JP5630979B2 - Animal stem cell cryopreservation solution - Google Patents
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Description
本発明は、再生医療用ヒト幹細胞の凍結解凍障害を軽減可能な凍害防御剤に関する。 The present invention relates to a frost damage protective agent capable of reducing freezing and thawing damage of human stem cells for regenerative medicine.
近年の再生医療の飛躍的研究の発展に伴い、ヒト由来幹細胞の医療応用が盛んとなってきている。ヒト体性幹細胞にはおもに骨髄などから採取される間葉系幹細胞や脂肪から採取される脂肪由来幹細胞がある。これらの幹細胞は骨や軟骨、脂肪に分化する能力を有しており、それぞれ骨再生や軟骨再生、脂肪再生に利用されている。また、これらの幹細胞は採取したのち大量に増やすことが可能であるため、余剰の細胞を凍結保存しておき複数回にわたって移植することや、別の患者に移植することが想定される。通常凍結保存は細胞に致命的ダメージを与えるため、凍害防御剤を添加する。その際、5〜20%のジメチルスルホキシド、グリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコールなどの凍害防御剤を含む培養液などの生理的溶液に細胞を懸濁しクライオチューブに詰めて冷却し、最終的に−80℃もしくは−196℃の極低温で凍結保存するのが一般的である(特許文献1,2)。そのなかで最も効果が高く、よく用いられているのがジメチルスルホキシドである(非特許文献1)。しかしジメチルスルホキシドが特に高い濃度では生理学的に有毒であり、凍結保存された細胞を注入された患者に高血圧、悪心、嘔吐を引き起こすことも知られている。ジメチルスルホキシドの毒性により解凍した細胞の培養時もしくは生体に注入した後の生存率や機能が低下する問題もある。
また、グリセリンなどの多価アルコール類は効果が低いため、細胞を懸濁してしばらく室温もしくは冷蔵で放置してから凍結する必要や、プログラムフリーザーなどによる厳密な温度管理が必要とされる(非特許文献2)。また、凍結保護効果が低く、解凍後の機能が低下するなどの問題があり、ジメチルスルホキシドと併用するなどの工夫が必要である。
このように培養細胞の凍結保存には基本的にジメチルスルホキシドが不可欠となっているのが現状であるが、先述した毒性に加え、ジメチルスルホキシドはHL−60細胞などの分化を誘導することやES細胞の分化に影響を及ぼすことが報告されており、ヒト幹細胞のように未分化維持が必要な細胞保存には適さないことが考えられる(非特許文献3,4)。
In addition, since polyhydric alcohols such as glycerin are less effective, it is necessary to freeze cells after suspending the cells for a while at room temperature or refrigeration, and to strictly control the temperature with a program freezer (non-patented) Reference 2). In addition, there is a problem that the cryoprotective effect is low and the function after thawing is lowered, and it is necessary to devise such as combined use with dimethyl sulfoxide.
As described above, dimethyl sulfoxide is basically indispensable for cryopreservation of cultured cells, but in addition to the toxicity described above, dimethyl sulfoxide induces differentiation of HL-60 cells and ES. It has been reported that it affects cell differentiation, and it is considered that it is not suitable for cell preservation that needs to maintain undifferentiation like human stem cells (Non-patent Documents 3 and 4).
現状の凍結保存法では、凍結解凍後の幹細胞の増殖率や分化能を完全な形で保存することは困難であり、毒性の低いジメチルスルホキシドに代わる新たな凍結保存物質が待ち望まれている。
そこで本発明は、ジメチルスルホキシドに代わる、低毒性で分化に影響を及ぼさない幹細胞の保護効果に優れた凍結保存液を提供することを目的とする。In the present cryopreservation method, it is difficult to preserve the proliferation rate and differentiation ability of stem cells after freeze-thawing in a complete form, and a new cryopreservation substance to replace dimethyl sulfoxide with low toxicity is awaited.
