JP6823874B2 - 細胞・ナノ薄膜複合体の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、細胞・ナノ薄膜複合体を基板よりタイミングを制御して剥離する手段、及びそれを用いた細胞・ナノ薄膜複合体の製造方法に関する。

近年、再生医療の分野で難治性疾患に対する細胞移植療法の開発が広く進められている。例えば、ｉＰＳ細胞より必要な細胞を誘導して細胞シートを作製し、それを患部に移植することで様々な臓器や組織を治療することが試みられている。これまでに細胞シートを用いた角膜、食道、心臓、歯周、軟骨等の各疾患に対する臨床研究、治験が行われており、またそれら以外にも肺や耳、肝臓、膵臓疾患等に対する適応拡大が検討されている。

細胞シートの作製・使用に際しては、作製した細胞シートを基板から無傷な状態で剥がすことが要求される。現在、細胞シートの回収方法として温度応答性の細胞培養皿を用いた研究（非特許文献１）や自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）と呼ばれるものを用いて電気化学的に基板から剥離させる手法（非特許文献２、特許文献１−２）などの研究が進められている。

高分子ナノ薄膜（以下、「ナノ薄膜」と記載する）は高分子物理学の分野で研究されているソフトナノ材料での比較的新しい分類である（非特許文献３）。ナノ薄膜は厚さが数十〜数百ｎｍの薄膜であり、高い柔軟性を有する。また薄くて柔軟であることから凹凸表面にも追従し、大きな分子間力によってあらゆる表面へ接着することが可能である。本発明者らはこれまでに、生体適合性がよく生分解性を有するポリ乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）でナノ薄膜を作製し、その上で細胞を培養することで柔軟性、展開性、接着性、生体適合性に優れた細胞・ナノ薄膜複合体が得られることを見出し、報告している（特許文献３）。この細胞・ナノ薄膜複合体は細胞シートの脆くて壊れやすいという欠点を克服し、効果的な細胞送達を可能にした（非特許文献４）。

一方、この細胞・ナノ薄膜複合体を作製するにはナノ薄膜上での細胞の長期培養が必要とされる。足場特性のある細胞を培養する場合、培養期間はナノ薄膜が基板に接着していることが必要であるが、細胞・ナノ薄膜複合体を利用する場面（治療・手術の現場）においては任意のタイミングで基板から剥離することが求められる。したがって、細胞・ナノ薄膜複合体の基板からの剥離を制御することができる技術が求められている。

特開２００８−２９５３８２号公報 ＷＯ２０１２／０３３１８１号公報 ＷＯ２０１４／２０８７７８号公報

坂井秀昭ら、"日本発・世界初の「細胞シート工学」技術による再生医療"，特許庁技術懇話会誌，２７１号 Ｉｎａｂａ Ｒ．ら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，３０，２１，３５７３−９，２００９． Ｊ．Ａ．Ｆｏｒｒｅｓｔら、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｏｌｌｏｉｄ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，９４，１−３，１６７−１９５，２００１ Ｔ．Ｆｕｊｉｅら、Ａｄｖ Ｍａｔｅｒ，２６，１６９９-１７０５，２０１４．

