JP6935403B2 - サルコペニア及びフレイルの処置方法 - Google Patents
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Description
(a)配列番号1又は5と少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列、
(b)配列番号2、3、4、又は6と少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列、及び
(c)配列番号7又は8、好ましくは配列番号7と少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
(a)老化している対象における筋機能及び/若しくは筋肉量の維持又は改善・増大、
(b)老化している対象における筋消耗の予防若しくは軽減、並びに/又は
(c)サルコペニア又はフレイルの処置、
に関して、配列番号7のタンパク質と比較して同様の効果又は向上した効果を提供する。
(a)老化している対象における筋機能及び/若しくは筋肉量の維持又は改善・増大、
(b)老化している対象における筋消耗の実質的な予防若しくは軽減、並びに/又は
(c)サルコペニア又はフレイルの処置、のための薬物を製造するための、本発明のニューレグリン−1(NRG1)若しくはそれらのフラグメント又はビタミンB12の使用を提供する。
(a)細胞集団を候補となる作用物質と接触させるステップ、
(b)細胞集団におけるNRG1レベルを測定するステップ、及び
(c)ステップ(b)において測定したNRG1レベルを、候補となる作用物質と接触させていない細胞の対照集団におけるNRG1レベルと比較するステップ、を含む、対象におけるニューレグリン−1(NRG1)レベルを増大可能な作用物質をスクリーニングする方法、を提供する。
(a)老化している対象における筋機能及び/若しくは筋肉量の維持又は改善・増大、
(b)老化している対象における筋消耗の実質的な予防若しくは軽減、並びに/又は
(c)サルコペニア又はフレイルの処置、に使用するための、本発明の作用物質を提供する。
(a)対象から分離した生体試料を準備するステップ、
(b)生体試料におけるニューレグリン−1(NRG1)のレベルを測定するステップ、及び
(c)ステップ(b)において測定したNRG1レベルを、1つ以上の対照試料から測定されたNRG1レベル又は参照レベルと比較するステップ、を含む、サルコペニア又はフレイルの診断方法を提供する。
一態様では、本発明は、老化している対象における筋機能及び/若しくは筋肉量の維持又は改善・増大、並びに/又は老化している対象における筋消耗の実質的な予防若しくは軽減、に使用するための、ニューレグリン−1(NRG1)又はそれらのフラグメントを提供する。ニューレグリンは、可溶性でありかつEGF様ドメインを特徴とする膜貫通型増殖因子であるファミリーに属する。ニューレグリンは、内皮、ニューロン、及び間葉由来の細胞で主に発現され、増殖、生存、又は遊走などの多様な生物学的機能に関与する。
MSERKEGRGKGKGKKKERGSGKKPESAAGSQSPALPPRLKEMKSQESAAGSKLVLRCETSSEYSSLRFKWFKNGNELNRKNKPQNIKIQKKPGKSELRINKASLADSGEYMCKVISKLGNDSASANITIVESNEIITGMPASTEGAYVSSESPIRISVSTEGANTSS
(配列番号1)
MSERKEGRGKGKGKKKERGSGKKPESAAGSQSPALPPRLKEMKSQESAAGSKLVLRCETSSEYSSLRFKWFKNGNELNRKNKPQNIKIQKKPGKSELRINKASLADSGEYMCKVISKLGNDSASANITIVESNEIITGMPASTEGAYVSSESPIRISVSTEGANTSSSTSTSTTGTSHLVKCAEKEKTFCVNGGECFMVKDLSNPSRYLCKCPNEFTGDRCQNYVMASFYKHLGIEFMEAEELYQKRVLTITGICIALLVVGIMCVVAYCKTKKQRKKLHDRLRQSLRSERNNTMNIANGPHHPNPPPENVQLVNQYVSKNVISSEHIVEREAETSFSTSHYTSTAHHSTTVTQTPSHSWSNGHTESILSESHSVIVMSSVENSRHSSPTGGPRGRLNGTGGPRECNSFLRHARETPDSYRDSPHSERYVSAMTTPARMSPVDFHTPSSPKSPPSEMSPPVSSMTVSMPSMAVSPFMEEERPLLLVTPPRLREKKFDHHPQQFSSFHHNPAHDSNSLPASPLRIVEDEEYETTQEYEPAQEPVKKLANSRRAKRTKPNGHIANRLEVDSNTSSQSSNSESETEDERVGEDTPFLGIQNPLAASLEATPAFRLADSRTNPAGRFSTQEEIQARLSSVIANQDPIAV
