JP6877605B2 - 血液を含むサンプルからの直接の核酸標的の多重検出 - Google Patents

Description

本発明は、血液を含むサンプルからの直接の核酸標的の多重検出のためのプロセス及び装置に関する。関係する例は、白血球に存在する人間のＤＮＡから増幅された人間の対照遺伝子と共に、目的のウイルスを同時に検出するものである。

この分野で限られた数の文献しかない事は、一般に用いられる蛍光ラベルリアルタイムＰＣＲ法が、テストされるべきサンプルに任意のかなりの量の血液がある場合に利用されることが出来ないことを示唆している。時間のかかる核酸抽出を必要としないで、例えばポイントオブケアで血液サンプルから直接に、病原体とヒト標的の両方を迅速に検出できることは、研究者及び臨床医にとって明らかに利益のあることであろう。

この発明の背景技術は、２つの異なる分野に存在する。まずは、超高速ＰＣＲの分野、そして、単一の閉止されたチューブ形式の粗試料から核酸を直接増幅することが出来るようになるまで超高速ＰＣＲを拡張する分野における、出願人自身の背景技術の知識である。感度のよい、検出に必要最小限の時間のみを使用する診断テストのための条件は、例えば、インフィールドスクリーニングによって多くの命が救われるであろう新生感染症の流行に際して、明確に確立されている。出願人は、複数のマトリクスから目的の種を高速に直接検出することを以前に示した。望ましく、且つ、技術的に難しい一つの目的は、全血サンプルから、直接、血液媒介病原体を直接スクリーニングする事である。この難しい問題は、一つ目は、反応に受け入れられることが出来る血液の量を、二つ目は、アッセイ結果におけるこの血液の存在の影響を含む。

背景技術情報の第２の関連する領域は、Barnesらのグループの研究(Mutants of Taq DNA polymerase resistant to PCR inhibitors allow DNA amplification from whole blood and crude soil samples) （あらゆる公開文献への十分な参照が必要である）である。また、抑制物質が存在するときの直接ＰＣＲを可能とするように設計された、発生酵素および添加剤も存在する。この研究は、ポリメラーゼの突然変異によって、全血の存在下において、酵素がＤＮＡを増幅することができるようにすることが出来ることを示した。同一の論文は、本発明が解決しようとする問題、人間の血液の存在によって観察される蛍光抑制物質を取り上げている。

リアルタイムＰＣＲが、標準的なリアルタイム熱循環器（standard realtime thermal cycler）内にヒト全血が存在する状態で完了するとき、非常に高いバックグラウンドと、それに加えて、用いた染料の波長に依存する８５〜９５％のオーダの、蛍光信号の減衰とが観察される。本発明者は、挿入染料アプローチを用いて、これを解決することを追求したが、血液サンプル内のヒト全ゲノムＤＮＡのバックグラウンドのレベルがかなり高いことから、このアプローチは臨床使用向きではなくなり、また多重化も不可能となる。全ての臨床アッセイは、内部制御核酸種のある形態を有することになり、したがって、ヒト全血サンプルからの目的の種の直接診断検出を実行することは不可能であった。

本発明者は、蛍光収集における血液の影響を決定するために、初期実験を繰り返したが、これは機能しないだろうと仮定されていたので、ＰＣＲの分野に関連した背景を記載した論文は殆どなかった。しかし、脳と他の臓器を検査するための、直接蛍光イメージング血液の分野に幾つかの論文が存在する。データは８５〜９５％の蛍光の減少−全血からの直接の核酸標的の直接多重検出を不可能とする−がどうして存在するのかを効果的に示している。まず、５４１と５７７ｎｍ周辺に大きな吸収ピークがあり、これらが、これらの波長のあらゆる一般的な染料からの蛍光出力を完全に吸収する。第２に、観察可能な赤方偏移がある；標準的なシステムは、検出器の前段に、狭い１０〜２０ｎｍ帯域通過フィルタを有し、あらゆる波長シフトは、収集されるだろう波長から、光の一部を明らかに遠ざけるだろう。第３に、ヘモグロビン自身の存在から、強度消光（quenching）効果が存在する。まとめると、単一の閉止チューブ形式に於ける複数の核酸標的の直接な多重検出を可能とするための、波長不感検出器と、フィルタの使用の一般的に用いられる組み合わせは、血液の存在下では機能しないだろう。

