JP6827795B2 - 好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリンを含む多発性嚢胞腎の予防または治療用の医薬組成物 - Google Patents
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Description
臨床的ヒト腎臓標本および患者
すべての腎臓組織は、國立成功(National Cheng Kung)病院のヒトバイオバンクから得た。この研究は國立成功大學(National Cheng Kung University)のメディカルセンターの治験審査委員会によって承認された(A−ER−101−228)。NGALタンパク質レベルは、台湾國立成功大學病院の病理学部から得られた3つのヒト腎臓標本(2例のPKD症例、1例の正常腎臓)における免疫組織化学によって検査した。正常な組織は、非尿生殖器系の病気がないことを検死で確認済みの死亡患者から得た。症例1は、重度の尿細管間質性腎炎による慢性腎不全のADPKDである。一方、症例2は、妊娠30週で、多発性嚢胞巨大腎がある初期のARPKDと診断され、妊娠は終了している。
腎臓を取り出し、4℃の10%ホルマリン中で一晩固定し、次に脱水およびパラフィン包埋を行い、免疫染色のために4μmの切片を作製した。NGALを検出するために、腎臓切片は、脱パラフィンおよび再水和後、アビジン/ビオチンブロッキングキット(Vector Laboratories, Burlingame,CA)でブロックし、ウサギ抗NGAL抗体、または、ヤギ抗ヒトNGAL抗体とともに、4℃で一晩インキュベートした。他の免疫染色のために、標準免疫ペルオキシダーゼプロトコル(Vectastain ABC kit;Vector Laboratories)を使用した。ヤギ血清でブロックした後、切片を一次抗体と共に室温で一時間インキュベートし、PBSでリンスし、ビオチン化ヤギ抗ウサギ抗体と共にインキュベートし、リンスし、次いでストレプトアビジン結合ペルオキシダーゼと共にインキュベートし、リンスし、次いで色素原として3−アミノ9−エチル−カルバゾールと共にインキュベートし、ヘマトキシリンで対比染色し、光学顕微鏡で検査した。
全てのマウスは、台湾台南市にある國立実験動物センター(NLAC)において12時間の明暗周期下で飼育され、全ての実験はNLACの動物実験委員会か認可した実験計画書に基づいて行われた。この研究において、本発明者たちは、実験の遂行に先立って、雄マウスと雌マウスに有意差がないことを確認した。いくつかの文献においても、雄雌の両方の動物を使って実験が行われていた。これは、動物の性別がPKDの病理学的および分子的分析にほとんど影響を与えないことを示唆している。従って、マウスの雄雌の両方を使用した。
本発明者たちの以前の研究では、PKDのマウスモデルについて記載した。Pkd1L3/L3マウスは、全長PC1の生成レベルが低く、次第に多発性嚢胞腎を進行した。(Jiang ST,et al.,Am J Pathol,168:205−220,2006)。オリジナルのPkd1L3/+マウスは、混合C57BL6−129バックグランドを有し、均一な遺伝的背景を得るために10世代以上にわたってC57BL/6Jマウスと戻し交配された。安定したC57BL/6Jの遺伝的背景を有するPkd1L3/+マウスを、ホモ接合突変異体Pkd1L3/L3を作製するために用いた。
Ngalの従来のノックアウトマウスは、VelociGeneバイオテクノロジーを使って作製されていた。マウスのNgal遺伝子はPGK/Neoカセットによって破壊され、lacZがレポーター遺伝子として使用された。Ngal-/-マウスは、元々、混合C57BL6−129バックグランドで繁殖され、Ngal-/-を作製するために、交雑する前に10世代以上にわたってC57BL/6Jマウスと戻し交配し、均一的な遺伝的背景を確保した。NGALの従来のノックアウトは、PKDのNGALタンパク質の腎機能を特徴づけるために、腎臓や他の組織からのNGALの生成を防ぐことができる。
