JP6895711B2 - 血清ベースの癌検出のためのシステム及び方法 - Google Patents

Description

関連出願
本出願は、合衆国法典第３５巻１１９条（ｅ）のもと、以下の係属中の米国特許仮出願に対する優先権を主張する。２０１２年１１月６日出願の「Ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｓｅｒｕｍ Ｂａｓｅｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ」と題する第６１／７９６，２６８号、２０１２年１２月１３日出願の「Ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｓｅｒｕｍ Ｂａｓｅｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ， Ｓｔａｇｉｎｇ， ａｎｄ Ｐｏｌｙｐ Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ」と題する第６１／７９７，６８６号、２０１２年１２月２８日出願の「Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ」と題する第６１／８４８，２４２号、及び２０１３年２月１５日出願の「Ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｓｔａｇｅ Ｕｓｉｎｇ Ｒａｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｉｎｇ」と題する第６１／７６５，５２４号である。これらの全ての出願は、それらの全体が本参照により本出願に組み込まれる。

癌は、死亡率及び罹患率の点においてだけでなく、進行癌の治療コスト並びに進行癌患者の生産性及び生活の質の低下の点においてもまた、重大である。癌は不治の病であるという共通概念にも関わらず、適時の医学的介入が施されることができれば、多くの癌は緩和され、遅らせられ、または治癒さえしうる。癌の早期発見のための手段及び方法の必要性が、広く認識されている。

癌は種々のメカニズムにより生じるが、そのすべてがよく理解されているわけではない。癌は、固体塊の形で生じる場合は腫瘍と呼ばれ、特徴として、制御解除された細胞成育及び／または増殖を示す。癌細胞はしばしば、自身が発生する元の細胞種に関連する他の特徴的な差異を示す。それは、細胞表面、分泌、核、及び／または細胞質タンパク質の発現異常、抗原性異常、脂質エンベロープ（つまり細胞膜）組成異常、核酸の産生異常、形態異常、及び他の差異を含む。一般に癌は、腫瘍形成の観察、または１つもしくはそれより多いこれらの特徴的差異の観察のいずれかにより診断される。癌は正常組織の細胞から生じるため、通常、癌細胞は初期には本来の正常組織の細胞によく類似し、癌細胞とその対応する本来の正常細胞との差異がより明らかであるステージへと進行するまで、癌細胞の検出をしばしば難しくする。癌の種類によっては、容易に検出可能となる前に、癌が比較的治療が困難なステージへと進行してしまっていうる。

癌の早期で明確な発見及び分類は、しばしば治療の成功にきわめて重要である。多くの癌の診断には、その癌の種類及び悪性度、並びにその進行のステージの判定が含まれる。この情報は、治療選択の本質を提供し、比較的早いステージの転移していないまたはゆっくり転移している癌にはより軽い治療（つまり、より少ない望ましくない副作用を有する）、患者の健康により大きなリスクを引き起こす癌にはより積極的な治療（つまり、より多い望ましくない副作用、及び／またはより低い治療指数を有する）の使用を可能にする。

癌が疑われる場合、医師はしばしば、その腫瘍、または１つもしくはそれより多い異常な特徴を有する組織切片を、摘出または生検し、また組織病理学的解析に出すであろう。一般に、標本を調製するのにかかる時間は、およそ１日またはそれより長い。病理医から医師へそして患者への結果の伝達は、その癌の診断及び指示されるあらゆる治療の開始をさらに遅らせうる。試料採取と診断との間の期間中、患者の不安は高まりうる。

試料が癌であるか否かを判定するために生体試料を解析するのに必要な時間を短縮する必要性が、認識されている。さらに、患者の不快感を最小化し、かつ患者の検査の許容性を改善するためには、従来の組織／細胞試料の代わりに体液を使用することが有益であろう。

分光学的技法は、生体分子についての情報を提供し、従って生体試料の病態についての情報を提供する可能性を有する。生体試料の状態（例えば、試料の代謝状態）が正常状態から病的状態へと変化するに従い、分光学的技法は、その変化を示すための情報を提供し、また診断しかつ疾患の予後を予測するのに役立ちうる。

様々な種類の疾患、とくに癌の検出のために、様々な種類の分光法及びイメージングが探究されうる。ラマン分光法は、試料の照射及び散乱線の検出に基づくため、生体試料の解析に適切となるように、非侵襲的かつ非破壊的に用いられうる。ゆえに、試料の調製は殆どまたは全く必要ない。さらに、水は非常に少ししかラマン散乱を示さず、ラマン分光法技法は水性環境において容易に実施されうる。

ラマン分光法は、分子の振動状態についての情報を提供する。多くの分子は、いくつかの振動状態で存在することが可能な原子結合を有する。そのような分子は、その許容される振動状態の２つの間の遷移に匹敵する入射放射線を散乱させ、続いて放射線を放射することができる。たいてい、散乱された放射線は同じ波長で再放射される。これはレイリーまたは弾性散乱と呼ばれるプロセスである。場合によっては、その再放射された放射線は、（分子の許容可能な振動状態、並びに初期及び最終振動状態に応じて）入射放射線よりわずかにより大きいまたはわずかにより小さいエネルギーを含有しうる。入射放射線と再放射放射線との間のエネルギー差の結果は、入射放射線と再放射放射線との間の波長の変化として現れ、また差の度合いはラマンシフト（ＲＳ）と呼ばれ、波数の単位（長さの逆数）で測定される。レーザー光源を用いる場合にそうであるように、入射光が実質的に単色（単一の波長）である場合、波長が異なる散乱光はレイリー散乱光とはより容易に区別されうる。

物質のラマンスペクトルは、その物質の分子組成を明らかにすることができ、それは有機及び無機分子中に存在する特定の官能基を含む。ラマン分光法は生体物質の検出に有用である。それは、それらの物質の全てではないとしても殆どが、様々な選択律に従う特徴的な「指紋」ラマンスペクトルを示し、これにより物質が同定されることができるからである。ラマンピーク位置、ピーク幅、ピーク形、及び選択律に対する追従性は、分子の正体を同定し、また凝縮相物質についての立体構造情報（例えば、結晶相、規則度、タンパク質二次構造）を決定するのに用いられうる。

過去数年の間には、科学者がラマン分光法に固有の問題を概ね克服することを可能にした、いくつかの重要な技術が幅広く使用されるようになった。これらの技術は、高効率固体レーザー、効率的レーザー除去フィルタ、及びシリコン（Ｓｉ）電荷結合素子（ＣＣＤ）検出器を含む。一般に、試料の大きさが画像収集用光学系の選択を決定する。例えば、サブミクロンからミリメートルの空間的寸法の試料の解析には、一般に顕微鏡が用いられる。ミリメートルからメートルの寸法範囲にあるより大きい対象物に対しては、マクロレンズ光学系が適切である。比較的アクセスし難い環境内に置かれた試料に対しては、フレキシブルファイバースコープまたはリジッドボアスコープが用いられうる。惑星の対象物などの非常に大規模な対象物に対しては、望遠鏡が適切な画像収集用光学系である。

様々な光学システムにより形成された画像の検出には、二次元のイメージング焦点面アレイ（ＦＰＡ）検出器が一般に用いられる。ＦＰＡ検出器の選択は、目的の試料の特性を明らかにするために用いられる、分光学的技法により左右される。例えば、Ｓｉ ＣＣＤ検出器または相補的金属酸化物半導体（ＣＭＯＳ）検出器は、一般に可視（ＶＩＳ）波長蛍光及びラマン分光学的イメージングシステムと共に用いられ、一方でインジウムガリウムヒ化物（ＩｎＧａＡｓ）ＦＰＡ検出器は、一般に近赤外（ＮＩＲ）光学的イメージングシステムと共に用いられる。

ラマン散乱光を検出し、またその光のラマンシフトを正確に決定するためには、試料は実質的に単色の光で照射されるべきである。そのような光は、約１．３ナノメートル（ｎｍ）以下、また好ましくは１．０、０．５０または０．２５ｎｍ以下の帯域幅を有する。適切な光源は、様々な、レーザー、及び多色光源−モノクロメータの組み合わせを含む。照射光の帯域幅、波長分解要素の分解能、及び検出器のスペクトル幅は、スペクトル特徴がどれだけ良く観察され、検出され、または他のスペクトル特徴から区別されることができるかを決めることが認識されている。これらの要素（つまり、光源、フィルタ、格子、または波長によりラマン散乱光を区別するのに用いられる他のメカニズム）の特性の総合が、ラマンシグナル検出システムのスペクトル分解能を定義する。これらの要素の既知の関係は、当業者が容易に計算可能な方法で適切な構成要素を選択することを可能にする。システムのスペクトル分解能の限界（例えば、放射光の帯域幅に関連する限界）は、スペクトル特徴を分解し、検出し、または区別する能力を制限しうる。当業者は、ラマン散乱シグナルの分離及び形が、本明細書で開示されるあらゆるラマンスペクトル特徴について、システムのスペクトル分解能の許容可能な限界を決定しうること、またどのように決定しうるかを理解する。

分光学的イメージングは、デジタルイメージングと、ラマン散乱、蛍光、フォトルミネッセンス、紫外（ＵＶ）、ＶＩＳ、及び赤外（ＩＲ）吸収分光法を含みうる分子分光法技法とを組み合わせる。物質の化学的解析に適用される場合、分光学的イメージングは一般に化学的イメージングと呼ばれる。分光学的（つまり、化学的）イメージングを実施するための器械は、一般に、照明光源、画像収集用光学系、焦点面アレイイメージング検出器、及びイメージング分光器を有する。

