JP6890830B2 - Ｃｔｌａ−４アンタゴニストによる、免疫応答の増強方法 - Google Patents

Description

本願は、２０１５年５月１日に提出された米国特許仮出願第６２／１５５，９５９号に基づく利益を主張するものであり、この仮出願の全体は、参照により、本明細書に援用される。

配列表の援用
２０１６年４月１９日に作成された、１ＫＢ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）で測定した場合）の「ＢＡＣＭＰ０００５ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称のファイルに含まれている配列表は、本明細書とともに電子申請によって提出し、参照により、本明細書に援用する。

本発明は広くは、分子生物学、免疫学及び医学の分野に関するものである。より詳細には、本発明は、免疫応答の増強方法に関するものである。

細胞障害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）は、マウスにおいてもヒトにおいても、Ｔ細胞免疫の重要な制御因子であり（Ｋｒｕｍｍｅｌ ａｎｄ Ａｌｌｉｓｏｎ，１９９５）、ＣＴＬＡ−４が非常に重要であることは、出生後の期間に広範囲リンパ増殖症及び自己免疫により死亡したホモ接合ヌル変異体の驚くべき表現型によって初めて示された（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５、Ｔｉｖｏｌ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。最近の報告でも、ヒトＣＴＬＡ−４のヘテロ接合変異により、常染色体優性免疫調節異常症候群を発症し得ることが示され、免疫ホメオスタシスの維持におけるＣＴＬＡ−４の重要な役割が浮き彫りになっている（Ｓｃｈｕｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０１４、Ｋｕｅｈｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ヒトのがん患者では、ＣＴＬＡ−４の非特異的拮抗作用により、進行がん、最も顕著にはメラノーマが、免疫の介在で治癒されるに至っている（Ｈｏｄｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。ＣＴＬＡ−４は、複雑かつ議論を招く生物学的特性を呈しており、様々な選択的スプライシングアイソフォームに起因する機能が数種類仮定されている。この分子は、Ｂ７（ＣＤ８０及びＣＤ８６）に高い親和性で結合する細胞外ドメインと、疎水性膜貫通ドメインと、細胞内細胞質尾部とからなる。ＣＴＬＡ−４の機能に関する現在の理解は大まかには、細胞内経路と細胞外経路に分けることができる（Ｗｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。細胞外機能は、トランスエンドサイトーシスによって、ＡＰＣの表面からＢ７を枯渇させることによって機能するようであるが、ＤＣにおける負のシグナル伝達の誘導も伴うとみられる（Ｑｕｒｅｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１、Ｄｅｊｅａｎ ｅｔ ａｌ．，２００９、Ｇｒｏｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２００２）。細胞内機能は、免疫ホメオスタシスに対する重要性は低いと考えられている。ＣＴＬＡ−４の十分な細胞を含む骨髄キメラにおけるＣＴＬＡ−４欠損細胞は、超活性化されず、そのうえ、その細胞質尾部のＹＶＫＭモチーフに、負に制御するフォスファターゼＳＨＰ−２及びＰＰＡ２を動員することによって、エフェクターＴ細胞の機能制御で重要な役割を果たす可能性が高いからである。ＣＴＬＡ−４は、胸腺選択の際に、免疫シナプスにおけるシグナル強度を定めることによって、中枢性トレランスにおいて役割を果たすとも考えられてもいる（Ｗｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１１、Ｑｕｒｅｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１、Ｋｏｗａｌｃｚｙｋ ｅｔ ａｌ．，２０１４、Ｇａｒｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１４、Ｗｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８）。自己免疫疾患患者の血清で見られることの多い可溶性アイソフォームが存在することも報告されているが、このアイソフォームの正確な機能は、まだ明確にはなっていない（Ｅｓｐｏｓｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１４、Ｄａｒｏｓｚｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ，２００９、Ｐｕｒｏｈｉｔ ｅｔ ａｌ，２００５、Ｏａｋｓ ａｎｄ Ｈａｌｌｅｔｔ，２０００）。ごく最近のデータにより、無細胞血清で検出された可溶性ＣＴＬＡ−４の大半は実際には、分泌された微小胞中間体の細胞膜に結合した完全長ＣＴＬＡ−４であり得ることが暗示されている（Ｅｓｐｏｓｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。
ＣＴＬＡ−４がその抑制活性を発揮するメカニズムの詳細は、実質的に議論を呼ぶ部分であるが、その発現パターンについては、議論の余地が大幅に小さくなっている。ＣＴＬＡ−４は、リンパ球系統に特異的な発現パターンを呈すると考えられており、研究報告書には、調節性Ｔ細胞（Ｒｅａｄ ｅｔ ａｌ，２０００）、通常の活性化Ｔ細胞（Ｌｉｎｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９２）での発現、Ｂ細胞での誘導発現（Ｋｕｉｐｅｒ ｅｔ ａｌ，１９９５）が記載されているとともに、最近では、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞での発現も報告されている（Ｓｏｊａｎｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。表面染色では概して、他の造血系統でのＣＴＬＡ−４の発現は検出されない。さらに、Ｔ細胞特異的プロモーターからＣＴＬＡ−４をトランスジェニック発現させたところ、ＣＴＬＡ−４−欠損マウスで観察される致死性の自己免疫を解除するのに十分であったことから、ＣＴＬＡ−４の重要な機能は主に、Ｔリンパ球系統に限られている可能性があることが示唆されている（Ｍａｓｔｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ，２０００）。しかしながら、ＣＴＬＡ−４の機能に関して機構学者がかなり検討してきたにもかかわらず、ＣＬＬＡ−４の機能をどのように調節して、免疫的なメリットをもたらすかは、不明なままである。

Ｋｒｕｍｍｅｌ ａｎｄ Ａｌｌｉｓｏｎ，１９９５ Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｓｃｈｕｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０１４ Ｔｉｖｏｌ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｋｕｅｈｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４ Ｈｏｄｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０ Ｗｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１１ Ｑｕｒｅｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１ Ｄｅｊｅａｎ ｅｔ ａｌ．，２００９ Ｇｒｏｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２００２ Ｋｏｗａｌｃｚｙｋ ｅｔ ａｌ．，２０１４ Ｇａｒｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１４ Ｗｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８ Ｅｓｐｏｓｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１４ Ｄａｒｏｓｚｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ，２００９ Ｐｕｒｏｈｉｔ ｅｔ ａｌ，２００５ Ｏａｋｓ ａｎｄ Ｈａｌｌｅｔｔ，２０００ Ｒｅａｄ ｅｔ ａｌ，２０００ Ｌｉｎｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｋｕｉｐｅｒ ｅｔ ａｌ，１９９５ Ｓｏｊａｎｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，２０１４ Ｍａｓｔｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ，２０００

第１の実施形態では、少なくとも第１の抗原または抗原感作樹状細胞と、ＣＴＬＡ−４アンタゴニストとを含む免疫原性組成物を提供する。さらなる実施形態では、対象の免疫応答の誘導方法であって、ＣＴＬＡ−４アンタゴニストと併せて、免疫原性組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。

いくつかの態様では、これらの実施形態に従って使用するＣＴＬＡ−４アンタゴニストは、ＣＴＬＡ−４に特異的な低分子阻害剤または阻害性核酸である。特定の態様では、この阻害性核酸はＲＮＡである。さらなる態様では、このＲＮＡは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。

さらなる態様では、ＣＴＬＡ−４アンタゴニストは、ＣＴＬＡ−４結合性抗体である。いくつかの態様では、この抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である。いくつかの態様では、ＣＴＬＡ−４結合性抗体は、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、遺伝子改変ＩｇＧアイソタイプまたはこれらの抗原結合性断片であってよい。この抗体は、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）３、一価のｓｃＦｖ、二価のｓｃＦｖ、二重特異性抗体または単一ドメイン抗体であってもよい。この抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体または脱免疫化抗体であってよい。

いくつかの態様では、これらの実施形態の免疫原性組成物は、抗原感作樹状細胞集団を含む。別の態様では、免疫原性組成物は、ポリペプチド抗原を含んでもよい。特定の態様では、免疫原性組成物は、抗原をコードする核酸を含んでもよい。特定的な態様では、この核酸は、ＤＮＡ発現ベクターである。この方法の代替的な態様では、免疫原性組成物は、ＣＴＬＡ−４アンタゴニストの前またはＣＴＬＡ−４アンタゴニストと本質的に同時に投与しても、ＣＴＬＡ−４アンタゴニストの後に投与してもよい。具体的な態様では、免疫原性組成物は、ＣＴＬＡ−４アンタゴニストの約１週間、１日、８時間、４時間、２時間または１時間以内に投与する。

本発明の実施形態の特定の態様は、免疫原性組成物に関するものである。いくつかのケースでは、この免疫原性組成物は、腫瘍細胞抗原または感染症抗原を含む。特定の態様では、免疫原性組成物は、少なくとも第１のアジュバントを含む。いくつかの態様では、対象は、疾患を罹患しているか、または疾患を罹患するリスクを有する。特定的な態様では、その疾患は、感染症またはがんである。

本発明のさらなる実施形態では、ＣＴＬＡ−４の発現を低下させるように遺伝子改変されている樹状細胞集団を提供する。いくつかの態様では、この遺伝子改変には、ＣＴＬＡ−４に特異的な外因性の阻害性核酸の導入が含まれる。特定の態様では、この阻害性核酸はＲＮＡである。さらなる態様では、このＲＮＡは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。別の態様では、遺伝子改変には、ＣＴＬＡ−４を低下させる、細胞集団におけるゲノムの欠失または挿入が含まれる。例えば、遺伝子改変には、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムを用いるゲノム編集を含めることができる。具体的な態様では、この細胞集団は、ＣＴＬＡ−４遺伝子内にヘミ接合欠失を含む。

さらなる実施形態では、本発明は、対象における免疫応答の誘導方法であって、上記の実施形態と態様による細胞集団を有効量投与することを含む方法を提供する。この方法のいくつかの具体的な態様では、樹状細胞は、少なくとも第１の抗原で感作されている。特定の態様では、対象は、がんを罹患しており、樹状細胞は、少なくとも第１のがん細胞抗原で感作されている。別の態様では、対象は、感染症に罹患しており、樹状細胞は、少なくとも第１の感染症抗原で感作されている。

特定の態様では、本発明の組成物は、抗原感作樹状細胞を含む。別の態様では、本発明の組成物は、第１の抗原を含み、この抗原は、腫瘍細胞抗原または感染症抗原である。

本発明のさらなる実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞の培養方法であって、少なくとも第１の抗原で感作した樹状細胞集団の存在下で、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体の集団を培養することを含み、（ｉ）前記培養が、ＣＴＬＡ−４アンタゴニストの存在下であるか、または（ｉｉ）前記樹状細胞集団が、ＣＴＬＡ−４の発現を低下させるように遺伝子改変されている方法を提供する。いくつかの態様では、この方法はさらに、抗原特異的Ｔ細胞のエキソビボ拡張方法として定義されている。特定の態様では、樹状細胞集団は、初代樹状細胞を含む。さらなる態様では、前記培養は、ＣＴＬＡ−４アンタゴニストの存在下である。具体的な態様では、ＣＴＬＡ−４アンタゴニストは、ＣＴＬＡ−４に特異的な阻害性核酸である。特定の態様では、この阻害性核酸はＲＮＡである。さらなる態様では、このＲＮＡは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。別の態様では、ＣＴＬＡ−４アンタゴニストは、ＣＴＬＡ−４結合性抗体である。

この方法のさらなる態様では、前記樹状細胞集団は、ＣＴＬＡ−４の発現を低下させるように遺伝子改変されている。いくつかの態様では、この遺伝子改変には、ＣＴＬＡ−４に特異的な外因性の阻害性核酸の導入が含まれる。特定の態様では、この阻害性核酸はＲＮＡである。特定的な態様では、このＲＮＡは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。いくつかの具体的な態様では、遺伝子改変には、ＣＴＬＡ−４を低下させる、細胞集団におけるゲノムの欠失または挿入が含まれる。別の態様では、細胞集団は、ＣＴＬＡ−４遺伝子内にヘミ接合欠失またはホモ接合欠失を含む。例えば、いくつかの態様では、樹状細胞のＣＴＬＡ−４遺伝子の１つまたは両方のコピーを完全または部分的に欠失させて、ＣＴＬＡ−４ポリペプチドの発現が阻害されるようにできる。

本発明の実施形態の態様は、対象の疾患を治療するための組成物と方法に関するものである。例えば、その疾患は、感染症またはがんであることができる。いくつかの態様では、そのがんは、乳がん、肺がん、頭頸部がん、前立腺がん、食道がん、気管がん、脳腫瘍、肝臓がん、膀胱がん、胃がん、膵がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、睾丸がん、大腸がん、直腸がんまたは皮膚がんであってよい。本発明の実施形態による治療対象は、いくつかの態様では、哺乳動物の対象である。例えば、対象は、ヒトなどの霊長類動物であってよい。さらなる態様では、対象は、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヤギ、ブタまたは動物園の動物など、ヒト以外の哺乳動物である。

本発明の実施形態の特定の態様は、対象への細胞組成物または免疫原性組成物の投与に関するものである。一態様では、この組成物は、全身投与してよい。さらなる態様では、この組成物は、静脈内、経皮、腫瘍内、筋内、腹腔内、皮下または局所投与してよい。この方法はさらに、第２の療法を対象に行うことを含んでよい。例えば、いくつかの態様では、第２の療法は、抗がん療法である。第２の抗がん療法の例としては、手術療法、化学療法、放射線療法、凍結療法、ホルモン療法、免疫療法またはサイトカイン療法が挙げられるが、これらに限らない。

さらなる態様では、本発明の実施形態の方法はさらに、本発明の組成物を対象に２回以上、例えば、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１５回、２０回またはそれを上回る回数など投与することを含んでもよい。

本明細書で使用する場合、「本質的に含まない」とは、特定の成分に関しては、本明細書では、その特定の成分が、組成物に意図的には配合されていなかったり、及び／または混入物質としてもしくは微量で存在するに過ぎなかったりすることを意味するものとして用いる。したがって、組成物への意図しないいずれかの混入に起因する特定の成分の総量は、０．０５％を大きく下回り、好ましくは０．０１％を下回る。最も好ましいのは、標準的な解析方法によって、この特定の成分の量を検出できない組成物である。

本明細書と請求項で使用する場合、「ａ」または「ａｎ」は、１以上を意味してよい。本明細書と請求項で使用する場合、「ａ」または「ａｎ」という語は、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」という語と併用するときには、１または１超を意味してよい。本明細書と請求項で使用する場合、「別の」または「さらなる」とは、少なくとも第２またはそれ以降のものを意味してよい。

本明細書と請求項で使用する場合、「約」という用語は、ある値に、その値を割り出すために用いられる方法、装置に関する固有変動、または研究対象の間に存在する変動が含まれることを示す目的で用いる。

本発明のその他の目的、特徴及び利点は、下記の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、本発明の特定の実施形態を示す一方で、詳細な説明及び特定の実施例は、本発明の趣旨及び範囲の範囲内の様々な変更及び修正は当該詳細な説明から当業者に明らかとなるため、説明するためだけに示されていることを理解されたい。

下記の図面は、本明細書の一部を形成するとともに、本発明の特定の態様をさらに実証する目的で含まれている。本明細書に示されている具体的な実施形態の詳細な説明と併せて、これらの図面のうちの１つ以上を参照することによって、本発明への理解を深めることができる。

