JP6877605B2 - 血液を含むサンプルからの直接の核酸標的の多重検出 - Google Patents

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Description

本発明は、血液を含むサンプルからの直接の核酸標的の多重検出のためのプロセス及び装置に関する。関係する例は、白血球に存在する人間のDNAから増幅された人間の対照遺伝子と共に、目的のウイルスを同時に検出するものである。
この分野で限られた数の文献しかない事は、一般に用いられる蛍光ラベルリアルタイムPCR法が、テストされるべきサンプルに任意のかなりの量の血液がある場合に利用されることが出来ないことを示唆している。時間のかかる核酸抽出を必要としないで、例えばポイントオブケアで血液サンプルから直接に、病原体とヒト標的の両方を迅速に検出できることは、研究者及び臨床医にとって明らかに利益のあることであろう。
この発明の背景技術は、2つの異なる分野に存在する。まずは、超高速PCRの分野、そして、単一の閉止されたチューブ形式の粗試料から核酸を直接増幅することが出来るようになるまで超高速PCRを拡張する分野における、出願人自身の背景技術の知識である。感度のよい、検出に必要最小限の時間のみを使用する診断テストのための条件は、例えば、インフィールドスクリーニングによって多くの命が救われるであろう新生感染症の流行に際して、明確に確立されている。出願人は、複数のマトリクスから目的の種を高速に直接検出することを以前に示した。望ましく、且つ、技術的に難しい一つの目的は、全血サンプルから、直接、血液媒介病原体を直接スクリーニングする事である。この難しい問題は、一つ目は、反応に受け入れられることが出来る血液の量を、二つ目は、アッセイ結果におけるこの血液の存在の影響を含む。
背景技術情報の第2の関連する領域は、Barnesらのグループの研究(Mutants of Taq DNA polymerase resistant to PCR inhibitors allow DNA amplification from whole blood and crude soil samples) (あらゆる公開文献への十分な参照が必要である)である。また、抑制物質が存在するときの直接PCRを可能とするように設計された、発生酵素および添加剤も存在する。この研究は、ポリメラーゼの突然変異によって、全血の存在下において、酵素がDNAを増幅することができるようにすることが出来ることを示した。同一の論文は、本発明が解決しようとする問題、人間の血液の存在によって観察される蛍光抑制物質を取り上げている。
リアルタイムPCRが、標準的なリアルタイム熱循環器(standard realtime thermal cycler)内にヒト全血が存在する状態で完了するとき、非常に高いバックグラウンドと、それに加えて、用いた染料の波長に依存する85〜95%のオーダの、蛍光信号の減衰とが観察される。本発明者は、挿入染料アプローチを用いて、これを解決することを追求したが、血液サンプル内のヒト全ゲノムDNAのバックグラウンドのレベルがかなり高いことから、このアプローチは臨床使用向きではなくなり、また多重化も不可能となる。全ての臨床アッセイは、内部制御核酸種のある形態を有することになり、したがって、ヒト全血サンプルからの目的の種の直接診断検出を実行することは不可能であった。
本発明者は、蛍光収集における血液の影響を決定するために、初期実験を繰り返したが、これは機能しないだろうと仮定されていたので、PCRの分野に関連した背景を記載した論文は殆どなかった。しかし、脳と他の臓器を検査するための、直接蛍光イメージング血液の分野に幾つかの論文が存在する。データは85〜95%の蛍光の減少−全血からの直接の核酸標的の直接多重検出を不可能とする−がどうして存在するのかを効果的に示している。まず、541と577nm周辺に大きな吸収ピークがあり、これらが、これらの波長のあらゆる一般的な染料からの蛍光出力を完全に吸収する。第2に、観察可能な赤方偏移がある;標準的なシステムは、検出器の前段に、狭い10〜20nm帯域通過フィルタを有し、あらゆる波長シフトは、収集されるだろう波長から、光の一部を明らかに遠ざけるだろう。第3に、ヘモグロビン自身の存在から、強度消光(quenching)効果が存在する。まとめると、単一の閉止チューブ形式に於ける複数の核酸標的の直接な多重検出を可能とするための、波長不感検出器と、フィルタの使用の一般的に用いられる組み合わせは、血液の存在下では機能しないだろう。
