JP6867623B2 - Whooping cough model animal and its preparation method, and method using whooping cough model animal - Google Patents
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Description
本発明は、百日咳モデル動物およびその作製方法、百日咳モデル動物を用いた百日咳の予防または治療に用いられる医薬品の評価方法、咳発作誘発因子の特定方法、ならびに医薬品の製造方法に関するものである。 The present invention relates to a pertussis model animal and a method for producing the same, a method for evaluating a drug used for prevention or treatment of pertussis using the pertussis model animal, a method for identifying a cough attack inducer, and a method for producing a drug.
百日咳は主として小児および10代の青少年に発生する伝染性の強い疾患で，百日咳菌（Bordetella pertussis）に起因する。症状は初め非特異的上気道感染様で，次に通常は長く高調の鶏鳴様吸気（笛声）で終わる発作性または痙攣性の咳が発現する。
百日咳菌感染により引き起こされる咳発作の発症メカニズムおよびその誘発因子は未だに解明されていない。その理由の一つに、現在まで百日咳菌感染における咳発作を忠実に再現する有用な動物モデルは開発されていない事が挙げられる。
これまで、マウスやラットといった小型で扱い易いげっ歯類を用いた感染モデルが報告されている。マウスでは百日咳菌経鼻投与による上下気道組織への菌体の定着や百日咳毒素が原因の白血球増多性を引き起こすが、肝心な発作性の咳嗽は生じないことが報告されている（非特許文献１、非特許文献２）。
ラットは唯一、咳発作が報告されている小動物である（非特許文献３、非特許文献４）。これらの報告において用いられた実験系では、百日咳菌を封じ込めたアガロール粒子を作製し、これを外科的に露出させたラット気管支あるいは肺に直接投与したことが報告されている。非特許文献４では、投与9日後から咳発作が観察されている。またこの実験系で観察される咳発作は百日咳ワクチンで抑制される事があわせて報告されている（非特許文献５）。
しかし、上記実験系では気道等での菌体の定着を観察していないうえに、百日咳菌感染群の咳発作の回数が対照群に比べて有意ではなく、咳発作の回数を評価の対象とする感染モデルとしては十分ではない。また感染手法が非常に煩雑であるため他のグループからの追試報告はなく、汎用的で簡便な方法とは言い難いという問題がある。
ブタは類縁菌である気管支敗血症菌の自然宿主であるが、近年、百日咳菌経鼻投与により百日咳様症状を示す事が報告されているが、発作性の咳嗽は認められない（非特許文献６）。
現在、百日咳菌感染による咳発作を再現する動物モデルとしてヒヒ (Papio anubis)が注目されている。百日咳菌を経気道投与することで、感染3日後から激しい咳発作が生じる（非特許文献７）。また現行の百日咳ワクチン接種により咳発作の発症は抑制されることが報告されている（非特許文献８）。しかし、ヒヒ百日咳モデルは実験動物として凡用性は非常に低く、倫理的障害を考え合わせると容易に使用できる動物モデルではないという問題がある。
Whooping cough is a highly contagious disease that occurs primarily in children and teenagers and is caused by Bordetella pertussis. Symptoms initially resemble nonspecific upper respiratory tract infections, followed by paroxysmal or convulsive cough, which usually ends with a long, harmonic-like inspiration (whistle).
The pathogenic mechanism of cough attacks caused by B. pertussis infection and its inducers have not yet been elucidated. One of the reasons is that no useful animal model has been developed to date that faithfully reproduces the coughing attack in Bordetella pertussis infection.
So far, infection models using small and easy-to-use rodents such as mice and rats have been reported. It has been reported that in mice, nasal administration of Bordetella pertussis causes colonization of cells in upper and lower respiratory tract tissues and leukoplasia caused by pertussis toxin, but does not cause essential paroxysmal cough (non-patent literature). 1. Non-patent document 2).
Rats are the only small animals for which cough attacks have been reported (Non-Patent Documents 3 and 4). In the experimental system used in these reports, it has been reported that agarol particles containing B. pertussis were prepared and directly administered to the surgically exposed rat bronchi or lungs. In
However, in the above experimental system, colonization of bacterial cells in the respiratory tract was not observed, and the number of cough attacks in the pertussis-infected group was not significant as compared with the control group, and the number of cough attacks was evaluated. It is not sufficient as an infection model. In addition, since the infection method is very complicated, there is no additional test report from other groups, and there is a problem that it cannot be said that it is a general-purpose and simple method.
Pigs are a natural host of bronchial septicemia, which is a related bacterium. In recent years, it has been reported that nasal administration of Bordetella pertussis causes pertussis-like symptoms, but paroxysmal cough is not observed (Non-Patent Document 6). ).
Currently, baboons (Papio anubis) are attracting attention as an animal model that reproduces cough attacks caused by Bordetella pertussis infection. By administering Bordetella pertussis through the respiratory tract, severe coughing attacks occur 3 days after infection (Non-Patent Document 7). It has also been reported that the current pertussis vaccination suppresses the onset of cough attacks (Non-Patent Document 8). However, the baboon whooping cough model has very low versatility as an experimental animal, and there is a problem that it is not an easy-to-use animal model considering ethical obstacles.
百日咳は、母親からの免疫（経胎盤移行抗体）が期待できないため、乳児期早期から罹患し、１歳以下の乳児、ことに生後6カ月以下ではそれ以上の乳児に比べ死に至る危険性も高い。百日咳ワクチンを含むDPT 三種混合ワクチン（ジフテリア・百日咳・破傷風）またはDPT-IPV四種混合ワクチン（ジフテリア・百日咳・破傷風・不活化ポリオ）の接種が我が国を含めて世界各国で実施されており、その普及とともに各国で百日咳の発生数は激減している。しかしながら、百日咳菌に対する終生免疫は獲得できないため、百日咳ワクチン接種の普及率が低下すれば、感染率が増加する。百日咳ワクチン接種の普及率を維持するためには、現在においても、安全で高力価な百日咳ワクチンの開発は重要な課題である。
現在の日本国内における、百日咳ワクチンの力価試験には1947年にKendrickにより開発されたIntracerebral challenge test (脳内攻撃試験)が採用されている(非特許文献９)。百日咳ワクチンの有効性評価にマウス脳内攻撃試験を用いることは、自然感染と感染経路が異なるものの、STANDFASTらによって実施された大規模な野外実験の結果、脳内攻撃試験で算出された全菌体百日咳ワクチンの力価と百日咳菌自然感染に対するワクチンの効果とが平行することが示されている(非特許文献１０)。このように脳内攻撃試験は、全菌体百日咳ワクチンの免疫効果を定量的に扱えることから広く普及し、現在に至っている。しかし近年、脳内攻撃試験は自然感染の状態を再現していない、現行の無細胞百日咳ワクチンの力価試験に適していないなど、当該試験についての是非が論じられている(非特許文献１１、非特許文献１２、非特許文献１３、非特許文献１４)。実際、2000年にNIBSCのワーキンググループにおいて無細胞百日咳ワクチン効力試験モデルについて議論が行われているものの、未だ脳内攻撃試験の代替となりうる試験法は確立されていない。
前述のように議論される背景には、ワクチン評価に適切な百日咳動物モデルが確立されていない事が理由の一つとして挙げられる。最近、ヒヒを用いた百日咳ワクチンの評価を行った研究成果が報告された(非特許文献７)ことは、先述べた通りである。この研究成果では、百日咳菌経気道投与ヒヒにおいて、無細胞百日咳ワクチン免疫群では上気道における菌体の排除こそはできないものの、咳発作は抑制される事が示されている。このことから、ヒヒ百日咳モデルは新たな動物モデルとして注目されている。しかし、先に述べたようにヒヒを百日咳ワクチン評価系として用いるには、実験動物として凡用性の低さや倫理的な問題、また費用面を考えると現実的ではない。
Pertussis is afflicted early in infancy because mothers cannot expect immunity (transplacental transfer antibody), and there is a higher risk of death than infants under 1 year old, especially those under 6 months of age. .. DPT triple vaccine (diphtheria, whooping cough, tetanus) or DPT-IPV quaternary vaccine (diphtheria, whooping cough, tetanus, inactivated polio) including pertussis vaccine is being inoculated all over the world including Japan. With the spread, the number of whooping coughs has decreased sharply in each country. However, since lifelong immunity to B. pertussis cannot be obtained, if the prevalence of pertussis vaccination decreases, the infection rate will increase. In order to maintain the prevalence of pertussis vaccination, the development of a safe and highly potent pertussis vaccine is still an important issue.
Intracerebral challenge test (intracerebral attack test) developed by Kendrick in 1947 is adopted for the titer test of pertussis vaccine in Japan at present (Non-Patent Document 9). Although the use of the mouse intracerebral attack test to evaluate the efficacy of the pertussis vaccine has a different infection route from natural infection, all bacteria calculated in the intracerebral attack test as a result of a large-scale field experiment conducted by STANDFAST et al. It has been shown that the titer of the body pertussis vaccine and the effect of the vaccine against natural infection with Bordetella pertussis are parallel (Non-Patent Document 10). In this way, the intracerebral attack test has become widespread because it can quantitatively treat the immune effect of the whole-cell pertussis vaccine, and has continued to this day. However, in recent years, the pros and cons of the test have been discussed, such as the intracerebral attack test does not reproduce the state of natural infection and is not suitable for the titer test of the current cell-free pertussis vaccine (Non-Patent Document 11, Non-Patent Document 11, Non-Patent
One of the reasons for the discussion as described above is that a suitable pertussis animal model for vaccine evaluation has not been established. As mentioned above, the results of research on the evaluation of pertussis vaccine using baboons have recently been reported (Non-Patent Document 7). The results of this study show that in the pertussis transairway-administered hihi, the cell-free pertussis vaccine immune group cannot eliminate the cells in the upper respiratory tract, but suppresses coughing attacks. For this reason, the baboon whooping cough model is drawing attention as a new animal model. However, as mentioned above, it is not realistic to use baboon as a pertussis vaccine evaluation system because of its low versatility as an experimental animal, ethical issues, and cost.
百日咳菌感染により、ヒトでみられる顕著な咳発作を呈し、安価で利便性が高く、咳発作誘発因子の特定や医薬品の評価や製造にも用いることができる百日咳動物モデルの開発が望まれていた。 It is desired to develop a pertussis animal model that exhibits prominent coughing attacks found in humans due to pertussis infection, is inexpensive and highly convenient, and can be used for identifying coughing attack-inducing factors and for evaluating and manufacturing pharmaceutical products. It was.
本発明者らは、鋭意研究の結果、顕著な咳発作を呈するマウスの百日咳モデル動物の開発に成功した。また、本発明の百日咳モデル動物の咳発作は、現行の百日咳ワクチンを含むDPT-IPVワクチンにより抑制される事を確認したことから、本発明により、新たな百日咳ワクチンなどの医薬品の有効性評価試験方法や、咳発作誘発因子の特定方法、当該評価方法を用いた医薬品の製造方法を提供することができる。
すなわち、本発明は、以下の通りである。
［１］
C57BL/6マウスに、百日咳菌Bp 18323株を含む菌液、もしくは百日咳菌Bp 18323株を含む菌体破砕液を接種する工程を含む、百日咳モデルマウスの作製方法。
［２］
前記C57BL/6マウスが、成熟マウスである、［１］に記載の方法。
［３］
前記菌液に0.5×108cfu/ml以上、好ましくは1×108cfu/ml以上、更に好ましくは2×10８cfu/ml以下の百日咳菌Bp 18323株が含まれる、もしくは前記菌体破砕液に0.8 mg/ml以上、好ましくは1.0 mg/ml以上、さらに好ましくは1.2 mg/ml以下の菌体成分が含まれる、［１］に記載の方法。
［４］
被験物質の評価方法であって、
（１）C57BL/6マウスに被験物質を投与する工程、
（２）被験物質を投与したマウス、および被験物質を投与しないC57BL/6マウスに、百日咳菌Bp 18323株、もしくは百日咳菌Bp 18323株の菌体破砕液を接種する工程、
（３）前記被験物質を投与したマウスにおける咳発作回数を、前記被験物質を投与しないマウスおよび／または百日咳菌もしくは百日咳菌体破砕液を接種しないマウスにおける咳発作回数と比較する工程、および、
（４）前記（３）の工程により得られた結果に基づいて、被験物質の百日咳菌感染による咳発作の抑制作用における有効性を判定する工程、
を含む評価方法。
［５］
前記被験物質が百日咳ワクチンである、［４］に記載の方法。
［６］
百日咳菌Bp 18323株に感染したC57BL/6マウス、あるいは百日咳菌Bp 18323株の菌体破砕液を接種したC57BL/6マウスであって、咳発作を呈することを特徴とする、百日咳モデルマウス。
［７］
百日咳菌の咳発作誘発因子の特定方法であって、
（１）百日咳菌Bp 18323株の１つの機能もしくは構造的因子をコードする遺伝子を欠損または発現を抑制するよう改変した百日咳菌Bp 18323株を作製する工程
（２）前記（１）の工程により得られた改変した百日咳菌Bp 18323株またはその菌体破砕液をC57BL/6マウスに投与する工程
（３）前記（２）のマウスにおける咳発作回数を、溶媒接種群および／または［６］に記載の百日咳モデルマウスにおける咳発作回数と比較する工程、および、
（４）前記（３）の工程により得られた結果に基づいて、百日咳菌の咳発作誘発因子を特定する工程、
を含む特定方法。
［８］
百日咳ワクチンの製造方法であって、
（１）百日咳菌の防御抗原を製造する工程
（２）百日咳菌Bp 18323株、もしくは百日咳菌Bp 18323株の菌体破砕液を接種したC57BL/6マウスを用いて前記百日咳菌の防御抗原の効力を測定する工程、および
（３）前記百日咳菌の防御抗原を製薬学的に許容される担体および／または他の免疫原性成分と混合し、単位用量製剤に製剤化する工程、
を含む、製造方法。
As a result of diligent research, the present inventors have succeeded in developing a pertussis model animal of a mouse exhibiting a remarkable cough attack. In addition, since it was confirmed that the cough attack of the pertussis model animal of the present invention is suppressed by the DPT-IPV vaccine including the current pertussis vaccine, the efficacy evaluation test of a new drug such as the pertussis vaccine is performed by the present invention. It is possible to provide a method, a method for identifying a cough attack-inducing factor, and a method for producing a drug using the evaluation method.