図１Ａ〜Ｂ−樹状細胞は、ＣＴＬＡ−４を分泌する：（Ａ）事前にＣＤ１４の選択とＣＤ１１ｃ濃縮を行うかまたは行わずに、ヒトＤＣをバフィーコートの付着性画分から分化させ（ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４）、その後、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦα及びＰＧＥ_２で４８時間成熟させた。また、成熟時に、ＤＣを非ターゲティング（ＮＴ）ｓｉＲＮＡまたはＣＴＬＡ−４ ｓｉＲＮＡのいずれかで処理し、ＤＣ培養上清液を回収し、ＣＴＬＡ−４について、同じバフィーコートに由来する非付着性ＰＢＭＣであって、様々に刺激した非付着性ＰＢＭＣと比較してアッセイした。（Ｂ）αＣＴＬＡ−４のＢＮＩ３クローンもしくはＡ３．６Ｂ１０．Ｇ１クローン、またはアイソタイプコントロール抗体のいずれかをコートしたプロテインＧプラスビーズとともに、ＤＣ培養上清液を一晩、４℃で回転した。ＩＬ−１２ｐ３５を用いて、抗体ｃｏＩＰ特異性を確認した。 図２Ａ〜Ｅ−樹状細胞は、細胞内ＣＴＬＡ−４を有する：ＣＤ１４選択、ＤＣ分化及びＣＤ１１ｃ濃縮後、ＤＣの細胞内ＣＴＬＡ−４について解析した。（Ａ）フローサイトメトリー、（Ｂ）免疫蛍光共焦点顕微鏡及び（Ｃ）ＲＴ−ＰＣＲによって、ＣＤ１１ｃ^＋ＤＣが、細胞内ＣＴＬＡ−４を有することが示された。いずれの方法によっても、ＤＣの成熟に対応して、ＣＴＬＡ−４の量が増大することが明らかになったとともに、ＣＴＬＡ−４ ｓｉＲＮＡによって、ＣＴＬＡ−４ ｍＲＮＡレベルが無事に低下した。（Ｄ）Ｔ細胞に伴う、極性化した表面結合ＣＴＬＡ−４よりも、ＤＣの方が、ＣＴＬＡ−４の分布が広かった。（Ｅ）Ｍ−ＣＳＦ及びＴＧＦ−βによって分化させた寛容原性ＤＣは、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４で分化させた通常のＤＣよりも、高レベルの細胞内ＣＴＬＡ−４を有していた。 図２Ａ〜Ｅ−樹状細胞は、細胞内ＣＴＬＡ−４を有する：ＣＤ１４選択、ＤＣ分化及びＣＤ１１ｃ濃縮後、ＤＣの細胞内ＣＴＬＡ−４について解析した。（Ａ）フローサイトメトリー、（Ｂ）免疫蛍光共焦点顕微鏡及び（Ｃ）ＲＴ−ＰＣＲによって、ＣＤ１１ｃ^＋ＤＣが、細胞内ＣＴＬＡ−４を有することが示された。いずれの方法によっても、ＤＣの成熟に対応して、ＣＴＬＡ−４の量が増大することが明らかになったとともに、ＣＴＬＡ−４ ｓｉＲＮＡによって、ＣＴＬＡ−４ ｍＲＮＡレベルが無事に低下した。（Ｄ）Ｔ細胞に伴う、極性化した表面結合ＣＴＬＡ−４よりも、ＤＣの方が、ＣＴＬＡ−４の分布が広かった。（Ｅ）Ｍ−ＣＳＦ及びＴＧＦ−βによって分化させた寛容原性ＤＣは、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４で分化させた通常のＤＣよりも、高レベルの細胞内ＣＴＬＡ−４を有していた。 図２Ａ〜Ｅ−樹状細胞は、細胞内ＣＴＬＡ−４を有する：ＣＤ１４選択、ＤＣ分化及びＣＤ１１ｃ濃縮後、ＤＣの細胞内ＣＴＬＡ−４について解析した。（Ａ）フローサイトメトリー、（Ｂ）免疫蛍光共焦点顕微鏡及び（Ｃ）ＲＴ−ＰＣＲによって、ＣＤ１１ｃ^＋ＤＣが、細胞内ＣＴＬＡ−４を有することが示された。いずれの方法によっても、ＤＣの成熟に対応して、ＣＴＬＡ−４の量が増大することが明らかになったとともに、ＣＴＬＡ−４ ｓｉＲＮＡによって、ＣＴＬＡ−４ ｍＲＮＡレベルが無事に低下した。（Ｄ）Ｔ細胞に伴う、極性化した表面結合ＣＴＬＡ−４よりも、ＤＣの方が、ＣＴＬＡ−４の分布が広かった。（Ｅ）Ｍ−ＣＳＦ及びＴＧＦ−βによって分化させた寛容原性ＤＣは、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４で分化させた通常のＤＣよりも、高レベルの細胞内ＣＴＬＡ−４を有していた。 図３Ａ〜Ｅ−樹状細胞は、微小胞構造に内包された完全長ＣＴＬＡ−４を分泌する：（Ａ）ＤＣ培養上清液をネイキッドプロテインＧプラスビーズでプレクリアしてから、抗ＣＤ６３コートビーズでｃｏＩＰを行った。続いて、枯渇上清液の完全長ＣＴＬＡ−４（ｆｌＣＴＬＡ−４）含有量について、ウエスタンブロットによって解析した。あるいは、ｃｏＩＰの前に、上清液を様々な濃度のＮＰ−４０で１時間処理してから、ウエスタンブロットによって、上清液に残ったｆｌＣＴＬＡ−４について解析した。（Ｂ、Ｃ）未熟ＤＣと成熟ＤＣを共焦点顕微鏡によって解析して、ゴルジ体、Ｒａｂ５及びＣＴＬＡ−４の局在を確認した。（Ｄ）３つの独立したバフィーコート生成物に由来するＤＣ培養上清液をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｔｏｔａｌ Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔで処理した。精製エクソソーム（３０〜１２０ｎｍ）のＣＤ６３、Ｒａｂ５、ＩＬ−１２及びＣＴＬＡ−４について、ウエスタンブロットによって、残った上清液成分と比較した。（Ｅ）ＤＣ培養上清液から精製したエクソソームを抗ＣＴＬＡ−４コートビーズとともにインキュベートした。続いて、ＣＴＬＡ−４^＋プルダウン画分のＣＴＬＡ−４、ＣＤ６３、Ｒａｂ５及びＲａｂ１１について、ウエスタンブロットによって、残留画分と比較した。^＊ｐ＜０．０５ 図４Ａ〜Ｅ−ＤＣ由来のエクソソームは、エクソソーム表面のＣＴＬＡ−４によって媒介される自己分泌／傍分泌の形で、ＤＣによって内在化される：（Ａ）ＣＦＳＥ標識ＤＣの染色パターンによって、ＣＴＬＡ−４^＋構造とのある程度の共局在が示されている。（Ｂ）続いて、ＣＦＳＥ負荷ＤＣから得た培養上清液からすべての細胞を枯渇させ、様々な時点に、非標識ＤＣとともにインキュベートした。レシピエントの非標識ＤＣは、結合を可視化できたとともに、（Ｃ）ＣＦＳＥ^＋微小胞を内在化した。（Ｄ）様々な濃度のαＣＴＬＡ−４をコートしたプロテインＧプラスビーズとともに、培養ＣＦＳＥ負荷ＤＣ上清液をインキュベートし、その後、処理した上清液を非標識ＤＣとともに６時間、３７℃でインキュベートしてから、ＣＦＳＥ^＋微小胞の取り込みをフローサイトメトリーで解析した。（Ｅ）ＣＦＳＥ^＋ ＣＴＬＡ−４^＋微小胞とのインキュベーションから６時間及び１２時間後に、レシピエントＤＣが依然としてαＣＤ８６及びαＣＤ８０抗体に結合できる能力についても解析した。ＣＦＳＥ^＋微小胞を内在化したＤＣにおいて、Ｂ７発現が有意なログ倍低下したことが明らかになった。この低下は、Ｂ７に特異的であったとともに、ＣＤ１１ｃのような他のマーカーでは観察されなかった。６時間及び１２時間におけるエラーバーは、４回の独立した実験の±ＳＤである。^＊はｐ＜０．０５である。 図４Ａ〜Ｅ−ＤＣ由来のエクソソームは、エクソソーム表面のＣＴＬＡ−４によって媒介される自己分泌／傍分泌の形で、ＤＣによって内在化される：（Ａ）ＣＦＳＥ標識ＤＣの染色パターンによって、ＣＴＬＡ−４^＋構造とのある程度の共局在が示されている。（Ｂ）続いて、ＣＦＳＥ負荷ＤＣから得た培養上清液からすべての細胞を枯渇させ、様々な時点に、非標識ＤＣとともにインキュベートした。レシピエントの非標識ＤＣは、結合を可視化できたとともに、（Ｃ）ＣＦＳＥ^＋微小胞を内在化した。（Ｄ）様々な濃度のαＣＴＬＡ−４をコートしたプロテインＧプラスビーズとともに、培養ＣＦＳＥ負荷ＤＣ上清液をインキュベートし、その後、処理した上清液を非標識ＤＣとともに６時間、３７℃でインキュベートしてから、ＣＦＳＥ^＋微小胞の取り込みをフローサイトメトリーで解析した。（Ｅ）ＣＦＳＥ^＋ ＣＴＬＡ−４^＋微小胞とのインキュベーションから６時間及び１２時間後に、レシピエントＤＣが依然としてαＣＤ８６及びαＣＤ８０抗体に結合できる能力についても解析した。ＣＦＳＥ^＋微小胞を内在化したＤＣにおいて、Ｂ７発現が有意なログ倍低下したことが明らかになった。この低下は、Ｂ７に特異的であったとともに、ＣＤ１１ｃのような他のマーカーでは観察されなかった。６時間及び１２時間におけるエラーバーは、４回の独立した実験の±ＳＤである。^＊はｐ＜０．０５である。 図５Ａ〜Ｂ−ＣＦＳＥ負荷ＤＣにおけるＣＴＬＡ−４のｓｉＲＮＡノックダウンによって、ＣＦＳＥ負荷エクソソームの非標識レシピエントＤＣによる取り込みが減少する：（Ａ、Ｂ）ＤＣに５μＭのＣＦＳＥを負荷し、ＣＴＬＡ−４または非ターゲティング（ＮＴ）ｓｉＲＮＡで７２時間処理し、成熟させた。続いて、培養上清液を採取し、非標識ＤＣとともに、様々な期間インキュベートしてから、ＣＦＳＥ取り込みレベルと、特異的抗体によって依然として染色されるＣＤ８０（Ｂ７−１）の残留能力についてフローサイトメトリー解析を行った。 図６Ａ〜Ｄ−ＤＣ ＣＴＬＡ−４のノックダウンによって、Ｔ_Ｈ１の応答と抗腫瘍免疫が増強される：（Ａ）ヒトＤＣをＣＴＬＡ−４または非ターゲティング（ＮＴ）ｓｉＲＮＡで７２時間処理し、成熟させ、１：１０の比で、同系のＴ細胞と共培養し、９日目と２４日目に再刺激した。ブレフェルジンＡでの５時間のインキュベートと、フローサイトメトリーによる解析によって、プロセス全体にわたって、Ｔ細胞をサンプリングし、ＣＤ４：ＣＤ８比、ＣＤ８の活性化（ＣＤ２５及び細胞内ＩＦＮ−γ）、ならびにＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋ｔｒｅｇの量を割り出した。示されているデータは、生物学的に別の５つの生成物による５回の独立した実験を表すものである。（Ｂ）様々なｓｉＲＮＡ処理マウスＤＣ培養上清液の相対的なＣＴＬＡ−４濃度をウエスタンブロットによって特徴付け、その後、１×１０^６個の全脾臓細胞をこれらの上清液で培養し、５日目、７日目及び９日目に、補助的なＩＬ−２を加えた。データによって、ＣＤ８＋ＣＤ２５＋細胞の増殖が、低レベルのＣＴＬＡ−４上清液含有量に依存していたとともに、上清液におけるＣＴＬＡ−４の濃度に比例していたことが示された。（Ｃ／Ｄ）ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４とともに６日間培養したマウス骨髄から、マウスＢＭＤＣを分化させ、ＣＴＬＡ−４または非ターゲティング（ＮＴ）ｓｉＲＮＡで７２時間処理し、Ｂ１６ ｍＲＮＡを負荷し、成熟させ、レシピエントのＣ５７ＢＬ／６マウスの同側のフットパッドに注射し、このフットパッドには、３日前に、触知可能なＢ１６腫瘍を予め確立させておいた。１４日目にマウスに追加免疫を行い、３週間超、腫瘍を定期的に測定した。コホートは、それぞれ５匹のマウスからなっていた。^＊ｐ＜０．０５。（Ｅ）ＴＨ１またはＴＨ２のいずれかにインビトロで成熟中にＤＣを極性化し、２４時間後、培養上清液のＤＣ分泌ＣＴＬＡ−４の存在について、ウエスタンブロットによって解析した。ＴＨ１は、１ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１２で極性化した。ＴＨ２は、１０ｎｇ／ｍｌ（１ｘ）または１００ｎｇ／ｍｌ（１０ｘ）のＳＥＢで極性化した。ＩＭ＝未熟ＤＣ。 図６Ａ〜Ｄ−ＤＣ ＣＴＬＡ−４のノックダウンによって、Ｔ_Ｈ１の応答と抗腫瘍免疫が増強される：（Ａ）ヒトＤＣをＣＴＬＡ−４または非ターゲティング（ＮＴ）ｓｉＲＮＡで７２時間処理し、成熟させ、１：１０の比で、同系のＴ細胞と共培養し、９日目と２４日目に再刺激した。ブレフェルジンＡでの５時間のインキュベートと、フローサイトメトリーによる解析によって、プロセス全体にわたって、Ｔ細胞をサンプリングし、ＣＤ４：ＣＤ８比、ＣＤ８の活性化（ＣＤ２５及び細胞内ＩＦＮ−γ）、ならびにＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋ｔｒｅｇの量を割り出した。示されているデータは、生物学的に別の５つの生成物による５回の独立した実験を表すものである。（Ｂ）様々なｓｉＲＮＡ処理マウスＤＣ培養上清液の相対的なＣＴＬＡ−４濃度をウエスタンブロットによって特徴付け、その後、１×１０^６個の全脾臓細胞をこれらの上清液で培養し、５日目、７日目及び９日目に、補助的なＩＬ−２を加えた。データによって、ＣＤ８＋ＣＤ２５＋細胞の増殖が、低レベルのＣＴＬＡ−４上清液含有量に依存していたとともに、上清液におけるＣＴＬＡ−４の濃度に比例していたことが示された。（Ｃ／Ｄ）ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４とともに６日間培養したマウス骨髄から、マウスＢＭＤＣを分化させ、ＣＴＬＡ−４または非ターゲティング（ＮＴ）ｓｉＲＮＡで７２時間処理し、Ｂ１６ ｍＲＮＡを負荷し、成熟させ、レシピエントのＣ５７ＢＬ／６マウスの同側のフットパッドに注射し、このフットパッドには、３日前に、触知可能なＢ１６腫瘍を予め確立させておいた。１４日目にマウスに追加免疫を行い、３週間超、腫瘍を定期的に測定した。コホートは、それぞれ５匹のマウスからなっていた。^＊ｐ＜０．０５。（Ｅ）ＴＨ１またはＴＨ２のいずれかにインビトロで成熟中にＤＣを極性化し、２４時間後、培養上清液のＤＣ分泌ＣＴＬＡ−４の存在について、ウエスタンブロットによって解析した。ＴＨ１は、１ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１２で極性化した。ＴＨ２は、１０ｎｇ／ｍｌ（１ｘ）または１００ｎｇ／ｍｌ（１０ｘ）のＳＥＢで極性化した。ＩＭ＝未熟ＤＣ。 一般的な動物血清では、検出可能な完全長ＣＴＬＡ−４の存在は見られない：様々な一般的な血清（マウス、ヒト及びウシ）で作製した培地において、新鮮なＤＣの導入前のＣＴＬＡ−４について解析して、事前混入の可能性を割り出した。ＰＢＭＣ溶解液をＣＴＬＡ−４ウエスタンブロットコントロールとして用いた。 図８Ａ〜Ｂ−Ｔ細胞は、検出可能なＣＴＬＡ−４を分泌しなかったが、ＣＦＳＥ増殖アッセイ、ＣＤ２５の上方制御及びＩＦＮ−γの分泌によって割り出されたように、適宜活性化された：（Ａ、Ｂ）Ｔ細胞から分泌されるＣＴＬＡ−４の欠損は、不十分な刺激によるものではないことを確かめるために、ＣＦＳＥの増殖とＣＤ２５の上方制御（フローサイトメトリー）及びＩＦＮ−γの分泌（ウエスタンブロット）によって、Ｔ細胞の活性化を測定した。 ＣＤ１４選択、分化及びＣＤ１１ｃ濃縮後のＤＣ純度：ＣＤ３^＋細胞の混入の解析前、かつ後に実験で使用する前に、バフィーコートのＣＤ１４^＋単球画分を磁気によって選択してから、ＤＣの分化とその後のＣＤ１１ｃ濃縮を行った。 ＣＴＬＡ−４ ｓｉＲＮＡ特異性の機能確認：解析の４８時間前に、ＣＴＬＡ−４または非ターゲティング（ＮＴ）ｓｉＲＮＡをＴ細胞にエレクトロポレーションした。続いて、ＣＴＬＡ−４ノックダウンをウエスタンブロットとＴ細胞のＣＤ２５発現の上方制御によって確認した。 細胞内ＤＣ ＣＴＬＡ−４は、ＤＣの成熟の向上によって上方制御する：ＣＤ８０及びＣＤ８３の発現によって測定した場合、細胞内ＣＴＬＡ−４レベルは、ＤＣの相対的成熟度との相関が高かった。 循環ヒトＣＤ１１ｃ^＋細胞は、ＣＤ３^＋細胞とは異なるパターンで、細胞内ＣＴＬＡ−４を生理的に発現する：健常なボランティアから血液を採取し、その後、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ３及び細胞内ＣＴＬＡ−４に対して染色した。ＣＤ３^＋及びＣＤ１１ｃ^＋細胞に特異的にゲーティングしたことによって、ＳＥＢによる活性化は、ＣＤ３^＋サブセットでのＣＴＬＡ−４の発現を上方制御し（上部パネル）、いずれのサブセットも細胞内ＣＴＬＡ−４を有する（下部パネル）ことが示されている。細胞内ＣＴＬＡ−４の基底レベルは、不活性化ＣＤ３^＋細胞におけるよりも、ＣＤ１１ｃ^＋細胞における方が高かった。 αＣＴＬＡ−４の抗体特異性の確認：Ｔ細胞をαＣＴＬＡ−４またはアイソタイプコントロール抗体のいずれかで染色し、共焦点顕微鏡によって解析して、αＣＴＬＡ−４抗体特異性を確認した。 図１４Ａ〜Ｃ−ＣＴＬＡ−４ ｓｉＲＮＡは、ＤＣ ＣＴＬＡ−４を標的とするが、タンパク質レベルの下方制御が遅延される：ＣＴＬＡ−４ ｓｉＲＮＡは、ＤＣ ＣＴＬＡ−４を標的とし、最終的には、（Ａ、Ｂ）ウエスタンブロット及び（Ｃ）共焦点顕微鏡によってアッセイしたように、タンパク質の低減を導く。ＣＴＬＡ−４ ｓｉＲＮＡの処理から４８時間後に、事実上完全なタンパク質喪失を示すＴ細胞とは異なり、ＤＣ ＣＴＬＡ−４は、処理後７２時間まで、高い安定性を示すとともに、タンパク質レベルの低下をほとんど示さない。 Ｒａｂ１１とＣＴＬＡ−４は、ＤＣに共局在化しない：ＤＣを免疫蛍光共焦点顕微鏡によって解析して、Ｒａｂ１１とＣＴＬＡ−４の局在を割り出した。 図４Ｄの定量−αＣＴＬＡ−４コートビーズとともにＤＣ細胞培養上清液をインキュベートすることにより、その後のＣＦＳＥ標識エクソソームの非標識ＤＣによる取り込みがブロックされる：ＤＣ細胞培養上清液をαＣＴＬＡ−４コートビーズとともにインキュベートしたところ、その後のＣＦＳＥ標識エクソソームの非標識ＤＣによる取り込みが滴定可能な形でブロックされた。５μｇ／ｍｌの抗体濃度で、２６％少ないレシピエントＤＣが、ＣＦＳＥ^＋エクソソームを内在化させ（ｐ＝０．０２^＊）、５０μｇ／ｍｌの抗体濃度で、３５％少ないレシピエントＤＣが、ＣＦＳＥ^＋エクソソームを内在化させた（ｐ＝０．００７^＊＊）。ＣＤ１１ｃ内部コントロールの染色では、グループ間で統計的な違いがなかった。エラーバーは、３回の独立した実験の±ＳＤである。 図１７Ａ〜Ｂ−ＤＣ−エクソソームＣＴＬＡ−４は、生理学的にＢ７に結合する：（Ａ）ＣＦＳＥ負荷ＤＣ培養上清液を新鮮な培地で段階希釈し、フロー用に適格な抗体のαＣＤ８０及びαＣＤ８６と０．１％アジ化ナトリウムとともに、非標識ＤＣと２０分、４℃でインキュベートした。（Ｂ）図４Ｄ及び４Ｅと同様に、様々な濃度のαＣＴＬＡ−４をコートしたプロテインＧプラスビーズと、培養ＣＦＳＥ負荷ＤＣ上清液を１時間、インキュベートした。ビーズをペレット化し、フロー用に適格な抗体のαＣＤ８０及びαＣＤ８６と０．１％アジ化ナトリウムとともに、クリアした上清液を非標識ＤＣと２０分、４℃でインキュベートした。ＣＤ１１ｃを非Ｂ７コントロールとして用いた。 図１７Ａの定量−ＤＣ−エクソソームＣＴＬＡ−４は、生理学的にＢ７に結合する：３回の実験において、フロー用に適格な抗体のαＣＤ８０及びαＣＤ８６と０．１％アジ化ナトリウムとともに、ＣＦＳＥ標識ＤＣに由来する細胞培養上清液と、非標識レシピエントＤＣを２０分、４℃でインキュベートしたところ、１％または１０％上清液を用いたＢ７のＭＦＩの変化は見られなかったが（検出可能なＣＦＳＥ^＋小胞の取り込みも見られなかった）、１００％上清液では、ＣＤ８０のＭＦＩ及びＣＤ８６のＭＦＩのいずれも、有意に低下し、ＣＦＳＥの取り込みが５倍となった。いずれの希釈液の間においても、ＣＤ１１ｃのＭＦＩに、統計的に有意な差は見られなかった。^＊＝ｐ＜０．０５。エラーバー＝±ＳＤ。 図１７Ｂの定量−ＤＣ−エクソソームＣＴＬＡ−４は、生理学的にＢ７に結合する。３回の実験において、ＣＦＳＥ標識ＤＣ細胞培養上清液をαＣＴＬＡ−４ビーズで１時間プレクリアしてから、フロー用に適格な抗体のαＣＤ８０及びαＣＤ８６と０．１％アジ化ナトリウムとともに、非標識ＤＣを２０分、４℃でインキュベートしたところ、滴定可能かつ統計的に有意なＢ７のＭＦＩの増加が見られ、それに付随して、ＣＤ１１ｃのＭＦＩの増加は見られなかった一方で、ＣＦＳＥ^＋細胞の割合は４５％低下した。^＊＝ｐ＜０．０５。エラーバー＝±ＳＤ。 ＤＣ ＣＴＬＡ−４のｓｉＲＮＡノックダウンにより、インビトロでのＣＤ８^＋Ｔ細胞の産生が増大する：図６Ａから得られるデータの定量：８個の異なる生体生成物（バフィーコート）で行った８回の独立した実験において、自己ＰＢＭＣをＣＴＬＡ−４ ｓｉＲＮＡ処理ＤＣで拡張したところ、非ターゲティング（ＮＴ）ｓｉＲＮＡ処理ＤＣと比べて、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞の生成の割合が２倍になった。エラーバー＝±ＳＤ。ｐ＝０．００５（スチューデントペアｔ検定）。 ＣＴＬＡ−４−／−ＣＤ２８−／−ダブルノックアウトマウスに由来する細胞の解析により、マウスＤＣにおけるＣＴＬＡ−４の発現が確認される：脾臓細胞、ＢＭＤＣ及びＢＭＤＣ培養上清液を野生型マウスとＣＴＬＡ−４−／−ＣＤ２８−／−ダブルノックアウトマウスから生成してから、ＣＴＬＡ−４含有量について、ウエスタンブロット解析によって解析した。抗アクチンを負荷コントロールとして用いた。

