JP6884447B1 - コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２）を含む広範な微生物に有用な抗微生物剤 - Google Patents

コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２）を含む広範な微生物に有用な抗微生物剤 Download PDF

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Abstract

【課題】コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２）を含む広範な微生物に有用な新規抗微生物剤を提供すること。【解決手段】金属イオンと、Ｌ−システインと、Ｌ−アスコルビン酸と、界面活性剤とを含む、微生物に対する抗微生物剤であって、前記微生物がコロナウイルスを含む、抗微生物剤が提供される。コロナウイルスは、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２であり得る。本発明の抗微生物剤は、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、ノロウイルス、大腸菌、緑膿菌、サルモネラ、黄色ブドウ球菌、腸炎ビブリオ、カンピロバクターおよびカンジダにも効力を有し得る。【選択図】なし

Description

本発明は、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２）を含む広範な微生物に有用な抗微生物剤に関する。
２０１９年末から２０２０年の現在に至るまで、世界はＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２によるパンデミックの危機にさらされており、終息の目途はたっていない。
特許文献１は、広範なウイルスおよび細菌に有用な消毒液を開示しているが、コロナウイルスについては言及がない。
特許第５３２７２１８号明細書
本発明は、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２）を含む広範な微生物に有用な新規抗微生物剤を提供することを課題とする。
本発明者らは、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２）を含む広範な微生物に有用な新規配合の抗微生物剤を見出し、本発明を完成した。驚くべきことに、本発明は、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２）のみならず、インフルエンザウイルス、ノロウイルス、大腸菌、黄色ブドウ球菌など広範な微生物の不活化に有効な新規抗微生物剤を提供する。
本発明により、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２）のみならず、インフルエンザウイルス、ノロウイルス、大腸菌、黄色ブドウ球菌など広範な微生物の不活化に有効な新規抗微生物剤が提供される。
以下、本開示を最良の形態を示しながら説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本開示の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
以下に本明細書において特に使用される用語の定義および／または基本的技術内容を適宜説明する。
本明細書において、「微生物」とは、その個体の構造単位を肉眼で認識できない大きさの生物をいう。集合的には肉眼で観察することができるコロニー・プラークを作るものであっても、その個体が顕微鏡的大きさであるものは、微生物に含める。微生物としては、細菌、古細菌、真菌、藻類、単細胞動物、ウイルス、粘菌等が挙げられる。
本明細書において、「抗微生物剤」とは微生物を不活化する任意の物質をいう。ある物質の非存在下にて一定期間経過した後の微生物の数および／または感染価（例えば、プラーク測定法またはＴＣＩＤ５０によって測定した感染価）を、ある物質の存在下にて一定期間経過した後の当該微生物の数および／または感染価と比較した場合に、当該物質の存在下にて一定期間経過した微生物の数および／または感染価が、当該物質の存在下にて一定期間経過した微生物の数および／または感染価よりも少ない場合、当該微生物は「不活化」されており、当該物質は当該微生物の不活化能を有する。
本明細書において、「コロナウイルス」とは、コロナウイルス科に属する任意のウイルスをいう。
本明細書において、「約」とは、後に続く数値の±１０％をいう。
本明細書において「または」は、文章中に列挙されている事項の「少なくとも１つ以上」を採用できるときに使用される。「もしくは」も同様である。本明細書において「２つの値」の「範囲内」と明記した場合、その範囲には２つの値自体も含む。
（成分）
本発明の抗微生物剤は、金属イオンと、Ｌ−システインと、Ｌ−アスコルビン酸と、界面活性剤とを含むものであることを特徴とする。金属イオンとしては、亜鉛イオン（Ｚｎ２＋）、銅イオン（Ｃｕ２＋）、コバルトイオン（Ｃｏ２＋）、ニッケルイオン（Ｎｉ２＋）、三価の鉄イオン（Ｆｅ３＋）、二価の鉄イオン（Ｆｅ２＋）および銀イオン（Ａｇ＋）が挙げられるが、これらに限定されない。
