JP6835472B2 - 癌の処置のための組成物 - Google Patents
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Description
残念ながら、臨床で使用される微小管相互作用性抗癌薬は2つの重要な問題、すなわち耐性と神経毒性を共有する。
Aは、単一または縮合芳香族またはヘテロ芳香族環系であり;
R1は、H、C1−C6直鎖または分岐アルキル、アリール、フェニル、ベンジル、ハロアルキル、アミノアルキル、−OCH2Ph、SO2−アリール、SO2−フェニル、−(C=O)−アリール、−(C=O)−フェニルまたはOHであり;
R4およびR5は、それぞれ独立して水素、C1−C6直鎖または分岐アルキル、C1−C6直鎖または分岐ハロアルキル、C1−C6直鎖または分岐アルコキシ、C1−C6直鎖または分岐ハロアルコキシ、F、Cl、Br、I、CF3、CN、−CH2CN、NH2、OH、−OC(O)CF3、アルキルアミノ、アミノアルキル、−OCH2Ph、−NHCO−アルキル、COOH、−C(O)Ph、C(O)O−アルキル、C(O)H、−C(O)NH2またはNO2であり;ならびに
nは、1から4の間の整数である]
の構造によって表される化合物またはその薬学的に許容され得る塩、N−オキシド、水和物、互変異性体もしくは異性体、および薬学的に許容され得る担体を含む薬学的組成物に関する。
Aは、単一または縮合芳香族またはヘテロ芳香族環系であり;
R1は、H、C1−C6直鎖または分岐アルキル、アリール、フェニル、ベンジル、ハロアルキル、アミノアルキル、−OCH2Ph、SO2−アリール、SO2−フェニル、−(C=O)−アリール、−(C=O)−フェニルまたはOHであり;
R4およびR5は、それぞれ独立して水素、C1−C6直鎖または分岐アルキル、C1−C6直鎖または分岐ハロアルキル、C1−C6直鎖または分岐アルコキシ、C1−C6直鎖または分岐ハロアルコキシ、F、Cl、Br、I、CF3、CN、−CH2CN、NH2、OH、−OC(O)CF3、アルキルアミノ、アミノアルキル、−OCH2Ph、−NHCO−アルキル、COOH、−C(O)Ph、C(O)O−アルキル、C(O)H、−C(O)NH2またはNO2であり;ならびに
nは、1から4の間の整数である]
の構造によって表される化合物またはその薬学的に許容され得る塩、N−オキシド、水和物、互変異性体もしくは異性体と組み合わせて、BRAF阻害剤またはMEK阻害剤のうちの少なくとも1つを含む組成物を、BRAF変異癌に罹患している被験体に、前記癌を処置するのに有効な条件下で投与することを含む方法に関する。
Aは、単一または縮合芳香族またはヘテロ芳香族環系であり;
R1は、H、C1−C6直鎖または分岐アルキル、アリール、フェニル、ベンジル、ハロアルキル、アミノアルキル、−OCH2Ph、SO2−アリール、SO2−フェニル、−(C=O)−アリール、−(C=O)−フェニルまたはOHであり;
R4およびR5は、それぞれ独立して水素、C1−C6直鎖または分岐アルキル、C1−C6直鎖または分岐ハロアルキル、C1−C6直鎖または分岐アルコキシ、C1−C6直鎖または分岐ハロアルコキシ、F、Cl、Br、I、CF3、CN、−CH2CN、NH2、OH、−OC(O)CF3、アルキルアミノ、アミノアルキル、−OCH2Ph、−NHCO−アルキル、COOH、−C(O)Ph、C(O)O−アルキル、C(O)H、−C(O)NH2またはNO2であり;ならびに
nは、1から4の間の整数である]
の構造によって表される化合物またはその薬学的に許容され得る塩、N−オキシド、水和物、互変異性体もしくは異性体と組み合わせて、BRAF阻害剤またはMEK阻害剤のうちの少なくとも1つを含む組成物を前記被験体に投与することを含む方法に関する。
本発明は、例えば、以下を提供する。
(項目1)
BRAF阻害剤またはMEK阻害剤のうちの少なくとも1つと組み合わせた、式II:
[式中、
Aは、単一または縮合芳香族またはヘテロ芳香族環系であり;
R 1 は、H、C 1 −C 6 直鎖または分岐アルキル、アリール、フェニル、ベンジル、ハロアルキル、アミノアルキル、−OCH 2 Ph、SO 2 −アリール、SO 2 −フェニル、−(C=O)−アリール、−(C=O)−フェニルまたはOHであり;
R 4 およびR 5 は、それぞれ独立して水素、C 1 −C 6 直鎖または分岐アルキル、C 1 −C 6 直鎖または分岐ハロアルキル、C 1 −C 6 直鎖または分岐アルコキシ、C 1 −C 6 直鎖または分岐ハロアルコキシ、F、Cl、Br、I、CF 3 、CN、−CH 2 CN、NH 2 、OH、−OC(O)CF 3 、アルキルアミノ、アミノアルキル、−OCH 2 Ph、−NHCO−アルキル、COOH、−C(O)Ph、C(O)O−アルキル、C(O)H、−C(O)NH 2 またはNO 2 であり;ならびに
nは、1から4の間の整数である]
の構造によって表される化合物またはその薬学的に許容され得る塩、N−オキシド、水和物、互変異性体もしくは異性体、および薬学的に許容され得る担体を含む薬学的組成物。
(項目2)
前記式IIの化合物が、
またはそれらの組合せである、項目1に記載の組成物。
(項目3)
BRAF阻害剤またはMEK阻害剤のうちの少なくとも1つと組み合わせたチューブリン阻害剤および薬学的に許容され得る担体を含む薬学的組成物。
(項目4)
前記チューブリン阻害剤がドセタキセルである、項目3に記載の組成物。
(項目5)
前記BRAF阻害剤がベムラフェニブ、ダブラフェニブまたはそれらの組合せであり、および前記MEK阻害剤がトラメチニブまたはRO5068760またはそれらの組合せである、項目1から4のいずれか一項に記載の組成物。
(項目6)
被験体においてBRAF変異癌を処置する、抑制する、重症度を低減する、危険度を低減するまたは阻害する方法であって、式II:
[式中、
Aは、単一または縮合芳香族またはヘテロ芳香族環系であり;
R 1 は、H、C 1 −C 6 直鎖または分岐アルキル、アリール、フェニル、ベンジル、ハロアルキル、アミノアルキル、−OCH 2 Ph、SO 2 −アリール、SO 2 −フェニル、−(C=O)−アリール、−(C=O)−フェニルまたはOHであり;
R 4 およびR 5 は、それぞれ独立して水素、C 1 −C 6 直鎖または分岐アルキル、C 1 −C 6 直鎖または分岐ハロアルキル、C 1 −C 6 直鎖または分岐アルコキシ、C 1 −C 6 直鎖または分岐ハロアルコキシ、F、Cl、Br、I、CF 3 、CN、−CH 2 CN、NH 2 、OH、−OC(O)CF 3 、アルキルアミノ、アミノアルキル、−OCH 2 Ph、−NHCO−アルキル、COOH、−C(O)Ph、C(O)O−アルキル、C(O)H、−C(O)NH 2 またはNO 2 であり;ならびに
nは、1から4の間の整数である]
の構造によって表される化合物またはその薬学的に許容され得る塩、N−オキシド、水和物、互変異性体もしくは異性体と組み合わせて、BRAF阻害剤またはMEK阻害剤のうちの少なくとも1つを含む組成物を、BRAF変異癌に罹患している被験体に、前記癌を処置するのに有効な条件下で投与することを含む方法。
(項目7)
癌に罹患している被験体においてBRAF阻害剤耐性癌を処置する、抑制する、重症度を低減する、危険度を低減するまたは阻害する方法であって、式II:
[式中、
Aは、単一または縮合芳香族またはヘテロ芳香族環系であり;
R 1 は、H、C 1 −C 6 直鎖または分岐アルキル、アリール、フェニル、ベンジル、ハロアルキル、アミノアルキル、−OCH 2 Ph、SO 2 −アリール、SO 2 −フェニル、−(C=O)−アリール、−(C=O)−フェニルまたはOHであり;
R 4 およびR 5 は、それぞれ独立して水素、C 1 −C 6 直鎖または分岐アルキル、C 1 −C 6 直鎖または分岐ハロアルキル、C 1 −C 6 直鎖または分岐アルコキシ、C 1 −C 6 直鎖または分岐ハロアルコキシ、F、Cl、Br、I、CF 3 、CN、−CH 2 CN、NH 2 、OH、−OC(O)CF 3 、アルキルアミノ、アミノアルキル、−OCH 2 Ph、−NHCO−アルキル、COOH、−C(O)Ph、C(O)O−アルキル、C(O)H、−C(O)NH 2 またはNO 2 であり;ならびに
nは、1から4の間の整数である]
の構造によって表される化合物またはその薬学的に許容され得る塩、N−オキシド、水和物、互変異性体もしくは異性体と組み合わせて、BRAF阻害剤またはMEK阻害剤のうちの少なくとも1つを含む組成物を、BRAF阻害剤耐性癌に罹患している被験体に、前記癌を処置するのに有効な条件下で、前記被験体に投与することを含む方法。
(項目8)
黒色腫を処置する、抑制する、重症度を低減する、危険度を低減するまたは阻害する方法であって、式II:
[式中、
Aは、単一または縮合芳香族またはヘテロ芳香族環系であり;
R 1 は、H、C 1 −C 6 直鎖または分岐アルキル、アリール、フェニル、ベンジル、ハロアルキル、アミノアルキル、−OCH 2 Ph、SO 2 −アリール、SO 2 −フェニル、−(C=O)−アリール、−(C=O)−フェニルまたはOHであり;
R 4 およびR 5 は、それぞれ独立して水素、C 1 −C 6 直鎖または分岐アルキル、C 1 −C 6 直鎖または分岐ハロアルキル、C 1 −C 6 直鎖または分岐アルコキシ、C 1 −C 6 直鎖または分岐ハロアルコキシ、F、Cl、Br、I、CF 3 、CN、−CH 2 CN、NH 2 、OH、−OC(O)CF 3 、アルキルアミノ、アミノアルキル、−OCH 2 Ph、−NHCO−アルキル、COOH、−C(O)Ph、C(O)O−アルキル、C(O)H、−C(O)NH 2 またはNO 2 であり;ならびに
nは、1から4の間の整数である]
の構造によって表される化合物またはその薬学的に許容され得る塩、N−オキシド、水和物、互変異性体もしくは異性体と組み合わせて、BRAF阻害剤またはMEK阻害剤のうちの少なくとも1つを含む組成物を、黒色腫に罹患している被験体に、前記黒色腫を処置するのに有効な条件下で投与することを含む方法。
(項目9)
薬物耐性黒色腫を処置する、抑制する、重症度を低減する、危険度を低減するまたは阻害する方法であって、式II:
[式中、
Aは、単一または縮合芳香族またはヘテロ芳香族環系であり;
R 1 は、H、C 1 −C 6 直鎖または分岐アルキル、アリール、フェニル、ベンジル、ハロアルキル、アミノアルキル、−OCH 2 Ph、SO 2 −アリール、SO 2 −フェニル、−(C=O)−アリール、−(C=O)−フェニルまたはOHであり;
R 4 およびR 5 は、それぞれ独立して水素、C 1 −C 6 直鎖または分岐アルキル、C 1 −C 6 直鎖または分岐ハロアルキル、C 1 −C 6 直鎖または分岐アルコキシ、C 1 −C 6 直鎖または分岐ハロアルコキシ、F、Cl、Br、I、CF 3 、CN、−CH 2 CN、NH 2 、OH、−OC(O)CF 3 、アルキルアミノ、アミノアルキル、−OCH 2 Ph、−NHCO−アルキル、COOH、−C(O)Ph、C(O)O−アルキル、C(O)H、−C(O)NH 2 またはNO 2 であり;ならびに
nは、1から4の間の整数である]
の構造によって表される化合物またはその薬学的に許容され得る塩、N−オキシド、水和物、互変異性体もしくは異性体と組み合わせて、BRAF阻害剤またはMEK阻害剤のうちの少なくとも1つを含む組成物を、薬物耐性黒色腫に罹患している被験体に、前記黒色腫を処置するのに有効な条件下で投与することを含む方法。
(項目10)
癌に罹患している被験体においてBRAF阻害剤耐性癌を遅延させるまたは予防する方法であって、式II:
[式中、
Aは、単一または縮合芳香族またはヘテロ芳香族環系であり;
R 1 は、H、C 1 −C 6 直鎖または分岐アルキル、アリール、フェニル、ベンジル、ハロアルキル、アミノアルキル、−OCH 2 Ph、SO 2 −アリール、SO 2 −フェニル、−(C=O)−アリール、−(C=O)−フェニルまたはOHであり;
