JP2006337176A - Determination method of metabolite - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、生体内における代謝物の網羅的な定量方法に関するものである。 The present invention relates to a comprehensive method for quantifying metabolites in a living body.
近年、細胞機能を解明するためには遺伝子やタンパク質の発現のみならず、酵素が産生する全代謝物質を網羅的に測定し、遺伝子発現や酵素活性との関係を明確にすることが必要であると報告されている（非特許文献１、２）。 In recent years, in order to elucidate cell functions, it is necessary to comprehensively measure not only gene and protein expression but also all metabolites produced by enzymes and clarify the relationship between gene expression and enzyme activity. (Non-Patent Documents 1 and 2).
代謝物の定量方法は、質量分析装置を用いたいくつかの方法が知られている（非特許文献３−１０）。しかしながら、これらの方法では、すべてのサンプル、例えば、組織、生体液などに対して、代謝物を精度の高く、かつ網羅的に定量することは困難である。
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その解決しようとする課題は、生体内における代謝物の網羅的な定量方法を見出すことにある。 The present invention has been made in view of such circumstances, and the problem to be solved is to find a comprehensive method for quantifying metabolites in vivo.
本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意検討を重ねた結果、代謝的に同位体標識された代謝物群を調製し、サンプルと混合して質量分析装置で測定することにより、サンプル（例えば、組織、生体液、細胞など）中の１又は複数の代謝物を精度よく定量することを見出した。また、代謝的に同位体標識された代謝物群中の代謝物を定量しておくことにより、代謝物の網羅的な絶対定量をも可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。 In order to solve the above problems, the present inventors have made extensive studies, and as a result, prepared a metabolically isotopically labeled metabolite group, mixed with the sample, and measured with a mass spectrometer. It has been found that one or more metabolites in a tissue (for example, a tissue, a biological fluid, a cell, etc.) can be accurately quantified. Further, by quantifying metabolites in metabolically isotope-labeled metabolites, it was found that comprehensive absolute quantification of metabolites was possible, and the present invention was completed. .
すなわち本発明は、以下に関する。
（１）代謝物を定量する方法であって、
（a1）代謝的に同位体標識された第一の代謝物群を添加された第二の代謝物群を質量分析する工程と、
（a2）標識ピークと非標識ピークとの強度比を求めて、代謝物を定量する工程と、
を含む前記方法。
（２）第二の代謝物群が、代謝的に標識できないサンプルから得られた代謝物群である、（１）に記載の方法。
（３）第二の代謝物群が、細胞培養によって標識できないサンプルから得られた代謝物群である、（１）に記載の方法。
（４）第二の代謝物群が、組織または生体液から得られた代謝物群である、（１）に記載の方法。
（５）代謝的に同位体標識された第一の代謝物群を添加された第二の代謝物群が、代謝的に同位体標識された第一の代謝物群を添加されたサンプルから代謝物を抽出することによって得られたものである、（１）に記載の方法。
（６）代謝的に同位体標識された第一の代謝物群を添加された第二の代謝物群が、
（b1）サンプルに代謝的に同位体標識された第一の代謝物群を添加する工程と、
（b2）工程（b1）で得られたサンプルから代謝物を抽出する工程と、
を含む方法によって得られたものである、（１）に記載の方法。
（７）サンプルが、代謝的に標識できないサンプルである、（５）または（６）に記載の方法。
（８）サンプルが、細胞培養によって標識できないサンプルである、（５）または（６）に記載の方法。
（９）サンプルが、組織または生体液である、（５）または（６）に記載の方法。
（１０）同位体標識された代謝物の前駆体を加えて培養し、第一の代謝物群を代謝的に同位体標識する工程と、
をさらに含む、（１）〜（９）のいずれか一項に記載の方法。
（１１）複数のサンプルについて行い、各サンプル間の各代謝物のピーク強度比を比較する工程をさらに含む、（１）〜（１０）のいずれか一項に記載の方法。
（１２）代謝的に同位体標識された第一の代謝物群中に存在する代謝物が既知量である、（１）〜（１１）のいずれか一項に記載の方法。
（１３）代謝的に同位体標識された第一の代謝物群中に存在する代謝物を定量する工程と、
をさらに含む、（１）〜（１２）のいずれか一項に記載の方法。
（１４）代謝的に同位体標識された第一の代謝物群に存在する代謝物を定量する工程が、
（c1）代謝的に同位体標識された第一の代謝物群に既知量の同位体非標識の代謝物を添加する工程と、
（c2）各代謝物を質量分析する工程と、
（c3）各代謝物の標識ピークと非標識ピークとの強度比を求めて、各代謝物を定量する工程と、
を含む工程である、（１３）に記載の方法。
（１５）代謝物のデータベースと照合する工程と、
をさらに含む、（１）〜（１４）のいずれか一項に記載の方法。
（１６）定量される代謝物が、糖、有機酸、アミノ酸および脂質からなる群から選択される少なくとも一つである、（１）〜（１５）のいずれか一項に記載の方法。
（１７）定量される代謝物が、分子量1000以下の代謝物である、（１）〜（１６）のいずれか一項に記載の方法。
（１８）定量される代謝物が、タンパク質以外の代謝物である、（１）〜（１７）のいずれか一項に記載の方法。
（１９）質量分析により得られたマスクロマトグラムおよび／またはエレクトログラムを波形分離する工程と、
をさらに含む、（１）〜（１８）のいずれか一項に記載の方法。
（２０）波形分離処理により得られた固有の代謝物に由来する波形の面積を算出する工程と、
同位体標識された代謝物のm/zの値における固有の代謝物に由来する第一の波形の面積の値と同位体非標識の代謝物のm/zの値における固有の代謝物に由来する第二の波形の面積の値とから、（前記第一の波形面積）／（前記第二の波形面積）の比を算出する工程と、
をさらに含む、（１９）に記載の方法。
（２１）（１）〜（２０）のいずれか一項に記載の方法に使用するための代謝的に同位体標識された代謝物群。
（２２）（１）〜（２０）のいずれか一項に記載の方法に使用するための代謝的に同位体標識された代謝物群からなる試薬。
（２３）代謝物を定量するシステムであって、
（d1）代謝的に同位体標識された第一の代謝物群を添加された第二の代謝物群を質量分析することによって得られたデータを取得する入力部と、
（d2）標識ピークと非標識ピークとの強度比を求めて、代謝物を定量する制御部と、
を含む、前記システム。
（２４）質量分析により得られたマスクロマトグラムおよび／またはエレクトログラムを波形分離する制御部と、
をさらに含む、（２３）に記載のシステム。
（２５）代謝物を定量するためのプログラムであって、
（e1）代謝的に同位体標識された第一の代謝物群を添加された第二の代謝物群を質量分析することによって得られたデータを取得する手段と、
（e2）標識ピークと非標識ピークとの強度比を求めて、代謝物を定量する手段と、
を含む、前記プログラム。
（２６）質量分析により得られたマスクロマトグラムおよび／またはエレクトログラムを波形分離する手段と、
をさらに含む、（２５）に記載のプログラム。
That is, the present invention relates to the following.
(1) A method for quantifying metabolites, comprising:
(A1) mass analyzing a second metabolite group to which the first metabolite labeled metabolically isotope is added;
(A2) determining the intensity ratio between the labeled peak and the unlabeled peak, and quantifying the metabolite;
Including said method.
(2) The method according to (1), wherein the second metabolite group is a metabolite group obtained from a sample that cannot be metabolically labeled.
(3) The method according to (1), wherein the second metabolite group is a metabolite group obtained from a sample that cannot be labeled by cell culture.
(4) The method according to (1), wherein the second metabolite group is a metabolite group obtained from a tissue or a biological fluid.
(5) The second metabolite group added with the metabolically isotopically labeled first metabolite group is metabolized from the sample added with the metabolically isotopically labeled first metabolite group. The method according to (1), which is obtained by extracting a product.
(6) a second metabolite group to which the metabolically isotope-labeled first metabolite group is added,
(B1) adding a metabolically isotopically labeled first metabolite group to the sample;
(B2) extracting a metabolite from the sample obtained in step (b1);
The method according to (1), which is obtained by a method comprising:
(7) The method according to (5) or (6), wherein the sample is a sample that cannot be metabolically labeled.
(8) The method according to (5) or (6), wherein the sample is a sample that cannot be labeled by cell culture.
(9) The method according to (5) or (6), wherein the sample is a tissue or a biological fluid.
(10) adding a precursor of an isotopically labeled metabolite, culturing, and metabolically isotopically labeling a first metabolite group;
The method according to any one of (1) to (9), further comprising:
(11) The method according to any one of (1) to (10), further comprising a step of performing a plurality of samples and comparing a peak intensity ratio of each metabolite between the samples.
(12) The method according to any one of (1) to (11), wherein the metabolite present in the metabolically isotopically labeled first metabolite group is a known amount.
(13) quantifying a metabolite present in the metabolically isotopically labeled first metabolite group;
The method according to any one of (1) to (12), further comprising:
(14) quantifying the metabolite present in the first metabolite group labeled metabolically isotope,
(C1) adding a known amount of an isotope-unlabeled metabolite to a metabolically isotopically labeled first metabolite group;
(C2) mass spectrometric analysis of each metabolite;
(C3) determining the intensity ratio between the labeled peak and unlabeled peak of each metabolite, and quantifying each metabolite;
The method according to (13), wherein the method comprises:
(15) collating with a metabolite database;
The method according to any one of (1) to (14), further comprising:
(16) The method according to any one of (1) to (15), wherein the metabolite to be quantified is at least one selected from the group consisting of sugar, organic acid, amino acid, and lipid.
(17) The method according to any one of (1) to (16), wherein the metabolite to be quantified is a metabolite having a molecular weight of 1000 or less.
(18) The method according to any one of (1) to (17), wherein the metabolite to be quantified is a metabolite other than protein.
(19) Waveform separation of a mass chromatogram and / or electrogram obtained by mass spectrometry;
The method according to any one of (1) to (18), further comprising:
(20) calculating the area of the waveform derived from the unique metabolite obtained by the waveform separation process;
Derived from intrinsic metabolite in the value of the first waveform derived from the unique metabolite in the m / z value of the isotopically labeled metabolite and in the m / z value of the isotopically unlabeled metabolite Calculating the ratio of (first waveform area) / (second waveform area) from the value of the area of the second waveform
The method according to (19), further comprising:
(21) A metabolically isotopically labeled metabolite group for use in the method according to any one of (1) to (20).
(22) A reagent comprising a metabolically isotopically labeled metabolite group for use in the method according to any one of (1) to (20).
(23) A system for quantifying metabolites,
(D1) an input unit for acquiring data obtained by mass spectrometry of the second metabolite group to which the first metabolite labeled metabolically isotope is added;
(D2) a control unit for determining the intensity ratio between the labeled peak and the unlabeled peak and quantifying the metabolite;
Including the system.
(24) a control unit for waveform-separating a mass chromatogram and / or electrogram obtained by mass spectrometry;
The system according to (23), further including:
(25) A program for quantifying metabolites,
(E1) means for obtaining data obtained by mass spectrometry of the second metabolite group to which the first metabolite labeled metabolically isotope is added;
(E2) a means for determining the intensity ratio between the labeled peak and the unlabeled peak, and quantifying the metabolite;
Including the program.
(26) means for waveform-separating a mass chromatogram and / or electrogram obtained by mass spectrometry;
The program according to (25), further including:
本発明により、生体内における代謝物の網羅的な定量方法が提供される。
すなわち、これまでの代謝物の定量方法は、既知量の同位体標識された代謝物の標準品を添加して、ピーク強度を比較することによりサンプル中の代謝物を定量していた。そのため、これらの方法では、実験ごとに測定対象となる代謝物の標準品を準備しなければならず、網羅的な定量は困難であった。一方、本発明は、代謝的に同位体標識された代謝物群を使用するため、サンプルに含まれるほとんどすべての代謝物について定量することが可能となった。
The present invention provides a comprehensive method for quantifying metabolites in vivo.