Accordingly, an object of the present invention is to provide a cryopreservation solution that is excellent in the protective effect of stem cells, which has low toxicity and does not affect differentiation, instead of dimethyl sulfoxide.
本発明の凍結保存液は、カルボキシル基を導入したε−ポリ−L−リジンを実質上3−30%含み、その他組成は生理食塩水や培養液成分などの生理的溶液である。その生理的溶液にポリエチレングリコール、フィコール、デキストラン、ヒドロキシエチルスターチ、ポリビニルアルコール、ポリビニールビロリドン、パーコール、アルブミンなどの高分子化合物を添加することも可能である。また、エチレングリコールやグリセリン、プロピレングリコールなどの多価アルコールを1−20%添加することも有効である。 The cryopreservation solution of the present invention contains substantially 3-30% of ε-poly-L-lysine into which a carboxyl group has been introduced, and the other composition is a physiological solution such as physiological saline or a culture solution component. It is also possible to add high molecular compounds such as polyethylene glycol, ficoll, dextran, hydroxyethyl starch, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, percoll, and albumin to the physiological solution. It is also effective to add 1-20% of a polyhydric alcohol such as ethylene glycol, glycerin or propylene glycol.
再生医療に応用可能なヒト幹細胞を該保存液に浸漬して−80℃または液体窒素中もしくは液体窒素蒸気中で凍結保存することで毒性の高いジメチルスルホキシドを使用せずに生存率、分化能を維持したまま保存することが可能である。既存の凍害防御剤であるジメチルスルホキシドを使用しないため、凍結する細胞に対する毒性が低く抑えられ、機能を維持したまま長期間凍結保存することが可能である。また、ウシ胎児血清、アルブミンなどのタンパク質成分を使用しないため感染症などの心配がなく、生物製剤によるロット間格差も影響しない。
カルボキシル基を導入したε−ポリ−L−リジンは、そのアミノ基により細胞膜親和性を持ち、細胞の保護効果があると考えられるが、一方でカルボキシル基のマイナス電荷が細胞膜との親和性を低減させている。すなわち、細胞膜に対して非常に弱い相互作用を示すことが考えられ、この作用が毒性を与えずに細胞膜保護による凍害防御効果を示すと考えられる。また、本発明の凍結保存剤はジメチルスルホキシドに比べて毒性が低いため解凍後の洗浄が不要で、そのまま培地に添加することですぐに培養を行うことができる。
冷却工程においては、急激に冷却した場合には、細胞内と細胞外の水分の氷結に差が生じ、細胞の微細構造を破壊してしまうため、1分間に0.5℃から10℃の比率で冷却を行うことが好ましい。最も好ましいのは1分間に0.5℃から2℃の冷却速度である。また、保存工程は、−80℃以下で可能となるが、より安定な保存の面から液体窒素中または液体窒素蒸気層中で保存することが好ましい。本発明の作用の詳細は明らかではないが、ヒト間葉系幹細胞およびヒト脂肪由来幹細胞はマウスやラットの幹細胞や一般のヒト培養用細胞と比較して、凍結時の障害が大きいことが考えられ、通常よりも高い濃度の両性高分子凍害防御剤を使用することで、もしくは既存の多価アルコールなどの凍害防御剤と併用することにより、凍結障害が低く押さえられ再培養時の生存率が著しく向上するに至ったものと推測される。本発明によって、ヒト間葉系幹細胞およびヒト脂肪由来幹細胞を簡便且つ高い生存率で凍結保存を可能とする、凍結保存液および凍結保存方法が得られた。Human stem cells applicable to regenerative medicine are immersed in the preservation solution and stored frozen at -80 ° C. or in liquid nitrogen or liquid nitrogen vapor to increase the survival rate and differentiation potential without using highly toxic dimethyl sulfoxide. It is possible to preserve it while maintaining it. Since dimethyl sulfoxide, which is an existing freezing protection agent, is not used, toxicity to frozen cells is kept low, and it can be stored frozen for a long time while maintaining its function. In addition, since protein components such as fetal bovine serum and albumin are not used, there is no concern about infectious diseases and the difference between lots due to biologics is not affected.