例えば、ラマン化学的イメージング（ＲＣＩ）は、組織試料からのレーザー光の散乱に基づく、無試薬の組織イメージング手法である。本手法は、画像のピクセルが、対応する位置における試料のラマンスペクトルである、試料の画像を作成する。ラマンスペクトルは、各位置における試料の局所的な化学的環境についての情報を保有する。ＲＣＩは、約２５０ｎｍの空間分解能を有し、また、分子組成、立体構造、及び形態に基づき、定性的及び定量的な画像情報を潜在的に提供しうる。

試料の分光学的イメージグは、いくつかの方法の１つにより実行されうる。まず、照射される領域の各点におけるスペクトルを測定するため、点光源照射が試料上に提供されうる。レーザー線を用いて試料を照明することによってデータが作成される、ライン走査もまた用いられうる。スペクトルはまた、音響光学可変フィルタ（ＡＯＴＦ）、多重共役可変フィルタ（ＭＣＦ）、または液晶可変フィルタ（ＬＣＴＦ）などの電子工学的に調節可能な光学イメージングフィルタを用いることによって、試料を包含する全領域にわたって同時に採取されうる。ＭＣＦにおいては、そのような光学フィルタ中の有機物質は、適用される電圧により積極的に整列し、望ましい帯域通過及び透過機能をもたらす。そのような画像の各ピクセルに対して得られたスペクトルは、その結果ハイパースペクトル画像と呼ばれる複雑なデータセットを作成し、それは、本画像中の各ピクセル要素の、多数の波長における強度値または波長依存性を含有する。分光学的データを作成するために選択される方法は、解析される試料の性質、解析に要する時間、及びコストを含む様々な要因に依存しうる。

病態を判定する能力は、臨床診断及び癌検出に重要である。そのような検査は、しばしば、異なる波長における試料のスペクトルを獲得することを要する。従来型の分光学的装置は、検出器、可変フィルタ、または可能性のある他のシステム構成要素の作動範囲のため、限定された波長範囲にわたって作動する。これは、ＵＶ、ＶＩＳ、ＩＲ、ＮＩＲ、短波長赤外（ＳＷＩＲ）、中赤外（ＭＩＲ）、及び長波長赤外（ＬＷＩＲ）波長、並びに重複する範囲での解析を可能にする。これらは、約１８０−３８０ｎｍ（ＵＶ）、約３８０−７００ｎｍ（ＶＩＳ）、約７００−２５００ｎｍ（ＮＩＲ）、約８５０−１７００ｎｍ（ＳＷＩＲ）、及び約２５００−５０００ｎｍ（ＭＩＲ）、及び約５０００−２５０００ｎｍ（ＬＷＩＲ）の波長に対応する。その他の技法は、減衰全反射（ＡＴＲ）及び蛍光を含む。

癌に対する最も効果的な解決法は、早期の、発症前の検出である。一度、他の臓器への転移と組み合わせられた悪性で増大中の腫瘍などの癌の存在が明らかになると、生存率は非常に悪い。特に大腸癌（ＣＲＣ）の場合はそうである。先進諸国において３番目に多い癌である大腸癌の早期発見は、９５％の５年以上生存率をもたらしうる。しかしながら、末期発見は、たった５％という狼狽させるような生存率を有し、これに加えて寿命末期の医療費が何十万ドルにまで跳ね上がることが報告されている。早期の腫瘍マーカーは、その低い信頼性及び特定の癌の状態との不定の関連性ゆえ、今日まで臨床医及び保険者により高くは評価されてこなかった。早期発見を含む、ＣＲＣを発見する正確で信頼できるシステム及び方法が必要とされている。そのような解決法は、伝統的な方法を用いるよりも早く患者のＣＲＣを検出する可能性を有し、ＣＲＣの再発を監視し、また従って患者がより早く治療を求めることを可能にし、生存率を増加させうる。
この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては、以下のものがある（国際出願日以降国際段階で引用された文献及び他国に国内移行した際に引用された文献を含む）。
（先行技術文献）
（特許文献）
（特許文献１） 米国特許第７，０６０，９５５号明細書
（特許文献２） 米国特許第７，９９０，５３３号明細書
（特許文献３） 米国特許出願公開第２００８／０１１７４１６号明細書
（特許文献４） 米国特許出願公開第２０１２／０２００８５０号明細書
（特許文献５） 国際公開第２０１１／０８８５８０号
（特許文献６） 国際公開第２０１４／０７４５６９号

本開示は、ＣＲＣ及びその前癌性病変を診断するために、空間分解ラマン分光法及び／またはラマン化学的イメージング、並びに目的変数ありの多変量統計解析（つまり計量化学的）技法を用いて血清試料を解析するための、システム及び方法を規定する。癌の検出に加え、本開示のシステム及び方法は、試料の癌の悪性度を判定し、また癌を正常の試料及び／またはポリープの存在と識別する可能性をも有しうる。癌が進行するにつれ、試料中の分子の濃度または立体構造は変化しうる。これらの変化は、本明細書で開示されるシステム及び方法を用いて、またこれらのステージ間のスペクトル帯の変化を解析することにより、検出されうる。本開示は、分光学的、イメージング、及びセンサ融合技法の使用を有する様々な実施形態を提供する。

本明細書で開示されるシステム及び方法は、ファイバアレイスペクトル変換系（ＦＡＳＴ）装置とともに多点式のラマン分光法及び／またはイメージングを使用することを規定する。ＦＡＳＴの使用は、単一の画像フレーム中において、何百から何千の空間分解スペクトルの、十分なスペクトルの取得を可能にする。ＦＡＳＴ装置の使用は、ポイント走査または現在の可変フィルタベースの技術と比較して、データ取得得率を劇的に増加させることにより、先行技術の限界を克服する。データを再構築するために空間的／スペクトル情報を抽出するためには、ソフトウェア、ハードウェア、及び／またはソフトウェアとハードウェアとの組み合わせが用いられうる。さらにＦＡＳＴは、ＵＶからＩＲの広いスペクトル範囲にわたって作動する頑丈な技術である。従って、本開示のシステム及び方法は、乾燥血清試料などの生体試料に対して実施されうる、単純で低コストの無試薬ｉｎ ｖｉｔｒｏ診断検査を提供する可能性を有する。乾燥血清試料の解析はまた、患者に対して最小限しか侵襲的でないという点で、ＣＲＣを検出するための他の技法と比較して、長所をも提供する。

生体試料を解析するために、システムが提供される。本システムは、生体試料の少なくとも１つの位置を照明し、かつ少なくとも複数の相互作用した光子を生成するように設計された、照明光源を有しうる。その相互作用した光子は、少なくとも１つのミラーを用いて分光器へと向けられうる。少なくとも１つの検出器が、相互作用した光子を検出し、またその生体試料を表わす少なくとも１つのラマンデータセットを作成するように設計されうる。少なくとも１つの処理装置が、ラマンデータセットを解析し、また生体試料を少なくとも１つの病態と関連づけるように設計されうる。

少なくとも複数の相互作用した光子を生成するために、生体試料の少なくとも１つの位置を照明する工程を有する方法が提供される。その生体試料を表わす少なくとも１つのラマンデータセットを作成するため、相互作用した光子は収集され、かつ検出されうる。そのラマンデータセットは、生体試料を少なくとも１つの病態と関連づけるために解析されうる。

本開示はまた、機械可読なプログラムコードを含有する非一過性記録媒体をも規定し、それは処理装置により実行されると処理装置に以下を実施させる。少なくとも複数の相互作用した光子を生成するために生体試料の少なくとも１つの位置を照明させ、複数の相互作用した光子を収集させ、複数の相互作用した光子を検出させて生体試料を表わす少なくとも１つのラマンデータセットを作成させ、かつ生体試料を少なくとも１つの病態と関連づけるためにラマンデータセットを解析させる。

添付の図面は、本開示のさらなる理解を提供するために含められ、また本明細書に組み込まれてその一部を構成するが、本開示の実施形態を例証し、本開示と共に本開示の原理を説明するのに役立つ。