That is, the present invention is as follows.
[1]
A method for producing a pertussis model mouse, which comprises a step of inoculating a C57BL / 6 mouse with a bacterial solution containing Bordetella pertussis
[2]
The method according to [1], wherein the C57BL / 6 mouse is a mature mouse.
[3]
The bacterial solution contains Bordetella pertussis
[4]
It is an evaluation method of the test substance,
(1) Step of administering the test substance to C57BL / 6 mice,
(2) A step of inoculating a cell disrupted solution of Bordetella pertussis
(3) A step of comparing the number of coughing attacks in the mice to which the test substance was administered with the number of coughing attacks in the mice not administered with the test substance and / or the mice not infused with Bordetella pertussis or Bordetella pertussis.
(4) A step of determining the effectiveness of the test substance in suppressing a cough attack due to B. pertussis infection based on the results obtained in the above step (3).
Evaluation method including.
[5]
The method according to [4], wherein the test substance is a pertussis vaccine.
[6]
A C57BL / 6 mouse infected with
[7]
A method for identifying the cough attack-inducing factor of Bordetella pertussis
(1) Step of producing
(4) A step of identifying a cough attack-inducing factor of Bordetella pertussis based on the result obtained by the step (3) above.
Specific methods including.
[8]
How to make a pertussis vaccine
(1) Step of producing a protective antigen for Bordetella pertussis (2) Efficacy of the protective antigen for Bordetella pertussis using C57BL / 6 mice inoculated with
Manufacturing method, including.
本発明の百日咳モデル動物は、安価で利便性の高いマウスを用い、百日咳菌感染によりヒトと同様に顕著な咳発作を呈するから、本発明の動物モデルは、咳発作メカニズムの解明や咳発作の誘発因子同定、百日咳に対する医薬品のスクリーニング評価に有用である。また、本発明の評価方法は、従来のワクチン等の有効性評価試験に比べ、評価可能なワクチンの対象が拡大するとともに、感染拡大の抑制に直接関係する咳発作回数に基づく評価が可能となる。 Since the pertussis model animal of the present invention uses inexpensive and highly convenient mice and exhibits a prominent coughing attack as in humans due to B. pertussis infection, the animal model of the present invention can be used to elucidate the coughing attack mechanism and to clarify the coughing attack. It is useful for identifying inducers and screening evaluation of drugs for whooping cough. In addition, the evaluation method of the present invention expands the scope of evaluable vaccines as compared with conventional efficacy evaluation tests for vaccines and the like, and enables evaluation based on the number of cough attacks directly related to the suppression of infection spread. ..
（百日咳モデル動物）
本発明の百日咳モデル動物は、百日咳菌もしくは百日咳菌体破砕液の接種により顕著な咳発作を生じるマウスである。
「咳発作」とは、連続する咳が反復して生じることを意味する。
本発明の百日咳モデル動物は、接種後一定期間経過後に咳発作が生じる。好ましくは、接種後5日以上経過後に咳発作が生じ、約1週間以上咳発作が継続する。
「顕著な咳発作」とは、百日咳菌もしくは百日咳菌体破砕液の接種後一定期間の合計咳発作回数が、百日咳菌もしくは百日咳菌体破砕液を接種しない動物群（ネガティブコントロール群）に比較して、有意に増加することを意味する。好ましくは、接種後6〜14日間の一定期間の合計咳発作回数が、ネガティブコントロール群に比較して、有意に増加することを意味する。
本発明の百日咳モデル動物の咳発作は、有効量の百日咳ワクチンの投与により有意に抑制される。好ましくは、百日咳ワクチン投与群の百日咳菌接種後一定期間、より好ましくは6〜14日間の合計咳発作回数が、百日咳ワクチン非投与群と比較して、有意に少ないことを意味する。
(Whooping cough model animal)
The pertussis model animal of the present invention is a mouse that produces a prominent cough attack by inoculation with Bordetella pertussis or Bordetella pertussis.
"Coughing attack" means that a series of coughs occur repeatedly.
The pertussis model animal of the present invention develops a cough attack after a certain period of time after inoculation. Preferably, a cough attack occurs 5 days or more after inoculation, and the cough attack continues for about 1 week or more.
"Significant coughing attacks" means that the total number of coughing attacks for a certain period after inoculation of Bordetella pertussis or Bordetella pertussis is compared with the group of animals not infused with Bordetella pertussis or Bordetella pertussis (negative control group). It means that it will increase significantly. Preferably, it means that the total number of coughing attacks over a period of 6 to 14 days after inoculation is significantly increased compared to the negative control group.
Coughing attacks in the pertussis model animals of the present invention are significantly suppressed by administration of an effective amount of the pertussis vaccine. Preferably, it means that the total number of coughing attacks in the pertussis vaccine-administered group for a certain period of time after inoculation with B. pertussis, more preferably 6 to 14 days, is significantly smaller than that in the non-pertussis vaccine-administered group.
（百日咳モデル動物の作製方法）
本発明の百日咳モデル動物の作製方法を以下に示す。
１．動物種
本発明に用いることができる動物は、市販あるいは研究機関から入手可能なC57BL/6系統のマウスである。C57BL/6系統のマウスには、さらにC57BL/6JとC57BL/6Nの亜系統があり、同様に用いることができる。
入手可能なC57BL/6亜系統の主な種類と入手先は以下の通りである。
C57BL/6J：Jackson Laboratory
C57BL/6JMs：国立遺伝学研究所
C57BL/6JJcl：日本クレア
C57BL/6JNrs：放射線医学総合研究所
C57BL/6JJmsSlc：日本エスエルシー
C57BL/6NJcl：日本クレア
C57BL/6NCrlCrlj：日本チャールス・リバー
C57BL/6NCrl：日本チャールス・リバー
C57BL/6NCrSlc：日本エスエルシー
C57BL/6NSea：九動
C57BL/6JBomTac：Taconic Farms
C57BL/6JEiJ：Jackson Laboratory
C57BL/6JOlaHsd：Harlan
C57BL/6JRccHsd：Harlan
C57BL/6JSca：Scanbur A-S
C57BL/6NTac：Taconic Farms
C57BL/6NJ：Jackson Laboratory
C57BL/5NHsd：Harlan
C57BL/6NCrSim：Simonsen Laboratories
C57BL/6By：Jackson Laboratory
C57BL/6ByJ：Jackson Laboratory
好ましくは、C57BL/6Jマウスである。
本発明に用いることができるC57BL/6マウスは、体重10〜30ｇの成熟マウスであり、好ましくは百日咳菌もしくは百日咳菌体破砕液接種時点で7〜10週齢の雄マウスである。
２．百日咳菌
本発明に用いることができる百日咳菌は、WHOの参照株である18323株（以下、Bp 18323株と記載する）が好ましい。また、百日咳菌の菌体を破砕した、百日咳菌体破砕液も用いることができる。
３．百日咳菌もしくは百日咳菌体破砕液の接種方法
本発明において、百日咳菌を含む菌液、または百日咳菌体破砕液を動物に接種するには、噴霧による暴露や局所投与により行われるがこれに限定されるものではない。噴霧による暴露は、例えば、気密容器に動物を入れ、百日咳菌を含む菌液、または百日咳菌体破砕液をスプレー、ミストまたはエアロゾル等により気密容器内に充填し、感染に必要な時間暴露する方法が挙げられる。局所投与する場合は、百日咳菌を含む菌液、または百日咳菌体破砕液を、経鼻投与、経気道投与、または皮下投与することにより行うことができるが、これに限定されるものではない。経鼻もしくは経気道投与は、好ましくはマウスの鼻腔または気道内に菌液を噴霧するか、一定量を注射針から滴下して接種する。好ましくは経鼻投与である。
具体的には、百日咳菌の感染に十分な濃度、例えば、局所投与の場合、麻酔下で、0.5×108cfu/ml以上、好ましくは1×108cfu/ml以上、さらに好ましくは0.5〜2×10８cfu/mlの百日咳菌を含む菌液を作製し、接種する。噴霧の場合には、0.5×1010cfu/ml以上、好ましくは1〜2×1010cfu/mlの菌液を用いる。あるいは、百日咳菌体破砕液を用いるときは、局所投与の場合、麻酔下で、好ましくは0.8 mg/ml以上、より好ましくは1.0 mg/ml以上、さらに好ましくは0.8〜1.2 mg/mlの百日咳菌体破砕液を作製し、3〜7日間、好ましくは5日間連続接種する。噴霧の場合には、局所投与の濃度の2〜10倍程度の濃度の百日咳菌体破砕液を用い、5〜10日間暴露することにより接種する。
４．咳の評価
接種後、マウスを個別あるいは数匹毎に観察用のケージに入れ、通常の方法で飼育し、観察手順に従い咳発作を観察する。観察用のケージには、録音または動画の撮影機材を設置し、観察計画に基づき、ケージ内の音を一定時間録音または録画し、咳の回数をカウントする。観察用のケージには、咳以外の音を拾わないように、ケージの底に防音シートを設けても良い。
具体的な手順を以下に示すが、これに限定されるものではない。
（１）観察手順
観察用ケージのそばに、マイクロホンおよび／またはビデオカメラを設置し、ケージ内のマウスの様子を1日一匹ずつ一定時間記録する。あるいは、マイクロホンおよび／またはビデオカメラを設置したケージに、観察時間毎に観察するマウスを移動したり、ケージを観察時間毎に記録装置のそばに移動してもよい。
撮影後、録音または動画を再生し、咳音および／またはマウス動作を観察し、咳発作の回数を計測する。
（２）観察計画
観察期間中は、測定開始する時間を決め、毎日同じ時間に記録を開始し、一定時間、好ましくは5分間記録する。具体的には、観察は、接種後4〜6日目から咳発作がなくなるまで、または14日目まで行う。
(How to make a whooping cough model animal)
The method for producing the whooping cough model animal of the present invention is shown below.
1. 1. Animal Species The animals that can be used in the present invention are C57BL / 6 strain mice that are commercially available or available from research institutes. C57BL / 6 strain mice also have substrains of C57BL / 6J and C57BL / 6N, which can be used in the same manner.
The main types and sources of available C57BL / 6 substrains are as follows.
C57BL / 6J: Jackson Laboratory
C57BL / 6JMs: National Institute of Genetics
C57BL / 6JJcl: Claire Japan
C57BL / 6JNrs: National Institute of Radiological Sciences
C57BL / 6JJmsSlc: Japan SLC
C57BL / 6NJcl: Claire Japan
C57BL / 6NCrlCrlj: Japan Charles River
C57BL / 6NCrl: Charles River Japan
C57BL / 6NCrSlc: Japan SLC
C57BL / 6NSea: Kudo
C57BL / 6JBomTac: Taconic Farms
C57BL / 6JEiJ: Jackson Laboratory
C57BL / 6JOlaHsd: Harlan
C57BL / 6JRccHsd: Harlan
C57BL / 6JSca: Scanbur AS
C57BL / 6NTac: Taconic Farms
C57BL / 6NJ: Jackson Laboratory
C57BL / 5NHsd: Harlan
C57BL / 6NCrSim: Simonsen Laboratories
C57BL / 6By: Jackson Laboratory
C57BL / 6ByJ: Jackson Laboratory
Preferably, it is a C57BL / 6J mouse.