Ε-Poly-L-lysine introduced with a carboxyl group has cell membrane affinity due to its amino group, and is thought to have a cell-protecting effect. On the other hand, the negative charge of the carboxyl group reduces the affinity with the cell membrane. I am letting. That is, it is considered that a very weak interaction is exhibited with respect to the cell membrane, and this effect is considered to exhibit a frost damage protection effect by protecting the cell membrane without giving toxicity. Moreover, since the cryopreservation agent of the present invention is less toxic than dimethyl sulfoxide, it does not require washing after thawing, and can be cultured immediately by adding it to the medium as it is.
In the cooling process, if the water is rapidly cooled, there is a difference in freezing of water inside and outside the cell, and the fine structure of the cell is destroyed. It is preferable to perform cooling at. Most preferred is a cooling rate of 0.5 ° C. to 2 ° C. per minute. Moreover, although a preservation | save process becomes possible at -80 degrees C or less, it is preferable to preserve | save in liquid nitrogen or a liquid nitrogen vapor layer from the surface of more stable preservation | save. Although details of the action of the present invention are not clear, it is considered that human mesenchymal stem cells and human adipose-derived stem cells are more damaged during freezing than mouse and rat stem cells and general human culture cells. By using a higher concentration of amphoteric polymer frost damage protective agent than usual or in combination with existing frost damage protective agents such as polyhydric alcohol, the freezing damage is kept low and the survival rate during reculture is remarkably high. It is estimated that it has improved. According to the present invention, a cryopreservation solution and a cryopreservation method have been obtained that enable cryopreservation of human mesenchymal stem cells and human adipose-derived stem cells in a simple and high survival rate.
本発明の凍結保存液は、生理的溶液に、ポリリジンなどの高分子化合物が1−50w/w%溶解されてなる。好ましくは2〜20w/w%、特に好ましくは3〜15w/w%、さらに好ましくは5〜10w/w%溶解されてなる。生理的溶液としては、生理食塩水の他、各種の細胞または組織用の一般的な培養液を用いることができる。例えば、ダルベッコ改変イーグルMEM培地(DMEM)を好ましいものとして挙げることができる。ポリリジンに代えて同一分子内にカチオン性置換基とアニオン性置換基の両方をもつ単量体が重合した形の高分子化合物でも可能である。特には、ポリアミノ酸を好ましいものとして挙げることができる。すなわち、高分子化合物の繰り返し単位が、アミノ基及びカルボキシル基を共に有するのが特に好ましい。ポリリジンは、ε−ポリ−L−リジンもしくはε−ポリ−D−リジン、α−ポリ−L−リジン、α−ポリ−D−リジンのいずれであっても良い。凍結保護成分である高分子化合物は分子量が100〜100,000である。最も好ましい高分子種として、微生物または酵素により生産される数平均分子量がb1000〜2万、特には1000〜1万のε−ポリ−L−リジンを挙げることができる。ε−ポリ−L−リジンは、ストレプトマイセス属(Streptomyces)に属する放線菌により生産されてもっぱら食品添加物として用いられており(http//www.chisso.co.jp/fine/jp/polylisin/index.html)、重合度15〜35のものの他、重合度が20以下のものの生産も試みられている(例えば、特開2003−171463、特開2005−318815)。数平均分子量または数平均重合度の測定は、SDS−PAGE(ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動)法により、例えば、アトー(株)製の電気泳動装置及びデンシトグラフ(AE−6920V型)を用いて容易に測定することができる。このとき、標準タンパクマーカーを用いる。なお、ポリリジンは、加熱処理による高分子量化により分子量3万以上として用いることもできる。しかし、粘度の上昇を防ぐ等の観点から上記の分子量範囲が好ましい。末端のみにフリーのカルボキシル基を有するポリリジンは、側鎖に1級アミノ基のみを有しているが、後述するように無水カルボン酸を用いて部分的にアミド化することで、優れた混和性能ないし可溶化性能を発揮するものと考えられる。特には、無水ジカルボン酸などを反応させて部分的にカルボキシル化することで、優れた性能を発揮することができる。
ポリアミンのアミノ基は、好ましくは、部分的に、無水コハク酸によってカルボキシル化される。この際、ポリアミンのアミノ基について、好ましくは50〜99モル%、特には50〜93%、より好ましくは50〜90モル%、さらに好ましくは55〜80モル%、最も好ましくは58〜76モル%をカルボキシル化する。ここで用いられる無水コハク酸に代えて、無水酢酸、無水クエン酸、無水グルタル酸、無水リンゴ酸、無水フマル酸、及び無水マレイン酸などでも可能である。これらのうち、無水コハク酸を特に好ましいものとして挙げることができる。