本発明は、細胞・ナノ薄膜複合体を基板より剥離するタイミングを制御することが可能な新たな手段を提供することを目的とする。

本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、細胞・ナノ薄膜複合体を、自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）を介して基板となる電極基板に配設することにより、ＳＡＭを電気化学的に電極基板より剥離することにより、細胞・ナノ薄膜複合体を基板より遊離させ、回収できることを見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
［１］ 細胞・ナノ薄膜複合体の製造方法であって
ナノ薄膜が自己組織化単分子膜を介して電極基板に配設されてなる細胞培養基材において、該ナノ薄膜上にて細胞を培養する工程、
該電極基板に、該自己組織化単分子膜が該電極基板より還元脱離する電位を印加して、該自己組織化単分子膜を該電極基板より剥離する工程、ならびに
該自己組織化単分子膜の剥離に伴い、該電極基板より遊離した細胞・ナノ薄膜複合体を回収する工程、を含む、上記方法。
［２］ ナノ薄膜が、生体適合性高分子からなる、［１］の方法。
［３］ 生体適合性高分子が、ポリ乳酸グリコール酸共重合体である、［２］の方法。
［４］ 自己組織化単分子膜がアルカンチオール又はその誘導体、あるいはシステインからなる、［１］〜［３］のいずれかの方法。
［５］ 電極基板が多孔質体である、［１］〜［４］のいずれかの方法。
［６］ 電極基板である多孔質体がポーラス膜である、［５］の方法。
［７］ ナノ薄膜が自己組織化単分子膜を介して電極基板に配設されてなる細胞培養基材。
［８］ 電極基板が多孔質体である、［７］に記載の細胞培養基材。
［９］ 電極基板である多孔質体がポーラス膜である、［８］の細胞培養基材。
［１０］ ナノ薄膜が自己組織化単分子膜を介して電極基板に配設されてなる細胞培養基材、ならびに該電極基板へ電位を印加するために用いられるカウンター電極及び電源を含む、細胞培養装置。
［１１］ 電極基板が多孔質体である、［１０］の細胞培養装置。
［１２］ 電極基板である多孔質体がポーラス膜である、［１１］の細胞培養装置。
［１３］ 自己組織化単分子膜、ナノ薄膜、及び細胞が、この順で積層されてなる、細胞・ナノ薄膜複合体。

本発明によれば、細胞・ナノ薄膜複合体を、任意のタイミングで基板より遊離させ、回収することができる。

図１は、ナノ薄膜の作製方法の簡略図を示す。 図２は、ＳＡＭを備える電極基板の作製方法の簡略図を示す。 図３は、各ＳＡＭを備える電極基板に電位を印加して得られたサイクリックボルタモグラムを示す。（Ａ）１回目の掃引、（Ｂ）２回目の掃引。 図４は、ＳＡＭを備える電極基板上にナノ薄膜が配設されてなる細胞培養基材の写真図を示す。スケールバー：５．０ｍｍ。 図５は、電位を印加することにより電極基板からナノ薄膜が剥離する様子を示す写真図である。（ａ）電位を印加する前；（ｂ）剥離する瞬間；（ｃ）剥離した後。 図６は、電位を印加することにより電極基板から細胞・ナノ薄膜複合体が剥離する様子を示す写真図である。（ａ）電位を印加する前；（ｂ）剥離する瞬間；（ｃ）剥離した後。 図７は、細胞・ナノ薄膜複合体を電極基板から脱着させる前後の細胞生存率を示すグラフである。 図８は、金ポーラス電極の写真(a)とSEM画像（ｂ）である。 図９は、ナノ薄膜がポーラス電極から脱着する様子を示す写真である。 図１０は、ナノ薄膜が電極基板から脱着するのに要した時間を示すグラフである。 図１１は、シリンジ針による細胞・ナノ薄膜複合体の網膜下への移植の方法を示す図である。 図１２は、細胞・ナノ薄膜複合体を送達した後の網膜の光干渉断層計（OCT）画像である。 図１３は、摘出した眼球に確認された、後眼部の円形のナノ薄膜の写真である。 図１４は、摘出した眼球の網膜の凍結切片画像を示す。 図１５は、網膜切片のヘマトキシン・エオシン染色画像である。

１．細胞培養基材
本発明における「細胞培養基材」は、ナノ薄膜が自己組織化単分子膜を介して基板となる電極基板に配設されてなる構造を有し、細胞はナノ薄膜上に接着することができ、細胞培養において足場となる材料として利用することができる。

本発明において「ナノ薄膜」とは、５００ｎｍ未満、好ましくはおよそ４００ｎｍ以下、より好ましくはおよそ３００ｎｍ以下、さらに好ましくはおよそ２００ｎｍ以下の厚みを有する生体適合性高分子からなるシートを意味する。「ナノ薄膜」の厚みの下限は特に限定されないが、およそ２０ｎｍ以上、好ましくはおよそ４０ｎｍ以上、より好ましくはおよそ６０ｎｍ以上、さらに好ましくはおよそ８０ｎｍ以上、よりさらに好ましくはおよそ１００ｎｍ以上とすることができる。例えば、本発明において「ナノ薄膜」は、およそ２０ｎｍ〜３００ｎｍ、好ましくはおよそ１００ｎｍ〜２００ｎｍ程度の厚みを有する生体適合性高分子からなるシートとすることができる。