The C57BL / 6 mouse that can be used in the present invention is a mature mouse having a body weight of 10 to 30 g, preferably a male mouse 7 to 10 weeks old at the time of inoculation with Bordetella pertussis or Bordetella pertussis.
2. Bordetella pertussis The pertussis strain that can be used in the present invention is preferably 18323 strain (hereinafter referred to as
3. 3. Method of inoculating Bordetella pertussis or Bordetella pertussis crushed solution In the present invention, inoculating an animal with a bacterial solution containing Bordetella pertussis or a crushed solution of B. pertussis is limited to exposure by spraying or local administration. It's not something. Exposure by spraying is, for example, a method in which an animal is placed in an airtight container, and a bacterial solution containing Bordetella pertussis or a crushed solution of Bordetella pertussis is filled in the airtight container with a spray, mist, aerosol or the like, and exposed for the time required for infection. Can be mentioned. For local administration, a bacterial solution containing Bordetella pertussis or a crushed solution of Bordetella pertussis can be administered by nasal administration, respiratory tract administration, or subcutaneous administration, but is not limited thereto. For nasal or respiratory tract administration, the bacterial solution is preferably sprayed into the nasal cavity or respiratory tract of mice, or a fixed amount is inoculated by dropping from an injection needle. Nasal administration is preferable.
Specifically, a concentration sufficient for infection with Bordetella pertussis, for example, in the case of local administration, under anesthesia, 0.5 × 10 8 cfu / ml or more, preferably 1 × 10 8 cfu / ml or more, more preferably 0.5 to Prepare a bacterial solution containing 2 × 10 8 cfu / ml Bordetella pertussis and infect it. In the case of spraying, use a bacterial solution of 0.5 × 10 10 cfu / ml or more, preferably 1 to 2 × 10 10 cfu / ml. Alternatively, when using a pertussis cell disruption solution, in the case of local administration, under anesthesia, preferably 0.8 mg / ml or more, more preferably 1.0 mg / ml or more, still more preferably 0.8 to 1.2 mg / ml of Bordetella pertussis. A crushed solution is prepared and infused continuously for 3 to 7 days, preferably 5 days. In the case of spraying, use a pertussis cell disruption solution with a concentration of about 2 to 10 times the concentration of local administration, and inoculate by exposure for 5 to 10 days.
4. Evaluation of cough After inoculation, mice are placed in individual or individual observation cages, reared in the usual manner, and cough attacks are observed according to the observation procedure. Recording or video recording equipment is installed in the observation cage, and the sound in the cage is recorded or recorded for a certain period of time based on the observation plan, and the number of coughs is counted. The observation cage may be provided with a soundproof sheet at the bottom of the cage so as not to pick up sounds other than coughing.
The specific procedure is shown below, but the procedure is not limited thereto.
(1) Observation procedure A microphone and / or a video camera is installed near the observation cage, and the state of the mice in the cage is recorded one by one a day for a certain period of time. Alternatively, the observation mouse may be moved to a cage equipped with a microphone and / or a video camera at each observation time, or the cage may be moved near the recording device at each observation time.
After shooting, play a recording or video, observe coughing and / or mouse movements, and count the number of coughing attacks.
(2) Observation plan During the observation period, determine the time to start measurement, start recording at the same time every day, and record for a certain period of time, preferably 5 minutes. Specifically, observations should be made from 4 to 6 days after inoculation until the coughing attack disappears or 14 days after inoculation.
本発明は、さらに百日咳モデル動物を用いる、百日咳の予防または治療に用いられる医薬品を評価またはスクリーニングするための方法を提供する。
本発明方法により評価可能な医薬品は、百日咳ワクチンなどの生物由来製剤のほか、様々な物質にも適用することができる。
本発明の医薬品の評価方法を以下に示す。
（百日咳モデル動物を用いた評価方法）
（１）被験物質を投与した百日咳モデル動物を作製する工程
前出の（百日咳モデル動物の作製方法）に従い、百日咳モデル動物を作製し、被験物質を投与する。あるいは、予め被験物質を投与した動物に、（百日咳モデル動物の作製方法）に従い、百日咳菌もしくは百日咳菌体破砕液を接種し、被験物質を投与した百日咳モデル動物を作製する。
被験物質としては、あらゆる公知物質または新規物質を用いることができる。例えば、核酸、糖質、脂質、蛋白質、抗体、ワクチン、ペプチド、有機低分子化合物、有機高分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分などがあげられる。
被験物質の投与量は、用いる被験物質の性質等に応じ、適宜決定される。
被験物質の投与時期は、被験物質の性質等に応じ、百日咳菌もしくは百日咳菌体破砕液の接種前または接種後に投与される。被験物質が、生体の免疫に作用するものである場合には、所望の免疫作用が発現される時間を考慮して、百日咳菌もしくは百日咳菌体破砕液の接種に先立って、投与することができる。
被験物質の投与回数についても、被験物質の性質、予定される用法等に応じ適宜決定される。
被験物質の投与経路については、被験物質の効果が最も発揮される方法、あるいは予定される投与方法に応じ、適宜選択される。投与方法は、被験物質の性質を考慮し、全身投与または局所投与が選択される。
対照として、被験物質のかわりに、被験物質投与の際に用いた溶媒などを投与し、被験物質を投与しない百日咳モデル動物を同様に作製する。
（２）被験物質を投与した百日咳モデル動物における咳発作回数を、被験物質を投与しない百日咳モデル動物（対照群）および／またはネガティブコントロール群における咳発作回数と比較する工程
被験物質の投与あるいは百日咳菌もしくは百日咳菌体破砕液を接種後（百日咳モデル動物の作製方法）の４．咳の評価に従って、一定期間咳発作を観察し、被験物質を投与した百日咳モデル動物における咳発作回数を対照群および／またはネガティブコントロール群と比較し、被験物質の投与により有意に咳発作回数が減少しているかを判定する。
（３）比較工程により得られた結果に基づいて、被験物質の有効性を判定する工程
比較工程（２）により、対照群と比較して有意に被験物質投与群の咳発作が減少している場合に、当該被験物質は、百日咳菌もしくは百日咳菌体破砕液の接種による咳発作を有意に抑制する効果を有すると評価することができるため、当該被験物質を百日咳治療または予防のための医薬品候補物質として選択することができる。
The present invention further provides a method for evaluating or screening a drug used for the prevention or treatment of whooping cough using a whooping cough model animal.
The drug that can be evaluated by the method of the present invention can be applied to various substances as well as biological preparations such as pertussis vaccine.
The evaluation method of the pharmaceutical product of the present invention is shown below.
(Evaluation method using whooping cough model animals)
(1) Step of preparing a whooping cough model animal to which the test substance is administered A whooping cough model animal is prepared and the test substance is administered according to the above-mentioned (method for producing a whooping cough model animal). Alternatively, an animal to which the test substance has been administered in advance is inoculated with Bordetella pertussis or a pertussis cell disruption solution according to (Method for producing a pertussis model animal), and a pertussis model animal to which the test substance has been administered is prepared.
As the test substance, any known substance or a novel substance can be used. For example, nucleic acids, sugars, lipids, proteins, antibodies, vaccines, peptides, organic low molecular weight compounds, organic high molecular weight compounds, compound libraries prepared using combinatorial chemistry technology, solid phase synthesis and phage display methods. Random peptide libraries, or natural components derived from microorganisms, animals and plants, marine organisms, etc. can be mentioned.
The dose of the test substance is appropriately determined according to the properties of the test substance to be used and the like.
The administration time of the test substance depends on the nature of the test substance and the like, and is administered before or after inoculation of Bordetella pertussis or Bordetella pertussis crushed solution. When the test substance acts on the immunity of the living body, it can be administered prior to inoculation of Bordetella pertussis or Bordetella pertussis lysate in consideration of the time when the desired immunity effect is exhibited. ..
The number of administrations of the test substance is also appropriately determined according to the properties of the test substance, the planned usage, and the like.
The administration route of the test substance is appropriately selected according to the method in which the effect of the test substance is most exerted or the planned administration method. As the administration method, systemic administration or topical administration is selected in consideration of the nature of the test substance.
As a control, instead of the test substance, the solvent used for the administration of the test substance or the like is administered, and a pertussis model animal to which the test substance is not administered is similarly prepared.
(2) Step of comparing the number of coughing attacks in the pertussis model animal to which the test substance was administered with the number of coughing attacks in the pertussis model animal (control group) and / or the negative control group to which the test substance was not administered. Alternatively, after inoculating the pertussis cell disruption solution (method for producing a pertussis model animal), 4. According to the cough evaluation, coughing attacks were observed for a certain period of time, and the number of coughing attacks in the pertussis model animal to which the test substance was administered was compared with the control group and / or the negative control group, and the number of coughing attacks was significantly reduced by the administration of the test substance. Determine if you are doing it.
(3) Step to determine the effectiveness of the test substance based on the results obtained in the comparison step By the comparison step (2), the cough attacks in the test substance-administered group are significantly reduced as compared with the control group. In some cases, the test substance can be evaluated to have an effect of significantly suppressing a cough attack caused by inoculation with Bordetella pertussis or Bordetella pertussis crushed solution. Therefore, the test substance is a drug candidate for treating or preventing pertussis. Can be selected as a substance.
本発明の百日咳モデル動物を用いた評価方法は、百日咳ワクチンの評価に用いることができる。以下に具体的に説明する。
（百日咳ワクチンの評価方法）
（１）百日咳ワクチンを投与した動物を作製する工程
本発明の評価方法により評価可能な百日咳ワクチンは、単一の百日咳ワクチン、または百日咳ワクチンを含む混合ワクチンがあげられる。百日咳ワクチンは、全菌体ワクチン、あるいは無細胞ワクチン（acellular vaccine）であってもよく、ワクチン成分として、百日咳毒素（pertussis toxin, PT）および繊維状赤血球凝集素（filamentous hemagglutinin, FHA）の他、繊毛、外膜たん白（69KD抗原）などを含んでいても良い。
ここで、百日咳ワクチンを含む混合ワクチンは、百日咳菌以外のウイルスまたは菌に対する免疫原性成分を含む。具体的には、ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドを含むDPT、あるいは、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイドおよび不活化セービン株ポリオウイルスを含むDPT-IPVなどが挙げられる。
本発明の評価方法で用いられる百日咳ワクチンの投与量は百日咳ワクチンの力価に応じて決定され、高用量群または低用量群などの複数の用量群を設定し、各群ごとに投与してもよい。
本発明の評価方法で用いられる百日咳ワクチンの投与時期は、百日咳ワクチンによる免疫獲得に必要な期間を考慮して決定することができる。通常、百日咳菌もしくは百日咳菌体破砕液接種の3-4週間前、好ましくは4週間前である。
本発明の評価方法で用いられる百日咳ワクチンの投与回数は、好ましくは百日咳菌感染までの間に1〜2回である。
投与方法は、ワクチン投与により免疫が獲得できる方法であれば、全身投与でも局所投与でもよく、通常、予定されるワクチンの用法に応じて決定される。局所投与の場合、腹腔内投与が好ましい。
百日咳ワクチンによる免疫獲得に必要な期間経過後、百日咳ワクチンを投与した動物群および百日咳ワクチンを投与しない群（対照群）に百日咳菌もしくは百日咳菌体破砕液を接種し、（百日咳モデル動物の作製方法）の４．咳の評価に従って、咳発作を観察する。
（２）百日咳ワクチンを投与した百日咳モデル動物における咳発作回数を、対照群および／またはネガティブコントロール群における咳発作回数と比較する工程
ワクチンを投与した百日咳菌接種動物における咳発作を対照群等と比較し、有意に咳発作回数が減少しているかを判定する。
（３）比較工程により得られた結果に基づいて、百日咳ワクチンの有効性を判定する工程
比較工程（２）により、対照群と比較して有意に被験物質投与群の咳発作回数が減少している場合に、当該百日咳ワクチンは、充分な力価を有すると評価することができる。
The evaluation method using the pertussis model animal of the present invention can be used for evaluation of the pertussis vaccine. This will be described in detail below.
(Evaluation method of pertussis vaccine)
(1) Step of producing an animal to which the pertussis vaccine has been administered Examples of the pertussis vaccine that can be evaluated by the evaluation method of the present invention include a single pertussis vaccine or a combination vaccine containing the pertussis vaccine. The pertussis vaccine may be a whole cell vaccine or an acellular vaccine, and the vaccine components include pertussis toxin (PT), filamentous hemagglutinin (FHA), and others. It may contain ciliary hair, outer membrane protein (69KD antigen), and the like.