好ましい実施形態において、本発明の抗微生物剤は、三価の鉄イオン（Ｆｅ３＋）または二価の鉄イオン（Ｆｅ２＋）を含み、より好ましい実施形態においては三価の鉄イオン（Ｆｅ３＋）を含み、特に好ましい実施形態においては三価の鉄イオン（Ｆｅ３＋）、亜鉛イオン（Ｚｎ２＋）、およびニッケルイオン（Ｎｉ２＋）を含み得る。
本発明の抗微生物剤は、以下の濃度で各金属イオンまたはその組み合わせを含み得る：
・（ＩＩＩ）価の鉄イオン：約５０〜約３００ｐｐｍ、好ましくは約１８０〜約２５０ｐｐｍ
・亜鉛イオン：約２０〜約１５０ｐｐｍ、好ましくは約６０〜１２０ｐｐｍ
・ニッケルイオン：約２５〜約７５ｐｐｍ、好ましくは約３０〜約４５ｐｐｍ
・銅イオン：約１５〜約６０ｐｐｍ
・コバルトイオン：約１８０〜約３００ｐｐｍ
・（ＩＩ）価の鉄イオン：約１１０〜約４００ｐｐｍ
・銀イオン：約１〜約３ｐｐｍ
好ましい実施形態において、本発明の抗微生物剤は、約１：１〜約４：１の（ＩＩＩ）価の鉄イオンと前記亜鉛イオンとのｐｐｍ比を有し、より好ましくは約１．５：１〜約３：１の（ＩＩＩ）価の鉄イオンと前記亜鉛イオンとのｐｐｍ比を有する。（ＩＩＩ）価の鉄イオンは微生物の不活化に有効な成分ではあるが、使用時の匂いや着色、金属イオンの配合による析出の問題があり得る。本発明者らは、金属イオンの配合を鋭意研究した結果、鉄イオンによるそのような問題を可能な限り低減しつつ、それでいて優れた微生物の不活化能を有する抗微生物剤の配合を見出し、本発明を完成した。
好ましい実施形態において、本発明の抗微生物剤は、約２：１〜約８：１の（ＩＩＩ）価の鉄イオンとニッケルイオンとのｐｐｍ比を有し、より好ましくは約３：１〜約６：１の（ＩＩＩ）価の鉄イオンとニッケルイオンとのｐｐｍ比を有する。このような含有量および／または鉄イオンとの量比のニッケルイオンにおいて、十分に微生物を不活化し得る。
金属イオンは、例えば、水に溶解してイオンとなる各種化合物を液に添加することで供給され得る。例えばＦｅ３＋イオンについては塩化第二鉄、硝酸第二鉄・六水和物、硝酸第二鉄・九水和物、硝酸第二鉄・ｎ水和物、リン酸第二鉄・ｎ水和物、クエン酸第二鉄・ｎ水和物等、Ｆｅ２＋イオンについては塩化鉄・四水和物、グルコン酸鉄、クエン酸鉄、蓚酸鉄等、Ｚｎ２＋についてはクエン酸亜鉛・二水和物、グルコン酸亜鉛等、Ｃｕ２＋については塩化銅・二水和物、塩化二アンモニウム銅・二水和物、硝酸銅・三水和物等、Ｃｏ２＋についてはグルコン酸コバルト三水和物、水酸化コバルト、クエン酸コバルト等、Ｎｉ２＋については硝酸ニッケル等、Ａｇ＋については硫酸銀、リン酸銀等が挙げられる。
代表的な実施形態において、本発明の抗微生物剤は、Ｌ−システインを含む。Ｌ−システインは含硫アミノ酸の一種で皮膚の代謝に不可欠な成分でコラーゲンの生成を助け、Ｌ−アスコルビン酸と協働してメラニンの発生を抑制する。皮膚、爪、髪の主要構成成分で体内に広く分布している。理論に拘束されることを意図しないが、Ｌ−システインは、分子構造中にＳＨ基（硫黄と水素の結合したチオール基）と抗菌性の金属イオンとが結合、活性を増幅して強い殺菌性を発現、ＤＮＡ阻害、酵素の失活、代謝機能の阻害、蛋白の変性またフリーラジカルの発生により菌体破壊を促進せしめる。Ｌ−システインはまた、強い抗酸化作用と還元作用で構成成分の安定性に寄与し、生体親和性が高く病原体に強く付着してひいては浸透性を助長しうる役割を担う。その至適濃度は含有する金属イオンの種類とその濃度により若干異なるが、イオン濃度の数倍程度が好ましい。例えば、本発明の抗微生物剤におけるＬ−システインの含有量は、約１００〜約２０００ｐｐｍであり得、好ましくは約５００〜約１５００ｐｐｍであり得る。
代表的な実施形態において、本発明の抗微生物剤は、Ｌ−アスコルビン酸を含む。Ｌ−アスコルビン酸（ビタミンＣ）は生体に必須であり生体組織に馴染みよく少量を添加する事で細胞組織への親和性が増大する。理論に拘束されることを意図しないが、Ｌ−アスコルビン酸は強い抗酸化作用で金属イオンと食品保存剤の安定化と活性の維持、持続に寄与、同時に細菌等の有機物に接触すると金属イオンの抗菌作用を増幅し微生物に強い障害をもたらす。本発明の抗微生物剤におけるＬ−アスコルビン酸の含有量は、約１０〜約２００ｐｐｍであり得、好ましくは約５０〜約１５０ｐｐｍであり得る。
代表的な実施形態において、本発明の抗微生物剤は、界面活性剤を含む。この界面活性剤は、陰イオン系界面活性剤、陽イオン系界面活性剤、または両性界面活性剤であり得る。陰イオン系界面活性剤としては、アルキルベンゼンスルホン酸塩（ＡＢＳ系）、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩（ＬＡＳ系）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩（ＡＥＳ系）、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウロイルサルコシンナトリウム、高級アルコール硫酸エステル塩（ＡＳ）などが挙げられる。陽イオン系界面活性剤としては、塩化ステアリルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼントニウムなどが挙げられる。両性界面活性剤としては、塩酸アルキルジアミノエチルグリシン、塩酸アルキルポリアミノエチルグリシンなどが挙げられる。これらの界面活性剤は、１種又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。好ましい実施形態においては、本発明の抗微生物剤は、ラウリル硫酸ナトリウムを含み得る。本発明の抗微生物剤は、界面活性剤を約１０〜約２００ｐｐｍ、好ましくは約５０〜約１５０ｐｐｍ含み得る。