R 4 およびR 5 は、それぞれ独立して水素、C 1 −C 6 直鎖または分岐アルキル、C 1 −C 6 直鎖または分岐ハロアルキル、C 1 −C 6 直鎖または分岐アルコキシ、C 1 −C 6 直鎖または分岐ハロアルコキシ、F、Cl、Br、I、CF 3 、CN、−CH 2 CN、NH 2 、OH、−OC(O)CF 3 、アルキルアミノ、アミノアルキル、−OCH 2 Ph、−NHCO−アルキル、COOH、−C(O)Ph、C(O)O−アルキル、C(O)H、−C(O)NH 2 またはNO 2 であり;ならびに
nは、1から4の間の整数である]
の構造によって表される化合物またはその薬学的に許容され得る塩、N−オキシド、水和物、互変異性体もしくは異性体と組み合わせて、BRAF阻害剤またはMEK阻害剤のうちの少なくとも1つを含む組成物を前記被験体に投与することを含む方法。
(項目11)
癌に罹患している被験体において癌転移を処置する、抑制する、低減する、阻害する、除去する、遅延させるまたは予防する方法であって、式II:
[式中、
Aは、単一または縮合芳香族またはヘテロ芳香族環系であり;
R 1 は、H、C 1 −C 6 直鎖または分岐アルキル、アリール、フェニル、ベンジル、ハロアルキル、アミノアルキル、−OCH 2 Ph、SO 2 −アリール、SO 2 −フェニル、−(C=O)−アリール、−(C=O)−フェニルまたはOHであり;
R 4 およびR 5 は、それぞれ独立して水素、C 1 −C 6 直鎖または分岐アルキル、C 1 −C 6 直鎖または分岐ハロアルキル、C 1 −C 6 直鎖または分岐アルコキシ、C 1 −C 6 直鎖または分岐ハロアルコキシ、F、Cl、Br、I、CF 3 、CN、−CH 2 CN、NH 2 、OH、−OC(O)CF 3 、アルキルアミノ、アミノアルキル、−OCH 2 Ph、−NHCO−アルキル、COOH、−C(O)Ph、C(O)O−アルキル、C(O)H、−C(O)NH 2 またはNO 2 であり;ならびに
nは、1から4の間の整数である]
の構造によって表される化合物またはその薬学的に許容され得る塩、N−オキシド、水和物、互変異性体もしくは異性体と組み合わせて、BRAF阻害剤またはMEK阻害剤のうちの少なくとも1つを含む組成物を前記被験体に投与することを含む方法。
(項目12)
以前にタキサン薬物で処置された癌に罹患している被験体においてタキサン薬物に対する耐性がある二次癌を処置する、抑制する、低減する、阻害する、除去する、遅延させるまたは予防する方法であって、式II:
[式中、
Aは、単一または縮合芳香族またはヘテロ芳香族環系であり;
R 1 は、H、C 1 −C 6 直鎖または分岐アルキル、アリール、フェニル、ベンジル、ハロアルキル、アミノアルキル、−OCH 2 Ph、SO 2 −アリール、SO 2 −フェニル、−(C=O)−アリール、−(C=O)−フェニルまたはOHであり;
R 4 およびR 5 は、それぞれ独立して水素、C 1 −C 6 直鎖または分岐アルキル、C 1 −C 6 直鎖または分岐ハロアルキル、C 1 −C 6 直鎖または分岐アルコキシ、C 1 −C 6 直鎖または分岐ハロアルコキシ、F、Cl、Br、I、CF 3 、CN、−CH 2 CN、NH 2 、OH、−OC(O)CF 3 、アルキルアミノ、アミノアルキル、−OCH 2 Ph、−NHCO−アルキル、COOH、−C(O)Ph、C(O)O−アルキル、C(O)H、−C(O)NH 2 またはNO 2 であり;ならびに
nは、1から4の間の整数である]
の構造によって表される化合物またはその薬学的に許容され得る塩、N−オキシド、水和物、互変異性体もしくは異性体と組み合わせて、BRAF阻害剤またはMEK阻害剤のうちの少なくとも1つを含む組成物を前記被験体に投与することを含む方法。
(項目13)
前記タキサンがドセタキセルである、項目12に記載の方法。
(項目14)
前記BRAF阻害剤が、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、GDC−0879、PLX−4720、ソラフェニブトシル酸塩、LGX818またはそれらの任意の組合せであり、および前記MEK阻害剤が、トラメチニブ、セルメチニブ、RO5068760、MEK162、PD−325901、コビメチニブ、CI−1040またはそれらの任意の組合せである、項目6から13のいずれか一項に記載の方法。
(項目15)
前記癌が、黒色腫、甲状腺癌、結腸直腸癌、乳癌、結腸癌、胆道癌、非小細胞肺癌(NSCLC)または卵巣癌である、項目6、7または10から14のいずれか一項に記載の方法。
(項目16)
前記癌が、黒色腫、甲状腺癌、結腸直腸癌または卵巣癌である、項目6、7または10から15のいずれか一項に記載の方法。
(項目17)
前記癌が黒色腫である、項目6、7または10から16のいずれか一項に記載の方法。
(項目18)
前記黒色腫が薬物耐性黒色腫である、項目8または14から17のいずれか一項に記載の方法。
(項目19)
前記黒色腫がV600E陽性黒色腫である、項目14から18のいずれか一項に記載の方法。
(項目20)
前記癌が薬物耐性癌である、項目6から19のいずれか一項に記載の方法。
(項目21)
前記BRAF阻害剤がベムラフェニブ、ダブラフェニブまたはそれらの組合せであり、および前記MEK阻害剤がトラメチニブ、RO5068760またはそれらの組合せである、項目6から20のいずれか一項に記載の方法。
(項目22)
前記化合物が、
またはそれらの組合せである、項目6から21のいずれか一項に記載の方法。
(項目23)
薬物耐性癌を処置する、抑制する、重症度を低減する、危険度を低減するまたは阻害する方法であって、チューブリン阻害剤と組み合わせてBRAF阻害剤またはMEK阻害剤のうちの少なくとも1つを含む組成物を、薬物耐性癌に罹患している被験体に、前記癌を処置するのに有効な条件下で投与することを含む方法。
(項目24)
癌に罹患している被験体において獲得BRAF阻害剤耐性を抑制する方法であって、チューブリン阻害剤と組み合わせてBRAF阻害剤またはMEK阻害剤のうちの少なくとも1つを含む組成物を、癌に罹患している前記被験体に、前記獲得耐性を抑制するのに有効な条件下で投与することを含む方法。
(項目25)
癌に罹患している被験体においてBRAF阻害剤耐性の発現を遅延させるまたは予防する方法であって、チューブリン阻害剤と組み合わせてBRAF阻害剤またはMEK阻害剤のうちの少なくとも1つを含む組成物を、癌に罹患している前記被験体に、前記耐性を遅延させるまたは予防するのに有効な条件下で投与することを含む方法。
(項目26)
癌に罹患している被験体において癌転移を処置する、抑制する、阻害する、除去する、低減する、遅延させるまたは予防する方法であって、チューブリン阻害剤と組み合わせてBRAF阻害剤またはMEK阻害剤のうちの少なくとも1つを含む組成物を、癌に罹患している前記被験体に、前記癌転移を処置する、抑制する、阻害する、低減する、遅延させるまたは予防するのに有効な条件下で投与することを含む方法。
(項目27)
前記BRAF阻害剤がベムラフェニブ、ダブラフェニブまたはそれらの組合せであり、および前記MEK阻害剤がトラメチニブ、RO5068760またはそれらの組合せである、項目23から26のいずれか一項に記載の方法。
(項目28)
前記チューブリン阻害剤が、パクリタキセル、エポチロン、ドセタキセル、ディスコデルモリド、コルヒチン、コンブレスタチン、2−メトキシエストラジオール、メトキシベンゼンスルホンアミド(E7010)、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ビンフルイン、ドラスタチン、ハリコンドリン、ヘミアステリン、クリプトフィシン52、タキソールまたはそれらの任意の組合せである、項目23から27のいずれか一項に記載の方法。
(項目29)
前記チューブリン阻害剤が、ドセタキセル、コルヒチン、ビンブラスチン、タキソールまたはそれらの任意の組合せである、項目23から28のいずれか一項に記載の方法。
(項目30)
前記癌が、黒色腫、甲状腺癌、結腸直腸癌、乳癌、結腸癌、胆道癌、非小細胞肺癌(NSCLC)または卵巣癌である、項目23から29のいずれか一項に記載の方法。
(項目31)
前記癌が黒色腫である、項目23から30のいずれか一項に記載の方法。
(項目32)
BRAF阻害剤と組み合わせた、以下の構造:
によって表される化合物および薬学的に許容され得る担体を含む薬学的組成物。
(項目33)
前記BRAF阻害剤がベムラフェニブである、項目32に記載の組成物。
(項目34)
MEK阻害剤と組み合わせた、以下の構造:
によって表される化合物および薬学的に許容され得る担体を含む薬学的組成物。
(項目35)
前記MEK阻害剤がRO5068760である、項目34に記載の組成物。
(項目36)
チューブリン阻害剤、BRAF阻害剤および薬学的に許容され得る担体を含む薬学的組成物。
Aは、単一または縮合芳香族またはヘテロ芳香族環系であり;
Zは、OまたはSであり;
R1は、H、C1−C6直鎖または分岐アルキル、アリール、フェニル、ベンジル、ハロアルキル、アミノアルキル、−OCH2Ph、SO2−アリール、SO2−フェニル、−(C=O)−アリール、−(C=O)−フェニルまたはOHであり;
R2、R3、R4およびR5は、それぞれ独立して水素、C1−C6直鎖または分岐アルキル、C1−C6直鎖または分岐ハロアルキル、C1−C6直鎖または分岐アルコキシ、C1−C6直鎖または分岐ハロアルコキシ、F、Cl、Br、I、CF3、CN、−CH2CN、NH2、OH、−OC(O)CF3、アルキルアミノ、アミノアルキル、−OCH2Ph、−NHCO−アルキル、COOH、−C(O)Ph、C(O)O−アルキル、C(O)H、−C(O)NH2またはNO2であり;ならびに
mおよびnは、それぞれ独立して0から4の間の整数である]
の構造によって表される化合物またはその薬学的に許容され得る塩、N−オキシド、水和物、互変異性体もしくは異性体に関する。
Aは、単一または縮合芳香族またはヘテロ芳香族環系であり;
R1は、H、C1−C6直鎖または分岐アルキル、アリール、フェニル、ベンジル、ハロアルキル、アミノアルキル、−OCH2Ph、SO2−アリール、SO2−フェニル、−(C=O)−アリール、−(C=O)−フェニルまたはOHであり;
R4およびR5は、それぞれ独立して水素、C1−C6直鎖または分岐アルキル、C1−C6直鎖または分岐ハロアルキル、C1−C6直鎖または分岐アルコキシ、C1−C6直鎖または分岐ハロアルコキシ、F、Cl、Br、I、CF3、CN、−CH2CN、NH2、OH、−OC(O)CF3、アルキルアミノ、アミノアルキル、−OCH2Ph、−NHCO−アルキル、COOH、−C(O)Ph、C(O)O−アルキル、C(O)H、−C(O)NH2またはNO2であり;ならびに
nは、1から4の間の整数である]
の構造によって表される化合物またはその薬学的に許容され得る塩、N−オキシド、水和物、互変異性体もしくは異性体に関する。
R1およびR9は、それぞれ独立してH、C1−C6直鎖または分岐アルキル、アリール、フェニル、ベンジル、ハロアルキル、アミノアルキル、−OCH2Ph、SO2−アリール、SO2−フェニル、−(C=O)−アリール、−(C=O)−フェニルまたはOHであり;
R4およびR5は、それぞれ独立して水素、C1−C6直鎖または分岐アルキル、C1−C6直鎖または分岐ハロアルキル、C1−C6直鎖または分岐アルコキシ、C1−C6直鎖または分岐ハロアルコキシ、F、Cl、Br、I、CF3、CN、−CH2CN、NH2、OH、−OC(O)CF3、アルキルアミノ、アミノアルキル、−OCH2Ph、−NHCO−アルキル、COOH、−C(O)Ph、C(O)O−アルキル、C(O)H、−C(O)NH2またはNO2であり;ならびに
nは、1から4の間の整数である]
の構造によって表される化合物またはその薬学的に許容され得る塩、N−オキシド、水和物、互変異性体もしくは異性体に関する。
