JP6931605B2 - 人工膜を用いた皮膚角層細胞間脂質の機能評価方法 - Google Patents
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Description
本発明は、皮膚の角層細胞間脂質構造を模倣する人工膜を用いた皮膚角層細胞間脂質の機能評価方法に関する。
ヒト皮膚角層は外部からの異物の侵入や体内からの過度な水分の蒸散を防ぐバリア機能をもつ。角層は角層細胞と細胞間脂質で構成されている。皮膚角層細胞間脂質は、角層細胞の間でセラミド等からなる脂質の層と水分子の層が交互に規則正しく何層も重なりあう「ラメラ構造」という層状構造を形成し、角層の働きを支えている。皮膚バリア機能を解明する上で細胞間脂質の構造特性を明らかにすることは極めて重要であるが、評価の困難さや倫理的な観点から、哺乳動物の生体角層に代わる皮膚角層細胞間脂質人工モデル膜が求められている。
従来、スプレー法により、セラミド、コレステロール、遊離脂肪酸の３成分からなる人工膜を作製する方法が報告されている（例えば、非特許文献１）。スプレー法は脂質分子のラメラ型層状構造を形成する方法として好適である。
一方、ヒト皮膚のセラミドは１２タイプ、３４０種以上あることが知られている（非特許文献２、３）。なかでも、スフィンゴイド塩基としてフィトスフィンゴシンを含むセラミド類は皮膚バリア機能への奇与が大きいため、当該セラミド類を用いた人工膜は生体角層の代替モデルとして望ましい。
一方、ヒト皮膚のセラミドは１２タイプ、３４０種以上あることが知られている（非特許文献２、３）。なかでも、スフィンゴイド塩基としてフィトスフィンゴシンを含むセラミド類は皮膚バリア機能への奇与が大きいため、当該セラミド類を用いた人工膜は生体角層の代替モデルとして望ましい。
Biochimica et Biophysica Acta 1778, 2008, p.2421-2429
J. Lipid Res., 2008, 49(7), p.1466-1476
J. Lipid Res., 2010, 52(6), p.1211-1221
しかしながら、スフィンゴイド塩基としてフィトスフィンゴシンを含むセラミド類を用いた人工膜の構造を評価すると、生体角層には存在しないＶ−ｓｈａｐｅ構造が発現することが知られている。ここで、Ｖ−ｓｈａｐｅ構造とは、小角Ｘ線散乱法による解析において、ｓ＝０．２３ｎｍ−１もしくはｓ＝０．２７ｎｍ−１付近に散乱ピークを持つ構造体である。このＶ−ｓｈａｐｅはヒト角層中には観察されないため、人工膜における当該Ｖ−ｓｈａｐｅ構造の発現は、皮膚機能評価の正確性を期する観点からは望ましくない。
従って、本発明は、スフィンゴイド塩基としてフィトスフィンゴシンを含むセラミド類から形成され、Ｖ−ｓｈａｐｅ構造の発現を抑えた人工膜を製造でき、それを用いた皮膚角層細胞間脂質の機能評価方法を提供することに関する。
従って、本発明は、スフィンゴイド塩基としてフィトスフィンゴシンを含むセラミド類から形成され、Ｖ−ｓｈａｐｅ構造の発現を抑えた人工膜を製造でき、それを用いた皮膚角層細胞間脂質の機能評価方法を提供することに関する。
本発明者は、上記課題に鑑み鋭意研究を行ったところ、スフィンゴイド塩基としてフィトスフィンゴシンを含むセラミド類とコレステロールと遊離脂肪酸を用いた膜を形成した後、当該膜の相転移温度未満の温度に一旦昇温させ、次いで冷却する工程を経ることで、Ｖ−ｓｈａｐｅ構造の発現を抑えた人工膜が得られることを見出した。
すなわち、本発明は、次の工程（Ａ）及び（Ｂ）で得られた人工膜を用いる、皮膚角層細胞間脂質の機能評価方法を提供するものである。
（Ａ）基板上に、スフィンゴイド塩基としてフィトスフィンゴシンを含むセラミド類とコレステロールと遊離脂肪酸を含有する溶解液を噴霧して、膜を形成する工程
（Ｂ）前記膜を、当該膜の相転移温度未満の温度に昇温させた後、冷却する工程