Cdh16−mNgalトランスジェニックマウスは、マウスCdh16プロモーターの制御下で、マウスNGALを過剰発現する(Shao X,et al.,J Am Soc Nephrol,13:1824−1836,2002)。Ksp−Cdh16−mNgalは、内因性NGALの発現およびADPKDにおける嚢胞形成の前に、外因性NGALの早期発現を確実にした。Cdh16−mNgalトランスジェニックマウスは、C57BL/6J遺伝的背景を有する。DNA組換プロトコルは、NLACのバイオ安全委員会で承認された。ここで、Ngalは、NCBI遺伝子No.16819、または、EMBL−EBI No.ENSMUSG00000026822である。
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用い、尾部から抽出したゲノムDNAから全ての変異マウスの遺伝子型決定を行った。各試料は20μLのPCR反応混合物を含み、βアクチンは内部コントロールとして使用された。プライマー配列は、
・マウスNgalフォワードプライマー、配列番号1(5’−ATGGCCCTGAGTGTCATGTGTC−3’)、
・マウスNgalリバースプライマー、配列番号2(5’−GCTCCAGATGCTCCTTGGTATG−3’);
・β−アクチンフォワードプライマー、配列番号3(5’−GGCATTGTTACCAACTGGGACG−3’)、
・β−アクチンリバースプライマー、配列番号4(5’−AGGAAGGCTGGAAAAGAGCC−3’)
である。
Ngalノックアウト突然変異体を、以下のプライマーを用いて分析した。
・マウスNgal 5’UTRフォワードプライマー、配列番号5(5’−TTCCTCCTCCAGCACACATCAGAC−3’)、
・lacZリバースプライマー、配列番号6(5’−GAGTAACAACCCGTCGGATTCTC−3’)、
・マウスNgalリバースプライマー、配列番号7(5’−AGGGGTTACTGTCAGAGTGGCTATC−3’)。
マウスの腎臓から抽出した全タンパク質(50μg)は、ウエスタンブロット解析に供した。pQEタンパク質発現系(Qiagen)を用いて、マウス全長NGALおよび精製NGALタンパク質を6×Hisタグで発現させた。そして、精製NGALは、マウスの全長NGALタンパク質を用いてウサギを免疫化することによって、NGAL抗体を生成するために使用された。その他の抗体は、Slc22A17に対するウサギポリクローナル抗体(GTX85032;GeneTex)、GAPDHに対するウサギポリクローナル抗体(631401;BioLegend)、α−平滑筋アクチン(α−SMA)に対するマウスモノクローナル抗体(A2547;Sigma−Aldrich)、低酸素誘導因子1−α(HIF−1α)に対するウサギポリクローナル抗体(GTX 127309;GeneTex)、mTOR(リン酸化Ser2448)に対するウサギモノクローナル抗体(5536;Cell Signaling Technology)、mTORに対するウサギモノクローナル抗体(2983;Cell Signaling Technology)、β−アクチン(8H10D10)に対するマウスモノクローナル抗体(12262;Cell Signaling Technology)、S6K1(リン酸化Thr389)に対するウサギポリクローナル抗体(ab2571;Abcam)、p70 S6キナーゼに対するウサギモノクローナル抗体(2708;Cell Signaling Technology)、Akt(リン酸化Ser473)に対するウサギポリクローナル抗体(9271;Cell Signaling Technology)、Aktに対するウサギポリクローナル抗体(9272;Cell Signaling Technology)、カスパーゼ−3に対するウサギポリクローナル抗体(9662;Cell Signaling Technology)、増殖細胞核抗原(PCNA)に対するマウスモノクローナル抗体(307902;Biolegend)、表皮成長因子受容体(EGFR)(リン酸化Tyr1068)に対するウサギポリクローナル抗体(2234;Cell Signaling Technology)、および、EGFRに対するウサギモノクローナル抗体(GTX61503;GeneTex)を用いた。