(配列番号2)
MSERKEGRGKGKGKKKERGSGKKPESAAGSQSPALPPRLKEMKSQESAAGSKLVLRCETSSEYSSLRFKWFKNGNELNRKNKPQNIKIQKKPGKSELRINKASLADSGEYMCKVISKLGNDSASANITIVESNEIITGMPASTEGAYVSSESPIRISVSTEGANTSSSTSTSTTGTSHLVKCAEKEKTFCVNGGECFMVKDLSNPSRYLCKCPNEFTGDRCQNYVMASFYKAEELYQKRVLTITGICIALLVVGIMCVVAYCKTKKQRKKLHDRLRQSLRSERNNTMNIANGPHHPNPPPENVQLVNQYVSKNVISSEHIVEREAETSFSTSHYTSTAHHSTTVTQTPSHSWSNGHTESILSESHSVIVMSSVENSRHSSPTGGPRGRLNGTGGPRECNSFLRHARETPDSYRDSPHSERYVSAMTTPARMSPVDFHTPSSPKSPPSEMSPPVSSMTVSMPSMAVSPFMEEERPLLLVTPPRLREKKFDHHPQQFSSFHHNPAHDSNSLPASPLRIVEDEEYETTQEYEPAQEPVKKLANSRRAKRTKPNGHIANRLEVDSNTSSQSSNSESETEDERVGEDTPFLGIQNPLAASLEATPAFRLADSRTNPAGRFSTQEEIQARLSSVIANQDPIAV
(配列番号3)
MSERKEGRGKGKGKKKERGSGKKPESAAGSQSPALPPRLKEMKSQESAAGSKLVLRCETSSEYSSLRFKWFKNGNELNRKNKPQNIKIQKKPGKSELRINKASLADSGEYMCKVISKLGNDSASANITIVESNEIITGMPASTEGAYVSSESPIRISVSTEGANTSSSTSTSTTGTSHLVKCAEKEKTFCVNGGECFMVKDLSNPSRYLCKCPNEFTGDRCQNYVMASFYSTSTPFLSLPE
(配列番号4)
MSERKEGRGKGKGKKKERGSGKKPESAAGSQSPALPPRLKEMKSQESAAGSKLVLRCETSSEYSSLRFKWFKNGNELNRKNKPQNIKIQKKPGKSELRINKASLADSGEYMCKVISKLGNDSASANITIVESNEIITGMPASTEGAYVSSESPIRISVSTEGANTSSSTSTSTTGTSHLVKCAEKEKTFCVNGGECFMVKDLSNPSRYLCK
(配列番号5)
MSERKEGRGKGKGKKKERGSGKKPESAAGSQSPALPPRLKEMKSQESAAGSKLVLRCETSSEYSSLRFKWFKNGNELNRKNKPQNIKIQKKPGKSELRINKASLADSGEYMCKVISKLGNDSASANITIVESNEIITGMPASTEGAYVSSESPIRISVSTEGANTSSSTSTSTTGTSHLVKCAEKEKTFCVNGGECFMVKDLSNPSRYLCKCPNEFTGDRCQNYVMASFYKHLGIEFMEQKRVLTITGICIALLVVGIMCVVAYCKTKKQRKKLHDRLRQSLRSERNNMMNIANGPHHPN
(配列番号6)
SHLVKCAEKEKTFCVNGGECFMVKDLSNPSRYLCKCPNEFTGDRCQNYVMASFYKHLGIEF
(配列番号7、NRG1β)
HLVKCAEKEKTFCVNGGECFMVKDLSNPSRYLCKCQPGFTGARC
(配列番号8、NRG1α)
(a)老化している対象における筋機能及び/若しくは筋肉量の維持又は改善・増大、
(b)老化している対象における筋消耗の予防若しくは軽減、並びに/又は
(c)サルコペニア又はフレイルの処置、
に関して、配列番号7のタンパク質と比較して同様の効果又は向上した効果を提供する。
一態様では、本発明は、老化している対象における筋機能及び/若しくは筋肉量の維持又は改善・増大、並びに/又は老化している対象における筋消耗の実質的な予防若しくは軽減、に使用するための、ビタミンB12を提供する。
シアノコバラミン(R=−CN)
ヒドロキソコバラミン(R=−OH)
メチルコバラミン(R=−CH3)及び
アデノシルコバラミン(R=−5’−デオキシアデノシル)である。
(a)老化している対象における筋機能及び/若しくは筋肉量の維持又は増大、
(b)老化している対象における筋消耗の実質的な予防若しくは軽減、並びに/又は
(c)サルコペニア又はフレイルの処置、のための薬剤の製造のための、本明細書において記載されるとおりのビタミンB12の使用、を提供する。
一実施形態では、対象はビタミンB12欠乏症であり得る。
