JP6853467B2 - 骨折治療剤 - Google Patents
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Description
Lonza社から購入したヒト骨髄由来間葉系幹細胞(hBMSCs;PT-2501)を、15%ウシ胎児血清(FBS;Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)、2mM L-グルタミン(Invitrogen)、100 units/ml ペニシリン(Sigma)及び100μg/ml ストレプトマイシン(Sigma)を含有するα-MEM(Gibco BRL)にて培養して本実施例で使用した。
基礎培地として、20 %ウシ胎児血清(FBS;Invitrogen)、抗生物質(100 units/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン)、2mM グルタミン、0.1mM L-アスコルビン酸(Wako;013-12061)及び55μM 2-メルカプトエタノール(Gibco;12571-063)を含有するα-MEM培地(Invitrogen)を用いた。
5週齢のマウスに1日あたり50 mg/kgの用量でトリプトファン又はキヌレニンを腹腔内注射により投与し、投与開始から1週間後に、直径1 mmの骨欠損を作製した。骨欠損を作製してから2週間後に組織を回収し、X線Micro-CT(SkyScan 1174 compact micro-CT,SkyScan,Aartselaar,Belgium)にて解析を行った。また、投与開始から3週間後に、マウスの大腿骨骨髄から骨髄由来間葉系幹細胞(BMSCs)を採取した。
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞(hBMSCs)又は骨髄由来間葉系幹細胞(BMSCs)を細胞剥離用溶液「Accutase」(Innovative Cell Technologies Inc.,San Diego,CA,USA)を用いて回収し、70μmのセルストレーナーを通して単一細胞にした。抗human/mouse SSEA-4抗体(Biosciences)に30分間反応させ、フローサイトメーター(AccuriTM C6, BD Biosciences)を用いてFACS解析を行った。
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞(hBMSCs)又は骨髄由来間葉系幹細胞(BMSCs)からTotal RNAを「RNA purification kit:PureLinkTM RNA Minit Kit」(Life Technologies,Gaithersburg,MD,USA)を用いて精製した。各遺伝子の発現量は、配列番号1〜26で示されるプライマーを用いて、定量性RT-PCRキット「KAPA SYBR FAST Universal qPCR kit (Kapa Biosystems)」により定量した。内部標準遺伝子として、Ribosomal protein S29遺伝子を用いた。
(1)Ribosomal protein S29遺伝子定量用プライマー
sense:ACACTGGCGCACATATTGAGG(配列番号1)
anti-sense:TCTCGCTCTTGTCGTGTCTGTTC(配列番号2)
(2)Oct-4遺伝子定量用プライマー
sense:CCGAGTGTGGTTCTGTAAC(配列番号3)
anti-sense:GAAAGGGACCGAGGAGTA(配列番号4)
(3)Nanog遺伝子定量用プライマー
sense:TCTCCAACATCCTGAACCT(配列番号5)
anti-sense:GCGTCACACCATTGCTAT(配列番号6)
(4)ALP(alkaline phosphatase)遺伝子定量用プライマー
sense:GCACCGCCACCGCCTACC(配列番号7)
anti-sense:CCACAGATTTCCCAGCGTCCTTG(配列番号8)
(5)DSPP(dentinsialophosphoprotein)遺伝子定量用プライマー
sense:TGGAGCCACAAACAGAAGCAACAC(配列番号9)
anti-sense:TGGACAACAGCGACATCCTCATTG(配列番号10)
(6)OPN(osteopontin)遺伝子定量用プライマー
sense:ATGTGATTGATAGTCAGGAACTT(配列番号11)
anti-sense:GTCTACAACCAGCATATCTTCA(配列番号12)
(7)OCN(osteocalcin)遺伝子定量用プライマー
sense:CAGAGTCCAGCAAAGGTG(配列番号13)
anti-sense:AGCCATTGATACAGGTAGC(配列番号14)
(8)LPL(Lipoprotein lipase)遺伝子定量用プライマー
sense:GAAATGACAGGTAGCCACGGACTC(配列番号15)
