JP6909466B2 - Method for producing labeled metabolites, method for quantifying metabolites, and kit for producing labeled metabolites - Google Patents
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Description
本発明は、標識代謝物の製造方法、代謝物の定量方法、及び標識代謝物製造キットに関する。 The present invention relates to a method for producing a labeled metabolite, a method for quantifying a metabolite, and a kit for producing a labeled metabolite.
近年の質量分析技術の進歩により、メタボローム解析は、基礎研究分野のみならず、医療、創薬、食品、農業、環境等の様々な分野で広く普及している。メタボローム解析においては、質量分析のピーク強度やピーク面積から測定対象の代謝物の相対量を解析することが主流である。しかし、測定毎の前処理法や分析方法、分析条件を揃えることは困難であり、また代謝物毎にイオン化効率も異なるため、測定されたサンプルデータはそのままでは比較や統合が行えない。この問題を解決する方法としては、安定同位体標識（ＳＩ標識）された標識代謝物を内部標準物質とした質量分析により、測定対象の代謝物を定量する絶対定量法が知られている。 Due to recent advances in mass spectrometry technology, metabolome analysis has become widespread not only in basic research fields but also in various fields such as medicine, drug discovery, food, agriculture, and the environment. In metabolome analysis, it is mainstream to analyze the relative amount of metabolites to be measured from the peak intensity and peak area of mass spectrometry. However, it is difficult to prepare the pretreatment method, analysis method, and analysis conditions for each measurement, and the ionization efficiency differs for each metabolite, so that the measured sample data cannot be compared or integrated as it is. As a method for solving this problem, an absolute quantification method is known in which a metabolite to be measured is quantified by mass spectrometry using a labeled metabolite labeled with a stable isotope (SI label) as an internal standard substance.
しかし、ＳＩ標識化合物は一般に高価であり、また合成が困難なものも多い。そのため、メタボローム解析のような測定対象の代謝物が数百種類にものぼる網羅的な解析においては、それら全ての代謝物に対応する標識代謝物を個別に用意することは現実的ではない。そこで、ＳＩ標識化合物を含む培地で細胞を培養し、培養細胞中でＳＩ標識化合物を代謝させ、得られたＳＩ標識細胞から抽出した標識代謝物を内部標準物質として使用することが提案されている（特許文献１、非特許文献１）。 However, SI-labeled compounds are generally expensive and often difficult to synthesize. Therefore, in a comprehensive analysis such as metabolome analysis in which there are hundreds of types of metabolites to be measured, it is not realistic to individually prepare labeled metabolites corresponding to all of these metabolites. Therefore, it has been proposed to culture cells in a medium containing an SI-labeled compound, metabolize the SI-labeled compound in the cultured cells, and use the labeled metabolite extracted from the obtained SI-labeled cells as an internal standard substance. (Patent Document 1, Non-Patent Document 1).
しかし、特許文献１等の方法では、ＳＩ標識化合物を用いた細胞培養だけでなく、標識代謝物を得るためにクエンチング、細胞破砕、抽出等も行うため、それらを実施するための設備が必要なうえ、作業も煩雑である。また、標識代謝物によっては、細胞から抽出するまでに細胞中で消費されたり、細胞からの抽出効率が低かったりすることで充分な量が得られにくい。特に中心代謝系、なかでも解糖系やペントースリン酸系等の代謝物であるリン酸化化合物をＳＩ標識した標識代謝物を簡便かつ安価に得ることは難しい。ＳＩ標識細胞から抽出した抽出液中には、標的とする標識代謝物以外にも数多くの未知代謝物が存在する。そのため、質量分析計にて本抽出液を内部標準液として取得したデータは、複雑性を増し、時には誤同定につながるケースもある。したがって、純度が高くかつ包括的に標識代謝物のみを調製できる手法が理想的と考えられる。
近年、トランスオミクス解析、コホート解析や薬物動態解析等の絶対定量を必要とするメタボローム解析の重要性が増していることから、より簡便かつ安価に純度の高い多数の標識代謝物を製造できる方法が求められている。
However, in the method of Patent Document 1 and the like, not only cell culture using SI-labeled compounds but also quenching, cell disruption, extraction and the like are performed in order to obtain labeled metabolites, so equipment for carrying out these is required. Moreover, the work is complicated. Further, depending on the labeled metabolite, it is difficult to obtain a sufficient amount because it is consumed in the cell before it is extracted from the cell or the extraction efficiency from the cell is low. In particular, it is difficult to easily and inexpensively obtain a labeled metabolite in which a phosphorylated compound, which is a metabolite such as glycolysis or pentose phosphate, is SI-labeled. In the extract extracted from SI-labeled cells, there are many unknown metabolites in addition to the targeted labeled metabolites. Therefore, the data acquired by the mass spectrometer using this extract as an internal standard solution increases in complexity and sometimes leads to misidentification. Therefore, a method capable of preparing only labeled metabolites with high purity and comprehensively is considered to be ideal.
