JP6873418B2 - Method for producing transgenic cells and substitute polymer of polyethyleneimine - Google Patents
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Description
本発明は、遺伝子導入された細胞の製造方法、及び遺伝子導入に好適なポリエチレンイミンの置換体ポリマーに関する。 The present invention relates to a method for producing a gene-introduced cell and a polyethyleneimine substituted polymer suitable for gene transfer.
細胞への遺伝子導入技術として、ポリエチレンイミンなどのポリマーをナノキャリアとして使用した技術が知られている。このようなナノキャリアとＤＮＡとの複合体を形成させた後に、細胞へ投与することによって、ＤＮＡ単独で細胞へ投与した場合と比較して、高い効率で遺伝子が導入され発現する。このようなナノキャリアにおいて、遺伝子の導入と発現の効率を上昇させるために、新しいナノキャリアとなる化合物が探索されてきた（特許文献１、特許文献２）。また新しいナノキャリアとなる化合物は、細胞毒性の点においても良好であることが求められている。
As a technique for introducing genes into cells, a technique using a polymer such as polyethyleneimine as a nanocarrier is known. By forming a complex of such nanocarriers and DNA and then administering it to cells, the gene is introduced and expressed with high efficiency as compared with the case where DNA alone is administered to cells. In such nanocarriers, compounds serving as new nanocarriers have been searched for in order to increase the efficiency of gene transfer and expression (
細胞の凍結保存技術として、凍結保存剤を添加した凍結保存技術が知られている（特許文献３）。 As a cell cryopreservation technique, a cryopreservation technique in which a cryopreservation agent is added is known (Patent Document 3).
したがって、本発明の目的は、遺伝子の導入と発現の効率に優れた、細胞への遺伝子導入の手段を提供することにある。 Therefore, an object of the present invention is to provide a means for introducing a gene into a cell, which is excellent in efficiency of gene transfer and expression.
本発明者は、細胞への遺伝子導入の手段について、鋭意研究を行ってきたところ、カチオン性ポリマー又はカチオン性脂質と遺伝子との複合体を形成した後に培地へ添加した状態で、細胞を凍結解凍することによって、上記目的を達成できることを見いだして、本発明に到達した。 The present inventor has conducted intensive research on means for introducing genes into cells, and found that cells were frozen and thawed in a state where they were added to a medium after forming a complex of a cationic polymer or a cationic lipid and a gene. We have arrived at the present invention by finding that the above object can be achieved by doing so.
したがって、本発明は次の（１）以下を含む。
（１）
核酸とカチオン性ポリマー又はカチオン性脂質との複合体を、培地中へ添加して、培地中で細胞と接触可能にする工程、
培地中の複合体と細胞を、凍結する工程、
凍結した細胞を、解凍する工程、
を含む、遺伝子導入された細胞を製造する方法。
（２）
核酸とカチオン性ポリマー又はカチオン性脂質との複合体が、
核酸と、カチオン性ポリマー又はカチオン性脂質とを、溶液中で混合することによって複合体を形成する工程、によって形成された複合体である、（１）に記載の方法。
（３）
核酸が、遺伝子導入される遺伝子を含む核酸である、（１）〜（２）のいずれかに記載の方法。
（４）
核酸とカチオン性ポリマー又はカチオン性脂質との複合体を、培地中へ添加して、培地中で細胞と接触可能にする工程が、
核酸とカチオン性ポリマー又はカチオン性脂質との複合体を、細胞が分散した培地中へ添加して、培地中で細胞と接触可能にする工程である、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）
カチオン性ポリマーが、
ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリオルニチン、ポリアリルアミン、及びこれらの修飾ポリマーからなる群から選択された１種以上のカチオン性ポリマーである、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）
ポリエチレンイミンが、直鎖型ポリエチレンイミンまたは分岐型ポリエチレンイミンである、（５）に記載の方法。
（７）
ポリエチレンイミンの修飾ポリマーが、アミノ基を有するポリエチレンイミンの置換体ポリマーであって、
アミノ基、及びアミノ基が置換されてなる次のＲ1基：
Ｒ1基： −ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（ＣＨ2−ＣＯＯＨ）Ｒ11
（ただし、Ｒ11基は、水素、又はＣ１〜Ｃ６のアルキル基である）
を有する、ポリエチレンイミン置換体ポリマーである、（５）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）
ポリエチレンイミンの修飾ポリマーが、アミノ基を有するポリエチレンイミンの置換体ポリマーであって、
アミノ基、アミノ基が置換されてなる次のＲ1基、及びアミノ基が置換されてなる次のＲ2基：
Ｒ1基： −ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（ＣＨ2−ＣＯＯＨ）Ｒ11
（ただし、Ｒ11基は、水素、又はＣ１〜Ｃ６のアルキル基である）
Ｒ2基： −ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（ＣＨ2−ＣＯＯＨ）Ｒ21
（ただし、Ｒ21基は、水素、又はＣ１〜Ｃ６のアルキル基であり、Ｒ11基とは異なる基である）
を有する、ポリエチレンイミン置換体ポリマーである、（５）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（９）
培地が、凍結保護剤を含む培地である、（１）〜（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）
凍結保護剤が、ＤＭＳＯ、両性電解質高分子化合物、ポリオール類、及び糖類からなる群から選択された凍結保護剤である、（９）に記載の方法。
（１１）
（１）〜（１０）のいずれかに記載の方法によって製造された遺伝子導入細胞の遺伝子を発現させて、遺伝子産物を製造する方法。
Therefore, the present invention includes the following (1) and the following.
(1)
A step of adding a complex of nucleic acid to a cationic polymer or cationic lipid into a medium to allow contact with cells in the medium.
The step of freezing the complex and cells in the medium,
The process of thawing frozen cells,
A method of producing transgenic cells, including.
(2)
Complexes of nucleic acids with cationic polymers or cationic lipids
The method according to (1), wherein the complex is formed by a step of forming a complex by mixing a nucleic acid and a cationic polymer or a cationic lipid in a solution.
(3)
The method according to any one of (1) to (2), wherein the nucleic acid is a nucleic acid containing a gene into which a gene is introduced.
(4)
The step of adding a complex of nucleic acid to a cationic polymer or cationic lipid into the medium to allow contact with the cells in the medium
Any of (1) to (3), which is a step of adding a complex of a nucleic acid and a cationic polymer or a cationic lipid into a medium in which cells are dispersed so as to be in contact with the cells in the medium. The method described.
(5)
Cationic polymer,
The method according to any one of (1) to (4), which is one or more cationic polymers selected from the group consisting of polyethyleneimine, polylysine, polyornithine, polyallylamine, and modified polymers thereof.
(6)
The method according to (5), wherein the polyethyleneimine is a linear polyethyleneimine or a branched polyethyleneimine.
(7)
The modified polymer of polyethyleneimine is a substitute polymer of polyethyleneimine having an amino group.
The amino group and the following R 1 group in which the amino group is substituted:
R 1 group: -NH-CO-CH (CH 2- COOH) R 11
(However, the R 11 group is hydrogen or an alkyl group of C1 to C6)
The method according to any one of (5) to (6), which is a polyethyleneimine-substituted polymer having the above.
(8)
The modified polymer of polyethyleneimine is a substitute polymer of polyethyleneimine having an amino group.
Amino group, the next R 1 group with the amino group substituted, and the next R 2 group with the amino group substituted:
R 1 group: -NH-CO-CH (CH 2- COOH) R 11
(However, the R 11 group is hydrogen or an alkyl group of C1 to C6)
R 2 groups: -NH-CO-CH (CH 2- COOH) R 21
(However, the R 21 group is a hydrogen or an alkyl group of C1 to C6, which is different from the R 11 group.)
The method according to any one of (5) to (6), which is a polyethyleneimine-substituted polymer having the above.
(9)
The method according to any one of (1) to (8), wherein the medium is a medium containing a cryoprotectant.
(10)
The method according to (9), wherein the cryoprotectant is a cryoprotectant selected from the group consisting of DMSO, amphoteric electrolyte polymer compounds, polyols, and saccharides.
(11)
A method for producing a gene product by expressing a gene of a transgenic cell produced by the method according to any one of (1) to (10).