Here, the combination vaccine including the pertussis vaccine contains an immunogenic component against a virus or fungus other than Bordetella pertussis. Specific examples thereof include DPT containing diphtheria toxoid and tetanus toxoid, and DPT-IPV containing diphtheria toxoid, tetanus toxoid and inactivated Sabin strain poliovirus.
The dose of the pertussis vaccine used in the evaluation method of the present invention is determined according to the titer of the pertussis vaccine, and even if a plurality of dose groups such as a high dose group or a low dose group are set and administered individually. Good.
The administration time of the pertussis vaccine used in the evaluation method of the present invention can be determined in consideration of the period required for immunity acquisition by the pertussis vaccine. It is usually 3-4 weeks, preferably 4 weeks before inoculation of Bordetella pertussis or Bordetella pertussis crushed solution.
The frequency of administration of the pertussis vaccine used in the evaluation method of the present invention is preferably 1 to 2 times before infection with Bordetella pertussis.
The administration method may be systemic administration or topical administration as long as immunity can be obtained by vaccination, and is usually determined according to the planned usage of the vaccine. In the case of topical administration, intraperitoneal administration is preferable.
After the period required to acquire immunity with the pertussis vaccine, the group of animals to which the pertussis vaccine was administered and the group to which the pertussis vaccine was not administered (control group) were inoculated with pertussis or pertussis cell disruption solution (method for producing a pertussis model animal). ) 4. Observe cough attacks according to the cough assessment.
(2) Step of comparing the number of coughing attacks in the pertussis model animal to which the pertussis vaccine was administered with the number of coughing attacks in the control group and / or the negative control group. And determine if the number of coughing attacks is significantly reduced.
(3) A step of determining the effectiveness of the pertussis vaccine based on the results obtained in the comparison step. In the comparison step (2), the number of cough attacks in the test substance-administered group was significantly reduced as compared with the control group. If so, the pertussis vaccine can be evaluated as having sufficient titer.
本発明は、さらに百日咳菌の咳発作誘発因子の特定方法に関する。
本発明の百日咳菌の咳発作誘発因子の特定方法は、百日咳菌Bp 18323株の特定の機能もしくは構造的因子をコードする遺伝子を欠損、またはその発現を抑制するよう改変し、改変した百日咳菌Bp 18323株を用いてC57BL/6系統のマウスに感染させ、（百日咳モデル動物を用いた評価方法）に従い咳発作回数を評価し、どの遺伝子が咳発作の発現に影響を及ぼすのかを検討する。本発明の特定方法により、百日咳菌による咳発作を誘発する因子を特定することができる。
以下に、具体的に説明する。
（百日咳菌の咳発作誘発因子の特定方法）
（１）百日咳菌Bp 18323株の１つの機能もしくは構造的因子をコードする遺伝子を欠損または発現を抑制するよう改変した百日咳菌Bp 18323株を作製する工程
ここで、機能もしくは構造的因子とは、PT、FHA、易熱性皮膚壊死毒素、アデニル酸シクラーゼ、線毛、外膜たん白（69KD抗原）などが挙げられる。
機能もしくは構造的因子をコードする遺伝子を欠損または発現を抑制するよう改変した百日咳菌Bp 18323株は、例えば、EP 0,322,115、US 275,376や特許第2655583号に記載の方法など、公知の方法を用いて作製することができる。
具体的には、百日咳菌の機能もしくは構造的因子をコードする遺伝子を破壊したり、除去したりすることにより完全なmRNAを産生不能にする。機能もしくは構造的因子をコードする遺伝子を欠損させる具体的な手段としては、対象の遺伝子(ゲノムDNA)を常法に従って単離し、例えば、(1)そのコード領域(cds)やプロモーター領域に他のDNA断片(例えば、薬剤耐性遺伝子やレポーター遺伝子等)を挿入することによりcdsもしくはプロモーターの機能を破壊する方法、(2)当該遺伝子の全部または一部を切り出して該遺伝子を欠失させる (例えば、薬剤耐性遺伝子やレポーター遺伝子等で置換する)方法、(3)cds内に終止コドンを挿入して完全な蛋白質の翻訳を不能にする方法、(4)転写領域内部へ遺伝子の転写を終結させるDNA配列 (ターミネーター配列)を挿入して、完全なmRNAの合成を不能にする方法、あるいは(5)cds内の酵素活性に関わるアミノ酸を任意のアミノ酸に置換し、酵素活性を不活化する方法などによって、結果的に遺伝子を不活性化するように構築したDNA配列を有するDNA鎖 (以下、ターゲッティングベクターと略記する)を、相同組換えにより百日咳菌の当該機能を担う遺伝子座に組み込ませる方法などが用いられ得る。好ましくは、薬剤耐性遺伝子をcds内に挿入して対象の遺伝子を破壊する方法、または対象遺伝子の全部もしくは一部を薬剤耐性遺伝子で置換除去する方法が挙げられる。特に好ましくは、対象遺伝子の大部分を除去し、薬剤耐性遺伝子で置換する方法が挙げられる。
薬剤耐性遺伝子としては、カナマイシン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子などを用いることができる。これらの遺伝子は、上記プラスミドから適当な制限酵素により切り出すこともできるし、あるいは上記プラスミドを鋳型として、これらの遺伝子の上下流域の配列をプライマーに用い、PCR法により増幅してもよい。
（２）前記（１）の工程により得られた改変した百日咳菌Bp 18323株またはその菌体破砕液をC57BL/6マウスに投与する工程
前出の（百日咳モデル動物の作製方法）にしたがって、改変した百日咳菌Bp 18323株またはその菌体破砕液をC57BL/6マウスに投与する（改変群）。
対照として、改変した百日咳菌Bp 18323株またはその菌体破砕液のかわりに、それに用いた溶媒のみをC57BL/6マウスに投与する（溶媒接種群）。必要に応じ、改変しない百日咳菌Bp 18323株またはその菌体破砕液をC57BL/6マウスに投与する（ポジティブコントロール群）。
（３）前記（２）のマウスにおける咳発作回数を比較する工程
前出の（百日咳モデル動物を用いた評価方法）にしたがって、改変群、溶媒接種群、必要に応じポジティブコントロール群の咳発作回数を比較する。
（４）百日咳菌の咳発作誘発因子を特定する工程
咳発作回数に関し、溶媒投与群と比較し有意な差が見られなかった改変群、もしくはポジティブコントロール群と比較して有意に少なかった改変群の機能もしくは構造的因子が、咳発作の誘発因子であると特定できる。百日咳菌経鼻投与工程に限り、マウス気道への百日咳菌の定着菌数がポジティブコントロール群と比較して大きな差がない場合のみを適応改変群とする。
The present invention further relates to a method for identifying a cough attack-inducing factor of Bordetella pertussis.
In the method for identifying a cough attack-inducing factor of Bordetella pertussis of the present invention, a gene encoding a specific functional or structural factor of
The details will be described below.
(Method of identifying the cough attack inducer of Bordetella pertussis)
(1) Step of producing
Specifically, it renders complete mRNA incapable of producing by disrupting or eliminating genes encoding the functional or structural factors of Bordetella pertussis. As a specific means for deleting a gene encoding a functional or structural factor, the gene of interest (genomic DNA) is isolated according to a conventional method, and for example, (1) other coding regions (cds) or promoter regions are used. A method of disrupting the function of cds or promoter by inserting a DNA fragment (for example, drug resistance gene or reporter gene), (2) cutting out all or part of the gene and deleting the gene (for example, (Replace with drug resistance gene, reporter gene, etc.), (3) Insert termination codon in cds to disable complete protein translation, (4) DNA that terminates gene transcription into the transcription region By inserting a sequence (terminator sequence) to disable the synthesis of complete mRNA, or (5) replacing the amino acid involved in the enzymatic activity in cds with an arbitrary amino acid and inactivating the enzymatic activity, etc. As a result, a method of incorporating a DNA strand having a DNA sequence constructed so as to inactivate a gene (hereinafter abbreviated as a targeting vector) into a locus responsible for the function of pertussis by homologous recombination, etc. Can be used. Preferably, a method of inserting the drug resistance gene into cds to destroy the target gene, or a method of replacing all or a part of the target gene with the drug resistance gene can be mentioned. Particularly preferred is a method of removing most of the target gene and replacing it with a drug resistance gene.
As the drug resistance gene, a canamycin resistance gene, a streptomycin resistance gene, a spectinomycin resistance gene, a gentamicin resistance gene, a chloramphenicol resistance gene, an erythromycin resistance gene and the like can be used. These genes can be excised from the above-mentioned plasmid with an appropriate restriction enzyme, or can be amplified by the PCR method using the above-mentioned plasmid as a template and the sequences in the upstream and downstream regions of these genes as primers.
(2) Step of administering the modified
As a control, instead of the modified
(3) Step of comparing the number of coughing attacks in the mouse of the above (2) According to the above-mentioned (evaluation method using a whooping cough model animal), the number of coughing attacks in the modified group, the solvent inoculation group, and if necessary, the positive control group. To compare.
(4) Step to identify the cough attack-inducing factor of Bordetella pertussis The modified group in which the number of cough attacks was not significantly different from that in the solvent-administered group, or the modified group in which the number of cough attacks was significantly smaller than that in the positive control group. Functional or structural factors can be identified as inducing factors for coughing attacks. Only in the step of nasal administration of B. pertussis, the adaptive modification group is defined only when the number of B. pertussis colonized in the mouse respiratory tract is not significantly different from that of the positive control group.
本発明の別の態様は、本発明の百日咳モデル動物を用いた百日咳の予防または治療用医薬品の製造方法に関するものである。
本発明の製造方法により得られる医薬品は、百日咳モデル動物を用いスクリーニングする工程により選択された、公知物質または新規物質を有効成分として含有する医薬品である。
以下に、具体的に説明する。
（医薬品の製造方法）
（１）百日咳モデル動物を用い化合物をスクリーニングする工程
前出の（百日咳モデル動物を用いた評価方法）に従い、咳発作を有意に抑制する化合物を選択する。スクリーニングに供される化合物としては、例えば、核酸、糖質、脂質、蛋白質、抗体、ワクチン、ペプチド、有機低分子化合物、有機高分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分などがあげられる。
（２）上記（１）により得られた化合物に製薬学的に許容される担体を加える工程
「製薬学的に許容される担体」としては特に制限されることなく、公知の製剤学的方法に用いられる物質の中から適宜選択することができる。例えば、滅菌水や生理食塩水、植物油、溶剤、基剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、芳香剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤、希釈剤、等張化剤、無痛化剤、増量剤、崩壊剤、緩衝剤、コーティング剤、滑沢剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等が挙げられるが、これらに制限されない。
本発明の製造方法により得られる医薬品は、例えば、特に、局所、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内または皮内経路により投与することができる。
経口投与の剤型としては、散剤、細粒剤、顆粒、錠剤、カプセル剤が好ましく、常法により製造することができる。局所投与の剤型としては、注射剤、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、眼軟膏剤、点眼剤、点耳剤、うがい薬、およびエアロゾルの形態としてもよく、例えば、保存剤、薬剤浸透を促進する溶剤、および軟膏およびクリームでの軟化剤を含む適当な慣用的添加物を含んでよい。
本発明の製造方法により得られる医薬品の投与量は、投与対象者の年齢、体重など種々の条件に応じて適宜選択することができるが、活性成分の1日投与量が、0.001mg/kgないし1g/kg、好ましくは0.1mg/kgないし100mg/kgの範囲で用いられる。
Another aspect of the present invention relates to a method for producing a drug for preventing or treating whooping cough using the pertussis model animal of the present invention.
The drug obtained by the production method of the present invention is a drug containing a known substance or a novel substance as an active ingredient selected by the step of screening using a whooping cough model animal.
The details will be described below.
(Manufacturing method of pharmaceutical products)
(1) Step of screening a compound using a whooping cough model animal A compound that significantly suppresses a cough attack is selected according to the above-mentioned (evaluation method using a whooping cough model animal). Compounds used for screening include, for example, nucleic acids, sugars, lipids, proteins, antibodies, vaccines, peptides, organic low molecular weight compounds, organic high molecular weight compounds, compound libraries prepared using combinatorial chemistry technology, and solid phases. Examples include a random peptide library prepared by phase synthesis or a phage display method, or natural components derived from microorganisms, animals and plants, marine organisms, and the like.