本発明において利用可能な「生体適合性高分子」としては、例えばポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリブチレンサクシネート、ポリジオキサノン、ポリジメチルシロキサン、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレン、ポリ酢酸ビニル、ポリ（３，４−エチレンジオキシチオフェン）、タンパク質（コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、ファイブロネクチン、エラスチン）、多糖類（キトサン、アルギン酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、セルロース）、核酸（ＤＮＡ，ＲＮＡ）及びそれらの共重合体等が挙げられる。好ましくは、生体適合性高分子は生体分解性ポリマーであり、特に好ましくはポリ乳酸グリコール酸共重合体（以下、「ＰＬＧＡ」と記載する。）である。

本発明においてナノ薄膜の形状は特に限定されず、円形、楕円形、多角形（例えば、長方形、正方形、五角形、六角形等）又はそれらの組合せ等、任意の形状とすることができる。例えば、ナノ薄膜の直径又は最も長い対角線の長さを、およそ１０μｍ〜２０ｍｍ、好ましくはおよそ５０μｍ〜１５ｍｍ、より好ましくはおよそ１００μｍ〜１０ｍｍ、さらに好ましくはおよそ１５０μｍ〜５ｍｍ、よりさらに好ましくはおよそ２００μｍ〜３ｍｍ、とりわけ好ましくはおよそ３００μｍ〜１ｍｍ程度とすることができる（これらに限定はされない）。ナノ薄膜がこのような形状（サイズ）を有することによって、最終生成物である細胞・ナノ薄膜複合体を細管により吸引・放出することができ、当該複合体の生体への移植操作等を容易にすることができる。

ナノ薄膜の細胞を担持する側の表面は、細胞の接着及び増殖を促進する細胞外基質によりコーティングすることができる。本発明において利用可能な「細胞外基質」としては、例えば、Ｉ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、フィブロネクチン、ポリ−Ｄ−リジン（ＰＤＬ）、ラミニン、ポリ−Ｌ−オルニチン／ラミニン（ＰＬＯ／ＬＭ）等が挙げられる。

ナノ薄膜中又はその表面には、機能性物質を含めることができる。「機能性物質」とは、細胞の増殖、分化、生理活性等を制御する機能を有する物質（例えば、タンパク質、ポリペプチド、化合物等）やナノ薄膜の可視化を可能にする物質を意味する。このような機能性物質としては、成長／増殖因子（例えば、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）等）、眼圧降下剤、神経保護剤、抗生物質、抗がん剤、可視化プローブ（造影剤、ナノ粒子、蛍光色素等）が挙げられる。

また、ナノ薄膜中又はその表面には、金属、半導体、セラミック、磁性体等からなるナノ粒子、好ましくは磁性体ナノ粒子を含めることができる。当該ナノ粒子は１ｎｍ〜５００ｎｍ、好ましくは１ｎｍ〜５０ｎｍ程度の粒子径を有する。ナノ薄膜が当該ナノ粒子を有することによって、ナノ薄膜の表面に当該ナノ粒子に起因する凹凸を形成することができる。ナノ薄膜の表面に凹凸を形成することによって、細胞が接着できる表面積を増すことができると共に、細胞の増殖活性を増大させることができる。また、ナノ薄膜に磁性体ナノ粒子含めた場合には、磁力を用いてナノ薄膜を移動／集合させることができ、最終生成物である細胞・ナノ薄膜複合体の操作性を高めることができる。

本発明において利用可能な「電極基板」としては、自己組織化単分子膜がチオレートを介して結合することができ、かつ作用電極として機能する導電性を有するものであればよく、例えば、金、銀、白金、銅等の貴金属や、シリコン、炭化ケイ素、セレン化亜鉛等の半導体、酸化スズ、酸化亜鉛、酸化インジウムなどの金属酸化物より選択される一又は複数の材料（電極材料）を利用することができる。電極基板は電極材料からなるものであってもよいし、他の材料（支持基板）の表面の一部又は全体が電極材料で覆われてなるものであってもよい。他の材料は特に限定されず、合成樹脂、金属、無機材料（ガラス、シリコン、セラミック等）を利用することができ、導電性を有するものであっても、導電性を有さないものであってもよい。

電極基板の形状や大きさは、上記ナノ薄膜を支持できる限り特に限定されず、任意の形状とすることができ、上記ナノ薄膜と同じ形状及び／又は大きさであってもよいし、上記ナノ薄膜の形状及び／又は大きさとは異なっていてもよい。

