，
被検細胞塊又は組織内のカルシウムイオンを除去すること，
当該標的細胞と接触することにより又は当該標的細胞の内部に取り込まれることにより蛍光を発する蛍光プローブを，当該標被検細胞塊又は組織に接触させること，及び，
前記蛍光プローブによる蛍光発光が観察された場合には，前記標的細胞が存在すると決定することを含む方法に関する。

本発明において，「標的細胞」とは，採用された蛍光プローブと接触し又は蛍光プローブを取り込むことにより発光する細胞を意味する。よって，標的細胞と採用する蛍光プローブは目的に応じて適宜選択することができる。例えば，蛍光プローブがｇＧｌｕ−ＨＭＲＧである場合，標的細胞はがん細胞，特には固形癌細胞である。本明細書における「癌」としては，これらに限定されるものではないが，肺癌，非小細胞肺癌，小細胞肺癌，非ホジキンリンパ腫， 副腎皮質癌，ＡＩＤＳ関連癌，エイズ関連リンパ腫，小児小脳星細胞腫，小児大脳星細胞腫，基底細胞癌，皮膚癌（非黒色腫），胆道癌，肝外胆管がん，肝内胆管癌，膀胱癌，骨や関節の癌，骨肉腫と悪性線維組織球腫，脳癌，脳腫瘍，脳幹神経膠腫，小脳星細胞腫，神経膠腫，大脳星細胞腫／悪性神経膠腫，上衣腫，髄芽腫，テント上原始神経外胚葉性腫瘍，視経路および視床下部神経膠腫，頭頸部癌，転移性扁平上皮頸部癌，気管支腺腫／カルチノイド，カルチノイド腫瘍，神経系リンパ腫，中枢神経系の癌，中枢神経系リンパ腫，神経芽細胞腫，小児癌，Ｓｅｚｉａｒｙ症候群，頭蓋外胚細胞腫瘍，性腺外胚細胞腫瘍，肝外胆管癌，眼の癌，眼内黒色腫，網膜芽細胞腫，唾液腺癌，口腔癌，口腔空洞癌，口腔咽頭癌，口腔癌，舌の癌，食道がん，胃癌，消化管カルチノイド腫瘍，消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ），小腸癌，結腸癌，結腸直腸癌，直腸癌，肛門直腸癌，肛門癌，胚細胞腫瘍，肝細胞（肝臓）癌，ホジキンリンパ腫，喉頭癌，咽頭癌，下咽頭癌，鼻咽頭癌，副鼻腔および鼻腔癌，咽喉癌，膵島細胞腫瘍（内分泌膵臓），膵臓癌，副甲状腺癌，肝臓癌，胆嚢癌，虫垂癌，腎臓癌，尿道癌，腎盂と尿管の移行上皮癌および他の泌尿器の癌，扁平上皮癌，陰茎癌，精巣癌，胸腺腫，胸腺腫および胸腺癌，甲状腺癌，前立腺癌，卵巣癌，卵巣上皮癌，卵巣低悪性度腫瘍，卵巣胚細胞腫瘍，妊娠性絨毛腫瘍，乳癌，子宮癌，子宮肉腫，子宮頸癌，子宮内膜がん，子宮体がん，膣がん，外陰癌，ウィルムス腫瘍，皮膚癌（非メラノーマ），皮膚癌（黒色腫），褐色細胞腫，メルケル細胞皮膚癌，中皮腫，悪性中皮腫，多発性内分泌腫瘍症候群，骨髄異形成症候群，骨髄異形成／骨髄増殖性疾患，松果体芽腫および下垂体腫瘍，形質細胞腫，胸膜肺芽細胞腫，網膜芽細胞腫，横紋筋肉腫，肉腫，ユーイング腫瘍，軟組織肉腫，軟組織肉腫，菌状息肉腫，カポジ肉腫を挙げることができる。