Ｉ．本発明の実施形態
抗原提示に対するＣＴＬＡ−４の作用は、これまで特徴付けられてこなかったので、ＣＴＬＡ−４の活性をどのように調節して、免疫応答を制御するのかは不明であった。本明細書に示されている調査によって、成熟骨髄樹状細胞が、細胞内ＣＴＬＡ−４の発現を上方制御し、その後、ＣＴＬＡ−４は、（小胞体の仲介によって）細胞外空間に分泌されることが初めて示されている。ＤＣ由来の細胞外ＣＴＬＡ−４は、Ｂ７の抗体結合を競合的に阻害し、その存在によって、インビトロにおける下流のＴ細胞応答と、インビボにおける抗腫瘍免疫を負に調節する。したがって、この重要な造血系統に機能性ＣＴＬＡ−４が予期せず存在することにより、ＣＴＬＡ−４アンタゴニスト薬によって調節できる適応免疫応答に対するＤＣの制御レベルの向上が示される。具体的には、本明細書に示されている調査によって、ＣＴＬＡ−４アンタゴニストを用いて、Ｔ細胞免疫応答を増強できることが示されている。

したがって、本発明の実施形態は、ＣＴＬＡ−４アンタゴニストを含む免疫原性組成物（例えば、ワクチン組成物）を提供する。このようなアンタゴニストを加えると、その組成物が強固な免疫応答、具体的には、強固なＴ細胞媒介性免疫応答を誘導する能力が増強される。同様に、ＣＴＬＡ−４アンタゴニストの投与と併せて、免疫原性組成物（例えば、抗原を含む組成物）を投与することによって、対象の免疫応答を増強させる方法を提供する。

さらに、樹状細胞の抗原提示におけるＣＴＬＡ−４の調節的な役割に鑑みると、ＣＴＬＡ−４活性の改変を用いて、樹状細胞の機能を増強できる。したがって、いくつかの態様では、ＣＴＬＡ−４の発現の下方制御を含む樹状細胞を提供する。重要なことに、このような改変樹状細胞は、抗原に感作されると、より強固なＴ細胞応答を誘導できる。したがって、本発明で提供する改変樹状細胞は、抗原で感作して、対象に直接投与して、その対象の免疫応答を誘導できる。同様に、改変樹状細胞をエキソビボで用いて、標的Ｔ細胞の集団を刺激及び拡張でき、そして、そのＴ細胞を治療剤として使用してよい。

ＩＩ．ＣＴＬＡ−４アンタゴニスト
本発明の実施形態の特定の態様は、ＣＴＬＡ−４アンタゴニストに関するものである。いくつかの態様では、ＣＴＬＡ−４アンタゴニストは、低分子アンタゴニストである。さらなる態様では、ＣＴＬＡ−４アンタゴニストは、ＣＴＬＡ−４に結合して、その活性を阻止する抗体であることができる。さらなる態様では、ＣＴＬＡ−４アンタゴニストは、ＣＴＬＡ−４の発現を低下させる阻害性核酸であることができる。

Ａ．ＣＴＬＡ−４−結合抗体
特定の実施形態では、ＣＴＬＡ−４タンパク質の少なくとも一部に結合して、ＣＴＬＡ−４のシグナル伝達を阻害する抗体またはその断片を想定する。本明細書で使用する場合、「抗体」という用語は広くは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及び遺伝子改変ＩｇＧなどのいずれかの免疫結合剤と、抗原結合活性を保持している抗体ＣＤＲドメインを含むポリペプチドを指すように意図されている。抗体は、キメラ抗体、親和性成熟抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体もしくは抗原結合性抗体断片、または天然リガンドもしくは合成リガンドからなる群から選択してよい。

好ましくは、この抗ＣＴＬＡ−４抗体は、モノクローナル抗体またはヒト化抗体である。したがって、既知の手段によって、かつ本明細書に記載されているように、ＣＴＬＡ−４タンパク質、そのそれぞれのエピトープの１つ以上または上記のいずれかのコンジュゲート体（このような抗原またはエピトープは、天然源から単離されているか、天然化合物の合成誘導体または変異体であるかは問わない）に特異的なポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗体断片、ならびに結合ドメイン及びＣＤＲ（上記のいずれの操作済みの形態も含む）を作製してよい。

本発明の実施形態に適する抗体断片の例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片、（ｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなる「Ｆｄ」断片、（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬ及びＶＨドメインからなる「Ｆｖ」断片、（ｉｖ）ＶＨドメインからなる「ｄＡｂ」断片、（ｖ）単離ＣＤＲ領域、（ｖｉ）連結された２つのＦａｂ断片を含む二価の断片であるＦ（ａｂ’）２断片、（ｖｉｉ）ＶＨドメインとＶＬドメインを会合させて結合ドメインを形成させるペプチドリンカーによって、ＶＨドメインとＶＬドメインが連結されている一本鎖Ｆｖ分子（「ｓｃＦｖ」）、（ｖｉｉｉ）二重特異性一本鎖Ｆｖ二量体（米国特許第５，０９１，５１３号を参照のこと）、ならびに（ｉｘ）遺伝子融合によって構築したディアボディ、多価の断片または多特異性断片（米国特許出願公開第２００５０２１４８６０号）が挙げられるが、これらに限らない。Ｆｖ、ｓｃＦｖまたはディアボディ分子は、ＶＨドメインとＶＬドメインを連結するジスルフィド架橋の導入によって安定化されていてよい。ＣＨ３ドメインに接合されたｓｃＦｖを含むミニボディを作製してもよい（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。

抗体様結合ペプチド模倣体も実施形態において想定されている。Ｌｉｕらの文献（２００３）には、ペアダウン（ｐａｒｅｄ−ｄｏｗｎ）抗体として機能するとともに、血中半減期の延長と合成方法の煩雑さの軽減という特定の利点を有するペプチドである「抗体様結合ペプチド模倣体」（ＡＢｉＰ）が記載されている。

ＣＴＬＡ−４タンパク質に特異的な抗体を産生させるために、動物に、ＣＴＬＡ−４ポリペプチド配列のような抗原を接種してよい。抗原を別の分子に結合またはコンジュゲートさせて、免疫応答を増強する場合が多い。本明細書で使用する場合、コンジュゲート体は、動物において免疫応答を惹起するために用いる抗原に結合したいずれかのペプチド、ポリペプチド、タンパク質またはタンパク質以外の水性物質である。抗原の接種に応じて動物において産生される抗体は、様々な個々の抗体産生Ｂリンパ球から作られる様々な同一ではない分子（ポリクローナル抗体）を含む。ポリクローナル抗体は、抗体種の混合集団であり、その各抗体種は、同じ抗原上の異なるエピトープを認識できる。動物においてポリクローナル抗体を産生させるための的確な条件を与えれば、動物の血清中の抗体の大半は、動物に免疫を施した抗原化合物上の集合的なエピトープを認識することになる。この特異性をアフィニティー精製によってさらに高めて、対象とする抗原またはエピトープを認識する抗体のみを選択する。