さらに本発明は次の（１２）以下を含む。
（１２）
アミノ基を有するポリエチレンイミンの置換体ポリマーであって、
アミノ基、アミノ基が置換されてなる次のＲ1基、及びアミノ基が置換されてなる次のＲ2基：
Ｒ1基： −ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（ＣＨ2−ＣＯＯＨ）Ｒ11
（ただし、Ｒ11基は、水素、又はＣ１〜Ｃ６のアルキル基である）
Ｒ2基： −ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（ＣＨ2−ＣＯＯＨ）Ｒ21
（ただし、Ｒ21基は、水素、又はＣ１〜Ｃ６のアルキル基であり、Ｒ11基とは異なる基である）
を有する、ポリエチレンイミン置換体ポリマー。
（１３）
Ｒ11基が、水素、又はＣ１〜Ｃ２のアルキル基であり、Ｒ21基が、Ｃ３〜Ｃ５のアルキル基である、（１２）に記載のポリエチレンイミン置換体ポリマー。
（１４）
Ｒ11基が、水素であり、Ｒ21基が、ブチル基である、（１２）に記載のポリエチレンイミン置換体ポリマー。
（１５）
ポリエチレンイミン置換体ポリマーにおいて、
置換前のアミノ基のモル数を１００とした場合のＲ1基のモル数の比率が、５〜２５の範囲にあり、
置換前のアミノ基のモル数を１００とした場合のＲ2基のモル数の比率が、１０〜３０の範囲にある、（１２）〜（１４）のいずれかに記載のポリエチレンイミン置換体ポリマー。
（１６）
（１２）〜（１５）のいずれかに記載のポリエチレンイミン置換体ポリマーからなる、遺伝子導入剤。
（１７）
（１２）〜（１５）のいずれかに記載のポリエチレンイミン置換体ポリマーと、核酸を含む、核酸複合体組成物。
（１８）
核酸が、遺伝子導入される遺伝子を含む核酸である、（１７）に記載の核酸複合体組成物。
（１９）
（１７）〜（１８）のいずれかに記載の核酸複合体組成物によって遺伝子導入されてなる、遺伝子導入細胞。
（２０）
（１７）〜（１８）のいずれかに記載の核酸複合体組成物によって遺伝子導入された遺伝子が発現されて産生された、遺伝子産物。
Further, the present invention includes the following (12) and the following.
(12)
A substitute polymer of polyethyleneimine having an amino group.
Amino group, the next R 1 group with the amino group substituted, and the next R 2 group with the amino group substituted:
R 1 group: -NH-CO-CH (CH 2- COOH) R 11
(However, the R 11 group is hydrogen or an alkyl group of C1 to C6)
R 2 groups: -NH-CO-CH (CH 2- COOH) R 21
(However, the R 21 group is a hydrogen or an alkyl group of C1 to C6, which is different from the R 11 group.)
Polyethyleneimine substituted polymer having.
(13)
The polyethyleneimine substituted polymer according to (12), wherein the R 11 group is an alkyl group of hydrogen or C1 to C2, and the R 21 group is an alkyl group of C3 to C5.
(14)
The polyethyleneimine-substituted polymer according to (12), wherein the R 11 group is hydrogen and the R 21 group is a butyl group.
(15)
In the polyethyleneimine substituted polymer,
The ratio of the number of moles of R 1 group when the number of moles of amino groups before substitution is 100 is in the range of 5 to 25.
The ratio of the number of moles of R 2 groups in the case where the number of moles of amino groups prior to replacement and 100 is in the range of 10 to 30, (12) polyethyleneimine substituted polymer according to any one of the - (14) ..
(16)
A gene transfer agent comprising the polyethyleneimine substituted polymer according to any one of (12) to (15).
(17)
A nucleic acid complex composition comprising the polyethyleneimine-substituted polymer according to any one of (12) to (15) and a nucleic acid.
(18)
The nucleic acid complex composition according to (17), wherein the nucleic acid is a nucleic acid containing a gene into which a gene is introduced.
(19)
A transgenic cell in which a gene is introduced by the nucleic acid complex composition according to any one of (17) to (18).
(20)
A gene product produced by expressing a gene into which a gene has been introduced by the nucleic acid complex composition according to any one of (17) to (18).
本発明は、遺伝子の導入と発現の効率に優れた、細胞への遺伝子導入の手段及び遺伝子導入に好適なポリエチレンイミンの置換体ポリマーを提供する。 The present invention provides a means for introducing a gene into a cell and a substitute polymer of polyethyleneimine suitable for the transfer of a gene, which has excellent efficiency of gene transfer and expression.
具体的な実施の形態をあげて、以下に本発明を詳細に説明する。本発明は、以下にあげる具体的な実施の形態に限定されるものではない。 The present invention will be described in detail below with reference to specific embodiments. The present invention is not limited to the specific embodiments listed below.
［凍結解凍による遺伝子導入］
本発明によれば、核酸とカチオン性ポリマー又はカチオン性脂質との複合体を、培地中へ添加して、培地中で細胞と接触可能にする工程、培地中の複合体と細胞を、凍結する工程、凍結した細胞を、解凍する工程、を含む方法によって、遺伝子導入された細胞を製造することができる。この方法は、細胞へ遺伝子を導入する方法でもある。
[Gene transfer by freezing and thawing]
According to the present invention, a step of adding a complex of nucleic acid and a cationic polymer or a cationic lipid into a medium to make it contactable with cells in the medium, freezing the complex and cells in the medium. Gene-introduced cells can be produced by a method including a step, a step of thawing frozen cells. This method is also a method of introducing a gene into a cell.
従来、カチオン性ポリマー等を使用した細胞への遺伝子導入技術の改良は、核酸のキャリアとしてより特性の優れた新規なカチオン性ポリマー等の化合物を開発するというアプローチによって、行われてきた。しかし、本発明者は、カチオン性ポリマー又はカチオン性脂質を核酸のキャリアとして使用して複合体を形成させた後に、これを培地に添加して細胞を凍結することによって、従来から知られているカチオン性ポリマー又はカチオン性脂質であっても、導入と発現の効率が大幅に上昇することを見いだして、本発明に到達した。 Conventionally, improvement of gene transfer technology into cells using a cationic polymer or the like has been carried out by an approach of developing a novel compound such as a cationic polymer having more excellent properties as a carrier of nucleic acid. However, the present inventor has conventionally known by using a cationic polymer or a cationic lipid as a carrier of nucleic acid to form a complex, and then adding this to a medium to freeze the cells. We have arrived at the present invention by finding that the efficiency of introduction and expression is significantly increased even with cationic polymers or cationic lipids.
［核酸］
導入される核酸は、遺伝子導入される遺伝子を含む核酸であり、従来の遺伝子導入技術において使用されている核酸を使用することができる。好適な実施の態様において、核酸として、例えば、DNA、RNA、small interfering RNA(siRNA)、遺伝子導入される遺伝子を含むプラスミドの形態の核酸を使用することができる。
[Nucleic acid]
The nucleic acid to be introduced is a nucleic acid containing a gene to be introduced, and the nucleic acid used in the conventional gene transfer technique can be used. In a preferred embodiment, the nucleic acid can be, for example, a nucleic acid in the form of a plasmid containing, for example, DNA, RNA, small interfering RNA (siRNA), the gene to be transgenic.
［細胞］
遺伝子導入される細胞は、従来の遺伝子導入技術において使用されている細胞を、特に制限なく使用することができる。動物細胞を好適に使用できる。好適な実施の態様において、細胞として、例えば、Chinese Hamster Ovary（CHO）細胞、間葉系幹細胞、がん細胞などをあげることができる。細胞の状態は、核酸とカチオン性ポリマーとの複合体が、培地中で十分に接触可能な状態であれば、特に制限はない。例えば、ディッシュ上で培養された状態の細胞であってもよく、三次元的な組織に包埋された状態の細胞であってもよく、培地中に分散された状態の細胞であってもよい。好適な実施の態様において、培地中に細胞が分散された状態の細胞を使用することができる。
[cell]
As the gene-introduced cell, the cell used in the conventional gene transfer technique can be used without particular limitation. Animal cells can be preferably used. In a preferred embodiment, the cells include, for example, Chinese Hamster Ovary (CHO) cells, mesenchymal stem cells, cancer cells and the like. The state of the cell is not particularly limited as long as the complex of the nucleic acid and the cationic polymer can be sufficiently contacted in the medium. For example, it may be a cell cultured on a dish, a cell embedded in a three-dimensional tissue, or a cell dispersed in a medium. .. In a preferred embodiment, cells in which cells are dispersed in a medium can be used.