R1は、H、C1−C6直鎖または分岐アルキル、アリール、フェニル、ベンジル、ハロアルキル、アミノアルキル、−OCH2Ph、SO2−アリール、SO2−フェニル、−(C=O)−アリール、−(C=O)−フェニルまたはOHであり;
R4およびR5は、それぞれ独立して水素、C1−C6直鎖または分岐アルキル、C1−C6直鎖または分岐ハロアルキル、C1−C6直鎖または分岐アルコキシ、C1−C6直鎖または分岐ハロアルコキシ、F、Cl、Br、I、CF3、CN、−CH2CN、NH2、OH、−OC(O)CF3、アルキルアミノ、アミノアルキル、−OCH2Ph、−NHCO−アルキル、COOH、−C(O)Ph、C(O)O−アルキル、C(O)H、−C(O)NH2またはNO2であり;ならびに
nは、1から4の間の整数である]
の構造によって表される化合物またはその薬学的に許容され得る塩、N−オキシド、水和物、互変異性体もしくは異性体に関する。
本発明の別の態様は、薬学的に許容され得る担体および本発明の態様による少なくとも1つの化合物を含む薬学的組成物に関する。薬学的組成物は、1つまたはそれを超える本発明の上記で同定された化合物を含有し得る。典型的には、本発明の薬学的組成物は、BRAF阻害剤またはMEK阻害剤のうちの少なくとも1つと組み合わせた、式I、II、IIIもしくはIVまたは17yaもしくは12daの化合物またはその薬学的に許容され得る塩などの本発明の化合物、および薬学的に許容され得る担体を含む。本発明の薬学的組成物はまた、BRAF阻害剤またはMEK阻害剤のうちの少なくとも1つと組み合わせたチューブリン阻害剤、および薬学的に許容され得る担体も含み得る。「薬学的に許容され得る担体」という用語は、任意の適切なアジュバント、担体、賦形剤または安定剤を指し、固体または液体形態、例えば錠剤、カプセル、粉末、溶液、懸濁液または乳剤であり得る。一部の実施形態では、薬学的組成物は、BRAF阻害剤と、式I、II、IIIもしくはIVまたは17yaもしくは12daの化合物またはその薬学的に許容され得る塩などの本発明の化合物との組合せ、および薬学的に許容され得る担体を含む。一部の実施形態では、薬学的組成物は、MEK阻害剤と、式I、II、IIIもしくはIVまたは17yaもしくは12daの化合物またはその薬学的に許容され得る塩などの本発明の化合物との組合せ、および薬学的に許容され得る担体を含む。一部の実施形態では、薬学的組成物は、BRAF阻害剤およびMEK阻害剤と、式I、II、IIIもしくはIVまたは17yaもしくは12daの化合物またはその薬学的に許容され得る塩などの本発明の化合物との組合せ、および薬学的に許容され得る担体を含む。一部の実施形態では、薬学的組成物は、BRAF阻害剤とチューブリン阻害剤との組合せ、および薬学的に許容され得る担体を含む。一部の実施形態では、薬学的組成物は、MEK阻害剤とチューブリン阻害剤との組合せ、および薬学的に許容され得る担体を含む。一部の実施形態では、薬学的組成物は、BRAF阻害剤、MEK阻害剤とチューブリン阻害剤との組合せ、および薬学的に許容され得る担体を含む。
Aは、単一または縮合芳香族またはヘテロ芳香族環系であり;
R1は、H、C1−C6直鎖または分岐アルキル、アリール、フェニル、ベンジル、ハロアルキル、アミノアルキル、−OCH2Ph、SO2−アリール、SO2−フェニル、−(C=O)−アリール、−(C=O)−フェニルまたはOHであり;
R4およびR5は、それぞれ独立して水素、C1−C6直鎖または分岐アルキル、C1−C6直鎖または分岐ハロアルキル、C1−C6直鎖または分岐アルコキシ、C1−C6直鎖または分岐ハロアルコキシ、F、Cl、Br、I、CF3、CN、−CH2CN、NH2、OH、−OC(O)CF3、アルキルアミノ、アミノアルキル、−OCH2Ph、−NHCO−アルキル、COOH、−C(O)Ph、C(O)O−アルキル、C(O)H、−C(O)NH2またはNO2であり;ならびに
nは、1から4の間の整数である]
の構造によって表される化合物またはその薬学的に許容され得る塩、N−オキシド、水和物、互変異性体もしくは異性体、および薬学的に許容され得る担体を含む薬学的組成物に関する。別の実施形態では、別の実施形態では、本発明の化合物は化合物17yaである。別の実施形態では、本発明の化合物は化合物12daである。
1つの実施形態では、本発明は、本発明の方法のいずれかにおける使用のための、本明細書で述べる任意の実施形態を含む、化合物および組成物を提供する。1つの実施形態では、本発明の化合物またはこれを含む組成物の使用は、当業者に理解されるように、被験体において所望の応答を阻害する、抑制する、増強するまたは刺激するうえで有用性を有する。別の実施形態では、組成物は、その活性が本発明の化合物が投与される特定の適用のために有用である付加的な活性成分をさらに含んでもよい。
BRAF変異黒色腫およびベムラフェニブ耐性癌の処置のための化合物12daまたは17yaおよびベムラフェニブの併用
ベクターは、V600E変異体に関して承認された新規抗黒色腫薬であるが、約9か月の間に耐性を発現する。化合物12daおよび17yaを含むいくつかのチューブリン阻害剤を、どちらもBRAF V600E変異細胞株である親A375およびMDA−MB−435細胞に対するベムラフェニブとの抗増殖併用効果を評価するためにスクリーニングした。これらの組合せは耐性を克服するのに役立ち得る。
試薬および細胞株
ベムラフェニブ(PLX4032、RG7204またはR05185426としても公知)、トラメチニブ、スニチニブ(リンゴ酸塩)およびドセタキセルをLC Laboratories(Woburn,MA)より購入した。化合物12daは、以下で述べるように社内で合成した。化合物をジメチルスルホキシド(DMSO、Sigma−Aldrich,St.Louis,MO)に溶解し、10mMの保存溶液を作製した。ヒト黒色腫A375細胞株をATCC(Manassas,VA)より入手した。WM164およびMDA−MB−435細胞は、Dr.Meenhard Herlyn(Wistar Institute,Philadelphia,PA)およびDr.Robert Clarke(Georgetown University,Washington,DC)からそれぞれ入手した。すべての細胞株をこの試験のための使用に先立って確認した。細胞を、10%胎仔ウシ血清(FBS、Atlanta Biologicals,Lawrenceville,GA)、1%抗生物質/抗真菌薬混合物(Sigma−Aldrich,St.Louis,MO)および5μg/mLウシインスリン(Sigma−Aldrich,St.Louis,MO)を添加したDMEM培地(Mediatech,Inc.,Manassas,VA)中で培養した。
ベムラフェニブに対する獲得耐性を有する黒色腫細胞株を、報告されている方法(Su F,Bradley WD,Wang Qら、“Resistance to selective BRAF inhibition can be mediated by modest upstream pathway activation.”Cancer Res.(2012)72:969−978)に従って、漸増濃度のベムラフェニブ中で親A375細胞を少なくとも3か月間培養することによって慢性選択した。単離された耐性A375RF21細胞株は、ベムラフェニブについてのIC50が着実に50倍以上増大した(MTSアッセイによって決定された親A375細胞株における0.57±0.03μΜと比較してA375RF21細胞では28.9±0.6μΜ、図1)。耐性A375RF21細胞株を、2.5μΜベムラフェニブを含む完全成長培地中で維持した。
先に述べたようにMTSまたはSRBアッセイを用いて細胞増殖生存能を検討した。ベムラフェニブとチューブリン阻害剤の併用のインビトロ試験を設計し、各セットの処置の5つの複製と共にCalcuSynソフトウェア(Biosoft,Ferguson,MO)を用いて実施した。薬剤濃度は、パイロット試験からの各試験薬のIC50値に基づいて選択した。相乗作用、付加的な活性または拮抗作用は、Chou−Talalay法(Chou TC.“Drug combination studies and their synergy quantification using the Chou−Talalay method.”Cancer Res.(2010)70:440−446)を介して決定し、ソフトウェア出力で計算した併用指数(CI)を示した。
フローサイトメトリ分析を以前に記述されているように実施した(Wang Z,Chen J,Wang Jら、“Novel tubulin polymerization inhibitors overcome multidrug resistance and reduce melanoma lung metastasis.”Pharm.Res.(2012)29:3040−3052)。G2およびM期の細胞周期分布(図23)を決定するために、細胞をトリプシンで採取し、抗ホスホヒストンH3−AlexaFluor(登録商標)488抗体を用いて暗所にて氷上で1時間染色し、次いでPI/RNアーゼ溶液を用いて製造者の指示に従って(#FCCH025103、EMD Millipore Corporation,Ballerica,MA)暗所にて室温で30分間染色した。データをさらに処理し、Modfit 2.0プログラム(Verity Software House,Topsham,ME)を使用してグラフを作成した。
HTS−チューブリン重合アッセイを、市販のキットを製造者の指示に従って(#BK004P、Cytoskeleton,Inc.,Denver,CO)使用して、以前に記述されているように実施した。ウシ脳チューブリン(0.4mg)を5μΜ 12da、20μΜベムラフェニブまたは2つの薬剤の組合せと混合し、110μLの一般的チューブリン緩衝液(80mM PIPES、2.0mM MgCl2、0.5mM EDTAおよび1mM GTP)、pH6.9中でインキュベートした。340nmでの吸光度を、SYNERGY HTマイクロプレートリーダー(Bio−Tek Instruments,Winooski,VT)によって37℃で1分ごとに45分間、動力学的に記録した。単剤処置または併用処置のいずれかからのデータを、陽性対照群である10μMコルヒチンからのデータと比較した。
指示されている時点の処置時に、ヒト黒色腫A375RF21、MDA−MB−435またはWM164細胞を収集し、ウェスタンブロット法によって関連カスケードタンパク質またはアポトーシスマーカーを検討した。ホスファターゼ−プロテイナーゼ阻害剤カクテル(Sigma−Aldrich,St.Louis,MO)を含むRIPA緩衝液(Sigma−Aldrich,St.Louis,MO)で細胞を溶解することによって全タンパク質を抽出した。次にキット(Sigma−Aldrich,St.Louis,MO)を使用してBCA法によって一般タンパク質濃度を測定した。細胞溶解物を、Laemmli負荷緩衝液(Bio−Rad,Hercules,CA)を使用して等しい一般タンパク質濃度に希釈し、5分間煮沸してタンパク質を変性させた。次に10μgの一般タンパク質を含む群試料を電気泳動のために4〜15%トリス−HClプレキャストポリアクリルアミドゲル(Bio−Rad,Hercules,CA)の各ウェルに負荷し、その後0.2μmニトロセルロース膜(Bio−Rad,Hercules,CA)に移した。1×TBST中で室温にて1時間、5%ウシ血清アルブミンでブロックした後、膜を一次ウサギ抗体(Cell Signaling Technology,Inc.,Danvers,MA):抗ホスホERK1/2(Thr202/Tyr204;#9101)、抗p44/42 MAPK(ERK1/2;#9102)、抗ホスホAKT(Ser473;#9271)、抗AKT(#9272)、抗サイクリンD1(92G2;#2978);抗切断PARP(Asp214;#9185)、抗切断カスパーゼ3(Asp 175;#9664)、抗RAS(#3339)、抗ARAF(#4432)、抗BRAF(#9433)、抗CRAF(#9422)、ホスホPI3キナーゼp85(Tyr458)/p55(Tyrl99)(#4228)、抗PTEN(#9188)、抗PDGF受容体β(#3169)または抗GAPDH(#3683)と共に別々に4℃で一晩さらにインキュベートした。次に膜を抗ウサギIgG HRP結合二次抗体(Cell Signaling、#7071)と共に室温で1時間インキュベートした。1×LumiGLO(登録商標)試薬(Cell Signaling、#7003)と共に1分間インキュベートすることによって標的タンパク質を検出し、x線フィルムに暴露した。フィルムをグレースケールでスキャンし、レーン強度をImageJソフトウェア(NIH,Bethesda,MD,USA)で定量化した。