図面において、
図１は、本開示のシステムの代表的なハウジング構成を例証する。 図２は、本開示のシステムを例証する。 図３Ａは、本開示のファイバアレイスペクトル変換系（ＦＡＳＴ）装置を例証する。 図３Ｂは、本開示の様々な実施形態の代表的な試料採取の配置を例証する。 図４は、本開示のシステムを例証する。 図５Ａは、本開示の方法を例証する。 図５Ｂは、本開示の方法を例証する。 図６Ａは、複数の分光学的様式からのデータ融合を利用した、本開示のシステムの１つの実施形態を例証する。 図６Ｂは、複数の分光学的様式からのデータ融合を利用した、本開示のシステムの１つの実施形態を例証する。 図７Ａは、本開示の１つの実施形態の、低スループット試料採取の配置を例証する。 図７Ｂは、本開示の１つの実施形態の、高スループット試料採取の配置を例証する。 図８Ａは、正常、癌、及びポリープ試料間を識別するための、本開示の検出能力を例証する、代表的な試料データセットに対するＲＡＣＣ（大腸癌に対するラマン解析）指標の算出を例証する。 図８Ｂは、代表的な試料データセットの受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線を例証する。 図８Ｃは、癌の悪性度を検出するための本開示の検出能力を例証する、代表的な試料データセットに対するＲＡＣＣ指標の算出を例証する。 図９Ａは、代表的な試料データセットのＲＯＣ曲線を例証する。 図９Ｂは、ＣＲＣ及び正常試料間を識別するための本開示の検出能力を例証する、代表的な試料データセットに対するＲＡＣＣ指標の算出を例証する。 図１０は、ＣＲＣ及び正常試料のＲＣＩデータを例証する。 図１１Ａは、図１０に例証されるＣＲＣ及び正常試料に対する平均クラススペクトルを例証する。 図１１Ｂは、図１０に例証されるＣＲＣ及び正常試料を識別するモデルについての、投影における変数の重要度（ＶＩＰ）スコアを例証する。 図１２Ａは、格子型の試料採取配置のＲＣＩデータを用いてＣＲＣ及び正常試料間を識別するための、本開示の検出能力を例証する。 図１２Ｂは、リング型の試料採取配置のＲＣＩデータを用いてＣＲＣ及び正常試料間を識別するための、本開示の検出能力を例証する。 図１２Ｃは、図１２Ａ及び図１２Ｂに例証される試料採取配置に関する統計的情報を例証する。 図１３Ａは、ＣＲＣ試料の蛍光化学的画像を例証する。 図１３Ｂは、正常試料の蛍光化学的画像を例証する。 図１４は、データ融合を用いてＣＲＣ及び正常試料間を識別するための、本開示の検出能力を例証する。 図１５は、タンパク質立体構造に関連づけられるスペクトル特徴を含む種々のスペクトル特徴を解析するための、本開示の能力を例証する。 図１６は、タンパク質立体構造の評価に関連する、代表的な目的のスペクトル特徴を例証する。 図１７は、ＣＲＣ及び正常試料を識別するモデルについてのＶＩＰスコアを例証する。 図１８Ａは、アミド１ピーク重心（ＣＯＭ）に関連するＲＣＩデータを例証する。 図１８Ｂは、ランダムコイル立体構造を表わすスペクトルデータを例証する。

詳細な開示
次に本開示の実施形態への言及が詳細になされ、その例は添付の図面中に例証される。同じまたは類似の要素に言及するためには、可能な限り、明細書全体に渡って同じ参照番号が使用される。

本開示は、生体試料または生体試料の構成要素を解析するためのシステム及び方法を規定する。生体試料の例は、尿、唾液、痰、糞便、血液、血清、血漿、粘液、膿、精液、傷から出る液体、洗浄液、脳脊髄液、膣液、及びこれらの組み合わせなどの体液を含むが、これに限定されない。本開示は、生体試料の病態の判定（癌または正常試料の検出）に焦点をあてるが、本開示は、本明細書で開示されるシステム及び方法が、試料の他の特徴（例えば、代謝状態、水和状態、炎症状態、及びこれらの組み合わせ）、及び病態の定義内であるポリープの存在などの前駆状態を判定するのに用いられうることもまた意図する。さらに、本明細書において提供される実施例はＣＲＣの検出に関するが、本開示はＣＲＣに限定されず、本システム及び方法は、幅広い種類の癌を検出するのに用いられうる。試料が癌を有するか否かの検出に加え、本システム及び方法は、癌の悪性度（または疾患の程度）を判定するのにもまた適用されうる。

本開示は、病態を判定するために生体試料を解析するためのシステムを規定し、それは図１−４によりさらに例証される。システム１００の代表的なハウジングは図１に例証される。図１に見られるように、システム１００は、解析対象の試料を配置するための試料ドメイン２００と、試料ドメイン２００中に配置された試料を表わす少なくとも１つのラマンデータセットを作成するための測定ドメイン３００と、測定ドメイン３００により作成されたデータを解析するための解析ドメイン４００とを有しうる。

図２は、本開示のシステム１００のより詳細な描写である。図２に例証されるように、試料ドメイン２００は、試料を配置するためのステージ２１０をさらに有しうる。このステージ２１０は、解析対象の様々な試料を解析するために、移動させられうる。１つの実施形態においては、試料は、スライドガラスに付着させられ、または、マイクロタイター試料プレート２３０などのウェルプレート中に配置されてもよい。試料は、解析のために、顕微鏡対物レンズ２４０などの収集光学系の下に配置されてもよい。

測定ドメイン３００は、試料を表わすＲＧＢ画像を作成するように設計された、ＲＧＢカメラ３２０を有しうる。光子を試料から少なくとも１つのレンズ３１５を通ってＲＧＢカメラ３２０へと向けるように、少なくとも１つのミラー３１０が設計されうる。作成されたＲＧＢ画像は、解析のために試料を整列させるのを補助するのに使用され、かつ／または、試料中に形態的特徴もしくは目的の領域を見つけるのに使用されうる。ＲＧＢ画像はまた、測定ドメイン３００により作成されるラマンデータセットと相関させられうる。

なお図２を参照し、測定ドメイン２００は、照明光子を放射するように設計された、少なくとも１つのレーザー照明光源３２５をさらに有しうる。その照明光子は、目的でない光の波長をフィルタ除去し、かつ１つまたはそれより多い目的の光の波長を通過させるために、レーザー帯域通過フィルタ（ＬＢＦ）を通過させられてもよい。これらのフィルタをかけた照明光子は、二色性ミラーまたは二色性ビームスプリッタなどの、少なくとも１つのメカニズム３３５により、試料へと向けられうる。

その照明光子は、試料を照射し、また少なくとも複数の相互作用した光子を生成しうる。１つの実施形態においては、これらの相互作用した光子は、試料により散乱させられた光子、試料により吸収された光子、試料により反射された光子、試料から放射された光子、及びこれらの組み合わせのうちの少なくとも１つを有しうる。

複数の相互作用した光子は、短い波長を有する光子をフィルタ除去するためにロングパスフィルタ（ＬＰＦ）３４０を通過させられ、また少なくとも１つのミラー３４５により、レンズ３５０を介して、ＦＡＳＴ装置３５５の二次元端へと向けられうる。ＦＡＳＴ装置３５５は、図３Ａ中により詳細に例証される。図３Ａにおいて、ＦＡＳＴ装置３５５は二次元端３５６と一次元端３５７とを有する。１つの実施形態においては、二次元端３５６はヘビ状配列などの配列を有しうる。ＦＡＳＴ装置３５５の二次元端３５６は、一次元ファイバ堆積３５７へと引き解かれる、光学ファイバの二次元アレイを有しうる。１つの実施形態においては、二次元端３６５は非直線形状（例えば、円形、正方形、長方形などのいかなる非直線的形状でもよい）であってもよく、一次元直線端３５７は直線形でありうる。

相互作用した光子は、ＦＡＳＴ装置の入力部（二次元端３６５）上に収束させられうる。その入力部は、何千に至る個別のファイバから構成されうる。各ファイバは、生体試料の励起された領域中の対応する特定の位置により散乱させられた（あるいは、吸収、反射、及び／または放射された）光を収集する。

一次元ファイバ堆積３５７（出力端）は、図２及び図３Ａの両方において例証される分光器３６０の入射スリットに向けられうる。分光器３６０は、複数の光子を複数の波長へと分離し、各ファイバからの個々の散発的なスペクトルを提供するように機能しうる。複数のラマンスペクトル、及びゆえに複数の試料領域の照合が、単一の測定サイクルで、従来型のラマンセンサでの場合と本質的には同じ時間で得られうる。

図２を参照し、光子は検出器３６５で検出され、生体試料を表わすラマンデータセットを作成する。１つの実施形態においては、検出器３６５により生成された単一フレーム中に埋め込まれたスペクトル／空間情報を抽出するために、処理装置（及び／またはソフトウェア）３７０が使用されうる。

図３Ａを参照し、３６１は代表的な検出器３６５出力部を表し、３６２は代表的なスペクトル再構築を表し、また３６３は代表的な画像再構築を表わす。

１つの実施形態においては、収集ラマン効率を最大化するため、目的の領域がＦＡＳＴ装置によりレーザースポット領域に光学的に一致させられうる。１つの実施形態においては、本開示は、レーザー光線のみが視野（ＦＯＶ）内での走査のために移動させられる構成を意図する。本開示はまた、試料が移動させられレーザー光線が静止している、好ましい実施形態も意図する。

「走査」ＦＯＶをラマン収集ＦＯＶと光学的に一致させることは可能である。ＦＯＶは、各ＦＡＳＴファイバがＦＯＶの１つの領域から光を収集するように、長方形のＦＡＳＴ装置上に映し出される。最大の空間分解能をもたらすファイバ当たりの面積は、ＦＯＶ全体の面積をファイバ数で割ることにより容易に計算される。ラマン散乱はレーザーが試料を励起する場合にのみ生成されるため、ラマンスペクトルは、ファイバの収集領域がレーザー光線により走査されているファイバにおいてのみ、得られることになる。レーザー光線のみの走査は、既製の検流計駆動式ミラーシステムを利用しうる迅速な工程である。

ＦＡＳＴ装置３５５の組み立ては、アレイの二次元端３５６、及び遠位端である一次元端３５７の両方における各ファイバの位置の知識を要する。各ファイバは、二次元アレイ（イメージング端）における固定位置から光を収集し、（そのファイバの遠位端３５７を介して）この光を検出器３６５上の固定位置へと伝導する。