anti-sense:CCGCCGCCGACCAAAGAAG(配列番号16)
(9)PPAR-γ(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma)遺伝子定量用プライマー
sense:GGAGGTCAGCGGACTCTGGATTC(配列番号17)
anti-sense:CTGTCGGTTTCAGAAATGCCTTGC(配列番号18)
(10)ADIPOQ(Adiponectin)遺伝子定量用プライマー
sense:TATACCGCTCAGCATTCA(配列番号19)
anti-sense:CCTTCACATCCTTCATATAGAC(配列番号20)
(11)Sox-9遺伝子定量用プライマー
sense:TGAAATCTGTTCTGGAATGTT(配列番号21)
anti-sense:ACTGCTGGTGTTCTGAGA(配列番号22)
(12)ACAN(Aggrecan)遺伝子定量用プライマー
sense:GGCATTTCAGCGGTTCCTTCTC(配列番号23)
anti-sense:CAGCAGTTGTCTCCTCTTCTAC(配列番号24)
(13)Col2(Collagen type2)遺伝子定量用プライマー
sense:TGGAGCAGCAAGAGCAAGGAGA(配列番号25)
anti-sense:CCGTGGACAGCAGGCGTAGG(配列番号26)
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞(hBMSCs)又は骨髄由来間葉系幹細胞(BMSCs)を96 wellプレートにて播種し、トリプトファン又はキヌレニンにて刺激した。刺激してから2日後に細胞をPFA(Paraformaldehyde)にて固定し、抗CD146抗体(Abcam)、抗Nanog抗体(Abcam)、又は抗Ki-67抗体(Abcam)にて1時間反応後、Alexa Fluor(登録商標)488コンジュゲート抗マウス抗体(Invitrogen)にて染色した。核染色には、4’,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI;Invitrogen)を用いた。
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞(hBMSCs)又は骨髄由来間葉系幹細胞(BMSCs)を10-8M デキサメタゾン(dexamethasone;Sigma)、β-グリセロフォスフェート(β-glycerophosphate;Sigma)を含有する基礎培地にて7、14、21日間それぞれ培養し、各遺伝子の発現量を定量性RT-PCR法にて解析した。また、アリザリンレッドにてカルシウム沈着を染色した。
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞(hBMSCs)又は骨髄由来間葉系幹細胞(BMSCs)を10-7Mデキサメタゾン(dexamethasone;Sigma)、1% (100U/ml each)ペニシリン(Sigma)、1% (2mM)グルタミン(Sigma)、5 mg/ml リン酸L-アスコルビン酸(L-ascorbic acid phosphate)、1% ITS(ITS Premix Universal Culture Supplement,Corning)、100 μg/ml ピルビン酸ナトリウム(sodium pyruvate)、10 ng/ml TGF-b3 (R&D systems,Minneapolis,MN,USA)を含有するDMEM(high glucose, Invitrogen)培地にて、マイクロマス培養を行った。培養3週間後に細胞を回収して切片を作製し、サフラニンO染色を行った。また、各遺伝子の発現量を定量性RT-PCR法にて解析した。
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞(hBMSCs)又は骨髄由来間葉系幹細胞(BMSCs)を1 μg/mlインシュリン(Sigma)、0.5 mM 1-メチル-3-イソブチルキサンチン(1-methyl-3-isobutylxanthine;Sigma)、60 μMインドメタシン(indomethacin;Sigma)を含有する基礎培地にて培養し、各遺伝子の発現量を定量性RT-PCR法にて解析した。また、オイルレッドOにて細胞内の脂肪滴を染色した。
ヒト骨髄液から得られたヒト骨髄(hBM)細胞1x106個を6cm2培養皿に播種し、キヌレニンを用いて刺激し、基礎培地にて培養した。培養3週間後にトルイジンブルー染色を行い、50個以上細胞が存在するコロニーの数を計測した。
Boyden chamber法(8 μm microporous membrane、BD Falcon(登録商標) HTS FluoroBlokTM inserts,BD Biosciences)を用い、細胞遊走アッセイを実施した。細胞播種24時間後に遊走した細胞をAlexa Fluor(登録商標)546ファロイジン色素(Invitrogen)にて染色し、その細胞数を計測した。