また、電極基板は、多孔質体やメッシュ等、培養培地が透過可能な形状とすることができる。電極基板が多孔質体やメッシュ等の形状を有することによって、電極基板に電位を印加した際に、自己組織化単分子膜との間に、培養培地が辺縁部からだけでなく、電極基板を透過して侵入することができ、電極表面への電解質溶液の迅速な供給が可能となり、電極基板からの自己組織化単分子膜の剥離を容易にすることができる。また、例えば、多孔質体としてポーラス膜（ポーラス電極基板）を用いることができ、ポーラス膜として金をコートしたポーラス薄膜が例示される。ポーラス膜のポアサイズは、数百nm〜数μm、好ましくは約１μmである。

本発明において「自己組織化単分子膜」とは、電極基板及び／又はナノ薄膜と結合する複数の疎水性化合物が、分子間相互作用により、高密度に集積し形成される高配向なナノレベルの単分子膜である。このような自己組織化単分子膜は一般的に「ＳＡＭ」（Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｓｅｍｂｌｅｄ Ｍｏｎｏｌａｙｅｒの略語）と呼ばれることがあり、本明細書においても、自己組織化単分子膜のことを単に「ＳＡＭ」と呼ぶ場合がある。また、本明細書において、ＳＡＭを形成するために用いられる化合物を、ＳＡＭ化合物と呼ぶ場合がある。

ＳＡＭ化合物としては、末端にチオール基（−ＳＨ基）を有する、あるいはスルフィド（−Ｓ−）又はジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）構造を有し、これらを介して電極基板と結合可能な直鎖状疎水性分子が挙げられる。好ましくは、ＳＡＭ化合物として炭素数４〜２０個、例えば炭素数４〜１５個程度のアルカンチオールや、システインを利用することができる。特に好ましくは、システインである。ＳＡＭがシステインからなる場合、当該ＳＡＭは比較的低い還元電位の印加によって電極基板の表面より剥離することができる。

ＳＡＭ化合物は、ナノ薄膜と結合することが可能な官能基で修飾された誘導体とすることができる。用いる官能基は、用いるナノ薄膜に応じて適宜選択することが可能であり、アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アルデヒド基等を用いることができる。例えば、ナノ薄膜がＰＬＧＡからなる場合、ＳＡＭ化合物は当該ナノ薄膜と結合可能なようにカルボキシル基で修飾することができる。

上記ＳＡＭ化合物からなるＳＡＭは、電極基板とナノ薄膜の双方に結合することができ、これによりナノ薄膜はＳＡＭと結合し、当該ＳＡＭを介して、当該ＳＡＭと結合する電極基板に吸着し、配設される。

本発明の細胞培養基材は以下の工程を含む手法により得ることができる。なお、以下、便宜上、ナノ薄膜を作製する工程を［１］とし、電極基板を作製する工程を［２］として記載するが、これら工程の順序は特に限定されず、電極基板を作製する工程をナノ薄膜を作製する工程の前に行ってもよいし、あるいは両工程を同時に行ってもよい。

［１］ナノ薄膜を作製する工程
本発明におけるナノ薄膜は公知の手法（ＷＯ２０１４／２０８７７８号公報）に基づいて作製することができ、以下及び図１に、マイクロスタンプ法とスピンコーティング法を組み合わせた作製方法の概略を示すが、ナノ薄膜の作製方法は当該手法に限定されない。

（ｉ）例えば、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、金属、シリコン、ガラス等を用いて所定のパターンが凸状に刻みこまれた基板（以下、「スタンプ」と記載する）を作製する。スタンプは常法に従い、フォトリソグラフィー技術を利用して作製することができる。例えば、基板表面をオクタデシルトリメトキシシラン（ＯＤＭＳ）、オクタデシルジメチルクロロシラン、トリアルコキシヘキサデシルシラン等の長鎖状疎水性分子でコーティングした後、その上にポジ型フォトレジストを塗布する。次に、前記レジストにフォトマスクを透過させて露光（電子照射、紫外線照射、Ｘ線照射等）する。続いて、基体上のレジストを現像し、感光した領域のレジストを除去する。そして、Ｏ_２プラズマ処理、ＣＯプラズマ処理又はハロゲンガスを用いた反応性イオンエッチング処理により、レジストで保護されていない領域の長鎖状疎水性分子を除去する。最後にアセトン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジクロロメタン等を用いてレジストを除去することで、スタンプを得ることができる（図１中、（ａ）として示す）。