(2) Step of adding a pharmaceutically acceptable carrier to the compound obtained in (1) above The "pharmaceutically acceptable carrier" is not particularly limited, and can be applied to a known pharmaceutical method. It can be appropriately selected from the substances used. For example, sterile water, saline, vegetable oils, solvents, bases, emulsifiers, suspensions, surfactants, stabilizers, flavors, fragrances, excipients, vehicles, preservatives, binders, diluents, etc. Isotonic agents, soothing agents, bulking agents, disintegrants, buffers, coatings, lubricants, colorants, sweeteners, thickeners, flavoring agents, solubilizers or other additives. However, it is not limited to these.
The pharmaceutical product obtained by the production method of the present invention can be administered, for example, by a topical, oral, intravenous, intraperitoneal, intramuscular, subcutaneous, intranasal or intradermal route.
As the dosage form for oral administration, powders, fine granules, granules, tablets, and capsules are preferable, and they can be produced by a conventional method. Dosage forms for topical administration may be in the form of injections, ointments, creams, lotions, eye ointments, eye drops, ear drops, mouthwashes, and aerosols, such as preservatives and drug penetrations. It may contain an accelerating solvent and suitable conventional additives, including softeners in ointments and creams.
The dose of the drug obtained by the production method of the present invention can be appropriately selected according to various conditions such as the age and body weight of the subject to be administered, and the daily dose of the active ingredient is 0.001 mg / kg or more. It is used in the range of 1 g / kg, preferably 0.1 mg / kg to 100 mg / kg.
本発明の更なる態様は、百日咳ワクチンの製造方法に関するものである。
本発明の製造方法により得られる百日咳ワクチンは、百日咳菌の防御抗原のみを含む百日咳単独ワクチン、百日咳菌の防御抗原のほかに、他の免疫原性成分等を含む混合ワクチンが含まれる。
以下に具体的に説明する。
（百日咳ワクチンの製造方法）
（１）百日咳菌の防御抗原を製造する工程
百日咳菌の防御抗原は、公知の方法、例えばWO 2008/044611の実施例５に記載の方法により製造することができる。具体的には、百日咳菌の防御抗原は、例えば、百日咳菌Ｉ相菌（東浜株）の培養液を硫安分画法・蔗糖密度勾配遠心分画法などの物理化学的方法で感染防御抗原画分を抽出・分離・精製したのち、残存する毒性をホルマリンで減毒することによって得ることもできる。
百日咳菌の防御抗原には、PT、FHA、外膜たん白（69KD抗原）、線毛（FB抗原、凝集原(FGG)とも呼ばれる）が含まれる。百日咳菌の防御抗原としては、必ずしも上記各抗原の全てを含んでいる必要はなく、これらの抗原のうち１種以上、好ましくは２種以上、より好ましくは３種以上を含んでいてもよい。
（２）百日咳菌の防御抗原の効力を測定する工程
上記（１）の工程により得られた百日咳菌の防御抗原を前出の（百日咳ワクチンの評価方法）に準じて、百日咳菌Bp 18323株、もしくは百日咳菌Bp 18323株の菌体破砕液を接種したマウスを用いて百日咳菌の防御抗原の効力を測定する。
具体的には、以下の工程を含む。
ｉ）C57BL/6マウスに百日咳菌の防御抗原を投与する工程
ｉｉａ）前記百日咳菌の防御抗原を投与したマウス、および前記百日咳菌の防御抗原を投与しないC57BL/6マウスに、百日咳菌Bp 18323株、もしくは百日咳菌Bp 18323株の菌体破砕液を接種する工程、あるいは、
ｉｉｂ）前記百日咳菌の防御抗原を投与したマウス、および標準品や参照品となる百日咳ワクチンを投与したC57BL/6マウスに、百日咳菌Bp 18323株、もしくは百日咳菌Bp 18323株の菌体破砕液を接種する工程
ｉｉｉａ）前記百日咳菌の防御抗原を投与したマウスにおける咳発作回数を、前記百日咳菌の防御抗原を投与しないマウス（対照群）および／またはネガティブコントロール群における咳発作回数と比較する工程、あるいは、
ｉｉｉｂ）前記百日咳菌の防御抗原を投与したマウスにおける咳発作回数を、標準品や参照品となる百日咳ワクチンを投与したマウスにおける咳発作回数と比較する工程、および、
ｉｖ）前記ｉｉｉａ）またはｉｉｉｂ）の工程により得られた結果に基づいて、前記百日咳菌の防御抗原の効果を評価する工程。
ここで、標準品となる百日咳ワクチンとしては、国際標準品または国内標準品を用いることができる。国際標準品とは国際単位（IU/mL）が定められたものをいい、国内標準品は対応する国際標準品がある場合は、それの区分に一致させたもの、対応する国際品のない場合は独立の国内単位を定めたものである。参照品としては、既にワクチンの効力が明らかとなっているワクチンを用いることができ、既に市販されている百日咳ワクチンが挙げられる。
（３）単位用量製剤に製剤化する工程
上記（２）の工程により測定された、所定の効力を有する百日咳菌の防御抗原に、適宜製薬学的に許容される担体および／または所望により他の免疫原性成分等と混合し、単位用量製剤を製造する。あるいは、単位用量製剤に製剤化してから上記（２）の工程を行っても良い。
製薬学的に許容される担体は、（医薬品の製造方法）の（２）に記載の通りである。
他の免疫原性成分としては、百日咳菌以外の免疫原性成分が挙げられる。そのような免疫原性成分としては、例えば、百日咳菌以外のウイルスまたは菌に対する免疫原性成分が挙げられる。免疫原性成分としては、例えば、トキソイド、弱毒化ウイルス、不活化ウイルス、タンパク質、ペプチド、ポリサッカライド、リポポリサッカライド、リポペプチド、またはこれらの組み合わせなどが挙げられる。百日咳菌以外のウイルスまたは菌としては、例えば、ポリオウイルス、ジフテリア菌、破傷風菌、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、耳下腺炎ウイルス、風疹ウイルス、ヘルペスウイルス、水疱瘡ウイルス、狂犬病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、肝炎ウイルス、肺炎双球菌、髄膜炎菌、チフス菌、インフルエンザｂ菌などが挙げられる。好ましくは、不活化セービン株ポリオウイルス、ジフテリアトキソイド、または破傷風トキソイドである。
本発明の製造方法により得られるワクチンとしては、百日咳菌の防御抗原の他に、ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドを含むDPT、あるいは、百日咳菌の防御抗原に、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイドおよび不活化セービン株ポリオウイルスを含むDPT-IPVなどの2価以上の混合ワクチンが好ましい。
本発明の製造方法により得られる百日咳ワクチンは、１つの製剤中に１回分の投与量を含有する製剤であり、アンプルやシリンジなどが典型的な形態である。
本発明の製造方法により得られる百日咳ワクチンは、常套手段に従って、注射剤として製剤化することができる。注射剤は、自体公知の方法に従って、例えば、上記物質を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられる。調製された注射液は、通常、適当なアンプル、シリンジなどに充填される。
本発明の製造方法により得られる百日咳ワクチンは、必要に応じて、保存剤、抗酸化剤、キレート剤などの製剤添加剤を含有していてもよい。保存剤としては、例えば、チメロサール、２−フェノキシエタノールなどが挙げられる。キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸、グリコールエーテルジアミン四酢酸などが挙げられる。
本発明の製造方法により得られる百日咳ワクチンは、さらにアジュバントを含有していてもよい。アジュバント化剤としては、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、塩化アルミニウムなどが挙げられる。
本発明の製造方法により得られる百日咳ワクチンは、例えば、皮下注射もしくは筋肉注射によって、好ましくは皮下注射によって、非経口的に投与することができる。
本発明の製造方法により得られる百日咳ワクチンの１回投与量は、投与対象者の年齢、体重など種々の条件に応じて適宜選択することができる。通常、単位製剤中の百日咳菌の防御抗原は4国際単位以上含む。他の免疫原性成分を含む混合ワクチンの単位製剤中には、ジフテリアトキソイドを約15Lf、破傷風トキソイドを約2.5Lf、不活化セービンＩ型ポリオウイルスをＤ抗原として約2〜4単位（好ましくは約3単位）、不活化セービンＩＩ型ポリオウイルスをＤ抗原として約80〜120単位（好ましくは約100単位）、不活化セービンＩＩＩ型ポリオウイルスをＤ抗原として約80〜120単位（好ましくは約100単位）含有していてもよい。
本発明の製造方法により得られる百日咳ワクチンの投与回数は、例えば、初回免疫として、3〜8週の間隔で、2〜3回投与してもよい。初回免疫として本発明の百日咳ワクチンを2回投与した場合には、さらに3〜8週の間隔で1回投与するのが好ましい。追加免疫として、初回免疫後6ヶ月以上の間隔をおいて（例えば、初回免疫終了後12ヶ月から18ヶ月までの間に）、さらに1回投与してもよい。
A further aspect of the present invention relates to a method for producing a pertussis vaccine.
The pertussis vaccine obtained by the production method of the present invention includes a pertussis alone vaccine containing only a protective antigen of Bordetella pertussis, a combined vaccine containing a protective antigen of Bordetella pertussis, and other immunogenic components.
This will be described in detail below.
(Manufacturing method of pertussis vaccine)
(1) Step of producing a protective antigen of Bordetella pertussis The protective antigen of Bordetella pertussis can be produced by a known method, for example, the method described in Example 5 of WO 2008/044611. Specifically, the protective antigen of Bordetella pertussis is, for example, an infection protective antigen image of a culture solution of Bordetella pertussis I phase (Higashihama strain) by a physicochemical method such as a sulfuric acid fractionation method or a sucrose density gradient centrifugation method. It can also be obtained by extracting, separating and purifying the portion, and then detoxifying the remaining toxicity with formalin.
Protective antigens for Bordetella pertussis include PT, FHA, adventitial protein (69KD antigen), and pili (also called FB antigen, agglutinogen (FGG)). The protective antigen for Bordetella pertussis does not necessarily include all of the above antigens, and may contain one or more, preferably two or more, and more preferably three or more of these antigens.
(2) Step of measuring the efficacy of the protective antigen of Bordetella pertussis The protective antigen of Bordetella pertussis obtained by the above step (1) is used according to the above-mentioned (Evaluation method of pertussis vaccine),
Specifically, the following steps are included.
i) Step of administering Bordetella pertussis protective antigen to C57BL / 6 mice ia)
iib)
iii) A step of comparing the number of coughing attacks in mice administered with the protective antigen against Bordetella pertussis to the number of coughing attacks in mice administered with a standard or reference pertussis vaccine, and
iv) A step of evaluating the effect of the protective antigen of Bordetella pertussis based on the result obtained by the step of iii) or iii).
Here, as the standard product of pertussis vaccine, an international standard product or a domestic standard product can be used. An international standard product is a product with an international unit (IU / mL), and a domestic standard product is a product that matches the classification of the corresponding international standard product, or if there is no corresponding international product. Defines an independent domestic unit. As a reference product, a vaccine whose efficacy has already been clarified can be used, and examples thereof include a pertussis vaccine already on the market.
(3) Step of formulating into a unit-dose formulation The protective antigen of Bordetella pertussis, which has a predetermined efficacy, measured by the step of (2) above, is appropriately pharmaceutically acceptable carrier and / or other, if desired. A unit dose preparation is produced by mixing with immunogenic components and the like. Alternatively, the step (2) above may be performed after formulation into a unit dose formulation.
The pharmaceutically acceptable carrier is as described in (2) of (Pharmaceutical manufacturing method).
Other immunogenic components include immunogenic components other than Bordetella pertussis. Examples of such immunogenic components include immunogenic components against viruses or fungi other than Bordetella pertussis. Immunogenic components include, for example, toxoids, attenuated viruses, inactivated viruses, proteins, peptides, polypeptides, lipopolysaccharides, lipopeptides, or combinations thereof. Viruses or fungi other than pertussis include, for example, poliovirus, diphtheria, tetanus, influenza virus, measles virus, parotid inflammation virus, rash virus, herpesvirus, vesicular virus, mad dog disease virus, human immunodeficiency virus, etc. Hepatitis virus, pneumonia diplococcus, meningitis, typhoid, influenza b and the like can be mentioned. Preferably, it is an inactivated Sabin strain poliovirus, diphtheria toxoid, or tetanus toxoid.
The vaccine obtained by the production method of the present invention includes DPT containing diphtheria toxoid and tetanus toxoid in addition to the protective antigen of pertussis, or diphtheria toxoid, tetanus toxoid and inactivated Sabin strain polio as the protective antigen of pertussis. A divalent or higher valent combination vaccine such as DPT-IPV containing a virus is preferable.
The pertussis vaccine obtained by the production method of the present invention is a preparation containing a single dose in one preparation, and an ampoule, a syringe, or the like is a typical form.