In recent years, the importance of metabolome analysis, which requires absolute quantification such as transomics analysis, cohort analysis, and pharmacokinetic analysis, has increased. It has been demanded.
本発明は、安定同位体で標識された多数の標識代謝物を簡便かつ安価に製造できる標識代謝物の製造方法、及び該製造方法を利用した代謝物の定量方法、並びに標識代謝物製造キットの提供を目的とする。 The present invention relates to a method for producing a labeled metabolite capable of easily and inexpensively producing a large number of labeled metabolites labeled with stable isotopes, a method for quantifying a metabolite using the production method, and a labeled metabolite production kit. For the purpose of providing.
本発明は、以下の態様を有する。
［１］分子内の少なくとも１つの原子が安定同位体で置換されて標識された標識化合物を細胞抽出液中で代謝させ、安定同位体で標識された標識代謝物を製造する、標識代謝物の製造方法。
［２］前記細胞抽出液に補酵素を添加する、［１］に記載の標識代謝物の製造方法。
［３］前記安定同位体が、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ及び３４Ｓからなる群から選ばれる少なくとも１種である、［１］又は［２］に記載の標識代謝物の製造方法。
［４］前記細胞抽出液が、大腸菌由来、ウサギ網状赤血球由来、昆虫細胞由来、小麦胚芽由来、又はタバコ培養細胞由来の細胞抽出液である、［１］〜［３］のいずれかに記載の標識代謝物の製造方法。
［５］前記標識化合物が、１３Ｃ標識グルコースである、［１］〜［４］のいずれかに記載の標識代謝物の製造方法。
［６］前記標識化合物が、１８Ｏ標識アデノシン三リン酸である、［１］〜［４］のいずれかに記載の標識代謝物の製造方法。
［７］［１］〜［６］のいずれかに記載の標識代謝物の製造方法により製造した標識代謝物を内部標準物質とした質量分析により、代謝物を定量する、代謝物の定量方法。
［８］細胞抽出液を備える、安定同位体で標識された標識代謝物を製造するための標識代謝物製造キット。
［９］ろ過手段をさらに備える、［８］に記載の標識代謝物製造キット。
The present invention has the following aspects.
[1] A labeled metabolite in which at least one atom in the molecule is replaced with a stable isotope and the labeled compound is metabolized in a cell extract to produce a labeled metabolite labeled with a stable isotope. Production method.
[2] The method for producing a labeled metabolite according to [1], wherein a coenzyme is added to the cell extract.
[3] The stable isotope, 2 H, 13 is a C, 15 N, 17 O, 18 O and 34 at least one selected from the group consisting of S, [1] or [2] signs metabolism according Manufacturing method of things.
[4] The above-mentioned one of [1] to [3], wherein the cell extract is a cell extract derived from Escherichia coli, rabbit reticulocyte, insect cell, wheat germ, or cultured tobacco cell. Method for producing labeled metabolites.
[5] The method for producing a labeled metabolite according to any one of [1] to [4], wherein the labeled compound is 13 C-labeled glucose.
[6] The method for producing a labeled metabolite according to any one of [1] to [4], wherein the labeled compound is 18 O-labeled adenosine triphosphate.
[7] A method for quantifying metabolites, wherein the metabolites are quantified by mass spectrometry using the labeled metabolites produced by the method for producing labeled metabolites according to any one of [1] to [6] as an internal standard substance.
[8] A labeled metabolite production kit for producing a labeled metabolite labeled with a stable isotope, which comprises a cell extract.
[9] The labeled metabolite production kit according to [8], further comprising a filtration means.
本発明によれば、安定同位体で標識された多数の標識代謝物を簡便かつ安価に製造できる。 According to the present invention, a large number of labeled metabolites labeled with stable isotopes can be produced easily and inexpensively.
［標識代謝物の製造方法］
本発明の標識代謝物の製造方法は、分子内の少なくとも１つの原子が安定同位体で置換されて標識された標識化合物を細胞抽出液中で代謝させ、安定同位体で標識された標識代謝物を製造する方法である。
[Manufacturing method of labeled metabolite]
In the method for producing a labeled metabolite of the present invention, a labeled compound in which at least one atom in the molecule is replaced with a stable isotope is metabolized in a cell extract, and the labeled metabolite labeled with a stable isotope is used. Is a method of manufacturing.