１つの実施形態において、本発明の抗微生物剤は、食品保存剤を含む。この食品保存剤としては、ソルビン酸、ソルビン酸塩、安息香酸、安息香酸塩、およびパラオキシ安息香酸エステルが挙げられるが、これらに限定されない。代表的な実施形態においては、本発明の抗微生物剤は、ソルビン酸またはソルビン酸塩を含む。本発明の抗微生物剤における食品保存剤の濃度は、約２０〜約１００ｐｐｍであり得る。
１つの実施形態において、本発明の抗微生物剤は、各成分をより高濃度に含む原液から調製されてもよい。本明細書に記載の抗微生物剤となるように（例えば、水により）希釈されることが企図される原液、および原液から用時調製された希釈液も本発明の範囲内であると企図される。
本発明の抗微生物剤は、好ましくは、効力の維持と安定性、および微生物内部への浸透をサポートするために、ｐＨが約２．５〜約４．０、より好ましくは約３であり得る。ｐＨの調整は、公知のｐＨ調整剤を使用して行うことができる。１つの実施形態において、微生物の不活化の後に、本発明の抗微生物剤は中和されてもよい。
（ウイルス）
本発明の抗微生物が不活化できるウイルスとしては、特に限られるものではないが、例えば動物（例えば、ヒト）に対して感染するウイルス（ＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスを含む。）が挙げられ、ヒトに罹患して風邪様症候群を示すウイルスであるアデノウイルス科のウイルス、ヘルペスウイルス科のウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス、水痘・帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス、ＥＢウイルス）、インフルエンザウイルス（例えば、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス）、肝炎ウイルス（Ｃ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス）、ＨＩＶ等の免疫不全ウイルス、ＨＣｏＶ−ＨＫＵ１、ＨＣｏＶ−ＯＣ４３、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ、ＭＥＲＳ−ＣｏＶおよびＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２等のコロナウイルスが含まれる。
本発明の抗微生物剤は、コロナウイルスを不活化することができる。コロナウイルスはエンベロープ（ｅｎｖｅｌｏｐｅ）に包まれたＲＮＡウイルスとして存在する。その直径は約８０〜１２０ｎｍで，遺伝物質は全ＲＮＡウイルスの中で最大である。
ヒトに感染するコロナウイルスとしては、風邪の原因ウイルスとしてヒトコロナウイルス２２９Ｅ、ＯＣ４３、ＮＬ６３、ＨＫＵ−１の４種類、そして、重篤な肺炎を引き起こす２００２年に発生した重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）コロナウイルスと２０１２年に発生した中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）コロナウイルス、および２０１９年に発生したいわゆる新型コロナウイルス（２０１９−ｎＣｏＶ、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２）の３種類が知られている。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２は、ＳＡＲＳコロナウイルスと同じベータコロナウイルス属に分類され、新型コロナウイルスの遺伝子はＳＡＲＳコロナウイルスの遺伝子と相同性が高く（約８０％程度）、さらに、ＳＡＲＳコロナウイルスと類似する受容体（ＡＣＥ１またはＡＣＥ２）を使ってヒトの細胞に吸着・侵入することが最近の研究で報告されている。ＡＣＥ１またはＡＣＥ２のサブタイプの違いによって感染性の違いに顕れることも報告されている。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２は、臨床症状は、頭痛、高熱、倦怠感、咳などのインフルエンザ様症状から、重症例では呼吸困難を主訴とする肺炎に進行するとされている。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２は非常に感染力が強く、全世界で現時点で４０００万人以上が感染し、１００万人以上の死者を出している。本発明は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２を不活化できる点で顕著な効果を奏するものである。