［培地］
培地としては、従来の遺伝子導入技術において使用されている細胞の培地を、特に制限なく使用することができる。好適な実施の態様において、培地としては、例えば、無血清ダルベッコ改良イーグル培地（DMEM培地）、ＲＰＭＩ培地、イーグル培地をあげることができる。
[Culture medium]
As the medium, the cell medium used in the conventional gene transfer technique can be used without particular limitation. In a preferred embodiment, examples of the medium include serum-free Dulbecco-improved Eagle's medium (DMEM medium), RPMI medium, and Eagle's medium.
［凍結保護剤］
本発明は、凍結の工程によって細胞へ高い効率で遺伝子導入を可能としているが、好適な実施の態様において、細胞の保護のために、培地として、凍結保護剤が添加された培地を使用することができる。このような凍結保護剤として、公知の凍結保護剤を使用することができる。凍結保護剤として、例えば、ＤＭＳＯ、両性電解質高分子化合物、ポリオール類、糖類をあげることができる。両性電解質高分子化合物としては、例えば、カルボキシル基が導入されたε−ポリ−Ｌ−リジン、ポリジメチルアミノエチルメタクリル酸・メタクリル酸共重合体、ポリスルホベタインをあげることができる。ポリオール類としては、例えば、グリセリン、エチレングリコール、ヒドロキシエチルスターチ、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロースをあげることができる。糖類としては、例えば、トレハロース、グルコース、スクロースをあげることができる。これらの凍結保護剤は、それぞれ公知の濃度となるように添加して、使用することができる。ＤＭＳＯは、培地中の最終濃度として、例えば１〜２０質量％の濃度となるように使用できる。カルボキシル基が導入されたε−ポリ−Ｌ−リジンは、培地中の最終濃度として、例えば１〜２０質量％の濃度となるように使用できる。カルボキシル基が導入されたε−ポリ−Ｌ−リジンは、特許文献３に記載の方法によって合成することができる。カルボキシル基を導入したε−ポリ−Ｌ−リジンにおいて、アミノ基に対するカルボキシル基の比率（カルボキシル基／アミノ基）が、例えば０．８〜１９の範囲、好ましくは１．５〜１５の範囲とすることができる。ポリジメチルアミノエチルメタクリル酸・メタクリル酸共重合体は、文献「Rajan R, et al., J. Biomater. Sci. Polym. Ed., 24, 1767-1780, 2013」の開示を参照して使用することができる。ポリスルホベタインは、文献「Rajan R, et al., Biomacromolecules, 17, 1882-1893, 2016」の開示を参照して使用することができる。
[Freeze protectant]
Although the present invention enables highly efficient gene transfer into cells by the step of freezing, in a preferred embodiment, a medium to which a cryoprotectant is added is used as a medium for protecting the cells. Can be done. As such a cryoprotectant, a known cryoprotectant can be used. Examples of the cryoprotectant include DMSO, amphoteric electrolyte polymer compounds, polyols, and saccharides. Examples of the amphoteric electrolyte polymer compound include ε-poly-L-lysine into which a carboxyl group has been introduced, a polydimethylaminoethyl methacrylic acid / methacrylic acid copolymer, and polysulfobetaine. Examples of the polyols include glycerin, ethylene glycol, hydroxyethyl starch, hydroxypropyl starch, and methyl cellulose. Examples of saccharides include trehalose, glucose, and sucrose. Each of these cryoprotectants can be added and used so as to have a known concentration. DMSO can be used so that the final concentration in the medium is, for example, 1 to 20% by mass. The carboxyl group-introduced ε-poly-L-lysine can be used so that the final concentration in the medium is, for example, 1 to 20% by mass. The ε-poly-L-lysine into which a carboxyl group has been introduced can be synthesized by the method described in Patent Document 3. In the carboxyl group-introduced ε-poly-L-lysine, the ratio of the carboxyl group to the amino group (carboxyl group / amino group) is, for example, in the range of 0.8 to 19, preferably in the range of 1.5 to 15. be able to. Polydimethylaminoethyl methacrylic acid / methacrylic acid copolymer is used with reference to the disclosure of the document "Rajan R, et al., J. Biomater. Sci. Polym. Ed., 24, 1767-1780, 2013". be able to. Polysulfobetaines can be used with reference to the disclosure of the literature "Rajan R, et al., Biomacromolecules, 17, 1882-1893, 2016".
［カチオン性ポリマー］
カチオン性ポリマーとしては、核酸との複合体を形成できるポリマーが使用される。カチオン性ポリマーとして、ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリオルニチン、ポリアリルアミンおよびこれらの修飾ポリマーからなる群から選択された１種以上のカチオン性ポリマーをあげることができる。従来から、遺伝子導入剤として使用されてきたカチオン性ポリマーを、本発明の凍結工程において、好適に使用することができる。
[Cationic polymer]
As the cationic polymer, a polymer capable of forming a complex with nucleic acid is used. Examples of the cationic polymer include one or more cationic polymers selected from the group consisting of polyethyleneimine, polylysine, polyornithine, polyallylamine and modified polymers thereof. Conventionally, a cationic polymer that has been used as a gene transfer agent can be suitably used in the freezing step of the present invention.
［カチオン性脂質］
カチオン性脂質としては、核酸との複合体を形成できる脂質が使用される。カチオン性脂質として、例えば、ポリフェクトアミン、1,2-dioleoyloxy-3-trimethylammonium propane chloride、 1,2-dioleyloxy-3-trimethylammonium propane chloride、 1,2-diolyloxy-3-dimethylaminonium propane、 O,O’-ditetradecanoyl-N-(α-trimethylammonioacetyl)diethanolamine chlorideをあげることができる。従来から、遺伝子導入剤として使用されてきたカチオン性脂質を、本発明の凍結工程において、好適に使用することができる。
[Cationic lipid]
As the cationic lipid, a lipid capable of forming a complex with a nucleic acid is used. As cationic lipids, for example, polyfectamine, 1,2-dioleoyloxy-3-trimethylammonium propane chloride, 1,2-dioleyloxy-3-trimethylammonium propane chloride, 1,2-diolyloxy-3-dimethylaminonium propane, O, O' -ditetradecanoyl-N- (α-trimethylammonioacetyl) diethanolamine chloride can be given. Conventionally, cationic lipids that have been used as gene transfer agents can be suitably used in the freezing step of the present invention.
［ポリエチレンイミン］
ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）としては、直鎖型ポリエチレンイミン及び分岐型ポリエチレンイミンをあげることができる。これらの構造式を、図１、図２及び後述する実施例において、例示して示す。分岐型のポリエチレンイミンは、単一の繰り返し構造を備えているものではないが、その分岐構造に由来してアミノ基を有している。アミノ基を有するポリエチレンイミンは、そのアミノ基の一部又は全部を置換することによって、修飾ポリマーとして、置換体ポリマーを製造することができる。この置換体を製造するための修飾の流れを、図１、図２に例示して示す。
[Polyethyleneimine]
Examples of polyethyleneimine (PEI) include linear polyethyleneimine and branched polyethyleneimine. These structural formulas are illustrated in FIGS. 1, 2 and Examples described later. The branched polyethyleneimine does not have a single repeating structure, but has an amino group derived from the branched structure. Polyethylenimine having an amino group can produce a substituted polymer as a modified polymer by substituting a part or all of the amino group. The flow of modification for producing this substituent is illustrated in FIGS. 1 and 2.
［アミノ基を有するポリエチレンイミンの置換体ポリマー］
好適な実施の態様において、カチオン性ポリマーとして、ポリエチレンイミンの修飾ポリマーを使用することができる。特に好適なポリエチレンイミンの修飾ポリマーとして、アミノ基を有するポリエチレンイミンにおいて、アミノ基を置換して調製した置換体ポリマーをあげることができる。
[Polymer of polyethyleneimine having an amino group]
In a preferred embodiment, a modified polymer of polyethyleneimine can be used as the cationic polymer. As a particularly suitable modified polymer of polyethyleneimine, a substituted polymer prepared by substituting an amino group in polyethyleneimine having an amino group can be mentioned.