A375RF21細胞を6ウェルプレート(1×106/ウェル)に接種し、5‰DMSO、ベムラフェニブ、12da、ドセタキセルまたは指示されている組合せを含む成長培地で処置した。48時間のインキュベーション後、アネキシンV−FITCアポトーシス検出キット(Abcam,Cambridge,MA)を製造者の指示通りに使用してアポトーシス分析を実施し、BD LSR−IIサイトメータ(BD Biosciences,San Jose,CA)によって分析した。
7〜8週齢の雄性ヌードマウスをCharles River Laboratories International,Inc.(Wilmington,MA)より購入した。A375RF21細胞を、FBSを含まない氷冷フェノールレッド不含およびFBS不含DMEM培地に懸濁し、使用の直前に高濃度のマトリゲル(BD Biosciences,San Joes,CA)と1:1の比率で混合した。3×l06細胞を含む100μLのこの混合物を各マウスの左背側側腹部に皮下(s.c.)注射した。接種の1週間後に、マウスを4つの群に無作為に割り付け(初期低用量についてはn=7およびその後の高用量薬剤併用についてはn=5)、処置を開始した。化合物12daまたはベムラフェニブをPEG300(Sigma−Aldrich,St.Louis,MO)に希釈し、1日1回、週に5日で連続3週間、腹腔内(i.p.)注射によって投与した。ビヒクル対照群には、同じ容量(100μL)のPEG300を同じ投与頻度でi.p.注射した。実験の最後に、マウスを安楽死させ、腫瘍組織を単離して、計量し、次に10%ホルマリンリン酸緩衝液中に固定した。
1週間以上ホルマリン緩衝液に固定した腫瘍組織をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。免疫組織化学(IHC)分析のために、以下の一次抗体を使用した:ウサギ抗Ki67、抗ホスホAKT(Ser473)および抗ホスホERK1/2(Thr202/Tyr204)(#9027;#4060;#4376;Cell Signaling Technology,Inc.,Danvers,MA)。抗S100一次抗体をAbcam(#ab868、Abcam Inc.,Cambridge,MA)より購入した。製造者のプロトコルに従って分析を実施した。
Prism Software 5.0(GraphPad Software,Inc.,San Diego,CA)を使用してデータを分析した。統計的有意性(P<0.05)を、インビトロアポトーシス検出および異種移植試験に関してマン‐ホイットニー順位和検定(Mann−Whitney Rank Test)、ノンパラメトリックt検定および一方向ANOVAによって評価した。処置群をビヒクル群と比較し、併用処置群を、それに応じて、単剤処置を受けた群と比較した。
チューブリン阻害剤17yaおよび12daとベムラフェニブの併用は、親細胞株およびベムラフェニブ耐性黒色腫細胞株の両方において強力な相乗作用を示した。
化合物17yaおよび12daを含むいくつかのチューブリン阻害剤を、どちらもBRAFV600E変異細胞株である親A375およびMDA−MB−435細胞に対するベムラフェニブとの抗増殖併用効果を評価するためにスクリーニングした。どちらも周知の2つのチューブリン阻害剤、ドセタキセルおよびコルヒチンを比較のために含めた(表1および図24)。12daとベムラフェニブの併用に関して計算されたCI値は、それらのED50で0.32(A375細胞株)および0.10(MDA−MB−435細胞株)という低さであることが認められた。さらに、MEKi(トラメチニブ)および一般的受容体チロシンキナーゼ阻害剤(RTKi;スニチニブ)は付加的なCI値しか示さないことが明らかになった(表1)。
コルヒチン部位に結合するチューブリン阻害剤として、化合物12daは、親A375細胞株においてG2/M期を用量依存的に有効にブロックする。化合物12daとベムラフェニブの併用がベムラフェニブ耐性細胞を異なる複製期で停止させるかどうかを判定するため、A375RF21細胞において細胞周期分析を実施した。指示濃度の化合物溶液に24時間暴露した後、図2Bのデータは相乗的細胞周期停止を明らかに示した。DMSO対照に関しては、50%のA375RF21細胞がG0/G1期に分布し、S期またはG2/M期の細胞の割合は、対応して12%または32%であった。20nMの濃度の化合物12da単剤処置群については、G2/M期に分布する細胞の割合は70%まで蓄積していた。耐性A375RF21細胞株で同様のG0/G1細胞周期停止を生じさせるためにベムラフェニブを単剤として使用すると、親A375細胞での1μΜ未満と比較して、ベムラフェニブの濃度を30μΜまたはそれを超える濃度まで上昇させなければならなかった。予想されたように、ベムラフェニブと化合物12daの併用はA375RF21細胞をG0/G1期(48%)およびG2/M(43%)期の両方で強力に停止させた。加えて、併用処置ははるかに多い細胞デブリを生成し、これは癌細胞アポトーシスの増大を指示した。ベムラフェニブとドセタキセルの併用による処置は同様の相乗作用を生じさせた。
併用処置の細胞アポトーシス誘導作用の可能性をより明瞭に理解するために、アネキシンVおよびヨウ化プロピジウム共染色フローサイトメトリを利用して、A375RF21において生細胞とアポトーシス細胞を区別した。予想されたように、単剤処置は試験濃度で細胞アポトーシスを誘導することに控えめな作用しか生じさせなかった;これに対し、併用処置群はアポトーシスを有意に増強した(図3A)。Q1(早期アポトーシス)、Q2(アポトーシス)およびQ4(死細胞)に分布する細胞のパーセント合計を定量化した図3Bに示すように、化合物12daとベムラフェニブの併用は50±7.6%の計数された細胞アポトーシスまたは細胞死をもたらし、これは2つの単剤処置群のアポトーシスパーセント(化合物12daについては11.8±3.0%およびベムラフェニブについては11.9±3.5%)の単純合計よりはるかに高い。アポトーシス誘導の同様の相乗作用はドセタキセルを含む併用処置群でも観察された(ドセタキセル群については6.4±3.0%、併用については38.1±2.6%)。
化合物12daはチューブリン重合を標的とし(Chen J,Li CM,Wang Jら、“Synthesis and antiproliferative activity of novel 2−aryl−4−benzoyl−imidazole derivatives targeting tubulin polymerization.”Bioorg.Med.Chem.(2011)19:4782−4795;Chen J,Wang Z,Li CMら、“Discovery of novel 2−aryl−4−benzoyl−imidazoles targeting the colchicines binding site in tubulin as potential anticancer agents.”J.Med.Chem.(2010)53:7414−7427)、ベムラフェニブはBRAFV600Eを標的とすることが確認されている。この強力な相乗的併用を導く原因となる分子機構を理解するための最初のアプローチとして、相乗作用が化合物12daまたはベムラフェニブの直接標的の増強によって媒介されるかどうかを検討した。図4に示すように、ベムラフェニブ単独では、20μΜの高濃度でも、チューブリン重合に全く影響を及ぼさなかった。化合物12daにベムラフェニブを付加すると、単剤の化合物12daと比較して、多くてもチューブリン重合の阻害をかろうじて増大させる程度であった。併用処置におけるチューブリン重合の阻害はもっぱら化合物12daによって寄与され、相乗的併用は化合物12daの直接標的阻害の増強によって媒介されるのではないことを示唆した。次に、併用が、ベムラフェニブによるBRAFV600E阻害の特徴であるpERKに何らかの作用を及ぼすかどうかを、ウェスタンブロット法を用いて測定した。図5Aは、化合物12daまたは併用処置のいずれも、A375RF21耐性細胞との48時間のインキュベーション後にpERKまたは全ERKレベルに明確な影響を及ぼさないことを明らかにした。化合物12daを別のチューブリン阻害剤、ドセタキセルに置き換えても同様の結果を生じた(図5A)。それゆえ、相乗的併用はBRAFV600Eの阻害の増強を介するのではないと考えられた。
インビトロでA375RF21細胞に対して観察された強力な相乗作用がインビボでベムラフェニブ耐性腫瘍に移行され得るかどうかを評価するため、腫瘍成長への併用効果の影響を単剤処置の影響と比較した。化合物12daが25mg/kgの用量で親A375黒色腫腫瘍成長をインビボで抑制するのに有効であることが以前に確認された(Wang Z,Chen J,Wang Jら、“Novel tubulin polymerization inhibitors overcome multidrug resistance and reduce melanoma lung metastasis”.Pharm.Res.29(11):3040−3052)。パイロット試験は、ベムラフェニブ耐性A375RF21細胞が薬剤処置の不在下でそれらの親A375細胞と類似の成長動態を有する(図26)ことを示した。ベムラフェニブとのその併用に起因する潜在的に不測の毒性を回避するため、化合物12daの用量を10mg/kgに低減した。
図6および表6に提示する結果は有望であるが、腫瘍退縮をもたらすとは思われなかったので、化合物12daとベムラフェニブの両方について用量を50%増加することによって実験を反復した。結果を図7および表7に示す。