（細菌）
本発明の抗微生物剤は、コロナウイルスなどのウイルスのみならず、細菌（特に、病原性細菌）の不活化にも有効であり得る。本発明の抗微生物剤は、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ．）、腸炎ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｒｅａｅ）、大腸菌Ｏ−１５７（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ−１５７）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、偽膜性大腸炎菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、エルシニア腸炎菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、アメーバ赤痢菌（Ｅｎｔｅｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｕ ｃｅｒｅｕｓ）、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｉｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クラミデア肺炎菌（Ｃｈｌａｍｉｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、レジオネラ肺炎菌（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ブランハメラ菌（Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ａ型溶連菌（Ｓｔｏｒｅｐｔｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、オーム病菌（Ｃｈｒａｍｉｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｇｉｎｏｓａ）、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ，ＭＲＳＡ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、肺炎捍菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｓｐｐ．）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．）、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）、Ｂ型溶連菌（Ｓｔｏｒｅｐｔｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）などに有効であり得る。
（使用方法）
本発明の抗微生物剤は、処理対象物に接触させることで処理対象物上に存在している微生物を不活化することができる。前記処理対象物としては、環境、器具、人体、動物体、植物体、有機物等が挙げられる。環境としては、寝室、居間、洗面所、トイレ、浴室等の家庭環境、自動車、電車、航空機、船等の輸送機械内の環境、手術室、病室、休憩室、ネコ、ウサギ、イヌ、ニワトリ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ等の家畜を飼育する環境、魚介類の養殖場等が挙げられる。環境には、上記の環境に存在している家具類、道具類、器具類、遊具類、装置類等も含まれる。器具としては、例えば、金属製器具、非金属製器具、これらを複合した器具が挙げられる。人体や動物体としては、日常的に外界と接している皮膚、手指、粘膜をはじめ、創傷部位、疾患・病変部等が挙げられる。前記植物体としては、野菜、果物、観賞用植物等が挙げられる。前記有機物としては、人や動物の血液、体液、喀痰、膿、排泄物等が挙げられる。
本発明の抗微生物剤の接触方法としては、噴霧、塗布等、公知の手段であればよい。空気中への噴霧を行った場合には、空気の殺菌も行うことができる。本発明の抗微生物剤は代表的には溶液の形態で提供され、そのまま溶液として使用（例えば、処理対象物への塗布や、処理対象物の溶液への浸漬）されてもよいし、布などの担体に添加した後に担体を処理対象物と接触させてもよいし、噴霧などされて使用されてもよい。本発明の抗微生物剤は、目的の微生物が十分に死滅するだけの時間（例えば、約５秒、約１０秒、約１５秒、約３０秒、約４５秒、約１分、約２分、約５分、約１０分、約１５分、約３０分、約６０分）にわたって処理対象物と接触させることができる。
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
（実施例１ 抗微生物剤の製造）
以下の成分を有する溶液Ａおよび溶液Ｂをまず用意し、両者を混和した。
（溶液Ａ）
塩化第二鉄・六水和物（ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ） ０．９６ｇ