［アミノ基及びＲ1基を有するポリエチレンイミンの置換体ポリマー］
好適な実施の態様において、アミノ基を有するポリエチレンイミンの置換体ポリマーとして、アミノ基と、アミノ基が置換されてなるＲ1基を有する、ポリエチレンイミンの置換体ポリマーをあげることができる。
Replace polymer of polyethylenimine having an amino group and R 1 group]
In a preferable embodiment, as a replacement polymer polyethyleneimine having an amino group, having an amino group, an R 1 group which amino group is substituted, it can be mentioned substituents polymer polyethyleneimine.
上記Ｒ1基は、
Ｒ1基： −ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（ＣＨ2−ＣＯＯＨ）Ｒ11
である。
The above R 1 unit
R 1 group: -NH-CO-CH (CH 2- COOH) R 11
Is.
Ｒ1基において、Ｒ11基は、水素、又はＣ１〜Ｃ６のアルキル基とすることができ、好ましくは水素、又はＣ１〜Ｃ２のアルキル基であり、特に好ましくは水素である。 In the R 1 group, the R 11 group can be hydrogen or an alkyl group of C1 to C6, preferably hydrogen, or an alkyl group of C1 to C2, and particularly preferably hydrogen.
ポリエチレンイミン置換体ポリマーにおいて、置換前のアミノ基のモル数を１００とした場合のＲ1基のモル数の比率を、例えば５〜２５の範囲、１０〜２０の範囲とすることができる。 In the polyethyleneimine substituted polymer, the ratio of the number of moles of R 1 group when the number of moles of amino groups before substitution is 100 can be, for example, in the range of 5 to 25 or in the range of 10 to 20.
［アミノ基、Ｒ1基及びＲ2基を有するポリエチレンイミンの置換体ポリマー］
好適な実施の態様において、アミノ基を有するポリエチレンイミンの置換体ポリマーとして、アミノ基と、アミノ基が置換されてなるＲ1基と、アミノ基が置換されてなるＲ2基を有する、ポリエチレンイミンの置換体ポリマーをあげることができる。
[Polyethyleneimine substituted polymer having an amino group, R 1 group and R 2 group]
In a preferable embodiment, have as a substituent polymer polyethyleneimine having an amino group, an amino group, and R 1 group in which the amino group is substituted, the R 2 groups amino groups is substituted, polyethyleneimine Substitute polymer of.
上記Ｒ1基は、
Ｒ1基： −ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（ＣＨ2−ＣＯＯＨ）Ｒ11
である。
The above R 1 unit
R 1 group: -NH-CO-CH (CH 2- COOH) R 11
Is.
Ｒ1基において、Ｒ11基は、水素、又はＣ１〜Ｃ６のアルキル基とすることができ、好ましくは水素、又はＣ１〜Ｃ２のアルキル基であり、特に好ましくは水素である。 In the R 1 group, the R 11 group can be hydrogen or an alkyl group of C1 to C6, preferably hydrogen, or an alkyl group of C1 to C2, and particularly preferably hydrogen.
上記Ｒ2基は、
Ｒ2基： −ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（ＣＨ2−ＣＯＯＨ）Ｒ21
である。
The above R 2 groups
R 2 groups: -NH-CO-CH (CH 2- COOH) R 21
Is.
Ｒ2基において、Ｒ21基は、Ｒ11基とは異なる基であり、水素、又はＣ１〜Ｃ６のアルキル基とすることができ、好ましくはＣ３〜Ｃ５のアルキル基であり、特に好ましくはブチル基である。 Of the R 2 groups, the R 21 group is a group different from the R 11 group and can be hydrogen or an alkyl group of C1 to C6, preferably an alkyl group of C3 to C5, and particularly preferably butyl. Is the basis.
ポリエチレンイミン置換体ポリマーにおいて、置換前のアミノ基のモル数を１００とした場合のＲ1基のモル数の比率を、例えば５〜２５の範囲、１０〜２０の範囲とすることができる。置換前のアミノ基のモル数を１００とした場合のＲ2基のモル数の比率を、例えば１０〜３０の範囲、１５〜２５の範囲とすることができる。 In the polyethyleneimine substituted polymer, the ratio of the number of moles of R 1 group when the number of moles of amino groups before substitution is 100 can be, for example, in the range of 5 to 25 or in the range of 10 to 20. The ratio of the number of moles of R 2 groups when the number of moles of amino groups before substitution is 100 can be, for example, in the range of 10 to 30 and in the range of 15 to 25.
［核酸とカチオン性ポリマーとの複合体］
核酸とカチオン性ポリマーとの複合体を、培地中へ添加して、培地中で細胞と接触可能にする。好適な実施の態様において、複合体は、核酸と、カチオン性ポリマーとを、溶液中で混合することによって形成することができる。本発明は、この複合体組成物にもある。
[Complex of nucleic acid and cationic polymer]
A complex of nucleic acid and cationic polymer is added into the medium to allow contact with the cells in the medium. In a preferred embodiment, the complex can be formed by mixing the nucleic acid with a cationic polymer in solution. The present invention is also in this complex composition.
［凍結］
培地中の複合体と細胞を凍結する工程は、細胞の凍結保存時における凍結の操作と同様の操作によって行うことができる。例えば、フリーザー（例えば、−８０℃）の中に置いて、凍結することができる。凍結された細胞は、適宜保存することもできるが、速やかに解凍して、次の操作に供することもできる。
[frozen]
The step of freezing the complex and the cells in the medium can be performed by the same operation as the freezing operation during the cryopreservation of the cells. For example, it can be placed in a freezer (eg, −80 ° C.) to freeze. Frozen cells can be stored as appropriate, but can also be rapidly thawed and subjected to the next operation.
［解凍］
凍結した細胞を解凍する工程は、細胞の凍結保存時における解凍の操作と同様の操作によって行うことができる。例えば、室温下あるいは３７℃で静置して解凍してもよい。適宜、湯浴等の手段を使用してもよい。
[Decompression]
The step of thawing the frozen cells can be performed by the same operation as the thawing operation at the time of cryopreserving the cells. For example, it may be thawed at room temperature or at 37 ° C. As appropriate, means such as a hot water bath may be used.
［遺伝子発現］
凍結によって遺伝子導入された細胞は、解凍されて培養可能な状態となる。培養は、それぞれの細胞に応じた条件によって行うことができ、導入された遺伝子の発現を、それぞれの遺伝子に応じた公知の手段によって確認することができる。
[Gene expression]
The cells into which the gene has been introduced by freezing are thawed and ready for culturing. The culture can be carried out under the conditions corresponding to each cell, and the expression of the introduced gene can be confirmed by a known means corresponding to each gene.
［遺伝子導入剤］
核酸と複合体を形成して遺伝子導入を行うことができる遺伝子導入剤として、本発明において、上述のカチオン性ポリマーを使用することができる。好適な実施の態様において、遺伝子導入剤として、ポリエチレンイミンの置換体ポリマーを使用することができ、好ましくはアミノ基及びＲ1基を有するポリエチレンイミンの置換体ポリマー、及びアミノ基、Ｒ1基及びＲ2基を有するポリエチレンイミンの置換体ポリマーを使用することができる。
[Gene transfer agent]
In the present invention, the above-mentioned cationic polymer can be used as a gene transfer agent capable of forming a complex with nucleic acid to carry out gene transfer. In a preferable embodiment, the transgenic agent, it is possible to use the substitution polymer polyethyleneimine, preferably a substituted polymer, and amino groups of the polyethyleneimine having an amino group and R 1 groups, R 1 group and A substitute polymer of polyethyleneimine having R 2 groups can be used.