一方、本発明の凍結保存剤には、ジメチルスルホキシドやグリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、トレハロースやスクロースなどの既存の凍結保護物質が0.1−50w/w%、特には1〜20w/w%共存することでさらなる有効性の向上が期待される。細胞が凍結から解凍される際に酸化ストレスによるダメージを受けると言われており、抗酸化剤を添加することで効果が高まることも期待される。抗酸化剤は例えば、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、ビタミンE、ビタミンC、エピガロカテキンガレートなどのポリフエノール類またはグルタチオンなどが挙げられる。The cryopreservation solution of the present invention is obtained by dissolving 1-50 w / w% of a polymer compound such as polylysine in a physiological solution. It is preferably 2 to 20 w / w%, particularly preferably 3 to 15 w / w%, more preferably 5 to 10 w / w%. As a physiological solution, a general culture solution for various cells or tissues can be used in addition to physiological saline. For example, Dulbecco's modified Eagle MEM medium (DMEM) can be mentioned as a preferable one. Instead of polylysine, a polymer compound in which a monomer having both a cationic substituent and an anionic substituent in the same molecule is polymerized is also possible. In particular, polyamino acids can be mentioned as preferred. That is, it is particularly preferable that the repeating unit of the polymer compound has both an amino group and a carboxyl group. The polylysine may be any one of ε-poly-L-lysine, ε-poly-D-lysine, α-poly-L-lysine, and α-poly-D-lysine. The polymer compound as the cryoprotective component has a molecular weight of 100 to 100,000. As the most preferable polymer species, ε-poly-L-lysine having a number average molecular weight of b1000 to 20,000, particularly 1000 to 10,000, produced by a microorganism or an enzyme can be mentioned. ε-poly-L-lysine is produced exclusively by actinomycetes belonging to the genus Streptomyces and is used exclusively as a food additive (http://www.chisso.co.jp/fine/jp/polylisin). /Index.html), in addition to those having a polymerization degree of 15 to 35, production of those having a polymerization degree of 20 or less has also been attempted (for example, JP-A Nos. 2003-171463 and 2005-318815). The number average molecular weight or the number average degree of polymerization is measured by SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis), for example, using an electrophoresis apparatus manufactured by Ato Co., Ltd. and a densitograph (AE-6920V type). And can be easily measured. At this time, a standard protein marker is used. Polylysine can also be used with a molecular weight of 30,000 or more by increasing the molecular weight by heat treatment. However, the above molecular weight range is preferable from the viewpoint of preventing an increase in viscosity. Polylysine, which has a free carboxyl group only at the terminal, has only a primary amino group in the side chain, but has excellent mixing performance by partially amidating with carboxylic anhydride as described later. Or it is thought that solubilization performance is exhibited. In particular, excellent performance can be exhibited by reacting dicarboxylic anhydride or the like to partially carboxylate.
The amino group of the polyamine is preferably partially carboxylated with succinic anhydride. At this time, the amino group of the polyamine is preferably 50 to 99 mol%, particularly 50 to 93%, more preferably 50 to 90 mol%, still more preferably 55 to 80 mol%, most preferably 58 to 76 mol%. Is carboxylated. Instead of succinic anhydride used here, acetic anhydride, citric anhydride, glutaric anhydride, malic anhydride, fumaric anhydride, maleic anhydride and the like are also possible. Among these, succinic anhydride can be mentioned as a particularly preferable one.