本明細書において，「細胞塊」は，複数の同種又は異種の細胞が集積して塊状となったものを意味し，組織を含む。本明細書において，「組織」は，同種又は異種の細胞が三次元に配置して集合した生体構造を意味し，例えば，上皮組織，結合組織，筋組織，及び神経組織が含まれる。「標的細胞を含む細胞塊又は組織」は，標的細胞を含む限り他に標的細胞以外の細胞又は組織を有していてもよい。また，「標的細胞が存在すると思われる細胞塊又は組織」は，かならずしも標的細胞の存在を必要とするものではなく，標的細胞が存在する可能性がある細胞塊又は組織であればよく，かつ，標的細胞以外の細胞又は組織を有していてもよい。「標的細胞塊」は，主に標的細胞から構成される細胞塊を意味する。

標的細胞による蛍光の発光は，蛍光プローブが標的細胞の表面に接触し，または標的細胞の内部に取り込まれ，当該細胞表面又は細胞内の環境により蛍光色素を生じることにより行われる。蛍光プローブから蛍光色素を生じる環境とは，低酸素や酸性／アルカリ性などの環境であってもよいし，特定の物質が存在する環境であってもよい。すなわち，「標的細胞と接触すること又はその内部に取り込まれることにより蛍光を発する蛍光プローブ」は，該標的細胞が含有する物質と反応することにより蛍光を発するか，又は，該標的細胞又はその周辺が低酸素，酸性若しくはアルカリ性であることにより蛍光を発する蛍光プローブである。ここで，酸性若しくはアルカリ性は，生体にとってのｐＨの高低を意味し，例えば，酸性とはｐＨ６以下であってよく，アルカリ性とはｐＨ８以上であってよい。

また，前記特定の物質の例としては，酵素，イオン，一酸化窒素，又は活性酸素種を挙げることができる。酵素は特定の反応を触媒可能なタンパク質であれば特に限定されるものではないが，例えば，グリコシダーゼ，プロテアーゼ，又はペプチダーゼ（γーグルタミルトランスペプチダーゼなど）を挙げることができる。また，前記酵素，細胞膜表面に存在する酵素であっても，細胞内に存在する酵素であってもよい。本明細書におけるイオンとしては，カルシウムイオン又は金属イオン（例えば，鉄イオン，銅イオン，亜鉛イオン）を挙げることができる。活性酸素種としては，次亜塩素酸，過酸化水素，活性酸素，パーオキシナイトライト及びヒドロキシラジカルを挙げることができる。

例えば，蛍光プローブは，親水性とすることなどにより細胞内に取り込まれない物質であってもよい。具体的な蛍光プローブの例としては，ｇＧｌｕ−ＨＭＲＧ，Ｌｅｕ−ＨＭＲＧ，ＥＰ−ＨＭＲＧ又はＦｅＲｈｏＮｏｘ−１を挙げることができる。また，蛍光プローブは，リポソームなどのビークルに包埋されるなどによりＤＤＳ化されたものでもよい。

カルシウムイオンの除去は，細胞塊や組織内のカルシウムイオンが除去される方法であれば特に限定されるものではないが，例えば，金属イオンキレート剤を含有する緩衝剤又はカルシウム非含有緩衝液中に該標的細胞を含む細胞塊又は組織を浸漬させることにより行うことができる。金属イオンキレート剤としては，エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ），グリコールエーテルジアミン４酢酸（ＥＧＴＡ），またはクエン酸等の２価金属イオンキレート剤を用いることができる。また，緩衝液としては，リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ），リン酸緩衝液，クエン酸ナトリウム緩衝液，クエン酸−リン酸緩衝液，トリス−塩酸緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ），ＭＥＳ，ＰＩＰＥＳ，ＨＥＰＥＳ，ＡＤＡ，ＡＣＥＳ，ＭＯＰＳＯ，ＢＥＳ，ＭＯＰＳ，ＴＥＳ，ＤＩＰＳＯ，ＴＡＰＳＯ，ＰＯＰＳＯ，ＨＥＰＰＳＯ，ＥＰＰＳ，Ｂｉｃｉｎｅ，ＴＡＰＳ，Ｔｒｉｃｉｎｅを挙げることができる。該浸漬は，例えば，３０秒間〜１時間，３０秒間〜３０分間，１〜２０分間，３〜１０分間，５〜１５分間，又は１０〜２０分間，行うことができる。また，浸漬は，ｐＨ７〜８で行うことができる。カルシウムイオンの除去は１００％の除去を意味するものではなく，細胞間接着が緩んで細胞塊や組織内の目的の部位まで蛍光プローブが到達可能となれば十分である。特に蛍光プローブが細胞表面の物質と反応して蛍光物質を生じる場合，カルシウムイオンの除去は細胞塊や組織表面に含まれる当該物質および反応により生成した蛍光物質をｗａｓｈ ｏｕｔしてしまわない条件で行われることが望ましい。