The pertussis vaccine obtained by the production method of the present invention can be formulated as an injection according to conventional means. Injections are prepared according to methods known per se, for example, by dissolving, suspending or emulsifying the above substances in sterile aqueous or oily solutions commonly used in injections. As the aqueous solution for injection, for example, physiological saline, an isotonic solution containing glucose and other auxiliary agents, and the like are used. The prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule, syringe, or the like.
The pertussis vaccine obtained by the production method of the present invention may contain a pharmaceutical additive such as a preservative, an antioxidant, and a chelating agent, if necessary. Examples of the preservative include thimerosal, 2-phenoxyethanol and the like. Examples of the chelating agent include ethylenediaminetetraacetic acid and glycol ether diaminetetraacetic acid.
The pertussis vaccine obtained by the production method of the present invention may further contain an adjuvant. Examples of the adjuvant include aluminum hydroxide, aluminum phosphate, aluminum chloride and the like.
The pertussis vaccine obtained by the production method of the present invention can be administered parenterally, for example, by subcutaneous injection or intramuscular injection, preferably by subcutaneous injection.
The single dose of the pertussis vaccine obtained by the production method of the present invention can be appropriately selected according to various conditions such as the age and body weight of the subject to be administered. Usually, the protective antigen of B. pertussis in the unit preparation contains 4 international units or more. In the unit formulation of the combination vaccine containing other immunogenic components, about 15 Lf of diphtheria toxoid, about 2.5 Lf of tetanus toxoid, and about 2 to 4 units of inactivated Sabin type I poliovirus as D antigen (preferably about about). About 80 to 120 units (preferably about 100 units) with inactivated Sabin type II poliovirus as D antigen, about 80 to 120 units (preferably about 100 units) with inactivated Sabin type III poliovirus as D antigen. ) May be contained.
The number of administrations of the pertussis vaccine obtained by the production method of the present invention may be, for example, 2 to 3 times at intervals of 3 to 8 weeks as the initial immunization. When the pertussis vaccine of the present invention is administered twice as the initial immunization, it is preferable to administer it once at intervals of 3 to 8 weeks. As booster immunization, a single dose may be administered at intervals of 6 months or more after the initial immunization (for example, between 12 months and 18 months after the end of the initial immunization).
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、これは一例であり、本発明はこれらの具体例に限定されるものではない。
実施例１（C57BL/6Jマウスを用いた百日咳モデル動物の作製）
（１）百日咳菌感染モデル動物の作製
7週齢の雄のC57BL/6Jマウス（入手先：日本クレア株式会社、9匹数/群）に、0.5〜2×10８cfu/mlの百日咳菌（Bp 18323株、入手先：大阪大学）を含む菌液（組成：Stainer-Scholte（SS）液体培地〔Stainer, D. W., Scholte, M. J., J. Gen. Microbiol., 63, 211-220(1971)〕）を調製し、麻酔下で、注射針を用いてマウスの鼻腔内に50μl接種した。対照群(5匹数/群)として、百日咳菌を含まない溶媒（組成：SS液体培地、量50μl）を、麻酔下で、同様に接種した。
接種後、マウスを個別に観察用ケージに入れ、通常の飼育下で飼育した。
（２）咳発作の観察
観察手順に従いケージ内のマウスの様子を1日一匹当たり5分間撮影した。撮影した動画の再生によりマウスの動作および咳発作の音から咳発作症状を判別し、咳発作の回数を計測した。
咳発作は、感染後6日目から生じた。接種時を0日として経過日数と咳発作の回数をグラフ化した（図１のＡ）。実施例１の（１）で得られた感染動物の感染後6〜14日における45分間の咳発作の回数は、非感染動物と比較して有意に増加した（図１のＢ）。
＜観察手順＞
観察用ケージのそばに、マイクロホン接続ビデオカメラを設置し、ケージ内のマウスの様子を1日当たり5分間／匹記録する。観察は、接種後6日目から14日目まで行う。
撮影後、動画編集ソフトウェア（製品名：Adobe Premiere Pro、入手先：Adobe）で再生し、咳音とマウス動作を見て咳発作の回数を計測する。
（３）菌体定着確認試験
百日咳菌経鼻接種後6日目から14日目までの観察期間中、百日咳菌接種群の気道および肺へ菌体がどの程度定着しているかを確認するために定着菌体数確認試験を行った。
気道および肺への定着菌体数確認試験は、以下の手順で行った。
百日咳菌経鼻接種マウスより気道および肺を摘出後、各組織を均質化する。均質化液を任意の希釈倍率に希釈後、Bordet-Gengou血液寒天培地（極東製薬工業株式会社製）に播種し、37度で3-4日間培養する。形成されたコロニー数をカウントし、各組織に定着した菌体数を算出する。
結果を図１のＣおよびＤに示す。この結果から、気道および肺において十分な定着菌体数が確認できた。
Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to Examples, but this is an example, and the present invention is not limited to these specific examples.
Example 1 (Preparation of a whooping cough model animal using C57BL / 6J mice)
(1) Preparation of Bordetella pertussis infection model animal
7-week-old male C57BL / 6J mice (obtained from: CLEA Japan, nine speed / group), 0.5~2 × 10 8 cfu / ml of B. pertussis (
After inoculation, the mice were individually placed in observation cages and bred in normal captivity.
(2) Observation of cough attacks The state of the mice in the cage was photographed for 5 minutes per day according to the observation procedure. The cough attack symptoms were discriminated from the movement of the mouse and the sound of the cough attack by playing back the captured video, and the number of cough attacks was measured.
Cough attacks began 6 days after infection. The number of days elapsed and the number of coughing attacks were graphed with the time of inoculation as 0 days (A in FIG. 1). The number of 45-minute cough attacks in the infected animal obtained in Example 1 (1) 6 to 14 days after infection was significantly increased as compared with the non-infected animal (B in FIG. 1).
<Observation procedure>
A microphone-connected video camera is installed near the observation cage, and the state of the mice in the cage is recorded for 5 minutes / animal per day. Observation will be performed from the 6th to the 14th day after inoculation.
After shooting, play it with video editing software (product name: Adobe Premiere Pro, source: Adobe) and count the number of coughing attacks by watching the coughing sound and mouse movement.
(3) B. Pertussis colonization confirmation test To confirm the extent of bacterial cell colonization in the respiratory tract and lungs of the B. pertussis inoculated group during the observation period from the 6th to the 14th day after the nasal inoculation of B. pertussis. A colonization cell count confirmation test was conducted.
The test for confirming the number of colonized cells in the respiratory tract and lung was performed according to the following procedure.
After removing the airways and lungs from mice nasally inoculated with Bordetella pertussis, each tissue is homogenized. After diluting the homogenized solution to an arbitrary dilution ratio, seed it on Bordet-Gengou blood agar medium (manufactured by Far East Pharmaceutical Co., Ltd.) and incubate at 37 ° C for 3-4 days. The number of colonies formed is counted, and the number of bacterial cells colonized in each tissue is calculated.
The results are shown in C and D of FIG. From this result, a sufficient number of colonized cells could be confirmed in the respiratory tract and lungs.
比較例（各種条件により作製した百日咳菌経鼻接種による百日咳モデル動物の咳発作）
（１）種々の百日咳菌感染C57BL/6Jマウスの作製および咳発作評価
種々の百日咳菌株（BP140, BP141, BP142, BP144）(入手先：国立感染症研究所)およびTohama I株（入手先：大阪大学）を用い、実施例１と同様に百日咳菌感染C57BL/6マウスを作製し、一定時間の咳発作の回数をカウントした（図２のＡ）後、咳発作回数を解析し、菌株毎の比較を行った（図２のＢ）。また、気道およびへ肺の定着菌体数確認試験（図２のＣおよびＤ）を行った。
その結果、臨床分離株を感染させたマウスは、気道および肺において、いずれの臨床分離株も充分な菌数が定着していた。一方、咳発作の回数は非感染群と比較し有意な臨床分離株もみられたが、いずれもBp 18323株感染群より少なかった。Tohama I株感染C57BL/6マウスでは咳発作が認められなかった。
（２）百日咳菌Bp 18323株感染Balb/cマウスの作製および咳発作評価
7週齢のBalb/cマウス（入手先：日本エスエルシー、匹数：3匹/群）を用い実施例１と同様にBp 18323株を接種し、Bp 18323株感染Balb/cマウスを作製し、咳発作を観察（図３のＡ）し、実施例１において作製したBp 18323株感染C57BL/6マウスの咳発作と比較した（図３のＢ）。また、気道および肺への定着菌体数確認試験（図３のＣおよびＤ）を行った。
その結果、Bp 18323株はBalb/cマウスの肺および気道に、充分な菌数が定着しているにもかかわらず、咳発作の回数は非感染群と比較し有意ではなかった。
（３）百日咳菌Bp 18323 PT遺伝子欠損変異株感染C57BL/6Jマウスの作製および咳発作評価
Bp 18323株を基に作製したBp 18323 PT遺伝子欠損変異株を用い、実施例１と同様に百日咳菌感染C57BL/6マウスを作製し、一定時間の咳発作の回数をカウントした（図４のＡ）後、咳発作回数を解析し、菌株毎の比較を行った（図４のＢ）。また、気道およびへ肺の定着菌体数確認試験（図４のＣおよびＤ）を行った。
その結果、咳発作の回数はBp 18323株感染群と比較し、Bp 18323 PT遺伝子欠損変異株感染群では有意に減少した。一方、Bp 18323 PT遺伝子欠損変異株を感染させたマウスは、気道および肺において、充分な菌数が定着していたものの、百日咳菌Bp 18323と比較すると各組織への定着菌体数は有意に減少していた。
＜Bp 18323 PT遺伝子欠損変異株作製方法＞
Bp 18323遺伝子欠損変異株をNisikawa S et al, Microbiol Immunol 60 : 93-105, 2016に記載の方法を改変して作製した。以下使用したプライマーの入手先はInvitrogenである。S1からS5までのPT遺伝子オペロンの5'末端および3'-末端から約1000bpまでの領域(PT-UおよびPT-D)を、Bp 18323株のゲノムDNAをテンプレートとしてプライマーPT-U-F（gatccgagctctcccaacccgtcgtggtgcagaa；配列番号：１）とPT-U-R（ttagcttccttagctagtgcaacgccatcccgtc；配列番号：２）、およびPT-D-F（cgcgccatttaaatggcgtcgatatgctgagcc；配列番号：３）とPT-D-R（ttagcttccttagctagtgcaacgcatcccgtc；配列番号：４）を用いてPCRにて増幅させる。クロラムフェニコール耐性遺伝子（CmR）を、pKK232-8 DNA（入手先：大阪大学）をテンプレートとしてプライマーCmR-F（agctaaggaagctaaaatggag；配列番号：５）とCmR-R（catttaaatggcgcgcctt；配列番号：６）を用いてPCRにて増幅させる。pABB-CRS2-Gm（入手先：大阪大学）をテンプレートとしてプライマーpABB-CRS2-GmR-inverse-S（gggaattccacaaattgttatccg；配列番号：７）とpABB-CRS2-GmR- inverse-AS（gggagagctcggatccacta；配列番号：８）を用いてインバースPCR後、DpnI酵素処理したものをバックボーンベクターpABB-CRS2-GmRとする。PT-U、PT-DおよびCmRフラグメントをIn-Fusion HD cloning kit (入手先：Clontech Laboratories)を用いてバックボーンベクターpABB-CRS2-GmRに挿入結合させる。このベクターをΔPT-pABB-CRS2-GmRとする。ΔPT-pABB-CRS2-GmRを形質転換したE. coli DH5α λpir（入手先：大阪大学）とHB101/pRK2013プラスミド伝達ヘルパー株（入手先：大阪大学）を用いた三親接合伝達法を用いて Bp 18323株へのΔPT-pABB-CRS2-GmRのプラスミド挿入を行うことで、相同組換えによりPT遺伝子がCmRと置換されたBp 18323 PT遺伝子欠損変異株を作出する。
（４）結果の考察
これらの結果から、百日咳菌感染マウスの咳発作の程度は、百日咳菌の種類とマウスの系統の組合せによりばらつきがあり、Bp 18323株とC57BL/6マウスの組合せが、もっとも顕著に咳発作を呈することがわかった。また、Bp 18323 PT遺伝子欠損変異株感染群ではBp 18323株感染群と比較して、気道および肺への定着菌体数は減少していたが、咳発作の回数はさらに顕著に減少した。このことから、PTは百日咳モデルマウスの咳発作発症に関与している可能性が示唆された。
Comparative example (Cough attack of a pertussis model animal by nasal inoculation of Bordetella pertussis prepared under various conditions)
(1) Preparation of various pertussis-infected C57BL / 6J mice and evaluation of coughing attacks Various pertussis strains (BP140, BP141, BP142, BP144) (Source: National Institute of Infectious Diseases) and Thomas I strain (Source: Osaka) (University) was used to prepare C57BL / 6 mice infected with Bordetella pertussis in the same manner as in Example 1, and after counting the number of coughing attacks for a certain period of time (A in FIG. 2), the number of coughing attacks was analyzed for each strain. A comparison was made (B in FIG. 2). In addition, a test for confirming the number of colonized cells in the respiratory tract and lungs (C and D in FIG. 2) was performed.