That is, the conventional methods for quantifying metabolites have quantified metabolites in a sample by adding a standard amount of a known isotope-labeled metabolite and comparing peak intensities. Therefore, in these methods, a standard product of a metabolite to be measured has to be prepared for each experiment, and comprehensive quantification has been difficult. On the other hand, since the present invention uses metabolite groups that are metabolically isotope-labeled, almost all metabolites contained in a sample can be quantified.
本発明により、三種以上のサンプル間の比較が容易になった。また、これまでの代謝物の網羅的な定量方法は、同位体標識された代謝物群と同位体標識されていない代謝物群とを直接比較していたため、測定のたびに代謝物群を同位体標識する必要があった。また、サンプルが変わるたび、標識についての条件検討を行う必要があり、実験間の比較もできなかった。一方、本発明にかかる方法は、代謝的に同位体標識された代謝物群を保存し、適宜、用いることにより、実験間のデータ比較、例えばある実験データに対し、一定期間経過後（例えば、１ヶ月後、１年後等）に比較データを得て解析することが可能となる。さらには、使用した代謝的に同位体標識された代謝物群を譲渡又は貸し渡しすることにより、今まで不可能であった研究者間のデータ比較が可能となる。 The present invention facilitated comparison between three or more samples. In addition, the comprehensive quantification methods for metabolites so far have directly compared isotope-labeled metabolite groups with non-isotope-labeled metabolite groups. It was necessary to label the body. In addition, every time the sample changed, it was necessary to examine the conditions for labeling, and comparison between experiments could not be performed. On the other hand, according to the method of the present invention, metabolically isotopically labeled metabolite groups are stored and used appropriately, so that comparison of data between experiments, for example, certain experimental data can be performed after a certain period (for example, Comparison data can be obtained and analyzed one month later, one year later, etc. Furthermore, by transferring or lending the metabolically isotopically labeled metabolite group used, it is possible to compare data between researchers, which has been impossible until now.
本発明により、代謝的に同位体標識された代謝物群中の代謝物の濃度を算出しておくことにより、代謝物の網羅的な絶対定量が可能となった。また、代謝的に同位体標識された代謝物群を譲渡又は貸し渡しすることにより、研究者間のデータ共有化が可能となる。さらに、代謝的に同位体標識された代謝物群中の代謝物の絶対量を求めておけば、実験ごとに定量する必要がなく、その後の各種実験に応用できる。 According to the present invention, by calculating the concentration of a metabolite in a metabolically isotope-labeled metabolite group, comprehensive absolute quantification of the metabolite is possible. In addition, by sharing or lending metabolite groups that are metabolically isotope-labeled, it is possible to share data among researchers. Furthermore, if the absolute amount of a metabolite in a metabolite group that is metabolically isotope-labeled is determined, it is not necessary to quantify each experiment, and it can be applied to various subsequent experiments.
さらには、代謝物標準品の合成は、10倍から100倍程度の過剰量の試薬を用い、しかも合成スケールがマイクログラムからミリグラム単位となる。一方、質量分析に必要な代謝物標準品の量は、微量（通常、数pg〜数ng程度）であるため、質量分析に必要な百万倍以上の量を合成することになる。そのため、同位体標識された代謝物標準品の合成は、無駄が多く、非常に高価となり、従来の方法で網羅的に定量することはコストの面で難しい。一方、本発明の方法では、代謝物群の同位体標識は、細胞培養によって行うので、ごく微量でも効率がよく調製することができる。また、代謝的に同位体標識された代謝物群中の代謝物を定量するための代謝物標準品は、同位体を必要としない通常の代謝物標準品で対応できるので、同位体を必要とする代謝物標準品に比べて安価となり、網羅的な定量方法として適している。 Furthermore, the synthesis of the metabolite standard product uses an excess amount of reagent about 10 to 100 times, and the synthesis scale is in the microgram to milligram unit. On the other hand, since the amount of the metabolite standard necessary for mass spectrometry is a very small amount (usually about several pg to several ng), the amount more than one million times necessary for mass spectrometry is synthesized. Therefore, the synthesis of an isotope-labeled metabolite standard product is wasteful and very expensive, and it is difficult in terms of cost to comprehensively quantify by a conventional method. On the other hand, in the method of the present invention, since isotope labeling of metabolite groups is performed by cell culture, it can be efficiently prepared even in a very small amount. In addition, metabolite standards for quantifying metabolites in metabolically isotope-labeled metabolites can be handled by normal metabolite standards that do not require isotopes. Compared to standard metabolite products, it is less expensive and suitable as a comprehensive quantitative method.
以下に本発明の実施の形態について説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態にのみ限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、さまざまな形態で実施をすることができる。
なお、本明細書において引用した文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。
Embodiments of the present invention will be described below. The following embodiment is an example for explaining the present invention, and is not intended to limit the present invention only to this embodiment. The present invention can be implemented in various forms without departing from the gist thereof.
It should be noted that documents cited in the present specification, as well as published gazettes, patent gazettes, and other patent documents are incorporated herein by reference.
１．定義
本発明において用いる用語「代謝物」とは、生体内外に存在する酵素反応などを介した代謝反応によって作り出された代謝物質をいい、例えば、糖、有機酸、ペプチド、アミノ酸、脂質などがあげられる。生体外に存在する酵素反応などを介した代謝反応によって作り出された代謝物質は、例えば、チャネル、トランスポーターなどを介して生体外から取り込まれた代謝物があげられ、例えば、ビタミン類、リノレン酸などがあげられる。
代謝物は、好ましくは分子量2000以下の代謝物があげられ、より好ましくは分子量1000以下の代謝物があげられる。
1. Definitions The term “metabolite” used in the present invention refers to a metabolite produced by a metabolic reaction through an enzyme reaction or the like existing inside or outside a living body, such as sugar, organic acid, peptide, amino acid, lipid and the like. It is done. Examples of metabolites produced by metabolic reactions via enzyme reactions existing outside the body include metabolites taken from outside the body via channels, transporters, etc., such as vitamins and linolenic acid. Etc.
The metabolite is preferably a metabolite having a molecular weight of 2000 or less, more preferably a metabolite having a molecular weight of 1000 or less.
本発明において用いる用語「サンプル」とは、代謝物を含む測定対象物をいい、好ましくは、組織、生体液、細胞などがあげられる。組織としては、例えば、脳、脳の各部位（例えば、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆嚢、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、十二指腸、小腸、大腸、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、耳下腺、舌下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋などがあげられる。生体液としては、例えば、血液（血漿、血清を含む）、尿、糞、唾液、涙液、髄液、浸潤液（腹水、組織液を含む）などがあげられる。細胞としては、例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例えば、マクロファージ、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好酸球、好塩基球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、間質細胞もしくはこれらの前駆細胞、幹細胞、癌細胞などがあげられる。ここにあげたものは具体例であって、これらに限定されるものではない。 The term “sample” used in the present invention refers to a measurement object including a metabolite, and preferably includes tissues, biological fluids, cells, and the like. Examples of tissues include the brain, each part of the brain (for example, olfactory bulb, amygdala, basal sphere, hippocampus, hypothalamus, hypothalamus, cerebral cortex, medulla, cerebellum), spinal cord, pituitary gland, stomach, pancreas, kidney, Liver, gonad, thyroid, gallbladder, bone marrow, adrenal gland, skin, muscle, lung, duodenum, small intestine, large intestine, blood vessel, heart, thymus, spleen, submandibular gland, parotid gland, sublingual gland, peripheral blood, prostate, testicle Ovary, placenta, uterus, bones, joints, skeletal muscle, etc. Examples of the biological fluid include blood (including plasma and serum), urine, feces, saliva, tear fluid, spinal fluid, and infiltrating fluid (including ascites and tissue fluid). Examples of cells include hepatocytes, spleen cells, neurons, glial cells, pancreatic β cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, goblet cells, endothelial cells, smooth muscle cells, fibroblasts. , Fibrocytes, muscle cells, adipocytes, immune cells (eg macrophages, T cells, B cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, eosinophils, basophils, monocytes), megakaryocytes, smooth Examples thereof include membrane cells, chondrocytes, bone cells, osteoblasts, osteoclasts, mammary cells, stromal cells or their precursor cells, stem cells, cancer cells and the like. The examples given here are specific examples, and the present invention is not limited to these examples.
本発明において用いる用語「タンパク質」とは、二以上のアミノ酸がペプチド結合によって結合したペプチドを含む。また、タンパク質には、生理的な修飾を受けているもの（例えば、リン酸化タンパク質等）も含まれる。 The term “protein” used in the present invention includes a peptide in which two or more amino acids are bound by a peptide bond. Proteins also include those that have undergone physiological modifications (for example, phosphorylated proteins).
本発明において用いる用語「同位体標識された代謝物」とは、代謝物を構成する分子の全部または一部を同位体で標識された代謝物をいう。また、本発明において用いる用語「同位体標識された代謝物群」とは、二種以上の同位体標識された代謝物の集合をいう。 The term “isotope-labeled metabolite” used in the present invention refers to a metabolite in which all or part of the molecule constituting the metabolite is labeled with an isotope. The term “isotope-labeled metabolite group” used in the present invention refers to a set of two or more isotope-labeled metabolites.
本発明において用いる用語「代謝的に同位体標識された代謝物」とは、同位体標識された当該代謝物の前駆体を加えることにより、代謝的に代謝物を構成する分子の全部または一部を同位体で標識された代謝物をいう。また、本発明において用いる用語「代謝的に同位体標識された代謝物群」とは、二種以上の代謝的に同位体標識された代謝物の集合をいう。前記「代謝的に」とは、酵素反応などを介した生理的条件を示し、好ましくは培養細胞における代謝反応を示す。 The term “metabolically isotope-labeled metabolite” used in the present invention refers to all or a part of the molecule that metabolically constitutes a metabolite by adding a precursor of the isotope-labeled metabolite. Is a metabolite labeled with an isotope. The term “metabolically isotopically labeled metabolite group” used in the present invention refers to a set of two or more metabolically isotopically labeled metabolites. The term “metabolically” refers to a physiological condition through an enzyme reaction or the like, preferably a metabolic reaction in cultured cells.
本発明において用いる用語「代謝的に標識できないサンプル」とは、代謝的に標識できるサンプル以外のサンプルを指す。代謝的に標識できるサンプルとは、培養することによる同位体標識された当該代謝物の前駆体の影響を受けることなく代謝的に標識できるサンプルをいう。「代謝的に標識できないサンプル」には、たとえば、培養することによる同位体標識された当該代謝物の前駆体の影響を受けつつ代謝的に標識できるサンプル及び生体への投与、組織培養、その他の方法により標識できるサンプルが含まれるものとする。 As used herein, the term “sample that cannot be metabolically labeled” refers to a sample other than a sample that can be metabolically labeled. A sample that can be metabolically labeled means a sample that can be metabolically labeled without being affected by the precursor of the isotope-labeled metabolite that has been cultured. “Samples that cannot be metabolically labeled” include, for example, samples that can be metabolically labeled while being affected by the precursors of the metabolite that are isotopically labeled by culturing, administration to living bodies, tissue culture, etc. Samples that can be labeled by the method shall be included.
本発明において用いる用語「細胞培養によって標識できないサンプル」とは、細胞を培養することができないサンプルを指す。つまり、細胞培養できず、生体への投与、組織培養、その他の細胞培養以外の方法により標識できるサンプルは、「細胞培養によって標識できないサンプル」に含まれるものとする。細胞培養によって標識できないサンプルは、例えば、組織、生体液などがあげられる。 The term “sample that cannot be labeled by cell culture” as used in the present invention refers to a sample in which cells cannot be cultured. That is, samples that cannot be cultured and can be labeled by administration to a living body, tissue culture, and other methods other than cell culture are included in “samples that cannot be labeled by cell culture”. Examples of samples that cannot be labeled by cell culture include tissues and biological fluids.