本発明は、したがって、全血を含むサンプルから１以上の核酸標的を検出するための光学系を含む。

本発明者は、６２０ｎｍまでの大きな消光効果を越えると、血液が存在することによる影響ははるかに低くなり、８５〜９５％の抑制とは対照的に、２０〜３０％の範囲であることを発見した。したがって、本システムは、サンプルに赤色光の高い励起パワーを送る手段を提供する。第２のキーとなる特徴は、６５０ｎｍから７５０ｎｍまでの範囲の光を収集するように較正された分光光度計の使用により、発光された蛍光信号を検出する能力である。高い励起パワーの赤色光と分光光度計の使用により、スペクトル脱畳み込みアプローチによって、単一の蛍光読み取りにおいて、複数の目的の種を同時に検出することが出来るようになる。関連する例は、同様な症状を引き起こす臓器からの感染を排除しつつ、フィロウイルス科から帰結する感染間を区別し、依然、内部制御のためのスペクトル空間を有すること、とすることが出来る。標準的なＰＣＲ光学アプローチは、発光フィルタと組み合わせて、単一点励起源を用い、したがって、染料発光波長間に十分な間隔がなく、且つ、これらのチャネル間のクロストークを除去する能力もないであろう。システムは、赤色又は近赤外励起コンポーネントを有するものが存在するが、これらは、絶対的な条件がある場合、高いレベルの多重化は出来ない。

したがって、本発明の第１の側面によると、サンプルが全血を含むとき、単一の閉止チューブ形式において直接増幅される、複数の核酸標的の多重検出のための方法は、少なくとも２ｍＷのオーダで、好ましくは、５ｍＷより大きい、６２０ｎｍ波長より大きい波長での、赤色励起光のサンプルへの照射を含む。好適実施形態においては、この励起は、６３５ｎｍにおけるレーザダイオードによって照射されるが、６３３〜６４２の範囲が適用可能と分かっている。６４０ｎｍ波長範囲を下回るレーザからの発光を除去するために、帯域通過フィルタ又はショートパスが用いられることが出来る。別の実施形態においては、ＬＥＤ励起は、ＬＥＤを、大きな直径コア、高ＮＡファイバに結合することによって提供され、同様に帯域通過フィルタリングされる。更に、励起に関して、自由空間アプローチが実施されたが、好適実施形態は、ファイバベースの照射アプローチである。

本発明の第２の側面によると、サンプルが全血を含むときに直接増幅される複数の核酸標的の多重検出のための装置が提供され、この装置は、増幅を起こさせるように配置された反応チャンバと、６２０ｎｍ波長より大きい波長で、赤色励起光をサンプルへ照射する手段と、を備える。

励起光は、好ましくは、少なくとも２ｍＷのオーダのパワーで照射され、更により好ましくは、５ｍＷを超える。励起は、６３５ｎｍのレーザダイオードで照射されることが出来るが、６３３〜６４２の範囲が適用可能であることがわかっている。６４０ｎｍ波長範囲を下回るレーザからの発光を除去するために、帯域通過フィルタ又はショートパスが用いられることが出来る。別の実施形態においては、ＬＥＤ励起は、ＬＥＤを大きな直径コア、高ＮＡファイバに結合することにより提供され、同様に、帯域通過フィルタリングされる。更に、励起に関し、自由空間アプローチが実施されたが、好適実施形態は、ファイバベースの照射アプローチである。装置は、結果の放射プロファイルの調査のための分光光度計を組み込む事ができる。

好適実施形態においては、システムは、直接インフィールド検出のための８ウェルランダムアクセスシステムの形態を取る(GB2015000027)。この以前の明細書は、直接フリーズ／ソー（freeze/thaw）(EP2585581) 媒介溶解と、単一閉止チューブ形式での組み合わせ増幅を可能とするＨＲＭアプローチ(US8597937)を利用するシステムを記述する。８ウェル形式は、８つの反応容器のすべてが、蛍光信号を、単一の共有分光光度計に送らなくてはならず、したがって、光ファイバアレイは、好適実施形態を形成することを意味する。これは、８つの個々のレーザダイオードモジュールにそれぞれがいたる、８つの２００ミクロンコア０．２２ＮＡファイバからなる８つに分岐した（octofurcated）ファイバアレイからなる。これらは、レーザダイオード、制御電子機器、コリメートのための非球面レンズ、及び、６４０ｎｍより小さい光のみを発光するための帯域又はショート通過フィルタを備える。これらのレーザダイオードのそれぞれは、ＨＲＭ機構(US8597937)の分岐内に含まれる手段によって温度制御され、それらの温度が、一定に保たれるようにする；レーザダイオードシフト波長及び、温度シフトを有する励起パワーなどは、安定化されなければならない。８つに分岐した照射ファイバは、８つの収集ファイバと、接合部分で合わされ、ダブルコアファイバは、各サンプル反応容器の上部にいたり、一つは、励起を提供し、もう一つは、放射蛍光を収集する。８つの収集ファイバは、ＳＭＡコネクタ終端において、添付の図面のように、２×４のアレイに合わされ、これらは、６５０ｎｍより小さい任意の光を除去する長波長通過フィルタを通った後、分光光度計に収束され、意図された放射光のみが、分光光度計上に画像形成されるようにする。