後述する実施例で示すように、このアミノ基、Ｒ1基及びＲ2基を有するポリエチレンイミンの置換体ポリマーは、凍結工程を備えた本発明の遺伝子導入方法において好適に使用できることに加えて、凍結工程を備えない従来の手法による遺伝子導入方法においても好適に使用することができる。したがって、本発明は、アミノ基を有するポリエチレンイミンの置換体ポリマーであって、アミノ基、アミノ基が置換されてなるＲ1基、及びアミノ基が置換されてなるＲ2基を有する、ポリエチレンイミン置換体ポリマーにもある。このアミノ基、Ｒ1基及びＲ2基を有するポリエチレンイミン置換体ポリマーは、従来の遺伝子導入剤であるポリエチレンイミンと比較して、ＩＣ５０の濃度が５倍以上であるという、細胞毒性が著しく低減されたものとなっている。 As shown in Examples described later, in addition to being able to be suitably used in the gene transfer method of the present invention comprising a freezing step, the substitute polymer of polyethyleneimine having an amino group, R 1 group and R 2 group can be suitably used. It can also be suitably used in a gene transfer method by a conventional method that does not include a freezing step. Accordingly, the present invention is a substituted polymer of polyethylenimine having an amino group, an amino group, R 1 groups amino groups is substituted, and R 2 groups which amino group is substituted, polyethyleneimine It is also found in the substituent polymer. The amino group, polyethylene imine substituted polymer having R 1 group and R 2 groups, as compared with polyethyleneimine which is a conventional gene transfer agents, that the concentration of IC50 is 5 times or more, significantly reduced cytotoxicity It has been done.
以下に実施例をあげて、本発明を詳細に説明する。本発明は、以下に例示する実施例に限定されるものではない。なお、実施例中、特にことわりのない限り「％」及び「部」はそれぞれ重量％及び重量部を示す。 Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples. The present invention is not limited to the examples illustrated below. In the examples, “%” and “parts” indicate% by weight and parts by weight, respectively, unless otherwise specified.
［合成］
0.5gの分岐型ポリエチレンイミン（シグマアルドリッチ製、1級：2級：3級アミン＝１：２：１(モル比)、分子量２５ｋDa）を10mLの0.5MNaCl水溶液に溶解し、pHを塩酸で5.0に調整した。ブチル無水コハク酸（BSA、東京化成）0.266ｇを加えて100℃で2時間反応させ、次に無水コハク酸（SAナカライテスク）を0.170g加えて100℃で2時間反応させた。透析により精製を行い、凍結乾燥により回収した。TNBS法（Haneeb, A. F. Anal. Biochem. 1966, 14, 328-36による）によるアミノ基の定量から、BSAの置換率は約20±0.8モル％、SAの置換率は約15±1.2％であった。PEI-BSA(20)-SA(15)と表記。BSAによる置換を行わず、SAによる置換のみ行ったPEI-SA(15)も併せて毒性試験に供した。
[Composite]
0.5 g of branched polyethyleneimine (manufactured by Sigma-Aldrich, primary: secondary: tertiary amine = 1: 2: 1 (molar ratio), molecular weight 25 kDa) was dissolved in 10 mL of 0.5 MNaCl aqueous solution, and the pH was 5.0 with hydrochloric acid. Adjusted to. 0.266 g of butyl succinic anhydride (BSA, Tokyo Kasei) was added and reacted at 100 ° C. for 2 hours, then 0.170 g of succinic anhydride (SA nacalai Tesque) was added and reacted at 100 ° C. for 2 hours. It was purified by dialysis and recovered by freeze-drying. From the quantification of amino groups by the TNBS method (Haneeb, AF Anal. Biochem. 1966, 14, 328-36), the BSA substitution rate was about 20 ± 0.8 mol% and the SA substitution rate was about 15 ± 1.2%. It was. Notated as PEI-BSA (20) -SA (15). PEI-SA (15), which was not replaced by BSA but only replaced by SA, was also subjected to the toxicity test.
上述した、ブチル無水コハク酸と無水コハク酸でアミノ基の一定割合を修飾した分岐型ポリエチレンイミン（ＰＥＩ−ＢＳＡ−ＳＡ）の合成の流れを、図１に示す。図１において、出発材料である分岐型ＰＥＩの構造式では、アミノ基を有する繰り返し単位と、アミノ基を有さない繰り返し単位とが、それぞれ繰り返し単位数ｘとｙとで存在していることを示しているが、これは分子全体の繰り返し単位数のなかにあるアミノ基を有する繰り返し単位の数を、まとめて表現するための構造式であって、アミノ基を有する繰り返し単位と有さない繰り返し単位とが、それぞれ連続して存在していることを示すものではない。図１に例示した分岐型ＰＥＩの構造とは異なる構造の分岐型ＰＥＩを例示して、出発材料として使用してＰＥＩ−ＢＳＡ−ＳＡを合成する流れを、図２に示す。図２においても例示した繰り返し単位の構造式は、繰り返し単位の構造の多様性を説明するための例示であって、この構造式と完全同一の繰り返し単位によって分子全体が構成されていることを示すものではない。 The flow of synthesis of branched polyethyleneimine (PEI-BSA-SA) in which a certain ratio of amino groups is modified with butyl succinic anhydride and succinic anhydride as described above is shown in FIG. In FIG. 1, in the structural formula of the branched PEI as a starting material, it is found that a repeating unit having an amino group and a repeating unit having no amino group exist with the number of repeating units x and y, respectively. As shown, this is a structural formula for collectively expressing the number of repeating units having an amino group in the number of repeating units of the entire molecule, and is a structural formula for collectively expressing the number of repeating units having an amino group and repeating units having no amino group. It does not indicate that the units exist consecutively. FIG. 2 shows a flow of synthesizing PEI-BSA-SA by exemplifying a branched PEI having a structure different from that of the branched PEI illustrated in FIG. 1 and using it as a starting material. The structural formula of the repeating unit illustrated in FIG. 2 is an example for explaining the structural diversity of the repeating unit, and shows that the entire molecule is composed of the repeating unit that is exactly the same as this structural formula. It's not a thing.
合成したＰＥＩ−ＢＳＡ−ＳＡの特定を１Ｈ−ＮＭＲ測定によって行った。１Ｈ−ＮＭＲ測定によるグラフを図３Ａに示す。図３Ｂに図３Ａの１Ｈ−ＮＭＲ測定のピーク番号に対応する構造式中の位置を示す。 The synthesized PEI-BSA-SA was identified by 1H-NMR measurement. The graph by 1H-NMR measurement is shown in FIG. 3A. FIG. 3B shows the position in the structural formula corresponding to the peak number of the 1H-NMR measurement of FIG. 3A.
［毒性試験］
毒性試験では、HEK293細胞を使用した。96wellプレートに各ウェルあたり1000個の細胞を播種し、72時間後、所定濃度のPEI化合物を添加し、さらに24時間後、細胞の生存率をMTT法で定量化し、化合物無添加系に対する生存率の比を計算した。その割合が50％を切るのに必要な濃度をIC50で表し、毒性の指標とした。市販の分岐型PEIのIC50 ha40μg/mL、PEI-SA(15)のIC50は175μg/ML、PEI-BSA(20)-SA(15)のIC50は220μg/mLという結果であり、PEI-BSA(20)-SA(15)が最も低い毒性を示した。これは、アミノ基がより多くカルボキシル基に変換されていることが原因であると考えられる。この結果のグラフを、図４に示す。図４のグラフのなかで、下向きの矢印は、それぞれのカーブのなかでＩＣ５０にあたる値が、横軸でどの値に相当するかを示した矢印である。
[Toxicity test]
HEK293 cells were used in the toxicity test. 1000 cells were seeded for each well on a 96-well plate, 72 hours later, a predetermined concentration of PEI compound was added, and 24 hours later, the cell viability was quantified by the MTT method, and the viability for the compound-free system The ratio of was calculated. The concentration required for the ratio to drop below 50% was expressed in IC50 and used as an index of toxicity. Commercially available branched PEI IC50 ha 40 μg / mL, PEI-SA (15) IC50 175 μg / ML, PEI-BSA (20) -SA (15) IC50 220 μg / mL, PEI-BSA ( 20)-SA (15) showed the lowest toxicity. It is considered that this is because more amino groups are converted to carboxyl groups. A graph of this result is shown in FIG. In the graph of FIG. 4, the downward arrow is an arrow indicating which value corresponds to the IC50 in each curve on the horizontal axis.