蛍光プローブと細胞塊又は組織との接触は，該蛍光プローブを含有する液中に細胞塊又は組織を浸漬させて行ってもよいし，該蛍光プローブを含有する液を細胞塊又は組織又はそれらを含む部位に滴下またはスプレーなどで散布して行ってもよい。蛍光プローブを含有する液は，好ましくは緩衝液であり，より好ましくは，細胞塊又は組織からカルシウムイオンを除去可能な緩衝液である。例えば，キレート剤を含有する緩衝剤又はカルシウム非含有ＰＢＳ中に該蛍光プローブを含有させて用いてもよい。

標的細胞からの蛍光発光の測定及び観察は，用いた蛍光プローブに応じた波長における発光を適宜当業者周知の装置及び方法により検出することにより行うことができる。好ましくは，標的細胞からの蛍光発光は，標的細胞を非標的細胞から識別可能な強度の蛍光である。また，標的細胞からの蛍光発光は，目視で標的細胞を非標的細胞から識別可能な強度であってもよい。

本発明の方法は，特に腫瘍細胞やがん細胞が細胞塊の内部に存在して，単に蛍光プローブを接触させたのみでは当該腫瘍細胞やがん細胞が検出されない場合に有用である。本発明の方法を用いることにより，細胞塊の内部の腫瘍細胞やがん細胞を発光させることができ，これにより細胞塊や組織の内部に存在する腫瘍やがんの存在を確実に検出することができる。

よって，一態様において前記標的細胞はがん細胞又は腫瘍細胞である。本発明は，がん細胞又は腫瘍細胞と非がん細胞又は非腫瘍細胞とを区別する方法であって，上記方法により，がん細胞又は腫瘍細胞を蛍光発光させること，及び，蛍光を発光している細胞をがん細胞又は腫瘍細胞と決定し，蛍光を発光していない細胞を非がん細胞又は非腫瘍細胞と決定することにより，がん細胞又は腫瘍細胞と非がん細胞又は非腫瘍細胞とを区別することを含む方法に関する。このようながん細胞又は腫瘍細胞と非がん細胞又は非腫瘍細胞との区別は，例えば，手術時の確実ながん細胞又は腫瘍細胞の除去を可能とし，また，がん又は腫瘍診断時における診断精度を高めることができる。

別の態様において，本発明は，がん又は腫瘍の診断方法又はモニタリング方法，あるいは，それらのための情報を提供する方法であって，被験者由来の細胞塊サンプル又は組織サンプル中のカルシウムイオンを除去すること；がん細胞若しくは腫瘍細胞と接触することにより又はがん細胞若しくは腫瘍細胞の内部に取り込まれることにより蛍光を発する蛍光プローブを，当該サンプルに接触させること；及び，当該サンプル中に蛍光を発光している細胞が存在する場合，該被験者をがん又は腫瘍に罹患していると診断すること又は該被験者にがん又は腫瘍が存在する（あるいは、経過又は予後が不良である）と判定すること，あるいは，そのような情報を提供することを含む方法に関する。本方法において，がん細胞若しくは腫瘍細胞と接触することにより又はがん細胞若しくは腫瘍細胞の内部に取り込まれることにより蛍光を発する蛍光プローブとしては，例えば，ｇＧｌｕ−ＨＭＲＧを挙げることができる。本明細書において，「モニタリング方法」とは，がん又は腫瘍に罹患している可能性がある患者におけるがん若しくは腫瘍の有無のモニタリング，がん若しくは腫瘍患者の術後若しくは治療後の経過の良又は不良，がん若しくは腫瘍患者の又は予後の良又は不良に関するモニタリングを含む。