モノクローナル抗体は、すべての抗体分子が、同じエピトープを認識する単一種の抗体である。すべての抗体産生細胞が、１つのＢリンパ球細胞株に由来するからである。モノクローナル抗体（ＭＡｂ）の生成方法は概して、ポリクローナル抗体を調製するための株と同じ株で始める。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体の生成の際には、マウス及びラットのような齧歯動物を使用する。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体の生成の際には、ウサギ細胞、ヒツジ細胞またはカエル細胞を使用する。ラットを使用することは周知であり、特定の利点を得ることができる。マウス（例えばＢＡＬＢ／ｃマウス）が通常使用され、概して、安定した融合体の割合が高くなる。

ハイブリドーマ技術は、事前にＣＴＬＡ−４抗原で免疫したマウス由来の１つのＢリンパ球を不死化ミエローマ細胞（通常マウスミエローマ）と融合することを含むものである。この技術は、同じ抗原またはエピトープ特異性を有する構造的に同一な抗体（モノクローナル抗体）を無限の量で産生できるように、無限の生成数で単一抗体産生細胞を増殖する方法を提供する。

免疫したウサギの調製したてのウサギ末梢血単核球から、血漿Ｂ細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ５−ＣＤ１９＋）を単離し、さらに、ＣＴＬＡ−４結合細胞について選択してよい。抗体産生Ｂ細胞の濃縮後、全ＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡを合成してよい。重鎖と軽鎖の両方の抗体可変領域のＤＮＡ配列を増幅し、ファージディスプレイＦａｂ発現ベクターに構築し、Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換してよい。複数ラウンドの濃縮パニングを通じて、ＣＴＬＡ−４特異的結合Ｆａｂを選択して、シークエンシングしてよい。選択したＣＴＬＡ−４結合ヒットは、ヒト胎児腎（ＨＥＫ２９３）細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において、哺乳動物発現ベクター系を用いて、ウサギにおける完全長ＩｇＧ及びウサギ／ヒトキメラ形態として発現させて、プロテインＧ樹脂を高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）分離ユニットとともに用いて精製してよい。

一実施形態では、抗体は、キメラ抗体、例えば、ヒト以外のドナー由来の抗原結合配列を、異種のヒト以外の配列、ヒト配列またはヒト化配列（例えば、フレームワーク及び／または定常ドメイン配列）に移植したものを含む抗体である。モノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖定常ドメインをヒト由来の類似ドメインと置換して、外来抗体の可変領域をインタクトなままにする方法が開発されている。あるいは、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックなマウスで、「完全ヒト」モノクローナル抗体を産生させる。齧歯動物、例えば、マウスのアミノ酸配列とヒトのアミノ酸配列の両方を有する抗体可変ドメインを組み換えによって構築することによって、モノクローナル抗体の可変ドメインを、よりヒトの形態に変換する方法も開発されている。「ヒト化」モノクローナル抗体では、超可変ＣＤＲのみがマウスモノクローナル抗体に由来しており、フレームワーク領域と定常領域は、ヒトアミノ酸配列に由来している（米国特許第５，０９１，５１３号及び同第６，８８１，５５７号を参照のこと）。齧歯動物に特徴的である、抗体中のアミノ酸配列を、ヒト抗体の対応する位置に見られるアミノ酸配列に置き換えると、治療的な使用時の有害な免疫反応の可能性が低下することになると考えられている。ハイブリドーマまたはその他の抗体産生細胞に対して、遺伝子変異またはその他の変更を加えてもよく、この変異または変更によって、そのハイブリドーマによって産生される抗体の結合特異性を変更してもしなくてもよい。

様々な動物種におけるポリクローナル抗体の産生方法と、ヒト化抗体、キメラ抗体及び完全ヒト抗体を含む様々なタイプのモノクローナル抗体の産生方法は、当該技術分野において周知であり、容易に予想可能である。例えば、米国特許出願公開第２００４／０１２６８２８号及び同第２００２／０１７２６７７号、ならびに米国特許第３，８１７，８３７号、同第３，８５０，７５２号、同第３，９３９，３５０号、同第３，９９６，３４５号、同第４，１９６，２６５号、同第４，２７５，１４９号、同第４，２７７，４３７号、同第４，３６６，２４１号、同第４，４６９，７９７号、同第４，４７２，５０９号、同第４，６０６，８５５号、同第４，７０３，００３号、同第４，７４２，１５９号、同第４，７６７，７２０号、同第４，８１６，５６７号、同第４，８６７，９７３号、同第４，９３８，９４８号、同第４，９４６，７７８号、同第５，０２１，２３６号、同第５，１６４，２９６号、同第５，１９６，０６６号、同第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、同第５，４２０，２５３号、同第５，５６５，３３２号、同第５，５７１，６９８号、同第５，６２７，０５２号、同第５，６５６，４３４号、同第５，７７０，３７６号、同第５，７８９，２０８号、同第５，８２１，３３７号、同第５，８４４，０９１号、同第５，８５８，６５７号、同第５，８６１，１５５号、同第５，８７１，９０７号、同第５，９６９，１０８号、同第６，０５４，２９７号、同第６，１６５，４６４号、同第６，３６５，１５７号、同第６，４０６，８６７号、同第６，７０９，６５９号、同第６，７０９，８７３号、同第６，７５３，４０７号、同第６，８１４，９６５号、同第６，８４９，２５９号、同第６，８６１，５７２号、同第６，８７５，４３４号及び同第６，８９１，０２４号という米国特許及び米国特許出願に、このような方法を可能にする説明が示されている。本明細書に引用されているすべての特許、特許出願公開及びその他の文献は、参照により、本願に援用される。

抗体は、鳥類及び哺乳動物を含むいずれかの動物源から産生させてもよい。好ましくは、抗体は、ヒツジ、ネズミ（例えば、マウス及びラット）、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマまたはニワトリである。加えて、最近の技術により、ヒトコンビナトリアル抗体ライブラリーからヒト抗体を開発及びスクリーニング可能になっている。例えば、米国特許第６，９４６，５４６号（参照により、本明細書に援用される）に記載されているように、バクテリオファージ抗体発現技術により、動物の免疫を行わずに、特異的抗体を生成可能になっている。これらの技法は、Ｍａｒｋｓ（１９９２）、Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）、Ｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．（１９９２）、Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）及びＳｃｈｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９６）にさらに説明されている。

ＣＴＬＡ−４に対する抗体には、その抗体の動物種、モノクローナル細胞株またはその他の供給源にかかわらず、ＣＴＬＡ−４の作用を中和または相殺する能力があることは十分に予想される。特定の動物種は、治療抗体の生成には、あまり好ましくないことがある。抗体の「Ｆｃ」部分を介した、補体系の活性化により、アレルギー応答を起こす可能性が高い場合があるからである。しかしながら、抗体全体は、酵素によって、「Ｆｃ」（補体結合）断片と、結合ドメインまたはＣＤＲを有する抗体断片とに消化され得る。Ｆｃ部分を除去すると、抗原抗体断片が、望ましくない免疫応答を惹起する可能性が低下するので、予防的処置または治療的処置用では、Ｆｃのない抗体が優先されることがある。上記のように、他の種において産生させたか、または他の種に由来する配列を有する抗体を動物に投与することに起因する有害な免疫学的帰結を軽減または排除するために、抗体は、キメラ抗体または部分的もしくは完全ヒト抗体となるように構築してもよい。

置換変異体には典型的には、タンパク質内の１つ以上の部位で、１つのアミノ酸を別のアミノ酸に置換した部分が含まれ、置換変異体は、他の機能または特性の喪失の有無にかかわらず、ポリペプチドの１つ以上の特性を調節するように設計されていてよい。置換は、保存的なものであってよく、すなわち、１つのアミノ酸が、同様の形態及び電荷のアミノ酸に置き換えられている。保存的置換は、当該技術分野において周知であり、例えば、アラニンのセリンへの変更、アルギニンのリジンへの変更、アスパラギンのグルタミンまたはヒスチジンへの変更、アスパルテートのグルタメートへの変更、システインのセリンへの変更、グルタミンのアスパラギンへの変更、グルタメートのアスパルテートへの変更、グリシンのプロリンへの変更、ヒスチジンのアスパラギンまたはグルタミンへの変更、イソロイシンのロイシンまたはバリンへの変更、ロイシンのバリンまたはイソロイシンへの変更、リジンのアルギニンへの変更、メチオニンのロイシンまたはイソロイシンへの変更、フェニルアラニンのチロシン、ロイシンまたはメチオニンへの変更、セリンのトレオニンへの変更、トレオニンのセリンへの変更、トリプトファンのチロシンへの変更、チロシンのトリプトファンまたはフェニルアラニンへの変更及びバリンのイソロイシンまたはロイシンへの変更が挙げられる。あるいは、置換は、ポリペプチドの機能または活性が影響を受けるように、非保存的であってもよい。非保存的な変更には典型的には、残基を化学的に異なる残基に置き換えること（極性または荷電アミノ酸を非極性または非荷電アミノ酸に置き換える、非極性または非荷電アミノ酸を極性または荷電アミノ酸に置き換えるなど）が伴う。

タンパク質は、組換え体であっても、インビトロで合成してもよい。あるいは、非組み換えタンパク質または組み換えタンパク質を細菌から単離してもよい。このような変異体を含む細菌を組成物及び方法で実現してよいことも想定されている。その結果、タンパク質は、単離する必要はない。

組成物には、総ポリペプチド、ペプチド及び／またはタンパク質が１ｍｌ当たり約０．００１ｍｇ〜約１０ｍｇ存在することが想定されている。したがって、組成物中のタンパク質の濃度は、約、少なくとも約または最大で約０．００１ｍｇ／ｍｌ、０．０１０ｍｇ／ｍｌ、０．０５０ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、０．３ｍｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ、０．７ｍｇ／ｍｌ、０．８ｍｇ／ｍｌ、０．９ｍｇ／ｍｌ、１．０ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ、２．０ｍｇ／ｍｌ、２．５ｍｇ／ｍｌ、３．０ｍｇ／ｍｌ、３．５ｍｇ／ｍｌ、４．０ｍｇ／ｍｌ、４．５ｍｇ／ｍｌ、５．０ｍｇ／ｍｌ、５．５ｍｇ／ｍｌ、６．０ｍｇ／ｍｌ、６．５ｍｇ／ｍｌ、７．０ｍｇ／ｍｌ、７．５ｍｇ／ｍｌ、８．０ｍｇ／ｍｌ、８．５ｍｇ／ｍｌ、９．０ｍｇ／ｍｌ、９．５ｍｇ／ｍｌ、１０．０ｍｇ／ｍｌもしくはこれを超える値（または導き出せるいずれかの範囲）であることができる。このうち、約、少なくとも約または最大で約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％が、ＣＴＬＡ−４に結合する抗体であってよい。

抗体または好ましくは抗体の免疫部分は、他のタンパク質に化学的にコンジュゲートするか、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させることができる。本明細書及び添付の請求項の目的においては、このようなすべての融合タンパク質は、抗体または抗体の免疫部分の定義に含まれる。

実施形態は、ＣＴＬＡ−４、ポリペプチド及びペプチドに対する抗体及び抗体様分子であって、抗体コンジュゲート体またはペイロードを形成するように少なくとも１つの作用剤に連結されている抗体及び抗体様分子を提供する。診断剤または治療剤としての抗体分子の有効性を高めるために、少なくとも１つの所望の分子もしくは部分に連結させるか、共有結合させるか、またはその分子もしくは部分と複合体を形成させるのが通常である。このような分子または部分は、少なくとも１つのエフェクター分子またはレポーター分子であってよいが、これらに限らない。エフェクター分子は、所望の活性、例えば細胞障害性活性を有する分子を含む。抗体に結合させたエフェクター分子の非限定的な例としては、毒素、治療用酵素、抗生物質、放射性物質標識ヌクレオチドなどが挙げられる。これに対して、レポーター分子は、アッセイを用いて検出できるいずれかの分子として定義される。抗体にコンジュゲートしたレポーター分子の非限定的な例としては、酵素、放射線標識、ハプテン、蛍光標識、りん光分子、化学発光分子、発色団、発光分子、光親和性分子、着色粒子またはビオチンなどのリガンドが挙げられる。

当該技術分野においては、抗体をそのコンジュゲート部分に結合またはコンジュゲートするためのいくつかの方法が知られている。いくつかの結合方法には、例えば、抗体に結合する有機キレート剤（ジエチレントリアミンペンタ酢酸無水物（ＤＴＰＡ）、エチレントリアミンテトラ酢酸、Ｎ−クロロ−ｐ−トルエンスルホンアミド及び／またはテトラクロロ−３−６？−ジフェニルグリコウリル−３など）を用いる金属キレート錯体の使用が伴う。モノクローナル抗体は、グルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸塩のようなカップリング剤の存在下で、酵素と反応させてもよい。フルオレセインマーカーとのコンジュゲート体は、これらのカップリング剤の存在下、またはイソチオシアネートとの反応によって調製する。

Ｂ．ＣＴＬＡ−４阻害性核酸
特定の態様では、方法には、ＣＴＬＡ−４を標的とした阻害性核酸のようなＣＴＬＡ−４阻害剤の使用が伴う。阻害性核酸の例としては、ＣＴＬＡ−４ ｍＲＮＡのすべてまたは一部と相補的なアンチセンス核酸、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）及びショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が挙げられるが、これらに限らない。阻害性核酸は、例えば、細胞における遺伝子の転写を阻害したり、細胞におけるｍＲＮＡの分解を媒介したり、及び／またはｍＲＮＡからのポリペプチドの翻訳を阻害したりできる。典型的には、阻害性核酸は、１６〜１０００以上のヌクレオチド長、特定の実施形態では、１８〜１００ヌクレオチド長であってよい。特定の実施形態では、阻害性核酸は、１６ヌクレオチド長、１７ヌクレオチド長、１８ヌクレオチド長、１９ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長、２１ヌクレオチド長、２２ヌクレオチド長、２３ヌクレオチド長、２４ヌクレオチド長、２５ヌクレオチド長、２６ヌクレオチド長、２７ヌクレオチド長、２８ヌクレオチド長、２９ヌクレオチド長、３０ヌクレオチド長、３１ヌクレオチド長、３２ヌクレオチド長、３３ヌクレオチド長、３４ヌクレオチド長、３５ヌクレオチド長、３６ヌクレオチド長、３７ヌクレオチド長、３８ヌクレオチド長、３９ヌクレオチド長、４０ヌクレオチド長、４１ヌクレオチド長、４２ヌクレオチド長、４３ヌクレオチド長、４４ヌクレオチド長、４５ヌクレオチド長、４６ヌクレオチド長、４７ヌクレオチド長、４８ヌクレオチド長、４９ヌクレオチド長または５０ヌクレオチド長であってよい。いくつかの態様では、阻害性核酸は、１つ以上の修飾ヌクレオチドまたは核酸アナログを含んでよい。典型的には、阻害性核酸は、細胞内の１つの遺伝子の発現を阻害することになるが、特定の実施形態では、阻害性核酸は、細胞内の２つ以上の遺伝子の発現を阻害することになる。

いくつかの態様では、阻害性核酸は、二本鎖構造を形成できる。例えば、この二本鎖構造は、部分的または完全に相補的である２つの別個の核酸分子に起因してよい。特定の実施形態では、阻害性核酸は、１つの核酸または核酸アナログのみを含むとともに、それ自体で相補することによって（例えば、ヘアピンループを形成することによって）、二本鎖構造を形成してよい。阻害性核酸の二本鎖構造は、１６〜５００個以上の連続した核酸塩基を含んでよい。例えば、阻害性核酸は、ＣＴＬＡ−４ ｍＲＮＡに相補的である１７〜３５個の連続した核酸塩基、より好ましくは１８〜３０個の連続した核酸塩基、より好ましくは１９〜２５個の核酸塩基、より好ましくは２０〜２３個の連続した核酸塩基、２０〜２２個の連続した核酸塩基または２１個の連続した核酸塩基を含んでよい。このようなｓｉＲＮＡまたは二本鎖ＲＮＡ分子の使用方法は、米国特許第６，５０６，５５９号及び同第６，５７３，０９９号、ならびに米国特許出願公開第２００３／００５１２６３号、同第２００３／００５５０２０号、同第２００４／０２６５８３９号、同第２００２／０１６８７０７号、同第２００３／０１５９１６１号、同第２００４／００６４８４２号に記載されており、これらはそれぞれ、参照により、その全体が本明細書に援用される。