各ファイバは、一列の検出器より広範囲に及ぶかもしれず、これは再構築された画像において一ファイバあたり一ピクセルの場合よりも高い分解能を可能にする。実際、この超分解能は、ファイバピクセル（つまり、各ファイバに関連づけられる検出器中のピクセル）間での内挿と組み合わせられると、別の方法で可能であるよりもずっと高い空間分解能を達成する。ゆえに、空間的較正は、イメージング端及び遠位端におけるファイバの幾何（つまり、ファイバの対応付け）の知識のみならず、どの検出器列が一定のファイバと関連するかの知識もまた必要とする。

他の分光学的方法よりもＦＡＳＴ装置を使用することの根本的な長所は、解析のスピードである。ＦＡＳＴ技術は、数個から何千もの全スペクトル幅の空間分解スペクトルを同時に獲得できる。特にレーザー誘発性の光損傷に敏感な試料については、完全な光学的イメージングデータセットが、一定の物質から１つのスペクトルを生成するのにかかる時間で獲得されうる。ＦＡＳＴ装置はまた複数の検出器を搭載していてもよく、また試料の形態及び化学についての重要な見識を提供するために、色分けされたＦＡＳＴ分光学的画像は、他の高空間分解能を有するグレースケール画像に重ね合わせられてもよい。

ＦＡＳＴ装置の活用は、「多点式」解析と呼ばれうるもののために、システム１００を設計する１つの方法である。多点式解析を実施するには、生体試料及び評価されるべき範囲が、生体試料の特質、及び望まれる多点式試料採取の種類に応じて、全体的にまたは部分的に照明される。照明範囲は、複数の、隣接する、隣接しないまたは重複する点へと分割され、その各点においてスペクトルが生成される。１つの実施形態においては、これらのスペクトルはその平均が計算される。別の１つの実施形態においては、照明スポットのサイズが、試料の大きい領域に渡って空間的に試料採取／平均するのに十分に、拡大されうる。これは、トランセクト試料採取も含みうる。

一例として、試料の全体が照明され、選択された点において相互作用した光子を評価することにより、多点式解析が行われうる。あるいは、試料の複数の点が照明されてもよく、これらの点から発散される相互作用した光子が評価されうる。それらの点は、連続的に（つまり順次に）評価されうる。この方法を実施するには、取得時間と分光学的マップの空間的分解能との間に固有のトレードオフが存在する。完全なスペクトルそれぞれを収集するには、一定の時間がかかる。試料の単位面積あたりより多くのスペクトルが収集されるほど、分光学的マップの見かけの分解能は高くなるが、データ取得にはより長い時間がかかる。別の１つの実施形態においては、画像範囲中の選択された全ての点について、相互作用した光子は並列に（つまり、同時に）評価されうる。この全点の並列処理は、化学的イメージングと呼ばれ、非常に多数の空間的点及びスペクトルチャネルが選択される場合、かなりのデータ取得時間、計算時間、及びキャパシティを必要としうるが、比較的少数のスペクトルチャネルが評価される場合は、より少ないデータ取得時間、計算時間、及びキャパシティしか必要としない。

本開示は、ＦＯＶ（例えば、顕微鏡の拡大視野範囲）中の複数の点における相互作用した光子の評価を規定する。その複数の点は、全体として、ＦＯＶ面積の一部しか表さない（多点式）。視野範囲の合計面積のごく一部を表わす点において（例えば、合計で視野範囲の２５％、５％、１％、またはそれより小さい範囲を表わす、２、３、４、６、１０、５０、１００、またはそれより多い点において）ＦＯＶの標本抽出をすることが分かっている。それらの点は、ＦＯＶの画像の個々のピクセル、または複数の隣接するもしくはグループ化されたピクセルにより画像中に表される視野範囲の領域でもよい。個々の点として評価される領域またはピクセルの形は、重要ではない。例えば、円形、環状、正方形、または長方形の領域またはピクセルが、個々の点として評価されうる。ライン走査設定においては、列状のピクセルもまた、評価されうる。図３Ｂは、本開示の様々な実施形態の代表的な試料採取の配置を例証する。

多点式解析の各点に対応する領域は、種々の既知の方法で選択または生成されうる。１つの実施形態においては、構造化照明が使用されうる。一例として、照明または収集光路に配置された共焦点マスクまたは回折光学素子は、照明または収集を、決められた幾何学的関係を有する試料の一定部分に限定しうる。

ＦＯＶ中の複数の点における分光学的解析（多点式解析）は、画像の画素（ピクセル）それぞれにおいてスペクトルイメージングを実施する必要なしに、高質のスペクトル計測及び解析を可能にする。光学的イメージング（例えば、ＲＧＢイメージング）は試料に対して（例えば、同時にまたは別々に）実施されても良く、その光学的画像は、目的の領域を定義し位置確認をするために、選択されたスペクトル情報と組み合わせられてもよい。この目的の領域の十分な異なる位置から迅速にスペクトルを一度に得ることは、非常に効率的で正確な、スペクトル解析、及び試料中の構成要素の同定を可能にする。さらに、試料中またはＦＯＶ中の目的の領域の同定は、その試料またはＦＯＶのその部分の、より詳細なラマン散乱（または他の）解析が実施されるべきであるという合図として用いられうる。

ＦＡＳＴ分光学的及び／またはイメージング応用に多数の光学ファイバが必要であることは、イメージング分光写真器に対する並外れた必要性を生じさせ、これは多点式方法が取り組む問題である。何百万ものピクセルを有する代わりに、多点式解析は、２から何千ものファイバを含有する束状のより大きな直径のファイバを活用することができる。スペクトル計測及び解析の多点式方法においては、完全なスペクトルのイメージング（それは物理的な画像を作成するのに少なくとも何千もの隣接するピクセルを要する）は必要でない。代わりに、２から何千もの点において同時に実施されるスペクトル計測が、解析及び同定に必要な試料上の様々な点からの高質な空間分解スペクトルを、迅速に（およそ何秒で）提供することができる。ゆえに、ＦＯＶ中の解析される点の正確な幾何学的配置は不明であるものの、その点はそれでもなお、試料またはＦＯＶに広がる明確な幾何学的配置を有する。解析された点は、生体試料の病態に関して、情報価値を有しうる。

再び図２を参照し、光子は分光器３６０へと送達されうる。その分光器は、相互作用した光子を複数の波長へとフィルタ分離させるように設計されている。検出器３６５は、試料を表わす少なくとも１つのラマンデータセットを作成するように設計されうる。１つの実施形態においては、ラマンデータセットは、少なくとも１つのラマンスペクトルと少なくとも１つのラマン化学的画像とのうちの、少なくとも一方を有しうる。１つの実施形態においては、検出器３６５は、ＣＣＤ検出器、倍増型電荷結合素子（ＩＣＣＤ）検出器、ＩｎＧａＡｓ検出器、インジウムアンチモン化合物（ＩｎＳｂ）検出器、及びテルル化水銀カドミウム（ＭＣＴ）検出器のうちの少なくとも１つをさらに有しうる。

システム１００は、少なくとも１つの処理装置３７０をさらに有しうる。処理装置３７０は、測定ドメイン３００及び解析ドメイン４００の両者において様々な機能を実行するように機能しうる。測定ドメイン３００において、処理装置３７０は測定制御装置３７５を有してもよく、その制御装置は、データ取得及びシステム１００の較正などのシステム１００の様々な特色を制御するための、ソフトウェアを有しうる。

システム１００は、測定ドメイン３００により作成されたデータを解析するように設計された、解析ドメイン４００もまた有しうる。処理装置３７０は、解析ドメイン４００において機能し、ラマンデータを解析しうる。この解析に基づき、解析レポート４２０が作成されうる。この解析レポート４２０は、解析対象の生体試料の病態の判定を有しうる。

１つの実施形態においては、システム１００は、少なくとも１つの参照データセットを有する少なくとも１つの参照データベースをさらに有しうる。各参照データセットは、既知の病態と関連づけられる。この参照データは、処理装置３７０中に保管され、生体試料から作成されたラマンデータセットを解析するためにアクセスされうる。

図４は、本開示のシステム１００の別の１つの実施形態を例証するために提供される。図４の実施形態においては、システム１００はＦＡＳＴ装置３５５を有さず、むしろライン走査型設定を用いて作動する。ここでは、相互作用した光子は分光器３６０に直接向けられる。システム１００のその他の態様は、図２の実施形態における態様と同じでもよい。

本開示は、病態を判定するために生体試料を解析するための方法もまた規定する。１つの実施形態においては、生体試料は少なくとも１つの組織を有しうる。本開示は、この組織が、血液などの体液、または血清もしくは血漿などの組織の構成要素を有しうることを意図する。組織の構成要素を解析する際、本開示の方法は、試料からあらゆる細胞のまたはその他の残骸を取り除くため、解析の前に生体試料を処理する工程を有してもよい。体液の解析は、従来の生検手法よりも侵襲的でない、疾患を検出するメカニズムを提供する可能性を有する。

本開示の方法の１つの実施形態が、図５に例証される。そのような実施形態においては、方法５００は、工程５１０において、少なくとも複数の相互作用した光子を生成するための、生体試料の少なくとも１つの位置を照明する工程を有しうる。これらの相互作用した光子は、生体試料により散乱させられた光子、生体試料により吸収された光子、生体試料により反射された光子、及び生体試料により放射された光子のうちの少なくとも１つを有しうる。