On the other hand, in the cryopreservation agent of the present invention, existing cryoprotectants such as dimethyl sulfoxide, glycerol, ethylene glycol, propylene glycol, trehalose and sucrose are 0.1-50 w / w%, particularly 1-20 w / w%. Coexistence is expected to further improve effectiveness. It is said that when cells are thawed from freezing, they are damaged by oxidative stress, and the effect is expected to increase by adding antioxidants. Examples of the antioxidant include catalase, peroxidase, superoxide dismutase, vitamin E, vitamin C, polyphenols such as epigallocatechin gallate, glutathione, and the like.
以下、この発明の実施例及び比較例を示す。なお、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
<実施例1 凍結保存溶液の調整>
ε−ポリ−L−リジン(チッソ社製、分子量4000)は25%水溶液のものを用い、分子中のアミノ基に対し、モル%で0−100%の無水コハク酸(和光純薬工業製)を添加することでカルボキシル基導入率の異なるポリリジンを作成した。ポリリジン分子中のアミノ基のカルボキシル基への置換率はTNBS法により求めた。(たとえばポリリジンのアミノ基のうち65モル%をカルボキシル基に置換した場合、PLL(0.65)と表示する。)それぞれのカルボキシル基導入ポリリジン溶液をダルベッコ改変培地(DMEM、シグマアルドリッチ製)に0−20w/w%となるように添加した。この際、pHが6.4−8.0の範囲内になるように1Nの塩酸もしくは水酸化ナトリウム水溶液で中和した。
<実施例2 ヒト間葉系幹細胞の凍結保存>
1×106個のヒト間葉系幹細胞(理研バイオリソースセンター)をクライオバイアル(Simport Plastics)中で各凍結保存液1mLに懸濁し、−80℃のフリーザー中で凍結保存を行った。このとき、冷却速度を簡易的に−1℃/分とするため、冷却イソプロピルアルコールを封入した冷却チャンバー(ミスターフロスティ、Nunc製)中に凍結バイアルを放置し、−80℃冷凍庫内で凍結を行った。1週間後、37℃の温浴中で速やかに融解し、DMEMで洗浄したのち、6wellカルチャーディッシュに1×105個ずつ播種し、6時間後の生存率をトリパンブルー染色により評価した。比較例としては一般的によく用いられている保存液である10%DMSO/ウシ胎児血清(FBS)を用いた。6時間後の生存率を持って評価したことの理由としては、解凍直後の生存率評価ではトリパンブルーの取り込みは排除できるがその後ディッシュに生着できずに死んでいく細胞が多数いる場合、過大評価してしまうおそれがあるためであり、ディッシュに播種して6時間後にはそれら付着できなかった細胞はすべて死滅し、実質正常に増殖に向かう細胞のみを生細胞として評価できるためである。
表1に示すように、ヒト間葉系幹細胞を凍結保存するにあたり、アミノ基のうち46%以上をカルボキシル基に変換したカルボキシル化ポリリジン10%溶液を用いた場合、比較例のDMSO溶液を用いた場合に比べて播種後6時間においてほぼ同じか、より良好な生存率を示した。特にアミノ基の変換率が65%であるとき最も良い保存効果が得られた。また、デキストラン(分子量7万、名糖産業)を10%添加した保存液ではほとんど生存率は向上しなかったが、ヒト血清アルブミン(三菱ウェルファーマ)を10%添加した保存液およびプロピレングリコール(和光純薬)を10%添加した保存液ではいずれも90%を超える保存効果が得られ、相乗効果が確認された。プロピレングリコールは毒性が低く、生物由来でないため、ジメチルスルホキシドおよび生物由来原料を用いない凍結保存液組成としてカルボキシル化ポリリジンと併用することでさらなる再生医療用凍害防御液として応用可能な凍害防御効果が得られることが確認された。