細胞抽出液としては、特に限定されず、植物細胞、動物細胞、真菌細胞、細菌細胞等から抽出した細胞抽出液を使用できる。例えば、大腸菌由来、ウサギ網状赤血球由来、昆虫細胞由来、小麦胚芽由来、タバコ培養細胞由来、マウスＬ−細胞由来、エールリッヒ腹水癌細胞由来、Ｈｅｌａ細胞由来、ＣＨＯ細胞由来、出芽酵母由来等の細胞抽出液が挙げられる。なかでも、細胞抽出液としては、大腸菌由来、ウサギ網状赤血球由来、昆虫細胞由来、小麦胚芽由来又はタバコ培養細胞由来の細胞抽出液が好ましく、特に、無細胞タンパク質合成に利用され多くの酵素が活性を維持され、且つ、比較的安価である点から、大腸菌由来の細胞抽出液が好ましい。大腸菌由来の抽出液は、公知の方法で調製したものを使用してもよく、市販品を使用してもよい。 The cell extract is not particularly limited, and a cell extract extracted from plant cells, animal cells, fungal cells, bacterial cells and the like can be used. For example, cell extraction from Escherichia coli, rabbit reticulocyte, insect cell, wheat germ, tobacco cultured cell, mouse L-cell, Ehrlich ascites cancer cell, Hela cell, CHO cell, budding yeast, etc. Liquid can be mentioned. Among them, as the cell extract, a cell extract derived from Escherichia coli, rabbit reticular erythrocytes, insect cells, wheat germ or cultured tobacco cells is preferable, and in particular, it is used for cell-free protein synthesis and many enzymes are active. A cell extract derived from Escherichia coli is preferable because it can maintain the above-mentioned substance and is relatively inexpensive. As the extract derived from Escherichia coli, one prepared by a known method may be used, or a commercially available product may be used.
細胞抽出液の調製方法としては、公知の方法を採用でき、例えば、以下の方法が挙げられる。細胞をフレンチプレスやグラスビーズにて破砕し、遠心分離にて不溶成分を沈殿させて分離する。得られた溶液をインキュベーションすることによりＤＮＡ、ＲＮＡを分解し、透析やゲルろ過等を用いてタンパク質以外の大腸菌由来のＤＮＡ、ＲＮＡ、その他の代謝化合物などの低分子を除去する。 As a method for preparing the cell extract, a known method can be adopted, and examples thereof include the following methods. The cells are crushed with a French press or glass beads, and the insoluble component is precipitated and separated by centrifugation. DNA and RNA are decomposed by incubating the obtained solution, and small molecules such as DNA, RNA and other metabolic compounds derived from Escherichia coli other than protein are removed by dialysis, gel filtration and the like.
細胞抽出液としては、例えば無細胞タンパク質合成キット（商品名：無細胞くん、大陽日酸社製）の構成要素であるＳ３０細胞抽出液、もしくはキット内液を使用してもよい。大腸菌Ｓ３０細胞抽出液は、増殖させた大腸菌の菌体を破砕して細胞破砕液を得て、この細胞破砕液を３０，０００ｘｇの遠心分離にかけて分離した上清から得たものである。このキットは、細胞抽出液にアミノ酸、目的タンパク質の遺伝子、エネルギー液を加え試験管内でタンパク質を合成するためのキットである。このキットに含まれる細胞抽出液は、その作成工程において細胞膜、膜タンパク質、核酸やアミノ酸等の低分子化合物は除去されているが、その他の可溶性のタンパク質は除去されておらず、大腸菌の中心代謝に関わる多くの酵素はその活性を維持したまま抽出液内に存在している。 As the cell extract, for example, the S30 cell extract, which is a component of the cell-free protein synthesis kit (trade name: Cell-free, manufactured by Taiyo Nippon Sanso Co., Ltd.), or the solution in the kit may be used. The Escherichia coli S30 cell extract is obtained by crushing the grown Escherichia coli cells to obtain a cell crushed solution, and the cell crushed solution is obtained from a supernatant separated by centrifugation at 30,000 xg. This kit is a kit for synthesizing a protein in vitro by adding an amino acid, a gene of a target protein, and an energy solution to a cell extract. The cell extract contained in this kit has cell membranes, membrane proteins, small molecule compounds such as nucleic acids and amino acids removed in the process of preparation, but other soluble proteins have not been removed, and the central metabolism of Escherichia coli. Many of the enzymes involved in this are present in the extract while maintaining their activity.