本発明の化合物、組成物、使用及び方法は、老化している対象における筋機能及び/若しくは筋肉量の維持又は改善・増大を提供し得る。
本明細書において「処置」についてなされる全ての言及は、治癒的、緩和的、及び予防的処置を含むものの、本発明の文脈においてなされる「予防」についての言及は、より一般的に予防的処置に関連することは認識されるであろう。処置に、疾患の重症度の進行を停止することもまた更に含んでもよい。
哺乳類、特にヒトの処置が好ましい。しかし、ヒト及び動物の処置の両方が、本発明の範囲内である。
本発明は、年齢に伴って生じる筋機能及び筋肉量の低下に対処するための手段を提供する。加齢による筋機能の低下及び筋肉量の減少は、全ての個体において必ず生じるものの、その進行は、広範な遺伝的要因並びに例えば身体活動及び栄養摂取などの環境的要因によって異なる。
一態様では、本発明は、対象におけるニューレグリン−1(NRG1)レベルを増大させることのできる作用物質を、スクリーニングするための方法を提供する。かかる方法は、
(a)細胞集団を候補となる作用物質と接触させるステップ、
(b)細胞集団におけるNRG1レベルを測定するステップ、及び
(c)ステップ(b)において測定したNRG1レベルを、候補となる作用物質と接触させていない細胞の対照集団におけるNRG1レベルと比較するステップ、を含む。
(a)筋肉細胞ベースのスクリーニング(例えば、C2C12細胞株及び/又はヒト初代筋芽細胞):細胞を90%コンフルエントまで増殖させて、最大で14日間分化誘導する。候補となる作用物質を1〜2日間培地に加えて、NRG1発現をqPCRにより評価する。
(b)神経シュワン細胞ベースのスクリーニング(ラット初代細胞)。細胞を増殖条件下で増殖させ、候補となる作用物質を1〜2日間培地に加える。NRG1発現をqPCRにより評価する。
(c)候補となる作用物質を共培養系(シュワン細胞/運動ニューロン)で試験して、ミエリン形成について評価する。
一態様では、本発明は、
(a)対象から分離した生体試料を準備するステップ、
(b)生体試料におけるニューレグリン−1(NRG1)のレベルを測定するステップ、及び
(c)ステップ(b)において測定したNRG1レベルを、1つ以上の対照試料から測定されたNRG1レベル又は参照レベルと比較するステップ、を含む、サルコペニア又はフレイルの診断方法を提供する。
(a)対象から分離した生体試料を準備するステップ、
(b)生体試料におけるニューレグリン−1(NRG1)のレベルを測定するステップ、及び
(c)ステップ(b)において測定したNRG1レベルを、1つ以上の対照試料から測定されたNRG1レベル又は参照レベルと比較するステップ、を含む、年齢に伴う筋機能及び/又は筋肉量の低下を診断する方法を提供する。
(a)対象から分離した生体試料を準備するステップ、
(b)生体試料におけるニューレグリン−1(NRG1)のレベルを測定するステップ、
(c)ステップ(b)において測定したNRG1レベルを、1つ以上の対照試料から測定されたNRG1レベル又は参照レベルと比較するステップ、並びに
(d)筋機能及び/若しくは筋肉量を維持又は増大させるための食事療法を適用する更なるステップ、を含む、食事療法の選択方法を提供し、かかる対象は、サルコペニアを有するとして若しくはサルコペニアを発症するリスクがあるとして、又はフレイルであるとして若しくはフレイルになるリスクがあるとして予め診断されている。
(a)対象から分離した生体試料を準備するステップ、
(b)生体試料におけるニューレグリン−1(NRG1)のレベルを測定するステップ、及び
(c)ステップ(b)において測定したNRG1レベルを、より早い時点で同じ対象から採取された試料から測定されたNRG1レベルと比較するステップ、を含む、対象におけるサルコペニア又はフレイルの進行を判定する方法を提供する。
用語「食事療法」は、対象に与えられ、対象の食生活に変化をもたらす、外部因子を指す。一実施形態では、食事療法は、高カロリー食である。別の実施形態では、食事療法は、高タンパク質食及び/又は高炭水化物食である。別の実施形態では、食事療法は、ビタミン及びミネラル、特にビタミンB12及び/又はビタミンDが栄養補給された、規定食である。
本明細書において言及される特定のタンパク質及びヌクレオチドに加え、本発明は、それらの多様体、誘導体、類似物、相同体、及びそれらのフラグメントの使用を包含する。
材料及び方法
ラットにおける齢によるニューレグリン−1(NRG1)の血中濃度の変動。
スローオフレートDNAアプタマー検出(Gold,L.et al.(2010)PLoS ONE 5:e15004)を用い、8ヶ月齢、18ヶ月齢、又は24ヶ月齢のラット由来の血清中、ニューレグリン−1(NRG1、特に、NRG1βEGFドメイン)のレベルを、測定した。1群当たり10匹のラットを分析した。