<実施例3 ヒト脂肪由来幹細胞の凍結保存>
脂肪は骨髄に比べ容易にしかも多量に採取可能であり、幹細胞のソースとして注目されている。以下に、今回実験に使用したヒト脂肪由来幹細胞脂肪の採取方法を記載した。吸引により採取した脂肪組織を5%抗生剤含有リン酸緩衝液(PBS)で2回洗浄した。37℃で30分間0.075%Collagenase solutionで脂肪を消化し、遠心操作により細胞群を分離した。分離された細胞群を、DMEM−F12,10%FBSおよび抗生物質を含む培地内に混合して細胞懸濁液を生成し、培養容器に播種した。培養容器内に播種された細胞群に含まれている細胞のうち、接着性の高い脂肪組織由来幹細胞が培養容器の底面に接着し、それ以外のより接着性の低い細胞は培養容器の底面に接着できずに、洗浄ステップにおいて上清とともに除去される。このようにして、純度よく分離された脂肪組織由来幹細胞を得た。
また、PLL(0.65)の濃度を0−12w/w%まで変化させてヒト脂肪由来幹細胞を凍結させたところ、表3に示すような結果が得られた。すなわち、PLL(0.65)の濃度が7%あたりからかなり生存率が高くなってきており、12%程度で最も高くなっている。これはL929の生存率がPLL(0.65)7.5%以上でほぼ95%を示すのに対し、より高濃度が必要という結果である。つまり、ヒト脂肪由来幹細胞はL929のような不死化細胞に比べると増殖率も弱く、凍結に対する感受性も高いからではないかと予想される。従ってより高濃度の凍害防御剤が必要となるが、ジメチルスルホキシドのような毒性の高い保存剤は濃度を高めることがすなわち毒性につながるため、最適な保存液の設計が困難であったといえる。しかしながらPLL(0.65)の様な高分子物質は毒性も低く、浸透圧も低く抑えることが可能であることから濃度を高めることが容易であり、幹細胞の凍結保存には適していることが示唆される。また、毒性の低いエチレングリコールやグリセリン、プロピレングリコールと共存させることにより相乗効果が見られることも有用な知見である。
次にヒト脂肪由来幹細胞の凍結解凍後の増殖を調べ、細胞の倍加時間を測定したところ、表4に示すようにジメチルスルホキシド凍結保存に関しては未凍結保存に比べて約10時間以上も倍加時間が長くなっている。これは細胞が正常な増殖状態に戻るまでに時間を要することを意味している。一方、PLL系ではPLL(0.65)での保存が最も倍加時間が短くなる傾向にあり、また濃度は10−12%で最も短い倍加時間を取ることから、最適な濃度域も10%前後であることが確認された。この場合もプロピレングリコール添加で若干倍加時間の短縮が見られ、相乗効果が確認されている。
また、ヒト脂肪由来幹細胞の本発明凍結保存液にて凍結解凍後の分化能に関してもヒト間葉系幹細胞の凍結保存と同様、未凍結系、ジメチルスルホキシド系と比較して全く同等の分化能を維持していたことから、ヒト脂肪由来幹細胞においても本発明凍結保存液は有効であることが確認された。
ヒト脂肪由来幹細胞に対するPLL(0.65)の毒性試験を行った。10%ウシ胎児血清を含有したダルベッコ改変イーグルMEM培地(DMEM)に懸濁させたヒト脂肪由来肝細胞を、96wellマイクロプレートに10×103cell/well播種し、37℃で72時間培養後、PLL(0.65)を、最終濃度0−14%となるように添加し、48時間後、未添加系をコントロールとして細胞の増殖が50%阻害される濃度をIC50とし、MTT法で求めた。その結果を図2に示す。比較例はDMSO系(10%DMSO/ウシ胎児血清)とした。図2の結果から知られるように、PLL(0.65)は14%でも細胞の増殖抑制は起こらず、IC50が約4%であったジメチルスルホキシドよりも明らかに毒性が低いことがわかった。これはPLL(0.65)がマイナス電荷を帯びているため細胞膜との相互作用が低いことと、高分子化合物であるため高濃度においても浸透圧が低く抑えられることなどが原因と考えられる。したがって本凍結保存剤を使用することで既存の凍結保存液に比べ細胞毒性を低くすることができ、幹細胞のような比較的弱い細胞の凍結保存に適したものが得られることがわかった。Examples of the present invention and comparative examples will be described below. In addition, this invention is not limited to the following Example.