（Ａ）基板上に、スフィンゴイド塩基としてフィトスフィンゴシンを含むセラミド類とコレステロールと遊離脂肪酸を含有する溶解液を噴霧して、膜を形成する工程
（Ｂ）前記膜を、当該膜の相転移温度未満の温度に昇温させた後、冷却する工程
本発明によれば、スフィンゴイド塩基としてフィトスフィンゴシンを含むセラミド類から形成され、皮膚の角層細胞間脂質構造を模倣する人工膜を用いた皮膚角層細胞間脂質の機能評価方法が提供される。
本発明は、（Ａ）基板上に、スフィンゴイド塩基としてフィトスフィンゴシンを含むセラミド類とコレステロールと遊離脂肪酸を含有する溶解液を噴霧して、膜を形成する工程と、（Ｂ）前記膜を、当該膜の相転移温度未満の温度に昇温させた後、冷却する工程で得られた人工膜を用いる、皮膚角層細胞間脂質の機能評価方法である。
〔工程（Ａ）〕
本工程では、基板上に、スフィンゴイド塩基としてフィトスフィンゴシンを含むセラミド類とコレステロールと遊離脂肪酸を含有する溶解液を噴霧して、膜を形成する。
基板は、特に限定されず、ガラス基板、金属基板、高分子基板等が挙げられる。
本工程では、基板上に、スフィンゴイド塩基としてフィトスフィンゴシンを含むセラミド類とコレステロールと遊離脂肪酸を含有する溶解液を噴霧して、膜を形成する。
基板は、特に限定されず、ガラス基板、金属基板、高分子基板等が挙げられる。
スフィンゴイド塩基としてフィトスフィンゴシン（Ｐ）を含むセラミド類の脂肪酸部分は、非水酸化脂肪酸（Ｎ）、α位（Ａ）或いはω位が水酸化された脂肪酸（ＥＯ）が挙げられる。ω位の水酸基には別の脂肪酸やタンパク質が付加し得る。
脂肪酸は、炭素数１６〜３２の飽和脂肪酸、一価不飽和脂肪酸又は多価不飽和脂肪酸が好ましい。
具体的には、市販されているものとして、Ｎ−テトラコサノイル-フィトスフィンゴシン（Ｎ−Tetracosanoyl-phytosphingosine：#2036, Matreya LLC, USA)、Ｎ−オクタデカノイル-フィトスフィンゴシン（Ｎ−Octadecanoyl-phytosphingosine：#2034, Matreya LLC, USA)、Ｎ−ヘキサデカノイル-フィトスフィンゴシン（Ｎ−Hexadecanoyl-phytosphingosine：#2035, Matreya LLC, USA)等が挙げられる。
脂肪酸は、炭素数１６〜３２の飽和脂肪酸、一価不飽和脂肪酸又は多価不飽和脂肪酸が好ましい。
具体的には、市販されているものとして、Ｎ−テトラコサノイル-フィトスフィンゴシン（Ｎ−Tetracosanoyl-phytosphingosine：#2036, Matreya LLC, USA)、Ｎ−オクタデカノイル-フィトスフィンゴシン（Ｎ−Octadecanoyl-phytosphingosine：#2034, Matreya LLC, USA)、Ｎ−ヘキサデカノイル-フィトスフィンゴシン（Ｎ−Hexadecanoyl-phytosphingosine：#2035, Matreya LLC, USA)等が挙げられる。
コレステロールは、特に限定されない。
遊離脂肪酸は、炭素数１６〜３２の飽和脂肪酸、一価不飽和脂肪酸又は多価不飽和脂肪酸が挙げられる。なかでも、ラメラ構造を形成させる観点から、炭素数１６〜２４の飽和脂肪酸が好ましく、パルミチン酸（Ｃ１６：０）、ステアリン酸（Ｃ１８：０）、アラキジン酸（Ｃ２０：０）、ベヘン酸（Ｃ２２：０）又はこれらの組み合わせがより好ましい。
スフィンゴイド塩基としてフィトスフィンゴシンを含むセラミド類とコレステロールと遊離脂肪酸の質量比（セラミド類：コレステロール：遊離脂肪酸）は、皮膚角層中に含まれるこれらの脂質類の組成に近づけるとの観点から、１：１：１〜１：０．５：１が好ましく、１：０．７４：１〜1：０．６５：１がより好ましい。
スフィンゴイド塩基としてフィトスフィンゴシンを含むセラミド類とコレステロールと遊離脂肪酸は、これらの脂質を溶媒中に溶解して溶解液とすればよい。