工程５２０においては、複数の相互作用した光子が収集されうる。１つの実施形態においては、複数の相互作用した光子が、ＦＡＳＴ装置を通って分光器へと通過させられうる。別の１つの実施形態においては、ライン走査手法が使用され、複数の相互作用した光子が、ＦＡＳＴ装置を使用せずに分光器へと直接通過させられうる。いずれの実施形態においても、分光器は、複数の相互作用した光子を複数の波長へと分離するように設計されうる。

工程５３０においては、複数の相互作用した光子は、検出されて、生体試料を表わす少なくとも１つのラマンデータセットを作成しうる。本開示は、このラマンデータセットが、少なくとも１つのラマンスペクトルと少なくとも１つのラマン化学的画像とのうちの、少なくとも一方を有しうることを意図する。工程５４０においては、ラマンデータセットが、生体試料を少なくとも１つの病態と関連付けるように解析されうる。１つの実施形態においては、病態は、癌、正常、及びポリープの存在のうちの１つを有しうる。病態が癌を有する場合、生体試料を解析する工程は、癌の悪性度を少なくとも１度判定する工程をさらに有しうる。病態が正常を有する場合は、本方法は、その生体試料と関連する少なくとも１つの非癌状態を判定する工程をさらに有しうる。１つの実施形態においては、本開示は、各患者に対して経時的に複数のデータセットを作成することを意図する。そのような実施形態においては、本明細書で開示されるシステム及び方法は、患者を癌についてスクリーニングするだけでなく、また患者を再発、疾患の進行、及び寛解について監視するために、生体試料を解析することに活用されうる。

本開示は、生体試料の構成要素をもう１つ評価することにより、病態の判定が達成されうることを意図する。測定されうる構成要素の例は、化学物質、生物毒素、微生物、バクテリア、原生動物、ウィルス、タンパク質、フラボノイド、ケラチノイド、代謝物質、酵素、電解質、核酸、及びこれらの組み合わせを含むが、これに限定されない。生体試料中のタンパク質の立体構造（規則的または不規則）もまた、解析されうる。

測定されうる代謝物質の例は、ＴＣＡサイクル関連代謝物質（コハク酸、イソクエン酸、クエン酸）、トリプトファン代謝関連代謝物質（５−ヒドロキシトリプトファン、５−ヒドロキシインドール酢酸、トリプトファン）、腸内細菌叢代謝関連代謝物質（２−ヒドロキシ馬尿酸、フェニル酢酸、フェニルアセチルグルタミン、ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸、ｐ−クレゾール）、及びその他の代謝物質（５−オキソプロリン、Ｎ−アセチル−アスパテム、３メチル−ヒスチジン、ヒスチジン、ミリスチン酸、プトレシン、キヌレン酸）を含むが、これに限定されない。解析されうる核酸の例は、ＳＥＰＴ９メチル化ＤＮＡ、非特異的ＲＮＡ ＳＥＲＳ、分泌及び細胞表面遺伝子を含むが、これに限定されない。測定されうるその他の解析対象物は、ＣＥＡ、ＣＡ−１９、Ｅ−セレクチン、ヌクレオソーム、及びこれらの混合物を含むが、これに限定されない。１つの実施形態においては、本開示は、生体試料中に存在する血清タンパク質を調節するトレースレベルの解析対象物を解析する工程を規定する。

１つの実施形態においては、生体試料を解析する工程５４０は、図５Ｂに示される工程をさらに有しうる。そのような実施形態においては、解析する工程５４０は、工程５４０ａにおいて器械応答補正を適用する工程を有しうる。１つの実施形態においては、器械応答補正が、不整列のスペクトルを整列させる少なくとも１つの較正移動機能をさらに有しうる。

較正移動機能は、少なくとも１つの生体試料を表わす２つまたはそれより多いスペクトルデータセットを作成する工程を有しうる。較正移動を決定するためには、スペクトル上の基準点が、両セットのスペクトルに共通な点となるように選択される。本明細書で開示されるように、器械及び／または試料の違いにより、異なるデータ集団間に非線形スペクトルシフトが存在しうる。１つの実施形態においては、１００２ｃｍ^−１、１０３５ｃｍ^−１、１４５０ｃｍ^−１、及び１６７２ｃｍ^−１に対応する４つのスペクトルピークが選択されうる。しかしながら、本開示はこれらの波長には限定されず、他の波長も適用されうる。次に、スペクトルをシフトさせ引き延ばすため、これらの既知のピークを基準点として用いて、区分的線形補正がデータに適用される。１つの実施形態においては、次に、解析のためにスペクトルが単一のデータセットへと組み合わせられうる。

器械的要因は、低強度のスペクトルに干渉を引き起こす。これらの要因の排除は、わずかなラマンシグナルを示しうる。これらの要因は、標準物質の、収集されたスペクトルと経験的なスペクトルとを比較することにより除去されうる。コズミック補正及びフラットフィールド化などの、他の処理工程が適用されてもよい。コズミック事象はランダムに起こり、画像中に明るいピクセルとして見られうる。例えば、コズミック事象は、近くの隣接するピクセルを比較するメディアンフィルタを使用することにより排除されうる。フラットフィールド化は、照明されたＦＯＶ中のシグナルの均一性を改善するために用いられうる工程である。これは、標準的な均一な物質全体の照明パターンを測定し、次いでこのパターンを試料画像から抽出することにより、実行されうる。

再び図５Ｂを参照して、スペクトルは処理されてもよい。これは、スペクトル短縮化５４０ｂ、ベースライン補正５４０ｃ、及びベクトル正規化５４０ｄを含んでもよく、これらは当技術分野において公知である。ベースライン補正は、組織蛍光及びバックグラウンド干渉を含むいくつかの要因により影響を受けうる、変動するベースラインに起因するデータの変動性を除去する。例えば、最初の２つのスペクトルデータ点及び最後の２つのスペクトルデータ点は、ゼロのベースラインまでずらされうる。正規化は、複数のスペクトルが直接比較されうるように、複数のスペクトルを同一の強度スケール上に置く。正規化の１つの方法は、すべてのデータについて等しい、スペクトル下積算面積を与える。

解析５４０は、外れ値データ、または解析に適切でないデータ（試料採取の間違いなど）を排除する１つまたはそれより多い工程を適用する工程をさらに有しうる。工程５４０ｅにおいては、患者データから解析はずれ値スペクトルを排除するために、患者内外れ値除去がデータに適用されうる。工程５４０ｆにおいては、解析に適切でない場合は、１人の患者に関連するすべてのデータを排除するために、完全患者外れ値除去が適用されうる。

工程５４０ｇにおいては、データの教師付き分類を実施するために、少なくとも１つのアルゴリズムが適用されうる。このアルゴリズムは、支持ベクトルメカニズム（ＳＶＭ）、及び／または関連ベクトルメカニズム（ＲＶＭ）を有しうる。別の１つの実施形態においては、そのアルゴリズムは少なくとも１つの計量化学的技法を有してもよい。適用されうる計量化学的技法の例は、多変量曲線分解、主成分分析（ＣＰＡ）、ｋ平均法、バンド標的エントロピー最小化（ＢＴＥＭ）法、適応部分空間検出器、コサイン相関解析、ユークリッド距離解析、部分最小二乗回帰、スペクトル混合分解、スペクトル角マッパー法、スペクトル情報発散法、マハラノビス距離法、及びスペクトル非混合を含むが、これに限定されない。

１つの実施形態においては、計量化学的技法は、部分最小二乗判別解析（ＰＬＳＤＡ）を有しうる。ＰＬＳＤＡからの予測値は、通常ゼロと１との間の値であり、１はクラス内に帰属することを示し、ゼロはクラス内に非帰属であることを示す。

１つの実施形態においては、「患者一人抜き」（ＬＯＰＯ）交差検証を用いて、全ての試料が試験されるまで、モデルが繰り返し構築されうる。結果をさらに解析するため、ＲＯＣ曲線が作成されうる。ＲＯＣ曲線は、感度及び特異性のプロット図であり、感度及び特異性を最大化する閾値スコアを選択するための検定として使用されうる。

部分最小二乗（ＰＬＳ）要素の選択は、ＰＬＳＤＡモデルの構築／評価工程において重要な工程である。ＰＬＳ要素を多く保持しすぎると、系統的ノイズ源を含みうる、クラス／スペクトルデータの過剰適合を引き起こす。保持するＰＬＳ要素が少なすぎると、クラス／スペクトルデータの適合不足を引き起こす。ＰＬＳ要素の最適な選択のためには、一般に混同行列が性能指数（ＦＯＭ）として用いられる。ＰＬＳＤＡモデルについての誤分類率は、保持されるＰＬＳ要素の関数として評価される。誤分類率は、重要なパラメータではあるが、モデル性能の基礎である最終的なＲＯＣ曲線をあまり説明しない。本方法は、ＰＬＳ要素の最適な選択のために、ＲＯＣ下面積（ＡＵＲＯＣ）並びに理想的なセンサまでの最小距離などの、ＲＯＣ曲線からのパラメータに基づく、代替的なＦＯＭを用いる。現在ＲＯＣ曲線は要素の選択には使用されていないため、本手法は既存技術の限界を克服する。伝統的にはＲＯＣ曲線は、モデルを構築するためにパラメータを選択するためではなく、モデルの性能を判定するために、評価工程の最後に作成される。