使用においては、好適実施形態は、各個別の容器の照射が順番に検出器に一つのスペクトルの画像形成を行うように、順序だてられて動作する。電子制御の手段は、この照射を、時間ベースと加熱システムの両方に同期し、各ウェルからの同時の読み取りが、正しい時間点でなされるようにする。

異なる数の分光光度計および実際に異なるファイバアレイを用いた、自由空間照射を伴う一つの容器から単一の分光光度計への、中心的な主張を満たす実施形態を構成することができるということが、はっきりとわかり、ここで中心的な主張とは、システムは、６２０ｎｍより大きい波長において十分な励起パワーを持っていなければならず、好適には、結果として得られる放射プロファイルの調査のための分光光度計を利用する、ということである。

本発明の実施形態が、添付の図面を参照して、例示の形で具体的に記述されるだろう。
蛍光ネガティブ対照サンプルがなく、血液が存在しない場合の、様々な積分時間での、励起光波長に対する相対的検出強度のグラフである。 挿入染料及びＤＮＡがある場合の、図１Ａと同様のグラフである。 血液がある場合の、図１Ａと同様のグラフである。 血液がある場合の、図１Ｂと同様のグラフである。 赤色励起を用いたことにより発生する蛍光を示すグラフである。 ８つのウェルフィールドＰＣＲ装置の透視図である。 図３に図示された装置の平面図である。 図３の装置のヘッドアレイの断面図である。 図３の装置における光学構成の平面図である。 図３の装置に対する光励起源アレイを図示する。 分光光度計を示す。 光ファイバアレイ１３を示す。 ＰＣＲシステムと光学素子を示すためにむき出しにされた完全なＰＣＲ装置を示す。

図１Ａ〜１Ｄ及び図２は、ＰＣＲを受けるサンプルの蛍光から発せられる信号への血液の影響を示し、縦軸は、光の相対的強度を示し、横軸は、ナノメータ（ｎｍ）での波長を示す。

図１Ａは、血液を含まない、対照サンプルからの結果を図示する。観察される信号は、青色４７３ｎｍＬＥＤ励起から発生する。

図１Ｂは、二重鎖ＤＮＡの１００ｎｇ（ナノグラム）の添加を含む、通常濃度でのＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ挿入染料の添加によって生成される蛍光を示す。より高い積分時間において検出器を飽和する蛍光を示す。参考までに、５４５ｎｍで、５５，０００の強度がバックグラウンドに生じた。

図１Ｃは、サンプルへの、１０体積％のヒト血液の添加の効果を示す。５６０と６１０ｎｍにおいて放射ピークを有する内在性自己蛍光が存在する。

図１Ｄは、サンプルへの、１０体積％のヒト血液の添加を伴う、図１Ｂの実験と同一の実験設定の結果を示す。例えば、５４５ｎｍにおいて、複数の吸収ピークが観察され、また、６１０ｎｍにおいて、自己蛍光の著しい増加がみられる。５４５ｎｍでの信号強度は、図１Ｂに比べ、９２％を超えて低下した。

異なるパラメータ下での２ｍＷ赤色（６２５ｎｍ）でのサンプルからの蛍光の分光出力が、図２に示されている。グラフは、１０体積％のヒト血液の添加が、あり（＋）及びなし（−）の影響を示す。赤色中心染料Cal635、Quasar70及び Quasar 705は、他の可視波長では血液の存在下で８５〜９５％の抑制が観察されるのに対して、３０〜５０％のみの抑制を示す。

図１Ａ〜１Ｄ及び図２は、まとめると、本発明は、従来のＱＰＣＲ光アプローチを用いて観察される蛍光信号の９０％より大きい抑制を解決することを示す。

図３〜９に示されるように、本発明の好適な実施形態は、全血の存在下での増幅された核酸標的のフィールド検出のための装置１０である。血液は、赤色である限り、ヒトのものでも、他の動物のものでもよい。