溶媒は、メタノール等のアルコール類；クロロホルム、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；酢酸エチル等のエステル類；ヘキサン、シクロヘキサン等の炭化水素類；ジエチルエーテル等のエーテル類、又はこれらの混合物が挙げられる。なかでも、溶解性の点、結晶析出抑制の点から、クロロホルムとメタノールの混液を用いることが好ましい。
両者の混合比（クロロホルム：メタノール、ｖ／ｖ）は、同様の点から、７：１〜３：１が好ましく、５．５：１〜４．５：１がより好ましい。
溶解液を調製する際は、おおよそ４０℃の温度で、超音波処理で混合撹拌することが好ましい。
溶媒は、メタノール等のアルコール類；クロロホルム、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；酢酸エチル等のエステル類；ヘキサン、シクロヘキサン等の炭化水素類；ジエチルエーテル等のエーテル類、又はこれらの混合物が挙げられる。なかでも、溶解性の点、結晶析出抑制の点から、クロロホルムとメタノールの混液を用いることが好ましい。
両者の混合比（クロロホルム：メタノール、ｖ／ｖ）は、同様の点から、７：１〜３：１が好ましく、５．５：１〜４．５：１がより好ましい。
溶解液を調製する際は、おおよそ４０℃の温度で、超音波処理で混合撹拌することが好ましい。
溶解液には、スフィンゴイド塩基としてフィトスフィンゴシンを含むセラミド類とコレステロールと遊離脂肪酸の他に、例えば、スフィンゴイド塩基としてスフィンゴシン（Ｓ）、ジヒドロスフィンゴシン（ＤＳ）、６−ヒドロキシスフィンゴシン（Ｈ）を含むセラミド類や、それらのリゾ体、分解生成物等が含まれていてもよい。
溶解液の噴霧は、特に限定されず、公知の方法を適用できる。
噴霧時の温度は、室温が好ましい。
また、噴霧時の圧力は、噴霧ノズルの形状にも依存するが、例えば一般的な塗料塗布用のスプレー装置（ノズル口径０．２ｍｍ）であれば１０ｋＰａ程度好ましい。
噴霧時の温度は、室温が好ましい。
また、噴霧時の圧力は、噴霧ノズルの形状にも依存するが、例えば一般的な塗料塗布用のスプレー装置（ノズル口径０．２ｍｍ）であれば１０ｋＰａ程度好ましい。
基板上に形成される膜の膜厚は、結晶化抑制の点から、１０〜１００００ｎｍ好ましい。
〔工程（Ｂ）〕
本工程では、工程（Ａ）で形成された膜を、当該膜の相転移温度未満の温度に昇温させた後、冷却する。
非特許文献１に示されるように、一般的に膜の温度処理は膜の相転移温度よりも１０℃程度高い温度で行うところ、膜の相転移温度よりも低い温度領域で昇温、次いで冷却することでＶ−ｓｈａｐｅ構造の発現しない人工膜を得ることができる。
本工程では、工程（Ａ）で形成された膜を、当該膜の相転移温度未満の温度に昇温させた後、冷却する。
非特許文献１に示されるように、一般的に膜の温度処理は膜の相転移温度よりも１０℃程度高い温度で行うところ、膜の相転移温度よりも低い温度領域で昇温、次いで冷却することでＶ−ｓｈａｐｅ構造の発現しない人工膜を得ることができる。
膜の相転移温度は、膜の示差走査熱量測定（ＤＳＣ）測定によって求めることができる。ＤＳＣ測定は通常実施される方法に従って実施すればよい。詳細は後述したとおりである。
昇温温度は、膜形成時の温度よりも高く、かつ、膜の相転移温度未満の温度であればよいが、上限は、好ましくは膜の相転移温度よりも５℃程度低い温度に設定する。また、下限は、膜に含まれるコレステロールの融点以上が好ましい。
例えば、後記実施例に示したＣ２４ＮＰ−Ｃ２４ＮＳ、コレステロール及びベヘン酸から成る人工膜のＤＳＣの測定結果によれば、当該膜の相転移温度は７０℃であった。また、膜に含まれるコレステロールの融点は約６０℃であった。
したがって、昇温温度は、７０℃未満であるが、好ましくは、６０〜６５℃の範囲である。