（ｉｉ）得られたスタンプの表面（パターンが刻みこまれたスタンプ面）に生体適合性高分子層を形成する。生体適合性高分子又は生体適合性高分子の構成要素（例えば、生体分解性ポリマーの構成要素であるところのモノマー等）（以下、「生体適合性高分子等」と記載する。）を適当な溶媒（例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトン、酢酸エチル等）中に１ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは５ｍｇ／ｍＬ〜４０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解し、この生体適合性高分子等の溶液をスピンコーティング法にてスタンプ表面に塗布する。スピンコーターの回転速度、回転時間を調節することにより、スタンプ表面上に塗布される生体適合性高分子等の厚みを調節することができ、得られるナノ薄膜の厚みを調節することができる。

次いで、塗布された生体適合性高分子等を重合及び／又は架橋することによって、スタンプ表面上に生体適合性高分子からなる層を形成することができる（図１中、（ｂ）として示す）。ここで「重合」としては、重縮合、重付加、付加縮合、開環重合、付加重合（ラジカル重合、アニオン重合、カチオン重合）、熱による固相重合、光重合、放射線重合、プラズマ重合等を挙げることができる。また「架橋」は、公知の架橋剤（例えば、アルキルジミデート類、アシルジアジド類、ジイソシアネート類、ビスマレイミド類、トリアジニル類、ジアゾ化合物、グルタルアルデヒド等）を用いて行うことができる。

（ｉｉｉ）水溶性犠牲層を備える支持基板を作製する。支持基板（例えば、シリコン、ガラス等）（図１中、（ｃ）として示す）の一表面を、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）若しくはその誘導体、ポリイソプロピルアクリルアミド若しくはその誘導体、ポリエーテル若しくはその誘導体、多糖類、高分子電解質又はその塩等の水溶性高分子を用いてコーティングする。コーティングはキャスト法、スピンコーティング法等により水溶性高分子を支持基板上に塗布し、乾燥させることにより行うことができる。これにより、水性溶媒に可溶な水溶性犠牲層を備える支持基板を得ることができる（図１中、（ｄ）として示す）。

（ｉｖ）スタンプ表面上の生体適合性高分子層を、支持基板の水溶性犠牲層上にスタンプ・ベイクする（図１中、（ｅ）として示す）。生体適合性高分子の水溶性犠牲層上へのベイクは熱処理により行うことができる。これにより、生体適合性高分子がパターンを維持したまま水溶性犠牲層上に転写され、生体適合性高分子を担持する支持基板（生体適合性高分子担持支持基板）を得ることができる（図１中、（ｆ）として示す）。

（ｖ）生体適合性高分子担持支持基板を水に浸し、水溶性犠牲層を溶解させることによって、支持基板より生体適合性高分子を遊離させ、所定のパターンを有するナノ薄膜を得ることができる（図１中、（ｇ）として示す）。

［２］ＳＡＭを備える電極基板を作製する工程
以下及び図２に、スパッタリング法を用いた電極基板の作製方法の概略を示すが、電極基板の作製方法は、当該手法に限定はされない。

（ｉ）支持基板（合成樹脂、金属、無機材料（ガラス、シリコン、セラミック等））の上に、所定のパターンが切り抜かれたステンシルマスクをのせ、スパッタリングにより電極材料を基板上に付着させ、薄膜を形成させる（図２中、（ａ），（ｂ）として示す）。スパッタリングは公知の手法（２極スパッタリング法、マグネトロンスパッタリング法、ＤＣスパッタリング法、ＲＦ（高周波）スパッタリング法等）を用いて行うことができる。スパッタリングの時間を調節することによって、支持基板上に付着する電極材料の厚みを調節することができる。電極材料の支持基板に対する付着性を高めるために、電極材料を付着させる前に、チタンやニッケル等別の金属で支持基板を予めコーティングしてもよい。

（ｉｉ）ＳＡＭ化合物を適当な溶媒（例えば、水、アルコール（エタノール等）、アセトン、酢酸エチル等）中に０．１〜１０ｍＭ、好ましくは１〜２ｍＭの濃度で溶解し、このＳＡＭ化合物の溶液に、上記電極材料を付着させた支持基板を浸し（図２中、（ｃ）として示す）、ＳＡＭ化合物をチオレートを介して電極材料に結合させ、電極材料表面にＳＡＭを形成させる。