本発明の方法は，ｉｎ ｖｉｔｒｏ，ｅｘ ｖｉｖｏ，及びｉｎ ｖｉｖｏのいずれで行うこともできる。例えば，がん手術中に癌細胞の存在する領域を決定するために行う場合，本発明の方法は生体内の標的細胞に対して行われる。このような場合，本発明の方法は，更に前記方法によりがん細胞又は腫瘍細胞と決定された細胞を除去することを含んでいてもよい。

以下，実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし，本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお，本願全体を通して引用される全文献は参照によりそのまま本願に組み込まれる。

（実施例１）臨床検体
乳がん手術時に病理診断目的で摘出されたセンチネルリンパ節を含むリンパ節を分割し，ＰＢＳで湿らせたガーゼに包んだ状態で，手術室から検査室へ運搬した。室温の試薬及びＰＢＳ（１４０ｍＭ ＮａＣｌ，２．７ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ ＰＯ_４ ^３−，ｐＨ＝７．４）を用いた。ＰＢＳ浸漬サンプルは，ＰＢＳを入れた容器に浸漬し，１分，５分，１０分，又は１分〜３０分の成行時間浸漬し続けた。ＰＢＳ非浸漬サンプルは，ＰＢＳ浸漬を行う代わりに乾燥しないようＰＢＳで湿らせたガーゼに包んだ状態で保管し，蛍光測定に使用した。リンパ節をピンセットで注意深く取り出し，シャーレに乗せて蛍光測定機で自家蛍光の可視画像を撮影した。リンパ節を入れたシャーレにＰＢＳに溶解した５０μＭ ｇＧｌｕ−ＨＭＲＧをリンパ節が完全に沈むまで添加し，蛍光測定を継続した。また，本試験で使用した検体の病理診断も行い，各リンパ節にがんが転移しているかどうかの最終的な結果と照らし合わせた。

測定開始時から１０分後のリンパ節における蛍光強度増加を図１に示す。蛍光強度は，蛍光強度が一定である蛍光強度標準板の蛍光強度との比率（測定された蛍光強度／蛍光強度標準板の蛍光強度）で表した。
全２５個の検体中，病理診断でがん転移が認められなかった５検体については，蛍光増加もほとんど見られなかった。がんが認められた２０例においてはＰＢＳ浸漬を行なったものは，その浸漬時間に関わらず強い蛍光が観察された。一方ＰＢＳ浸漬を行なっていない検体の中には弱い蛍光しか観察されないものがあり，がん細胞を含まない検体と区別することが難しい例が観察された。本結果から，蛍光試薬でがんを検出する前に，ＰＢＳで浸漬することで，ｇＧｌｕ−ＨＭＲＧを用いた診断精度が上がることが明らかとなった。

（実施例２）がん由来培養細胞で作られたスフェロイドにおける，ｇＧｌｕ−ＨＭＲＧの蛍光強度変化
ＨｅＬａ細胞を１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し，４−６日培養した。得られたスフェロイドをガラスボトムディッシュ上に置き，３時間程度培養した後，培養液を除いてＰＢＳ（−）で１０分間浸漬した。コントロールは，ＰＢＳ（−）に浸漬せず，ＨＢＳＳで洗浄した。ＰＢＳ（−）又はＨＢＳＳに溶解した１μＭ ｇＧｌｕ−ＨＭＲＧ溶液を，それぞれ，ＰＢＳ（−）浸漬スフェロイド又はコントロールスフェロイドに添加した。ｇＧｌｕ−ＨＭＲＧ溶液添加直後（０分後），１０分後，２０分後，３０分後，及び６０分後のスフェロイドを，蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＤＭＩ ６０００ ＣＳ，ｌｅｎｓ：１０×，ｆｉｌｔｅｒ Ｌｅｉｃａ Ｌ５，励起波長４６０−５００ｎｍ，蛍光波長５１２−５４２ｎｍ）を用いて撮影した。また，ＰＢＳ（−）浸漬後１０分のスフェロイドの透過光画像を撮影した。