装置１０は、それぞれが、個別の光検出ヘッド１１を有する、ランダムにアクセス可能な８つの反応ステーションを備える。エンドユーザに解析結果を提示するためのディスプレイモニタ１２が存在する。各光ヘッド１１は、ＳＭＡコネクタ１４によって固定される８分岐ファイバアレイ１３の１つの分岐を含む。これらのコネクタの夫々内では、コリメートレンズ１５が配置され、反応容器から発せられる励起ビーム及び放射光がファイバ１３内へと収束されるようにする。励起ビームは、クリアリッド（clear lid）１６を介して、反応容器１７に収束され、反応容器の底部で１点に収束される。ファイバアレイ１３の遠端は、ＳＭＡ筐体に含まれる８つの赤色レーザダイオード１８に取り付けられ、それぞれは、帯域通過フィルタ１９を有し、不要な波長が、ファイバに入射されるのを防止する。レーザダイオード１８は、ＰＣＢ２によって駆動され、電流をそれぞれのデバイスに送り、励起パワーがアレイ１３に渡って規格化されることが出来るようにする。

各光検出ヘッド１１は、ピボット２１を介して装置に搭載され、ヘッド１１が、反応容器１７をのけて旋回できるようにし、容器１７が、冷却／加熱装置に配置されたり、これから取り除かれたりできるようにし、したがって、ＰＣＲが容器の内容物について実行されることが出来るようにする。

水冷ブロック２２が、レーザダイオード１８のアセンブリの温度を安定化するために配置される。

この実施形態においては、６３５〜６３８ｎｍで放射するレーザダイオード１８が、反応容器内で蛍光を励起するために、６３０〜６４２を通過するが、ＯＤ６における他の波長をブロックするレーザ筐体内の帯域通過フィルタとペアにされる。

分光光度計２３（図８）は、分光光度計２３の入り口において、ファイバアレイ１３及び、ペアにされた６５０又は６６５ｎｍ長波長通過フィルタ２４を介して、反応容器１７から放射される光を受信するように配置される。

図９は、光ファイバアレイ１３を示す。右側のファイバ束２５は、レーザダイオードに取り付けられた、単一コアを含むファイバを備える。これらのファイバは、スプリッタ２６に入り、ここから、２つのコアを含む８つのファイバ２７が伸び、一つは、励起のためのレーザダイオード１８に戻され、他方は、検出のために、分光光度計２３に導かれる。ファイバ２７は、装置ピボットヘッドに配置されるものである。分光光度計２３に通じる分岐は、スプリッタを出て、２×４アレイに８つのコアを含む、単一ファイバ２８に結合される。

図面には図示されていないのが、反応容器１７内で、ＰＣＲ反応が実行される手段である。マイクロタイターの容量である反応容器１７は、ペルチェセルの作動面に連携する反応容器受け入れカップ内にぴったりと保持され、規定温度が、反応容器の反応チャンバ内で、迅速に到達されることが出来るようにする。ペルチェセルの底面（基面）は、ＰＣＲサイクルの上限温度と下限温度の中間の一定温度で流れるように水が配置される熱源シンクと連携する。

使用においては、病原体などの潜在標的を含むと疑われるヒト全血は、例えば、Cy5.5、 quasar 670、 quasar 705又は、当分野で知られる任意の他の多重染料で標識された、正しいプライマ及びプローブと共に、反応容器１７内に配置される。レーザは、ＰＣＲが進むと、反応容器１７に照射され、増幅が成功すると、血液が存在しても観察することが出来るスペクトルを生成する。

Claims (10)

1. サンプルが血液を含む場合に、前記サンプルとの増幅反応において直接増幅される拡散標的の多重検出のための方法であって、前記増幅反応の励起が６２０ｎｍよりも大きい波長でなされ、かつ、前記励起が２ｍＷを超えるパワーで引き起こされることを特徴とする方法。
2. 単一の閉止チューブ形式で実行される、請求項１に記載の方法。
3. 前記励起は５ｍＷを超えるパワーで引き起こされる、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記血液は全血である、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記サンプルは、少なくとも１０体積％の血液を含む、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記励起は、６３３〜６４０ｎｍの範囲で照射される、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記増幅反応は、ＰＣＲ、等熱増幅、又はＲＴ−ＰＣＲを含む、請求項１又は２に記載の方法。
8. 後続のプロセスは、検出される複数の信号から発生する複数の観察されたスペクトルを分光的に脱畳み込みすることを含む、請求項１乃至７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記励起は、レーザ又は発光ダイオード（ＬＥＤ）によって照射される、請求項１乃至８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記増幅反応を加熱及び冷却するように配置された作動面と、前記増幅反応の上限温度と下限温度との中間の一定温度に維持される基面とを有するペルチェセルを用いて、前記増幅反応を引き起こし且つ制御することを含む、請求項１乃至９のいずれか１項に記載の方法。

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