２．代謝物の定量方法
本発明は、代謝物の定量方法であって、
（a1）代謝的に同位体標識された第一の代謝物群を添加された第二の代謝物群を質量分析する工程と、
（a2）標識ピークと非標識ピークとの強度比を求めて、代謝物を定量する工程と、
を含む、前記方法を提供する（図１）。図１は、本発明の代謝物の定量方法の一例を概念的に示したフローチャートである。
2. The present invention relates to a method for quantifying metabolites, comprising:
(A1) mass analyzing a second metabolite group to which the first metabolite labeled metabolically isotope is added;
(A2) determining the intensity ratio between the labeled peak and the unlabeled peak, and quantifying the metabolite;
The method is provided (FIG. 1). FIG. 1 is a flowchart conceptually showing an example of the metabolite quantification method of the present invention.
（１）代謝的に同位体標識された第一の代謝物群を添加された第二の代謝物群を質量分析する工程
（A）代謝的に同位体標識された第一の代謝物群
代謝的に同位体標識された第一の代謝物群は、代謝物群を構成する分子の全部又は一部を同位体で標識されていればよく、その調製方法については、特に限定されない。
(1) A step of mass-analyzing the second metabolite group to which the first metabolite labeled metabolically is added. (A) The first metabolite group labeled metabolically isotope. Metabolism The first isotope-labeled first metabolite group is not particularly limited as long as all or part of the molecules constituting the metabolite group is labeled with an isotope.
以下、具体的な調製方法の一例について記載する。
代謝的に同位体標識された第一の代謝物群は、代謝物群を代謝的に同位体標識することによって調製することができる。代謝的に同位体標識された第一の代謝物群は、例えば、培養可能な細胞を同位体標識された代謝物の前駆体を含む培地で培養することによって、細胞中の代謝物が代謝的に同位体標識されることにより調製することができる。細胞は、好ましくは大腸菌、酵母などがあげられる。
本発明において用いる用語「前駆体」とは、代謝物の構成成分になりうる分子を指す。前駆体は、炭素源としては、例えば、グルコース、マルトースおよびガラクトースなどの糖類などがあげられ、窒素源としては、例えば、塩化アンモニウムおよび硫酸アンモニウムなどの無機塩類などがあげられる。また、前駆体は、例えば、グルタミン酸、クエン酸などがあげられる。さらには、前駆体は、ビタミン類として、例えば、チミン、アデノシン、グアノシン、シチジン、チアミン、ビオチンなどがあげられる。さらには、前駆体は、例えば、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、フェニルアラニン、プロリン、メチオニン、セリン、スレオニン、チロシン、トリプトファン、バリンなどのアミノ酸など、リノレン酸、パルミチン酸などの脂肪酸などがあげられる。
培地は、例えば、液体培地および固体培地などがあげられ、好ましくは液体培地があげられる。大腸菌を選択した場合には、液体培地および固体培地は、例えば、LB寒天培地（カタログ番号240110：日本ベクトンディッキンソン株式会社）やBGLB培地 （カタログ番号MB0030：栄研器材株式会社）などがあげられ、動物細胞を選択した場合には、液体培地は、例えば、DMEM、MEM、RPMI1640およびIMDMなどがあげられ、必要に応じてウシ胎児血清（FCS）などの血清、ペニシリンおよびストレプトマイシンなどを添加することができ、pH約6〜8、30〜40℃において15〜200時間前後の培養を行うことができる。また、必要に応じて培地の交換を行ったり、通気及び攪拌を行ったりすることができる。
また、代謝的に同位体標識された代謝物群の調製は、市販の同位体標識用キットを用いることもできる。キットは、例えば、バクテリア用としてCambridge Isotope laboratory社（アンドーバー、MA）（http://www.isotope.com/）のBIO-EXPRESS-MIN (CGM-3000-CN)およびBIO-EPRESS-1000 (CGM-1000-CN)、酵母用としてBIO-EXPRESS YBN (CGM-5000-N)などがあげられる。
Hereinafter, an example of a specific preparation method will be described.
The first metabolically isotopically labeled metabolite group can be prepared by metabolically isotopically labeling the metabolite group. The first metabolically isotopically labeled metabolite group is obtained by, for example, culturing a culturable cell in a medium containing a precursor of an isotopically labeled metabolite so that the metabolite in the cell is metabolized. Can be prepared by isotopically labeling. Preferred examples of cells include Escherichia coli and yeast.
As used herein, the term “precursor” refers to a molecule that can be a component of a metabolite. In the precursor, examples of the carbon source include saccharides such as glucose, maltose, and galactose, and examples of the nitrogen source include inorganic salts such as ammonium chloride and ammonium sulfate. Examples of the precursor include glutamic acid and citric acid. Furthermore, the precursor includes vitamins such as thymine, adenosine, guanosine, cytidine, thiamine, biotin and the like. Furthermore, the precursor is, for example, alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, phenylalanine, proline, methionine, serine, threonine, tyrosine, tryptophan, valine, etc. And other fatty acids such as linolenic acid and palmitic acid.
Examples of the medium include a liquid medium and a solid medium, and a liquid medium is preferable. When E. coli is selected, examples of the liquid medium and solid medium include LB agar medium (catalog number 240110: Nippon Becton Dickinson Co., Ltd.) and BGLB medium (catalog number MB0030: Eiken Equipment Co., Ltd.). When animal cells are selected, examples of the liquid medium include DMEM, MEM, RPMI1640, and IMDM. If necessary, serum such as fetal calf serum (FCS), penicillin, and streptomycin can be added. The culture can be performed at a pH of about 6 to 8 and 30 to 40 ° C. for about 15 to 200 hours. Moreover, a culture medium can be replaced | exchanged as needed, and aeration and stirring can be performed.
Moreover, a commercially available kit for isotope labeling can also be used for the preparation of metabolically isotopically labeled metabolite groups. For example, BIO-EXPRESS-MIN (CGM-3000-CN) and BIO-EPRESS-1000 (Cambridge Isotope laboratory (Andover, MA) (http://www.isotope.com/) are used for bacteria. CGM-1000-CN) and BIO-EXPRESS YBN (CGM-5000-N) for yeast.
このようにして得られた細胞は、代謝的に同位体標識された第一の代謝物群として使用でき、また、破砕した後、代謝的に同位体標識された第一の代謝物群として使用することもできる。破砕する方法は、例えば、ダウンス型テフロン（登録商標）・ホモジナイザー、ポリトロン、ワーリング・ブレンダー、ポッター型ガラス・ホモジナイザー、超音波破砕装置、細胞溶解液（例えば、PIERCE社のM-PER: cat no. 78501, T-PER: cat no. 78510など）を用いる方法、凍結融解法および冷メタノールを加える方法などがあげられ、好ましくは冷メタノールを加える方法があげられる。破砕した細胞は、遠心分離操作により、不溶性物質を除去することが好ましい。このようにして、代謝的に同位体標識された第一の代謝物群を調製することができる。
さらに、クロロホルムおよび水を加えて抽出を行うことができる。極性代謝物を抽出する場合には水層（上層）を、脂質などの低極性代謝物を抽出する場合にはクロロホルム層（下層）を選択することができる。
The cells obtained in this way can be used as the first metabolite group that is metabolically isotope-labeled, and after disruption, they can be used as the first metabolite group that is metabolically isotope-labeled. You can also Methods for disruption include, for example, Downs type Teflon (registered trademark) homogenizer, polytron, Waring blender, potter type glass homogenizer, ultrasonic disruption device, cell lysate (for example, M-PER: cat no. 78501, T-PER: cat no. 78510), a freeze-thaw method, a method of adding cold methanol, and the like, and a method of adding cold methanol is preferable. It is preferable to remove insoluble substances from the disrupted cells by centrifugation. In this way, a first metabolite group that is metabolically isotopically labeled can be prepared.
Furthermore, extraction can be performed by adding chloroform and water. When extracting a polar metabolite, an aqueous layer (upper layer) can be selected, and when extracting a low-polarity metabolite such as lipid, a chloroform layer (lower layer) can be selected.
本発明で用いる同位体は、例えば、放射性同位体、安定同位体などがあげられ、好ましくは安定同位体があげられる。安定同位体は、例えば、2H、13C、15N、17O、18O、33Pおよび34S並びにこれらの組み合わせなどがあげられ、好ましくは2H、13C、15Nおよび18O並びにこれらの組み合わせなどがあげられ、より好ましくは13Cがあげられる。 Examples of the isotope used in the present invention include a radioisotope and a stable isotope, preferably a stable isotope. Examples of stable isotopes include 2 H, 13 C, 15 N, 17 O, 18 O, 33 P and 34 S, and combinations thereof, preferably 2 H, 13 C, 15 N and 18 O and Combinations thereof and the like can be mentioned, and 13 C is more preferable.
なお、代謝的に同位体標識された第一の代謝物群は、適当な条件、好ましくは−２０℃以下、より好ましくは−８０℃以下で保存することができる。 The first metabolite group that is metabolically isotope-labeled can be stored under appropriate conditions, preferably −20 ° C. or lower, more preferably −80 ° C. or lower.
（B）第二の代謝物群の調製
第二の代謝物群は、サンプルを破砕することで調製することができる。サンプルは、例えば、組織、生体液、細胞などがあげられ、好ましくは組織があげられる。破砕する方法は、例えば、ダウンス型テフロン（登録商標）・ホモジナイザー、ポリトロン、ワーリング・ブレンダー、ポッター型ガラス・ホモジナイザー、超音波破砕装置、細胞溶解液（例えば、PIERCE社のM-PER: cat no. 78501, T-PER: cat no. 78510など）を用いる方法、凍結融解法および冷メタノールを加える方法などがあげられ、好ましくは冷メタノールを加える方法があげられる。破砕した細胞は、遠心分離操作により、不溶性物質を除去することが好ましい。このようにして、第二の代謝物群を調製することができる。
さらに、クロロホルムおよび水を加えて抽出を行うことができる。極性代謝物を抽出する場合には水層（上層）を、脂質などの低極性代謝物を抽出する場合にはクロロホルム層（下層）を選択することができる。
(B) Preparation of second metabolite group The second metabolite group can be prepared by crushing a sample. Examples of the sample include tissues, biological fluids, cells and the like, and preferably tissues. Methods for disruption include, for example, Downs type Teflon (registered trademark) homogenizer, polytron, Waring blender, potter type glass homogenizer, ultrasonic disruption device, cell lysate (for example, M-PER: cat no. 78501, T-PER: cat no. 78510), a freeze-thaw method, a method of adding cold methanol, and the like, and a method of adding cold methanol is preferable. It is preferable to remove insoluble substances from the disrupted cells by centrifugation. In this way, a second metabolite group can be prepared.
Furthermore, extraction can be performed by adding chloroform and water. When extracting a polar metabolite, an aqueous layer (upper layer) can be selected, and when extracting a low-polarity metabolite such as lipid, a chloroform layer (lower layer) can be selected.
また、必要に応じて、前記第二の代謝物群を精製することができる。精製する方法は、例えば、群特異的アフィニティーカラム精製、カチオン交換クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーを利用する方法などがあげられ、好ましくはカチオン交換クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーを利用する方法があげられる。 Moreover, said 2nd metabolite group can be refine | purified as needed. Examples of the purification method include group-specific affinity column purification, cation exchange chromatography, anion exchange chromatography, and reverse phase chromatography. Preferably, cation exchange chromatography, anion exchange chromatography, reverse An example is a method using phase chromatography.