蛍光観察の結果を図２に示す。ＰＢＳ（−）に比べ，ＨＢＳＳ（より血液に近い生理的な緩衝液）ではスフェロイド中央部での蛍光上昇が遅いことが観察された。すなわち試薬の反応・浸透の速度に，溶液組成や予備浸漬処理が重要であることが示された。また，透過光画像（図３）において，ＰＢＳ（−）浸漬により，細胞同士の接着が弱くなっているのが観察された。

（実施例３）がん由来培養細胞スフェロイドを用いた，ｇＧｌｕ−ＨＭＲＧ反応および浸透度の定量
Ｎｕｎｃｌｏｎ ｓｐｈｅｌａにＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸がん細胞株）又はＡ５４９細胞（ヒト肺胞基底上皮腺癌細胞株）を１×１０^４ｃｅｌｌを播種し，７−１４日培養した。得られたスフェロイドを，ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ ｃｏａｔしたガラスボトムディッシュに約２４時間かけて接着させた。培地を各バッファーに置換して室温で１０分間インキュベートした（浸漬，ｒｉｎｓｅ）。ディッシュのバッファーを，最終濃度が０．１μＭ（Ａ５４９細胞）または１μＭ（ＨｅＬａ細胞）となるようにｇＧｌｕ−ＨＭＲＧを溶解させた各バッファーと置換し，蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＤＭＩ ６０００ ＣＳ，ｌｅｎｓ：１０×，ｆｉｌｔｅｒ Ｌｅｉｃａ Ｌ５，ｅｘ４６０−５００ｎｍ，ｅｍ．５１２−５４２ｎｍ）で観察した。ＩｍａｇｅＪで図４に示す表面からの距離のエリア（ＲＯＩ）を取り，測定開始と５分後での平均輝度の増加を解析した。生理食塩水に浸漬し，ＰＢＳ（−）に溶解したｇＧｌｕ−ＨＭＲＧを添加した場合の蛍光も観察した。

用いたバッファー及びその組成は以下の通りである。
ＰＢＳ（−）：１４０ｍＭ ＮａＣｌ，２．７ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ ＰＯ_４ ^３−（ｐＨ＝７．４）
ＰＢＳ（＋）：上記ＰＢＳ（−）に加えて，０．９０ｍＭ ＣａＣｌ_２，０．３３ｍＭ ＭｇＣｌ_２（ｐＨ＝７．４）
ＰＢＳ−Ｃａ：上記ＰＢＳ（−）に加えて，０．９０ｍＭ ＣａＣｌ_２（ｐＨ＝７．４）
ＰＢＳ−Ｍｇ：上記ＰＢＳ（−）に加えて，０．３３ｍＭ ＭｇＣｌ_２（ｐＨ＝７．４）
ＰＢＳ−ＥＤＴＡ：上記ＰＢＳ（−）に加えて，０．２ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ＝７．４）
生理食塩水：１５４ｍＭ ＮａＣｌ
ＨＢＳＳ（＋）：ＨＢＳＳ−Ｈａｎｋ’ｓ平衡塩溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ社，＃１４０２５０７６）

ＨｅＬａ細胞を用いたＰＢＳ（−）とＨＢＳＳ（＋）の結果を図５に示す。ＨｅＬａ細胞で形成させたスフェロイドをバッファーで洗浄せず，体液に近いＨＢＳＳに溶解したｇＧｌｕ−ＨＭＲＧと反応させた場合，表面から離れるにつれて蛍光の上昇が遅くなった。それに比べ，ＰＢＳ（−）に１０分浸漬したあとでＰＢＳ（−）に溶解したｇＧｌｕ−ＨＭＲＧに浸漬すると，蛍光の上昇はより早かった。

Ａ５４９細胞を用いた，ＰＢＳ（−），ＰＢＳ（＋），ＰＢＳ−Ｃａ，及びＰＢＳ−Ｍｇの結果を図６に示す。ＰＢＳ（−）浸漬処理により，ＰＢＳ（＋）浸漬に比べて，蛍光強度上昇速度が早くなった。ＰＢＳ（−）にＭｇ^２＋のみを添加したＰＢＳ−ＭｇにおいてもＰＢＳ（−）と変わらない結果が得られた。一方，ＰＢＳにＣａ^２＋を添加したＰＢＳ−Ｃａを用いると，ＰＢＳ（＋）と同様に蛍光上昇しにくくなった。本結果から，カルシウムイオンの有無が重要と考えられた。