BRAFV600E変異を保持する黒色腫患者に関して承認された最初の薬剤であるベムラフェニブは、初期療法において著明な応答を示したが、この薬剤を服用したほとんどすべての患者が数か月以内にベムラフェニブに対する耐性を発現した(Bollag G,Tsai J,Zhang Jら、“Vemurafenib:the first drug approved for BRAF−mutant cancer.”Nat.Rev.Drug Discov.(2012)11:873−886)。初期耐性または獲得耐性の基礎となる機構を理解することおよび適切な併用戦略を開発することは、そのような耐性を克服するより有効な方法を提供し得る。BRAFまたはMEK1/2阻害剤に対する黒色腫腫瘍耐性を除去するまたは低減するために、ベムラフェニブと他剤との有効な併用を模索するために前臨床試験および臨床試験の両方において豊富な文献が存在する(Greger JG,Eastman SD,Zhang Vら、“Combinations of BRAF,MEK,and PI3K/mTOR inhibitors overcome acquired resistance to the BRAF inhibitor GSK2118436 dabrafenib,mediated by NRAS or MEK mutations.”Mol.Cancer Ther.(2012)11:909−920;Patel SP,Lazar AJ,Papadopoulos NEら、“Clinical responses to selumetinib(AZD6244;ARRY−142886)−based combination therapy stratified by gene mutations in patients with metastatic melanoma.”Cancer(2013)119(4):799−805;Flaherty KT,Infante JR,Daud Aら、“Combined BRAF and MEK inhibition in melanoma with BRAF V600 mutations.”N.Engl.J.Med.(2012)367:1694−1703;Niehr F,von Euw E,Attar Nら、“Combination therapy with vemurafenib(PLX4032/RG7204)and metformin in melanoma cell lines with distinct driver mutations.”J.Transl.Med.(2011)9:76;Paraiso KH,Haarberg HE,Wood Eら、“The HSP90 inhibitor XL888 overcomes BRAF inhibitor resistance mediated through diverse mechanisms.”Clin.Cancer Res.(2012)18:2502−2514;Koya RC,Mok S,Otte Nら、“BRAF inhibitor vemurafenib improves the antitumor activity of adoptive cell immunotherapy.”Cancer Res.(2012)72:3928−3937)。RAF/MEK/ERK経路に対する阻害剤は、黒色腫腫瘍細胞死ではなく主としてG1細胞周期停止を生じさせる。したがって同じ経路内の異なる成分を標的とする作用物質の併用(例えばベムラフェニブとMEK1/2阻害剤の併用)は、最初は有効であるが(Little AS,Smith PD,Cook SJ.“Mechanisms of acquired resistance to ERK1/2 pathway inhibitors.”Oncogene(2012)32(10):1207−1215)、これらのG1細胞周期停止から逃れることができる耐性細胞に対しては持続的な相乗作用を維持することができない。チューブリン阻害剤の主要な特徴の1つは、細胞をG2/M期で強力に停止させるそれらの能力であるので、ベムラフェニブとチューブリン阻害剤の併用は、黒色腫細胞を相乗的に停止させてアポトーシスの増強をもたらし、獲得耐性を克服すると考えられた。この試験では、新規チューブリン阻害剤、化合物12daを、黒色腫腫瘍に対するベムラフェニブとのその併用を検討するために選択した。ベムラフェニブ耐性ヒト黒色腫細胞株A375RF21を開発し、化合物12daとベムラフェニブの併用がインビトロで強力な相乗作用を有することを示した。相乗作用は、チューブリン重合の阻害の増強またはp−ERK活性化の低減を介する可能性は低いことが確認された。その代わりに、実験結果は、この併用処置が、相乗的G1およびG2/M細胞周期停止によって生じるアポトーシス誘導の増強を介して獲得ベムラフェニブ耐性を克服し、AKTリン酸化に関連する生存シグナル伝達経路を実質的に損傷することを明らかにした。インビトロで認められた強力な相乗作用は、ベムラフェニブ耐性異種移植モデルで試験した場合、インビボでの有意の効果に明らかに移行することが示された。組織切片に関するさらなる免疫組織化学分析は、腫瘍増殖の強力な阻害とpAKTの活性低下を確認した。PI3K/AKT/mTORシグナル伝達経路の活性化は、ヒト黒色腫細胞株においてERK1/2阻害に対する感受性低下に寄与することが示されており(Bartholomeusz C,Gonzalez−Angulo AM.“Targeting the PI3K signaling pathway in cancer therapy.”Expert Opin.Ther.Targets(2012)16:121−130)、いくつかの最近の試験は、PI3K/AKT/mTOR経路を標的とする阻害剤とBRAF阻害剤またはMEK阻害剤との相乗的併用を明らかに示している(Liu R,Liu D,Xing M.“The Akt inhibitor MK2206 synergizes,but perifosine antagonizes,the BRAF(V600E)inhibitor PLX4032 and the MEK1/2 inhibitor AZD6244 in the inhibition of thyroid cancer cells.”J. Clin.Endocrinol.Metab.(2012)97:E173−182)。最近、いくつかの新規クラス化合物がチューブリン重合の阻害剤として報告され、AKT経路の強力な阻害も示した(Krishnegowda G,Prakasha Gowda ASら、“Synthesis and biological evaluation of a novel class of isatin analogs as dual inhibitors of tubulin polymerization and Akt pathway.”Bioorg.Med.Chem.(2011)19:6006−6014;Viola G,Bortolozzi R,Hamel Eら、“MG−2477,a new tubulin inhibitor,induces autophagy through inhibition of the Akt/mTOR pathway and delayed apoptosis in A549 cells.”Biochem.Pharmacol.(2012)83:16−26;Zhang C,Yang N,Yang CHら、“S9,a novel anticancer agent,exerts its anti−proliferative activity by interfering with both PI3K−Akt−mTOR signaling and microtubule cytoskeleton.”PLoS One(2009)4:e4881)。加えて、構成的に活性なPI3K/AKT経路は、微小管を標的とするチューブリン重合剤(MTPA)に対する多剤耐性をもたらすことが示されており、またPI3K/AKT媒介性シグナル伝達経路の阻害は、MTPA誘導性アポトーシスに対して癌細胞を感作することが示されている(Bhalla KN.“Microtubule−targeted anticancer agents and apoptosis.”Oncogene(2003)22:9075−9086)。これらの試験は、癌細胞におけるチューブリン重合阻害剤とAKT下方調節との間の密接な相互作用を指示する。加えて、MEK阻害剤AZD6244が、ドセタキセルと併用した場合、黒色腫細胞における成長停止および腫瘍退縮を誘導することが最近報告された(Haass NK,Sproesser K,Nguyen TKら、“The mitogen activated protein/extracellular signal−regulated kinase kinase inhibitor AZD6244(ARRY−142886)induces growth arrest in melanoma cells and tumor regression when combined with docetaxel.”Clin.Cancer Res.(2008)14:230−239)。興味深いことに、今回の結果はこれらの試験と一致する。本発明で提示したインビボ試験は、A375RF21異種移植モデルを使用することにより、既にベムラフェニブ耐性である腫瘍細胞における有効な併用処置を示す。腫瘍細胞がベムラフェニブに耐性になる前に併用を用いた場合、腫瘍退縮はより増強され得、耐性腫瘍細胞の発現が有意に遅延され得るまたはさらには予防され得ることが考えられる。これは、患者における少なくとも実質的により長い進行のない期間および/または疾患後退の増強となり得る。合わせると、この試験は、黒色腫患者に対する大きく改善された療法のために強力なチューブリン阻害剤をRAF/MEK/ERK経路を標的とする阻害剤と併用することについての最初の直接の証拠および論理的根拠を提供する。
(実施例2)
選択したアリール−ベンゾイル−イミダゾール化合物の合成
2−アリール−1H−イミダゾール(9a〜j、p、x;図8および9)の調製。
2−アリール−1−(フェニルスルホニル)−1H−イミダゾール(10a〜j、p、x;図8および9)の調製。
アリール(2−アリール−1−(フェニルスルホニル)−1H−イミダゾール−4−イル)メタノン(11aa〜ai、ba、ca、cb、da、db、ea、eb、fa、fb、ga、gb、ha、hb、ia、ib、ja、jb、pa;図8および9)の調製。
アリール(2−アリール−1H−イミダゾール−4−イル)メタノン(12aa〜ai、ba、ca、cb、da、db、ea、eb、fa、fb、ga、gb、ha、hb、ia、ib、ja、jb、pa;図8および9)の調製のための一般的手順
(2−(4−ヒドロキシフェニル)−1H−イミダゾール−4−イル)(アリール)メタノン(12ka、12kb;図9)の調製。
(2−アリール−1H−イミダゾール−4−イル)(3,4,5−トリヒドロキシフェニル)メタノン13ea、13fa、13haの調製(図9)。
アリール(2−アリール−1H−イミダゾール−4−イル)メタノン−HCl塩(12db−HCl)の調製。
アリール(2−フェニル−1H−イミダゾール−1−イル)メタノン(12aba、12aaa;図10)の調製。
1−置換−(2−フェニル−1H−イミダゾール−1−イル)−アリール−メタノン(12dc、12fc、12daa、12dab、12cba、11gaa、12la;図11〜12)の調製。
R1=Cl(12fc)
12daa、12dab、12cbaの合成、方法E:[図11]:
R1=Me;R2=CH3;R3=3,4,5−(OMe)3(12dab)
R1=OMe;R2=CH3;R3=F(12cba)
R1=Br;R2=H(12la)
(2−(4−ブロモフェニル)−1H−イミダゾール−4−イル)(3,4,5−トリメトキシフェニル)メタノン(12la)の合成(図12)
(4−フルオロフェニル)(2−(4−メトキシフェニル)−1H−イミダゾール−4−イル)メタノン(12cb)の合成(図8)。
(2−(p−トリル)−1H−イミダゾール−4−イル)(3,4,5−トリメトキシフェニル)メタノン(12da)の合成(図9)。
(2−(4−クロロフェニル)−1H−イミダゾール−4−イル)(3,4,5−トリメトキシフェニル)メタノン(12fa)の合成(図9および13)。
(インドリル)−1H−イミダゾール−4−イル)(3,4,5−トリメトキシフェニルメタノン(17ya)、(17yab)および(17yac)の合成(図14)
(2−(1H−インドール−3−イル)−1H−イミダゾール−4−イル)(3,4,5−トリメトキシフェニル)メタノン(17ya)の合成:
選択した本発明のABI化合物の抗増殖活性
細胞培養細胞傷害性アッセイ
実験材料および方法
3つの黒色腫細胞株(1つのマウス黒色腫細胞株、B16−F1および2つのヒト転移性黒色腫細胞株、A375およびWM−164)ならびに4つのヒト前立腺癌細胞株(LNCaP、PC−3、Du 145およびPPC−1)を使用した本発明の化合物のインビトロ抗成長活性の結果を表8〜10に要約する。
細胞周期分布をヨウ化プロピジウム(PI)染色によって測定した。処置した細胞をPBSで洗浄し、70%氷冷エタノールで一晩固定した。次に固定細胞をRNアーゼA(300μg/mL)の存在下に20μg/mLのPIで37℃にて30分間染色した。細胞周期分布は、University of Tennessee Health Science Center,TNの蛍光活性化細胞選別(FACS)分析コアサービスによって分析された。