ＩＩＩ．本発明の実施形態の樹状細胞集団
樹状細胞の単離培養及び感作方法は、当該技術分野において周知である。例えば、米国特許第８，７２８，８０６号（参照により、その全体が本明細書に援用される）には、本発明の実施形態の組成物と方法で使用してよい抗原感作樹状細胞をもたらすための詳細な方法が示されている。

Ａ．遺伝子改変樹状細胞
本発明の実施形態の特定の態様は、ＣＴＬＡ−４の発現を低下させるように遺伝子改変した樹状細胞に関するものである。いくつかの態様では、この遺伝子改変には、ＣＴＬＡ−４に特異的な外因性の阻害性核酸の導入が含まれる。特定の態様では、阻害性核酸は、樹状細胞においてＤＮＡベクターから発現されるＲＮＡのようなＲＮＡである。さらなる態様では、阻害性核酸は、樹状細胞に導入されているｓｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡであってよい。このようなＲＮＡの詳細な開示は、上に示されている。

さらなる態様では、遺伝子改変には、ＣＴＬＡ−４を低下させる、細胞集団におけるゲノムの欠失または挿入が含まれる。別の態様では、樹状細胞は、ＣＴＬＡ−４遺伝子内にヘミ接合欠失またはホモ接合欠失を含む。例えば、いくつかの態様では、ＣＴＬＡ−４ポリペプチドの発現を阻害するように、樹状細胞のＣＴＬＡ−４遺伝子の１つまたは両方のコピーを完全または部分的に欠損させることができる。いくつかの態様では、１つ以上のＣＴＬＡ−４遺伝子を発現しないように細胞を改変することは、ＣＴＬＡ−４遺伝子座を特異的に標的とする人工ヌクレアーゼを細胞に導入することが含まれていてよい。様々な態様において、人工ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９であってよい。様々な態様において、人工ヌクレアーゼを細胞に導入することは、人工ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを細胞に導入することが含まれていてよい。

したがって、いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）による破壊など、１つ以上のＤＮＡ結合核酸を用いてゲノム改変（例えば、ゲノムの編集の削除）を行う。例えば、この破壊は、クラスター化した規則的な配置の短い回文反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）とＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質を用いて行うことができる。概して、「ＣＲＩＳＰＲシステム」とは総合的には、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡまたは活性部分ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒ−メイト配列（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムの関連においては、「ダイレクトリピート」と、ｔｒａｃｒＲＮＡによってプロセッシングされる部分ダイレクトリピートを含む）、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムの関連においては、「スペーサー」ともいう）ならびに／またはＣＲＩＳＰＲ遺伝子座のその他の配列及び転写産物を含め、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の発現または活性の誘導に関わる転写産物とその他の要素を指す。

ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムは、ＤＮＡに配列特異的に結合する非コードＲＮＡ分子（ガイド）ＲＮＡと、ヌクレアーゼ機能（例えば、２つのヌクレアーゼドメイン）を持つＣａｓタンパク質（例えばＣａｓ９）を含むことができる。ＣＲＩＳＰＲシステムの１つ以上の要素は、タイプＩ、タイプＩＩまたはタイプＩＩＩ ＣＲＩＳＰＲシステムから得ることができ、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓのように、内因性ＣＲＩＳＰＲシステムを含む特定の生物から得ることができる。

いくつかの態様では、ＣａｓヌクレアーゼとｇＲＮＡ（標的配列に特異的なｃｒＲＮＡと固定ｔｒａｃｒＲＮＡとの融合体を含む）が細胞に導入されている。概して、ｇＲＮＡの５’末端の標的部位は、相補的な塩基対合を用いて、Ｃａｓヌクレアーゼを標的部位、例えば遺伝子に導く。標的部位は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列（典型的にはＮＧＧまたはＮＡＧなど）の５’末端の直前の位置に基づき、選択してよい。この関連では、ガイドＲＮＡの最初の２０ヌクレオチドを改変して、標的ＤＮＡ配列に対応させることによって、ｇＲＮＡを所望の配列に導く。概して、ＣＲＩＳＰＲシステムは、標的配列部位でのＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促す要素によって特徴付けられる。典型的には、「標的配列」は広くは、その配列と相補性を有するようにガイド配列が設計されている配列を指し、標的配列とガイド配列とのハイブリダイゼーションによって、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促す。ハイブリダイゼーションを起こして、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促すのに十分な相補性があれば、完全な相補性は必ずしも必要ではない。

ＣＲＩＳＰＲシステムは、標的部位において二本鎖の切断（ＤＳＢ）を誘導した後、本明細書で論じられているような破壊をもたらすことができる。別の実施形態では、「ニッカーゼ」とみなされるＣａｓ９変異体を用いて、標的部位において一本鎖にニックを入れる。例えば、一対のニッカーゼを用いて、特異性を高めることができ、それらのニッカーゼはそれぞれ、配列を標的とする一対の異なるｇＲＮＡによってそれぞれ導かれ、ニックが導入されたら、同時に５’末端のオーバーハングが導入されるようになっている。別の実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓ９が異種のエフェクターに融合されている。

典型的には、内因性ＣＲＩＳＰＲシステムの関連では、ＣＲＩＳＰＲ複合体（標的配列とハイブリダイズされるとともに、１つ以上のＣａｓタンパク質と複合体を形成するガイド配列を含む）の形成により、標的配列内または標的配列の近く（例えば、標的配列から１塩基対、２塩基対、３塩基対、４塩基対、５塩基対、６塩基対、７塩基対、８塩基対、９塩基対、１０塩基対、２０塩基対、５０塩基対またはそれを超える塩基対以内）の１本または両方の鎖が切断される。ｔｒａｃｒ配列（野生型ｔｒａｃｒ配列の全部または一部（例えば、野生型ｔｒａｃｒ配列の約２０ヌクレオチド以上、約２６ヌクレオチド以上、約３２ヌクレオチド以上、約４５ヌクレオチド以上、約４８ヌクレオチド以上、約５４ヌクレオチド以上、約６３ヌクレオチド以上、約６７ヌクレオチド以上、約８５ヌクレオチド以上、またはそれを超えるヌクレオチド以上）を含むか、または野生型ｔｒａｃｒ配列の全部または一部からなっていてもよい）は、ガイド配列に機能可能に連結されているｔｒａｃｒメイト配列のすべてまたは一部と、ｔｒａｃｒ配列の少なくとも一部に沿ってハイブリダイズするなどによって、ＣＲＩＳＰＲ複合体の一部を形成してもよい。ｔｒａｃｒ配列は、ハイブリダイズしてＣＲＩＳＰＲ複合体の形成に関与するのに十分な相補性をｔｒａｃｒメイト配列に対して有し、例えば、最適に整列させたとき、ｔｒａｃｒメイト配列の長さ沿いの配列相補性が少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％である。

ＣＲＩＳＰＲシステムの１つ以上の要素の発現を駆動する１つ以上のベクターを細胞に導入して、ＣＲＩＳＰＲシステムの要素の発現によって、１つ以上の標的部位においてＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を導くようにできる。例えば、Ｃａｓ酵素と、ｔｒａｃｒ−メイト配列に連結されたガイド配列と、ｔｒａｃｒ配列はそれぞれ、別のベクターの別の調節要素に機能可能に連結できる。あるいは、同じまたは異なる調節要素から発現される要素の２つ以上を１つのベクター内で組み合わせてよく、１つ以上の追加のベクターによって、その第１のベクターに含まれていないＣＲＩＳＰＲシステムのいずれかの成分をもたらしてよい。そのベクターは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列のような挿入部位（「クローニング部位」ともいう）を１つ以上含んでよい。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入部位は、１つ以上のベクターの１つ以上の配列要素の上流及び／または下流に位置している。複数の異なるガイド配列を用いるときには、１つの発現コンストラクトを用いて、細胞内の複数の異なる対応標的配列にＣＲＩＳＰＲ活性を導いてよい。

ベクターは、Ｃａｓタンパク質のようなＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に機能可能に連結された調節要素を含んでよい。Ｃａｓタンパク質の非限定的な例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２としても知られている）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆｌ、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、それらのホモログまたはそれらの改変型が挙げられる。これらの酵素は既知であり、例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースにおいて、受託番号Ｑ９９ＺＷ２で見ることができ、このデータは、参照により本明細書に援用される。

ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ９（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓまたはＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ由来のもの）であることができる。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の位置（標的配列内及び／または標的配列の相補体内の位置など）で、１本または両方の鎖の切断を誘導できる。ベクターは、対応する野生型酵素に対して変異が加えられているＣＲＩＳＰＲ酵素をコードして、その変異ＣＲＩＳＰＲ酵素が、標的配列を含む標的ポリヌクレオチドの１本または両方の鎖を切断する能力が欠損するようにできる。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９のＲｕｖＣ Ｉ触媒ドメインにおけるアスパルテートをアラニンに置換すると（Ｄ１０Ａ）、Ｃａｓ９が、両方の鎖を切断するヌクレアーゼから、ニッカーゼ（１本鎖を切断する）に変換される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼは、ガイド配列（複数可）、例えば、ＤＮＡ標的のそれぞれセンス鎖とアンチセンス鎖を標的とする２つのガイド配列と組み合わせて用いてよい。この組み合わせによって、両方の鎖にニックを入れて、ＮＨＥＪを誘導するのに用いることが可能になる。

いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列は、真核細胞のような特定の細胞での発現のために、コドンが最適化されている。真核細胞は、哺乳動物（ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌまたはヒト以外の霊長類動物が挙げられるが、これらに限らない）のような特定の生物の細胞であっても、このような生物に由来するものであってもよい。概して、コドンの最適化とは、対象とする宿主細胞での発現を高めるために、天然型アミノ酸配列を保持しながら、天然型配列の少なくとも１つのコドンを、その宿主細胞の遺伝子で使用される頻度が多いかまたは最も多いコドンに置き換えることによって、核酸配列を改変するプロセスを指す。様々な種が、特定のアミノ酸の特定のコドンについて特定のバイアスを示す。コドンバイアス（生物間のコドン使用頻度の差）は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率と相関する場合が多く、これは、とりわけ、翻訳されるコドンの特性及び特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用性に依存すると考えられている。細胞中の選択されるｔＲＮＡの優勢は概して、ペプチド合成において最も頻繁に使用されるコドンを反映したものである。したがって、遺伝子は、コドンの最適化に基づいて、所定の生物において最適に遺伝子が発現されるように調節できる。

概して、ガイド配列は、標的配列とハイブリダイズして、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列への配列特異的な結合を誘導するように、標的ポリヌクレオチド配列と十分な相補性を有するいずれかのポリヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態では、ガイド配列とその対応する標的配列との相補性の程度は、好適なアラインメントアルゴリズムを用いて最適に整列させたとき、約５０％以上、６０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７．５％以上、９９％以上またはそれ以上である。

ＩＶ．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証する目的で含まれている。以下の実施例に開示されている技法は、本発明の実施において十分に機能することを本発明者が見出した技法を表しているので、本発明を実施するための好ましい態様を構築するとみなすことができることを当業者は理解すべきである。しかしながら、当業者であれば、本開示に鑑み、本発明の趣旨及び範囲から逸脱しなければ、開示されている具体的な実施形態に多くの変更を加えることができ、その変更によっても、同様または類似の結果が得られることが分かるはずである。

実施例１−材料及び方法
下記の実施例で用いた試薬は、以下のとおりである。ウエスタンブロット及びｃｏＩＰ抗体−αヒトＣＴＬＡ−４クローンＡ３．６Ｂ１０．Ｇ１（カタログ番号：５２５４０１、カリフォルニア州サンディエゴのＢｉｏｌｅｇｅｎｄ）、αヒトＣＴＬＡ−４クローンＢＮＩ３（カタログ番号：５５５８５１、カリフォルニア州サンディエゴのＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、αヒトＣＴＬＡ−４（カタログ番号：ａｂ１０７１９８、マサチューセッツ州ケンブリッジのＢｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ヒト／マウスαＩＬ−１２ｐ３５（カタログ番号：ＭＡＢ１５７０、ミネソタ州ミネアポリスのＲ＆Ｄ）、ヒトαＩＦＮγ（カタログ番号：ａｂ９６５７、マサチューセッツ州ケンブリッジのＡｂｃａｍ）、プロテインＧプラスアガロース懸濁液（カタログ番号：ＩＰ０４、マサチューセッツ州ビレリカのＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、ヒトＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ（商標）ＦＣ ｂｌｏｃｋ（カタログ番号：４２２３０１、カリフォルニア州サンディエゴのＢｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ポンソーＳ溶液（カタログ番号：６２２６−７９−５、ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ）、Ｒｅｓｔｏｒｅ（商標）Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ Ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（カタログ番号：２１０５９、イリノイ州ロックフォードのＰｉｅｒｃｅ）、二次抗体（αＧｏａｔ−ＨＲＰ、αウサギ−ＨＲＰ、αマウス−ＨＲＰ）及びβ−アクチン（テキサス州ダラスのＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ）。機能性抗体−αヒトＣＤ３クローンＵＣＨＴ１（カタログ番号：５５５３２９、カリフォルニア州サンディエゴのＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、αヒトＣＤ２８（カタログ番号：５５５７２５、カリフォルニア州サンディエゴのＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）。フロー抗体−αヒトＣＤ１１Ｃ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＩＦＮγ及びＣＴＬＡ−４フロー抗体（カリフォルニア州サンディエゴのＢｉｏｌｅｇｅｎｄ）。Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｔｅｔｒａｍｅｒ Ｃｏｒｅ（テキサス州ヒューストン）から得たＨＩＶテトラマー（ＨＩＶ−ｐｏｌ４６８、ＩＬＫＥＰＶＨＧＶ）。共焦点顕微鏡抗体及び試薬−αＣＴＬＡ−４−ビオチンクローンＢＮＩ３（カタログ番号：５５５８５２、カリフォルニア州サンノゼのＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ストレプトアビジン−ＡＰＣ（カタログ番号：５５４０６７、カリフォルニア州サンノゼのＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、Ｒａｂ５（カタログ番号：１０８０１１、マウス−モノクローナル、ドイツのｓｙｎａｐｔｉｃ ｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｒａｂ１１（カタログ番号：６１０６５６ ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｇｉａｎｔｉｎ（許可元：テキサス州ヒューストンのＢＣＭのＤｒ．Ｒｉｃｋ Ｓｉｆｅｒｓ）、Ａｌｅｘａ−ｆｌｕｏｒ Ｍｓ５４６（許可元：テキサス州ヒューストンのＢＣＭのＤｒ．Ａｎｎａ Ｓｏｋａｃ）、Ａｌｅｘａ−ｆｌｕｏｒ Ｒｂ５４６（許可元：テキサス州ヒューストンのＢＣＭのＤｒ．Ａｎｎａ Ｓｏｋａｃ）、ＣＤ３−ＦＩＴＣ（カタログ番号：５５５３３２、カリフォルニア州サンノゼのＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＣＤ１１ｃクローン３．９−Ａｌｅｘａ−ｆｌｕｏｒ ４８８：（カタログ番号：３０１６１８、カリフォルニア州サンノゼのＢｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＤＡＰＩ：ＳｌｏｗＦａｄｅ（登録商標）Ｇｏｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔａｎｔ（カタログ番号：Ｓ３６９３８、ニューヨーク州グランドアイランドのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）。樹状細胞の選択及び濃縮−Ｈｕｍａｎ ＣＤ１４ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（カタログ番号：１８０１８、ＥａｓｙＳｅｐ、カナダのバンクーバーのＳｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｈｕｍａｎ Ｍｙｅｌｏｉｄ ＤＣ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｋｉｔ（カタログ番号：１９０２１、ＥａｓｙＳｅｐ、カナダのバンクーバーのＳｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。

Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（テキサス州ヒューストン）から４〜６週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを得た。Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅの規定のＩＡＣＵＣ要件に従って、すべてのマウスを維持した。

樹状細胞の調製、濃縮及び成熟：正常ドナー末梢血バフィーコートをＧｕｌｆ Ｃｏａｓｔ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｂａｎｋから得た。製品をＰＢＳ（ニュージャージー州アレンデールのＬｏｎｚａ）で１：３で希釈し、４５０×ｇにおいてフィコール勾配（Ｌｙｍｐｈｏｌｙｔｅ、ノースカロライナ州バーリントンのＣｅｄａｒｌａｎｅ Ｌａｂｓ）で遠心分離して、生存白血球を単離した。ＣｌｉｎｉｍａｃｓというＣＤ１４ビーズ（カリフォルニア州サンディエゴのＭｉｌｔｅｎｙｉ−Ｂｉｏｔｅｃ）をメーカーの指示に従って用いて、ＣＤ１４^＋細胞を全ＰＢＭＣから磁気分離した。１０％ヒトＡＢ血清（ジョージア州ローレンスビルのＡｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）と、５０μｇ／ｍｌの硫酸ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と、１０μｇ／ｍｌの硫酸ゲンタマイシンと、２ｍＭのｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と、５０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ（カリフォルニア州サウザンドオークスのＡｍｇｅｎ）と、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４（ミネソタ州ミネアポリスのＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）とを添加したＡＩＭ−Ｖ培地（カリフォルニア州カールスバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、ＣＤ１４^＋細胞を６日間培養した。３日目に、培養培地を除去し、等量の新鮮な培地を補給した。加湿容器において、３７℃、５％の大気中ＣＯ_２で細胞を培養した。分化から６日目に、未熟ＤＣを採取し、ＥａｓｙＳｅｐ Ｈｕｍａｎ Ｍｙｅｌｏｉｄ ＤＣ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｋｉｔ（ブリティッシュコロンビア州バンクーバーのＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をメーカーの指示に従って用いて、さらに濃縮した。成熟した場合、ＤＣをさらに４８時間、ＩＴＩＰ［１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１β（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）と、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）と、１５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）と、１μｇ／ｍｌのＰＧＥ_２（Ｓｉｇｍａ）］を加えた以外は、上記のようにＡＩＭ−Ｖで培養した。

寛容原性樹状細胞：バフィーコートＤＣを接着性単球から調製し、上記のようにインキュベートした。ただし、１００ｎｇ／ｍｌのマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）と１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β（カリフォルニア州サンディエゴのｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の存在下で分化させた。通常のＤＣ調製物との違いをＣＤ１１ｃ、ＣＤ８０、ＣＤ８３及びＣＤ８６のフローサイトメトリーによって確認した。

Ｔ細胞刺激と解析：バフィーコートの非付着性画分からＰＢＭＣを単離し、ＲＰＭＩ−１０％ＦＢＳ、１％アンチアンチに再懸濁し、１ｕＭのＣＦＳＥを負荷し、１ｕｇ／ｍｌの固定化αＣＤ３（クローンＵＣＨＴ１）を事前にコーティングした（２４時間、４℃）９６ウェル免疫吸収平底プレートに、１×１０^６／ウェルで播種した。このプレートを３７℃、５％ＣＯ_２で３日日インキュベートし、細胞をＰＢＳで洗浄し、９６ウェル丸底プレートに１０^５細胞／ウェルで再播種し、αＣＤ２８（様々な濃度）で３日間、３７℃、５％ＣＯ_２で処理した。あるいは、ＰＢＭＣは、４日間、様々な濃度のＳＥＢで処理した。続いて、細胞をフローサイトメトリーによって、ＣＦＳＥレベルについて解析し、培養上清液をウエスタンブロットによってＩＦＮ−γについて解析した。

ｓｉＲＮＡのトランスフェクション：ＣＴＬＡ−４（マウス及びヒト）ｓｉＧｅｎｏｍｅ ＳＭＡＲＴ Ｐｏｏｌと非ターゲティングｓｉＲＮＡプールをＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（デラウェア州ウィルミントン）から購入した。簡潔に述べると、５０μｌのｓｉＲＮＡバッファー中でｓｉＲＮＡを再構成し、１ｕｌ／反応物をＶｉａｓｐａｎ（ニューヨーク州ポモーナのＢａｒｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｔｅｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓの子会社））で予め希釈してから、Ｖｉａｓｐａｎに再懸濁した細胞（２０〜４０×１０^６／ｍｌ）に１：１で加えた。細胞を氷上で１０分インキュベートしてから、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ（カリフォルニア州ハーキュリーズのＢｉｏ−ｒａｄ）を用いてエレクトロポレーションを行った（ＤＣ−２５０Ｖ、１２５μＦ、Ω＝∞、４ｍｍキュベット、Ｔ細胞−１４０Ｖ、１０００μＦ、Ω＝∞、４ｍｍキュベット）。

ウエスタンブロット及び解析：すべてのゲル電気泳動は、変性・還元条件下、１２％ポリアクリルアミドゲルで行った後、抗体プロービングのために、０．４５μｍのニトロセルロース膜に転写した。すべてのブロック及び抗体染色工程は、５％ミルク中で行い、一次抗体を一晩、４℃で適用した。Ｉｍａｇｅ Ｌａｂ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０．１というソフトウェア（カリフォルニア州ハーキュリーズのＢｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によってサポートされているＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳというデジタル画像システムを用いて、ウエスタンブロット化学発光シグナルを検出した。いずれのウエスタンブロットも、ポンソーＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）染色膜のデンシトメトリーによって定量した。細胞死からの残存細胞の溶解液または破片の上清液への混入は、抗βアクチン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）による免疫染色と追加のデンシトメトリーによって制御した。デンシトメトリーは、ＩｍａｇｅＪというソフトウェア（メリーランド州ベセスダのＮＩＨ）を用いて行った。いずれのウエスタンブロットも、少なくとも３回の独立した実験を表すものである。

免疫共沈降：個々の実験アプローチに基づき、サンプルを調製した。培養培地上清液を遠心分離（４００×ｇ、室温、５分）によって細胞から分離したか、または細胞を様々な濃度のＮＰ−４０細胞溶解バッファー（１時間、４℃）で溶解させてから、破片を遠心分離した（２０分、４℃、２０，０００×ｇ）。続いて、サンプルをネイキッドプロテインＧプラスビーズでプレクリアし（回転させながら１時間、室温）、その後、ビーズを遠心分離した（１０分、室温、１００×ｇ）。次に、残った上清液をαＣＴＬＡ−４コートビーズとともにインキュベートし（回転させながら一晩、４℃）、その後、ビーズを遠心分離した（１０分、室温、１００ｘｇ）。続いて、ビーズをＰＢＳまたは洗剤で５回丁寧に洗浄し、ＳＤＳ及びβ−メルカプトエタノールを含むゲル電気泳動ローディングダイで、プロテインＧプルダウンの残った中身をボイルしてから、ウエスタンブロットによって解析した。

フローサイトメトリー及び解析：いずれのフローサイトメトリー解析も、ＬＳＲ ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて行って、ＭａｃＩｎｔｏｓｈ用のＦｌｏｗＪｏ バージョン１０．０．００００３（オレゴン州アシュランドのＴｒｅｅ Ｓｔａｒ Ｉｎｃ）で解析した。示されているすべてのフロー解析は、少なくとも３回の独立した実験を表すものである。

免疫蛍光法及び共焦点顕微鏡：６ウェルプレートで樹状細胞を培養し、成熟させてから、遠心分離（４００×ｇ、室温、５分）によって、２４ウェルプレート内の１２ｍｍの丸いポリ−Ｌ−リジンコートカバースリップ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ）に回収した。培地を吸引除去し、細胞を氷冷ＰＢＳで２回、緩やかに洗浄した。細胞をＰＥＭ（８０ｍＭのカリウムＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．８）、５ｍＭのＥＧＴＡ（ｐＨ７．０）及び２ｍＭのＭｇＣｌ_２、いずれもＳｉｇｍａ製）バッファー中の４％ホルムアルデヒドで３０分、氷上で固定した。固定後、細胞をＰＥＭバッファーで３回洗浄した（５分／１回）。自家蛍光を消光するとともに、抗原性を高めるために、上記のカバースリップを５分間、ＰＥＭバッファー中の新たに作製した１ｍｇ／ｍｌの水素化ホウ素ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）で２回インキュベートした。消光の後、細胞を２回、ＰＥＭバッファーで洗浄した。続いて、カバースリップをＰＥＭ＋０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００（マサチューセッツ州ウォルサムのＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で３０分インキュベートすることによって、細胞を透過処理した。細胞を３回、ＰＥＭバッファーで洗浄した（５分／１回）。ＴＢＳ−Ｔ／１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）でブロッキングを行った（１時間、室温）。ブロッキングバッファーを除去し、適当な一次抗体を加え、細胞をその一次抗体で一晩、４℃でインキュベートした。一次抗体を除去し、細胞を５回、ブロッキングバッファーで洗浄してから、適当な二次抗体でインキュベートした（１時間、室温）。二次抗体を除去してから、ＴＢＳ−Ｔで５回、ＰＥＭで２回洗浄した（それぞれ５分）。続いて、細胞をＰＥＭ中の４％ホルムアルデヒドで２０分固定してから、３回、ＰＥＭで洗浄した（５分）。自家蛍光を消光するために、カバースリップを２回、ＰＥＭバッファー中の新たに作製した１ｍｇ／ｍｌの水素化ホウ素ナトリウムでインキュベートしてから、２回、ＰＥＭで洗浄し、２回、ＴＢＳ−Ｔで洗浄した。続いて、細胞をＤＡＰＩ（ニューヨーク州グランドアイランドのＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ部門）で２分間対比染色した。ＤＡＰＩを除去し、ＴＢＳ−Ｔを細胞に加えた。Ｐｒｏｌｏｎｇ（登録商標）Ｇｏｌｄ ａｎｔｉｆａｄｅ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて、カバースリップをスライドに取り付けた。６０倍／開口数０．９５の油浸対物レンズを備えるＺｅｉｓｓ ＬＳＭ ７１０共焦点顕微鏡（マサチューセッツ州ピーボディのＣａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，Ｉｎｃ）で、画像を取得した。２倍のズーム倍率、１画素当たり１０４ｎｍの解像度で画像を得た。用いた抗体は、ストレプトアビジン−ＡＰＣ（１：５００）を含むＣＴＬＡ−４−ビオチン（０．２５μｇ／ｍｌ）、Ａｌｅｘａ−ｆｌｕｏｒ Ｍｓ５４６（１：５００）を含むＲａｂ５（１：１０００）、Ａｌｅｘａ−ｆｌｕｏｒ Ｒｂ５４６（１：５００）を含むＧｉａｎｔｉｎ（１：１０００）、ＣＤ３−ＦＩＴＣ（１：１０）、ＣＤ１１ｃ−Ａｌｅｘａ−ｆｌｕｏｒ４８８（２．５ｕｇ／ｍＬ）及びＤＡＰＩ（１：２５００）であった。示されているすべての画像は、少なくとも３回の独立した実験を表すものである。

ＣＴＬＡ−４ ＲＴ−ＰＣＲ：負荷した成熟ＤＣを１ｍｌのＴｒｉｚｏｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に、１サンプル当たり＜１×１０^７細胞で再懸濁し、メーカーの指示に従って全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡを１μｇ／μｌのＤＮａｓｅ Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処理した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ＤＮａｓｅで処理したＲＮＡサンプルからｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲによって、３５サイクル、５５℃のアニーリング温度で、ＣＴＬＡ−４フォワードプライマー（ＡＴＧＧＣＴＴＧＣＣＴＴＧＧＡＴＴＴＣＡＧＣＧＧＣ（配列番号１））とＣＴＬＡ−４リバースプライマー（ＴＣＡＡＴＴＧＡＴＧＧＧＡＡＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＧ（配列番号２）を用いて増殖した。プライマーは、可溶性ＣＴＬＡ−４アイソフォームと膜結合型ＣＴＬＡ−４アイソフォームの両方に対応する転写産物を増幅するように設計した。コントロールとして、ＧＡＰＤＨを増幅した。

インビトロ共培養：樹状細胞をＣＴＬＡ−４または非ターゲティングｓｉＲＮＡのいずれかで、合わせて７２時間処理し、合わせて４８時間成熟させてから、ＲＰＭＩ−１６４０／１０％ＦＢＳ／１％アンチアンチで、自己Ｔ細胞と１：１０の比で共培養セットアップを行い、３７℃、５％大気中ＣＯ_２でインキュベートした。９日目に、Ｔ細胞を適当なＤＣで再刺激し、５日目、７日目、１０日目、１２日目、１４日目、１６日目、１８日目、２０日目、２２日目に、対応する拡張許容性で、２００ＩＵ／ｍｌの組み換えヒトＩＬ−２（カリフォルニア州エメリービルのＮｏｖａｒｔｉｓの子会社のＣｈｉｒｏｎ）を培養液に加えた。増殖の計数とフローサイトメトリー解析のために、様々な時点にＴ細胞を回収した。

インビボＢ１６腫瘍／ワクチン接種：マウス骨髄由来ＤＣ（ＢＭＤＣ）を下記のように調製した。Ｃ５７ＢＬ／６マウス大腿骨と脛骨から骨髄を単離し、赤血球をＡＣＫ溶解バッファー（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で５分間、室温で溶解させ、残った細胞を４０ｍｌのＲＰＭＩ／１０％ＦＢＳ／１％アンチアンチに再懸濁し、播種した（約１匹のマウス／２０ｍｍのグリッドを有する１５０×２５ｍｍの組織培養皿）。培地に２０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦと１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４を添加した。３日目及び５日目に培地を新しくし、６日目に細胞を採取して、それに従って処理した。注射の７２時間前に、ＢＭＤＣに、ｓｉＲＮＡをエレクトロポレーションし、負荷し、２４時間成熟させてから、Ｂ１６で処理したレシピエントマウスの同側のフットパッドに注射した。レシピエントマウスには、ＤＣの注射の７２時間前に、５０，０００個のＢ１６細胞を脇腹に皮下投与した（ＤＣ投与時に、腫瘍をかろうじて触ることができるようにした）。ＤＣの注射に付随して、マウス１匹当たり５００ｕｇのイミキモド（Ｓｉｇｍａ）で腫瘍周辺にアジュバント投与を行った。１４日目に、イミキモドによる追加のアジュバント投与と併せて、マウスの同側のフットパッドに追加免疫を行った。腫瘍をカリパスによって一日おきに測定した。