Ａ５４９細胞を用いた，ＰＢＳ（−），ＰＢＳ（＋），生理食塩水，生理食塩水＋ＰＢＳ（−）に溶解したｇＧｌｕ−ＨＭＲＧ添加の結果を図７に示す。生理食塩水では，蛍光強度の上昇は遅かった。ＰＢＳに含まれるリン酸バッファーによるｐＨ安定効果も重要であると考えられる。

（実施例４）がん由来培養細胞スフェロイドを用いた，キレート剤によるｇＧｌｕ−ＨＭＲＧ反応および浸透度に与える影響の評価
カルシウムなど２価イオン依存的な接着による影響を評価するため，以下のバッファーを使用すること以外は実施例３と同じ条件で蛍光を観察した。
（１）前処理なし（ｎｏ ｒｉｎｓｅ），ＰＢＳ（−）溶解ｇＧｌｕ−ＨＭＲＧ溶液浸漬
（２）ＰＢＳ（−）浸漬による前処理
（３）ＰＢＳ（＋）浸漬による前処理
（４）ＰＢＳ（−）＋０．２ｍＭ ＥＤＴＡ浸漬による前処理

ＨｅＬａ細胞を用いた結果を図８に示す。２価イオン（Ｃａ^２＋，Ｍｇ^２＋）を含まないＰＢＳ（−）で浸漬することで，浸漬なしや，２価イオンを含むＰＢＳ（＋）浸漬に比べて，表面から離れた場所での蛍光上昇が早くなった。また，２価イオンキレーター（ＥＤＴＡ）添加により，更に蛍光上昇が早くなった。

Ａ５４９細胞を用いた結果を図９に示す。Ａ５４９細胞でもＨｅＬａ細胞と同様の傾向を示した。ＰＢＳ（−）に２価イオン（Ｃａ^２＋，Ｍｇ^２＋）を添加したＰＢＳ（＋）では浸漬しないときとほぼ同等の蛍光上昇速度であった。一方で，２価イオンをキレートするＥＤＴＡを０．２ｍＭ添加すると，ＰＢＳ（−）と比べても，より表面から深いところで蛍光強度の上昇が大きくなった。

（実施例５）異なる蛍光プローブを用いた場合の前処理の影響
蛍光プローブとしてｇＧｌｕ−ＨＭＲＧの代わりに，５μＭのＦｅＲｈｏＮｏｘ−１プローブを用いたこと以外は，実施例３と同様の方法により蛍光を測定した。細胞はＡ５４９細胞のみ用いた。

結果を図１０に示す。蛍光プローブとしてｇＧｌｕ−ＨＭＲＧを用いた場合と同じ傾向がＦｅＲｈｏＮｏｘ−１プローブにおいても観察された。このことから，カルシウム除去が，別の蛍光プローブについても同様に細胞塊内部への浸透を促進させるとことが示された。

以上より，ＰＢＳ（−）であらかじめ浸漬すると，スフェロイドの中心部でｇＧｌｕ−ＨＭＲＧによる蛍光上昇が早くなった。また，ＰＢＳ（＋），ＰＢＳ−Ｃａ^２＋など，カルシウムを含む溶液では，この効果はほとんど見られなかった。逆に，ＰＢＳ−ＥＤＴＡでカルシウムイオンを積極的に除くと，この効果はより増強された。細胞像から，ＰＢＳ（−）浸漬は，カルシウム依存的な接着を阻害し，細胞間に隙間を作って試薬が浸透しやすくなっていると考えられる。同じくカルシウムを含まない生理食塩水では効果がはっきり見られなかった。この現象は，ＨｅＬａ細胞だけでなく，Ａ５４９細胞でも観察され，特定の細胞腫に依存しないと考えられる。また，この現象は，ｇＧｌｕ−ＨＭＲＧだけでなく，ＦｅＲｈｏＮｏｘ−１でも観察され，機能性蛍光プローブで細胞の特徴を検出しようとするときに応用可能であることが示された。