標識化合物は、生体内で代謝される化合物であって、分子内の少なくとも１つの原子が安定同位体で置換されて標識された化合物である。細胞抽出液に標識化合物を加えることで、該細胞抽出液中に含まれる残存代謝により該標識化合物が化学変換され、安定同位体で標識された複数の標識代謝物が一度に合成される。 A labeled compound is a compound that is metabolized in vivo and is labeled by substituting at least one atom in the molecule with a stable isotope. By adding the labeled compound to the cell extract, the labeled compound is chemically converted by the residual metabolism contained in the cell extract, and a plurality of labeled metabolites labeled with stable isotopes are synthesized at one time.
標識対象の化合物は、生体内で代謝される化合物であればよく、代謝の原料化合物であってもよく、中間体であってもよい。標識対象の化合物の具体例としては、例えば、解糖系、ペントースリン酸系及びクエン酸回路で代謝される化合物であるグルコース、グルコース−６−リン酸、フルクトース−６−リン酸や、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、ピルビン酸、クエン酸、グルタミン酸、α―ケトグルタル酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸等が挙げられる。 The compound to be labeled may be any compound that is metabolized in vivo, and may be a raw material compound for metabolism or an intermediate. Specific examples of the compound to be labeled include glucose, glucose-6-phosphate, fructose-6-phosphate, and adenosine triphosphate, which are glycolytic, pentogluic acid, and citric acid cycle compounds. Acids (ATP), pyruvic acid, citric acid, glutamic acid, α-ketoglutaric acid, succinic acid, fumaric acid, malic acid and the like can be mentioned.
標識化合物の標識に用いる安定同位体としては、例えば、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３４Ｓが挙げられる。
標識化合物中の安定同位体の数は、１つであってもよく、２つ以上であってもよい。また、標識化合物中の安定同位体は、１種であってもよく、２種以上であってもよい。
The stable isotopes used for labeling of a labeled compound, e.g., 2 H, 13 C, 15 N, 17 O, 18 O, 34 S and the like.
The number of stable isotopes in the labeled compound may be one or two or more. Further, the stable isotope in the labeled compound may be one kind or two or more kinds.
標識化合物の具体例としては、例えば、２Ｈ標識グルコース、１３Ｃ標識グルコース、１８Ｏ標識ＡＴＰ、１５Ｎ標識アンモニウム塩等が挙げられる。なかでも、解糖系やペントースリン酸系等の中心代謝に関わる多くの標識代謝物が簡便かつ安価に得られることから、１３Ｃ標識グルコース、１８Ｏ標識ＡＴＰが好ましい。
標識化合物としては、１種を単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
Specific examples of the labeled compound include 2 H-labeled glucose, 13 C-labeled glucose, 18 O-labeled ATP, 15 N-labeled ammonium salt and the like. Of these, 13 C-labeled glucose and 18 O-labeled ATP are preferable because many labeled metabolites involved in central metabolism such as glycolysis and pentose phosphate can be obtained easily and inexpensively.
As the labeling compound, one type may be used alone, or two or more types may be used in combination.
１３Ｃ標識グルコースは、グルコースの分子内の炭素原子が１３Ｃで置換されて標識された標識化合物である。１３Ｃ標識グルコースとしては、グルコースが代謝分解された代謝物が全て１３Ｃ標識される点から、グルコースの全ての炭素原子が１３Ｃで置換された１３Ｃ標識グルコースが好ましい。 13 C-labeled glucose is a labeled compound in which the carbon atom in the glucose molecule is replaced with 13 C. 13 The C-labeled glucose, from the point where the glucose is metabolized degraded metabolites all 13 C-labeled, 13 C-labeled glucose all carbon atoms of the glucose is replaced by 13 C are preferred.
１８Ｏ標識ＡＴＰは、ＡＴＰの分子内の酸素原子が１８Ｏで置換されて標識された標識化合物である。１８Ｏ標識ＡＴＰとしては、γ位のリン酸の転移先の化合物を１８Ｏ標識できる点から、ＡＴＰのγ位の酸素原子が１８Ｏで置換されて標識された１８Ｏ標識ＡＴＰが好ましい。 18 O-labeled ATP is a labeled compound in which the oxygen atom in the molecule of ATP is replaced with 18 O. 18 The O-labeled ATP, from viewpoint of 18 O labeled transition destination of the compounds of the γ-position phosphate, 18 O-labeled ATP is preferably the oxygen atom of γ-position of ATP is labeled substituted with 18 O.
標識化合物の製造方法は、特に限定されず、公知の方法を採用できる。 The method for producing the labeled compound is not particularly limited, and a known method can be adopted.