神経と筋肉との共培養物を、神経筋接合部が成熟するまでin vitroで生育させた。β−アミロイド(Ab)を用いるインキュベーション(2.5μM)によりダメージを誘導し、Abにより誘導されるダメージからの神経筋接合部の保護についての陽性対照としてはリルゾール(5μM)を使用した。Abにより誘導されるダメージに対するニューレグリン−1(NRG1、図2に示す通り様々な濃度)の効果は、神経筋接合部(NMJ)の大きさを測定することにより評価した。1群につき6ウェルを解析し、対照条件と比較した。未損傷の対照条件は、Ab処理を行わない場合の神経筋接合部の大きさとする。その他の全ての条件を、ダメージを受けた神経筋接合部の大きさについての参照値を表すAb処理のみの場合と比較する。
16ヶ月齢のプレサルコペニアラットを、ニューレグリン−1(NRG1、ReprokineのNRG1 βEGFドメイン(カタログ番号RKQ02297))又は生理食塩水のいずれかで5ヶ月間処理した。NRG1を1μg/kg(体重)で1週間当たり3回皮下注射した。次に、後肢の骨格筋量を評価し、生理食塩水の対照を注射した成体健常ラット群(実験開始時に8ヶ月齢)と比較した。次に、後肢骨格筋量を評価し、成体健常ラット群と比較した。
神経と筋肉との共培養物を、神経筋接合部が成熟するまでin vitroで生育させた。β−アミロイド(Ab)を用いるインキュベーション(2.5μM)によりダメージを誘導し、Abにより誘導されるダメージからの神経筋接合部の保護についての陽性対照としてはリルゾール(5μM)を使用した。Abにより誘導される損傷に対するメチルコバラミン(MeCbl、1又は100nM)及びアデノシルコバラミン(AdenoCbl、1又は100nM)の効果を、神経筋接合部(NMJ)の数及び大きさ、並びに神経突起ネットワークを測定することにより評価した。1群につき6ウェルを解析し、対照条件(CTL)と比較した。未損傷の対照条件は、Ab処理を行わない場合の神経筋接合部の大きさとする。その他の全ての条件を、ダメージを受けた神経筋接合部の大きさについての参照値を表すAb処理のみの場合と比較する。
16ヶ月齢のプレサルコペニアラットを、アデノシルコバラミン(AdoCbl,C0884,Sigma aldrich)、メチルコバラミン(MeCbl,M9756,Sigma aldrich)、又は生理食塩水のいずれかで5ヶ月間処理した。AdoCbl及びMeCblを1μg/kg(体重)で1週間当たり3回皮下注射した。次に、前脛骨筋(TA)を切り出し、更なる解析のため凍結した。組織学的検査のため、TAを10μmで凍結切片化し、ラミニンで染色して(L9393,Sigma aldrich)筋繊維を観察可能な状態にした。その後、1、2A、及び2B型の特有の筋繊維型を適切な抗体(クローンBAD5、BFF3、及びSC71、それぞれDSHBより)により免疫標識した。スライドスキャナ(VS−120,Olympus)を使用して画像を取得し、in−house MetaXpress journal(Molecular Devices(Sunnyvale,USA))を用い解析した。老齢ラット由来の画像を、生理食塩水の対照を注射した成体健常ラット群(実験開始時に8ヶ月齢)と比較した。遺伝子発現の解析のため、製造元の指示どおりにmiRNeasyミニキット(Qiagen)を使用して、全RNAを抽出し、標準感度のRNA解析キットをFragment Analyzer(Advanced Analytical Technologies)で使用して、RNAの品質を確認した。次に、Eberwine T7法に基づく標準的なアフィメトリクスプロトコルにより、試料をAffymetrix Rat230PM96−Arrayに結合させた。LIMMAを使用して、統計解析を実施し、GSEAに利用して、老齢対照ラットと成体ラットとの比較、並びにAdoCbl又はMeCblのいずれかで処理した老齢ラットと老齢対照ラットとの比較を行った。
HSMMヒト筋芽細胞をin vitroで生育させて、成熟筋管へと分化誘導した。40ng/mLのTNFaと共に4日間インキュベートし、筋管萎縮を誘導した。TNFaと共にMeCbl(1nM)及びAdoCbl(1nM)をインキュベートして、誘導される筋萎縮症に対するそれらの効果を試験した。筋萎縮の予防についての陽性対照として15nMのIGF1を使用する。4日間の処理後、核とミオシン重鎖とについて細胞を染色し、筋管内部の核の割合(すなわち、融合指数)を定量した。
神経と筋肉との共培養物を、神経筋接合部が成熟するまでin vitroで生育させた。β−アミロイド(Ab)を用いるインキュベーション(10μM)によりダメージを誘導し、Abにより誘導されるダメージからの神経筋接合部の保護についての陽性対照としてはリルゾール(5μM)を使用した。Abにより誘導されるダメージに対するニューレグリン−1(NRG1、30nM)及び/又はアデノシルコバラミン(AdoCbl、1nM)の効果は、神経筋接合部(NMJ)の大きさ又は数を測定することにより評価した。1群につき6ウェルを解析し、Abにより誘導されるダメージなしの対照条件(CTL)と比較した。