再び図５Ｂを参照して、工程５４０ｈにおいては試料解析レポートが作成されうる。この解析レポートは、処理装置３７０のＲＡＣＣ試料解析４１０機能により、解析ドメイン４００中で作動しながら、作成されうる。解析レポートは、病態の判定、癌の悪性度、または生体試料の解析から導かれる他の結論を有しうる。

工程５４０ｈにおいて作成された解析レポートはまた、解析対象の生体試料を表わすＲＡＣＣ指標も有しうる。ここで、生体試料を解析する工程５４０は、各生体試料に対してＲＡＣＣ指標を計算する工程をさらに有しうる。このＲＡＣＣ指標は、癌についてのスコアを表し、また少なくとも１つのアルゴリズムを適用することにより算出されうる。試料のクラス帰属（例えば、癌または正常）を予測するためには、閾値が訓練データから決定される必要がある。閾値より大きいＲＡＣＣ指標を有する試料は癌と分類され、閾値より小さいＲＡＣＣ指標を有するあらゆる試料は正常と分類されることになる。その閾値は、訓練データを処理することにより作成されたＲＯＣ曲線上の最適な操作点に相当する。それは、分類子の性能が理想的なセンサに可能な限り近くなるように選択される。理想的なセンサは、１００％の感度、１００％に等しい特異性、ＡＵＲＯＣ１．０を有し、ＲＯＣプロット図の左上端により表わされる。最適な操作点を選択するために、観察されたＲＡＣＣ指標値にわたって閾値が掃引される。真の陽性、真の陰性、擬陽性、及び偽陰性の分類は各閾値において計算され、感度及び特異性の結果を与える。最適な操作点とは、理想的なセンサからの最小距離であるＲＯＣ曲線上の点である。この感度及び特異性に対応する閾値が、モデルの閾値として選択される。あるいは、閾値は、大津法などのクラスタ法を用いることにより計算されうる。訓練データからＲＡＣＣ指標を用いてヒストグラムが推定されても良く、大津法はヒストグラムを２つの部分またはクラスに分割する。

１つの実施形態においては、方法５００は、ラマン以外の様式を用いて、生体試料を表わす少なくとも１つのさらなる分光学的及び／またはイメージングデータセットを作成する工程をさらに有しうる。例えば、方法５００は、生体試料を表わす少なくとも１つのＲＧＢ画像を作成する工程をさらに有しうる。このＲＧＢ画像は、試料内の目的の位置及び／または特色を評価するために使用されうる。そのＲＧＢ画像はまた、ラマンデータセットと相関させられてもよい。

ラマンデータセットをＲＧＢ画像で補足増強する工程に加え、本開示はまた、方法５００が、データ融合を適用する工程をさらに有しうることも意図する。そのような実施形態においては、データを補足増強し、かつ病態を判定するために生体試料を解析するために、他の分光学的及び／またはイメージング技法がラマンデータと組み合わせられてもよい。

例えば、データ融合を実行するための１つの選択肢は、ラマン及び蛍光様式の両方を使用し、画像加重ベイズ融合（ＩＷＢＦ）などの方法を用いて各センサからのスコアを融合することである。１つの実施形態においては、検出閾値が全ての真の陽性ピクセルを見つけるように設定された場合に、融合された検出画像中の擬陽性ピクセルの数を最小化した加重値のセットを見つけるために、モンテカルロ法が用いられうる。それらの項はまた、線形回帰、ニューラルネットワーク、ファジー理論などの他の方法を用いても組み合わせられうる。

融合は、しばしば、より優れた識別性能を提供し、スコア分布の向上を可能にする。融合は、個々のセンサからの結果よりも小さい値域及び分散を有する分布を生成しうる。２つのクラスを識別するために選択された閾値は、クラス内のスコア分布に大いに依存するため、これは有益でありうる。クラス内のスコア分布が密であるほど、またクラス間の差が大きいほど、モデルの性能はいっそう優れることになる。

センサ融合を活用する実施形態においては、図２及び４に例証されるシステムの実施形態は、異なる分光学的及び／またはイメージング様式を用いるデータ作成を可能にする、追加の構成要素を許容するように変更されうる。例えば、蛍光データがラマンデータに融合させられる実施形態においては、追加の構成要素は、照明光子を生体試料に向けるため、また相互作用した光子を適切な検出器に向けるために、蛍光光源、並びに１つまたはそれより多い二色性のミラー及び／またはビームスプリッタを有しうる。１つの実施形態においては、ＦＡＳＴ装置にかつ／または分光器に向けられる前に、相互作用した光子をフィルタにかけるため、レイリー除去フィルタが用いられうる。本開示はまた、他のフィルタが用いられうることも意図する。

データ融合のための潜在的なシステム構成をさらに例証するために、図６Ａ及び６Ｂが提供される。図６Ａ及び６Ｂは、図２及び４におけるシステムをさらに向上させることを意図し、同じまたは類似の要素に言及するためには、同じ参照文字が用いられる。図６Ａにおいては、１つの分光器３６０及び１つの検出器３６５が使用される。ここでは、追加の照明光源である蛍光光源３２６が、例えばウェルプレート２３０中などの、試料の少なくとも１つの位置を照明するために提供される。生成された相互作用した光子は、収集光学系２４０を通過させられ、少なくとも１つの二色性ミラー／ビームスプリッタ３３６により、レイリー除去フィルタ３５１を通って、ＦＡＳＴ装置３５５の二次元端３５６へと向けられうる。この実施形態においては、分光器３６０は、分光格子分光器を有しうる。分光格子分光器３６０は、３６７により、より詳細に例証される。光子は、分光器３６０により複数の波長へと分離され、また検出器３６５に検出されてラマンデータセットと蛍光データセットの両方を作成しうる。ここで、その蛍光データセットは、少なくとも１つの蛍光スペクトルと少なくとも１つの蛍光化学的画像とのうち、少なくとも一方を有しうる。典型的な検出器画像は３８０により例証され、代表的なラマン及び蛍光スペクトルは３９０及び３９１により例証される。

ラマン／蛍光データ融合を利用する別の１つの実施形態が、図６Ｂに例証される。ここでは、２つの別々の分光器３６０及び３６１が、ＦＡＳＴ装置３５５の一次元端３５７から、相互作用した光子を受け取るように設計される。各分光器は相互作用した光子を複数の波長へとフィルタ分離し、２つの分光器３６５及び３６６はこれらの光子を検出するように設計されうる。一方の検出器３６５はラマンデータセットを作成するように設計され、他方の検出器３６６は蛍光データセットを作成するように設計されうる。典型的な検出器画像は、３８０及び３８１により例証される。典型的なラマンスペクトルは３９０により例証され、代表的な蛍光スペクトルは３９１により例証される。

本明細書において既に論じられたシステム及び方法の実施形態に加え、本開示はまた、機械可読なプログラムコードを含有する非一過性の記録媒体をも規定する。１つの実施形態においては、機械可読なプログラムコードを含有するこの非一過性の記録媒体は、処理装置により実行されると処理装置に以下を実施させる。少なくとも複数の相互作用した光子を生成するために生体試料の少なくとも１つの位置を照明させ、複数の相互作用した光子を収集させ、複数の相互作用した光子を検出させ、生体試料を表わす少なくとも１つのラマンデータセットを作成させ、かつ生体試料を少なくとも１つの病態と関連づけるためにラマンデータセットを解析させる。１つの実施形態においては、その記録媒体は、処理装置により実行されると、相互作用した光子のＦＡＳＴ装置の通過を、処理装置にさらに引き起こさせる。

図７−１７は、生体試料の病態を判定するための、本開示の検出能力を例証するために提供される。患者から採取されたヒトの血液試料が、冷凍貯蔵から取り出され、約１時間かけて室温にて解凍された。試料は約１５秒間ボルテックスされた。ヒト血清２．５マイクロリットルが、マイクロピペッタにより、アルミニウムで被覆された顕微鏡用スライドガラス上に滴下され、約１８−２０時間かけて乾燥させられた。

図７Ａは、顕微鏡用スライドガラスを利用した典型的な試料調製を例証する。しかしながら、図７Ｂに例証されるように、本開示は、試料を入れるのに、９６ウェルプレートもまた使用されうることも意図する。なお、陽性及び陰性対照の両者に加え、各試料（患者）の２連が使用されたことに留意する。

図８Ａは、本開示の検出能力を例証する。ＲＡＣＣ指標スコアが各試料について算出され、ＲＡＣＣ識別プロット図上にプロットされた。対応するＲＯＣ曲線（図８Ｂ）に基づき、最適な操作点の決定に閾値が適用された。プロット図から分かるように、プロット図上での位置に基づき、試料は病態と関連づけられることができた。閾値より低い値となる試料は、正常と分類された。閾値より高い値をとる試料は、ＣＲＣまたはポリープ（潜在的な前駆状態）の存在のいずれかに分類された。ＣＲＣと判定された試料については、ＲＡＣＣ指標に基づき、癌の悪性度が特定されうる。試料の癌ステージの判定は、図８Ｃ中により詳細に例証され、各プロット図は各ステージに属する試料についての平均値及び標準偏差を表わす。

図９Ａ及び９Ｂは、本開示の検出能力をさらに例証し、また別の実験の結果を示すために提供される。ここでは、１１個のＣＲＣ試料及び２１個の正常試料がＳＶＭを用いて解析された。図９Ｂのプロット図に例証されるデータに適用する閾値を選択するためには、ＲＯＣ曲線（図９Ａ）が使用された。図９Ｂから分かるように、ＣＲＣ試料は正常試料から識別された。

