JP6890664B2 - Hiv感染を治療するキメラ抗原受容体の組換え遺伝子構築およびその応用 - Google Patents
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Description
本発明は、HIV感染を治療するキメラ抗原受容体(CAR)組換え遺伝子およびその構築方法を提供し、具体的なスプライシング方法は、シグナルペプチド、HIVウイルス感染細胞表面のgp120を認識可能な一本鎖抗体scFv、CD8 hinge、白血球抗原分化群分子膜貫通領域CD28−TM+ICD、4−1BB、およびCD3(白血球抗原分化群分子3)のζ鎖を順次スプライシングすることで、最後にHIVを治療できる完全なキメラ抗原受容体(CAR)分子が得られ、そのアミノ酸配列がSEQ ID NO.4に示され、その構造を図1に示し、該キメラ抗原受容体(CAR)をコードする遺伝子の塩基配列がSEQ ID NO.3に示される。
SEQ ID NO.4に示される配列でCARを合成し、全長CARのコード遺伝子をシームレス組換えクローニング技術に基づいて目的発現ベクターに挿入する(図2参照)。数回の実験を重ねた結果、好ましいプラスミドベクターとして、PTK881ベクターを骨格とし、CMVプロモーターをEF1αプロモーターに置き換えた後に改造されたPTK−EF1α−N6ベクター(その塩基配列がSEQ ID NO.5に示される)であり、最終的にCAR遺伝子が挿入されCARを発現し得る組換えプラスミドPTK−EF1α−N6ベクターが得られ、その塩基配列がSEQ ID NO.6に示される。
1)DMEM培養液16mlの入った2本の遠心チューブのうち、一方のチューブにPEI960μgを加え、他方のチューブにプレミックスPTK881ベクタープラスミド320μgを加え、ボルテックスで振とうし、そして室温で10分間平衡化する。
2)10mlピペットを用いてPEIを混合した培地を膨らませ、プラスミドを混合した培地を一滴ずつPEIに加え、そして室温で30分間インキュベートする。
3)T175フラスコにウシ胎児血清3mlを加え、PEIと混合したPTK−EF1α−N6ベクタープラスミドをその中に加え、次に多層細胞培養フラスコ内の培地をT175フラスコに注ぎ、上下左右逆さまにプラスミドと均一に混合し、最後にT175フラスコ内の培地を多層細胞培養フラスコに逆さまに注ぐ。37℃の5%CO2インキュベーターにて3日間培養し、上清を回収する。回収した上清を4000rpm(3000g)で30min遠心分離して293T細胞破片を除去する。
4)レンチウイルス液上清を0.22μmのメンブランフィルターで濾過し、250ml遠心分離ボトルに分注し、4℃、30000gで2.5時間遠心分離し、遠心分離した後に遠心分離ボトルをバイオセーフティキャビネットに注意深く移し、真空ポンプで上清を取り除き、沈殿物を残し、T細胞培地を500μl/遠心分離ボトルで加え、沈殿物をガンで吹き飛ばして均一に混合すれば、N6−CAR分子を含有するレンチウイルスベクターが得られ、直ちに使用するかまたは分注した後に−80℃で保存する。
ステップ1:患者のPBMC細胞の分離
(1)ヒト末梢血試料60〜80mlを採取し、採取しながら揺れて末梢血を抗凝固剤と十分に混合させる。
(2)末梢血を50ml遠心チューブに移し、DPBS緩衝液を用いて1:1で末梢血を希釈し、均一に混合する。希釈した血液試料を室温でヒトリンパ球分離液の入った15ml遠心チューブにゆっくり加える。方法は次のとおりである。10mlピペットで血液試料を吸引し、分離液の液面より上方0.5cmの位置まで伸び、血液試料が自然に滑り落ちて分離液の表面に広げられ、次いで液面を破壊しないように注意しながら血液試料を軽く加える。
(3)平衡化して30min遠心分離し、ゆっくりと加速させたり減速させたりする。
(4)遠心分離終了後、遠心チューブ内で、下から赤血球層、顆粒細胞層、Ficoll層、単核細胞層および血漿層の順に明らかに層が分離する。血漿層を白膜層から約5mmの位置まで吸引して捨てる。赤血球層以上の全ての液体を遠心チューブに慎重に吸引し、PBSで希釈し、細胞懸濁液との体積比を1:3より大きくし、均一に混合する。
(5)(1600r/min)で5min遠心分離し、細胞をPBSで再懸濁して均一に混合し、少量の細胞を取って計数する。
(6)300g(1200r/min)で5min遠心分離し、上清を無菌検出に送る。