<Example 1 Preparation of Cryopreservation Solution>
ε-poly-L-lysine (manufactured by Chisso Corporation, molecular weight 4000) is a 25% aqueous solution, and 0-100% succinic anhydride (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in mol% with respect to the amino group in the molecule. Was added to prepare polylysine having different carboxyl group introduction rates. The substitution rate of the amino group to the carboxyl group in the polylysine molecule was determined by the TNBS method. (For example, when 65 mol% of the amino group of polylysine is substituted with a carboxyl group, it is indicated as PLL (0.65).) Each of the carboxyl group-introduced polylysine solutions is added to Dulbecco's modified medium (DMEM, manufactured by Sigma-Aldrich). It added so that it might become -20w / w%. At this time, the solution was neutralized with 1N hydrochloric acid or aqueous sodium hydroxide so that the pH was in the range of 6.4-8.0.
<Example 2 Cryopreservation of human mesenchymal stem cells>
1 × 10 6 human mesenchymal stem cells (RIKEN BioResource Center) were suspended in 1 mL of each cryopreservation solution in a cryovial and then stored in a freezer at −80 ° C. At this time, in order to simply set the cooling rate to −1 ° C./min, the freezing vial is left in a cooling chamber (Mr. Frosty, manufactured by Nunc) filled with chilled isopropyl alcohol and frozen in a −80 ° C. freezer. It was. One week later, it was quickly thawed in a 37 ° C. warm bath, washed with DMEM, and then seeded in 1 × 10 5 pieces in a 6-well culture dish, and the survival rate after 6 hours was evaluated by trypan blue staining. As a comparative example, 10% DMSO / fetal bovine serum (FBS), which is a commonly used preservation solution, was used. The reason for the evaluation with the survival rate after 6 hours is that if the survival rate evaluation immediately after thawing can eliminate trypan blue uptake, but there are many cells that cannot be engrafted in the dish and then die, it is excessive. This is because all the cells that did not attach after 6 hours after seeding in the dish are killed, and only cells that are substantially normally proliferating can be evaluated as living cells.
As shown in Table 1, when cryopreserving human mesenchymal stem cells, when using a 10% solution of carboxylated polylysine in which 46% or more of amino groups were converted to carboxyl groups, the DMSO solution of Comparative Example was used. Compared to the case, the survival rate was almost the same or better at 6 hours after sowing. In particular, the best storage effect was obtained when the amino group conversion was 65%. In addition, the viability was hardly improved with a stock solution containing 10% dextran (molecular weight 70,000, famous sugar industry), but a stock solution containing 10% human serum albumin (Mitsubishi Pharma) and propylene glycol (Wako Pure) In each of the storage solutions to which 10% of (medicine) was added, a storage effect exceeding 90% was obtained and a synergistic effect was confirmed. Since propylene glycol has low toxicity and is not biologically derived, it can be used as a cryopreservation liquid composition that does not use dimethyl sulfoxide and biological raw materials, so that it can be used as a protective solution for frost damage for regenerative medicine. It was confirmed that
<Example 3 Cryopreservation of human adipose-derived stem cells>
Fat can be collected easily and in large quantities compared to bone marrow, and is attracting attention as a source of stem cells. The method for collecting human adipose-derived stem cell fat used in this experiment is described below. The adipose tissue collected by aspiration was washed twice with 5% antibiotic-containing phosphate buffer (PBS). Fat was digested with 0.075% Collagenase solution at 37 ° C. for 30 minutes, and cells were separated by centrifugation. The separated cell group was mixed in a medium containing DMEM-F12, 10% FBS and antibiotics to produce a cell suspension, and seeded in a culture vessel. Among the cells contained in the cell group seeded in the culture container, the highly adherent adipose tissue-derived stem cells adhere to the bottom surface of the culture container, and the other less adherent cells adhere to the bottom surface of the culture container. It cannot be adhered and is removed with the supernatant in the washing step. Thus, adipose tissue-derived stem cells separated with high purity were obtained.