硫酸亜鉛（無水）（ＺｎＳＯ４） ０．２５ｇ
硫酸ニッケル・七水和物（ＮｉＳＯ３／７Ｈ２Ｏ） ０．１８ｇ
上記を精製水２００ｍｌに溶解し、溶液Ａとした。
（溶液Ｂ）
Ｌ−システイン １ｇ
Ｌ−アスコルビン酸 ０．１ｇ
ソルビン酸カリウム ０．０５ｇ
ラウリル硫酸ナトリウム ０．１ｇ
３Ｎ塩酸 １ｍｌ
上記を精製水８００ｍｌに溶解し、溶液Ｂとした。
溶液Ｂに溶液Ａを注入して混和、攪拌して、必要に応じてｐＨ３．０±０．１に調整した。これを抗微生物剤とし、以下の実施例における試験のために使用した。なお、本実施例で製造した抗微生物剤は、１年半経過した後も微生物の不活化能の低下はほとんどなく、安定していた。
（実施例２ コロナウイルスの不活化試験）
実施例２の試験は、一般財団法人 日本繊維製品品質技術センターにおいて行った。
（使用材料）
・試験ウイルス：Ｓｅｖｅｒｅ ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ２（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２）、ＮＩＩＤ分離株；ＪＰＮ／ＴＹ／ＷＫ−５２１（国立感染症研究所より分与）
・宿主細胞：ＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２ ＪＣＲＢ１８１９
・ウシ胎児血清：Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）（シグマアルドリッチ）
・ネガティブコントロール：ＰＢＳ
・試験サンプル：実施例１において製造した抗微生物剤（液剤（ＭＩＯＮミネラルイオン除菌剤））
・薬剤不活化剤；ＳＣＤＬＰを２％ＦＢＳ含ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ）で１０倍希釈した溶液
（試験条件）
ウイルス懸濁液：試験サンプル＝１：９
作用温度 ２５℃
作用時間 １５秒および５分（ＰＢＳのみ混合直後も測定）
感染価測定法：プラーク測定法
（１）ウイルス懸濁液の調製
宿主細胞にウイルスを感染させ、ＥＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ）を加えて３７℃で所定時間培養後、４℃、１，０００×ｇで１５分間遠心分離した上清を試験ウイルス懸濁液とした。
（２）宿主細胞検証試験
（２−１）まず、細胞毒性を確認した。試験サンプル０．９ｍｌにＥＭＥＭ０．１ｍｌを加え、十分に攪拌して試験液とした。薬剤不活化剤０．９ｍｌに試験液０．１ｍｌを添加し、十分に攪拌した。２％ＦＢＳ含ＤＭＥＭを用いて１０倍希釈系列を作製し、プラーク測定法にて各希釈系列の細胞毒性の有無を確認した。この結果、実施例１において製造した抗微生物剤には細胞毒性がないことが確認された。
（２−２）次いで、試験ウイルスへの細胞の感受性を確認した。試験サンプル０．９ｍｌにＥＭＥＭ０．１ｍｌを加え、十分に攪拌してこれを試験液とした。薬剤不活化剤４．５ｍｌに試験液０．５ｍｌを添加し、十分に攪拌した。２％ＦＢＥ含ＤＭＥＭを用いて１０倍希釈系列を作製した。ＥＭＥＭを用いて４〜６×１０４ＰＦＵ／ｍｌに調製したウイルス懸濁液を各希釈系列の１／１００量添加して、室温で１０分間静置した。プラーク測定法にて各希釈系列１ｍＬ当たりのウイルス感染価を測定した。この結果、試験ウイルスに対する細胞の感受性が確認された。また、試験液を薬剤不活化剤で１０倍希釈することにより、検体の影響を受けずにウイルス感染価測定ができることを確認した。
Figure 0006884447
（３）コロナウイルスの不活化試験
試験サンプル０．９ｍｌに試験ウイルス懸濁液０．１ｍｌを加え、十分に攪拌し、２５℃で１５秒および５分間静置した。これを試験液とした。その後、宿主細胞検証試験で不活化が確認された条件で試験液を不活化した。これを反応停止液とした。この反応停止液を１００として、２％ＦＢＳ含ＤＭＥＭで１０倍希釈系列を作製し、反応停止液０．１ｍｌ当たりのウイルス感染価をプラーク測定法にて測定し、試験液１ｍｌ当たりのウイルス感染価を算出した。試験は三連で行った。結果を以下の表２に示す。
Figure 0006884447
表２の結果から明らかなように、実施例１で製造した本発明の抗微生物剤は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の不活化能を有することが分かった。
（実施例３ 各種ウイルスの不活化試験）
実施例３の試験は一般財団法人北里環境科学センターにおいて行った。
本実施例における試験ウイルスと、感染価測定用に用いた細胞との組み合わせは以下のとおりである。
・Ａ型インフルエンザウイルス（Ａ／ＰＲ／８／３４，ＡＴＣＣ ＶＲ−１４６９）
感染価測定用細胞：イヌ腎臓由来細胞株（ＭＤＣＫ；Ｍａｄｉｎ Ｄａｒｂｙ−Ｃａｎｉｎｅ Ｋｉｄｎｅｙ）
・ネコカリシウイルス（Ｆ−９，ＡＴＣＣ ＶＲ−７８２）
感染価測定用細胞：ネコ腎臓由来細胞株（ＣＲＦＫ；Ｃｒａｎｄｅｌｌ−Ｒｅｅｓ Ｆｅｌｉｎｅ Ｋｉｄｎｅｙ）
・ヒトアデノウイルス５型（Ａｄｅｎｏｉｄ７５，ＡＴＣＣ ＶＲ−５）
感染価測定用細胞：ヒト肺癌由来細胞株（Ａ５４９）