上記のとおり(Wang,E.et al.,J Pathol、222:238−248、2010)、標本をホルマリン中に固定し、パラフィンに包埋し、4μm切片に切断し、光学顕微鏡(Eclipse E600ニコン、日本)で検査するため、ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)またはマッソントリクローム染色した。マウス遺伝子型を盲検化し、嚢胞数およびサイズ(H&E染色)およびコラーゲン線維(Masson’s trichrome)の染色を定量化した。平均クイックスコア(QSs)の計算には、Image−Pro Plus v.4.5.0.29ソフトウェア(Media Cybernetics,Rockville、MD、20850 USA)を使用した。各スライドについて、ソフトウェアは分析のために5つのフィールド(200×)をランダムに選択した。適切なホワイトバランスの後で、ソフトウェアは、オペレータがデジタル画像をつかむことによって特別な関心領域をゲートし、それらを別々に検査することを可能にする。各スライドを解析して、標識指数(LI;全領域に対する陽性染色された領域の比)、および、平均光学密度(MOD;陽性ピクセルのカウントに基づく染色濃度)を決定した。QSは、LIとMODの数学的積として計算された。嚢胞の計数には、皮質、髄質および乳頭を含む、H&E染色された横断腎臓切片の代表的な画像を使用した。画像上にグリッドを配置し、嚢胞性および非嚢胞性領域を二分したグリッド交点の割合を計算した。
比較は3つの群:Pkd1L3/L3、Pkd1L3/L3;NgalTg/Tg、および、Pkd1L3/L3;Ngal-/-で行われた。パラメトリックデータは、すべての群でone−way ANOVA(一元配置分散分析)を用いて行われ、続いて各ペアのターキー多重比較テストが行われた。生存時間は中央値および四分位範囲(25%〜75%)として示され、群は非パラメトリックKruskal−Wallis検定とDunnの複数比較検定によって比較された。生存曲線を構築し、Kaplan−Meier推定値を用いて、対数ランク検定を用いて異なる群の生存率を比較した。0.05未満のp−値は統計学的に有意であると考えられる。
Ngal従来型ノックアウトおよびCdh16−mNgalトランスジェニックマウスの作製
マウスNgal標的化ストラテジー、および、Cdh16−mNgalトランスジーンは、それぞれ、図1Aおよび図1Bに示される。PCR分析により、これらのマウスの遺伝子型判定が確認された(図1C)。ヘテロ接合型NgalTg/oマウスの割合は、野生型C57BL/6Jマウスと戻し交配されたNgalTg/Tgマウスのホモ接合性も確認した。Ngalの発現レベルは、NgalTg/oとNgalTg/TgマウスのNgalのコピー数と正の相関があった(図1D)。
Pkd1L3/L3;NgalTg/Tgマウスは、Pkd1L3/+;NgalTg/TgマウスとPkd1L3/+;NgalTg/Tgマウスを交雑することで作製した。ウエスタンブロット解析により、Pkd1L3/L3マウスおよび野生型マウスの、尿、血清、腎臓における内因性NGALの発現の差異を検出した(図2A−2D)。Pkd1L3/L3マウスでは、嚢胞拡大過程に沿って徐々にレベルが上昇したのに対し、野生型マウスでは年齢とともにそのレベルが低下した。免疫組織化学的分析により、野生型マウスおよびPkd1L3/L3マウスの両方において、1日目、14日目および28日目の腎臓NGALの一時的発現パターンが明らかになった(図3)。14日目と28日目のPkd1L3/L3マウスにおいて、内因性NGALは、主に嚢胞上皮の頂端膜側に局在し、Pkd1L3/L3マウスでは、年齢とともに腎臓髄質の嚢胞は大きくなった。ADPKDまたは常染色体劣性多発性嚢胞腎(ARPKD)患者の腎臓においても、同様のパターンが観察された(図4)。結果は、嚢胞性上皮における内因性NGALのアップレギュレーションは、異常な腎発達を引き起こす可能性があることを示し、この議論はPKDの重症度におけるNGALの役割によって支持される。次に、これら3つのPKDマウス(すなわち、Pkd1L3/L3マウス、Pkd1L3/L3;NgalTg/Tgマウス、Pkd1L3/L3;Ngal-/-マウス)の21日目おける、NGALおよびNGAL−Rの腎臓発現を、ウエスタンブロット解析した(図5A)。Pkd1L3/L3;NgalTg/TgマウスにおけるNGALの腎臓レベルは、Pkd1L3/L3およびNgalTg/Tgマウスより、それぞれ、1.8倍および3.7倍高かった(図5B)。さらに、これら3つのPKDマウスにおけるNGAL−Rの腎臓発現は、PKDなしのコントロール同腹子におけるものと比較して、有意に上方制御された(p<0.001)(図5Aおよび5C)。結果は、外因性NGALは、内因性NGALの発現前にKsp−Cdh16プロモーターの制御下で胚腎臓において連続的に過剰発現されることを示し、このことは、外因性NGALが胚期のPkd1L3/L3マウスにおけるPKDの進行を妨げることを示唆している。