実施例２−ＤＣにおけるＣＴＬＡ−４の発現の確認と特徴付け
単球由来ＤＣは、ＣＴＬＡ−４ｍＲＮＡ転写産物を発現するが、細胞表面には、検出可能なＣＴＬＡ−４を呈さないことを本発明者は以前報告した（Ｄｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００９）。いくつかの他の散発的な報告書にも、多種多様な条件で、ＤＣまたはＣＤ１４^＋骨髄細胞によってＣＴＬＡ−４が発現されることが示唆されているが、最終的な特徴付けは、きちんと行われていない（Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１１、Ｌａｕｒｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，２０１０、Ｐｉｓｔｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，２００３）。本発明者は、ＣＴＬＡ−４の表面での発現が検出不能であったことを踏まえ、ＣＴＬＡ−４のＤＣによる発現が、細胞内発現、分泌発現またはこれらの可能性の組み合わせであり得るという仮説を試験しようと試みた。ＤＣがＣＴＬＡ−４を分泌するか否かを判断するために、本発明者は、いくつかの異なる成熟ＤＣ調製物の培養培地と、培養した同系の非付着性ＰＢＭＣ（末梢血単核球）の培養培地をウエスタンブロット解析によって解析したところ、ＤＣ調製物の培養培地のみで、ＣＴＬＡ−４が検出された（図１Ａ）。ＣＴＬＡ−４が、培養培地自体の固有の成分でないことを確認した後（図７）、本発明者はさらに、ＣＴＬＡ−４のｓｉＲＮＡノックダウンによって（図１Ａ）、また、十分に特徴付けがなされている２つの異なるαＣＴＬＡ−４クローン（ＢＮＩ３及びＡ３．６Ｂ１０．Ｇ１）の１つに共有結合したビーズを用いて、細胞培養培地のＣＴＬＡ−４特異的枯渇を行うことによって、推定されたＣＴＬＡ−４ウエスタンブロットバンドの同一性を確認した。それぞれのビーズ結合抗体クローンは独立して、ウエスタンブロットによって検出されるＣＴＬＡ−４バンドを実質的に阻害できたが、無関連のアイソタイプコントロール抗体に結合したビーズは、阻害できなかった（図１Ｂ）。いずれのビーズ結合抗体も、ＩＬ−１２のような非特異的タンパク質のシグナルを低下させなかった（図１Ｂ）。興味深いことに、培養培地で最も顕著に見られるＣＴＬＡ−４アイソフォームは、３７ｋｄの分子量マーカー（すでに報告済みのサイズの完全長（ｆｌＣＴＬＡ−４）アイソフォームであって、細胞質ドメインと膜貫通ドメインの両方を含むアイソフォーム）のすぐ上に移動した。これに対して、天然の条件または過刺激条件では、増殖、活性化及びＩＦＮ−γの放出は有意に増大したにもかかわらず（図８Ａ〜Ｂ）、ＣＴＬＡ−４の分泌は、ＣＤ１４⁻ＰＢＭＣからは検出されなかった（図１Ａ）。さらに、ＣＤ１４の選択と、その後のＣＤ１１ｃの濃縮によって生成されたＤＣ調製物は、実質的にＣＤ３^＋細胞が枯渇されていたことを本発明者は示したが（図９）、これにより、分泌ＣＴＬＡ−４源が実際に、ＣＤ１１ｃ^＋ＣＤ３⁻の細胞種であったことが示唆されている。ＣＴＬＡ−４ ｓｉＲＮＡが本当にＣＴＬＡ−４を標的としているかを確かめるために、非付着性ＰＢＭＣに、同じＣＴＬＡ−４ ｓｉＲＮＡプールをトランスフェクションし、ＣＤ３^＋Ｔ細胞におけるＣＴＬＡ−４ノックダウンの、予測した機能的結果（すなわち活性化）を確認した（図１０）。単球由来ＤＣは、ＣＴＬＡ−４を発現及び分泌する。

本発明者は、ＤＣに起因する分泌ＣＴＬＡ−４の存在を踏まえ、ＤＣ自体の上または中にＣＴＬＡ−４が見られるのではないかと推定した。本発明者は、未熟または成熟ＤＣの表面では、ＣＴＬＡ−４を普通には検出できなかったが、フローサイトメトリー（図２Ａ）と共焦点顕微鏡（図２Ｂ）によって、細胞内でＣＴＬＡ−４を認めた。ＤＣは、成熟するにつれて（図２Ａ、２Ｂ）、ＣＴＬＡ−４の発現が有意に増えることが観察され、この観察は、ＲＴ−ＰＣＲによって裏付けられた（図２Ｃ）。実際、ＣＴＬＡ−４発現の上方制御は、ＣＤ８０及びＣＤ８３のような他の成熟マーカーの上方制御と密接に相関していた（図１１）。活性化Ｔ細胞と比べて、ＣＴＬＡ−４局在のパターンは明らかに異なり、細胞膜の近くに集中しているのではなく、細胞の内側にわたって分散しているようであった（図２Ｄ）。さらに、Ｍ−ＣＳＦとＴＧＦ−βの存在下で生成した寛容化または「寛容原性」ＤＣの染色（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００７）によって、ＣＴＬＡ−４発現レベルが、ＧＭ−ＣＳＦで生成した通常のＤＣよりもｌｏｇ倍高いＣＤ１１ｃ^＋細胞集団が示された（図２Ｅ）。さらに、健常なドナーから採取した循環ＣＤ１１ｃ^＋細胞が、ドナー適合性循環ＣＤ３^＋細胞に匹敵する細胞内ＣＴＬＡ−４レベルを示したことで、インビボでの生理的関連性（図１２）を裏付け、アイソタイプコントロール抗体は、高い染色特異性を示した（図１３）。ＣＴＬＡ−４のｓｉＲＮＡノックダウンにより、ウエスタンブロット（図１４Ａ）と共焦点顕微鏡（図１４Ｃ）の両方によって示されているように、５日にわたって、シグナルが有意に低下した。興味深いことに、ＤＣのＣＴＬＡ−４は、非常に安定しているようであったとともに、ｓｉＲＮＡ投与から４８時間後〜９６時間後に、ほぼすべて、シグナルの低下が観察された（図１４Ｂ）。これは、ｓｉＲＮＡ投与から２４時間以内にほぼノックダウンが完了したＴ細胞ＣＴＬＡ−４の安定性と有意な対比をなしていた。

ＣＴＬＡ−４アイソフォームの検出にかかわらず、適切なサイズの可溶性ＣＴＬＡ−４（すなわち、膜貫通ドメインなしに発現されるもの。データは示されていない）は、ＤＣ培養培地で検出されたＣＴＬＡ−４の優勢なアイソフォームではなかった。むしろ、検出されたＣＬＴＡ−４の大部分は、予測されるサイズにおいて、完全長（ｆｌＣＴＬＡ−４）アイソフォームに対応していた。ＤＣは、多数のリガンド、レセプター及びその他の分子を含む微小胞の誘導分泌を通じて、他の細胞とやりとりを行うことが報告されている（Ｓｏｂｏ−Ｖｕｊａｎｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。微小胞は脂質膜を有するので、ＤＣの微小胞放出によって、ｆｌＣＴＬＡ−４を分泌させるのにふさわしいであろう。このような場合には、ｃｏＩＰによって微小胞が枯渇されると、ＣＴＬＡ−４も培養上清液から枯渇するはずである。ＬＡＭＰ−３（リソソーム膜タンパク質３）またはＣＤ６３は、エンドソームマーカーであり、循環微小胞／エクソソームの表面で見られる非常に豊富なタンパク質の１つとしても関係があるとされている（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｇｕｍｍｕｌｕｒｕ，２００６）。ＤＣ細胞培養上清液のＣＤ６３ ｃｏＩＰは、ウエスタンブロットによって事前に見られたＣＴＬＡ−４シグナルをほぼ完全に阻害し（図３Ａ）、ＤＣ培養培地からのＣＤ６３^＋微小胞の除去は、観察されるｆｌＣＴＬＡ−４の除去にも十分であったことが示された。ＣＤ６３ ｃｏＩＰの前のエクソソーム画分の部分的溶解により、ｆｌＣＴＬＡ−４シグナルが多少回復された。これはおそらく、微小胞脂質膜の溶解により、ＣＤ６３含有小胞から、多少ＣＴＬＡ−４が解放されたからである。ＣＤ６３ ｃｏＩＰの非存在下での溶解は、培地で検出されるＣＴＬＡ−４の量に影響を及ぼさなかったことから、ＣＤ６３抗体がＣＴＬＡ−４を非特異的に除去した可能性または溶解手順がウエスタンブロットでの検出を妨げた可能性が排除された。細胞外環境で観察されたｆｌＣＴＬＡ−４が、ＣＤ６３含有微小胞内に局在されたことをさらに確かめるために、ＮＰ−４０細胞溶解バッファーの濃度を増しながら、１時間、上清液を溶解し、残った微小胞をＣＤ６３ ｃｏＩＰによって枯渇させ、残ったＣＴＬＡ−４含有量をウエスタンブロットによって解析した。示されているように、細胞溶解バッファーの濃度を向上させたほど、ウエスタンブロットによって、強いｆｌＣＴＬＡ−４シグナルが得られ、ＣＤ６３ ｃｏＩＰによってエクソソームを枯渇しなかった上清液のシグナルと同程度であった（図３Ａ）。

分泌小胞における細胞外ＣＴＬＡ−４の存在は、その分泌機構の成分と共局在する細胞内ＣＴＬＡ−４の存在と一致するはずである。共焦点顕微鏡により、未熟ＤＣのゴルジ体内における細胞内ＣＴＬＡ−４の良好な共局在が示された（図３Ｂ）。成熟すると、ＣＴＬＡ−４の共局在は、ゴルジ体からＲａｂ５（エンドソーム生合成のマスター制御因子であるとともに、分泌エンドソームを同定するマーカーであることが知られているスモールＧＴＰａｓｅ）に移る（図３Ｂ／３Ｃ）（Ａｚｏｕｚ ｅｔ ａｌ，２０１４）。Ｒａｂ１１（リサイクリングエンドソームのマーカー（Ｕｌｌｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９６））では、ＣＴＬＡ−４との共局在はいずれかの有意な程度では観察されなかった（図１５）。未熟ＤＣにおけるゴルジ体との共局在または成熟ＤＣにおけるＲａｂ５との共局在は、相容れなかった。共焦点データにより、Ｒａｂ５とのＣＴＬＡ−４の共局在は、高度に極性化された形で細胞質内で（図３Ｃ、左パネル）、かつ出芽プロセスにおける分泌輸送小胞内で（図３Ｃ、右パネル）行われ得ることが示された。Ｔｏｔａｌ Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて、３つの独立した生体サンプルに由来するＤＣ上清液から、３０〜１２０ｎｍのサイズのエクソソーム微小胞を精製し、ＣＤ６３の存在に関して、残った上清液をエクソソーム画分と比較することによって、エクソソーム単離プロトコールの有効性を解析した。可溶性上清液画分は、引き続き、ＩＬ−１２などの分泌タンパク質を含んでいたが、エクソソーム画分のＲａｂ５及びＣＴＬＡ−４は、エクソソーム画分内のみに局在していた（図３Ｄ）。精製エクソソームのＣＴＬＡ−４ ｃｏＩＰを行い、その後、２つの画分を解析したところ、共焦点顕微鏡によって細胞内で観察されたのと同様に、ＣＴＬＡ−４が実際に、Ｒａｂ１１ではなく、Ｒａｂ５と細胞外で共局在したことが示された（図３Ｅ）。総合すると、これらのデータによって、ｆｌＣＴＬＡ−４が、未熟ＤＣにおいて分泌のために内包化されており、成熟すると、活性分泌機構と関連付けられ、最終的には、インタクト微小胞（本質的にエクソソームである）において、細胞外環境に分泌されることが示されている。

実施例３−ＤＣ ＣＴＬＡ−４機能の特徴付け
ＤＣの分泌する微小胞の機能的意義を確かめるために、本発明者はまず、そのような小胞を内在化できるかを割り出そうと試みた。これを確かめるために、ＤＣをＣＦＳＥで標識した。図４Ａには、ＣＦＳＥのＤＣによる取り込みは、細胞全体にわたって比較的均一であったとともに、ＣＴＬＡ−４^＋エンドソームと有意に共局在もしたことが示されている。続いて、ＣＦＳＥ標識ＤＣを４８時間培養し、その間、ＣＦＳＥ^＋微小胞が培養上清液に分泌された。続いて、ＣＦＳＥ^＋上清液を採取し、非標識ＤＣに加え、そのＤＣには、その後、ＣＦＳＥ^＋微小胞が結合し（図４Ｂ）、最終的には内在化した（図４Ｃ）ことを示すことができ、このプロセスは、共焦点顕微鏡（図４Ｂ〜Ｃ）とフローサイトメトリー（すなわち図４Ｄ及び１６）の両方によって、経時的に追跡することができた。抗ＣＴＬＡ−４クローンＢＮＩ３にコンジュゲートしたビーズで、上清液をプレクリアしたところ、ビーズコンジュゲートＢＮＩ３抗体の濃度に依存した形で、ＣＦＳＥ標識微小胞の非標識ＤＣによる取り込みを低減できた（図４Ｄ及び１６）。微小胞の取り込みは、フローサイトメトリーによって容易に定量できたので、このような取り込みのＢ７の表面発現に対する結果もモニタリングできた。図４Ｅによって示されているように、ＣＦＳＥ陽性となったＤＣにより、ｌｏｇ倍低いレベルのＣＤ８０及びＣＤ８６の表面発現が示され、ＣＤ１１ｃのような他の表面マーカーの発現では、変化はほとんど観察されなかった。Ｂ７抑制プロセスは、時間依存性であった。インキュベートから３時間後には、取り込みは観察されなかったが、ＣＦＳＥ標識微小胞でのインキュベートの６時間後には、１２〜１３％のＣＦＳＥ^＋ＤＣは、Ｂ７が「低かった」（これに対して、ＣＦＳＥ⁻ＤＣでは５〜６％）が、インキュベーションから１２時間後には、６５〜７５％のＣＦＳＥ^＋ ＤＣのＢ７が「低かった」（これに対して、ＣＦＳＥ⁻ＤＣでは１５％）。０．１％アジ化ナトリウムの存在下（すなわち、Ｂ７レセプターの下方制御が起こり得ない条件）で、１００％ＤＣ上清液中で、２０分、４℃でＢ７を染色したところ、ＣＤ１１ｃへの抗体結合量を減少させることなく、Ｂ７への抗体結合量を減少させる滴定可能な因子が上清液に存在することが示された（図１７Ａ及び１８）。前の実験におけるように、この因子は、抗ＣＴＬＡ−４ ＢＮＩ３にコンジュゲートしたビーズでプレクリアすることによって除去できた（図１７Ｂ及び１９）。微小胞の取り込みがＣＴＬＡ−４に依存することをさらに特徴付けるために、ＣＦＳＥの標識とＤＣの成熟の前に、まずＤＣを非標的化（ＮＴ）ｓｉＲＮＡまたはＣＴＬＡ−４特異的ｓｉＲＮＡのいずれかで処理した。図５Ａ及びＢに示されているように、ＣＴＬＡ−４ ｓｉＲＮＡで処理したＤＣに由来するＣＦＳＥ標識上清液でのインキュベートから９時間後、レシピエントＤＣは、大部分がＣＦＳＥ⁻のままであったのに対して、ＮＴ ｓｉＲＮＡで処理したＤＣに由来するＣＦＳＥ標識上清液で処理したレシピエントＤＣは、ＣＦＳＥ^＋となったことから、微小胞の取り込みが、ＣＴＬＡ−４／Ｂ７相互作用に依存していたことが示唆された。