反応液中の標識化合物の濃度は、０．１〜５００ｍＭが好ましく、１〜１００ｍＭがより好ましい。標識化合物の濃度が前記範囲の下限値以上であれば、標識代謝物が得られやすい。標識化合物の濃度が前記範囲の上限値以下であれば、より多種類の標識代謝物が合成されやすい。 The concentration of the labeled compound in the reaction solution is preferably 0.1 to 500 mM, more preferably 1 to 100 mM. When the concentration of the labeled compound is at least the lower limit of the above range, a labeled metabolite can be easily obtained. When the concentration of the labeled compound is not more than the upper limit of the above range, more kinds of labeled metabolites are likely to be synthesized.
細胞抽出液を調製する際には、目的の標識代謝物が生成される代謝に関わる補酵素の量が精製等によって少なくなることがある。この場合には、充分な量の標識代謝物が得られやすい点から、細胞抽出液に補酵素を添加することが好ましい。 When preparing a cell extract, the amount of coenzyme involved in metabolism that produces the desired labeled metabolite may be reduced by purification or the like. In this case, it is preferable to add a coenzyme to the cell extract from the viewpoint that a sufficient amount of labeled metabolite can be easily obtained.
添加する補酵素としては、例えば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）、コエンザイムＡ、ピリドキサールリン酸等が挙げられる。解糖系やペントースリン酸系等の中心代謝に関わる標識代謝物を製造する場合には、ＮＡＤ及びＮＡＤＰを添加することがより好ましい。
添加する補酵素は、１種であってもよく、２種以上であってもよい。
Examples of the coenzyme to be added include nicotinamide adenine dinucleotide (NAD), nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP), coenzyme A, pyridoxal phosphate and the like. When producing labeled metabolites involved in central metabolism such as glycolysis and pentose phosphate pathway, it is more preferable to add NAD and NADP.
The coenzyme to be added may be one type or two or more types.
補酵素を添加する場合、補酵素の添加量は、反応液の総量に対して、０．１〜２００ｍＭが好ましく、１〜１００ｍＭがより好ましい。補酵素の添加量が前記範囲の下限値以上であれば、標識代謝物が得られやすい。補酵素の添加量が前記範囲の上限値以下であれば、より多種類の標識代謝物が得られる。 When the coenzyme is added, the amount of the coenzyme added is preferably 0.1 to 200 mM, more preferably 1 to 100 mM with respect to the total amount of the reaction solution. When the amount of the coenzyme added is at least the lower limit of the above range, a labeled metabolite can be easily obtained. When the amount of the coenzyme added is not more than the upper limit of the above range, more kinds of labeled metabolites can be obtained.
細胞抽出液中で標識化合物を代謝させる際の反応温度は、２０〜４０℃が好ましく、２３〜３７℃がより好ましい。
反応時間は、３０分〜１０時間が好ましく、必要とする代謝物によって反応条件は最適化できる。
The reaction temperature for metabolizing the labeled compound in the cell extract is preferably 20 to 40 ° C, more preferably 23 to 37 ° C.
The reaction time is preferably 30 minutes to 10 hours, and the reaction conditions can be optimized depending on the required metabolites.
反応後には、反応液からタンパク質等の高分子化合物を除去して標識代謝物を精製することが好ましい。標識代謝物を精製する方法としては、限外ろ過が好ましい。限外ろ過は、精製作業が簡便であり、大腸菌系以外の細胞抽出液、例えばウサギ網状赤血球由来、昆虫細胞由来、小麦胚芽由来等の細胞抽出液を用いた場合にも応用可能であり、技術の一般化や商品化が極めて容易である。細胞抽出液中の一部の酵素が、欠損あるいは失活している場合においては、無細胞系外で別途調製した酵素を添加してもよい。 After the reaction, it is preferable to remove the polymer compound such as protein from the reaction solution to purify the labeled metabolite. Ultrafiltration is preferred as a method for purifying labeled metabolites. Ultrafiltration is easy to purify and can also be applied when using cell extracts other than Escherichia coli, such as cell extracts derived from rabbit reticular red erythrocytes, insect cells, wheat germs, etc. Is extremely easy to generalize and commercialize. If some of the enzymes in the cell extract are deficient or inactivated, enzymes prepared separately outside the cell-free system may be added.
本発明の製造方法で得られる標識代謝物は、例えば、定量した後に、メタボローム解析における質量分析の内部標準溶液として利用することができる。本発明の製造方法で得た標識代謝物を定量する方法としては、特に限定されず、例えば、別途調製した安定同位体で標識していない濃度既知の非標識代謝物を内部標準物質とする質量分析が挙げられる。 The labeled metabolite obtained by the production method of the present invention can be used as an internal standard solution for mass spectrometry in metabolome analysis, for example, after being quantified. The method for quantifying the labeled metabolite obtained by the production method of the present invention is not particularly limited. Analysis can be mentioned.