［プラスミドの抽出］
プラスミドは、大腸菌(DH5α)を用い、pAcGFP-N2(Clontech, USA)とpGL4.51[luc2/CMV/Neo] (Promega, USA)を増幅させ、Genopure plasmid kit（ロシュ）を用いて純化し、使用した。pAcGFP-N2はGreen Fluorescent Protein (GFP)をエンコードしており、大腸菌中での増幅にカナマイシン抵抗性遺伝子を使用した。pGL4.51[luc2/CMV/Neo]ベクターは、luc2リポーター遺伝子を有しており、大腸菌中での増幅にアンピシリン抵抗性遺伝子を使用した。大腸菌(DH5α)によるプラスミドの増幅と形質転換の手順を図５に示す。
[Extraction of plasmid]
The plasmid was amplified using Escherichia coli (DH5α), pAcGFP-N2 (Clontech, USA) and pGL4.51 [luc2 / CMV / Neo] (Promega, USA), purified using the Genopure plasmid kit (Roche), and purified. used. pAcGFP-N2 encodes Green Fluorescent Protein (GFP) and used the kanamycin resistance gene for amplification in E. coli. The pGL4.51 [luc2 / CMV / Neo] vector has the luc2 reporter gene, and the ampicillin resistance gene was used for amplification in E. coli. The procedure for plasmid amplification and transformation with Escherichia coli (DH5α) is shown in FIG.
［HEK293細胞への遺伝子導入］
遺伝子導入のために、市販のJETPEI（PolyPlus Transfection）、市販のリポフェクタミン3000（Thermo Scientific）、市販の分岐型PEI（シグマアルドリッチ社製、製品名Branched polyethyleneimine、平均分子量25000）、および上記合成したPEI-BSA(20)-SA(15)を用いた。JETPEIは、直鎖型ＰＥＩを用いた導入キットである。リポフェクタミン３０００は、リポフェクトアミンを用いた導入キットである。直鎖型ＰＥＩの構造を以下に示す。リポフェクトアミンの構造を図６に示す。
For gene transfer, commercially available JETPEI (PolyPlus Transfection), commercially available lipofectamine 3000 (Thermo Scientific), commercially available branched PEI (manufactured by Sigma-Aldrich, product name Branched polyethylenee, average molecular weight 25000), and the above-mentioned synthesized PEI- BSA (20) -SA (15) was used. JETPEI is an introduction kit using a linear PEI. Lipofectamine 3000 is an introduction kit using lipofectamine. The structure of the linear PEI is shown below. The structure of lipofectamine is shown in FIG.
JETPEIは、所定のプロトコルにしたがって、生理食塩水５０μＬ中にJETPEI試薬２μL及びプラスミド１μｇを含むように添加して混合し、複合体溶液として調製して、後述のように細胞に投与した。
リポフェクタミンは、所定のプロトコルにしたがって、Opti-MEMバッファー１２５μＬ中にリポフェクタミン溶液７．５μL及びプラスミド１μｇを含むように添加して混合し、複合体溶液として調製して、後述のように細胞に投与した。
市販の分岐型PEIは、リン酸緩衝液（pH7.4）５０μＬ中に、プラスミド1μgに対してポリマー2、5、7、10μg（ポリマー:DNA=2:1、5:1，7:1、10:1）となるように添加して混合し、複合体溶液として調製して、後述のように細胞に投与した。
上記合成したPEI-BSA(20)-SA(15)は、リン酸緩衝液（pH7.4）５０μＬ中に、プラスミド1μgに対してポリマー2、5、7、10μg（ポリマー:DNA=2:1、5:1，7:1、10:1）となるように添加して混合し、複合体溶液として調製して、後述のように細胞に投与した。
上記の直鎖型ＰＥＩ、リポフェクタミン、分岐型ＰＥＩ又はPEI-BSA(20)-SA(15)と、プラスミドとの複合体の溶液を細胞へ投与するにあたっては、後述する通り、凍結濃縮法による実験（凍結濃縮実験系）と、凍結濃縮を利用しない実験（非凍結濃縮実験系）とを行った。
JETPEI was added and mixed so as to contain 2 μL of JETPEI reagent and 1 μg of plasmid in 50 μL of physiological saline according to a predetermined protocol, prepared as a complex solution, and administered to cells as described below.
Lipofectamine was added and mixed in 125 μL of Opti-MEM buffer so as to contain 7.5 μL of lipofectamine solution and 1 μg of plasmid according to a predetermined protocol, prepared as a complex solution, and administered to cells as described below. ..
Commercially available branched PEI is available in 50 μL of phosphate buffer (pH 7.4) in 2, 5, 7, 10 μg of polymer per 1 μg of plasmid (polymer: DNA = 2: 1, 5: 1, 7: 1, It was added and mixed so as to be 10: 1), prepared as a complex solution, and administered to cells as described later.
The synthesized PEI-BSA (20) -SA (15) was prepared in 50 μL of phosphate buffer (pH 7.4) in a mixture of 1 μg of plasmid and 2, 5, 7, 10 μg of polymer (polymer: DNA = 2: 1). , 5: 1, 7: 1, 10: 1), mixed, prepared as a complex solution, and administered to cells as described below.
In administering the above-mentioned linear PEI, lipofectamine, branched PEI or PEI-BSA (20) -SA (15) and plasmid complex solution to cells, an experiment by freeze-concentration method will be used as described later. (Freeze-concentration experimental system) and experiments without using freeze-concentration (non-freeze-concentration experimental system) were conducted.
［非凍結濃縮系］
上記作成した複合体の細胞への投与にあたって、凍結濃縮を利用しない実験（本発明の比較例）を以下のように行った。
106個の細胞を3.5cmディッシュに播種し、１ｍL の培養液（無血清ダルベッコ改良イーグル培地（DMEM））中で10時間培養後、それぞれの複合体試薬溶液（いずれの複合体溶液も50μL、ただしリポフェクタミンによる複合体溶液は125μL）を添加後、10時間37℃、インキュベータ中で培養して、後述のように、共焦点レーザー顕微鏡でGFPの発現の観察(pAcGFP-N2の場合)、ルミノメータ（Lumat3、ベルトールド）でルシフェラーゼ活性の測定（pGL4.51の場合）を行い、遺伝子導入を確認した。
[Non-freeze concentration system]
An experiment (comparative example of the present invention) that did not utilize freeze-concentration was carried out as follows for administration of the above-prepared complex to cells.
10 6 cells were seeded in a 3.5 cm dish, cultured in 1 mL of culture medium (serum-free Dalveco improved Eagle's medium (DMEM)) for 10 hours, and then each complex reagent solution (50 μL of each complex solution). However, after adding Lipofectamine complex solution (125 μL), incubate in an incubator for 10 hours at 37 ° C, observe the expression of GFP with a confocal laser scanning microscope (in the case of pAcGFP-N2), and luminometer (in the case of pAcGFP-N2). Luciferase activity (in the case of pGL4.51) was measured with Lumat3, Berthold), and gene transfer was confirmed.
ルシフェラーゼ活性の測定は、ルシフェラーゼアッセイキット（Promega）を使用してその使用法に則り行った。培養後の細胞を１ｍL のPBSで3回洗浄し、キット付属の細胞溶解液（2mMジチオスレイトール、２ｍM 1,2-diaminocycloheaxane-N,N,N',N'-teraacetic acid、10%グリセリン1% Triton X-100の25mMトリスリン酸バッファーpH7.8溶液）500μLで細胞を溶解させ、全量をマイクロチューブに回収した。その後、13200rpmで遠心分離し、上清を回収した。キット付属のルシフェラーゼアッセイ試薬（ルシフェリンPBS溶液）をあらかじめ100μL添加したチューブに上記細胞溶解液上清を20μL添加し、ルミノメータにて2秒間の発光を測定し、RLU（相対発光量）を算出し、比較した。
Measurements of luciferase activity were performed using the luciferase assay kit (Promega) according to its usage. The cultured cells were washed 3 times with 1 mL of PBS, and the cell lysate (2 mM dithiothratel, 2
［凍結濃縮系］
上記調製した複合体の細胞への投与にあたって、凍結濃縮法による実験（本発明の実施例）を以下のように行った。
クライオバイアル中に106個の細胞を懸濁した１ｍL の無血清DMEM培地（10％DMSOおよび複合体試薬溶液（50μL（リポフェクタミンのみ125μL））含有）を添加し、-80℃のフリーザー中で一晩凍結した。37℃の湯浴中で解凍した後、１ｍL のPBSで3回遠心洗浄した後、3.5cmディッシュに細胞を全量播種し、１ｍL の無血清DMEM中を添加して37℃のインキュベータで10時間培養後、共焦点レーザー顕微鏡観察およびルシフェラーゼ活性の測定を行った。この凍結濃縮実験系の手順を図７に示す。
[Freeze concentration system]
Upon administration of the above-prepared complex to cells, an experiment by the freeze-concentration method (Example of the present invention) was carried out as follows.