本発明は、したがって、全血を含むサンプルから1以上の核酸標的を検出するための光学系を含む。
本発明者は、620nmまでの大きな消光効果を越えると、血液が存在することによる影響ははるかに低くなり、85〜95%の抑制とは対照的に、20〜30%の範囲であることを発見した。したがって、本システムは、サンプルに赤色光の高い励起パワーを送る手段を提供する。第2のキーとなる特徴は、650nmから750nmまでの範囲の光を収集するように較正された分光光度計の使用により、発光された蛍光信号を検出する能力である。高い励起パワーの赤色光と分光光度計の使用により、スペクトル脱畳み込みアプローチによって、単一の蛍光読み取りにおいて、複数の目的の種を同時に検出することが出来るようになる。関連する例は、同様な症状を引き起こす臓器からの感染を排除しつつ、フィロウイルス科から帰結する感染間を区別し、依然、内部制御のためのスペクトル空間を有すること、とすることが出来る。標準的なPCR光学アプローチは、発光フィルタと組み合わせて、単一点励起源を用い、したがって、染料発光波長間に十分な間隔がなく、且つ、これらのチャネル間のクロストークを除去する能力もないであろう。システムは、赤色又は近赤外励起コンポーネントを有するものが存在するが、これらは、絶対的な条件がある場合、高いレベルの多重化は出来ない。
したがって、本発明の第1の側面によると、サンプルが全血を含むとき、単一の閉止チューブ形式において直接増幅される、複数の核酸標的の多重検出のための方法は、少なくとも2mWのオーダで、好ましくは、5mWより大きい、620nm波長より大きい波長での、赤色励起光のサンプルへの照射を含む。好適実施形態においては、この励起は、635nmにおけるレーザダイオードによって照射されるが、633〜642の範囲が適用可能と分かっている。640nm波長範囲を下回るレーザからの発光を除去するために、帯域通過フィルタ又はショートパスが用いられることが出来る。別の実施形態においては、LED励起は、LEDを、大きな直径コア、高NAファイバに結合することによって提供され、同様に帯域通過フィルタリングされる。更に、励起に関して、自由空間アプローチが実施されたが、好適実施形態は、ファイバベースの照射アプローチである。
本発明の第2の側面によると、サンプルが全血を含むときに直接増幅される複数の核酸標的の多重検出のための装置が提供され、この装置は、増幅を起こさせるように配置された反応チャンバと、620nm波長より大きい波長で、赤色励起光をサンプルへ照射する手段と、を備える。
励起光は、好ましくは、少なくとも2mWのオーダのパワーで照射され、更により好ましくは、5mWを超える。励起は、635nmのレーザダイオードで照射されることが出来るが、633〜642の範囲が適用可能であることがわかっている。640nm波長範囲を下回るレーザからの発光を除去するために、帯域通過フィルタ又はショートパスが用いられることが出来る。別の実施形態においては、LED励起は、LEDを大きな直径コア、高NAファイバに結合することにより提供され、同様に、帯域通過フィルタリングされる。更に、励起に関し、自由空間アプローチが実施されたが、好適実施形態は、ファイバベースの照射アプローチである。装置は、結果の放射プロファイルの調査のための分光光度計を組み込む事ができる。
好適実施形態においては、システムは、直接インフィールド検出のための8ウェルランダムアクセスシステムの形態を取る(GB2015000027)。この以前の明細書は、直接フリーズ/ソー(freeze/thaw)(EP2585581) 媒介溶解と、単一閉止チューブ形式での組み合わせ増幅を可能とするHRMアプローチ(US8597937)を利用するシステムを記述する。8ウェル形式は、8つの反応容器のすべてが、蛍光信号を、単一の共有分光光度計に送らなくてはならず、したがって、光ファイバアレイは、好適実施形態を形成することを意味する。これは、8つの個々のレーザダイオードモジュールにそれぞれがいたる、8つの200ミクロンコア0.22NAファイバからなる8つに分岐した(octofurcated)ファイバアレイからなる。これらは、レーザダイオード、制御電子機器、コリメートのための非球面レンズ、及び、640nmより小さい光のみを発光するための帯域又はショート通過フィルタを備える。これらのレーザダイオードのそれぞれは、HRM機構(US8597937)の分岐内に含まれる手段によって温度制御され、それらの温度が、一定に保たれるようにする;レーザダイオードシフト波長及び、温度シフトを有する励起パワーなどは、安定化されなければならない。8つに分岐した照射ファイバは、8つの収集ファイバと、接合部分で合わされ、ダブルコアファイバは、各サンプル反応容器の上部にいたり、一つは、励起を提供し、もう一つは、放射蛍光を収集する。8つの収集ファイバは、SMAコネクタ終端において、添付の図面のように、2×4のアレイに合わされ、これらは、650nmより小さい任意の光を除去する長波長通過フィルタを通った後、分光光度計に収束され、意図された放射光のみが、分光光度計上に画像形成されるようにする。