ＤＣ ＣＴＬＡ−４の存在及び／または機能に関する報告はあまりないので、次に、ＣＴＬＡ−４生物学のカノニカルな理解に対して、ＤＣ ＣＴＬＡ−４が機能的であるか否かを我々はアッセイした。ＤＣ分泌ＣＴＬＡ−４が、Ｔ細胞の活性化を負に調節するかを試験するために、ＮＴ ｓｉＲＮＡまたはＣＴＬＡ−４ ｓｉＲＮＡのいずれかで処理した（共培養の開始前に７２時間）ＤＣとＰＢＭＣを共培養した。ＣＤ８：ＣＤ４の比は、早い時点（例えば５日目）においては同程度であったが、ＣＴＬＡ−４を欠失したＤＣでＰＢＭＣを培養したときには、ＣＤ８^＋ＣＤ２５^＋ＩＦＮ−γ^＋の割合の方がずっと大きかった（図６Ａ、左パネル）。この初期推移の後、２５日までに、ＣＴＬＡ−４欠失ＤＣで培養したＴ細胞では、ＣＤ８：ＣＤ４の比の有意な増加が一貫して見られ、ＣＤ８^＋ＣＤ２５^＋ＩＦＮ−γ^＋細胞の割合が大きくなった（図６Ａ及び２０）。加えて、ＤＣがＣＴＬＡ−４を欠失していたときには、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋ ｔｒｅｇの割合は、有意に低かった（図６Ａ、右パネル）。同様に、ｓｉＲＮＡで処理したＤＣ培養上清液であって、異なる量のＣＴＬＡ−４^＋微小胞を有するＤＣ培養上清液で、全脾臓細胞をインキュベートしたところ、ＣＤ８^＋ＣＤ２５^＋細胞のその後の増殖が、上清液ＣＴＬＡ−４含有量の低さに依存するとともに、上清液におけるＣＴＬＡ−４の濃度に比例することが示された（図６Ｂ）。インビボでのＤＣ ＣＴＬＡ−４の生理的関連性を試験するために、Ｂ１６メラノーマＤＣワクチンの調査を行い、この調査では、唯一変化させた変数は、ＤＣへのＢ１６ ｍＲＮＡのエレクトロポレーションの４８時間前にＮＴまたはＣＴＬＡ−４ ｓｉＲＮＡのいずれかを加えることであった。エレクトロポレーション後、ＤＣを２４時間成熟させ、事前に確立した触知可能なＢ１６腫瘍を持つレシピエントマウスに注射した。ＣＴＬＡ−４ ｓｉＲＮＡ ＤＣワクチンを投与されたマウスは、腫瘍の増殖が有意に遅延し（図６Ｃ）、転移が減少し、生存数が向上した（図６Ｄ）。ＤＣ ＣＴＬＡ−４のノックダウンが、ＣＤ８^＋ＩＦＮ−γ^＋細胞の産生向上及び抗腫瘍免疫の増強と関連することを踏まえ、ＴＨの極性化がＤＣ ＣＴＬＡ−４の放出において役割を果たし得るのか割り出すように我々は試みた。ＴＨ１の極性化を誘導する高用量ＩＬ−１２またはＴＨ２の極性化を誘導するＳＥＢ（Ｍａｎｄｒｏｎ ｅｔ ａｌ，２００６）のいずれかで成熟ＤＣをインキュベートし、ＤＣ培養上清液のウエスタンブロット解析によってＣＴＬＡ−４の放出を定量した。図６Ｅに示されているように、ＤＣのＴＨ１の極性化により、ＣＴＬＡ−４の分泌がほぼ完全に阻害されたのに対して、ＴＨ２の極性化により、ＣＴＬＡ−４の分泌が、用量に依存する形で増大した。全体として、データにより、ＤＣ ＣＴＬＡ−４が、ＣＤ８ ＣＴＬ活性の調節において、明らかな機能的用途として機能し、それに付随して、腫瘍免疫において生理学的結果をもたらすことが示唆されている。

ＣＴＬＡ−４^−／−ＣＤ２８^−／−ダブルノックアウトマウスに由来する細胞の解析により、マウスＤＣにおけるＣＴＬＡ−４の発現が確認される。野生型マウスとＣＴＬＡ−４^−／−ＣＤ２８^−／−ダブルノックアウトマウスから脾臓細胞、ＢＭＤＣ及びＢＭＤＣ培養上清液を生成してから、ＣＴＬＡ−４含有量についてウエスタンブロット解析によって解析した（図２１）。

本明細書で開示及び特許請求されている方法はいずれも、本開示に鑑みれば、過度の実験なしに作成及び実行することができる。本発明の組成物及び方法が、好ましい実施形態に関して記述されてきたが、様々な変形が、本発明の概念、趣旨、または範囲から逸脱することなく、本明細書に記載される方法に及びステップにおいてまたは方法のステップの順序において適用されてもよいことが、当業者には明らかであろう。より具体的には、同じまたは類似の結果を得られる限りは、本明細書に記載されている作用剤の代わりに、化学的にも生理学的にも関連する特定の作用剤を用いてよいことは明らかであろう。当業者に明らかなこのような類似の代用形態及び改変形態はいずれも、添付の特許請求の範囲に定められているような、本発明の趣旨、範囲及び概念の範囲内とみなす。

参照文献
下記の参照文献は、本明細書に定められている内容に対して、例示的、手順的またはその他の詳細な補足を行う範囲において、参照により、本明細書に具体的に援用される。
米国特許第３，８１７，８３７号
米国特許第３，８５０，７５２号
米国特許第３，９３９，３５０号
米国特許第３，９９６，３４５号
米国特許第４，１９６，２６５号
米国特許第４，２７５，１４９号
米国特許第４，２７７，４３７号
米国特許第４，３６６，２４１号
米国特許第４，４６９，７９７号
米国特許第４，４７２，５０９号
米国特許第４，６０６，８５５号
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米国特許第４，７４２，１５９号
米国特許第４，７６７，７２０号
米国特許第４，８１６，５６７号
米国特許第４，８６７，９７３号
米国特許第４，９３８，９４８号
米国特許第４，９４６，７７８号
米国特許第５，０２１，２３６号
米国特許第５，０９１，５１３号
米国特許第５，１６４，２９６号
米国特許第５，１９６，０６６号
米国特許第５，２２３，４０９号
米国特許第５，４０３，４８４号
米国特許第５，４２０，２５３号
米国特許第５，５６５，３３２号
米国特許第５，５７１，６９８号
米国特許第５，６２７，０５２号
米国特許第５，６５６，４３４号
米国特許第５，７７０，３７６号
米国特許第５，７８９，２０８号
米国特許第５，８２１，３３７号
米国特許第５，８４４，０９１号
米国特許第５，８５８，６５７号
米国特許第５，８６１，１５５号
米国特許第５，８７１，９０７号
米国特許第５，９６９，１０８号
米国特許第６，０５４，２９７号
米国特許第６，１６５，４６４号
米国特許第６，３６５，１５７号
米国特許第６，４０６，８６７号
米国特許第６，５０６，５５９号
米国特許第６，５７３，０９９号
米国特許第６，７０９，６５９号
米国特許第６，７０９，８７３号
米国特許第６，７５３，４０７号
米国特許第６，８１４，９６５号
米国特許第６，８４９，２５９号
米国特許第６，８６１，５７２号
米国特許第６，８７５，４３４号
米国特許第６，８８１，５５７号
米国特許第６，８９１，０２４号
米国特許第６，９４６，５４６号
米国特許第８，７２８，８０６号
米国特許出願公開第２００２／０１６８７０７号
米国特許出願公開第２００２／０１７２６７７号
米国特許出願公開第２００３／００５１２６３号
米国特許出願公開第２００３／００５５０２０号
米国特許出願公開第２００３／０１５９１６１号
米国特許出願公開第２００４／００６４８４２号
米国特許出願公開第２００４／０１２６８２８号
米国特許出願公開第２００４／０２６５８３９号
米国特許出願公開第２００５／０２１４８６０号
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本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
（ｉ）少なくとも第１の抗原感作樹状細胞または抗原と、（ｉｉ）ＣＴＬＡ−４アンタゴニストとを含む免疫原性組成物。
（項目２）
前記ＣＴＬＡ−４アンタゴニストが、ＣＴＬＡ−４に特異的な阻害性核酸である、項目１に記載の組成物。
（項目３）
前記阻害性核酸がＲＮＡである、項目２に記載の組成物。
（項目４）
前記ＲＮＡが、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である、項目３に記載の組成物。
（項目５）
前記ＣＴＬＡ−４アンタゴニストが、ＣＴＬＡ−４結合性抗体である、項目１に記載の組成物。
（項目６）
前記抗体がモノクローナル抗体である、項目５に記載の組成物。
（項目７）
前記抗体が組み換えたものである、項目５に記載の組成物。
（項目８）
前記抗体が、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡまたはこれらの抗原結合性断片である、項目５〜７のいずれか１項に記載の組成物。
（項目９）
前記抗体が、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）３、一価のｓｃＦｖ、二価のｓｃＦｖまたは単一ドメイン抗体である、項目５〜８のいずれか１項に記載の組成物。
（項目１０）
前記抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体または脱免疫化抗体である、項目５〜９のいずれか１項に記載の組成物。
（項目１１）
抗原感作樹状細胞を含む、項目１に記載の組成物。
（項目１２）
第１の抗原を含み、前記抗原が、腫瘍細胞抗原または感染症抗原である、項目１に記載の組成物。
（項目１３）
対象の免疫応答の誘導方法であって、ＣＴＬＡ−４アンタゴニストと併せて、免疫原性組成物を前記対象に投与することを含む前記方法。
（項目１４）
前記ＣＴＬＡ−４アンタゴニストが、ＣＴＬＡ−４に特異的な阻害性核酸である、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記阻害性核酸がＲＮＡである、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記ＲＮＡが、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記ＣＴＬＡ−４アンタゴニストがＣＴＬＡ−４結合性抗体である、項目１３に記載の方法。
（項目１８）
前記抗体がモノクローナル抗体である、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記抗体が組み換えたものである、項目１７に記載の方法。
（項目２０）
前記抗体が、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡまたはこれらの抗原結合性断片である、項目１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
（項目２１）
前記抗体が、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）３、一価のｓｃＦｖ、二価のｓｃＦｖまたは単一ドメイン抗体である、項目１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
（項目２２）
前記抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体または脱免疫化抗体である、項目１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
（項目２３）
前記免疫原性組成物が、抗原感作樹状細胞集団を含む、項目１３に記載の方法。
（項目２４）
前記免疫原性組成物が、ポリペプチド抗原を含む、項目１３に記載の方法。
（項目２５）
前記免疫原性組成物が、抗原をコードする核酸を含む、項目１３に記載の方法。
（項目２６）
前記核酸がＤＮＡ発現ベクターである、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記ＣＴＬＡ−４アンタゴニストの前または前記ＣＴＬＡ−４アンタゴニストと本質的に同時に、免疫原性組成物を投与する、項目２５に記載の方法。
（項目２８）
前記ＣＴＬＡ−４アンタゴニストの後に免疫原性組成物を投与する、項目２５に記載の方法。
（項目２９）
前記ＣＴＬＡ−４アンタゴニストの約１週間、１日、８時間、４時間、２時間または１時間以内に、免疫原性組成物を投与する、項目２７〜２８のいずれか１項に記載の方法。
（項目３０）
前記免疫原性組成物が、腫瘍細胞抗原または感染症抗原を含む、項目１３に記載の方法。
（項目３１）
前記免疫原性組成物が、少なくとも第１のアジュバントを含む、項目１３に記載の方法。
（項目３２）
前記対象が、疾患を罹患しているか、または疾患を罹患するリスクを有する、項目１３に記載の方法。
（項目３３）
前記疾患が、感染症またはがんである、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
ＣＴＬＡ−４の発現を低下させるように遺伝子改変されている樹状細胞集団。
（項目３５）
前記遺伝子改変に、ＣＴＬＡ−４に特異的な外因性の阻害性核酸の導入が含まれる、項目３４に記載の細胞集団。
（項目３６）
前記阻害性核酸がＲＮＡである、項目３５に記載の細胞集団。
（項目３７）
前記ＲＮＡが、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である、項目３６に記載の細胞集団。
（項目３８）
前記遺伝子改変に、ＣＴＬＡ−４を低下させる、細胞集団におけるゲノムの欠失または挿入が含まれる、項目３４に記載の細胞集団。
（項目３９）
前記遺伝子改変に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムを用いるゲノム編集が含まれる、項目３４に記載の細胞集団。
（項目４０）
前記細胞集団が、前記ＣＴＬＡ−４遺伝子内にヘミ接合欠失を含む、項目３４に記載の細胞集団。
（項目４１）
前記樹状細胞が、少なくとも第１の抗原で感作されている、項目３４に記載の細胞集団。
（項目４２）
前記抗原が、腫瘍細胞抗原または感染症抗原である、項目３４に記載の細胞集団。
（項目４３）
対象における免疫応答の誘導方法であって、項目３４〜４２のいずれか１項に記載の細胞集団を有効量、前記対象に投与することを含む前記方法。
（項目４４）
前記樹状細胞が、少なくとも第１の抗原で感作されている、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記対象が、がんを罹患しており、前記樹状細胞が、少なくとも第１のがん細胞抗原で感作されている、項目４３に記載の方法。
（項目４６）
前記対象が、感染症に罹患しており、前記樹状細胞が、少なくとも第１の感染症抗原で感作されている、項目４３に記載の方法。
（項目４７）
抗原特異的Ｔ細胞の培養方法であって、少なくとも第１の抗原で感作されている抗原提示細胞集団の存在下で、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体の集団を培養することを含み、
（ｉ）前記培養が、ＣＴＬＡ−４アンタゴニストの存在下であるか、または
（ｉｉ）前記抗原提示細胞集団が、ＣＴＬＡ−４の発現を低下させるように遺伝子改変されている樹状細胞集団を含む前記方法。
（項目４８）
抗原特異的Ｔ細胞のエキソビボ拡張方法としてさらに定義されている、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記樹状細胞集団が初代樹状細胞を含む、項目４７に記載の方法。
（項目５０）
前記培養が、ＣＴＬＡ−４アンタゴニストの存在下である、項目４７に記載の方法。
（項目５１）
前記ＣＴＬＡ−４アンタゴニストが、ＣＴＬＡ−４に特異的な阻害性核酸である、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
前記阻害性核酸がＲＮＡである、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
前記ＲＮＡが、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
前記ＣＴＬＡ−４アンタゴニストがＣＴＬＡ−４結合性抗体である、項目５０に記載の方法。
（項目５５）
前記樹状細胞集団が、ＣＴＬＡ−４の発現を低下させるように遺伝子改変されている、項目４７に記載の方法。
（項目５６）
前記遺伝子改変に、ＣＴＬＡ−４に特異的な外因性の阻害性核酸の導入が含まれる、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
前記阻害性核酸がＲＮＡである、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
前記ＲＮＡが、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である、項目５６に記載の方法。
（項目５９）
前記遺伝子改変に、ＣＴＬＡ−４を低下させる、細胞集団におけるゲノムの欠失または挿入が含まれる、項目５５に記載の方法。
（項目６０）
前記細胞集団に、ＣＴＬＡ−４遺伝子内のヘミ接合欠失が含まれる、項目５５に記載の方法。

Claims (9)

1. （ｉ）少なくとも第１の抗原感作樹状細胞と、（ｉｉ）ＣＴＬＡ−４アンタゴニストとを含む、免疫応答を活性化／増強するための免疫原性組成物であって、前記ＣＴＬＡ−４アンタゴニストがＣＴＬＡ−４結合性抗体である、組成物。
2. 前記ＣＴＬＡ−４結合性抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１に記載の組成物。
3. 前記抗体が、ＩｇＧまたはその抗原結合性断片、ＩｇＭまたはその抗原結合性断片、ＩｇＡまたはその抗原結合性断片、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）３、一価のｓｃＦｖ、二価のｓｃＦｖおよび単一ドメイン抗体からなる群から選択される抗体である、請求項１に記載の組成物。
4. 前記抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体または脱免疫化抗体である、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
5. 抗原感作樹状細胞を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
6. 前記抗原感作樹状細胞が、少なくとも第１のがん細胞抗原で感作されている、請求項５に記載の組成物。
7. 第１の抗原を含み、前記抗原が、腫瘍細胞抗原または感染症抗原である、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
8. 疾患の治療に使用するための請求項１〜７のいずれかに記載の組成物であって、前記疾患が感染症またはがんである、組成物。
9. 前記免疫原性組成物が、抗原感作樹状細胞集団を含む、請求項８に記載の疾患の治療に使用するための、請求項１〜７のいずれかに組成物。

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