When the concentration of PLL (0.65) was changed to 0-12 w / w% and human adipose-derived stem cells were frozen, the results shown in Table 3 were obtained. That is, the survival rate has increased considerably from around 7% of the concentration of PLL (0.65), and is highest at about 12%. This is a result of the fact that the survival rate of L929 is approximately 95% at PLL (0.65) 7.5% or higher, whereas a higher concentration is required. In other words, human adipose-derived stem cells are expected to have a lower growth rate and higher sensitivity to freezing than immortalized cells such as L929. Therefore, a higher concentration of anti-frost protection agent is required, but it can be said that it is difficult to design an optimal preservation solution because a highly toxic preservative such as dimethyl sulfoxide increases the concentration, that is, toxicity. However, a high molecular weight substance such as PLL (0.65) has low toxicity and can be kept low in osmotic pressure, so that it is easy to increase the concentration and is suitable for cryopreservation of stem cells. It is suggested. Another useful finding is that a synergistic effect can be seen by coexisting with low-toxicity ethylene glycol, glycerin and propylene glycol.
Next, the proliferation of human adipose-derived stem cells after freezing and thawing was examined, and the doubling time of the cells was measured. As shown in Table 4, the doubling time was about 10 hours or more in dimethyl sulfoxide cryopreservation compared to non-freezing preservation. It is getting longer. This means that it takes time for the cells to return to normal growth. On the other hand, in the PLL system, storage in PLL (0.65) tends to have the shortest doubling time, and since the concentration is 10-12% and takes the shortest doubling time, the optimal concentration range is also around 10%. It was confirmed that. Also in this case, the addition of propylene glycol slightly shortened the doubling time, confirming the synergistic effect.
Moreover, regarding the differentiation ability of human adipose-derived stem cells after freezing and thawing with the cryopreservation solution of the present invention, the differentiation ability of human adipose-derived stem cells is completely equivalent to that of unfrozen and dimethyl sulfoxide systems, as in the case of cryopreservation of human mesenchymal stem cells. Since it was maintained, it was confirmed that the cryopreservation solution of the present invention is effective also in human adipose-derived stem cells.
A toxicity test of PLL (0.65) on human adipose-derived stem cells was performed. Human adipose-derived hepatocytes suspended in Dulbecco's modified Eagle's MEM medium (DMEM) containing 10% fetal bovine serum was seeded on a 96-well microplate at 10 × 10 3 cells / well, and cultured at 37 ° C. for 72 hours. PLL (0.65) was added to a final concentration of 0-14%, and after 48 hours, the concentration at which cell growth was inhibited by 50% was determined by the MTT method using the non-added system as a control and IC 50 as the concentration. It was. The result is shown in FIG. The comparative example was DMSO system (10% DMSO / fetal calf serum). As can be seen from the results of FIG. 2, PLL (0.65) did not inhibit cell growth even at 14%, and was clearly less toxic than dimethyl sulfoxide, which had an IC 50 of about 4%. . This is thought to be due to the fact that PLL (0.65) is negatively charged and thus has a low interaction with the cell membrane, and because it is a polymer compound, the osmotic pressure can be kept low even at high concentrations. Therefore, it was found that by using this cryopreservation agent, the cytotoxicity can be lowered as compared with the existing cryopreservation solution, and a product suitable for cryopreservation of relatively weak cells such as stem cells can be obtained.
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Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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US11812739B2 (en) | 2016-02-17 | 2023-11-14 | Japan Advanced Institute Of Science And Technology | Vitreous state stabilizing agent for animal cell cryopreservation solution |
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