（ｉｉｉ）ステンシルマスクを除去することによって、所定のパターンを有し、ＳＡＭをその表面に備える電極基板を得ることができる（図２中、（ｄ）として示す）。

［３］細胞培養基材を得る工程
水中にて、［１］で得られたナノ薄膜を［２］で得られた電極基板上に（より詳細には、電極材料を付着させた領域上に）展開して載せ、水中より取り出し乾燥させ、ナノ薄膜とＳＡＭとを吸着させる。これにより、ナノ薄膜がＳＡＭを介して基板となる電極基板に吸着し、配設されてなる構造を有する細胞培養基材を得ることができる。

あるいは、上記「［２］ＳＡＭを備える電極基板を作製する工程」において、ＳＡＭを備える電極基板上にてナノ薄膜を形成してもよい。すなわち、上記「［２］ＳＡＭを備える電極基板を作製する工程」の工程（ｉｉ）においてＳＡＭを形成させた後、その表面に上記「［１］ナノ薄膜を作製する工程」の工程（ｉｉ）と同様の手法にて生体適合性高分子等の溶液を塗布する。次いで、塗布された生体適合性高分子等を重合及び／又は架橋することによって、ＳＡＭ表面上に生体適合性高分子からなるナノ薄膜を形成する。最後に、ステンシルマスクを除去することによって、所定のパターンを有し、ナノ薄膜がＳＡＭを介して基板となる電極基板に吸着・配設されてなる構造を有する細胞培養基材を得ることができる。

細胞培養基材のナノ薄膜の表面は、細胞の接着及び増殖を促進する細胞外基質によりコーティングすることができる。細胞外基質のコーティングは、適当な溶媒中に溶解した（例えば０．０１μｇ／ｍＬ〜５μｇ／ｍＬにて）細胞外基質溶液をスピンコーティング法等によりナノ薄膜上に塗布し、その後乾燥させることにより行うことができる。

２．細胞・ナノ薄膜複合体
本発明において、「細胞・ナノ薄膜複合体」とは、ナノ薄膜上に細胞を担持してなる構造を有する複合体である。より詳細には、本発明にける「細胞・ナノ薄膜複合体」とは、自己組織化単分子膜、ナノ薄膜、及び細胞が、この順で積層されてなる構造を有する複合体である。

本発明において、ナノ薄膜に担持させ得る細胞としては、細胞移植療法にて患者に移植され得る細胞（ただし、体液中に浮遊する細胞は除く）が挙げられ、例えば網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、視細胞、肝細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、血管内皮細胞、腎細胞、膵島細胞、表皮細胞、神経細胞等が挙げられる。これらの細胞は、本発明の細胞・ナノ薄膜複合体が導入・移植される患者より単離されたものであっても良いし、あるいは、ＥＳ細胞、幹細胞又はｉＰＳ細胞から誘導されたものであっても良い。

本発明の細胞・ナノ薄膜複合体は、上記細胞培養基材を用いて細胞を培養した後、電極基板より、細胞を担持するナノ薄膜が結合するＳＡＭを剥離することによって得ることができる。

電極基板からのＳＡＭの剥離は、電極基板にＳＡＭが還元脱離する電位を印加することによって行うことができる。

電極基板に印加する電位は、ＳＡＭが還元脱離する一方、細胞に悪影響を生じない電位であればよく、用いられるＳＡＭに応じて適宜決定することができる。電極基板に印加する電位は、サイクリックボルタンメトリー（Ｃｙｃｌｉｃ Ｖｏｌｔａｍｍｅｔｒｙ：ＣＶ）の測定により決定することができる。すなわち、所定の開始電位から所定の折り返し電位まで所定の掃引速度にて、ＳＡＭを備える電極基板に電位を印加する。次いで、当該所定の折り返し電位より折り返して、当該初期電位まで再び当該所定の掃引速度で電位を印加する。この間に電極基板に流れる電流を測定し、印加した電位との関係に基づいてサイクリックボルタモグラムを得る。得られたサイクリックボルタモグラムにおいて、負電流のピーク、すなわち、ＳＡＭの還元脱離に起因するピークを生じる電位を決定する。ＳＡＭを剥離するために電極基板に印加する電位は、このＳＡＭの還元脱離に起因するピークを生じる電位又はこれよりも負の電位とすることができる。