さらに、必要に応じて、前記第二の代謝物群について分離を行うことができる。分離方法は、例えば、フリーゾーン電気泳動（例えば、キャピラリー電気泳動、等速電気泳動など）および各種クロマトグラフィー（例えば、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィーなど）等があげられる。 Furthermore, the second metabolite group can be separated as necessary. Separation methods include, for example, free zone electrophoresis (eg, capillary electrophoresis, isotachophoresis, etc.) and various chromatography (eg, affinity chromatography, reverse phase chromatography, anion exchange chromatography, cation exchange chromatography, etc.) Etc.
なお、第二の代謝物群は、適当な条件、好ましくは−２０℃以下、より好ましくは−８０℃以下で保存することができる。 The second metabolite group can be stored under appropriate conditions, preferably -20 ° C or lower, more preferably -80 ° C or lower.
（C）代謝的に同位体標識された第一の代謝物群を添加された第二の代謝物群
ここで、代謝的に同位体標識された第一の代謝物群を添加された第二の代謝物群は、第二の代謝物群に代謝的に同位体標識された第一の代謝物群を添加してもよく、代謝的に同位体標識された第一の代謝物群を添加されたサンプルから代謝物を抽出することによって得られたものであってもよい。
代謝的に同位体標識された第一の代謝物群を添加されたサンプルから代謝物を抽出することによって代謝的に同位体標識された第一の代謝物群を添加された第二の代謝物群を得る方法は、例えば、以下の工程により行うことができる。
(C) Second metabolite group to which the first metabolically isotopically labeled metabolite group is added Here, the second metabolite group to which the first metabolically isotopically labeled metabolite group is added The first metabolite group that is metabolically isotopically labeled may be added to the second metabolite group, or the first metabolite group that is metabolically isotopically labeled is added. It may be obtained by extracting a metabolite from the prepared sample.
A second metabolite added with a metabolically isotopically labeled first metabolite group by extracting the metabolite from a sample added with the metabolically isotopically labeled first metabolite group The method for obtaining the group can be performed, for example, by the following steps.
（i）（b1）サンプルに代謝的に同位体標識された第一の代謝物群を添加する工程
サンプルに代謝的に同位体標識された第一の代謝物群を添加することができる。サンプルは、例えば、組織、生体液、細胞などがあげられ、好ましくは組織があげられる。代謝的に同位体標識された第一の代謝物群は、代謝的に同位体標識された第一の代謝物群を含む細胞としてサンプルに添加することが好ましい。
(I) (b1) Step of adding a metabolically isotopically labeled first metabolite group to a sample A metabolically isotopically labeled first metabolite group can be added to a sample. Examples of the sample include tissues, biological fluids, cells and the like, and preferably tissues. Preferably, the metabolically isotopically labeled first metabolite group is added to the sample as cells containing the metabolically isotopically labeled first metabolite group.
（ii）（b2）工程（b1）で得られたサンプルから代謝物を抽出する工程
工程（b1）で得られたサンプルから代謝物を抽出することによって、代謝的に同位体標識された第一の代謝物群を添加された第二の代謝物群を調製することができる。代謝的に同位体標識された第一の代謝物群を添加された第二の代謝物群は、工程（b1）で得られたサンプルを破砕することで調製することができる。破砕する方法は、例えば、ダウンス型テフロン（登録商標）・ホモジナイザー、ポリトロン、ワーリング・ブレンダー、ポッター型ガラス・ホモジナイザー、超音波破砕装置、細胞溶解液（例えば、PIERCE社のM-PER: cat no. 78501, T-PER: cat no. 78510など）を用いる方法、凍結融解法および冷メタノールを加える方法などがあげられ、好ましくは冷メタノールを加える方法があげられる。破砕した細胞は、遠心分離操作により、不溶性物質を除去することが好ましい。このようにして、代謝的に同位体標識された第一の代謝物群を添加された第二の代謝物群を調製することができる。
さらに、クロロホルムおよび水を加えて抽出を行うことができる。極性代謝物を抽出する場合には水層（上層）を、脂質などの低極性代謝物を抽出する場合にはクロロホルム層（下層）を選択することができる。
(Ii) (b2) Step of extracting a metabolite from the sample obtained in step (b1) The first metabolically isotopically labeled by extracting the metabolite from the sample obtained in step (b1) The second metabolite group to which the metabolite group is added can be prepared. The second metabolite group added with the metabolically isotopically labeled first metabolite group can be prepared by crushing the sample obtained in step (b1). Methods for disruption include, for example, Downs type Teflon (registered trademark) homogenizer, polytron, Waring blender, potter type glass homogenizer, ultrasonic disruption device, cell lysate (for example, M-PER: cat no. 78501, T-PER: cat no. 78510), a freeze-thaw method, a method of adding cold methanol, and the like, and a method of adding cold methanol is preferable. It is preferable to remove insoluble substances from the disrupted cells by centrifugation. In this way, a second metabolite group to which the metabolically isotopically labeled first metabolite group is added can be prepared.
Furthermore, extraction can be performed by adding chloroform and water. When extracting a polar metabolite, an aqueous layer (upper layer) can be selected, and when extracting a low-polarity metabolite such as lipid, a chloroform layer (lower layer) can be selected.
また、必要に応じて、前記第二の代謝物群を精製することができる。精製する方法は、例えば、群特異的アフィニティーカラム精製、カチオン交換クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーを利用する方法などがあげられ、好ましくはカチオン交換クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーを利用する方法があげられる。 Moreover, said 2nd metabolite group can be refine | purified as needed. Examples of the purification method include group-specific affinity column purification, cation exchange chromatography, anion exchange chromatography, and reverse phase chromatography. Preferably, cation exchange chromatography, anion exchange chromatography, reverse An example is a method using phase chromatography.
さらに、必要に応じて、前記第二の代謝物群について分離を行うことができる。分離方法は、例えば、フリーゾーン電気泳動（例えば、キャピラリー電気泳動、等速電気泳動など）および各種クロマトグラフィー（例えば、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィーなど）等があげられる。 Furthermore, the second metabolite group can be separated as necessary. Separation methods include, for example, free zone electrophoresis (eg, capillary electrophoresis, isotachophoresis, etc.) and various chromatography (eg, affinity chromatography, reverse phase chromatography, anion exchange chromatography, cation exchange chromatography, etc.) Etc.
なお、代謝的に同位体標識された第一の代謝物群を添加された第二の代謝物群は、適当な条件、好ましくは−２０℃以下、より好ましくは−８０℃以下で保存することができる。 The second metabolite group added with the metabolically isotopically labeled first metabolite group should be stored under appropriate conditions, preferably -20 ° C or lower, more preferably -80 ° C or lower. Can do.
（D）代謝的に同位体標識された第一の代謝物群を添加された第二の代謝物群の質量分析
前記代謝的に同位体標識された第一の代謝物群を添加された第二の代謝物群を質量分析する。質量分析は、質量分析装置により測定することができる。前記代謝的に同位体標識された第一の代謝物群を添加された第二の代謝物群は、そのまま質量分析装置により分析してもよく、濃縮、分離などを行ってもよい。濃縮方法は、例えば、遠心濃縮器（Speed Vacなど）による溶媒を除去する方法などがあげられる。分離方法は、例えば、フリーゾーン電気泳動（例えば、キャピラリー電気泳動、等速電気泳動など）および各種クロマトグラフィー（例えば、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィーなど）等があげられる。
(D) Mass spectrometry of the second metabolite group to which the metabolically isotopically labeled first metabolite group has been added. Mass analysis of two metabolite groups. Mass spectrometry can be measured with a mass spectrometer. The second metabolite group added with the metabolically isotopically labeled first metabolite group may be directly analyzed by a mass spectrometer, or may be concentrated, separated, and the like. Examples of the concentration method include a method of removing the solvent using a centrifugal concentrator (such as Speed Vac). Separation methods include, for example, free zone electrophoresis (eg, capillary electrophoresis, isotachophoresis, etc.) and various chromatography (eg, affinity chromatography, reverse phase chromatography, anion exchange chromatography, cation exchange chromatography, etc.) Etc.
また、前記代謝的に同位体標識された第一の代謝物群を添加された第二の代謝物群は、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）により分離してもよい。HPLCに用いるカラムは、例えば、アフィニティーカラム、逆相カラム、アニオン交換カラムおよびカチオン交換カラムなどがあげられる。HPLCの諸条件（流速、検出器、移動相など）は、当業者における技術常識により、適宜選択できる。 Further, the second metabolite group to which the metabolically isotopically labeled first metabolite group is added may be separated by high performance liquid chromatography (HPLC). Examples of the column used for HPLC include an affinity column, a reverse phase column, an anion exchange column, and a cation exchange column. Various HPLC conditions (flow rate, detector, mobile phase, etc.) can be appropriately selected according to common technical knowledge of those skilled in the art.
次に、前記の操作により得られた代謝物群を質量分析装置で測定することができる。質量分析装置は、例えば、マススペクトロメトリー（MS）、ガスクロマトグラフと結合された質量分析装置であるガスクロマトグラフィーマススペクトロメトリー（GC/MS）、液体クロマトグラフと結合された装置である液体クロマトグラフィーマススペクトロメトリー（LC/MS）、キャピラリー電気泳動と結合された質量分析装置であるキャピラリー電気泳動マススペクトロメトリー（CE/MS）などの汎用の装置があげられる。質量分析装置におけるイオン化方法は、例えば、MALDI（マトリックス支援レーザー脱離イオン化法）、ESI（エレクトロスプレーイオン化法）、EI（電子イオン化法）、CI（化学イオン化法）、APCI（大気圧化学イオン化法）、FAB（高速原子衝撃法）、LD、FD、SIMSおよびTSPなどがあげられ、LC/MSおよびCE/MSの場合には、好ましくはESIおよびAPCIがあげられ、GC/MSの場合には、好ましくはEIおよびCIがあげられる。アナライザーは、例えば、TOF（飛行時間型）、イオントラップ、二重収束型、四重極型およびフーリエ変換型などがあげられる。 Next, the metabolite group obtained by the above operation can be measured with a mass spectrometer. Mass spectrometers include, for example, mass spectrometry (MS), gas chromatography mass spectrometry (GC / MS) coupled to a gas chromatograph, and liquid chromatography coupled to a liquid chromatograph. General-purpose devices such as mass spectrometry (LC / MS) and capillary electrophoresis mass spectrometry (CE / MS), which is a mass spectrometer combined with capillary electrophoresis, can be mentioned. Examples of ionization methods in mass spectrometers include MALDI (matrix-assisted laser desorption ionization), ESI (electrospray ionization), EI (electron ionization), CI (chemical ionization), and APCI (atmospheric pressure chemical ionization). ), FAB (Fast Atom Bombardment), LD, FD, SIMS and TSP, etc. In the case of LC / MS and CE / MS, ESI and APCI are preferred, and in the case of GC / MS EI and CI are preferable. Examples of the analyzer include a TOF (time of flight type), ion trap, double focusing type, quadrupole type, and Fourier transform type.
（２）標識ピークと非標識ピークとの強度比を求めて、代謝物を定量する工程
本発明において、「標識ピーク」とは、質量分析の測定から得られるm/zの値に対するシグナル強度の分布（以下、「質量分析スペクトル」という。）および/または時間に対するシグナル強度の分布において、同位体標識された代謝物群に由来するシグナル強度又はその総和（通常面積で表されることは当業者であれば理解できる）をいう。また、本発明において、「マスクロマトグラム」とは、GC/MSおよびLC/MSの測定から得られる時間に対するシグナル強度の分布をといい、「エレクトログラム」とは、CE/MSの測定から得られる時間に対するシグナル強度の分布をいう。
本発明において、「非標識ピーク」とは、質量分析スペクトル、マスクロマトグラムおよび/またはエレクトログラムにおいて、同位体標識されていない代謝物群に由来するシグナル強度又はその総和をいう。
(2) Step of quantifying metabolite by determining intensity ratio between labeled peak and unlabeled peak In the present invention, “labeled peak” means the signal intensity relative to the value of m / z obtained from the mass spectrometry measurement. A signal intensity derived from an isotope-labeled metabolite group or a sum thereof (usually expressed as an area) in the distribution (hereinafter referred to as “mass spectrometry spectrum”) and / or the distribution of signal intensity with respect to time. If you can understand it). In the present invention, “mass chromatogram” refers to the distribution of signal intensity with respect to time obtained from GC / MS and LC / MS measurements, and “electrogram” is obtained from CE / MS measurements. The distribution of signal intensity over time.