使用においては、好適実施形態は、各個別の容器の照射が順番に検出器に一つのスペクトルの画像形成を行うように、順序だてられて動作する。電子制御の手段は、この照射を、時間ベースと加熱システムの両方に同期し、各ウェルからの同時の読み取りが、正しい時間点でなされるようにする。
異なる数の分光光度計および実際に異なるファイバアレイを用いた、自由空間照射を伴う一つの容器から単一の分光光度計への、中心的な主張を満たす実施形態を構成することができるということが、はっきりとわかり、ここで中心的な主張とは、システムは、620nmより大きい波長において十分な励起パワーを持っていなければならず、好適には、結果として得られる放射プロファイルの調査のための分光光度計を利用する、ということである。
本発明の実施形態が、添付の図面を参照して、例示の形で具体的に記述されるだろう。
蛍光ネガティブ対照サンプルがなく、血液が存在しない場合の、様々な積分時間での、励起光波長に対する相対的検出強度のグラフである。 挿入染料及びDNAがある場合の、図1Aと同様のグラフである。 血液がある場合の、図1Aと同様のグラフである。 血液がある場合の、図1Bと同様のグラフである。 赤色励起を用いたことにより発生する蛍光を示すグラフである。 8つのウェルフィールドPCR装置の透視図である。 図3に図示された装置の平面図である。 図3の装置のヘッドアレイの断面図である。 図3の装置における光学構成の平面図である。 図3の装置に対する光励起源アレイを図示する。 分光光度計を示す。 光ファイバアレイ13を示す。 PCRシステムと光学素子を示すためにむき出しにされた完全なPCR装置を示す。
図1A〜1D及び図2は、PCRを受けるサンプルの蛍光から発せられる信号への血液の影響を示し、縦軸は、光の相対的強度を示し、横軸は、ナノメータ(nm)での波長を示す。
図1Aは、血液を含まない、対照サンプルからの結果を図示する。観察される信号は、青色473nmLED励起から発生する。
図1Bは、二重鎖DNAの100ng(ナノグラム)の添加を含む、通常濃度でのSYBR Gold挿入染料の添加によって生成される蛍光を示す。より高い積分時間において検出器を飽和する蛍光を示す。参考までに、545nmで、55,000の強度がバックグラウンドに生じた。
図1Cは、サンプルへの、10体積%のヒト血液の添加の効果を示す。560と610nmにおいて放射ピークを有する内在性自己蛍光が存在する。
図1Dは、サンプルへの、10体積%のヒト血液の添加を伴う、図1Bの実験と同一の実験設定の結果を示す。例えば、545nmにおいて、複数の吸収ピークが観察され、また、610nmにおいて、自己蛍光の著しい増加がみられる。545nmでの信号強度は、図1Bに比べ、92%を超えて低下した。
異なるパラメータ下での2mW赤色(625nm)でのサンプルからの蛍光の分光出力が、図2に示されている。グラフは、10体積%のヒト血液の添加が、あり(+)及びなし(−)の影響を示す。赤色中心染料Cal635、Quasar70及び Quasar 705は、他の可視波長では血液の存在下で85〜95%の抑制が観察されるのに対して、30〜50%のみの抑制を示す。
図1A〜1D及び図2は、まとめると、本発明は、従来のQPCR光アプローチを用いて観察される蛍光信号の90%より大きい抑制を解決することを示す。
図3〜9に示されるように、本発明の好適な実施形態は、全血の存在下での増幅された核酸標的のフィールド検出のための装置10である。血液は、赤色である限り、ヒトのものでも、他の動物のものでもよい。