電極基板に印加する電位は、用いられるＳＡＭによって異なるものの、例えば、−０．１Ｖ〜−２．０Ｖ（ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌ）の範囲より選択される値とすることができる。例えば、ＳＡＭがシステインからなる場合、−０．７Ｖもしくはそれ以上、−０．８Ｖもしくはそれ以上、−０．９Ｖもしくはそれ以上、−１．０Ｖもしくはそれ以上、−１．１Ｖもしくはそれ以上、−１．２Ｖもしくはそれ以上、−１．３Ｖもしくはそれ以上、−１．４Ｖもしくはそれ以上、−１．５Ｖもしくはそれ以上、−１．６Ｖもしくはそれ以上、−１．７Ｖもしくはそれ以上、−１．８Ｖもしくはそれ以上、−１．９Ｖもしくはそれ以上の電位を印加することができる。

電極基板へ電位を印加する時間は、ＳＡＭが電極基板より剥離するのに十分な時間であって、細胞に悪影響を生じない時間であればよく、特に限定はされないが、例えば、５〜１００秒、好ましくは３０〜６０秒より適宜選択することができ、連続的に、又は断続的に行うことができる。

電極基板への電位の印加は常法にしたがって行うことができる。すなわち、カウンター電極及び細胞培養終了後の細胞を担持する細胞培養基材を、培地中、又は適当な緩衝液（例えば、ＰＢＳ）中に浸し、適当な電源にカウンター電極及び細胞培養基材の電極基板を接続することによって行うことができる。

電極基板への電位の印加により、ＳＡＭが電極基板より剥離され、それによって電極基板より遊離した細胞・ナノ薄膜複合体を得ることができる。電極基板からのＳＡＭの剥離、及び細胞・ナノ薄膜複合体の遊離を促すために、ピペッティングや振盪の操作を加えても良い。

３．細胞・ナノ薄膜複合体を用いた細胞送達
本発明の細胞・ナノ薄膜複合体は優れた柔軟性と自己支持性を有し、その直径又は最も長い対角線の長さよりも小さな内径を有する細管で吸引することができ、また当該細管より放出することができる。

「細管」としては例えば、ガラス針、注射針（シリンジ針）、カテーテル等が挙げられる。「細管」のサイズ（ゲージ）や長さは、細胞・ナノ薄膜複合体の大きさや、細胞・ナノ薄膜複合体を導入する部位等の要因に応じて適宜選択することができる。

本発明の細胞・ナノ薄膜複合体の生体内への導入は、生理食塩水と共に細胞・ナノ薄膜複合体を注射針又はカテーテル先端より吸引し、注射シリンジ又はカテーテル内に保持し、注射針又はカテーテル先端を疾患部位又はその近傍に挿入し、細胞・ナノ薄膜複合体を注射針又はカテーテル先端より放出して留置することにより行うことができる。細胞・ナノ薄膜複合体の生体内への導入により、前記疾患部位又はその近傍に担持する細胞を送達することができる。生体内には一又はそれ以上の細胞・ナノ薄膜複合体を導入することができる。また、導入されたパターン化ナノ薄膜は生体内で分解吸収され得る。

例えば、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の細胞・ナノ薄膜複合体を網膜に導入することにより、加齢黄斑変性等の網膜病変を治療することができる。ナノ薄膜を用いるアプローチは、ナノ薄膜の高い柔軟性から細胞シートを網膜病変部等の複雑な表面にも安定に配置することが可能である。さらに、このアプローチでは、回収した細胞・ナノ薄膜複合体をシリンジ針にて低侵襲に網膜下に移植できるため、合併症発生の防止効果も期待できる。

４．細胞培養装置
本発明において細胞培養装置は、上記細胞・ナノ薄膜複合体の製造に用いられる、細胞培養基材、ならびに電極基板へ電位を印加するために用いられるカウンター電極及び適当な電源を含むことができる。

以下に実施例を示し、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
１．試薬
本実施例において、以下の試薬を用いた。
・１０−カルボキシデカンチオール（同仁化学研究所）
・７−カルボキシヘプタンチオール（同仁化学研究所）
・Ｌ−システイン（和光純薬）
・ポリ乳酸グリコール酸共重合体（７５：２５，ＰＬＧＡ，Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）
・ポリビニルアルコール（分子量１３，０００−２３，０００，ＰＶＡ，ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）
・ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ，東レダウコーニング）
その他全ての試薬は市販されているものを使用した。