CellTiter 96(登録商標)AQueous One Solution Cell Proliferation Assay kit(Promega,Madison,WI,USA)を用いて細胞生存率を評価した。具体的には、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞(hBMSCs)又は骨髄由来間葉系幹細胞(BMSCs)を96 wellプレートにて播種し、トリプトファン又はキヌレニンにて刺激し、15%ウシ胎児血清(FBS;Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)、2mM L-グルタミン(Invitrogen)、100 units/ml ペニシリン(Sigma)及び100 μg/ml ストレプトマイシン(Sigma)を含有するα-MEM(Gibco BRL)培地にて5%CO2存在下37℃で培養した。1時間後に490nmの吸光度を測定することにより細胞生存率(Cell viability)を評価した。
20種類のアミノ酸(orphan ligand library,enzo life science)を用いて一次スクリーニングを実施した。具体的には、5x104 cells/well(24 well plates)の濃度にてヒト骨髄由来間葉系幹細胞(hBMSCs)を播種した。hBMSCsを播種した次の日に、20種類のアミノ酸(10μM)をそれぞれ用いて刺激し、刺激から2日後に幹細胞マーカー(SSEA-4)をフローサイトメトリー法により解析した(FACS解析)。その結果、トリプトファン、メチオニン、プロリン刺激により幹細胞マーカー(SSEA-4)の上昇が認められた。得られた結果を図1に示す。
一次スクリーニングにより選択されたトリプトファン、メチオニン、プロリンを用いて、2日間ヒト骨髄由来間葉系幹細胞(hBMSCs)を刺激し、Nanog遺伝子、Oct-4遺伝子、Sox-2遺伝子の発現量を定量性RT-PCR法により測定した。その結果、トリプトファンがNanog遺伝子、Oct-4遺伝子、Sox-2遺伝子の発現を最も促進していた。得られた結果を図2に示す。
[in vitroにおけるL-トリプトファンの効果]
(1)FACS解析、定量性RT-PCR及び免疫染色(CD146)
L-トリプトファン(Sigma-Aldrich,CAS number 73-22-3)を用いて、2日間ヒト骨髄由来間葉系幹細胞(hBMSCs)を刺激した。上記(D)、(E)及び(F)に記載した方法により、FACS解析、定量性RT-PCR及び免疫染色(CD146)を行った。定量性RT-PCRにおいては、Nanog遺伝子、Sox-2遺伝子及びOct-4遺伝子の発現量を解析した。コントロールと比較して、L-トリプトファンにより発現量が著しく増加したことが確認された。得られた結果を図3に示す。
L-トリプトファン(Sigma-Aldrich,CAS number 73-22-3)を用いて、2日間ヒト骨髄由来間葉系幹細胞(hBMSCs)を刺激した。上記(K)及び(L)に記載した方法により、細胞遊走アッセイ及び細胞生存率の評価を行った。得られた結果を図4に示す。
L-トリプトファン(Sigma-Aldrich,CAS number 73-22-3)を用いて、2日間ヒト骨髄由来間葉系幹細胞(hBMSCs)を刺激した。上記(G)、(H)及び(I)に記載した方法により、骨芽細胞分化、軟骨細胞分化及び脂肪細胞分化の確認を行った。骨芽細胞分化の確認では、OPN(osteopontin)遺伝子及びOCN(osteocalcin)遺伝子の発現量を上記(E)に記載した定量性RT-PCR法にて解析した。軟骨細胞分化の確認では、Col2(Collagen type2)遺伝子の発現量を上記(E)に記載した定量性RT-PCR法にて解析した。脂肪細胞分化の確認では、PPAR-γ(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma)遺伝子、LPL(Lipoprotein lipase)遺伝子及びADIPOQ(Adiponectin)遺伝子の発現量を上記(E)に記載した定量性RT-PCR法にて解析した。得られた結果を図5に示す。L-トリプトファンにより骨芽細胞分化及び軟骨細胞分化が促進され、一方で、脂肪細胞分化が抑制されていることが分かる。
[in vitroにおけるD-トリプトファンの効果]
(1)FACS解析及び定量性RT-PCR
D-トリプトファン(Sigma-Aldrich,CAS number 153-94-6)を用いて(10,50,100μM)、2日間ヒト骨髄由来間葉系幹細胞(hBMSCs)を刺激した。上記(D)及び(E)に記載した方法により、FACS解析及び定量性RT-PCRを行った。定量性RT-PCRにおいては、Nanog遺伝子及びOct-4遺伝子の発現量を解析した。コントロールと比較して、D-トリプトファンにより発現量が著しく増加したことが確認された。得られた結果を図6に示す。