以上説明したように、本発明の標識代謝物の製造方法においては、安定同位体で標識された標識同位体を細胞抽出液中で代謝させることで、安定同位体で標識された複数の標識代謝物を製造できる。本発明の製造方法では、恒温槽等の簡易な設備で反応を実施でき、精製も簡便である。そのため、特許文献１等の従来の標識細胞を培養する方法のように細胞培養やクエンチング、細胞破砕、抽出等を行う設備も必要なく、作業も簡便である。また、個々の標識代謝物の合成する必要が無いため、多数の標識代謝物でも短時間に低コストに製造できる。
また、本発明では、用途に合わせてその代謝経路上流の標識化合物を用いることで、所望の標識代謝物の混合物を簡便に得ることができる。
As described above, in the method for producing a labeled metabolite of the present invention, a plurality of labeled metabolites labeled with a stable isotope are metabolized by metabolizing the labeled isotope labeled with a stable isotope in a cell extract. Can manufacture things. In the production method of the present invention, the reaction can be carried out in a simple facility such as a constant temperature bath, and purification is also simple. Therefore, unlike the conventional method for culturing labeled cells such as Patent Document 1, there is no need for equipment for cell culture, quenching, cell crushing, extraction, etc., and the work is simple. Moreover, since it is not necessary to synthesize individual labeled metabolites, a large number of labeled metabolites can be produced in a short time at low cost.
Further, in the present invention, a desired mixture of labeled metabolites can be easily obtained by using a labeled compound upstream of the metabolic pathway according to the intended use.
［標識代謝物製造キット］
本発明の標識代謝物製造キットは、安定同位体で標識された標識代謝物を製造するためのキットであって、細胞抽出液を備える。また、本発明の標識代謝物製造キットは、さらに補酵素を備えてもよい。
細胞抽出液及び補酵素としては、前述した標識代謝物の製造方法で挙げたものと同じものが挙げられる。
[Labeled metabolite production kit]
The labeled metabolite production kit of the present invention is a kit for producing a labeled metabolite labeled with a stable isotope, and comprises a cell extract. In addition, the labeled metabolite production kit of the present invention may further include a coenzyme.
Examples of the cell extract and coenzyme include the same as those mentioned in the above-mentioned method for producing a labeled metabolite.
標識代謝物製造キットの細胞抽出液への補酵素の添加量は、最終的な反応液の総量に対して、０．０１〜５００ｍＭとなる量が好ましく、１〜１００ｍＭとなる量がより好ましい。 The amount of the coenzyme added to the cell extract of the labeled metabolite production kit is preferably 0.01 to 500 mM, more preferably 1 to 100 mM with respect to the total amount of the final reaction solution.
本発明の標識代謝物製造キットは、ろ過手段をさらに備えることが好ましい。これにより、反応後の反応液から標識代謝物を簡便に精製できる。
ろ過手段としては、限外ろ過膜が好ましい。
The labeled metabolite production kit of the present invention preferably further comprises filtration means. Thereby, the labeled metabolite can be easily purified from the reaction solution after the reaction.
As the filtration means, an ultrafiltration membrane is preferable.
［代謝物の定量方法］
本発明の代謝物の定量方法は、本発明の標識代謝物の製造方法により製造した標識代謝物を内部標準物質とした質量分析により、代謝物を定量する方法である。本発明の代謝物の定量方法は、メタボローム解析に特に有用である。
本発明の代謝物の定量方法は、質量分析における内部標準物質として、本発明の標識代謝物の製造方法により製造した標識代謝物を用いる以外は、公知の方法を採用できる。標識代謝物は、本発明の製造方法により製造した後に前記した方法で定量してから内部標準物質として用いる。
[Method for quantifying metabolites]
The method for quantifying metabolites of the present invention is a method for quantifying metabolites by mass spectrometry using the labeled metabolites produced by the method for producing labeled metabolites of the present invention as an internal standard substance. The method for quantifying metabolites of the present invention is particularly useful for metabolome analysis.
As the method for quantifying metabolites of the present invention, known methods can be adopted except that the labeled metabolites produced by the method for producing labeled metabolites of the present invention are used as the internal standard substance in mass spectrometry. The labeled metabolite is produced by the production method of the present invention, quantified by the method described above, and then used as an internal standard substance.