図１０は、図９Ａ及び９Ｂのデータにより表される試料の、ＳＶＭ解析を用いた高解像度ラマン画像を例証する。図１０は、解析された集団からの２つの試料を例証し、１つは正常試料を代表し、１つはＣＲＣ試料を代表する。各患者（試料）についてのハイパーキューブデータが、２セットのデータに対して解析された。１セットはＣＲＣに対応し、１セットは正常に対応する。画像は、ＣＲＣまたは正常試料のいずれかを有する各試料について、各ピクセルにおけるＲＡＣＣ指標を例証する。画像における違いから分かるように、ＣＲＣ及び正常スコアの画像は、患者を癌についてスクリーニングするために生体試料を解析する可能性を有する。

図１１Ａ及び１１Ｂは、図１０の液滴を表わすスペクトルデータを例証する。図１１Ａは、ＣＲＣ及び正常試料の両者についての平均クラススペクトルを例証する。スペクトルの違いは明確であり、ラマン分光法の癌スクリーニングを補助する能力を示す。図１１Ｂは、ＣＲＣ試料についてのＶＩＰスコアを例証する。ＶＩＰは、モデルに用いられる投影における各変数の重要度を推定し、変数の選択のためにしばしば使用される。１（一）に近いまたはより大きいＶＩＰスコアを有する変数は、与えられたモデルにおいて重要であるとみなされうる。１つの実施形態においては、教師付き分類モデルにおいて識別力を支配するスペクトル特徴が、評価される波長の数を減らすのに使用されうる（重要なもののみ計量化学的／教師あり学習モデルに入力する）。スペクトル特徴の例は、約５０２ｃｍ^−１、約５２４ｃｍ^−１、約５４０ｃｍ^−１、約５５９ｃｍ^−１、約８５０ｃｍ^−１、約９９２ｃｍ^−１、約９９９ｃｍ^−１、約１０１０ｃｍ^−１、約１２１３ｃｍ^−１、約１２７４ｃｍ^−１を含みうるが、これに限定されない。

図１２Ａ及び１２Ｂは、本開示により意図される多点式試料採取の手法を実施することの、潜在的な有益性を例証する。図１２Ａは、格子型の試料採取を例証する。ＲＡＣＣ指標プロット図から分かるように、この試料採取手法を用いてデータが作成された場合、ＣＲＣ試料及び正常試料は容易に識別された。同様に、図１２Ｂにおいては、リング試料採取手法を用いてデータが作成された場合、ＣＲＣ試料は容易に正常試料から識別された。本開示の方法は、試料の外輪部（スポットの中心と外周との間）の試料採取を可能にすることにより、既存技術の限界を克服しうる。本実施形態は、液滴被覆沈着ラマン（ＤＣＤＲ）などの他の技法から区別されうる。ＤＣＤＲは、低濃度のタンパク質を有する試料において、ラマン検出を改善するために使用されうる方法である。その方法は、溶液中のタンパク質の疎水性表面上への沈着を有し、それは（Ｔｉｅｎｔａ基材などの）疎水性物質の薄層を用いて調製される。溶媒が（乾燥により）除去されると、試料中の乾燥したタンパク質は、試料の外縁（試料の外周）において局所的に濃縮されうる。これに対し、本開示は、高濃度のタンパク質を含有する試料の使用を規定する。本方法は、無試薬で、ＤＣＤＲとは異なり、溶液で試料を処理することを必要としない。また、図３Ｂ及び１２Ａにより例証されるように、本開示は、試料の外周を試料採取することに限定されず、試料の中心部分から得られるデータを使用してＣＲＣ及び正常試料間を識別する可能性を有する。

図１２Ｃは、図１２Ａ及び１２Ｂの試料採取手法に関する統計学的データを例証するために提供される。ヒストグラムは訓練データからのＲＡＣＣ指標を用いて算出され、大津法はヒストグラムを２つの部分またはクラス（平均値の差）に分割する。リング試料採取手法は、クラス平均値間のより大きい差を提供すること、及びクラス標準偏差を減少させることにより、その方法の統計を向上させた。

図１３Ａ−１３Ｂ及び図１４は、複数の様式からのデータを融合する、本開示の能力を例証するために提供される。図１３Ａ及び１３Ｂは、それぞれ、ＣＲＣ患者及び正常患者の蛍光画像を表わす。１つの実施形態においては、患者についてのラマンスペクトルに適用されるＳＶＭから算出されるＲＡＣＣ指標が、同じ患者についての蛍光スペクトルに適用されるＳＶＭから算出されるＲＡＣＣ指標と融合させられた。融合はＩＷＢＦを用いて実施された。融合された結果は、ＲＡＣＣ指標分布を向上させた。この実施例においては、融合は、蛍光データにおけるＣＲＣ試料についてのＲＡＣＣ指標の分布が小さいことを利用して、ラマンデータにおけるＣＲＣについてのＲＡＣＣ指標の分布を向上させた。正常試料についても同様に、融合は、蛍光試料のＲＡＣＣ指標を向上させ、ラマンデータにおけるＲＡＣＣ指標の分布が密であることを利用した。データ融合の結果は、図１４に例証される。図から分かるように、複数の分光学的モデルからのデータが、いずれの様式単独でよりも強固なデータセットを提供するために用いられうる。

本明細書において論じられるように、本開示は、１つの実施形態において、生体試料の病態を判定するために多くのスペクトル特徴が評価されうることを意図する。図１５−１８は、試料がＣＲＣを有するかを判定する際の少なくとも主要な一要素として、タンパク質の立体構造が評価される、本開示の実施形態をさらに例証するために提供される。例えば図１５は、代表的なデータについて、ＣＲＣ及び正常血清試料に関連づけられる、平均ラマンスペクトルを例証する。ラマンスペクトルは、血清タンパク質からの散乱を、主要な分子的部分として示す。ラマン分光法はタンパク質立体構造の検出ができることを証明してきたが、ＣＲＣ及び正常血清試料間の識別の根拠は、１つまたはそれより多い非常に豊富に存在する血清タンパク質の立体構造の変化から主に生じる。図１６は、血清タンパク質立体構造を示す、血清ラマンスペクトル中に観察することができる、いくつかのラマンスペクトル特徴を要約する。これらのスペクトル特徴においては、同定された波数（ｃｍ^−１）位置はスペクトル特徴のおおよその重心に対応し、そのスペクトル特徴の解析は、ＣＲＣ血清試料が、正常血清試料に比べて、ランダムコイルのタンパク質立体構造を多く含有することを示唆する。具体的には、ＣＲＣラマンスペクトルは１６６０．６ｃｍ^−１を中心とした肩バンドの増加を立証し、これはアミドＩピークの重心（ＣＯＭ）の増加として測定されることができ、ランダムコイルのタンパク質立体構造の増加を示すものである。

これに比べ、正常ラマンスペクトルは１６６０．３ｃｍ^−１にまで減少したＣＯＭを立証し、これはより規則正しいα−ヘリックスのタンパク質立体構造を示す。ＣＲＣスペクトルにおいてはランダムコイルタンパク質立体構造がより多く、正常スペクトルにおいてはα−ヘリックスのタンパク質立体構造がより多いという、一般的傾向を示す他の観測可能な変化は、（１）正常スペクトルにおける１２６３ｃｍ^−１（アミドＩＩＩスペクトル特徴）での増加、（２）正常スペクトルにおける９４１ｃｍ^−１（ポリペプチド骨格Ｃ−Ｃ伸縮スペクトル特徴）での増加、及び（３）ＣＲＣスペクトルにおける８５７／８２７ｃｍ^−１二重項比（チロシンフェルミ共鳴二重項）の増加を含む。図１７は、これらの試料について算出されたＶＩＰスコアを例証する。

図１８Ａは、アミド１ピークＣＯＭに関連するＲＣＩデータを例証する。アミド１振動は、主に（約８０％）Ｃ＝Ｏ伸縮モードの結果であり、これに加えＣ−Ｎ伸縮、及びＣα−ＣＮ変形からのわずかな寄与がある。それは、タンパク質二次構造にも影響を受けやすい。図１８Ｂは、ＣＲＣスペクトル及び正常スペクトル間の違いを例証する、これらの試料からのスペクトルデータを例証する。この違いは、ランダムコイルの立体構造を示し、またＣＲＣ試料及び正常試料間を識別するために使用されうる。

本開示はその特定の実施形態を参考にして詳細に開示されてきたが、当業者には、その実施形態の真髄及び範囲から逸れることなく、実施形態に様々な変更及び修正がなされうることが明らかであるだろう。ゆえに、本開示が、本開示の修正形及び変形物を、それらが添付の特許請求の範囲及びその同等物の範囲内におさまるならば、網羅することが意図される。

Claims (44)