Add 1 mL of serum-free DMEM medium (10% DMSO and complex reagent solution (50 μL (Lipofectamine only 125 μL))) in which 10 6 cells are suspended in a cryovial, and in a freezer at -80 ° C. Frozen in the evening. After thawing in a hot water bath at 37 ° C, centrifuging with 1 mL PBS three times, seeding all the cells in a 3.5 cm dish, adding in 1 mL of serum-free DMEM, and culturing in an incubator at 37 ° C for 10 hours. After that, confocal laser scanning microscopy and measurement of luciferase activity were performed. The procedure of this freeze-concentration experimental system is shown in FIG.
［GFP発現］
市販品のJETPEIでは、非凍結濃縮実験系では、GFPの発現による緑の蛍光がほとんど見られなかったが、凍結濃縮実験系では、GFPの発現による緑の蛍光が明瞭に確認された。市販の分岐型PEIでは凍結のあるなしにかかわらず、蛍光はほとんど観察されなかった。リポフェクタミン3000の場合も、凍結しない場合は蛍光が観察されなかったのに対し、凍結により蛍光が確認された。PEI-BSA(20)-SA(15)に関しては、いずれのポリマー：DNAの割合においても凍結後に蛍光が観察された。5:1の場合は、若干凍結無しの系でも蛍光が確認できた。
[GFP expression]
In the commercially available JET PEI, green fluorescence due to GFP expression was hardly observed in the non-freeze concentration experimental system, but green fluorescence due to GFP expression was clearly confirmed in the freeze concentration experimental system. Fluorescence was rarely observed with commercially available branched PEIs, with or without freezing. In the case of Lipofectamine 3000 as well, fluorescence was not observed when it was not frozen, whereas fluorescence was confirmed by freezing. For PEI-BSA (20) -SA (15), fluorescence was observed after freezing in all polymer: DNA ratios. In the case of 5: 1, fluorescence could be confirmed even in a system without freezing.
図８〜図１０に、市販のリポフェクタミン、分岐型ＰＥＩ、直鎖型ＰＥＩのGFP発現の様子を示す。図８〜図１０において、上段の図は、非凍結濃縮系によって得られた細胞の顕微鏡写真である。上段の左図は細胞の顕微鏡写真、上段の中央図はＧＦＰ発現を観察する蛍光顕微鏡写真、上段の右図は両視野を重ねた写真である。図８〜図１０のいずれの図においても、下段の図は、凍結濃縮系によって得られた細胞の顕微鏡写真である。下段の左図は細胞の顕微鏡写真、下段の中央図はＧＦＰ発現を観察する蛍光顕微鏡写真、下段の右図は両視野を重ねた写真である。 8 to 10 show the state of GFP expression of commercially available lipofectamine, branched PEI, and linear PEI. In FIGS. 8 to 10, the upper figure is a photomicrograph of cells obtained by a non-freeze concentration system. The upper left figure is a micrograph of cells, the upper center view is a fluorescence micrograph for observing GFP expression, and the upper right figure is a photograph in which both fields of view are overlapped. In any of the figures of FIGS. 8 to 10, the lower figure is a photomicrograph of the cells obtained by the freeze-concentration system. The lower left figure is a micrograph of cells, the lower center view is a fluorescence micrograph for observing GFP expression, and the lower right figure is a photograph in which both fields of view are overlapped.
図８は、市販の直鎖型ＰＥＩ（ＪＥＴ ＰＥＩ）による複合体を添加した場合の培養１０時間後のＧＦＰ発現の様子を示す顕微鏡写真である。
FIG. 8 is a micrograph showing the state of
図９は、市販の分岐型ＰＥＩによる複合体（PEI:DNA 5:1(w/w)）を添加した場合のＧＦＰ発現の様子を示す顕微鏡写真である。 FIG. 9 is a micrograph showing the state of GFP expression when a commercially available branched PEI complex (PEI: DNA 5: 1 (w / w)) is added.
図１０は、市販のリポフェクタミン（リポソーム系導入試薬）による複合体を添加した場合のＧＦＰ発現の様子を示す顕微鏡写真である。 FIG. 10 is a micrograph showing the state of GFP expression when a complex with a commercially available lipofectamine (liposome-based introduction reagent) is added.
図１１は、PEI-BSA-SAによる複合体（PEI-BSA(20)-SA(15)-DNA (AcGFP)複合体）を添加した場合の１０時間培養後の細胞のＧＦＰ発現の様子を示す蛍光顕微鏡写真である。 FIG. 11 shows the state of GFP expression in cells after 10-hour culture when a PEI-BSA-SA complex (PEI-BSA (20) -SA (15) -DNA (AcGFP) complex) was added. It is a fluorescence micrograph.
［ルシフェラーゼアッセイ］
GFP発現の結果から、凍結濃縮が遺伝子導入の効果を向上させていることがわかった。これを定量化をするため、さらにルシフェラーゼアッセイを上述の通りに行った。
[Luciferase assay]
From the results of GFP expression, it was found that freeze concentration improved the effect of gene transfer. To quantify this, a luciferase assay was further performed as described above.
非凍結濃縮系の場合のルシフェラーゼ活性は、市販のリポフェクタミン、JETPEI、分岐型PEIにおいて、それぞれ150000、420000、160000（relative light unit (RLU)）であるのに対し、凍結濃縮系ではそれぞれ、310000、800000、470000（RLU）に向上した。 The luciferase activity in the non-freeze-concentrated system was 150,000, 420,000, and 160000 (relative light unit (RLU)) in the commercially available lipofectamine, JETPEI, and branched PEI, respectively, whereas in the freeze-concentrated system, they were 310,000, respectively. Improved to 800000 and 470000 (RLU).
一方、PEI-BSA(20)-SA(15)に関しては、ポリマー：DNAが2:1、5:1、7:1、10:1において、非凍結濃縮系はそれぞれ280000、420000、120000、200000（RLU）であったのに対し、凍結濃縮系ではそれぞれ、3100000、3200000、1450000、2100000（RLU）と市販のリポフェクタミン、JETPEI、分岐型PEIに比べて4倍から20倍以上の活性を示すことが確認できた。 On the other hand, regarding PEI-BSA (20) -SA (15), the polymer: DNA is 2: 1, 5: 1, 7: 1, 10: 1, and the non-freeze-concentrated system is 280,000, 420,000, 120,000, 200,000, respectively. In contrast to (RLU), the cryoconcentrated system showed 3100000, 3200000, 1450000, and 2100000 (RLU), which are 4 to 20 times more active than commercially available lipofectamine, JETPEI, and branched PEI, respectively. Was confirmed.
図１２に、市販のリポフェクタミン、JETPEI、分岐型PEIを用いた場合のルシフェラーゼ活性を、非凍結濃縮系と凍結濃縮系とで対比するグラフを示す。 FIG. 12 shows a graph comparing the luciferase activity when commercially available lipofectamine, JETPEI, and branched PEI are used between the non-freeze-concentrated system and the freeze-concentrated system.
図１３に、PEI-BSA(20)-SA(15)を用いた場合のルシフェラーゼ活性を、PEI-BSA(20)-SA(15)：DNAのそれぞれの比率ごとに、非凍結濃縮系と凍結濃縮系とで対比するグラフを示す。 In FIG. 13, the luciferase activity when PEI-BSA (20) -SA (15) was used was shown in the non-freeze enrichment system and frozen for each ratio of PEI-BSA (20) -SA (15): DNA. The graph which compares with the enrichment system is shown.