・ヒトエンテロウイルス７１型（Ｈ，ＡＴＣＣ ＶＲ−１４３２）
感染価測定用細胞：サル腎臓由来細胞（Ｖｅｒｏ）
（１）試験ウイルス液の調製
・Ａ型インフルエンザウイルス
ウイルスを孵化鶏卵に接種し、３５．５℃で２日間培養後、漿尿液を回収し、限外濾過膜で濃縮した後、ショ糖密度勾配遠心法（遠心条件；１０８，０００×ｇ、４℃、３時間）によりウイルス液を精製し、保存ウイルス液とした。試験には、保存ウイルス液をＰＢＳで１０倍に希釈して用いた。
・ネコカリシウイルス
ウイルスをＣＲＦＫ細胞に感染させ、細胞培養面積の約９０％以上が細胞変性効果（ＣＰＥ）を示したとき、−３０℃の冷凍庫に凍結保存した。その後、凍結融解操作を行い、２，３８０×ｇで１０分間遠心した上清を採取し、限外濾過膜で濃縮したウイルス液をショ糖クッション法（遠心条件；１０８，０００×ｇ、４℃、３時間）でさらに濃縮したウイルス液を保存ウイルス液とした。試験には、保存ウイルス液をＰＢＳで１０倍に希釈して用いた。
・ヒトアデノウイルス５型
ウイルスをＡ５４９細胞に感染させ、細胞培養面積の約９０％以上がＣＰＥを示したとき、−３０℃の冷凍庫に凍結保存した。その後、凍結融解操作を行い、２，３８０×ｇで１０分間遠心した上清を採取し、限外濾過膜で濃縮したウイルス液を保存ウイルス液とした。試験には、保存ウイルス液をＰＢＳで１０倍に希釈して用いた。
・エンテロウイルス７１型
ウイルスをＶｅｒｏ細胞に感染させ、細胞培養面積の約９０％以上がＣＰＥを示したとき、−３０℃の冷凍庫に凍結保存した。その後、凍結融解操作を行い、２，３８０×ｇで１０分間遠心した上清を採取し、限外濾過膜で濃縮したウイルス液を保存ウイルス液とした。試験には、保存ウイルス液を原液で用いた。
（２）ウイルス不活化試験
実施例１で製造した抗微生物剤（殺菌剤）を５ｍｌ容量の試験官に０．９ｍｌ分取したのち、試験ウイルス液０．１ｍｌを加えて混合し、室温で所定時間作用させた。殺菌剤の作用停止は、作用液から０．１ｍｌを採取し、実施例２と同様の反応停止液９．９ｍｌに添加して殺菌剤を希釈する方法を採用した。これをウイルス感染価測定用試料の原液とした。なお、作用時間０（初期）およびネガティブコントロールにはＰＢＳを用いた。
（３）ＴＣＩＤ５０法によるウイルス感染価測定
ウイルス感染価測定用の細胞をあらかじめ９６ウェルプレートに播種してＣＯ２インキュベータで４日間培養した。次いで、ウイルス感染価測定用試料の原液をＰＢＳで１０倍段階希釈した。培養液を除いた各ウェルに、感染価測定用試料の原液またはＰＢＳで１０倍段階希釈した試料２５μｌを接種し、３７℃で１時間、ウイルスを細胞に感染させた。１時間後、接種したウイルス液を除去し、ウイルス培養用の培地を１ウェル当たり０．１ｍｌ加え、３７℃のＣＯ２インキュベータで培養した。各ウイルスの培養期間は、以下のとおりであった。
・Ａ型インフルエンザウイルス；４日間
・ネコカリシウイルス；４日間
・ヒトアデノウイルス５型；６日間（３日目に培地交換を実施）
・エンテロウイルス７１型；６日間
培養後、ウイルスの増殖により生じたＣＰＥを顕微鏡で観察し、Ｒｅｅｄ−Ｍｕｅｎｃｈ法によりウイルス感染価（ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）を求めた。
なお、ネガティブコントロールの初期感染価と殺菌剤作用後の感染価から、下記式を用いて感染価対数減少値（ＬＲＶ；ｌｏｇ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｖａｌｕｅ）を算出した。
ＬＲＶ（感染価対数減少値）＝ｌｏｇ１０（対象の初期感染価÷殺菌剤作用後の感染価）
以下に各ウイルスに対する試験結果を示す。
Figure 0006884447
本発明の殺菌剤（実施例１で製造した抗微生物剤）により、インフルエンザウイルスが１５秒間で検出限界未満にまで不活化されていることに注目すべきである。本発明の抗微生物剤は、金属イオンの配合が最適化されていることにより、ウイルスの迅速な不活化が達成されている。
Figure 0006884447
ネコカリシウイルスはノロウイルスの代用として用いることができる。本発明の抗微生物剤はノロウイルスに対しても不活化することができると考えられる。
Figure 0006884447
Figure 0006884447
表６から明らかなとおり、殺菌剤（本発明の抗微生物剤）はヒトエンテロウイルス７１型に対しては効果を有さなかった。本発明の抗微生物剤は広範なウイルスに効力を有するものの、すべてのウイルスに効果を有するわけではないが、実施例２および３において確認された特定のウイルスに対しては少なくとも効力を有するものである。
（実施例４ 各種細菌の不活化試験）
実施例４の試験は一般財団法人北里環境科学センターにおいて行った。実施例４において用いた細菌の種類は以下のとおりである。
・Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＢＲＣ３９７２（大腸菌）
・Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｏ１５７：Ｈ７） ＲＩＭＤ０５０９９３９（腸管出血性大腸菌 Ｏ１５７）
・Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＮＢＲＣ１３２７５（緑膿菌）
・Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｕｂｓｐ． ｅｎｔｅｒｉｃａ ＮＢＲＣ３３１３（サルモネラ）
・Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＮＢＲＣ１２７３２（黄色ブドウ球菌）
・Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ （ＭＲＳＡ） ＩＩＤ１６７７（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌）
・Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ ＮＢＲＣ１２７１１（腸炎ビブリオ）
・Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ ｓｕｂｓｐ． ｊｅｊｕｎｉ ＪＣＭ２０１３（カンピロバクター）
・Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ＮＢＲＣ１５９４（カンジダ）
（１）試験菌液の調製
・大腸菌、Ｏ１５７、緑膿菌、サルモネラ、黄色ぶどう球菌、ＭＲＳＡ
凍結保存された菌株をＴＳＡ（トリプトンソイ寒天培地）に接種して、３６±２℃で、２４時間培養した。さらに同培地に接種して、３６±２℃で、１８時間培養後、発育した集落をかき取り、滅菌イオン交換水に懸濁して約１０７ＣＦＵ／ｍＬに調製し、これを試験菌液とした。
・腸炎ビブリオ
凍結保存された菌株を２．５％塩化ナトリウム加ＴＳＡに接種して、３６±２℃で、２４時間培養した。さらに同培地に接種して、３６±２℃で、１８時間培養後、発育した集落をかき取り、３％塩化ナトリウム溶液に懸濁して約１０７ＣＦＵ／ｍＬに調製し、これを試験菌液とした。
・カンピロバクター
凍結保存された菌株を５％ウマ血清加ＢＡ（ブルセラ寒天培地）に接種し、３６±２℃で３日間微好気培養した。発育した集落を５％ウマ血清加ＢＢ（ブルセラブロス）に接種して３６±２℃で２日間微好気条件下で静置培養した。培養後、リン酸緩衝液で約１０７ＣＦＵ／ｍＬに調製し、これを試験菌液とした。
・カンジダ
凍結保存された菌株をＰＤＡ（ポテトデキストロース寒天培地）に接種し、２６±２℃で２日間培養した。発育した集落を滅菌イオン交換水に懸濁して約１０７ＣＦＵ／ｍＬに調製し、これを試験菌液とした。
（２）殺菌効力試験
試験品（実施例１で製造した本発明の抗微生物剤）１０ｍＬに試験菌液０．１ｍＬを加え、試験管ミキサーで混合して０（初期）、５分間、菌種によっては３０分間、２５±２℃で作用させた。所定時間作用後、試験品１ｍＬを不活性化剤９ｍＬに添加して、試験菌に対する殺菌作用を停止させ、これを菌数測定用試料液とした。作用時間０（初期）およびネガティブコントロールは、試験品の代わりに滅菌生理食塩液を、腸炎ビブリオには３％塩化ナトリウム溶液を用いた。なお、不活性化剤としては、実施例２と同様にＳＣＤＬＰを用いたが、腸炎ビブリオについては２．５％塩化ナトリウム加ＳＣＤＬＰを用いた。
（３）菌数測定
・大腸菌、Ｏ１５７、緑膿菌、サルモネラ、黄色ぶどう球菌、ＭＲＳＡ
菌数測定用試料液を原液として、生理食塩液で１０倍段階希釈列を作製し、試料原液および希釈液の各１ｍＬをシャーレに移し、ＴＳＡ約２０ｍＬと混合後、固化させて３６±２℃で４３時間培養した。培養後の発育集落を数えて、試験品１ｍＬあたりの試験菌数を求めた（定量下限値：１０ＣＦＵ）。
・腸炎ビブリオ
菌数測定用試料液を原液として、３％塩化ナトリウム溶液で１０倍段階希釈列を作製し、試料原液および希釈液の各１ｍＬをシャーレに移し、２．５％塩化ナトリウム加ＴＳＡ約２０ｍＬと混合後、固化させて３６±２℃で４８時間培養した。培養後の発育集落を数えて、試験品１ｍＬあたりの試験菌数を求めた（定量下限値：１０ＣＦＵ）。
・カンピロバクター
菌数測定用試料液を原液として、リン酸緩衝液で１０倍段階希釈列を作製し、試料原液および希釈液の各０．１ｍＬを５％ウマ血清加ＢＡに塗抹し、３６±２℃で３日間微好気条件で培養した。培養後の発育集落を数えて、試験品１ｍＬあたりの試験菌数を求めた（定量下限値：１００ＣＦＵ）。
・カンジダ
菌数測定用試料液を原液として、生理食塩液で１０倍段階希釈列を作製し、試料原液および希釈液の各１ｍＬをシャーレに移し、ＰＤＡ約２０ｍＬと混合後、固化させて２６±２℃で４日間培養した。培養後の発育集落を数えて、試験品１ｍＬあたりの試験菌数を求めた（定量下限値：１０ＣＦＵ）。
（４）菌数対数減少値の算出
対照の初期菌数と試験品作用後の試験菌数から、下記式を用いて菌数対数減少値（＝ＬＲＶ；ｌｏｇ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｖａｌｕｅ）を算出した。
ＬＲＶ（菌数対数減少値）＝ｌｏｇ１０（対照の初期菌数÷試験品作用後の菌数）
（５）結果
試験品に５分間および３０分間作用後の菌数は、全菌種において定量下限値未満（＜１０または＜１００ＣＦＵ／ｍＬ）、ＬＲＶは３．３〜４．８となった。ネガティブコントロールとした生理食塩液または３％塩化ナトリウム溶液の３０分間作用後までの菌数は、初期値（２．３〜６．７×１０５ＣＦＵ／ｍＬ）から変動は無かった。したがって、本発明の抗微生物剤は、試験した９種の細菌に対して不活化能を有した。具体的な結果を以下に示す。