As a result, in the mice infected with the clinical isolates, sufficient bacterial numbers were established in both clinical isolates in the respiratory tract and lungs. On the other hand, the number of cough attacks was significant in some clinical isolates compared with the non-infected group, but all were less than in the
(2) Preparation of Balb / c mice infected with
A 7-week-old Balb / c mouse (obtained by Nippon SLC, number of animals: 3 / group) was inoculated with the
As a result, the number of cough attacks was not significant in the
(3) Preparation of C57BL / 6J mice infected with
Using the
As a result, the number of cough attacks was significantly reduced in the
<
A
(4) Consideration of results From these results, the degree of coughing attacks in B. pertussis-infected mice varies depending on the type of B. pertussis and the combination of mouse strains, and the combination of
実施例２（百日咳モデル動物を用いた咳発作誘発因子の特定）
（１）百日咳菌体破砕液の作製
Bp 18323株（入手先：大阪大学）並びに、Bp 18323株を基に作製したBp 18323株 PT遺伝子欠損変異株およびBp 18323株 FHA遺伝子欠損変異株を使用する。SS液体培地で液体培養したBp 18323株（病原性モード, Bvg+）、Bp 18323株 PT遺伝子欠損変異株およびBp 18323株 FHA遺伝子欠損変異株のそれぞれの菌液を作製する。ネガティブコントロール群として40 mM MgSO4を含むSS液体培地で液体培養したBp 18323株（非病原性モード, Bvg-）の菌液を使用する。Bvg+で培養した百日咳菌はPTおよびFHAを産生するが、Bvg-で培養した百日咳菌ではそれら因子は産生されない。各種菌液を遠心（8,000×g）後、上澄み液を除去し、137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8.1 mM Na2HPO4, and 1.5 mM KH2PO4バッファー, pH 7.4 (D-PBS (-))にて沈殿菌体を懸濁し、超音波破砕器にて百日咳菌体を破砕する。各種菌体破砕液を遠心（8,000×g）後、上澄み液を回収し0.22μmフィルターにて菌体を完全に除去する。これを百日咳菌体破砕液とする。
＜Bp 18323 FHA遺伝子欠損変異株作製方法＞
Bp 18323株 FHA遺伝子欠損変異株は比較例（３）の＜Bp 18323 PT遺伝子欠損変異株作製方法＞に準じて作製した。以下使用したプライマーの入手先はInvitrogenである。FHA遺伝子の5'末端および3'-末端から約1000bpまでの領域(FHA-UおよびFHA-D)を、Bp 18323株のゲノムDNAをテンプレートとしてプライマーFHA-U-F（gatccgagctctcccaagaacggcacctggac；配列番号：９）とFHA-U-R（ttagcttccttagctaaataggtagtcgcggcc；配列番号：１０）、およびFHA-D-F（cgcgccatttaaatgattccgaccagcgaagtg；配列番号：１１）とFHA-D-R（atttgtggaattccctcagcttctgcagcagg；配列番号：１２）を用いてPCRにて増幅させ、FHA-UおよびFHA-Dフラグメントを調製する。比較例（３）と同様の手法でCmRフラグメントおよびバックボーンベクターpABB-CRS2-GmRを調製する。FHA-U、FHA-DおよびCmRフラグメントをIn-Fusion HD cloning kit (入手先：Clontech Laboratories)を用いてバックボーンベクターpABB-CRS2-GmRに挿入結合させる。このベクターをΔFHA-pABB-CRS2-GmRとする。ΔFHA-pABB-CRS2-GmRを形質転換したE. coli DH5α λpir（入手先：大阪大学）とHB101/pRK2013プラスミド伝達ヘルパー株（入手先：大阪大学）を用いた三親接合伝達法を用いて Bp 18323株へのΔFHA-pABB-CRS2-GmRのプラスミド挿入を行うことで、相同組換えによりFHA遺伝子がCmRと置換されたBp 18323 FHA遺伝子欠損変異株を作出する。
（２）精製PTの作製
Skelton SK et al, J. Clin. Microbiol 28:1062-1065,1990に記載の方法に従いPTを精製した。具体的にはCL液体培地（Imaizumi A et al, Infect. Immun 41:1138-1143, 1983）で液体培養（37度、48時間）したBp18323株の培養液を遠心（12,000×g）後、上澄み液を回収し硫酸アンモニウムを終濃度で1 Mとなるように添加する。butyl-Sepharose 4 Fast Flow（入手先：Amersham）を1 M硫酸アンモニウム溶液で平衡化し、回収した上澄み液を添加する。10 mMリン酸ナトリウム-3 M塩化ナトリウム（pH 7.4）溶液でカラムを洗浄後、5 mMリン酸ナトリウム-50 mM塩化ナトリウム溶液（pH 7.4）で吸着画分を溶出回収する。Fetuin-Agarose (入手先：Sigma)を10 mMリン酸ナトリウム-0.15 M塩化ナトリウム（pH 7.4）溶液で平衡化し、回収した溶出画分を添加し、50 mMトリス塩酸-1 M塩化ナトリウム（pH 7.4）溶液でカラムを洗浄した後、50 mMトリス塩酸-4 M塩化マグネシウム（pH 7.4）溶液で吸着画分を溶出回収する。溶出画分をD-PBS(-)で透析後、限界濾過サイズが3.0 kDaのビバスビンターボ15 (入手先：ザルトリウス) を用いて遠心濃縮した。
（３）百日咳菌体破砕液経鼻接種動物の作製
7週齢の雄のC57BL/6Jマウス（入手先：日本クレア株式会社、3匹数/群）に、1.0mg/mlの各種菌体破砕液（組成：D-PBS (-)）を、麻酔下で、注射針を用いてマウスの鼻腔内に50μl投与した。対照群(3匹数/群)として、百日咳菌体成分を含まない溶媒（組成：D-PBS (-)、量50μl）を、麻酔下で、同様に投与した（図５のＡおよびＢ）。
7週齢の雄のC57BL/6Jマウス（入手先：日本クレア株式会社、5匹数/群）に、1.0mg/mlの各種菌体破砕液（組成：D-PBS (-)）、精製PT（200ng、組成：D-PBS(-)）、または1.0mg/mlの百日咳菌PT遺伝子欠損菌体破砕液（組成：D-PBS -)）＋精製PT（200ng、組成：D-PBS (-)）を、麻酔下で、注射針を用いてマウスの鼻腔内に50μl投与した。対照群(5匹数/群)として、百日咳菌体成分を含まない溶媒（組成：D-PBS(-)、量50μl）を、麻酔下で、同様に投与した（図５のＣおよびＤ）。
接種後、マウスを個別に観察用ケージに入れ、通常の飼育下で飼育した。
（４）咳発作の観察
実施例１の（２）に従い、Bp 18323株（Bvg+）菌体破砕液接種群、Bp 18323株（Bvg-）菌体破砕液接種群、Bp 18323 FHA遺伝子欠損変異株菌体破砕液接種群、Bp 18323 PT遺伝子欠損変異株菌体破砕液接種群、および溶媒接種群について、一定時間の咳発作の回数をカウントした（図５のＡ）。上記検体経鼻接種後6〜14日目の咳発作の回数を、Bp 18323株（Bvg+）菌体破砕液接種群と溶媒接種群または、各種菌体破砕液接種群で比較した（図５のＢ）。
その結果、Bp 18323株（Bvg+）菌体破砕液接種群は溶媒接種群と比較して咳発作回数が有意に増加した（図５のＢ）。Bp 18323株（Bvg-）菌体破砕液接種群では、Bp 18323株（Bvg+）菌体破砕液接種群と比較し咳発作回数が有意に減少した（図５のＢ）。またBp 18323株（Bvg+）菌体破砕液接種群と比較し、Bp 18323 FHA遺伝子欠損変異株菌体破砕液接種群では咳発作回数に有意な差が認められなかったのに対し、Bp 18323 PT遺伝子欠損変異株菌体破砕液接種群では咳発作回数が有意に減少した（図５のＢ）。
実施例１の（２）に従い、百日咳菌18323株（Bvg+）菌体破砕液接種群、Bp 18323 PT遺伝子欠損変異株菌体破砕液接種群、精製PT接種群、Bp 18323 PT遺伝子欠損変異株菌体破砕液＋精製PT接種群および溶媒接種群について、一定時間の咳発作の回数をカウントした（図５のＣ）。上記検体経鼻接種後6〜14日目の咳発作の回数を、溶媒接種群、精製PT接種群、Bp 18323 PT遺伝子欠損変異株菌体破砕液＋精製PT接種群および、その他菌体破砕液接種群で比較した（図５のＤ）。
その結果、溶媒接種群と比較し、精製PT接種群およびBp 18323 PT遺伝子欠損変異株菌体破砕液＋精製PT接種群では咳回数咳発作回数が有意に増加した（図５のＤ）。
（５）結果の考察
これまで百日咳感染症におけるPTの役割、つまりPTと病態の関係は不明なままであったが、本発明の咳発作誘発因子の特定方法により咳発作とPTの関係が明らかとなり、PTは咳発作を引き起こすために重要な因子の一つであることが示された。また精製PTの経鼻接種群において百日咳モデルマウスの咳発作の回数は溶媒群と比較して有意に増加したものの、精製PTのみでは誘発が不十分であることが示唆された。Bp 18323 PT遺伝子欠損変異株菌体破砕液＋精製PT接種群において咳発作が十分に誘導されたことを考え合わせると、菌体成分による宿主組織への炎症などを含む刺激反応が咳発作誘発に重要である可能性が考えられる。
Example 2 (Specification of Cough Attack Inducing Factor Using Pertussis Model Animal)
(1) Preparation of Bordetella pertussis crushed solution
The
<
(2) Preparation of purified PT
PT was purified according to the method described in Skelton SK et al, J. Clin. Microbiol 28: 1062-1065, 1990. Specifically, the culture solution of the Bp18323 strain that was liquid-cultured (37 ° C., 48 hours) in CL liquid medium (Imaizumi A et al, Infect. Immun 41: 1138-1143, 1983) was centrifuged (12,000 × g) and then the supernatant. Collect the solution and add ammonium sulfate to a final concentration of 1 M. Equilibrate butyl-
(3) Preparation of animals nasally inoculated with Bordetella pertussis crushed solution
Anesthetize 7-week-old male C57BL / 6J mice (obtained by Japan Claire Co., Ltd., 3 animals / group) with 1.0 mg / ml of various bacterial cell disruptions (composition: D-PBS (-)). Below, 50 μl was administered intranasally to mice using a needle. As a control group (number of animals / group), a solvent containing no Bordetella pertussis component (composition: D-PBS (-),
7-week-old male C57BL / 6J mice (obtained by Japan Claire Co., Ltd., 5 animals / group), 1.0 mg / ml various cell disruption solutions (composition: D-PBS (-)), purified PT (200 ng, composition: D-PBS (-)) or 1.0 mg / ml Bordetella pertussis PT gene-deficient cell disruption solution (composition: D-PBS-)) + purified PT (200 ng, composition: D-PBS (-) )) Was administered under anesthesia in 50 μl into the nasal cavity of mice using an injection needle. As a control group (number of 5 animals / group), a solvent containing no Bordetella pertussis component (composition: D-PBS (-),
After inoculation, the mice were individually placed in observation cages and bred in normal captivity.
(4) in accordance with cough bouts observed in Example 1 (2),
As a result, the number of coughing attacks was significantly increased in the Bp 18323 strain (Bvg + ) cell disruption solution inoculated group as compared with the solvent inoculated group (B in FIG. 5).
According to (2) of Example 1,
As a result, the number of coughs and the number of cough attacks were significantly increased in the purified PT inoculated group and the
(5) Consideration of results Until now, the role of PT in pertussis infection, that is, the relationship between PT and pathological condition has remained unclear, but the relationship between cough attack and PT is clarified by the method for identifying the cough attack inducer of the present invention. It was shown that PT is one of the important factors to cause a cough attack. In addition, although the number of coughing attacks in pertussis model mice was significantly increased in the nasal inoculation group of purified PT as compared with the solvent group, it was suggested that the induction was insufficient only with purified PT.