反転ABI(RABI)は、細胞周期分析により、それらが細胞をG2/M期で停止させることを明らかにした。化合物12q、70a、70fおよび70mをPC3細胞に関して24時間処置し(図15)、PI染色細胞の分布をFACS分析によって検討した。4つの異なる濃度−1、10、50および100nMの各化合物を、用量効果を調べるために選択した。ビヒクル処置群では、約18%のPC3細胞がG2/M期に分布した。RABIは、G2/M期の細胞の割合を約70%まで濃度依存的に増大させた。G2/M期で細胞を停止させる種々の濃度の効力は、インビトロ細胞成長阻害活性と正に相関した。RABIの抗増殖作用を表10Aおよび10Bに報告する。一部のRABIは極めて強力な抗増殖作用を示した(例えば70a参照)。
薬物耐性黒色腫細胞におけるアリール−ベンゾイル−イミダゾール(ABI)化合物の活性
P糖タンパク質(Pgp)媒介性薬剤排出は、癌細胞が有効な細胞内抗癌薬濃度の蓄積を妨げる主要機構である。ABI化合物の活性を多剤耐性(MDR)黒色腫細胞(MDA−MB−435/LCCMDR1)およびそれらの親非耐性癌細胞(MDA−MB−435)に対して比較した。MDA−MB−435細胞は、最初は乳癌細胞株と指定されたが、M14黒色腫細胞株が起源であることが決定的に示された。化合物12da、12fb、12cb、11cbおよび11fbを、コルヒチン、パクリタキセルおよびビンブラスチンを含む他のチューブリン標的化薬剤と共に、MDR黒色腫細胞株およびその親黒色腫細胞株の両方に関して試験した(表11A)。パクリタキセルおよびビンブラスチンは、細胞チューブリンを標的とすることが公知の臨床的に使用される抗癌薬である。コルヒチンは癌処置のためのFDA承認薬ではないが、そのプロドラッグであるZD6126が固形腫瘍に関して臨床試験中である。ボルテゾミブは最初の治療用プロテアソーム阻害剤であり、多発性骨髄腫における使用に関して2003年にFDAによって承認された。ABT−751は、チューブリンコルヒチン結合部位を標的とすることが公知である。これは、再発性または難治性神経芽細胞腫を有する小児のための臨床試験下にある有望な薬剤候補物である。化合物12da、12fb、12cb、11cb、11fbは、コルヒチン(65.8)、パクリタキセル(69.3)およびビンブラスチン(27.5)よりもはるかに良好な耐性指数を有していた(12daについては3.0、12fbは0.9、12cbは1.3、11cbは0.8、11fbは0.7)。コルヒチン、パクリタキセルおよびビンブラスチンは非耐性黒色腫細胞株において優れた活性を示したが(0.5〜10nM)、これらの化合物はMDR黒色腫細胞株では効力が有意に低かった(277〜658nM)。これに対し、12cb、11cb、11fbは、MDR(12da、12fb、12cb、11cbおよび11fbについてそれぞれ15nM、38nM、30nM、30nM、35nM)ならびに非耐性黒色腫細胞株(12da、12fb、12cb、11cbおよび11fbについてそれぞれ5nM、41nM、24nM、38nM、50nM)の両方に基本的に等しい効力を有していた。化合物12daは、A375およびWM−164細胞に対してパクリタキセルおよびコルヒチンよりも活性であった。
インビトロ微小管重合アッセイ
実験材料および方法
ウシ脳チューブリン(0.4mg)(Cytoskeleton,Denver,CO)を10μΜの試験化合物と混合し、110μlの一般的チューブリン緩衝液(80mM PIPES、2.0mM MgCl2、0.5mM EGTAおよび1mM GTP)、pH6.9中でインキュベートした。340nmでの吸光度を、SYNERGY 4マイクロプレートリーダー(Bio−Tek Instruments,Winooski,VT)によって1分ごとに15分間観測した。分光光度計をチューブリン重合のために37℃に設定した。
アリール−ベンゾイル−イミダゾール(ABI)化合物によるチューブリン重合の阻害を検討した。ウシ脳チューブリン(純度>97%)を10μΜの濃度の3つの強力なABI化合物、12cb、12daおよび12dbと共にインキュベートし、これらのABI化合物のチューブリン重合への作用を測定した(図17)。チューブリン重合は化合物12daによって完全に阻害され、化合物12cbおよび12dbとのインキュベーションの間に〜80%の阻害が観察された。
インビトロでの黒色腫阻害
実験材料および方法
B16−F1黒色腫細胞を0.8%基礎寒天の上にコロニー形成密度(6ウェルプレートで2000細胞/ウェル)で塗布した。細胞を、胎仔ウシ血清および抗生物質−抗真菌薬溶液を添加したDMEM培地と共に0.4%寒天中で、37℃にて95%空気および5%CO2の雰囲気中で成長させた。細胞を種々の濃度(20、100および500nM)の化合物12da、12cbおよび12fbで処置した。化合物を1mM DMSO保存溶液から培地に添加し、DMSOの対応する希釈物を対照として使用した。細胞を14日間成長させた。プレートを写真撮影し、コロニーの数をArtek 880 Automated Colony Counter(Artek Systems Corporation,Farmingdale,NY)によって測定した。
4つの代表的な写真を図18に示す。14日間のインキュベーション後、約130の検出可能なコロニー(100μmを超える直径)が対照(処置なし)において形成された。
インビボ抗腫瘍活性
実験材料および方法
動物:4〜6週齢の雌性C57/BLマウスをHarlan Laboratories(Harlan Laboratories Inc.,Indianapolis,IN)より購入した。動物の飼育施設は実験動物ケア評価認証協会(Association for Assessment and Accreditation and Laboratory Animal Care)の規格に適合した。すべての手順を我々の施設内動物実験委員会(Institutional Animal Care and Use Committee)のガイドラインに従って実施した。
ABI類似体の効果をインビボで評価するため、マウス黒色腫B16−F1異種移植片への化合物12cbの抗腫瘍活性を試験した。悪性黒色腫処置におけるゴールドスタンダードであるDTIC(Against DTIC)を陽性対照として使用した(図19A)。20匹の雌性C57/BLマウスを4つの群:ビヒクル対照群、DTIC(60mg/kg)処置群、12cb(10mg/kg)処置群および12cb(30mg/kg)処置群に分けた。各々のマウスに50万個のB16−F1黒色腫細胞を皮下注射した。腫瘍接種の7日後、処置を開始し、各化合物を毎日腹腔内注射した(図19)。腫瘍体積は、14日間の処置後に、12cb(10mg/kg)、DTIC(60mg/kg)および12cb(30mg/kg)に関してそれぞれ47%、51%および73%有意に縮小した(p<0.05)。実験期間中、いずれの処置群においても有意の体重減少を認めなかった。
化合物17ya、12faおよび55のインビトロおよびインビボ薬理学
実験材料および方法
前立腺癌の細胞培養および細胞傷害性アッセイ。すべての前立腺癌細胞株(LNCaP、PC−3およびDU145、PPC−1)をATCC(American Type Culture Collection,Manassas,VA,USA)より入手した。ヒトPC−3_TxRはパクリタキセルに耐性であり、PC−3と比較したMDRモデルとして使用した。細胞培養用品はCellgro Mediatech(Herndon,VA,USA)より購入した。すべての細胞株を使用して、スルホローダミンB(SRB)アッセイによって化合物17ya、12faおよび55の抗増殖活性を試験した。すべての細胞株を、2mMグルタミンおよび10%胎仔ウシ血清(FBS)を含むRPMI 1640培地中で維持した。
17yaおよび55は、多剤耐性細胞を含む細胞において幅広い細胞傷害性を示す。
癌細胞株の成長を阻害する17yaおよび55の能力を、SRBアッセイを用いて評価した(表12)。両化合物は、5つの前立腺癌および1つの神経膠腫癌細胞株を含むいくつかのヒト癌細胞株の成長を、低いナノモル範囲のIC50値で阻害した。17yaは、これらの細胞株において55より1.7〜4.3倍高い効力を示した。P糖タンパク質(P−gp)を過剰発現するパクリタキセル耐性PC−3(PC−3/TxR)細胞株を使用して、17yaおよび55に関する薬物耐性の作用を検討し、その親であるPC−3細胞株に対して比較した。ドセタキセルのIC50値は、PC−3およびPC−3/TxR細胞株においてそれぞれ1.2±0.1nMおよび17.7±0.7nMであった。17yaおよび55はどちらも、親PC−3およびPC−3/TxRに対して等効力であったが、パクリタキセルおよびドセタキセルはそれぞれ85倍および15倍の相対的耐性を示した。これらのデータは、17yaおよび55の両方がP−gp媒介性薬物耐性を回避することを指示する。
チューブリンと低分子阻害剤の相互作用を検討するために競合的マス結合アッセイを開発した。この試験では、様々な濃度の17yaおよび55を使用して、コルヒチン−チューブリン結合部位と競合させた。両化合物はチューブリン結合に関してコルヒチンと有効に競合した(図20A);しかし、それらの競合的結合曲線は、公知の強力なコルヒチン部位結合リガンドであるポドフィロトキシンと比較した場合、より高い濃度で実質的にゼロから逸脱した。これは、17yaおよび55の両方がポドフィロトキシンよりも低い親和性を示したことまたはそれらがコルヒチン結合部位に部分的に結合することを示唆する。陰性対照であるビンブラスチンは、コルヒチン−チューブリン結合を阻害せず、この競合的マス結合アッセイの特異性を成功裏に実証した。
薬剤様特性、例えば代謝安定性、透過性、水溶解度および薬剤間相互作用を17yaおよび55に関して検討した(表13A)。17yaは、55より大きな代謝安定性および水溶解度を示した。両方の化学物質が十分すぎるほどの透過性値を示し、それらを経口的に使用する潜在的可能性を示唆した。加えて、17yaおよび55はどちらも、CYP酵素阻害アッセイでマイクロモル範囲の高いIC50値を示し、両化合物が主要なCYP肝酵素を介した薬剤間相互作用を回避し得ることを指示した。全体として、両化合物は好ましい薬剤様特性を示した。
化合物17yaはイミダゾール環を含んでおり、この環は水溶解度を改善し、>75μg/mLの水溶解度をもたらした(表13A)。化合物12faおよび55はより低い溶解度を示し、それぞれ12および19μg/mLを示した。全体として、17yaは高い水溶解度を明らかにし、12faおよび55は許容され得る溶解度を示し、1hより大きく改善した。12faのより高い溶解度は、1hと比較してはるかに改善された経口バイオアベイラビリティとなった(ラットにおいて35%対3.3%)。17yaおよび55についても同様に、水溶解度は、以下で論じるようにはるかに改善された経口バイオアベイラビリティと相関した(表14)。
ICRマウス、Sprague−Dawleyラットおよびビーグル犬において単回(i.v.またはp.o.)投与で与えた17yaおよび55の薬物動態パラメータを表14に要約する。17yaはマウスおよびラットにおいて低いクリアランスを示し、17yaがこれらの種で代謝安定性および最小限の初回通過代謝を示すことを示唆した。17yaはマウスおよびラットで中等度の容積の分布を有し、腫瘍を含む組織中に適切に分布し得ることを指示した。マウスおよびラットと異なり、驚くべきことに、イヌにおける17yaの総クリアランスは高かった。イヌ血漿中の2つの豊富な代謝産物、ヒドロキシル化代謝産物および親の+34m/zを有する未知の代謝産物(データは示していない)は、イヌ肝ミクロソームで認められたものと一致した。要約すると、イヌでは55と比較してより高いクリアランスとより低い経口暴露が17yaに関して得られたが、マウスおよびラットでは得られなかった。加えて、17yaはイヌ肝ミクロソームにおいてのみ豊富な代謝産物を示したが、マウス、ラットまたはヒト肝ミクロソームではこれを示さなかった(データは示していない)。17yaは、ラット、マウスおよびイヌにおいてそれぞれ21%、36%および50%の許容され得る経口バイオアベイラビリティを示した。その一方で、55はラットで低いクリアランスを有し、マウスおよびイヌでは中等度のクリアランスを有していた。17yaと同様に、55はこれらの種で中等度の容積の分布を示した。55は、3つの種の間で一定な経口バイオアベイラビリティを有していた(24%〜36%)。これらの特性は、17yaおよび55の両方が潜在的に経口で使用可能なチューブリン阻害剤であることを指示する。