尚、膜に含まれるコレステロールの融点は、Ｘ線小角散乱の温度変化測定によって求めることができる。
昇温温度は、膜形成時の温度よりも高く、かつ、膜の相転移温度未満の温度であればよいが、上限は、好ましくは膜の相転移温度よりも５℃程度低い温度に設定する。また、下限は、膜に含まれるコレステロールの融点以上が好ましい。
例えば、後記実施例に示したＣ２４ＮＰ−Ｃ２４ＮＳ、コレステロール及びベヘン酸から成る人工膜のＤＳＣの測定結果によれば、当該膜の相転移温度は７０℃であった。また、膜に含まれるコレステロールの融点は約６０℃であった。
したがって、昇温温度は、７０℃未満であるが、好ましくは、６０〜６５℃の範囲である。
尚、膜に含まれるコレステロールの融点は、Ｘ線小角散乱の温度変化測定によって求めることができる。
形成された膜を昇温状態に保持しておく時間は膜全体が設定温度となるに足る時間以上であればよいが、膜全体を準安定状態とする点から、１０分〜２０分が好ましい。
膜形成時の温度から昇温温度に至るまでに要した時間から算出される昇温速度は、１５〜２５Ｋ/ｍｉｎが好ましい。
膜形成時の温度から昇温温度に至るまでに要した時間から算出される昇温速度は、１５〜２５Ｋ/ｍｉｎが好ましい。
冷却温度は、昇温温度より低い温度であれば良く、膜全体を準安定状態とする点から、室温とすることが好ましい。
昇温温度から冷却温度に至るまでに要した時間から算出される冷却速度は、１５〜２５Ｋ/ｍｉｎが好ましい。
昇温温度から冷却温度に至るまでに要した時間から算出される冷却速度は、１５〜２５Ｋ/ｍｉｎが好ましい。
本発明では、工程（Ｂ）の後に、膜を水和する工程（Ｃ）を更に含むことが好ましい。工程（Ｃ）では、水和状態の均質化を図る観点から、再度、膜を膜の相転移温度未満の温度に昇温させた後、冷却することが好ましい。昇温条件は、工程（Ｂ）と同じであることが好ましい。
膜の水和は、膜に水分を供給できればよく、例えば、水に浸漬する方法、加水する方法等が挙げられる。
膜の水和は、膜に水分を供給できればよく、例えば、水に浸漬する方法、加水する方法等が挙げられる。
本発明の処理の結果、スフィンゴイド塩基としてフィトスフィンゴシンを含むセラミド類から形成され、ヒト皮膚の角層細胞間脂質のラメラ構造を模した人工膜が得られる。後記実施例に示すように、斯かる人工膜にはＶ-ｓｈａｐｅ構造の存在を示すピークが存在しない。人工膜におけるＶ-ｓｈａｐｅ構造生成は、Ｘ線小角散乱法によって確認できる。
本発明の人工膜は、生体角層に代わって、皮膚角層細胞間脂質の機能、例えば、皮膚バリア機能を評価するために用いられる。
本発明の人工膜は、生体角層に代わって、皮膚角層細胞間脂質の機能、例えば、皮膚バリア機能を評価するために用いられる。
［Ｘ線小角散乱］
装置：
・大型放射光施設（SPring-8）ビームライン40B2
X線の波長：0.08 nm、検出器-試料間距離：50 cm、露光：30秒、検出器：イメージングプレートR-AXIS VII（RIGAKU、Japan）
・NanoViewer（RIGAKU、Japan）
X線の波長：0.15 nm、検出器-試料間距離：8 cm、露光：120秒、検出器：半導体検出器Pilatus100k（RIGAKU、Japan）
装置：
・大型放射光施設（SPring-8）ビームライン40B2
X線の波長：0.08 nm、検出器-試料間距離：50 cm、露光：30秒、検出器：イメージングプレートR-AXIS VII（RIGAKU、Japan）
・NanoViewer（RIGAKU、Japan）
X線の波長：0.15 nm、検出器-試料間距離：8 cm、露光：120秒、検出器：半導体検出器Pilatus100k（RIGAKU、Japan）
［熱分析測定（ＤＳＣ測定）］
装置：
・DSC HS84（Mettler Toledo、Switzerland）
装置：
・DSC HS84（Mettler Toledo、Switzerland）