ウエスタンブロット解析で、NgalTg/0マウスの、尿、血清、腎臓における外因性NGALの発現を検出した(図6A)。野生型マウスとNgal-/-マウスを比べると、野生型(WT)マウスでは肺および脾臓の組織でNGALが発現したが(図6B)、Ngal-/-マウスでは見られなかった(図6C)。加えて、外因性NGALの腎臓特異的過剰発現が、NgalTg/Tgマウス(図6D)、および、Pkd1L3/L3;NgalTg/Tgマウス(図6E)で検出された。さらに、野生型のマウスと比較して、NgalTg/TgマウスおよびNgal-/-マウスの腎臓切片における糸球体を計数することによって、NGALの腎臓発達に対する効果を調べた(図6F)。これらの結果は、腎糸球体の数は、年齢や性別が一致したマウスの間で、有意差がなかったことを示した(p=0.294)。
NGALの差次的発現によって、Pkd1L3/L3、Pkd1L3/L3;NgalTg/Tg、および、Pkd1L3/L3;Ngal-/-マウスの生存上のNGALの効果が観察された(図7A)。ログランクテストでは、Pkd1L3/L3マウス(中央値=25日、四分位範囲[IQR]23−26日)およびPkd1L3/L3;Ngal-/-マウス(中央値=26日,IQR24−31日)と比較して、Pkd1L3/L3;NgalTg/Tgマウスの寿命が著しく伸びた(中央値=46日、IQR37−60日)(Pkd1L3/L3;NgalTg/Tgに対して、両方ともp<0.001)(図7B)。さらに、Pkd1L3/L3およびPkd1L3/L3;Ngal-/-マウスの間で、寿命に有意差はなかった(p=0.2988)。
総腎臓体積(TKV)は、BUNの増加およびPKDの疾患進行と正の相関があることが知られていた。多発性嚢胞腎は、Pkd1L3/L3およびPkd1L3/L3;Ngal-/-マウスにおいて、21日で終末段階に進行した。Pkd1L3/L3;NgalTg/Tgマウスの腎臓は、Pkd1L3/L3およびPkd1L3/L3;Ngal-/-マウスの腎臓よりも小さい(図8A)。加えて、21日目の体重に対する腎臓重量の中央値は、Pkd1L3/L3マウス(中央値=23.1%、IQR20.9−27.6%)およびPkd1L3/L3;Ngal-/-マウス(中央値=24.4%、IQR22.7−27.7%)と比較して、Pkd1L3/L3;NgalTg/Tgマウス(中央値=14.1%、IQR12.2−15.5%)は明らか低かった(Pkd1L3/L3;NgalTg/Tgに対して、両方ともp<0.001)(図8B)。腎嚢胞サイズも、他の2種類のPKDマウスと比較して、Pkd1L3/L3;NgalTg/Tgマウスは有意に小さかった(Pkd1L3/L3;NgalTg/Tgに対して、両方ともp<0.001)(図8C)、一方、嚢胞数には有意な差はなかった(図8D)。これらの結果は、外因性腎臓特異的NGALの過剰発現が、嚢胞サイズを減少させることによってPKDの急速な進行を防止するが、Pkd1L3/L3;NgalTg/Tgマウスの嚢胞数を減少しないこと実証した。この結果に基づき、Ngalの欠失はPKDに影響を与えないことが認められ、このことから、NGALではなくPC1の減少がPKDの進行を決定することが示唆される。さらに、Pkd1L3/L3マウスの内因性NGALのアップレギュレーションは、マウスを早期死から保護することができない。
21日目の、ヘマトキシリンおよびエオシン染色(H&E、図9A、上部パネル)した腎臓切片、および、マッソントリクローム染色(図9A、下部パネル)した腎臓切片を検査した。次に、腎線維症およびNGAL投与の有効性を調べた。具体的には、糸球体線維症の評価のため、マッソントリクローム染色を用いてコラーゲンを染色し、糸球体線維症スコアを統計解析ソフトウェアによりさらに計算した。結果は、野生型マウスは、Pkd1L3/L3マウス(p=0.002)およびPkd1L3/L3;Ngal-/-マウス(p=0.015)マウスと比較して、有意に低い腎臓線維症のスコアを示したが、Pkd1L3/L3;NgalTg/Tgマウス(p=0.417)では有意差はなかった(図9B)。PKDの進行性線維症に関連するα−SMAの腎臓レベル、および、腎臓の尿細管間質区画における低酸素症に関連するHIF−1αの腎臓レベルをさらに調べた。