In the present invention, the “unlabeled peak” refers to a signal intensity derived from a group of metabolites that are not labeled with an isotope or a sum thereof in a mass spectrometry spectrum, a mass chromatogram, and / or an electrogram.
質量分析装置による測定から得られたデータを用いて、各代謝物について、標識ピークと非標識ピークとの強度比（＝「非標識ピークの強度」／「標識ピークの強度」）（以下、単に「ピーク強度比」と称する場合がある）を求めることにより、各代謝物を定量することができる。
同位体標識された代謝物は、同位体標識されていない代謝物に比べ、同位体標識されている分子量の分、分子量が大きくなり質量分析スペクトル上でペアのピークとして観測される。同位体標識された代謝物の分子量は、同定された代謝物から計算によって求めることができる。
Using the data obtained from the measurement by the mass spectrometer, for each metabolite, the intensity ratio between the labeled peak and the unlabeled peak (= “intensity of the unlabeled peak” / “intensity of the labeled peak”) (hereinafter, simply Each metabolite can be quantified by determining (sometimes referred to as “peak intensity ratio”).
The isotope-labeled metabolite is observed as a pair of peaks on the mass spectrometry spectrum because the molecular weight is increased by the amount of the isotope-labeled molecular weight compared to the non-isotopically labeled metabolite. The molecular weight of the isotopically labeled metabolite can be determined by calculation from the identified metabolite.
より具体的には、例えば、サンプルAおよびサンプルBに含まれる代謝物量を比較する場合、サンプルAにおける各代謝物の非標識ピークを当該代謝物に対応する標識ピークで除することによって、当該代謝物における非標識ピーク/標識ピーク（ピーク強度比A）を求める。一方、サンプルBにおける各代謝物の非標識ピークを当該代謝物に対応する標識ピークで除することによって、当該代謝物における非標識ピーク/標識ピーク（ピーク強度比B）を求める。次に、ピーク強度比Aとピーク強度比Bとを比較することで、サンプルAおよびサンプルBにおける代謝物を相対的に定量することができる。 More specifically, for example, when comparing the amount of metabolite contained in sample A and sample B, the metabolite in sample A is divided by the labeled peak corresponding to the metabolite by dividing the unlabeled peak of each metabolite. The unlabeled peak / labeled peak (peak intensity ratio A) in the product is determined. On the other hand, by dividing the unlabeled peak of each metabolite in sample B by the labeled peak corresponding to the metabolite, the unlabeled peak / labeled peak (peak intensity ratio B) in the metabolite is obtained. Next, by comparing the peak intensity ratio A and the peak intensity ratio B, the metabolites in the sample A and the sample B can be relatively quantified.
なお、サンプル中では存在していて、代謝的に同位体標識された代謝物群には存在していない代謝物が存在することがある。この場合には、質量分析装置で測定した際に、近傍の標識ピーク、好ましくはGC/MSおよびLC/MSであればクロマトグラフィーでの溶出時間が近い標識ピーク、MALDI-MSであれば分子量が近い標識ピーク、CE/MSであれば電気泳動における泳動時間または溶出時間が近いピークを対象としてピーク強度比を求めて、サンプル間で当該ピーク強度比を比較することによっても定量することができる。したがって、サンプル中のすべての代謝物を測定することが可能である。 There may be metabolites that are present in the sample but are not present in the metabolically isotopically labeled metabolite group. In this case, when measured with a mass spectrometer, a nearby labeled peak, preferably a labeled peak with a short elution time in chromatography if GC / MS and LC / MS, and a molecular weight if MALDI-MS is used. If it is a near-labeled peak, or CE / MS, the peak intensity ratio can be determined for a peak with a near electrophoresis time or elution time in electrophoresis, and the peak intensity ratio can be compared between samples. Therefore, it is possible to measure all metabolites in the sample.
より具体的には、サンプルAおよびサンプルBにおける代謝物Xを比較する場合、代謝的に同位体標識された代謝物群に代謝物Xが存在せず、近傍に代謝物Yが存在することがある。ここで、近傍とは、GC/MSおよびLC/MSであればクロマトグラフィーでの溶出時間が近いこと、MALDI-MSであれば分子量が近いこと、CE/MSであれば電気泳動における泳動時間または溶出時間が近いことが好ましい。この場合には、サンプルAにおける代謝物Xの非標識ピークを代謝物Yに対応する標識ピークで除することによって、代謝物Xにおける非標識ピーク/代謝物Yにおける標識ピーク（ピーク強度比C）を求める。一方、サンプルBにおける代謝物Xの非標識ピークを代謝物Yに対応する標識ピークで除することによって、代謝物Xにおける非標識ピーク/代謝物Yにおける標識ピーク（ピーク強度比D）を求める。次に、ピーク強度比Cとピーク強度比Dとを比較することで、サンプルAおよびサンプルBにおける代謝物を相対的に定量することができる。近傍の代謝物を複数選択することによって、測定の精度を上げることができる。 More specifically, when comparing the metabolite X in the sample A and the sample B, the metabolite X does not exist in the metabolically isotope-labeled metabolite group, and the metabolite Y exists in the vicinity. is there. Here, the vicinity means that the elution time in chromatography is close for GC / MS and LC / MS, the molecular weight is close for MALDI-MS, the electrophoresis time in electrophoresis for CE / MS, or It is preferable that the elution time is close. In this case, by dividing the unlabeled peak of metabolite X in sample A by the labeled peak corresponding to metabolite Y, the labeled peak in metabolite X / labeled peak in metabolite Y (peak intensity ratio C) Ask for. On the other hand, by dividing the unlabeled peak of metabolite X in sample B by the labeled peak corresponding to metabolite Y, the labeled peak in metabolite X / labeled peak in metabolite Y (peak intensity ratio D) is determined. Next, by comparing the peak intensity ratio C and the peak intensity ratio D, metabolites in the sample A and the sample B can be relatively quantified. By selecting a plurality of nearby metabolites, the accuracy of measurement can be increased.
また、本工程において、代謝物を絶対定量することもできる。ここで、本発明において用いる用語「絶対定量」とは、測定結果を量または濃度として得ることを目的とする定量方法である。
代謝的に同位体標識された第一の代謝物群に存在する代謝物が既知量である場合には、質量分析装置による測定から得られたデータ用いて、各代謝物について、標識ピークと非標識ピークとの強度比を求めることにより、各代謝物を絶対定量することができる。代謝的に同位体標識された第一の代謝物群に存在する代謝物の絶対量を求めておけば、その後、各種実験において当該代謝的に同位体標識された第一の代謝物群を使用できるため、実験ごとに定量を行うことを余儀なくされていた従来の方法に比べて非常に有用である。
In this step, the metabolite can also be quantified absolutely. Here, the term “absolute quantification” used in the present invention is a quantification method for the purpose of obtaining a measurement result as a quantity or concentration.
If the metabolite present in the first metabolite group that is metabolically isotope-labeled is a known amount, the labeled peak and non- By determining the intensity ratio with the labeled peak, each metabolite can be absolute quantified. Once the absolute amount of metabolites present in the metabolically isotopically labeled first metabolite group is determined, the metabolically isotopically labeled first metabolite group is then used in various experiments. Therefore, it is very useful as compared with the conventional method in which the quantification must be performed for each experiment.
（３）代謝的に同位体標識された第一の代謝物群に存在する代謝物を定量する工程
代謝的に同位体標識された第一の代謝物群に存在する代謝物の定量は、例えば、既知量の代謝物標準品を用いて質量分析により行うことができる。代謝的に同位体標識された第一の代謝物群に存在する代謝物を定量する方法は、例えば、以下の工程により行うことができる。
(3) Step of quantifying metabolite existing in metabolically isotopically labeled first metabolite group The quantification of metabolite existing in metabolically isotopically labeled first metabolite group is, for example, Can be performed by mass spectrometry using known amounts of metabolite standards. The method for quantifying the metabolite present in the metabolically isotopically labeled first metabolite group can be performed, for example, by the following steps.
（A）（c1）代謝的に同位体標識された第一の代謝物群に同位体非標識の代謝物を添加する工程
代謝的に同位体標識された第一の代謝物群に既知量の同位体非標識の代謝物を添加する。代謝的に同位体標識された第一の代謝物群は、前記「（１）代謝的に同位体標識された第一の代謝物群を添加された第二の代謝物群を質量分析する工程（A）代謝的に同位体標識された第一の代謝物群」中に記載された方法により調製することができる。
(A) (c1) adding a non-isotope-labeled metabolite to a metabolically isotopically labeled first metabolite group a known amount of metabolically isotopically labeled first metabolite group Add non-isotopically labeled metabolites. The first metabolite group that is metabolically isotopically labeled is the step of mass spectrometry of the second metabolite group to which the first metabolite group that is metabolically isotopically labeled is added. (A) metabolically isotope-labeled first metabolite group ”.
同位体非標識の代謝物は、例えば、化学的な合成法などにより製造することができる。化学的な合成法により製造された代謝物の量は、重量を測定することによって定量することができる。
同位体非標識の代謝物は、代謝的に同位体標識されただいい地の代謝物群を抽出する前に加えてもよく、抽出した後に加えてもよい。
An isotope-unlabeled metabolite can be produced by, for example, a chemical synthesis method. The amount of metabolite produced by chemical synthesis can be quantified by measuring weight.
The isotope-unlabeled metabolite may be added before or after extraction of a metabolite group that is metabolically isotopically labeled.
（B）（c2）各代謝物を質量分析する工程
前記工程（c1）で得られた同位体非標識の代謝物を添加された代謝的に同位体標識された第一の代謝物群を質量分析する。質量分析は、前記「（１）代謝的に同位体標識された第一の代謝物群を添加された第二の代謝物群を質量分析する工程（D）第二の代謝物群の質量分析」中に記載された方法により行うことができる。
(B) (c2) Step of mass-analyzing each metabolite Mass of the first metabolically labeled metabolite group added with the non-isotope-labeled metabolite obtained in step (c1). analyse. The mass spectrometry is performed by performing the mass analysis of the second metabolite group to which the first metabolite labeled with metabolic isotopes is added (D) mass analysis of the second metabolite group. Can be carried out by the method described in the above.
（C）（c4）各代謝物の標識ピークと非標識ピークとの強度比を求めて、各代謝物を定量する工程
各代謝物の標識ピークと非標識ピークとの強度比を求めて、各代謝物を定量する。定量は、前記「（２）（b4）標識ピークと非標識ピークとの強度比を求めて、代謝物を定量する工程」中に記載された方法により行うことができる。
(C) (c4) The step of quantifying each metabolite by determining the intensity ratio between the labeled peak and the unlabeled peak of each metabolite. The intensity ratio between the labeled peak and the unlabeled peak of each metabolite is determined, and Quantify metabolites. The quantification can be performed by the method described in the above-mentioned “(2) (b4) Step of determining the intensity ratio between labeled peak and unlabeled peak to quantify the metabolite”.