実施例１及び比較例１
クロロホルムとメタノールの混合溶媒（５：１、ｖ／ｖ）２ｍＬに、Ｃ２４ＮＰ−Ｃ２４ＮＳ（９：１、Ｍａｔｒｅｙａ製）と、コレステロールと、ベヘン酸（Ｃ２２：０）を計３ｍｇ加え、超音波処理を行って溶解させた。スフィンゴイド塩基としてフィトスフィンゴシンを含むセラミド類とコレステロールと遊離脂肪酸の質量比（セラミド類：コレステロール：遊離脂肪酸）は１：０．７：１であった。
次いで、スプレー法を用いてＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ＧＳＷＰメンブラン０．２２μｍに溶解液を吹き付け、膜を形成させた。膜厚は５μｍである。 ＤＳＣ測定の結果、膜の相転移温度は７０℃を示した。また、Ｘ線小角散乱の温度変化測定の結果、膜に含まれるコレステロールの融点は約６０℃であった。
クロロホルムとメタノールの混合溶媒（５：１、ｖ／ｖ）２ｍＬに、Ｃ２４ＮＰ−Ｃ２４ＮＳ（９：１、Ｍａｔｒｅｙａ製）と、コレステロールと、ベヘン酸（Ｃ２２：０）を計３ｍｇ加え、超音波処理を行って溶解させた。スフィンゴイド塩基としてフィトスフィンゴシンを含むセラミド類とコレステロールと遊離脂肪酸の質量比（セラミド類：コレステロール：遊離脂肪酸）は１：０．７：１であった。
次いで、スプレー法を用いてＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ＧＳＷＰメンブラン０．２２μｍに溶解液を吹き付け、膜を形成させた。膜厚は５μｍである。 ＤＳＣ測定の結果、膜の相転移温度は７０℃を示した。また、Ｘ線小角散乱の温度変化測定の結果、膜に含まれるコレステロールの融点は約６０℃であった。
次いで、メンブランを実施例１では６０℃加温処理、比較例１では８５℃加温処理を行った。加温時間は１５分とした。
室温まで自然冷却した後、水（ＭｉｌｌｉＱ水−比抵抗で１８．２ＭΩ・ｃｍ）をメンブラン上に１００μＬ滴下し、再度、実施例１では６０℃加温処理、比較例１では８５℃加温処理を行った。加温時間は１５分とした。次いで、室温まで冷却して人工膜を得た。
実施例１及び比較例１の人工膜のＸ線小角散乱測定の結果を図１に示す。
図１に示すとおり、比較例１ではＶ−ｓｈａｐｅ構造が発現したのに対して、実施例１ではＶ−ｓｈａｐｅ構造がみられなかった。実施例１では５ｎｍの周期構造由来の散乱ピークが観察されており、用いた脂質分子の分子長からバイレイヤーが積層するラメラ構造の形成が確認された。
図１に示すとおり、比較例１ではＶ−ｓｈａｐｅ構造が発現したのに対して、実施例１ではＶ−ｓｈａｐｅ構造がみられなかった。実施例１では５ｎｍの周期構造由来の散乱ピークが観察されており、用いた脂質分子の分子長からバイレイヤーが積層するラメラ構造の形成が確認された。
Claims (2)
- 次の工程（Ａ）及び（Ｂ）で得られた人工膜を用いる、皮膚角層細胞間脂質の機能評価方法。
（Ａ）基板上に、スフィンゴイド塩基としてフィトスフィンゴシンを含むセラミド類とコレステロールと遊離脂肪酸を含有する溶解液を噴霧して、膜を形成する工程
（Ｂ）前記膜を、当該膜の相転移温度未満の温度に昇温させた後、冷却する工程 - 工程（Ａ）において、スフィンゴイド塩基としてフィトスフィンゴシンを含むセラミド類とコレステロールと遊離脂肪酸の質量比（セラミド類：コレステロール：遊離脂肪酸）が１:１：１〜１：０．５：１である、請求項１記載の皮膚角層細胞間脂質の機能評価方法。
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| JP2017252799A JP6931605B2 (ja) | 2017-12-28 | 2017-12-28 | 人工膜を用いた皮膚角層細胞間脂質の機能評価方法 |
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