1. 複数の相互作用した光子を生成するために、一滴の体液である生体試料の少なくとも１つの位置を照明する工程と、
   複数の収集した光子を生成するために、前記複数の相互作用した光子を収集する工程と、
   複数の波長を有する複数の光子を生成するために、ファイバアレイスペクトル変換系装置に前記収集した光子を通過させる工程であって、前記ファイバアレイスペクトル変換系装置は、一次元ファイバ堆積へと引き解かれる光学ファイバの二次元アレイを有し、前記ファイバアレイスペクトル変換系装置は、前記ファイバの二次元アレイで前記複数の収集した光子を受け取るように、かつ前記複数の収集した光子を線状配置に変換するように設計されている、前記通過させる工程と、
   前記線状配置の前記複数の収集した光子を検出し、一滴の体液である前記生体試料を表わす少なくとも１つのラマンデータセットを作成する工程と、
   一滴の体液である前記生体試料を少なくとも１つの病態と関連づけるために、前記ラマンデータセットを解析する工程であって、前記ラマンデータセットを解析する工程は、一滴の体液である前記生体試料上のリング型試料採取の配置で行われる、前記解析する工程と、
   を有する、方法。
2. 請求項１記載の方法において、前記一滴の体液は、１またはそれ以上の尿、唾液、痰、糞便、血液、血清、血漿、粘液、膿、精液、傷から出る液体、洗浄液、脳脊髄液、または膣液を有する、方法。
3. 請求項１記載の方法において、一滴の体液である前記生体試料が、組織の少なくとも１つの構成要素を有する、方法。
4. 請求項３記載の方法において、前記一滴の体液は、１またはそれ以上の血清及び血漿である、方法。
5. 請求項１記載の方法において、前記照明する工程が、さらに、一滴の体液である前記生体試料の複数の位置を照明する工程を有する、方法。
6. 請求項５記載の方法において、前記複数の位置が、構造化照明によって照明される、方法。
7. 請求項５記載の方法において、前記複数の位置が、幾何学的関係を有する、方法。
8. 請求項５記載の方法において、前記複数の位置が線状に配置される、方法。
9. 請求項１記載の方法において、前記照明する工程が、広視野照明を使用して達成される、方法。
10. 請求項１記載の方法において、前記病態が、癌を有する、方法。
11. 請求項１０記載の方法において、前記癌は、早期の癌である、方法。
12. 請求項１０記載の方法において、前記癌が大腸癌を有する、方法。
13. 請求項１記載の方法において、前記照明する工程が赤外レーザーを使用することによって達成される、方法。
14. 請求項１３記載の方法において、前記赤外レーザーが７８５ｎｍレーザーを有する、方法。
15. 請求項１記載の方法において、前記ラマンデータセットが少なくとも１つのラマンスペクトルを有する、方法。
16. 請求項１記載の方法において、前記ラマンデータセットが少なくとも１つのラマン化学的画像を有する、方法。
17. 請求項１記載の方法において、解析する工程がさらに、少なくとも１つのアルゴリズム技法を適用する工程を有する、方法。
18. 請求項１７記載の方法において、前記アルゴリズム技法が少なくとも１つの計量化学的技法を有する、方法。
19. 請求項１８記載の方法において、前記計量化学的技法が、多変量曲線分解、主成分分析、ｋ平均法、バンド標的エントロピー法、適応部分空間検出器、コサイン相関解析、ユークリッド距離解析、部分最小二乗回帰、スペクトル混合分解、スペクトル角マッパー法、スペクトル情報発散法、マハラノビス距離法、及びスペクトル非混合のうちの少なくとも１つを有する、方法。
20. 請求項１８記載の方法において、前記計量化学的技法が部分最小二乗判別解析を有する、方法。
21. 請求項１記載の方法であって、さらに、一滴の体液である前記生体試料を表わす少なくとも１つのＲＧＢ画像を作成する工程を有する、方法。
22. 請求項２１記載の方法であって、さらに、前記ＲＧＢ画像と前記ラマンデータセットとを融合する工程を有する、方法。
23. 請求項１記載の方法において、前記ラマンデータセットを解析する工程が、完全患者外れ値除去および患者内外れ値除去のうちの少なくとも一方を適用する工程を有する、方法。
24. 請求項１記載の方法において、前記ラマンデータセットを解析する工程が、少なくとも１つの較正移動機能を適用する工程を有し、前記較正移動機能はさらに区分的線形関数を有する、方法。
25. 請求項１記載の方法において、前記ラマンデータセットを解析する工程が、一滴の体液である前記生体試料のタンパク質立体構造を評価する工程を有する、方法。
26. 請求項２５記載の方法であって、さらに、前記タンパク質立体構造を評価するために少なくとも１つの目的のスペクトル特徴を評価する工程を有し、前記スペクトル特徴が、さらに、約１６６０ｃｍ^−１の波長、約９４１ｃｍ^−１の波長、約１２３０ｃｍ^−１〜１３００ｃｍ^−１の波長範囲、及び約８５７ｃｍ^−１／８２７ｃｍ^−１の波長比のうちの少なくとも１つを有する、方法。
27. 少なくとも１つの複数の相互作用した光子を生成するために、一滴の体液である生体試料の少なくとも１つの位置を照明するように設計された照明光源と、
    前記複数の相互作用した光子に向けるように設計された少なくとも１つのミラーと、
    一次元ファイバ堆積へと引き解かれる光学ファイバの二次元アレイを有するファイバアレイスペクトル変換系装置であって、前記ファイバアレイスペクトル変換系装置は、前記ファイバの二次元アレイで前記複数の相互作用した光子を受け取るように、かつ前記複数の相互作用した光子を線状配置に変換するように設計されている、前記ファイバアレイスペクトル変換系装置と、
    前記ファイバアレイスペクトル変換系装置から前記線状配置の前記複数の相互作用した光子を光学的に受け取り、かつ前記複数の相互作用した光子を、複数の波長を有する複数のフィルタ分離された光子へとフィルタ分離するように設計された分光器と、
    前記複数のフィルタ分離した光子を検出し、かつ一滴の体液である前記生体試料を表わす少なくとも１つのラマンデータセットを作成するように設計された少なくとも１つの検出器と、
    リング型の配置で一滴の体液である前記生体試料上の前記ラマンデータセットを解析することによって病態を同定するように設計された少なくとも１つの処理装置と
    を有する、システム。
28. 請求項２７記載のシステムにおいて、前記照明光源が赤外レーザーを有する、システム。
29. 請求項２８記載のシステムにおいて、前記赤外レーザーが７８５ｎｍレーザーを有する、システム。
30. 請求項２７記載のシステムにおいて、前記検出器が、ＣＣＤ検出器、ＩＣＣＤ検出器、ＩｎＧａＡｓ検出器、ＩｎＳｂ検出器、及びＭＣＴ検出器のうちの少なくとも１つを有する、システム。
31. 請求項２７記載のシステムであって、さらに、一滴の体液である前記生体試料を表わす少なくとも１つのＲＧＢ画像を作成するように設計されたＲＧＢ検出器を有する、システム。
32. 請求項３１記載のシステムであって、さらに、前記相互作用した光子を前記ＲＧＢ検出器へと向けるように設計された少なくとも１つの第２のミラーを有する、システム。
33. 請求項２７記載のシステムであって、さらに、一滴の体液である生物試料を保持するために設計されたステージを有する、システム。
34. 請求項２７記載のシステムであって、さらに、少なくとも１つの参照データセットを有し、前記参照データセットは、少なくとも１つの既知の病態と関連付けられる、システム。
35. 請求項３４記載のシステムにおいて、前記既知の病態が、癌を有する、システム。
36. 請求項２７記載のシステムにおいて、前記ラマンデータセットが少なくとも１つのラマンスペクトルを有する、システム。
37. 請求項２７記載のシステムにおいて、前記ラマンデータセットが少なくとも１つのラマン化学的画像を有する、システム。
38. 請求項２７記載のシステムにおいて、前記照明光源が、さらに、広視野照明を用いて一滴の体液である前記生体試料を照明するように設計されている、システム。
39. 請求項２７記載のシステムにおいて、前記照明光源が、さらに、一滴の体液である前記生体試料を複数の点において照明するように設計されている、システム。
40. 請求項３９記載のシステムにおいて、前記複数の点が線状に配置される、システム。
41. 請求項２７記載のシステムにおいて、前記照明光源が、さらに、構造化照明を用いて一滴の体液である前記生体試料を照明するために設計されている、システム。
42. 請求項２７記載のシステムにおいて、前記処理装置が、さらに、少なくとも１つのアルゴリズム技法を適用することによって前記ラマンデータセットを解析するように設計されている、システム。
43. 請求項４２記載のシステムにおいて、前記解析が、さらに、前記ラマンデータセットを少なくとも１つの参照データセットと比較することを有する、システム。
44. 機械可読なプログラムコードを含有する非一過性記録媒体であって、処理装置によって実行される際に、当該処理装置に、
    複数の相互作用した光子を生成するために、一滴の体液である生体試料の少なくとも１つの位置を照明光源によって照明させ、
    前記複数の相互作用した光子を収集装置によって収集させ、
    複数の収集した光子を前記収集装置によって生成させ、
    ファイバアレイスペクトル変換系装置によって、光学ファイバの二次元アレイで前記複数の収集した光子を受け取り、かつ前記複数の収集した光子を一次元ファイバ堆積で線状配置に変換させ、
    前記線状配置の前記複数の収集した光子を検出器によって検出させ、一滴の体液である前記生体試料を表わす少なくとも１つのラマンデータセットを作成させ、かつ
    前記生体試料を少なくとも１つの病態と関連付けるために、前記ラマンデータセットを解析させ、前記ラマンデータセットの解析は、一滴の体液である前記生体試料上のリング型試料採取の配置で行われる、
    記録媒体。

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