Figure 0006884447
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なお、Ｏ１５７およびＭＲＳＡを用いて、上記の除菌剤の３倍希釈および５倍希釈も併せて試験したところ、上記除菌剤と比較して希釈とともに抗微生物能が低下した（データ示さず）。
（実施例５ 比較試験データ）
銀イオンを金属イオンとして使用した抗微生物剤と、実施例１で作製した抗微生物剤と、それを３倍希釈した抗微生物剤とで、抗微生物能を比較した。
銀イオンを金属イオンとして使用した抗微生物剤（１０００ｍＬ）の組成は以下のとおりであった。
ＡｇＮＯ３：０．００５ｇ（３ｐｐｍ）
ＺｎＳＯ４：０．２９ｇ
Ｌ−システイン：０．２ｇ（２００ｐｐｍ）
Ｌ−アスコルビン酸：０．１ｇ
ラウリル硫酸ナトリウム：０．１ｇ
ソルビン酸カリウム：０．０５ｇ
希塩酸で ｐＨ３．０ に調整。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｏ１５７：Ｈ７）ＲＩＭＤ ０５０９９３９（腸管出血性大腸菌Ｏ１５７）およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ） ＩＩＤ １６７７（メチシリン耐性黄色ぶどう球菌）を細菌として用い、実施例４と同様に抗微生物活性を求めた。
Figure 0006884447
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表１６および１７の結果から、本発明の抗微生物剤の金属イオンの配合は銀イオンタイプよりも優れていること、および本発明の抗微生物剤の抗微生物活性は濃度依存的であることが明らかになった。
本発明は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２を含むコロナウイルスや、インフルエンザウイルス、ノロウイルス、大腸菌、黄色ブドウ球菌など広範な微生物の不活化に有効な新規抗微生物剤として利用され得る。

Claims (8)

  1. 金属イオンと、Ｌ−システインと、Ｌ−アスコルビン酸と、界面活性剤とを含む、微生物に対する抗微生物剤であって、前記微生物がコロナウイルスを含む、抗微生物剤であって、前記金属イオンは、
    約１８０〜約２５０ｐｐｍの（ＩＩＩ）価の鉄イオン、
    約６０〜約１２０ｐｐｍの亜鉛イオン、
    約３０〜約４５ｐｐｍのニッケルイオン
    を含み、約１．５：１〜約３：１の（ＩＩＩ）価の鉄イオンと前記亜鉛イオンとのｐｐｍ比を有する、抗微生物剤。
  2. 前記コロナウイルスが、ＨＣｏＶ−ＨＫＵ１、ＨＣｏＶ−ＯＣ４３、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ、およびＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２からなる群から選択される、請求項１に記載の抗微生物剤。
  3. 前記コロナウイルスが、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２を含む、請求項２に記載の抗微生物剤。
  4. 前記微生物が、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、ノロウイルス、大腸菌、緑膿菌、サルモネラ、黄色ブドウ球菌、腸炎ビブリオ、カンピロバクターおよびカンジダをさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗微生物剤。
  5. 約１００〜約２０００ｐｐｍのＬ−システイン、約１０〜約２００ｐｐｍのＬ−アスコルビン酸、約１０〜約２００ｐｐｍのラウリル硫酸ナトリウム、および約２０〜約１００ｐｐｍのソルビン酸またはソルビン酸塩を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗微生物剤。
  6. 約２．５〜約４．０のｐＨを有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗微生物剤。
  7. 前記金属イオンは、約３：１〜約６：１の（ＩＩＩ）価の鉄イオンとニッケルイオンとのｐｐｍ比を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗微生物剤。
  8. 以下の成分を含む微生物に対する抗微生物剤であって、前記微生物がコロナウイルスを含む、抗微生物剤：
    ・（ＩＩＩ）価の鉄イオン：約１９８ｐｐｍ
    ・亜鉛イオン：約１０１ｐｐｍ
    ・ニッケルイオン：約３８ｐｐｍ
    ・Ｌ−システイン：約１０００ｐｐｍ
    ・Ｌ−アスコルビン酸：約１００ｐｐｍ
    ・ソルビン酸カリウム：約５０ｐｐｍ
    ・ラウリル硫酸ナトリウム：約１００ｐｐｍ。
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