（実施例６）ｐＨの影響異なる蛍光プローブを用いた場合の前処理の影響
ガラス面に培養した培養細胞にｇＧｌｕ−ＨＭＲＧを反応させ，蛍光強度を比較した。４分割ガラスボトムディッシュに同じ密度でＨｅＬａ細胞を播種した。ＤＭＥＭ＋８％ＦＢＳ，Ｐ．Ｓ．中にて，３７℃，５％ＣＯ_２条件下で約８時間培養した。細胞をｐＨ６．５，７．３，７．８に調整したＰＢＳ（−）で３回リンスした後，各溶液に２μＭ ｇＧｌｕ−ＨＭＲＧを加えたものに置換した。３７℃，５％ＣＯ_２で２０分間染色し，溶液を交換せずに，同じ条件で蛍光顕微鏡で観察した。１００ｍｓ ｅｘｐｏｓｕｒｅ，ｇａｉｎ ５ Ｉｎｔ ５， ＮＤ１。ＤＩＣとの重ね合わせ画像を参照しながら，蛍光像の細胞５つの蛍光強度，および背景の蛍光強度を測定し，平均と標準偏差をプロットした。また，ｇＧｌｕ−ＨＭＲＧの蛍光強度とＨＭＲＧ（ＧＧＴと反応後の蛍光物質）の蛍光強度を各ｐＨで測定した。

蛍光強度はｐＨ依存性があり，ｐＨが下がるとシグナルが低下し，バックグラウンドが増加した（非図示）。ｐＨ７．３もしくはそれ以上において，シグナルの強度が増加した。また，ｇＧｌｕ−ＨＭＲＧの蛍光強度とＨＭＲＧ（ＧＧＴと反応後の蛍光物質）の蛍光強度を各ｐＨで測定した結果，ｐＨの上昇と共に蛍光強度が減少し，ｐＨ６〜８の条件下が好ましく，より好ましくはＨ６〜７．５であることが示された（非図示）。これらの結果から，ｐＨが蛍光強度の測定に影響を与えることが示された。

Claims (13)