PC−3(図21A)およびパクリタキセル耐性前立腺癌(PC−3/TxR)(図21B)細胞をヌードマウスに接種し、腫瘍体積を約150〜300mm3まで増大させた。 前立腺癌のために臨床で使用されている、ドセタキセル(10または20mg/kg)を使用して、インビボでP−gp媒介性薬物耐性のモデルにおけるその有効性を評価した。PC−3/TxR腫瘍は迅速に成長することが認められ、その体積は試験の終了時に1500〜2500mm3に達した。10および20mg/kgの静脈内投与したドセタキセルは両方のモデルで用量反応を示したが(図21Aおよび21B)、10mg/kgで静脈内投与した場合、腫瘍成長阻害(TGI)作用はPC−3腫瘍での84%TGIからPC−3/TxR腫瘍では14%TGIに低下した(表15)。加えて、より高用量(20mg/kg)で、ドセタキセルはPC−3腫瘍の部分的な退縮(>100%TGI)を生じさせたが、PC−3/TxR腫瘍では辛うじて56%TGIであった。PC−3/TxR腫瘍におけるドセタキセルの有効性は、PC−3腫瘍におけるものと比較した場合著しく低下し、効果がP−gp媒介性薬物耐性によって損なわれることを示唆し、またこれらの結果は、我々のインビトロ細胞傷害性またはアポトーシスデータと非常に良好に一致する。PC−3/TxR腫瘍におけるドセタキセルの効果の欠如に対し、経口投与した17ya(6.7mg/kg)は、体重への影響を伴わずに100%を超えるTGIを明らかにした(図21Bおよび表15)。加えて、PC−3/TxR腫瘍を担持する4匹のヌードマウスのうち2匹は19日目に腫瘍が存在しなかった(データは示していない)。
PC−3/TxR異種移植モデルをさらに利用して、17ya(他の投薬スケジュールで)および55の効果を評価した。17yaの最大耐容量(体重減少>20%)は、1日1回4日間経口投与した場合、10mg/kg;または1日2回(b.i.d.)5日間投与した場合は3.3mg/kgであることが認められた(データは示していない)。図21Cに示すように、3.3mg/kgの17yaを第1週目の最初の連続4日間b.i.d.で投与し、その後スケジュールを2週目から4週目まで1日1回に変更した。結果は、4〜19日目の間部分的な退縮が得られ、TGIは97%であり、7匹のマウスのうち1匹は26日目に腫瘍を有していなかったことを示す。より低い投与頻度(q2d)でより高用量(10mg/kg)の17yaは(図21D)、13日目から29日目までの間部分的な退縮を生じさせた。これらのデータは、最適用量および投薬スケジュールでのレジメンは17yaがPC−3/TxR腫瘍を成功裏に阻害するのを促進することを示唆する。55を、10または30mg/kg b.i.d.で1週目から4週目まで週に5回、ヌードマウスに経口投与した。図21Cに示すように、阻害プロフィールはPC−3/TxR腫瘍における用量反応を示す。TGI値は、低用量(10mg/kg)での処置群に関して59%であった。さらに、高用量(30mg/kg)は、19日目から試験の終了時(26日目)まで部分的退縮(>100%TGI)を示し始めた。ビヒクル群の一部のマウスは、一部には癌悪液質のために、終了時に体重が減少していた。これに対し、17ya(3.3mg/kg)または55(30mg/kg)で処置したマウスは体重が増加しつつあり(表15)、17yaまたは55のこれらの最適用量が良好に耐容され得ることおよび癌悪液質を予防することを示唆した。
20mg/kgの17yaまたは55の経口投与後1時間目と4時間目にヌードマウスにおける全脳濃度を測定した(表16)。脳濃度対血漿濃度の比率を測定し、ヌードマウスにおけるドセタキセルと比較した。55は、17yaおよびドセタキセルより高い脳透過性を示した。17yaだけが1時間目と4時間目の両方でドセタキセルよりわずかに高い脳/血漿濃度比を示した。55の脳濃度は、1時間目と4時間目にそれぞれ血漿濃度の14〜19%に達し、ドセタキセルと比較して1時間目と4時間目の両方で3.2倍高い脳/血漿比を示した。これらのデータは、55が、より高い脳透過性および神経膠腫細胞における高い効力(22nM、表12)を有するので、神経膠腫を処置するために潜在的に好ましい特性を示したことを示唆する。
白血病(HL60)異種移植におけるインビボ効果(図22)
HL60細胞(10×107/mL)を、10%FBSを含むRPMI1640成長培地中で調製し、マトリゲル(BD Biosciences,San Jose,CA)と1:1の比率で混合した。100μLの混合物(5×l06細胞/動物)を6〜8週齢の雄性無胸腺ヌードマウスの側腹部に皮下注射することによって腫瘍を確立した。腫瘍の長さと幅を測定して、腫瘍体積(mm3)を式、π/6×L×W2によって計算し、ここで長さ(L)および幅(W)はmmで測定した。腫瘍体積が約200mm3に達したとき、HL60腫瘍を担持する動物をビヒクル[Tween80/DMSO/H2O(2/2/6)]または17ya(20mg/kg)で経口的に処置した。投薬スケジュールは週に1回、2週間であった。ビンブラスチン(1mg/mL)を週に1回腹腔内注射によって投与した。
ヒト前骨髄球性白血病細胞、HL60細胞をヌードマウスに接種し、腫瘍体積を約200mm3まで増大させた。白血病を含む血液癌のために臨床で使用されているビンブラスチン(1mg/kg)を使用して、陽性対照薬に対するこのインビボモデルの応答を評価した。腫瘍体積(mm3)を時間に対してプロットし、4〜5匹の動物からの平均±SDを示している。HL60腫瘍は迅速に成長することが認められ、体積は2週間以内に2000〜3000mm3に達した。ビンブラスチンの1mg/kgの腹腔内注射は非常に強力な腫瘍成長阻害作用を示し(図22)、腫瘍成長阻害(TGI)は84%であった。経口投与した17ya(20mg/kg)は40%の腫瘍成長阻害を示した。HL60腫瘍のサイズは、著しい増大を伴わずに17ya処置後5日目まで維持されたが、その次の2日間に腫瘍サイズが有意に増大した(60〜100%)。これは、より頻度の高い投薬スケジュールが17yaの腫瘍成長阻害作用を増強し得ることを示唆する。
BRAFiと代替的な経路を標的とするチューブリン阻害剤との併用はベムラフェニブ耐性の発現を遅延させるまたは予防することができる。
この試験の治療上の具体的な目的を図27に要約する。
BRAFi(ベムラフェニブもしくはダブラフェニブ)またはMEKi(トラメチニブ)とドセタキセル(承認されているチューブリン阻害剤)との併用は黒色腫患者由来の異種移植(PDXまたは「xenopatient」)腫瘍モデルにおける獲得ベムラフェニブ耐性を抑制することができる。
この分野における最近の取り組みにより、PDXモデルを成功率に確立するために一部のプロトコルが標準化された。現在、様々なPDXモデルが商業的ソースから入手可能である。購入した、低継代の2つの(P2)PDX腫瘍を移植したNSGマウス(典型的には1〜2匹のマウス)を使用する。腫瘍を約1,500mm3まで成長させ、5匹までの新たなNSGマウスに伝播させて、十分なP3腫瘍を提供する。全体的な遺伝的および組織学的忠実性を確保するために、5つの無作為に採取したP3腫瘍の遺伝的プロフィールおよび組織学を特性付け、もとのP0腫瘍からのデータで検証した後、腫瘍片をその後の試験のために多数のマウスに移植する(図27)。これらの検証分析における明瞭さを確実にするために組織学的分析を実施する。
3つの現在承認されているBRAFiまたはMEKiを試験し、臨床での今後の優先順位付けのためにそれらの併用効果を順位付ける。NSGマウスは腫瘍増殖のための最適マウスであるが、毛皮を有しており、ヌードマスより高価である(2〜3倍)。数多くの試験が、ヌードマウスを使用した終末実験結果は、PDX試験においてより高価で困難なNSGマウスを用いた場合と比較して等しく良好であることを明らかにしている。それゆえ、終末効果試験ではヌードマウスを使用する。ダブラフェニブ+トラメチニブの標準的な組合せを参照併用処置として含める。加えて、この工程で使用するすべての薬剤は承認薬であり、それらの薬物動態特性は公知である。したがってこの試験に関しては確立されている用量および投与経路に従う。具体的には、ベムラフェニブ(45mg/kg)、ダブラフェニブ(30mg/kg)およびトラメチニブ(0.3mg/kg)を経口栄養によってマウスに与える。ドセタキセル(10mg/kg)は、経口では使用可能でないため、尾静脈に静脈内注射する。
獲得ベムラフェニブ耐性を克服する理想的な戦略は、その発現を防ぐ非常に有効な療法を事前使用することである。残念ながら、これは既存の療法では現実的でなく、大部分の患者は急速にベムラフェニブ耐性を発現する。Stuartらは最近、単剤ベムラフェニブの間欠的な高用量投薬スケジュールが連続的な投薬スケジュールと比較して薬物耐性の発現を減弱し得ることを示唆した。しかし、この「休薬期間」戦略の患者への心理的影響と長期的な臨床効果は今のところ不明のままである。耐性黒色腫腫瘍はしばしば活性化MEK−ERK経路への依存を発現するため、単剤の使用は十分ではないことがあるが、BRAFi/MEKiとチューブリン阻害剤の適切な併用は腫瘍増殖を抑制するうえでまだ非常に有効である(図6および7)。それゆえ、BRAFi/MEKiとドセタキセルの併用がベムラフェニブ耐性腫瘍に対して実質的な腫瘍退縮を誘導することを確認することは重要である。そのような結果は、腫瘍がベムラフェニブ耐性となった場合でも長期的な患者の生存につながり得る。
PDXモデルにおける併用処置の潜在的毒性を測定する:
処置の期間中PDX腫瘍担持マウスの体重および活動を詳細に観測することに加えて、終末点で採取した血液試料を、採取後24時間以内に包括的臨床病理学分析(血液化学)に送る。完全な病理学、化学および血液学(分画を伴う完全血球算定)プロフィールを検定し、詳細な結果を提供する。先に述べたのと同様に結果を毒性の潜在的指標の徴候に関して分析する。病理学的分析のために、ホルマリン固定腫瘍組織をパラフィンブロックに加工し、切片をヘマトキシリンとエオシンで染色する。スライドガラスを走査し、ScanScope(登録商標)XT(Aperio Technologies,Inc.,CA)を用いて0.25ピクセル/μmで顕微鏡スライドガラス上に組織全体のデジタル複製を作製する。走査工程は、組織画像を表示し、種々の倍率で分析することを可能にし、従来の顕微鏡による組織の伝統的な観察を詳細に模倣する。
薬剤併用が増強された効果を維持するかどうかを評価するため、採取したPDX腫瘍を腫瘍切片に加工し、免疫組織化学を実施する。
最初はベムラフェニブ感受性であるPDX腫瘍に関して、集中的ウェスタンブロット分析を実施し、BRAFiまたはMEKi耐性を付与することが公知の極めて重要なタンパク質レベルの変化を測定し、実験の間に採取した連続的腫瘍生検を使用して治療効果の今後のモニタリングのために有用な潜在的バイオマーカーを同定する。特に、上記で提示したデータに基づき、MAPK、PDGFβ、PI3K/AKT中の要素およびアポトーシス経路はベムラフェニブ耐性に関与することが周知であるので、それらを検討することに集中的に取り組む。RAS、RAF、RAF、MEK1/2、ホスホ−MEK1/2(Ser217/221)、ERK1/2、ホスホ−ERK1/2(Thr202/Tyr204)、AKT、ホスホ−AKT(Ser473)、PDGFβ、切断PARPまたはカスパーゼ3のタンパク質の発現レベルを、A375RF21モデルに関する作業と同様にして分析する。ベムラフェニブ耐性であるPDX腫瘍に関して、それらの遺伝子プロフィールをP0腫瘍について得て、基線耐性機構を測定し、初期基線耐性に関与するタンパク質についての集中的ウェスタンブロット分析によって治療効果を観測する。