(1)ステップ1のPBMC細胞を、30mlの生理食塩水で再懸濁した後にサンプリングし計数し(サンプリング終了後、50mlまで補加して均一に混合し、500g、10min、18℃、急速に加速させたり減速させたりして遠心分離し、上清を除去する)、計数した後に107/80μLでbufferを加えて均一に混合し(上清が完全に除去されない場合、bufferを加えないことが好ましい)、107/20μLでCD8 Microbeadsを加えて再懸濁し、4〜8℃で15minインキュベートする。
(2)インキュベート終了後、107個当たり1〜2mlでbufferを加えて細胞を洗浄し、500g、10minで遠心分離する。
(3)500μLのbufferで108個もある細胞を再懸濁する(細胞数が多い場合、bufferの使用量も多くなる)。
(4)ミルテニー専用LSカラムを磁気スタンドに置き、3mlのbufferでLSカラムをすすいだ後、細胞再懸濁液をLSカラムに加え、流れ終わらせる。3mlのbufferでLSカラムを3回洗浄し、毎回流れ終わらせる必要がある。LSカラムを磁気スタンドから取り外し、5mlのbufferをLSカラムに加え、ピストンで標識された細胞を洗い流す(標識された細胞がいずれも洗い流されることを確保するために2回すすぐ)。
(5)CD8+T細胞を洗い流した後、生理食塩水で30mlに再懸濁し、サンプリングし計数し、500g、10min、18℃で遠心分離し、細胞沈殿物が得られると、培養に用いることができる。
(1)ステップ2のCD8+T細胞を計数し、2×106/mlの密度で培養フラスコに加え、均一に混合してCO2インキュベーターに入れて2時間培養する。
(2)培養フラスコを取り出し、軽く揺れ、底部に沈殿した懸濁細胞を浮遊させ、ピペットで培地を吸引して遠心チューブに移し、少量の培地で培養フラスコを洗浄して懸濁細胞を全て収集し、均一に混合して計数する。
(3)細胞計数に応じて細胞濃度を調整し、1.2×106/mlの濃度で培養フラスコに接種し(100〜120ml in a T150、50〜60ml in a T75、15〜29ml in a T25)、CD3/CD28磁気ビーズを加え、細胞と磁気ビーズとの比は1:3で(加える前に磁気ビーズを培地で3回洗浄し、保存液を除去する)、IL−2(100U/mL)を加え、均一に混合してCO2インキュベーターに入れて培養し、細胞を収集する。
磁気ビーズを12時間加えた後、ステップ3での生長状態が良好なCD8+T細胞懸濁液を、遠心チューブに適量入れて300gで5分間遠心分離する。上清を捨て、1×106/ml細胞の割合でキメラ抗原受容体(CAR)ウイルスベクターを加え、また最終濃度が4μg/mlのPolybreneを加え、均一に混合する。細胞懸濁液を37℃で少量インキュベートする。4時間インキュベートした後にT細胞完全培地を適量流加して培養する。細胞培養3日目に、細胞を計数しかつ細胞状態および増殖状況に応じて培地を流加し、細胞濃度を0.6×106/mlに調整し、そしてIL−2(100U/mL)を補充する。細胞培養5日目に、細胞を均一に混合して遠心チューブに移し、磁気ビーズを磁気スタンドから取り外し、細胞を計数しかつ培地を流加し、かつIL−2(100U/mL)を補充し、細胞密度を0.6×106/mLに調整して培養を続ける。scFvの発現をフローサイトメトリーで検出すると同時に、一部のCD8+Tリンパ球をgoat anti−human Fab antibody抗体により刺激して連続継代することにより、anti−gp120でCARが形質導入されたCD8+Tリンパ球の自己増幅能を確定し、結果を図3に示す。
N6−CARの機能をさらに検出するために、N6−CAR−T細胞をHIV−1に感染した2つの細胞株H9−NL4−3およびH9−NDKとそれぞれ混合して培養し、U底タイプの96ウェルプレートで細胞殺傷実験を行う。まずCalcein−AMでHIV感染細胞株H9および陰性対照細胞を標識し、100μl(標的細胞含有数104)を96ウェルプレートに取り、勾配希釈されたCAR−T細胞100μlを対応する96ウェルプレートに加え、有効標的比は5:1から10:1の範囲であるように確保し、最終容量が1ウェルあたり200μlである。室温、200gで30分間遠心分離し、37℃で2〜3時間インキュベートする。遠心分離して上清を取って蛍光を測定し、溶解の割合を計算することでHIV感染細胞に対するN6−CAR−T細胞の細胞傷害性を判断し、実験結果を図4に示す。