本発明では、例えば、標識代謝物を内部標準物質とした代謝物の質量分析における、内部標準物質である標識代謝物由来のピーク強度と、測定対象の代謝物由来のピーク強度とを比較することで、測定対象の代謝物を定量することができる。 In the present invention, for example, in mass spectrometry of a metabolite using a labeled metabolite as an internal standard substance, the peak intensity derived from the labeled metabolite, which is an internal standard substance, and the peak intensity derived from the metabolite to be measured are compared. Therefore, the metabolite to be measured can be quantified.
測定対象の代謝物としては、特に限定されず、例えば、生体から採取した組織（脳、脊髄、胃、膵臓、腎臓、肝臓、甲状腺、胆嚢、肺、小腸、大腸等）、生体液（血液、尿等）、細胞（肝細胞、免疫細胞、幹細胞、癌細胞等）等に含まれる代謝物や植物や微生物等の生体試料が挙げられる。 The metabolite to be measured is not particularly limited, and for example, tissues (brain, spinal cord, stomach, pancreas, kidney, liver, thyroid, bile sac, lung, small intestine, large intestine, etc.) collected from a living body, biological fluid (blood, Examples thereof include metabolites contained in cells (hepatocytes, immune cells, stem cells, cancer cells, etc.) and biological samples such as plants and microorganisms.
測定対象の代謝物の調製方法としては、特に限定されず、公知の方法を採用できる。例えば、細胞や組織の場合、ホモジナイザー等で破砕し、遠心分離により不溶性物質を除去した後にクロロホルム等の有機溶剤及び水等を用いて代謝物を抽出する方法が挙げられる。 The method for preparing the metabolite to be measured is not particularly limited, and a known method can be adopted. For example, in the case of cells and tissues, a method of crushing with a homogenizer or the like, removing insoluble substances by centrifugation, and then extracting metabolites with an organic solvent such as chloroform and water or the like can be mentioned.
測定に用いる質量分析装置としては、特に限定されず、例えば、イオンクロマトグラフ質量分析（ＩＣ−ＭＳ）、ガスクロマトグラフ質量分析計（ＧＣ−ＭＳ）、液体クロマトグラフ質量分析計（ＬＣ−ＭＳ）等が挙げられる。
質量分析装置におけるイオン化方法は、特に限定されず、例えば、ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化法）、ＥＳＩ（エレクトロスプレーイオン化法）、ＥＩ（電子イオン化法）、ＣＩ（化学イオン化法）等が挙げられる。
The mass spectrometer used for the measurement is not particularly limited, and for example, an ion chromatograph mass spectrometer (IC-MS), a gas chromatograph mass spectrometer (GC-MS), a liquid chromatograph mass spectrometer (LC-MS), or the like. Can be mentioned.
The ionization method in the mass spectrometer is not particularly limited, and examples thereof include MALDI (matrix-assisted laser desorption ionization method), ESI (electrospray ionization method), EI (electron ionization method), and CI (chemical ionization method). Be done.
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の記載によっては限定されない。
［例１］
標識化合物として、グルコースの全ての炭素原子が１３Ｃで置換された１３Ｃ標識グルコース（シグマアルドリッチ社製）を用意した。
大腸菌由来の細胞抽出液が含まれている無細胞くん内液（大陽日酸社製）と、２００ｍＭの１３Ｃ標識グルコース水溶液と、２０ｍＭのＮＡＤ水溶液と、２０ｍＭのＮＡＤＰ水溶液とを表１に示す割合で混合し、３７℃で２時間反応させた。次いで、限外ろ過膜を用いて反応液をろ過し、無細胞系内に含まれるタンパク質等を除去して反応を停止させ、ろ液をイオンクロマトグラフ質量分析（ＩＣ−ＭＳ）により分析した。なお、無細胞くん内液は、主要構成成分として、大腸菌抽出液Ｓ３０、ＮＴＰ、Ｆｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ、クレアチンキナーゼ、ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、酢酸アンモニウム、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ポリエチレングリコール、酢酸マグネシウム、ｔＲＮＡ、Ｄ−グルタミン酸、クレアチンリン酸、ＤＴＴ、０．０５％ＮａＮ３及びｃＡＭＰを含む。
また、１３Ｃ標識グルコースの代わりに非標識グルコースを用いる以外は、上記と同様に反応を行い、ろ液を分析した。また、ネガティブコントロールとして、無細胞くん内液のみで同様の操作を行ってろ液を分析した。
ろ液の分析は、グルコース、グルコース−６−リン酸（Ｇ６Ｐ）、フルクトース−６−リン酸（Ｆ６Ｐ）、フルクトース−１，６−ビスリン酸（ＦＢＰ）、２−ホスホグリセリン酸（２−ＰＧＡ）、３−ホスホグリセリン酸（３−ＰＧＡ）、２，３−ビスホスホグリセリン酸（２，３−ＢＰＧＡ）、ラクテート（Ｌａｃ）及びホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）について行った。結果を図１に示す。
Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to Examples, but the present invention is not limited to the following description.