[in vitroにおけるD-トリプトファンとL-トリプトファンの効果の比較]
(1)FACS解析及び定量性RT-PCR
D-トリプトファン(Sigma-Aldrich,CAS number 153-94-6)及びL-トリプトファン(Sigma-Aldrich,CAS number 73-22-3)を用いて、2日間ヒト骨髄由来間葉系幹細胞(hBMSCs)を刺激した。上記(D)及び(E)に記載した方法により、FACS解析及び定量性RT-PCRを行った。定量性RT-PCRにおいては、Nanog遺伝子及びOct-4遺伝子の発現量を解析した。得られた結果を図7に示す。
D-トリプトファン(Sigma-Aldrich,CAS number 153-94-6)及びL-トリプトファン(Sigma-Aldrich,CAS number 73-22-3)を用いて、2日間ヒト骨髄由来間葉系幹細胞(hBMSCs)を刺激した。上記(K)に記載した方法により、細胞遊走アッセイを行った。得られた結果を図8に示す。
D-トリプトファン(Sigma-Aldrich,CAS number 153-94-6)及びL-トリプトファン(Sigma-Aldrich,CAS number 73-22-3)を用いて、2日間ヒト骨髄由来間葉系幹細胞(hBMSCs)を刺激した。上記(G)に記載した方法により、骨芽細胞分化の確認を行った。骨芽細胞分化の確認では、OPN(osteopontin)遺伝子の発現量を上記(E)に記載した定量性RT-PCR法にて解析した。得られた結果を図8に示す。
[in vivoにおけるL-トリプトファンの効果]
(1)骨欠損マウスの作製と骨髄由来間葉系幹細胞(BMSCs)の採取
5週齢のマウスに1日あたり50 mg/kgの用量でL-トリプトファン(Sigma-Aldrich,CAS number 73-22-3)を腹腔内注射により投与した。投与開始から1週間後に、直径1 mmの骨欠損を作製した。骨欠損を作製してから2週間後に組織を回収し、X線Micro-CT(SkyScan 1174 compact micro-CT,SkyScan,Aartselaar,Belgium)にて解析を行った。また、投与開始から3週間後に、マウスの大腿骨骨髄から骨髄由来間葉系幹細胞(BMSCs)を採取した。また、5週齢のマウスに1日あたり50 mg/kgの用量でL-トリプトファンを投与する代わりに、1日あたり10 mg/kgの用量でL-トリプトファンを投与した以外は、上記と同様にして、マウスの大腿骨骨髄から骨髄由来間葉系幹細胞(BMSCs)を採取した。
上記(1)で採取されたそれぞれの骨髄由来間葉系幹細胞(BMSCs)を基礎培地にて培養し、培養3週間後にトルイジンブルー染色を行い、50個以上細胞が存在するコロニーの数を計測した。また、上記(D)に記載した方法により、FACS解析を行った。得られた結果を図9に示す。
上記(1)で採取された骨髄由来間葉系幹細胞(BMSCs;50 mg/kgの用量でL-トリプトファンを投与)を基礎培地にて培養し、培養2週間後、上記(E)に記載した方法により、定量性RT-PCRを行った。定量性RT-PCRにおいては、Nanog遺伝子、Oct-4遺伝子及びSox-2遺伝子の発現量を解析した。コントロール(PBS)と比較して、L-トリプトファンにより発現量が著しく増加したことが確認された。得られた結果を図10に示す。
上記(1)で採取された骨髄由来間葉系幹細胞(BMSCs;50 mg/kgの用量でL-トリプトファンを投与)を基礎培地にて培養し、培養2週間後、上記(G)及び(I)に記載した方法により、骨芽細胞分化及び脂肪細胞分化の確認を行った。骨芽細胞分化の確認では、ALP(alkaline phosphatase)遺伝子、OPN(osteopontin)遺伝子及びOCN(osteocalcin)遺伝子の発現量を上記(E)に記載した定量性RT-PCR法にて解析した。脂肪細胞分化の確認では、PPAR-γ(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma)遺伝子及びLPL(Lipoprotein lipase)遺伝子の発現量を上記(E)に記載した定量性RT-PCR法にて解析した。得られた結果を図11に示す。L-トリプトファンにより骨芽細胞分化が促進され、一方で、脂肪細胞分化はコントロール(PBS)と同程度であった。
上記(1)の骨欠損マウス(50 mg/kgの用量でL-トリプトファンを投与)の大腿骨における骨再生量をX線Micro-CT(SkyScan 1174 compact micro-CT,SkyScan,Aartselaar,Belgium)を用いて解析した。骨欠損を作製した直後、及びコントロール(PBS)と比較して、L-トリプトファンにより骨再生量が著しく増加していた。得られた結果を図12に示す。