（４）代謝物のデータベースと照合する工程
本発明は、質量分析装置による測定から得られたデータを、ソフトウェアを使用して、代謝物のデータベースと照合することにより、第二の代謝物群中の代謝物を同定することができる。ソフトウェアは、例えば、Mass Navigator（登録商標）（三井情報開発株式会社製）、MassLynx（Waters社製）、Lipid Search（http://lipidsearch.jp/）（東京大学大学院医科学研究科、メタボローム講座）などがあげられ、好ましくはMass Navigator（登録商標）があげられる。また、データベースは、例えば、http://www.wileyregistry.com、http://chemdata.nist.gov/、http://www.aist.go.jp/RIODB/SDBS/cgi-bin/cre_index.cgiなどの質量分析と化合物のデータベースおよびhttp://cactus.nci.nih.gov/、http://www.genome.ad.jp/ligand/、http://www.biocheminfo.org/klotho/、http://www.metabolome.jp/download.htmlなどの化合物構造に関するデータベースなどがあげられる。このとき、同定された代謝物について、新たに代謝的に同位体標識することによって調製し、正確に同定されたことを確認することができる。また、同定された代謝物について、新たに代謝物標準品を調製し、HPLCやCEの溶出時間やMS/MSスペクトルなどの物理化学的分析情報が一致するか否かを検討して確認することができる。さらに、NMR測定から構造を確認することも可能である。質量分析装置による測定データを用いて、代謝物のデータベースと照合することにより、代謝物を同定することは当業者にとって容易である（Anal Chem. 2002;74(10):2233-9; Anal Chem. 2002;74(24):6224-9; Electrophoresis. 2004 Jul;25(13):1996-2002; Anal Chem. 2005;77(1):78-84; J Chromatogr A. 2003;989(2):293-301;
Anal Chem. 2004;76(5):1419-28.）。
(4) Step of collating with metabolite database In the present invention, the data obtained from the measurement by the mass spectrometer is collated with the metabolite database by using software, so that the second metabolite group is identified. Metabolites can be identified. Software includes, for example, Mass Navigator (registered trademark) (manufactured by Mitsui Information Development Co., Ltd.), MassLynx (manufactured by Waters), Lipid Search (http://lipidsearch.jp/) (Graduate School of Medical Science, University of Tokyo, Metabolome Course) Etc., preferably Mass Navigator (registered trademark). The database is, for example, http://www.wileyregistry.com, http://chemdata.nist.gov/, http://www.aist.go.jp/RIODB/SDBS/cgi-bin/cre_index. Mass spectrometry and compound database such as cgi and http://cactus.nci.nih.gov/, http://www.genome.ad.jp/ligand/, http://www.biocheminfo.org/klotho/ , Http://www.metabolome.jp/download.html and other database related to compound structures. At this time, the identified metabolite can be newly prepared by metabolically isotopic labeling, and it can be confirmed that it has been correctly identified. In addition, for the identified metabolites, prepare a new metabolite standard and examine whether the physicochemical analysis information such as HPLC and CE elution times and MS / MS spectra are consistent. Can do. Furthermore, the structure can be confirmed from NMR measurement. It is easy for those skilled in the art to identify a metabolite by comparing with a metabolite database using data measured by a mass spectrometer (Anal Chem. 2002; 74 (10): 2233-9; Anal Chem 2002; 74 (24): 6224-9; Electrophoresis. 2004 Jul; 25 (13): 1996-2002; Anal Chem. 2005; 77 (1): 78-84; J Chromatogr A. 2003; 989 (2) : 293-301;
Anal Chem. 2004; 76 (5): 1419-28.).
（５）質量分析により得られたマスクロマトグラムおよび／またはエレクトログラムを波形分離する工程
本発明は、質量分析装置による測定から得られたマスクロマトグラムおよび／またはエレクトログラムを波形分離処理することにより、固有の代謝物に由来する標識ピークおよび非標識ピークを求めて、標識ピークと非標識ピークの強度比を求めることにより、より正確に代謝物の定量を行うことができる。本発明は、例えば、代謝的に同位体標識された第一の代謝物群を添加された第二の代謝物群を質量分析する工程と、質量分析により得られたマスクロマトグラムおよび／またはエレクトログラムを波形分離する工程と、標識ピークと非標識ピークとの強度比を求めて、代謝物を定量する工程を含む方法により、代謝物を定量することができる。
(5) Step of Waveform Separation of Mass Chromatogram and / or Electrogram Obtained by Mass Spectrometry The present invention provides a waveform separation process for a mass chromatogram and / or electrogram obtained from measurement by a mass spectrometer. By determining a labeled peak and an unlabeled peak derived from a specific metabolite and determining an intensity ratio between the labeled peak and the unlabeled peak, the metabolite can be quantified more accurately. The present invention includes, for example, a step of mass-analyzing a second metabolite group added with a metabolically isotopically labeled first metabolite group, a mass chromatogram obtained by mass spectrometry, and / or electrolysis. The metabolite can be quantified by a method including a step of waveform-separating a gram and a step of quantifying the metabolite by obtaining an intensity ratio between a labeled peak and an unlabeled peak.
図２は、質量分析によって得られたデータを解析する方法のスキームの一例を示す。図２に示すように、本発明における代謝物の定量方法は、MS/MS処理による代謝物の構造式の決定（工程Ｓ１１１）、前記同位体標識された代謝物の第一のm/zの値の決定工程（工程Ｓ１１２）、前記構造式が決定された代謝物の第一のm/zの値から、前記代謝物に対応する同位体非標識の代謝物の第二のm/zの値の算出（工程Ｓ１１３）、前記第一及び第二のm/zの値におけるマスクロマトグラムの抽出（工程Ｓ１１４）、前記第一及び第二のm/zの値におけるマスクロマトグラムに対する波形分離処理（工程Ｓ１１５）、前記波形分離処理により得られた固有の代謝物由来の標識ピークおよび非標識ピークの算出（工程Ｓ１１６）、前記第一のm/zの値に対応する非標識ピークの値および前記第二のm/zの値に対応する標識ピークの値のピーク強度比の算出（工程Ｓ１１７）を含む。以下、各工程を詳述することにより、本発明に係る定量方法を説明する。 FIG. 2 shows an example of a scheme of a method for analyzing data obtained by mass spectrometry. As shown in FIG. 2, the metabolite quantification method according to the present invention includes determination of the metabolite structural formula by MS / MS treatment (step S111), and the first m / z of the isotope-labeled metabolite. Value determination step (step S112), from the value of the first m / z of the metabolite for which the structural formula is determined, the second m / z of the isotope-unlabeled metabolite corresponding to the metabolite Calculation of values (step S113), extraction of mass chromatograms at the first and second m / z values (step S114), waveform separation for the mass chromatograms at the first and second m / z values Processing (step S115), calculation of labeled peaks and unlabeled peaks derived from the unique metabolites obtained by the waveform separation processing (step S116), the value of the unlabeled peak corresponding to the first m / z value And calculating the peak intensity ratio of the labeled peak value corresponding to the second m / z value. Including the (step S117). Hereinafter, the quantitative method according to the present invention will be described by detailing each step.
図２に示す工程Ｓ１１１では、MS/MS処理から得られた質量分析スペクトルにより、代謝物の構造式を決定することができる（工程Ｓ１１１）。その後、解析対象とする代謝物の第一のm/zの値を定めることができる（工程Ｓ１１２）。 In step S111 shown in FIG. 2, the structural formula of the metabolite can be determined from the mass spectrometry spectrum obtained from the MS / MS process (step S111). Thereafter, the first m / z value of the metabolite to be analyzed can be determined (step S112).
その後、前記構造式が決定された代謝物の第一のm/zの値から、その代謝物に対応する同位体非標識の代謝物の第二のm/zの値を求めることができる。同位体標識された代謝物群を調製する際、例えば、前駆体として13C標識の前駆体を利用して細胞を培養した場合、第一の代謝物の分子量と第二の代謝物の分子量の差は、代謝物の構造式から算出することができる。そして、代謝物の電荷の値から、工程Ｓ１１３にて第二のm/zの値を算出することができる。 Thereafter, the second m / z value of the isotope-unlabeled metabolite corresponding to the metabolite can be obtained from the first m / z value of the metabolite for which the structural formula is determined. When preparing an isotope-labeled metabolite group, for example, when cells are cultured using a precursor of 13 C label as a precursor, the molecular weight of the first metabolite and the molecular weight of the second metabolite The difference can be calculated from the structural formula of the metabolite. Then, the second m / z value can be calculated in step S113 from the value of the charge of the metabolite.
前記第一のm/zの値における第一のマスクロマトグラムおよび前記第二のm/zの値における第二のマスクロマトグラムを質量分析装置による測定から得られたデータから抽出することができる（工程Ｓ１１４）。 The first mass chromatogram at the first m / z value and the second mass chromatogram at the second m / z value can be extracted from the data obtained from the measurement by the mass spectrometer. (Step S114).
ところで、組織、生体液、細胞などの中には複数種の代謝物が存在しており、その多くの代謝物を一度に質量分析すると、一つのマスクロマトグラムであっても、異なる代謝物由来のピークが重なることがある。そこで、本発明では、前記第一のマスクロマトグラム及び第二のマスクロマトグラムに対して、波形分離処理を行い（工程Ｓ１１５）、固有の代謝物由来のマスクロマトグラムに分離することができる。
本発明で用いる波形分離処理とは、複雑な波形に対する曲線適合法を基本とする合成的分離法である。これは、最初に各ピーク成分が特定の解析関数で表現できると仮定する。この仮定に基づき、いくつかのピーク関数を生成・合成し、各ピーク関数に含まれるパラメータを調整して観測波形との偏差を最小化することができる。偏差の最小点におけるパラメータより、各ピーク波形を分解・分離することにより行うことができる。なお、本発明による波形分離処理に利用される波形パラメータには、ピークの個数、各ピークの形、ピーク位置、ピーク高さ、ベースラインの形などが挙げられる。本発明では、例えば、ガウシアン関数とローレンツ関数とを利用して波形分離することができる。
波形分離処理は、同位体非標識の代謝物とそれに対応する同位体標識された代謝物について実行することができる。このようにして得られたマスクロマトグラムは、固有の代謝物に由来するマスクロマトグラムである。
By the way, there are multiple types of metabolites in tissues, biological fluids, cells, etc., and when many of these metabolites are mass analyzed at once, even one mass chromatogram is derived from different metabolites. The peaks may overlap. Therefore, in the present invention, the first mass chromatogram and the second mass chromatogram can be subjected to waveform separation processing (step S115) to be separated into inherent metabolite-derived mass chromatograms.
The waveform separation process used in the present invention is a synthetic separation method based on a curve fitting method for complex waveforms. This initially assumes that each peak component can be represented by a specific analytic function. Based on this assumption, several peak functions can be generated and combined, and the parameters included in each peak function can be adjusted to minimize the deviation from the observed waveform. This can be done by decomposing and separating each peak waveform from the parameter at the minimum point of deviation. The waveform parameters used for the waveform separation processing according to the present invention include the number of peaks, the shape of each peak, the peak position, the peak height, the shape of the baseline, and the like. In the present invention, for example, waveform separation can be performed using a Gaussian function and a Lorentz function.
The waveform separation process can be performed on an isotope-unlabeled metabolite and a corresponding isotope-labeled metabolite. The mass chromatogram thus obtained is a mass chromatogram derived from a unique metabolite.
そして、前記波形分離処理により得られた固有の代謝物由来の標識ピークおよび非標識ピークを算出することができる（工程Ｓ１１６）。また、標識ピークおよび非標識ピークは、前記波形分離処理により得られた固有の代謝物由来のマスクロマトグラムの面積から求めることが好ましい。次いで、前記第一のm/zの値に対応する標識ピークおよび前記第二のm/zの値に対応する非標識ピークのピーク強度比の算出することができる（工程Ｓ１１７）。また、当該ピーク強度比は、（第二の面積）/（第一の面積）の比から求めることが好ましい。このようにして、代謝物を定量することができる。 Then, the labeled peak and the unlabeled peak derived from the unique metabolite obtained by the waveform separation process can be calculated (step S116). The labeled peak and the unlabeled peak are preferably obtained from the area of the mass chromatogram derived from the unique metabolite obtained by the waveform separation process. Next, the peak intensity ratio of the labeled peak corresponding to the first m / z value and the unlabeled peak corresponding to the second m / z value can be calculated (step S117). The peak intensity ratio is preferably obtained from the ratio of (second area) / (first area). In this way, metabolites can be quantified.