ウエスタンブロット解析は、Pkd1L3/L3;NgalTg/Tgマウスにおけるα−SMAレベルは、野生型マウスのレベルに匹敵することを示した(図9C)。しかしながら、α−SMA、および、HIF−1αの発現は、他の2種類のPKDマウスより有意に低かった(Pkd1L3/L3;NgalTg/Tgに対して、両方ともp<0.001)(図9Dおよび9E)。上記の評価によれば、Pkd1L3/L3;NgalTg/Tgマウスの外因性NGALのレベルの増加は、腎臓線維症スコア、および、α−SMAとHIF−1αの発現を減らすことが証明された。したがって、これらの結果は、NGALが腎糸球体線維症、腎間質性線維症および腎臓の尿細管間質区画における低酸素症を改善することを示唆している。
増殖およびアポトーシスの両方が、多発性嚢胞嚢の早期嚢胞形成において増加した。ウエスタンブロット解析(図10A)では、他の2種類のPKDマウスと比較して、プロカスパーゼ3およびPCNAの発現の両方が減少し、活性カスパーゼ3はPkd1L3/L3;NgalTg/Tgマウスにおいて増加していることが明らかとなった(Pkd1L3/L3;NgalTg/Tgに対して、両方ともp<0.001)(図10Bおよび10C)。
PKDを有しないそれぞれのコントロール同腹子と比較して、3つのPKDマウスの全てがmTORおよびp−mTORの発現を示した(図11A)。さらに、Pkd1L3/L3;NgalTg/Tgマウスは、Pkd1L3/L3マウスおよびPkd1L3/L3;Ngal-/-マウスと比較して、最も低いmTORおよびp−mTORレベルであった(Pkd1L3/L3;NgalTg/Tgに対して、両方ともp<0.001)(図11B−11C)。mTORの主要上流調節因子(Akt)および下流標的[リボソームタンパク質S6キナーゼ(S6K)]は、細胞増殖に関与する。その後のウエスタンブロット解析(図12A)により、他の2種類のPKDマウスと比較して、Pkd1L3/L3;NgalTg/Tgマウスは、リン酸化Akt(p−Akt)およびリン酸化S6K(p−S6K)の発現が有意に減少したことを確認した(Pkd1L3/L3;NgalTg/Tgに対して、両方ともp<0.001)(図12Bおよび12C)。
EGFRおよびp−EGFRの過剰発現および頂端ミスロケーションは、嚢胞成長を促進すること、および、EGFRチロシンキナーゼ活性の阻害はPKDの発達を減弱させうること、が知られている(Orellana SA,et al.,Kidney Int,47:490−499,1995;Du J,et al.,Am J Physiol,269:C487−495,1995;Sweeney WE,et al.,Kidney Int,57:33−40,2000;Torres VE,et al.,Kidney Int,64:1573−1579,2003)。ウエスタンブロット解析(図13A)は、PKDを有しないコントロールの同腹子と比較して、3種類のPKDマウスの何れもが、EGFRおよびp−EGFR(Tyr1068)の両方の発現が有意に増加したことを示した(コントロールに対して、p<0.001)(図13Bおよび13C)。しかし、p−EGFR/EGFRの比は、3つのPKDマウス間で差異を示さなかった。
我々の研究において、私たちは、嚢胞の成長の減少における、分泌Ngalの治療効果を強く主張した。我々は、組換えマウスNgalタンパク質(mNGAL)をさらに調製し、低内毒素(100μg/day)と高純度(32mg/ml)を持つ機能性組み換えmNgalタンパク質を、PKDマウスの腹腔内に注射した。mNGAL(23〜200残基)のコード配列は、精製を容易にするためのN末端His6タグを有するpET21aベクターにサブクローンされた。続いて、配列決定による正しい構築物を、タンパク質発現のために大腸菌BL21(DE3)に形質転換した。単一の形質転換体の60mlの一晩培養物を、100μg/mlのアンピシリンを含有する6リットルの新鮮なLB培地に接種した。細胞をA600nm=0.6〜1.0に増殖させ、20℃で0.5mMイソプロピルβ−チオガラクトピラノシド(IPTG)で誘導した。16時間後、細胞を7,000×gで15分間遠心分離して、細胞ペーストを回収した。20mM Tris−HCl、400mM NaCl、10mM イミダゾールを含むpH8.0の溶解緩衝液中に、細胞ペレットを直ちに再懸濁させた。