8ヶ月齢、18ヶ月齢、又は24ヶ月齢のラット由来の血清に対しアプタマーベースのスクリーニング(Somalogic)を用い、本発明者らは、ニューレグリン−1(NRG1)血中濃度が年齢と共に低下することを発見した(図1)。この低下は、サルコペニアの進行に付随して生じる。
Claims (16)
- 30歳より高齢の老化している対象におけるサルコペニア又はフレイルを処置するための組成物であって、ニューレグリン−1(NRG1)を含む組成物。
- 前記NRG1が、骨格筋量を維持又は増大する、請求項1に記載の組成物。
- 前記NRG1が、対象に対して同時に、組み合わせて、連続的に、又は別個に投与される、ビタミンB12との組み合わせ製剤である、請求項1又は2に記載の組成物。
- 前記NRG1が、NRG1のI型、II型、III型、IV型、V型、又はVI型のアイソフォームである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記NRG1が、NRG1 HRG−α、HRG−β、又はHRG−γアイソフォームである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記NRG1が、
(a)配列番号1又は5と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列、
(b)配列番号2、3、4、又は6と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列、及び
(c)配列番号7又は8と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の組成物。 - 30歳より高齢の老化している対象におけるサルコペニア又はフレイルを処置するための、ニューレグリン−1(NRG1)と、ビタミンB12との組み合わせ製剤であって、前記NRG1と、ビタミンB12とが、対象に対して同時に、組み合わせて、連続的に、又は別個に投与するためのものである、組み合わせ製剤。
- 30歳より高齢の老化している対象におけるサルコペニア又はフレイルを処置するための作用物質であって、対象におけるニューレグリン−1(NRG1)レベルを増大可能な作用物質のスクリーニング方法であって、
(a)細胞集団を候補となる作用物質と接触させるステップ、
(b)前記細胞集団におけるNRG1レベルを測定するステップ、及び
(c)ステップ(b)において測定した前記NRG1レベルを、前記候補となる作用物質と接触させていない細胞の対照集団におけるNRG1レベルと比較するステップ、を含む、スクリーニング方法。 - (a)対象から分離された生体試料におけるニューレグリン−1(NRG1)のレベルを測定するステップ、及び
(b)ステップ(a)において測定した前記NRG1レベルを、1つ以上の対照試料から測定されたNRG1レベル又は参照レベルと比較するステップ、を含む、サルコペニア又はフレイルの診断を補助するための方法。 - 30歳より高齢の老化している対象におけるサルコペニア又はフレイルを処置するための組成物であって、ビタミンB12を含む組成物。
- 前記ビタミンB12が、骨格筋量を維持又は増大する、請求項10に記載の組成物。
- 前記ビタミンB12が、アデノシルコバラミン及び/又はメチルコバラミンである、請求項10又は11に記載の組成物。
- 前記ビタミンB12がアデノシルコバラミンであり、前記組成物が30歳より高齢の老化している対象における骨格筋機能及び/若しくは骨格筋量を維持又は改善・増大するための組成物である、請求項10〜12のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ビタミンB12がアデノシルコバラミンであり、前記組成物が30歳より高齢の老化している対象における骨格筋繊維の大きさを増大させるための組成物である、請求項10〜13のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ビタミンB12がメチルコバラミンであり、前記組成物が30歳より高齢の老化している対象における骨格筋萎縮症を実質的に予防又は軽減するための組成物である、請求項10〜12のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記対象が、ビタミンB12欠乏症であるとの診断を予め受けている、請求項10〜15のいずれか一項に記載の組成物。
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