[Example 1]
As a labeling compound, all of the carbon atoms of glucose were prepared 13 C-labeled glucose substituted (manufactured by Sigma-Aldrich) at 13 C.
Table 1 shows a cell-free protein containing a cell extract derived from Escherichia coli (manufactured by Taiyo Nippon Sanso Co., Ltd.), a 200 mM 13 C-labeled glucose aqueous solution, a 20 mM NAD aqueous solution, and a 20 mM NADP aqueous solution. The mixture was mixed at the indicated ratios and reacted at 37 ° C. for 2 hours. Next, the reaction solution was filtered using an ultrafiltration membrane to remove proteins and the like contained in the cell-free system to stop the reaction, and the filtrate was analyzed by ion chromatograph mass spectrometry (IC-MS). The cell-free fluid contains Escherichia coli extract S30, NTP, Folic acid, creatine kinase, HEPES (pH 7.5), ammonium acetate, T7 RNA polymerase, polyethylene glycol, magnesium acetate, tRNA, and D as the main constituents. -Contains glutamic acid, creatine phosphate, DTT, 0.05% NaN 3 and cAMP.
The reaction was carried out in the same manner as above except that unlabeled glucose was used instead of 13 C-labeled glucose, and the filtrate was analyzed. In addition, as a negative control, the filtrate was analyzed by performing the same operation only with the cell-free inner fluid.
Analysis of the filtrate was performed on glucose, glucose-6-phosphate (G6P), fructose-6-phosphate (F6P), fructose-1,6-bisphosphate (FBP), 2-phosphoglycerate (2-PGA). , 3-Phosphoglyceric acid (3-PGA), 2,3-bisphosphoglyceric acid (2,3-BPGA), lactate (Lac) and phosphoenolpyruvate (PEP). The results are shown in FIG.
図１に示すように、１３Ｃ標識グルコースは非標識グルコースと同様に細胞抽出液中で代謝され、１３Ｃで標識された標識グルコース−６−リン酸、標識フルクトース−６−リン酸、標識フルクトース−１，６−ビスリン酸、標識２−ホスホグリセリン酸、標識３−ホスホグリセリン酸、標識１，３−ビスホスホグリセリン酸、標識ラクテート及び標識ホスホエノールピルビン酸が生成したことが確認された。 As shown in FIG. 1, 13 C-labeled glucose is metabolized in the cell extract in the same manner as unlabeled glucose, and 13 C-labeled labeled glucose-6-phosphate, labeled fructose-6-phosphate, labeled fructose. It was confirmed that -1,6-bisphosphoric acid, labeled 2-phosphoglyceric acid, labeled 3-phosphoglyceric acid, labeled 1,3-bisphosphoglyceric acid, labeled lactate and labeled phosphoenolpyruvate were produced.
Claims (9)
前記標識化合物が、解糖系、ペントース−リン酸系又はクエン酸回路で代謝される原料化合物又は中間体であり、
前記標識代謝物が、前記原料化合物又は前記中間体が解糖系、ペントース−リン酸系又はクエン酸回路で代謝された代謝物である、標識代謝物の製造方法。 A method for producing a labeled metabolite, wherein at least one atom in the molecule is replaced with a stable isotope and the labeled compound is metabolized in a cell extract to produce a labeled metabolite labeled with a stable isotope. There,
The labeled compound is a glycolytic, pentose-phosphate-based, or raw material compound or intermediate metabolized in the citric acid cycle.
A method for producing a labeled metabolite, wherein the labeled metabolite is a metabolite in which the raw material compound or the intermediate is metabolized in a glycolytic, pentos-phosphate or citric acid cycle .
前記標識化合物が、解糖系、ペントース−リン酸系又はクエン酸回路で代謝される原料化合物又は中間体であり、
前記標識代謝物が、前記原料化合物又は前記中間体が解糖系、ペントース−リン酸系又はクエン酸回路で代謝された代謝物である、標識代謝物製造キット。 Manufacture of labeled metabolites for producing stable isotope-labeled labeled metabolites comprising a cell extract for metabolizing labeled compounds in which at least one atom in the molecule is replaced with a stable isotope. It ’s a kit ,
The labeled compound is a glycolytic, pentose-phosphate-based, or raw material compound or intermediate metabolized in the citric acid cycle.
A labeled metabolite production kit, wherein the labeled metabolite is a metabolite in which the raw material compound or the intermediate is metabolized in a glycolytic, pentos-phosphate or citric acid cycle .
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