上記(1)の骨欠損マウス(50 mg/kgの用量でL-トリプトファンを投与)において、骨欠損手術を行っていない方の大腿骨における海綿骨量をX線Micro-CT(SkyScan 1174 compact micro-CT,SkyScan,Aartselaar,Belgium)を用いて解析した。コントロール(PBS)と比較して、L-トリプトファンにより海綿骨量が著しく増加していた。得られた結果を図13に示す。
[in vitroにおけるL-キヌレニンの効果]
(1)FACS解析、定量性RT-PCR及び免疫染色(NANOG)
L-キヌレニン硫酸塩(Sigma-Aldrich,CAS number 16055-80-4)を用いて、2日間ヒト骨髄由来間葉系幹細胞(hBMSCs)を刺激した。上記(D)、(E)及び(F)に記載した方法により、FACS解析、定量性RT-PCR及び免疫染色(NANOG)を行った。定量性RT-PCRにおいては、Nanog遺伝子、Sox-2遺伝子及びOct-4遺伝子の発現量を解析した。コントロールと比較して、L-キヌレニンにより発現量が著しく増加したことが確認された。得られた結果を図14に示す。
L-キヌレニン硫酸塩(Sigma-Aldrich,CAS number 16055-80-4)を用いて、上記(J)に記載した方法により、コロニー形成アッセイを行った。得られた結果を図15に示す。
L-キヌレニン硫酸塩(Sigma-Aldrich,CAS number 16055-80-4)を用いて、2日間ヒト骨髄由来間葉系幹細胞(hBMSCs)を刺激した。上記(F)及び(K)に記載した方法により、免疫染色(Ki-67)及び細胞遊走アッセイを行った。得られた結果を図15に示す。
L-キヌレニン硫酸塩(Sigma-Aldrich,CAS number 16055-80-4)を用いて、2日間ヒト骨髄由来間葉系幹細胞(hBMSCs)を刺激した。上記(G)、(H)及び(I)に記載した方法により、骨芽細胞分化、軟骨細胞分化及び脂肪細胞分化の確認を行った。骨芽細胞分化の確認では、OPN(osteopontin)遺伝子及びOCN(osteocalcin)遺伝子の発現量を上記(E)に記載した定量性RT-PCR法にて解析した。軟骨細胞分化の確認では、Col2(Collagen type2)遺伝子、Sox-9遺伝子及びACAN(Aggrecan)遺伝子の発現量を上記(E)に記載した定量性RT-PCR法にて解析した。脂肪細胞分化の確認では、PPAR-γ(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma)遺伝子、LPL(Lipoprotein lipase)遺伝子及びADIPOQ(Adiponectin)遺伝子の発現量を上記(E)に記載した定量性RT-PCR法にて解析した。得られた結果を図16に示す。L-キヌレニンにより骨芽細胞分化及び軟骨細胞分化が促進され、一方で、脂肪細胞分化が抑制されていることが分かる。
[in vivoにおけるL-キヌレニンの効果]
(1)骨欠損マウスの作製
5週齢のマウスに1日あたり50 mg/kgの用量でL-キヌレニン硫酸塩(Sigma-Aldrich,CAS number 16055-80-4)を腹腔内注射により投与した。投与開始から1週間後に、直径1 mmの骨欠損を作製した。骨欠損を作製してから2週間後に組織を回収し、X線Micro-CT(SkyScan 1174 compact micro-CT,SkyScan,Aartselaar,Belgium)にて解析を行った。
上記(1)の骨欠損マウスの大腿骨における骨再生量をX線Micro-CT(SkyScan 1174 compact micro-CT,SkyScan,Aartselaar,Belgium)を用いて解析した。骨欠損を作製した直後、及びコントロール(PBS)と比較して、L-キヌレニンにより骨再生量が著しく増加していた。得られた結果を図17に示す。
上記(1)の骨欠損マウスにおいて、骨欠損手術を行っていない方の大腿骨における海綿骨量をX線Micro-CT(SkyScan 1174 compact micro-CT,SkyScan,Aartselaar,Belgium)を用いて解析した。コントロール(PBS)と比較して、L-キヌレニンにより海綿骨量が著しく増加していた。得られた結果を図18に示す。
[in vivoにおけるL-トリプトファンの効果]
実施例4において、5週齢のマウスに1日あたり50 mg/kgの用量でL-トリプトファンを腹腔内注射により投与する代わりに、経口投与により投与した以外は実施例4と同様にして骨欠損マウスを作製し、骨再生量の評価を行った。得られた結果を図19に示す。
[in vivoにおけるL-キヌレニンの効果]
実施例6において、5週齢のマウスに1日あたり50 mg/kgの用量でL-キヌレニンを腹腔内注射により投与する代わりに、経口投与により投与した以外は実施例6と同様にして骨欠損マウスを作製し、骨再生量の評価を行った。得られた結果を図19に示す。
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