［凍結濃縮系におけるエンドソームからのプラスミドＤＮＡのリリース］
PEI-BSA(20)-SA(15)を用いた複合体による凍結濃縮系において、複合体のプラスミドＤＮＡが細胞に導入発現される機構を確認するために、次の実験を行った。細胞の核をヘキスト３３３４２（Hoechst 33342）で染色し、エンドソームをリソトラッカーグリーン（lysotracker green）でラベルし、プラスミドＤＮＡをレッドシアニン３’（Red cyanine 3’）でラベルした、蛍光顕微鏡写真を図１４に示す。図１４の矢印で示す箇所において、赤色染色されたプラスミドＤＮＡが、緑色染色されたエンドソームの外に移行して、青色染色された細胞核の近傍に存在している。このように複合体による凍結濃縮系によって、プラスミドＤＮＡは細胞内に取り込まれた後に、エンドソームから放出されて、核へ移行するという機構が存在することが確認された。
[Release of plasmid DNA from endosomes in a cryoconcentration system]
The following experiment was conducted to confirm the mechanism by which the plasmid DNA of the complex was introduced and expressed in cells in a freeze-concentration system using a complex using PEI-BSA (20) -SA (15). Fluorescence micrographs of cell nuclei stained with Hoechst 33342, endosomes labeled with lysotracker green, and plasmid DNA labeled with Red cyanine 3'(FIG. 14). Shown in. At the point indicated by the arrow in FIG. 14, the red-stained plasmid DNA has migrated to the outside of the green-stained endosome and is present in the vicinity of the blue-stained cell nucleus. Thus, it was confirmed that there is a mechanism in which plasmid DNA is taken up into cells, released from endosomes, and translocated to the nucleus by the freeze-concentration system using the complex.
［凍結濃縮系におけるプラスミドＤＮＡの細胞への吸着］
凍結濃縮系において、複合体のプラスミドＤＮＡが細胞に導入発現される機構を確認するために、次の実験を行った。複合体は、直鎖型ＰＥＩ(JET PEI)と、レッドシアニン３’（Red cyanine 3’）でラベルしたプラスミドＤＮＡ（pAcGFPプラスミド）との複合体を使用した。凍結濃縮系において、複合体が導入された細胞の顕微鏡写真を図１５に示す。図１５の上段は非凍結濃縮系であり、図１５の下段は凍結濃縮系である。図１５の左図は細胞の顕微鏡写真、図１５の中央の図は蛍光顕微鏡写真、図１５の右図はこれらを同視野で重ねた写真である。非凍結濃縮系と比較して、凍結濃縮系においては、レッドシアニン３’でラベルされたプラスミドＤＮＡは、著しく細胞へ集中していた。
[Adsorption of plasmid DNA to cells in a freeze-concentration system]
The following experiments were performed to confirm the mechanism by which the plasmid DNA of the complex was introduced and expressed in cells in a freeze-concentration system. As the complex, a complex of linear PEI (JET PEI) and plasmid DNA labeled with Red cyanine 3'(pAcGFP plasmid) was used. A photomicrograph of cells into which the complex has been introduced in a freeze-concentration system is shown in FIG. The upper part of FIG. 15 is a non-freeze concentration system, and the lower part of FIG. 15 is a freeze concentration system. The left figure of FIG. 15 is a micrograph of cells, the center figure of FIG. 15 is a fluorescence micrograph, and the right figure of FIG. In the cryoconcentrated system, the plasmid DNA labeled with red cyanine 3'was significantly concentrated in the cells as compared to the non-freeze concentrated system.
本発明は細胞への遺伝子導入技術を提供する。本発明は産業上有用な発明である。 The present invention provides a technique for introducing a gene into a cell. The present invention is an industrially useful invention.
Claims (15)
培地中の複合体と細胞を、凍結する工程、
凍結した細胞を、解凍する工程、
を含む、遺伝子導入された細胞を製造する方法であって、
カチオン性ポリマーが、
アミノ基を有するポリエチレンイミンの置換体ポリマーであって、
アミノ基、アミノ基が置換されてなる次のＲ １ 基、及びアミノ基が置換されてなる次のＲ ２ 基：
Ｒ １ 基： −ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（ＣＨ ２ −ＣＯＯＨ）Ｒ １１
（ただし、Ｒ １１ 基は、水素、又はＣ１〜Ｃ６のアルキル基である）
Ｒ ２ 基： −ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（ＣＨ ２ −ＣＯＯＨ）Ｒ ２１
（ただし、Ｒ ２１ 基は、水素、又はＣ１〜Ｃ６のアルキル基であり、Ｒ １１ 基とは異なる基である）
を有する、ポリエチレンイミン置換体ポリマーである、方法。 A complex of a nucleic acid and a cationic polymer, was added to the medium, the process that allows contact with the cells in a medium,
The step of freezing the complex and cells in the medium,
The process of thawing frozen cells,
A method of producing transgenic cells, including
Cationic polymer,
A substitute polymer of polyethyleneimine having an amino group.
Amino group, the next R 1 group with the amino group substituted, and the next R 2 group with the amino group substituted:
R 1 group: -NH-CO-CH (CH 2- COOH) R 11
(Wherein, R 11 group is hydrogen or an alkyl group C1 -C6)
R 2 groups: -NH-CO-CH (CH 2- COOH) R 21
(However, R 21 groups are hydrogen, or an alkyl group of C1 -C6, a different group and R 11 group)
The method, which is a polyethyleneimine substituted polymer having .
核酸と、カチオン性ポリマーとを、溶液中で混合することによって複合体を形成する行程、によって形成された複合体である、請求項１に記載の方法。 Complex between a nucleic acid and a cationic polymer,
A nucleic acid, a cationic polymer, a complex formed by a process, for forming a complex by mixing in a solution, method of claim 1.
核酸とカチオン性ポリマーとの複合体を、細胞が分散した培地中へ添加して、培地中で細胞と接触可能にする工程である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。 A complex of a nucleic acid and a cationic polymer, was added to the medium, the process that allows contact with the cells in culture medium,
A complex of a nucleic acid and a cationic polymer, cells were added into the culture medium obtained by dispersing a process that allows contact with the cells in a medium, The method according to any one of claims 1 to 3.
ＤＭＳＯ、両性電解質高分子化合物、ポリオール類、及び糖類からなる群から選択された凍結保護剤である、請求項６に記載の方法。 Freeze protectant,
The method of claim 6 , wherein the cryoprotectant is selected from the group consisting of DMSO, amphoteric electrolyte polymer compounds, polyols, and saccharides.
アミノ基、アミノ基が置換されてなる次のＲ１基、及びアミノ基が置換されてなる次のＲ２基：
Ｒ１基： −ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（ＣＨ２−ＣＯＯＨ）Ｒ１１
（ただし、Ｒ１１基は、水素、又はＣ１〜Ｃ６のアルキル基である）
Ｒ２基： −ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（ＣＨ２−ＣＯＯＨ）Ｒ２１
（ただし、Ｒ２１基は、水素、又はＣ１〜Ｃ６のアルキル基であり、Ｒ１１基とは異なる基である）
を有する、ポリエチレンイミン置換体ポリマー。 A substitute polymer of polyethyleneimine having an amino group.
Amino group, the next R 1 group with the amino group substituted, and the next R 2 group with the amino group substituted:
R 1 group: -NH-CO-CH (CH 2- COOH) R 11
(Wherein, R 11 group is hydrogen or an alkyl group C1 -C6)
R 2 groups: -NH-CO-CH (CH 2- COOH) R 21
(However, R 21 groups are hydrogen, or an alkyl group of C1 -C6, a different group and R 11 group)
Polyethyleneimine substituted polymer having.
置換前のアミノ基のモル数を１００とした場合のＲ１基のモル数の比率が、５〜２５の範囲にあり、
置換前のアミノ基のモル数を１００とした場合のＲ２基のモル数の比率が、１０〜３０の範囲にある、請求項９〜１１のいずれかに記載のポリエチレンイミン置換体ポリマー。 In the polyethyleneimine substituted polymer,
The ratio of the number of moles of the R 1 group in the case where the number of moles of amino groups prior to replacement and 100 is in the range of 5 to 25,
The ratio of the number of moles of R 2 groups in the case where the number of moles of amino groups prior to replacement and 100 is in the range of 10 to 30, polyethyleneimine substituted polymer according to any of claims 9-11.
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