1. 標的細胞を非標的細胞から識別可能な強度で蛍光発光させる方法であって，
   当該標的細胞を含む細胞塊又は組織内のカルシウムイオンを除去すること，
   カルシウムイオンの除去後に，当該標的細胞と接触することにより又は当該標的細胞の
   内部に取り込まれることにより蛍光を発する蛍光プローブを，当該細胞塊又は組織に接触
   させること，及び
   前記カルシウムイオンが除去され，かつ，前記蛍光プローブを接触させられた前記細胞
   塊又は前記組織を蛍光発光させることを含み，
   前記標的細胞と接触すること又はその内部に取り込まれることにより蛍光を発する蛍光
   プローブが，該標的細胞が含有する酵素，鉄イオン，銅イオン，亜鉛イオン，一酸化窒素
   ，又は活性酸素種と反応することにより蛍光を発するか，又は該標的細胞のｐＨ等の物性
   により蛍光を発するか，又は，該標的細胞が低酸素であることにより蛍光を発する蛍光プ
   ローブであり，かつ，
   前記カルシウムイオンの除去が，金属イオンキレート剤を含有する緩衝液又はカルシウ
   ム非含有緩衝液中に該標的細胞を含む細胞塊又は組織を３０秒〜３０分間浸漬させること
   により行われ、
   ｅｘ ｖｉｖｏで行われる，方法。
2. 標的細胞塊の内部を蛍光発光させる方法，又は細胞塊若しくは組織の内部に存在する標
   的細胞を蛍光発光させる方法である，請求項１に記載の方法。
3. 標的細胞の存在する領域を決定する方法であって，
   カルシウムイオンの除去後に，当該標的細胞が存在すると思われる細胞塊又は組織内の
   カルシウムイオンを除去すること，
   当該標的細胞と接触することにより又は当該標的細胞の内部に取り込まれることにより
   蛍光を発する蛍光プローブを，当該標的細胞が存在すると思われる細胞塊又は組織に接触
   させること，及び，
   前記蛍光プローブによる蛍光発光が観察された領域を前記標的細胞が存在する領域であ
   ると決定することを含む方法であって，
   前記カルシウムイオンの除去が，金属イオンキレート剤を含有する緩衝液又はカルシウ
   ム非含有緩衝液中に該標的細胞を含む細胞塊又は組織を３０秒〜３０分間浸漬させること
   により行われ、
   ｅｘ ｖｉｖｏで行われる，方法。
4. 前記酵素が，グリコシダーゼ，プロテアーゼ，又はペプチダーゼである，請求項１〜請
   求項３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記酵素が，細胞膜表面に存在する酵素である，請求項１〜請求項４のいずれか１項に
   記載の方法。
6. 標的細胞を蛍光発光させる方法であって，
   当該標的細胞を含む細胞塊又は組織内のカルシウムイオンを除去すること，及び，
   カルシウムイオンの除去後に，当該標的細胞と接触することにより又は当該標的細胞の
   内部に取り込まれることにより蛍光を発する蛍光プローブを，当該細胞塊又は組織に接触
   させることを含み，かつ，
   前記カルシウムイオンの除去が，金属イオンキレート剤を含有する緩衝液又はカルシウ
   ム非含有緩衝液中に該標的細胞を含む細胞塊又は組織を３０秒〜３０分間浸漬させること
   により行われる方法であって，ｅｘ ｖｉｖｏで行われ，
   前記標的細胞が，がん細胞又は腫瘍細胞である方法。
7. がんが固形癌である，請求項６に記載の方法。
8. 標的細胞を非標的細胞から識別可能な強度の蛍光を標的細胞から発光させる方法である
   ，請求項６又は請求項７に記載の方法。
9. 前記蛍光プローブが，ｇＧｌｕ−ＨＭＲＧ，Ｌｅｕ−ＨＭＲＧ，ＥＰ−ＨＭＲＧ又はＦ
   ｅＲｈｏＮｏｘ−１である，請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載の方法。
10. がん細胞又は腫瘍細胞と非がん細胞又は非腫瘍細胞とを区別する方法であって，請求項
    ６に記載の方法により，がん細胞又は腫瘍細胞を蛍光発光させること，及び，蛍光を発光
    している細胞をがん細胞又は腫瘍細胞と決定し，蛍光を発光していない細胞を非がん細胞
    又は非腫瘍細胞と決定することにより，がん細胞又は腫瘍細胞と非がん細胞又は非腫瘍細
    胞とを区別することを含む方法。
11. がん又は腫瘍の診断のための情報を提供する方法であって，
    被験者由来の細胞塊サンプル又は組織サンプル中のカルシウムイオンを除去すること；
    カルシウムイオンの除去後に，がん細胞若しくは腫瘍細胞と接触することにより又はが
    ん細胞若しくは腫瘍細胞の内部に取り込まれることにより蛍光を発する蛍光プローブを，
    当該サンプルに接触させること；及び，
    前記カルシウムイオンが除去され、かつ、前記蛍光プローブに接触された当該サンプル
    の画像データを提供することを含み，かつ，
    前記カルシウムイオンの除去が，金属イオンキレート剤を含有する緩衝液又はカルシウ
    ム非含有緩衝液中に該標的細胞を含む細胞塊又は組織を３０秒〜３０分間浸漬させること
    により行われ、
    ｅｘ ｖｉｖｏで行われる，方法。
12. 請求項１〜請求項１１のいずれか１項に記載の方法における蛍光プローブの使用。
13. 組織内又は細胞塊の内部に存在する標的細胞を検出するための蛍光診断薬であって、
    金属イオンキレート剤を含有する緩衝液又はカルシウム非含有緩衝液中に３０秒間以上
    ｅｘ ｖｉｖｏで浸漬された後の当該組織又は細胞塊と接触させることにより、当該標的
    細胞を蛍光発光させる方法で用いられる，蛍光プローブを含有する蛍光診断薬。

Images