装置10は、それぞれが、個別の光検出ヘッド11を有する、ランダムにアクセス可能な8つの反応ステーションを備える。エンドユーザに解析結果を提示するためのディスプレイモニタ12が存在する。各光ヘッド11は、SMAコネクタ14によって固定される8分岐ファイバアレイ13の1つの分岐を含む。これらのコネクタの夫々内では、コリメートレンズ15が配置され、反応容器から発せられる励起ビーム及び放射光がファイバ13内へと収束されるようにする。励起ビームは、クリアリッド(clear lid)16を介して、反応容器17に収束され、反応容器の底部で1点に収束される。ファイバアレイ13の遠端は、SMA筐体に含まれる8つの赤色レーザダイオード18に取り付けられ、それぞれは、帯域通過フィルタ19を有し、不要な波長が、ファイバに入射されるのを防止する。レーザダイオード18は、PCB2によって駆動され、電流をそれぞれのデバイスに送り、励起パワーがアレイ13に渡って規格化されることが出来るようにする。
各光検出ヘッド11は、ピボット21を介して装置に搭載され、ヘッド11が、反応容器17をのけて旋回できるようにし、容器17が、冷却/加熱装置に配置されたり、これから取り除かれたりできるようにし、したがって、PCRが容器の内容物について実行されることが出来るようにする。
水冷ブロック22が、レーザダイオード18のアセンブリの温度を安定化するために配置される。
この実施形態においては、635〜638nmで放射するレーザダイオード18が、反応容器内で蛍光を励起するために、630〜642を通過するが、OD6における他の波長をブロックするレーザ筐体内の帯域通過フィルタとペアにされる。
分光光度計23(図8)は、分光光度計23の入り口において、ファイバアレイ13及び、ペアにされた650又は665nm長波長通過フィルタ24を介して、反応容器17から放射される光を受信するように配置される。
図9は、光ファイバアレイ13を示す。右側のファイバ束25は、レーザダイオードに取り付けられた、単一コアを含むファイバを備える。これらのファイバは、スプリッタ26に入り、ここから、2つのコアを含む8つのファイバ27が伸び、一つは、励起のためのレーザダイオード18に戻され、他方は、検出のために、分光光度計23に導かれる。ファイバ27は、装置ピボットヘッドに配置されるものである。分光光度計23に通じる分岐は、スプリッタを出て、2×4アレイに8つのコアを含む、単一ファイバ28に結合される。
図面には図示されていないのが、反応容器17内で、PCR反応が実行される手段である。マイクロタイターの容量である反応容器17は、ペルチェセルの作動面に連携する反応容器受け入れカップ内にぴったりと保持され、規定温度が、反応容器の反応チャンバ内で、迅速に到達されることが出来るようにする。ペルチェセルの底面(基面)は、PCRサイクルの上限温度と下限温度の中間の一定温度で流れるように水が配置される熱源シンクと連携する。
使用においては、病原体などの潜在標的を含むと疑われるヒト全血は、例えば、Cy5.5、 quasar 670、 quasar 705又は、当分野で知られる任意の他の多重染料で標識された、正しいプライマ及びプローブと共に、反応容器17内に配置される。レーザは、PCRが進むと、反応容器17に照射され、増幅が成功すると、血液が存在しても観察することが出来るスペクトルを生成する。

Claims (10)

  1. サンプルが血液を含む場合に、前記サンプルとの増幅反応において直接増幅される拡散標的の多重検出のための方法であって、前記増幅反応の励起が620nmよりも大きい波長でなされ、かつ、前記励起が2mWを超えるパワーで引き起こされることを特徴とする方法。
  2. 単一の閉止チューブ形式で実行される、請求項1に記載の方法。
  3. 前記励起は5mWを超えるパワーで引き起こされる、請求項1又は2に記載の方法。
  4. 前記血液は全血である、請求項1乃至3のいずれか1項に記載の方法。
  5. 前記サンプルは、少なくとも10体積%の血液を含む、請求項1乃至4のいずれか1項に記載の方法。
  6. 前記励起は、633〜640nmの範囲で照射される、請求項1乃至5のいずれか1項に記載の方法。
  7. 前記増幅反応は、PCR、等熱増幅、又はRT−PCRを含む、請求項1又は2に記載の方法。
  8. 後続のプロセスは、検出される複数の信号から発生する複数の観察されたスペクトルを分光的に脱畳み込みすることを含む、請求項1乃至7のいずれか1項に記載の方法。
  9. 前記励起は、レーザ又は発光ダイオード(LED)によって照射される、請求項1乃至8のいずれか1項に記載の方法。
  10. 前記増幅反応を加熱及び冷却するように配置された作動面と、前記増幅反応の上限温度と下限温度との中間の一定温度に維持される基面とを有するペルチェセルを用いて、前記増幅反応を引き起こし且つ制御することを含む、請求項1乃至9のいずれか1項に記載の方法。
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