細胞懸濁液をConstant Cell Disruption System(CONSTANT SYSTEM Ltd.、UK)により破壊し、17,000×gで遠心分離して細胞破片を除去した。無細胞抽出物を、予め溶解緩衝液で平衡化しておいたNi2+−NTAカラムに導入した。カラムを溶解緩衝液で洗浄し、続いてHis6タグ付きmNGALを10mMから500mMイミダゾールの直線勾配で溶出させた(図14A)。精製His6タグ付きmNGALを4倍の20mM Tris、pH8.0緩衝液で希釈し、続いて、予め20mM Tris、pH8.0緩衝液で平衡化したQアニオンイオン交換カラムに導入した。His6タグ付きmNGALを含有する低リポ多糖類(LPS)を、Qアニオン交換カラムを通過したフローから回収した(図14B)。最後に、His6タグ付きmNGALを濃縮し、−80℃で保存するため、Vivaspin 20(Sartorius、Germany)の10kDaカットオフサイズ膜を有するPBS緩衝液で交換した。皮下(SC)または腹腔内注射(IP)により、生後7日目に、Pkd1L3/L3マウス(n=3)、Pkd1L3/L3;Ngal-/-マウス(n=6)に、mNGAL(100μl/日)を注射した。我々のデータは、未処置群と比較して、mNGALを注入したPkd1L3/L3マウス(n=3、雄1匹、雌2匹)およびPkd1L3/L3;Ngal-/-マウス(n=6、雄3匹、雌3匹)において、生存率および日数が著しく増加したことを示した(図14C)。Pkd1L3/L3マウスの嚢胞腎も、未処置群と比較して、mNGAL処理Pkd1L3/L3マウスにおいて有意に遅延した(図14Dおよび表1)
Claims (9)
- 好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリン(NGAL)を含む多発性嚢胞腎(PKD)の予防または治療用の医薬組成物であって、
前記多発性嚢胞腎(PKD)の予防または治療が、
腎嚢胞の成長を遅延させ、同時に、
患者の生存および生存期間を統計学的に有意に改善する、
医薬組成物。 - 前記多発性嚢胞腎が、常染色体優性多発性嚢胞腎(ADPKD)である、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記多発性嚢胞腎(PKD)の予防または治療が、更に、同時に、
腎臓の嚢胞容積および腎臓重量を減少させ、
腎糸球体線維症および腎間質線維症を減少させ、
腎臓の尿細管間質区画の低酸素状態を低下させ、
腎尿細管の嚢胞性上皮細胞のアポトーシスを増加させ、および、
腎尿細管の嚢胞性上皮細胞の増殖を減少させる、
請求項1または2に記載の医薬組成物。 - PKDの予防または治療において、前記NGALが、
NGALおよびNGAL受容体(NGAL−R)の発現増加、および、
活性カスパーゼ−3の増加およびプロカスパーゼ3の減少、
の少なくとも1つを誘導する、請求項1または2に記載の医薬組成物。 - PKDの予防または治療において、前記NGALが、
α−SMA、
コラーゲン、
低酸素誘導因子1−α(HIF−1α)、
プロカスパーゼ3、
増殖細胞核抗原(PCNA)、
Akt、
哺乳類ラパマイシン標的タンパク質(mTOR)、および、
S6K、
の少なくとも1つの発現を阻害する、請求項1または2に記載の医薬組成物。 - 前記PKDの予防または治療が、患者に対するNGALを管理することで、
α−SMA、低酸素誘導因子1−α(HIF−1α)、Akt、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質(mTOR)、S6K、プロカスパーゼ3、増殖細胞核抗原(PCNA)の発現を抑制し、同時に、
NGAL、NGAL受容体(NGAL−R)、活性カスパーゼ3の発現を増加する、
請求項3に記載の医薬組成物。 - 前記NGALが用量依存性である、請求項1乃至6の何れか一項に記載の医薬組成物。
- 前記PKDの予防または治療が、有効量のNGALの注射投与によるものである、請求項1乃至7の何れか一項に記載の医薬組成物。
- 前記PKDの予防または治療が、毎日の有効量である5μg/体重(g)またはそれ以上のNGALを、腹腔内または皮下投与によるものである、請求項1乃至8の何れか一項に記載の医薬組成物。
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