BRAFiまたはMEKiとドセタキセルの併用は、ベムラフェニブ感受性およびベムラフェニブ耐性の両方のPDXモデルに対して有効であると予想される。この試験で使用するすべての薬剤が承認されているので、有効と証明された場合、この目的からの結果は、直ちに患者の利益となる第一選択併用療法としての役割を果たすことを意味し、速やかに臨床で試験することができる。
BRAFiまたはMEKiとABI(新規チューブリン阻害剤)の併用はPDX腫瘍における獲得BRAFi耐性および二次タキサン耐性を抑制する。
低継代の2つの(P2)PDX腫瘍を移植したNSGマウス(典型的には1〜2匹のマウス)をこの試験のために使用する。腫瘍を約1,500mm3まで成長させ、5匹までの新たなNSGマウスに伝播させて、十分なP3腫瘍を提供する。全体的な遺伝的および組織学的忠実性を確保するために、5つの無作為に採取したP3腫瘍の遺伝的プロフィールおよび組織学を特性付け、もとのP0腫瘍からのデータで検証した後、腫瘍片をその後の試験のために多数のマウスに移植する(図27)。
上記の章で簡単に述べた実験手順と同様にして、3つのベムラフェニブ耐性PDX腫瘍モデルを使用して実験を反復し、最大294匹までのマウスを使用してベムラフェニブ、ダブラフェニブまたはトラメチニブとABI(化合物12daまたは17ya)の併用における効果を測定する。前の章で述べたのと同様にして、腫瘍サイズ、連続的な腫瘍生検、終末血液試料および主要器官を測定または採取し、効果および潜在的毒性を評価する。潜在的毒性は、実験期間中および病理学的分析後の体重減少を観測することによって判定する。上記で詳述したように処置効果を評価し、潜在的バイオマーカーを同定するために集中的ウェスタンブロット分析を実施する。
BRAFiまたはMEKiとABIの併用は、ベムラフェニブ感受性およびベムラフェニブ耐性の両方のPDXモデルに対して有効であると予想される。そのような併用は、ドセタキセルを含む併用と同等またはより良好な効果を有すると予想されるが、ドセタキセルの使用に関連する潜在的二次薬物耐性を克服するという利点を有する。
黒色腫患者に長期的な生存を提供するうえでの主要な課題は、黒色腫転移のための有効は処置を見出すことである。皮下の性質に起因して、PDXモデルはまれにしか転移を生じない。それゆえ、上述したようにこれらの皮下PDXモデルにおいて黒色腫腫瘍に対する全身投与した薬剤併用の効果を評価することに加えて、ヌードマウスを用いて実験的肺転移モデルでの併用効果を測定する。肺転移モデルは、これが悪性黒色腫の主要な転移部位の1つであり、すべての黒色腫転移の中で最も低い5年生存率を有することから選択する。PIの研究室は黒色腫肺転移を評価するための十分に確立されたプロトコルを有しており(図28)、単剤としてのABIが黒色腫肺転移を有効に抑制できることを示した(化合物17yaを一例として示す)。同様のモデルは文献で広く使用されている。加えて、A375などの長年にわたる樹立細胞株から培養した細胞と異なり、PDX腫瘍から直接単離した初期継代単細胞懸濁液はプラスチック製品中では絶対に増殖しない。それゆえ、それらは腫瘍の不均一性、遺伝的忠実性およびもとの患者腫瘍中の細胞に対して予想される薬剤処置への応答を保持する可能性が高い。
単細胞懸濁液を標準的なプロトコルに従ってPDX腫瘍から作製する。簡単に述べると、NSGマウス(典型的には1〜2匹のマウス)を購入し、低継代の2つの(P2)PDX腫瘍を移植した後、腫瘍を約2,000mm3まで成長させる。NSGマウスからの外科的切除から1時間以内に、汚染を避けるために新鮮腫瘍をDMEM培地で3回洗浄する(氷上でそれぞれ5分)。壊死組織および結合組織がないPDX腫瘍を、無菌条件下で滅菌交差ブレードを使用して小片(1×1mmまたはそれ未満)に細分化する。腫瘍片をDMEM培地中1mg/mLの濃度で超純粋コラゲナーゼIV型(Gibco,17104−019)溶液と混合し、静かに振とうしながら37℃で1時間インキュベートする。消化後、生じた混合物をナイロンメッシュ細胞ストレーナー(BD Biosciences,70μm細孔、352340)でろ過して、単細胞懸濁液を得る。Auto T4 Cell Counterで細胞数を数え、ペレット化して、尾静脈注射のためにDMEM中に再懸濁する。トリパンブルー試験においてこの方法によって得られる細胞の生存率は、典型的には95%を超える。
上述した先の試験で最良の組合せが既に順位付けられているので、最適併用を試験する。承認されているダブラフェニブ+トラメチニブの併用は既に参照併用として含まれている。簡単に述べると、ベムラフェニブ感受性またはベムラフェニブ耐性PDX腫瘍モデルから生成した、100μLのDMEM中に懸濁した75000個の単細胞を、50匹のヌードマウス(6週齢、雄性および雌性)の各々に尾静脈を介して注入し、マウスを5つの群(n=10)に分ける:ビヒクル単独による陰性対照群(第1群);ダブラフェニブ+トラメチニブによる参照併用処置群(第2群);上記で決定したBRAFi/MEKiとドセタキセルの最適併用(第3群);上記で決定したBRAFi/MEKiと化合物12daまたは17yaの最適併用(第4および5群)。この実験的肺転移モデルに関して高い変動が予想されるので、統計的有意性を確保するために各群のマウスの数を7匹から10匹に増加する。腫瘍細胞注射の7〜10日後、マウスをビヒクルまたは薬剤併用で4週間毎日経口的に(経口的に使用可能でなく、i.v.経路によって投与するドセタキセルを除く)処置する。処置の最後に、すべてのマウスをCO2吸入とそれに続く頸椎脱臼によって犠死させる。マウスを解剖して肺を切除する。肺中の腫瘍結節の数を正確に計数し、肺の腫瘍結節の不在または数の減少に基づいて処置の効果を評価する。固定し、その後のH&E染色を伴うパラフィン包埋切片用に処理した後、結節の黒色腫性および腫瘍形態学も検査する。3つのベムラフェニブ感受性および3つのベムラフェニブ耐性PDXモデルからの細胞を使用してこの実験を実施するために、最大で50×3×2=300匹までのヌードマウスを使用すると予想される。
これらの併用は、ベムラフェニブ感受性腫瘍において、およびより小さな度合いで、ベムラフェニブ耐性腫瘍において肺転移の数を低減するのに有効であると予想される。チューブリン阻害剤(ドセタキセル、化合物12daまたは17ya)を含む併用は、特にベムラフェニブ耐性腫瘍転移に関して、ダブラフェニブ+トラメチニブの参照併用よりも有効であると考えられる。PDX腫瘍から単離した単細胞懸濁液が肺転移を形成することができないという起こりそうにないケースでは、選択的アプローチとして、樹立された初期継代BRAFV600Eヒト黒色腫株(YUGEN8、YUSAC2、YUKOLIおよびYUSIK)を使用する。
Claims (14)
- BRAF阻害剤と、
式II:
[式中、
Aは、フェニルまたはインドリル環系であり;
R1は、H、C1−C6直鎖または分岐アルキル、アリール、フェニル、ベンジル、ハロアルキル、アミノアルキル、−OCH2Ph、SO2−アリール、SO2−フェニル、−(C=O)−アリール、−(C=O)−フェニルまたはOHであり;
R4およびR5は、それぞれ独立して水素、C1−C6直鎖または分岐アルキル、C1−C6直鎖または分岐ハロアルキル、C1−C6直鎖または分岐アルコキシ、C1−C6直鎖または分岐ハロアルコキシ、F、Cl、Br、I、CF3、CN、−CH2CN、NH2、OH、−OC(O)CF3、アルキルアミノ、アミノアルキル、−OCH2Ph、−NHCO−アルキル、COOH、−C(O)Ph、C(O)O−アルキル、C(O)H、−C(O)NH2またはNO2であり;ならびに
nは、1から4の間の整数である]
の構造によって表される化合物またはその薬学的に許容され得る塩、N−オキシド、水和物、もしくは立体異性体と、
薬学的に許容され得る担体と
を含む、BRAF阻害剤に耐性がある癌を処置するための薬学的組成物であって、前記化合物が、前記BRAF阻害剤に耐性がある癌に対して320nM以下のIC 50 値の抗増殖活性を有する、薬学的組成物。 - 前記式IIの化合物が、
もしくはその薬学的に許容され得る塩、またはそれらの組合せである、請求項1に記載の組成物。 - 前記BRAF阻害剤がベムラフェニブ、ダブラフェニブまたはそれらの組合せである、請求項1から2のいずれか一項に記載の組成物。
- 被験体においてBRAF変異癌またはBRAF阻害剤に耐性がある癌を処置するための、または以前にタキサン薬物で処置された癌に罹患している被験体においてタキサン薬物に対する耐性がある二次癌を処置するための組成物であって、請求項1または2に規定される式IIの構造によって表される化合物と前記BRAF阻害剤とを含む、組成物。
- 前記タキサン薬物がドセタキセルである、請求項4に記載の組成物。
- 前記BRAF阻害剤が、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、GDC−0879、PLX−4720、ソラフェニブトシル酸塩、LGX818またはそれらの任意の組合せである、請求項4または5のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記癌が、黒色腫、甲状腺癌、結腸直腸癌、乳癌、結腸癌、胆道癌、非小細胞肺癌(NSCLC)または卵巣癌である、請求項4〜6のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記黒色腫が薬物耐性黒色腫および/またはV600E陽性黒色腫である、請求項7に記載の組成物。
- 前記BRAF阻害剤がベムラフェニブ、ダブラフェニブまたはそれらの組合せである、請求項4から8のいずれか一項に記載の組成物。
- BRAF阻害剤に耐性がある癌に罹患している被験体を処置するための、または癌に罹患している被験体においてBRAF阻害剤に対する獲得耐性を抑制するための組成物であって、前記組成物が、チューブリン阻害剤とBRAF阻害剤とを含み、前記チューブリン阻害剤が、式II:
[式中、
Aは、フェニルまたはインドリル環系であり;
R1は、H、C1−C6直鎖または分岐アルキル、アリール、フェニル、ベンジル、ハロアルキル、アミノアルキル、−OCH2Ph、SO2−アリール、SO2−フェニル、−(C=O)−アリール、−(C=O)−フェニルまたはOHであり;
R4およびR5は、それぞれ独立して水素、C1−C6直鎖または分岐アルキル、C1−C6直鎖または分岐ハロアルキル、C1−C6直鎖または分岐アルコキシ、C1−C6直鎖または分岐ハロアルコキシ、F、Cl、Br、I、CF3、CN、−CH2CN、NH2、OH、−OC(O)CF3、アルキルアミノ、アミノアルキル、−OCH2Ph、−NHCO−アルキル、COOH、−C(O)Ph、C(O)O−アルキル、C(O)H、−C(O)NH2またはNO2であり;ならびに
nは、1から4の間の整数である]
の構造によって表される化合物またはその薬学的に許容され得る塩、N−オキシド、水和物、もしくは立体異性体であり、前記化合物が、前記BRAF阻害剤に耐性がある癌に対して320nM以下のIC 50 値の抗増殖活性を有する、組成物。 - 前記式IIの化合物が、
もしくはその薬学的に許容され得る塩、またはそれらの組合せである、請求項10に記載の組成物。 - 前記BRAF阻害剤がベムラフェニブ、ダブラフェニブまたはそれらの組合せである、請求項10または11のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記BRAF阻害剤に耐性がある癌が、黒色腫、甲状腺癌、結腸直腸癌、乳癌、結腸癌、胆道癌、非小細胞肺癌(NSCLC)または卵巣癌である、請求項10から12のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記黒色腫が薬物耐性黒色腫および/またはV600E陽性黒色腫である、請求項13に記載の組成物。
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