実施例３（DTP-IPVワクチンの評価）
ワクチン投与群として、DTP-IPVワクチン（製品名：テトラビック、入手先：一般財団法人阪大微生物病研究会）用量：0.16IU/ｍL〜1IU/ｍLを、3週齢のC57BL/6Jマウス（入手先：日本クレア株式会社、5匹数/群）に腹腔内投与した。投与3週間後に同用量のDTP-IPVワクチンを腹腔内投与した。
対照として、同様に3週齢のC57BL/6Jマウス（日本クレア株式会社、4匹数/群）に、アルミニウムアジュバント(製品名：Imject（登録商標） Alum、入手先：Thermo scientific)用量 100μlを腹腔内投与した（非ワクチン投与群）。投与3週間後に同用量のアルミニウムアジュバントを腹腔内投与した。
ワクチン最終投与から7日目に、実施例１の（１）に従い、Bp 18323株（0.5〜2×10８cfu/ml）を含む菌液（組成：SS液体培地）をワクチン投与群および非ワクチン投与群４〜５匹/群のマウス鼻腔内に50μl接種し、百日咳モデル動物を作製した。非感染群は、溶媒（組成：SS液体培地）を鼻腔内に50μl接種した。
（１）咳発作の観察
実施例１の（２）に従い、ワクチン投与群、非ワクチン投与群および非感染群について、一定時間の咳発作の回数をカウントした（図６のＡ）。
百日咳菌経鼻接種後6〜14日目の咳発作の回数を、非感染群、非ワクチン投与群、ワクチン投与群で比較した（図６のＢ）。
その結果、DTP-IPVワクチンは、Bp 18323株に感染したC57BL/6マウスに生じる咳発作を有意に抑制した。またこの抑制は、接種したDTP-IPVワクチンの用量依存的であった。
（２）感染防御確認試験
DPT-IPVワクチン投与により、気道および肺において百日咳菌の感染がどの程度防御されたのかを確認するために、実施例１の（２）の方法に従い、ワクチン投与群について、感染後14日目に、気道および肺における定着菌体数を測定した（図６のＣおよびＤ）。
その結果、ワクチン投与群は百日咳菌の肺への定着菌体数は有意に減少した。気道への定着菌体数に有意差はなかった。
（３）抗体価の測定
ワクチン投与群について、ワクチン最終投与後7日目の血清中のマウスの抗PT抗体（抗PT-IgG抗体）価を下記の方法で測定した（図６のＥ）。
96wellプレートにPT（1.0μg/ml）を添加し、４度で１８時間以上反応させた。洗浄バッファー（組成：D-PBS (-)-0.05% Tween20）にて96wellプレートを洗浄後、ブロッキングバッファー（組成：D-PBS (-)-0.5% BSA）を各wellに添加し、37度で１時間反応させた。96wellプレートを洗浄バッファーにて洗浄後、任意の希釈倍率(100、1,000、10,000、100,000倍希釈)に希釈した免疫前のマウス抗血清および、DPT-IPV免疫マウス抗血清を各wellに添加し、37度で１時間反応させた。96wellプレートを洗浄バッファーにて洗浄後、5,000倍希釈した抗マウスIgG-HRP(入手先：Cappel) を各wellに添加し、37度で１時間反応させた。96wellプレートを洗浄バッファーにて洗浄後、TMB (3,39, 5, 59- tetramethylbenzidine) ペルオキシダーゼ酵素基質（入手先：和光純薬工業株式会社）含有溶液を各wellに添加し、室温で30分間反応させた。1.0 N H2SO4を各wellに添加し、反応を停止させた後、96wellプレートをMulti-Detection Microplate Reader (入手先：DSファーマバイオメディカル株式会社) を用いて 450 nm波長の吸光度を測定し、DPT-IPV免疫マウス抗血清中の抗PT-IgG抗体価を算出した。
その結果、ワクチン最終投与後7日目の血清中には、百日咳ワクチンの主成分であるPTに対する充分な抗体が存在していた。
（４）結果の考察
これらの結果から、マウスにおいて百日咳菌の気道への定着を抑制する効果を有さなくても、感染拡大の大きな要因である、咳発作を顕著に抑制できる物質が、ヒトの百日咳感染予防に有用であることが確認された。また、実施例2の（4）の記述と考え合わせると、百日咳ワクチン投与によりマウス体内で産生された抗PT-IgG抗体が、経鼻接種した百日咳菌が産生するPTと結合し、毒性機能阻害することで咳発作を抑制する可能性が示唆される。
Example 3 (Evaluation of DTP-IPV vaccine)
As a vaccine administration group, DTP-IPV vaccine (product name: Tetrabic, source: Osaka University Microbial Disease Research Association) Dose: 0.16 IU / mL to 1 IU / mL, 3-week-old C57BL / 6J mice ( Obtained from: Nippon Claire Co., Ltd., 5 animals / group) was intraperitoneally administered. Three weeks after administration, the same dose of DTP-IPV vaccine was intraperitoneally administered.
As a control, similarly, a 3-week-old C57BL / 6J mouse (Nippon Claire Co., Ltd., 4 animals / group) was given an aluminum adjuvant (product name: Imject® Alum, source: Thermo scientific) dose of 100 μl peritoneally. Internally administered (non-vaccine group). Three weeks after administration, the same dose of aluminum adjuvant was intraperitoneally administered.
7 days after the vaccine last dose, according (1) of Example 1, bacterial
(1) Observation of cough attacks According to (2) of Example 1, the number of cough attacks for a certain period of time was counted for the vaccinated group, the non-vaccinated group, and the non-infected group (A in FIG. 6).
The number of
As a result, the DTP-IPV vaccine significantly suppressed cough attacks in C57BL / 6 mice infected with the
(2) Infection protection confirmation test
In order to confirm how much the infection of B. pertussis was protected in the respiratory tract and lungs by the administration of DPT-IPV vaccine, according to the method of (2) of Example 1, the vaccinated group was administered on the 14th day after the infection. , The number of colonized cells in the respiratory tract and lung was measured (C and D in FIG. 6).
As a result, the number of B. pertussis colonized in the lungs was significantly reduced in the vaccinated group. There was no significant difference in the number of colonized cells in the respiratory tract.
(3) Measurement of antibody titer For the vaccine-administered group, the anti-PT antibody (anti-PT-IgG antibody) titer of mice in the serum on the 7th day after the final administration of the vaccine was measured by the following method (E in FIG. 6).
PT (1.0 μg / ml) was added to a 96-well plate, and the mixture was reacted at 4 degrees for 18 hours or more. After washing the 96-well plate with a washing buffer (composition: D-PBS (-)-0.05% Tween20), add blocking buffer (composition: D-PBS (-)-0.5% BSA) to each well at 37 ° C. It was allowed to react for 1 hour. After washing the 96-well plate with a washing buffer, pre-immunized mouse antiserum diluted to an arbitrary dilution ratio (100, 1,000, 10,000, 100,000-fold dilution) and DPT-IPV immune mouse antiserum were added to each well. The reaction was carried out at 37 degrees for 1 hour. After washing the 96-well plate with a washing buffer, anti-mouse IgG-HRP (source: Cappel) diluted 5,000 times was added to each well, and the mixture was reacted at 37 ° C. for 1 hour. After washing the 96-well plate with a washing buffer, add a solution containing TMB (3,39, 5, 59-tetramethylbenzidine) peroxidase enzyme substrate (source: Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) to each well and react at room temperature for 30 minutes. I let you. 1.0 NH 2 SO 4 was added to each well to stop the reaction, and then the 96 well plate was measured for absorbance at 450 nm wavelength using a Multi-Detection Microplate Reader (obtained by DS Pharma Biomedical Co., Ltd.). The anti-PT-IgG antibody titer in the antiserum of DPT-IPV immunized mice was calculated.
As a result, sufficient antibody against PT, which is the main component of the pertussis vaccine, was present in the serum 7 days after the final administration of the vaccine.
(4) Consideration of results From these results, a substance capable of significantly suppressing coughing attacks, which is a major factor in the spread of infection, is a human being, even if it does not have the effect of suppressing the colonization of Bordetella pertussis in the respiratory tract in mice. It was confirmed that it is useful for preventing Bordetella pertussis infection. In addition, when considered with the description in (4) of Example 2, the anti-PT-IgG antibody produced in the mouse body by administration of the pertussis vaccine binds to the PT produced by the nasal inoculated Bordetella pertussis and inhibits toxic function. It is suggested that this may suppress coughing attacks.
本発明の百日咳モデル動物は、安価で利便性が高く、ヒトにおける百日咳菌感染でみられる顕著な咳発作を呈するため、咳発作メカニズムの解明や咳発作の誘発因子特定、百日咳に対する医薬品のスクリーニング評価に有用である。本発明の評価方法は、様々な被験物質を評価することができ、医薬品開発に有用である。 The pertussis model animal of the present invention is inexpensive and highly convenient, and presents with a prominent coughing attack seen in humans with pertussis infection. It is useful for. The evaluation method of the present invention can evaluate various test substances and is useful for drug development.
Claims (8)
（１）C57BL/6マウスに被験物質を投与する工程、
（２）被験物質を投与したマウス、および被験物質を投与しないC57BL/6マウスに、百日咳菌Bp 18323株、もしくは百日咳菌Bp 18323株の菌体破砕液を接種する工程、
（３）前記被験物質を投与したマウスにおける咳発作回数を、前記被験物質を投与しないマウスおよび／または百日咳菌もしくは百日咳菌体破砕液を接種しないマウスにおける咳発作回数と比較する工程、および、
（４）前記（３）の工程により得られた結果に基づいて、被験物質の百日咳菌感染による咳発作の抑制作用における有効性を判定する工程、
を含む評価方法。 It is an evaluation method of the test substance,
(1) Step of administering the test substance to C57BL / 6 mice,
(2) A step of inoculating a cell disrupted solution of Bordetella pertussis Bp 18323 strain or Bordetella pertussis Bp 18323 strain into mice to which the test substance was administered and C57BL / 6 mice to which the test substance was not administered.
(3) A step of comparing the number of coughing attacks in the mice to which the test substance was administered with the number of coughing attacks in the mice not administered with the test substance and / or the mice not infused with Bordetella pertussis or Bordetella pertussis.
(4) A step of determining the effectiveness of the test substance in suppressing a cough attack due to B. pertussis infection based on the results obtained in the above step (3).
Evaluation method including.
（１）百日咳菌Bp 18323株の１つの機能もしくは構造的因子をコードする遺伝子を欠損または発現を抑制するよう改変した百日咳菌Bp 18323株を作製する工程
（２）前記（１）の工程により得られた改変した百日咳菌Bp 18323株またはその菌体破砕液をC57BL/6マウスに投与する工程
（３）前記（２）のマウスにおける咳発作回数を、溶媒接種群および／または請求項６に記載の百日咳モデルマウスにおける咳発作回数と比較する工程、および、
（４）前記（３）の工程により得られた結果に基づいて、百日咳菌の咳発作誘発因子を特定する工程、
を含む特定方法。 A method for identifying the cough attack-inducing factor of Bordetella pertussis
(1) Step of producing Bordetella pertussis Bp 18323 strain in which a gene encoding one functional or structural factor of Bordetella pertussis Bp 18323 strain is deleted or modified to suppress expression (2) Obtained by the step (1) above. Step of administering the modified Bordetella pertussis Bp 18323 strain or a cell disruption solution thereof to C57BL / 6 mice (3) The number of coughing attacks in the mouse of the above (2) is described in the solvent-inoculated group and / or claim 6. Steps to compare with the number of coughing attacks in Bordetella pertussis model mice, and
(4) A step of identifying a cough attack-inducing factor of Bordetella pertussis based on the result obtained by the step (3) above.
Specific methods including.
（１）百日咳菌の防御抗原を製造する工程
（２）百日咳菌Bp 18323株、もしくは百日咳菌Bp 18323株の菌体破砕液を接種したC57BL/6マウスを用いて前記百日咳菌の防御抗原の効力を測定する工程、および
（３）前記百日咳菌の防御抗原を製薬学的に許容される担体および／または他の免疫原性成分と混合し、単位用量製剤に製剤化する工程、
を含む、製造方法。
How to make a pertussis vaccine
(1) Step of producing a protective antigen for Bordetella pertussis (2) Efficacy of the protective antigen for Bordetella pertussis using C57BL / 6 mice inoculated with B. pertussis Bp 18323 strain or B. pertussis Bp 18323 strain. And (3) the step of mixing the protective antigen of Bordetella pertussis with a pharmaceutically acceptable carrier and / or other immunogenic component and formulating it into a unit dose formulation.
Manufacturing method, including.
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