野生型HIV−1感染の初世代CD4+T細胞の排除におけるN6−CAR−T細胞の有効性をさらに実証するために、野生型HIV−1NL4−3−EGFPおよびNDK−EGEPの2つの毒株を用いてそれぞれ健康なヒトの血液試料から分離したCD4+Tリンパ球に感染し、感染3時間後に血液を交換する。感染後8日目に、該細胞をN6−CARで改造された同源CD8+Tリンパ球と1:4の割合で混合し、24ウェルプレートで細胞殺傷実験を行う。標的細胞数が106/ウェルであり、RMPI1640完全培地容量が500μl/ウェルである。48時間後、フローサイトメトリーによりEGFP+CD4+Tリンパ球の割合を検出し、N6−CAR−T細胞の殺傷効果を検証し、実験結果を図5に示す。
Anti−gp120 CAR−Tリンパ球が体内でHIV感染細胞を排除できるか否かをさらに実証するために、蛍光遺伝子付きのNL4−3−EGFPウイルス(1x106pg p24/mouse)をヒト化マウスBLT体内に静脈内注射し、マウスに感染すると同時に、健康なボランティアからPBMCを分離し、次いでCD8+T細胞を分離し、N6−CARレンチウイルスで形質導入し、10日間体外増幅した後に、計数し、そして500μlのPBSで再懸濁し、1×107CD8+T/kgの用量で静脈内輸注する。2週間後、脾臓をマウス体内から収集し、包埋剤に入れて凍結切片を作製する。20枚を超える厚さ10μmの凍結切片を作製し、蛍光共焦点顕微鏡下で写真を撮影し、写真をVelocity5.0ソフトウェアで定量化し分析する(図6A)。同時に、収集した脾臓細胞の一部から単細胞懸濁液を調製し、5×106個の細胞にDNAzolを加えてゲノムDNAを抽出し、Nested−QPCRによってプロウイルスのコピー数を定量化して体内の全HIV感染細胞数を推定する(図6B)。
Claims (6)
- HIV感染を治療するキメラ抗原受容体N6−CARであって、
N末端からC末端へシグナルペプチド、一本鎖抗体scFv、CD8 hinge、白血球抗原分化群分子膜貫通領域CD28−TMおよびその細胞内ドメイン(ICD)、4−1BB、および白血球抗原分化群3のζ鎖CD3を順次連結することで得られるものであり、得られたキメラ抗原受容体のアミノ酸配列がSEQ ID NO.4に示され、
前記一本鎖抗体scFvが、HIVウイルス感染細胞表面のgp120を認識可能であり、HIVウイルス感染細胞表面のgp120に対する抗体の軽鎖、重鎖可変領域を直列することで得られるものであり、CAR分子全体の細胞外結合ドメインとして、そのアミノ酸配列がSEQ ID NO.2に示されることを特徴とするHIV感染を治療するキメラ抗原受容体N6−CAR。 - 請求項1に記載のキメラ抗原受容体をコードする遺伝子であって、
その塩基配列がSEQ ID NO.3に示されることを特徴とする請求項1に記載のキメラ抗原受容体をコードする遺伝子。 - 塩基配列がSEQ ID NO.4に示されるキメラ抗原受容体のコード遺伝子を含有しかつ発現し得る発現ベクターであって、
前記ベクターは、PTK881ベクターを骨格とし、CMVプロモーターをEF−1αプロモーターに置き換えた後に改造されたPTK−EF1α−N6ベクターであり、その塩基配列がSEQ ID NO.5に示されることを特徴とする塩基配列がSEQ ID NO.4に示されるキメラ抗原受容体のコード遺伝子を含有しかつ発現し得る発現ベクター。 - 遺伝子修飾されたCD8+Tリンパ球であって、
請求項3に記載のPTK−EF1α−N6発現ベクターを293T細胞にトランスフェクションして得られたレンチウイルスベクター形質導入CD8+Tリンパ球であり、これにより得られたキメラ抗原受容体を発現し得る遺伝子操作したT−リンパ球であることを特徴とする遺伝子修飾されたCD8+Tリンパ球。 - 請求項4に記載の遺伝子修飾されたCD8+Tリンパ球の調製方法であって、
(1)末梢血からPBMCを分離した後に磁気ビーズを用いてポジティブセレクションによりCD8+T細胞が得られ、そしてanti−CD3/28磁気ビーズ(細胞と磁気ビーズとの比は1:3)により12時間刺激し、次いでN6−CAR分子を組み換えたレンチウイルスを加えて4時間感染させた後に補液し(MOI=5)、ウイルス感染後3日目から細胞を計数し、細胞状態および増殖状況に応じて培地を流加し、細胞濃度を0.6×106/mlに調整し、そしてIL−2(100U/mL)を補充し、輸注した細胞数を満たすまで細胞をさらに増幅させる調製方法。 - N6−CARで遺伝子修飾されたCD8+Tリンパ球の使用であって、
前記N6−CARで遺伝子修飾されたCD8+Tリンパ球が抗HIV感染の生細胞薬の調製に応用されることを特徴とする請求項1に記載のN6−CARで遺伝子修飾されたCD8+Tリンパ球の使用。
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