なお、前記解析方法は、同位体標識された代謝物のマスクロマトグラムから、対応する同位体非標識の代謝物のマスクロマトグラムを求める方法に基づいて説明したが、先に、解析対象として同位体非標識の代謝物のマスクロマトグラムを決定した後で、対応する同位体標識された代謝物のマスクロマトグラムを求める方法でも、本発明に係る解析方法は実施可能である。
また、前記解析方法は、マスクロマトグラムについて説明したが、本発明に係る解析方法は、エレクトログラムについても同様の方法により実施可能である。
Although the analysis method has been described based on the method for obtaining the mass chromatogram of the corresponding isotope-unlabeled metabolite from the mass chromatogram of the isotope-labeled metabolite, The analysis method according to the present invention can also be carried out by a method for determining a mass chromatogram of a corresponding isotope-labeled metabolite after determining a mass chromatogram of a non-body-labeled metabolite.
Moreover, although the said analysis method demonstrated the mass chromatogram, the analysis method based on this invention can be implemented by the same method also about an electrogram.
３．代謝物の定量システム
本発明は、代謝物を定量するシステムであって、
（d1）代謝的に同位体標識された第一の代謝物群を添加された第二の代謝物群を質量分析することによって得られたデータを取得する入力部と、
（d2）標識ピークと非標識ピークとの強度比を求めて、代謝物を定量する制御部と、
を含む、前記システムを提供する。
3. TECHNICAL FIELD The present invention is a system for quantifying metabolites,
(D1) an input unit for acquiring data obtained by mass spectrometry of the second metabolite group to which the first metabolite labeled metabolically isotope is added;
(D2) a control unit for determining the intensity ratio between the labeled peak and the unlabeled peak and quantifying the metabolite;
The system is provided.
図３は、本発明の定量システムの構成の機能ブロック図の一例を示す。なお、図３では、前記構成のうち、本発明に関係する部分のみを概念的に示し、マイクロコンピュータから構成される。 FIG. 3 shows an example of a functional block diagram of the configuration of the quantitative system of the present invention. FIG. 3 conceptually shows only the part related to the present invention in the above configuration, and is constituted by a microcomputer.
本発明に係る定量システム１０は、概略的には、質量分析装置２０にて得られた質量分析データを解析する解析装置部３０と、代謝物の構造式決定および情報取得用の外部分析プログラム等を提供する外部装置部４０とを、ネットワーク５０を介して通信可能に接続して構成される。なお、図３に示すネットワーク５０は、解析装置部３０と外部装置部４０とを相互に接続する機能を有し、たとえば、インターネット等である。
The
本発明にて用いられる質量分析装置２０は、特に限定されるものではなく、市販の質量分析装置であればよい。そして、前記質量分析装置２０は、それ自体に当該装置にて測定して得られた結果を保存するデータ保存部２５を備えていてもよい。また、本発明に用いられる質量分析装置２０は、それ自体に装置を制御する制御部や入出力部を備えるものであってもよい。
The
図３に示す外部装置部４０は、ネットワークを介して、質量分析データを解析する解析装置部３０と相互に接続され、利用者に対して代謝物の構造式および情報等に関する外部データベースの外部分析プログラムを実行するウェッブサイトを提供する機能を具有する。
The
ここで、外部装置部４０は、ＷＥＢサーバやＡＳＰサーバ等として構成してもよく、そのハードウェア構成は、一般に市販されるワークステーション、パーソナルコンピュータ等の情報処理装置及びその付属装置により構成してもよい。また、外部装置部４０の各機能は、外部装置部のハードウェア構成中のＣＰＵ、ディスク装置、メモリ装置、入力装置、出力装置、通信制御装置等およびそれらを制御するプログラム等により実現される。
本発明では外部装置部としてhttp://www.wileyregistry.com、http://chemdata.nist.gov/、http://www.aist.go.jp/RIODB/SDBS/cgi-bin/cre_index.cgiなどの質量分析と化合物のデータベースおよびhttp://cactus.nci.nih.gov/、http://www.genome.ad.jp/ligand/、http://www.biocheminfo.org/klotho/、http://www.metabolome.jp/download.htmlなどの化合物構造に関するデータベースなどのデータベースを利用することができる。
Here, the
In the present invention, http://www.wileyregistry.com, http://chemdata.nist.gov/, http://www.aist.go.jp/RIODB/SDBS/cgi-bin/cre_index. Mass spectrometry and compound database such as cgi and http://cactus.nci.nih.gov/, http://www.genome.ad.jp/ligand/, http://www.biocheminfo.org/klotho/ , Http://www.metabolome.jp/download.html and other database related to compound structures can be used.
図３に示す解析装置部３０は、概略的には、質量分析装置２０の全体を統括的に制御するＣＰＵ等の制御部６０、通信回線等に接続されるルータ等の通信装置（不図示）に接続される通信制御インターフェース部７０、質量分析装置２０、およびディスプレイやプリンター等の出力装置９０に接続される入出力制御インターフェース部８０、および各種のデータベースを格納する記憶部１００を備えて構成される。各部は任意の通信路を介して通信可能に接続される。さらに、本発明による解析装置部３０は、ルータ等の通信装置及び専用線等の有線又は無線の通信回線を介して、ネットワークに通信可能に接続されている。
3 schematically includes a
記憶部１００に格納される各種のデータベース（質量分析データや代謝物データベース等）は、固定ディスク装置等のストレージ手段であり、ファイルやデータ等を格納する。
Various databases (mass spectrometry data, metabolite database, etc.) stored in the
前記記憶部１００の各構成要素のうち、質量分析データベースは、質量分析装置２０にて得られたデータベースである。また、代謝物データベースは、質量分析装置にて得られた質量分析スペクトルおよび／またはマスクロマトグラムの代謝物データベースや、インターネットを経由してアクセス可能な外部の代謝物データベースであってもよい。さらに、これらのデータベースをコピーしたり、オリジナルの配列情報を格納したり、さらに独自の識別番号を付与し作成したインハウスデータベースであってもよい。
Among the constituent elements of the
制御部６０は、本発明に係る解析方法を実行するプログラムを格納し、前記解析装置部３０を、ひいては定量システム１０の全体を制御する装置である。前記制御部６０は、ＯＳ（operating system）等の制御プログラム、各種の処理手順等を規定したプログラム、および所要データを格納するための内部メモリ（不図示）を有し、これらのプログラム等により、種々の処理を実行するための情報処理を行うことができる。なお、本発明に係る解析方法を実行するプログラムは、前記記憶部１００に格納されていてもよい。
The
図４は、本発明の定量プログラムの一例を概念的に示したフローチャートである。制御部６０は、質量分析装置２０にて得られた質量分析データを取得することができる（手順Ｓ２００）。そして、取得した質量分析データを記憶部１００に保存するが、その際に、後述する解析の便宜のため、データ検索を容易にするように、各質量分析データに、スキャン番号等の識別番号を付与することができる（手順Ｓ２０１）。次に、通信制御インターフェース部を介したインターネット５０を通じて、外部のデータベース、例えば、http://www.wileyregistry.com、http://chemdata.nist.gov/、http://www.aist.go.jp/RIODB/SDBS/cgi-bin/cre_index.cgiなどの質量分析と化合物のデータベースおよびhttp://cactus.nci.nih.gov/、http://www.genome.ad.jp/ligand/、http://www.biocheminfo.org/klotho/、http://www.metabolome.jp/download.htmlなどの化合物構造に関するデータベースなどのデータベースと照合させながら、MS/MS処理により、制御部６０にて代謝物の構造式を決定することができる（手順Ｓ２０２）。前記質量分析データの中から、解析対象とする質量分析スペクトルを決定する（手順Ｓ２０３）。その際、前述のように決定した質量分析スペクトルのm/zの値を定め、これを第一のm/zの値とする。この第一のm/zの値は、同位体非標識の代謝物の質量分析スペクトル、または同位体標識された代謝物の質量分析スペクトルであってもよい。かかる決定は、前述のスキャン番号から容易に行うことができる。
FIG. 4 is a flowchart conceptually showing an example of the quantitative program of the present invention. The
次に、前記構造式が決定された代謝物の第一のm/zの値から、その代謝物に対応する同位体非標識の代謝物の第二のm/zの値を求めることができる（手順Ｓ２０４）。同位体標識された代謝物群を調製する際、例えば、前駆体として13C標識の前駆体を利用して細胞を培養した場合、第一の代謝物の分子量と第二の代謝物の分子量の差は、代謝物の構造式から算出することができる。そして、代謝物の電荷の値から、第二のm/zの値を算出することができる（手順Ｓ２０５）。決定した第二のm/zの値から、その値のマスクロマトグラムを、記憶部１００に格納された質量分析データから抽出することができる。
Next, from the first m / z value of the metabolite whose structural formula is determined, the second m / z value of the isotope-unlabeled metabolite corresponding to the metabolite can be obtained. (Procedure S204). When preparing an isotope-labeled metabolite group, for example, when cells are cultured using a precursor of 13 C label as a precursor, the molecular weight of the first metabolite and the molecular weight of the second metabolite The difference can be calculated from the structural formula of the metabolite. Then, the second m / z value can be calculated from the charge value of the metabolite (step S205). From the determined second m / z value, a mass chromatogram of that value can be extracted from the mass analysis data stored in the
次いで、第一のm/zの値における第一のマスクロマトグラムおよび第二のm/zの値における第二のマスクロマトグラムを波形分離処理することができる（手順Ｓ２０６）。本処理により、固有の代謝物に由来するマスクロマトグラムを分離し、記憶部１００に格納することができる。
そして、前記波形分離処理により得られた固有の代謝物由来の標識ピークおよび非標識ピークを算出することができる（手順Ｓ２０７）。また、標識ピークおよび非標識ピークは、前記波形分離処理により得られた固有の代謝物由来のマスクロマトグラムの面積から求めることが好ましい。次いで、前記第一のm/zの値に対応する標識ピークおよび前記第二のm/zの値に対応する非標識ピークのピーク強度比の算出することができる（手順Ｓ２０８）。また、当該ピーク強度比は、（第二の面積）/（第一の面積）の比から求めることが好ましい。このようにして、代謝物を定量することができる。
Next, the first mass chromatogram at the first m / z value and the second mass chromatogram at the second m / z value can be subjected to waveform separation processing (step S206). By this processing, a mass chromatogram derived from a specific metabolite can be separated and stored in the
Then, a labeled peak and an unlabeled peak derived from the unique metabolite obtained by the waveform separation process can be calculated (step S207). The labeled peak and the unlabeled peak are preferably obtained from the area of the mass chromatogram derived from the unique metabolite obtained by the waveform separation process. Next, the peak intensity ratio of the labeled peak corresponding to the first m / z value and the unlabeled peak corresponding to the second m / z value can be calculated (step S208). The peak intensity ratio is preferably obtained from the ratio of (second area) / (first area). In this way, metabolites can be quantified.
その後、必要に応じ、前記比の値を、ディスプレイ若しくはプリンター等の出力装置９０に表示若しくは印字することができる。
Thereafter, the value of the ratio can be displayed or printed on an
また、前記プログラムは、マスクロマトグラムについて説明したが、本発明に係るプログラムは、エレクトログラムについても同様の方法により実施可能である。 Moreover, although the said program demonstrated mass chromatogram, the program based on this invention can be implemented by the same method also about electrogram.
４．代謝物の定量プログラム
本発明は、代謝物を定量するためのプログラムであって、
（e1）代謝的に同位体標識された第一の代謝物群を添加された第二の代謝物群を質量分析することによって得られたデータを取得する手段と、
（e2）標識ピークと非標識ピークとのピーク強度比を求めて、代謝物を定量する手段と、
を含む、前記プログラムを提供する。
4). The present invention is a program for quantifying a metabolite, comprising:
(E1) means for obtaining data obtained by mass spectrometry of the second metabolite group to which the first metabolite labeled metabolically isotope is added;
(E2) a means for determining a peak intensity ratio between a labeled peak and an unlabeled peak and quantifying a metabolite;
Including the program.
本発明のプログラムは、例えば、質量分析データの取得（手段Ｓ２００）、質量分析データに識別番号の付与（手段Ｓ２０１）、MS/MS処理による代謝物の構造の決定（手段Ｓ２０２）、解析対象の質量分析スペクトルの決定（第一のm/zの値の決定）（手段Ｓ２０３）、第二のm/zの値の決定（手段Ｓ２０４）、第一および第二のm/zの値におけるマスクロマトグラムの抽出（手段Ｓ２０５）、第一および第二のm/zの値におけるマスクロマトグラムに対する波形分離処理（手段Ｓ２０６）、波形分離処理により得られた固有の代謝物由来の標識ピークおよび非標識ピークの算出（手段Ｓ２０７）、非標識ピークと標識ピークとのピーク強度比の算出（手段Ｓ２０８）などを含む手段を有するプログラムがあげられる。 The program of the present invention includes, for example, acquisition of mass spectrometry data (means S200), assignment of an identification number to mass spectrometry data (means S201), determination of a metabolite structure by MS / MS processing (means S202), and analysis target Determination of mass spectrometry spectrum (determination of first m / z value) (means S203), determination of second m / z value (means S204), mass at first and second m / z values Extraction of chromatogram (means S205), waveform separation process (mass S206) for mass chromatogram at first and second m / z values, labeled peaks derived from unique metabolites obtained by waveform separation process and A program having means including calculation of a labeled peak (means S207), calculation of a peak intensity ratio between an unlabeled peak and a labeled peak (means S208), and the like.
また、前記プログラムは、マスクロマトグラムについて説明したが、本発明に係るプログラムは、エレクトログラムについても同様の方法により実施可能である。 Moreover, although the said program demonstrated mass chromatogram, the program based on this invention can be implemented by the same method also about electrogram.
本発明により、生体内における代謝物の網羅的な定量方法が可能となった。
すなわち、これまでの代謝物の定量方法は、既知量の同位体標識された代謝物の標準品を添加して、ピーク強度を比較することによりサンプル中の代謝物を定量していた。そのため、これらの方法では、実験ごとに測定対象となる代謝物の標準品を準備しなければならず、網羅的な定量は困難であった。一方、本発明は、代謝的に同位体標識された代謝物群を使用するため、サンプルに含まれるほとんどすべての代謝物について定量することが可能となった。
According to the present invention, a comprehensive method for quantifying metabolites in a living body has become possible.
That is, the conventional methods for quantifying metabolites have quantified metabolites in a sample by adding a standard amount of a known isotope-labeled metabolite and comparing peak intensities. Therefore, in these methods, a standard product of a metabolite to be measured has to be prepared for each experiment, and comprehensive quantification has been difficult. On the other hand, since the present invention uses metabolite groups that are metabolically isotope-labeled, almost all metabolites contained in a sample can be quantified.
Claims (26)
（a1）代謝的に同位体標識された第一の代謝物群を添加された第二の代謝物群を質量分析する工程と、
（a2）標識ピークと非標識ピークとの強度比を求めて、代謝物を定量する工程と、
を含む前記方法。 A method for quantifying metabolites, comprising:
(A1) mass analyzing a second metabolite group to which the first metabolite labeled metabolically isotope is added;
(A2) determining the intensity ratio between the labeled peak and the unlabeled peak, and quantifying the metabolite;
Including said method.
（b1）サンプルに代謝的に同位体標識された第一の代謝物群を添加する工程と、
（b2）工程（b1）で得られたサンプルから代謝物を抽出する工程と、
を含む方法によって得られたものである、請求項１に記載の方法。 A second metabolite group to which a metabolically isotopically labeled first metabolite group is added,
(B1) adding a metabolically isotopically labeled first metabolite group to the sample;
(B2) extracting a metabolite from the sample obtained in step (b1);
The method according to claim 1, which is obtained by a method comprising:
をさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。 Adding an isotope-labeled metabolite precursor and culturing to metabolically isotope-label the first metabolite group;
The method according to any one of claims 1 to 9, further comprising:
をさらに含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。 Quantifying metabolites present in the first metabolically labeled metabolite group; and
The method according to claim 1, further comprising:
（c1）代謝的に同位体標識された第一の代謝物群に既知量の同位体非標識の代謝物を添加する工程と、
（c2）各代謝物を質量分析する工程と、
（c3）各代謝物の標識ピークと非標識ピークとの強度比を求めて、各代謝物を定量する工程と、
を含む工程である、請求項１３に記載の方法。 Quantifying the metabolites present in the metabolically isotopically labeled first metabolite group,
(C1) adding a known amount of an isotope-unlabeled metabolite to a metabolically isotopically labeled first metabolite group;
(C2) mass spectrometric analysis of each metabolite;
(C3) determining the intensity ratio between the labeled peak and unlabeled peak of each metabolite, and quantifying each metabolite;
The method according to claim 13, wherein the method comprises:
をさらに含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。 Collating with a metabolite database;
The method according to claim 1, further comprising:
をさらに含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。 A waveform separation of a mass chromatogram and / or electrogram obtained by mass spectrometry;
The method according to claim 1, further comprising:
同位体標識された代謝物のm/zの値における固有の代謝物に由来する第一の波形の面積の値と同位体非標識の代謝物のm/zの値における固有の代謝物に由来する第二の波形の面積の値とから、（前記第一の波形面積）／（前記第二の波形面積）の比を算出する工程と、
をさらに含む、請求項１９に記載の方法。 Calculating the area of the waveform derived from the unique metabolite obtained by the waveform separation process;
Derived from intrinsic metabolite in the value of the first waveform derived from the unique metabolite in the m / z value of the isotopically labeled metabolite and in the m / z value of the isotopically unlabeled metabolite Calculating the ratio of (first waveform area) / (second waveform area) from the value of the area of the second waveform
20. The method of claim 19, further comprising:
（d1）代謝的に同位体標識された第一の代謝物群を添加された第二の代謝物群を質量分析することによって得られたデータを取得する入力部と、
（d2）標識ピークと非標識ピークとの強度比を求めて、代謝物を定量する制御部と、
を含む、前記システム。 A system for quantifying metabolites,
(D1) an input unit for acquiring data obtained by mass spectrometry of the second metabolite group to which the first metabolite labeled metabolically isotope is added;
(D2) a control unit for determining the intensity ratio between the labeled peak and the unlabeled peak and quantifying the metabolite;
Including the system.
をさらに含む、請求項２３に記載のシステム。 A controller that separates the waveform of the mass chromatogram and / or electrogram obtained by mass spectrometry;
24. The system of claim 23, further comprising:
（e1）代謝的に同位体標識された第一の代謝物群を添加された第二の代謝物群を質量分析することによって得られたデータを取得する手段と、
（e2）標識ピークと非標識ピークとの強度比を求めて、代謝物を定量する手段と、
を含む、前記プログラム。 A program for quantifying metabolites,
(E1) means for obtaining data obtained by mass spectrometry of the second metabolite group to which the first metabolite labeled metabolically isotope is added;
(E2) a means for determining the intensity ratio between the labeled peak and the unlabeled peak, and quantifying the metabolite;
Including the program.
をさらに含む、請求項２５に記載のプログラム。
Means for waveform separation of mass chromatograms and / or electrograms obtained by mass spectrometry;
The program according to claim 25, further comprising:
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Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012111249A1 (en) * | 2011-02-14 | 2012-08-23 | 学校法人麻布獣医学園 | Method for detecting mass change in mass spectrometry method and method for quantifying absolute amount of stable isotope-labeled protein |
| JP2019024326A (en) * | 2017-07-25 | 2019-02-21 | 大陽日酸株式会社 | Method of producing labelled metabolite, method of quantifying metabolite, and labelled metabolite production kit |
| CN113671097A (en) * | 2021-07-19 | 2021-11-19 | 中国农业科学院油料作物研究所 | Based on13Full-lipid quantitative method of C metabolism full-position labeled lipid combined isotope dilution mass spectrometry |
| CN114295766A (en) * | 2021-12-24 | 2022-04-08 | 中国科学院上海有机化学研究所 | Metabonomics data processing method and device based on stable isotope labeling |
| CN114577916A (en) * | 2020-12-01 | 2022-06-03 | 中国科学院大连化学物理研究所 | Analysis method of stable isotope labeling metabolic flow based on chip nanoliter electrospray mass spectrum |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002523058A (en) * | 1998-08-25 | 2002-07-30 | ユニバーシティ オブ ワシントン | Rapid quantitative analysis of proteins or protein functions in complex mixtures |
| JP2005300430A (en) * | 2004-04-14 | 2005-10-27 | Shimadzu Corp | Method for specifically detecting labeled peptide, and method for specifically detecting peak located to one side |
-
2005
- 2005-06-02 JP JP2005162313A patent/JP2006337176A/en active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002523058A (en) * | 1998-08-25 | 2002-07-30 | ユニバーシティ オブ ワシントン | Rapid quantitative analysis of proteins or protein functions in complex mixtures |
| JP2005300430A (en) * | 2004-04-14 | 2005-10-27 | Shimadzu Corp | Method for specifically detecting labeled peptide, and method for specifically detecting peak located to one side |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012111249A1 (en) * | 2011-02-14 | 2012-08-23 | 学校法人麻布獣医学園 | Method for detecting mass change in mass spectrometry method and method for quantifying absolute amount of stable isotope-labeled protein |
| JPWO2012111249A1 (en) * | 2011-02-14 | 2014-07-03 | 学校法人麻布獣医学園 | Method for detecting mass change in mass spectrometry and method for quantifying absolute amount of stable isotope-labeled protein |
| JP2019024326A (en) * | 2017-07-25 | 2019-02-21 | 大陽日酸株式会社 | Method of producing labelled metabolite, method of quantifying metabolite, and labelled metabolite production kit |
| CN114577916A (en) * | 2020-12-01 | 2022-06-03 | 中国科学院大连化学物理研究所 | Analysis method of stable isotope labeling metabolic flow based on chip nanoliter electrospray mass spectrum |
| CN114577916B (en) * | 2020-12-01 | 2022-12-09 | 中国科学院大连化学物理研究所 | Analysis method of stable isotope labeling metabolic flow based on chip nanoliter electrospray mass spectrum |
| CN113671097A (en) * | 2021-07-19 | 2021-11-19 | 中国农业科学院油料作物研究所 | Based on13Full-lipid quantitative method of C metabolism full-position labeled lipid combined isotope dilution mass spectrometry |
| CN113671097B (en) * | 2021-07-19 | 2024-02-23 | 中国农业科学院油料作物研究所 | Based on 13 Full-lipid quantification method by combining C metabolism full-position marked lipid with isotope dilution mass spectrometry |
| CN114295766A (en) * | 2021-12-24 | 2022-04-08 | 中国科学院上海有机化学研究所 | Metabonomics data processing method and device based on stable isotope labeling |
| CN114295766B (en) * | 2021-12-24 | 2022-12-02 | 中国科学院上海有机化学研究所 | Metabonomics data processing method and device based on stable isotope labeling |
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