２．細胞培養基材の作製
２−１．ＳＡＭ化合物溶液の調製
本実施例においては、３種類のＳＡＭ化合物を用いて実験を行った。各ＳＡＭ化合物溶液は以下の条件で調製した。
・１０−カルボキシデカンチオールをエタノールに溶かし、１ｍＭに調製した。
・７−カルボキシヘプタンチオールをエタノールに溶かし、１ｍＭに調製した。
・Ｌ−システインを蒸留水に溶かし、１ｍＭに調製した。

２−２．電極基板の作製
電極基板は図２に示す手法に準じて作製した。

すなわち、シリコーンゴムシート（厚さ２００μｍ）をカッティングプロッター（Ｃｒａｆｔ ＲＯＢＯ Ｐｒｏ，ＧＲＡＰＨＴＥＣ）を用いて目的の形状にカットし、ガラス基板に貼り付けた状態でチタンを６０秒間スパッタリングした。次いで、金を６０秒間スパッタリングした後、「２−１．ＳＡＭ化合物溶液の調製」で作製したいずれかのＳＡＭ化合物溶液に室温で３０分間浸して、金の表面にＳＡＭを形成させた。最後に、シリコーンゴムシートを剥がすことによって、表面にＳＡＭを備える金がパターニングされた電極基板を得た。

２−３．ＳＡＭの電気化学的評価
上記「２−２．電極基板の作製」で作製した、１０−カルボキシデカンチオール、７−カルボキシヘプタンチオール、又はＬ−システインからなる各ＳＡＭを備える金がパターニングされた電極基板について、ＡＬＳ電気化学アナライザー（ＡＬＳ Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ Ｍｏｄｅｌ７６０Ｃ，ＣＨ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いてサイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）を測定した。

測定には三電極式を使用し、上記電極基板、参照電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ電極）、カウンター電極（Ａｇ電極）をそれぞれＡＬＳ電気化学アナライザーに接続し、３０分間窒素バブリングしたＫＯＨ水溶液（０．５Ｍ）に各電極を浸してＣＶの測定を以下の条件にて行った。
・走査速度：０．１Ｖｓ^−１
・セグメント：２
・サンプリング間隔：０．００１Ｖ
・感度：１ｅ−４ＡＶ^−１

各ＳＡＭを備える電極基板のサイクリックボルタモグラムを、図３に示す。１回目の掃引（Ａ）では、各ＳＡＭを備える電極基板のグラフについてそれぞれピークが確認された。一方、２回目の掃引（Ｂ）では全ての電極基板のグラフについてピークが認められなかった。この結果は、１回目の掃引において各電極基板よりＳＡＭが剥離したことを示す。

また、以下の表１に電極基板から剥離したＳＡＭ化合物の分子数をサイクリックボルタモグラムのピーク値から算出した結果を示す。剥離したＳＡＭ化合物の分子数はサイクリックボルタモグラムの負のピークにおける総電荷量と、ＳＡＭ化合物１分子につき１電子が反応することに基づいて算出した。元々電極基板と結合していた分子数の理論値と比較したところ、３種類のＳＡＭ全てで５０〜７０％の分子が剥離したことが示された。

この結果より還元電位を印加することで、電極基板上の大部分のＳＡＭを剥離できることが確認された。

上記ＣＶの結果より、Ｌ−システインからなるＳＡＭが最も低い電位で、電極基板より剥離することが確認された。この結果より、３種類のＳＡＭの中でＬ−システインからなるＳＡＭが、電位を印加したときに最も脱離しやすいことが示された。以後の実験は、ＳＡＭの形成にＬ−システインを用いて実施した。

２−４．細胞培養基材の作製
ＰＬＧＡからなるナノ薄膜は図１に示す手法に準じて作製した。

（１）ＰＶＡを蒸留水に１００ｍｇ／ｍＬにて溶かし、ＰＶＡを調製した。ガラス基板にＰＶＡ溶液を４０００ｒｐｍにて４０秒間スピンコートし、１２０℃のホットプレートで９０秒間加温した。

（２）ＰＬＧＡをＣＨ_２Ｃｌ_２に２０ｍｇ／ｍＬにて溶かし、ＰＬＧＡ溶液を調製した。ＰＤＭＳで目的の形状のスタンプを作製し、これにＰＬＧＡ溶液を４０００ｒｐｍにて４０秒間スピンコートした。

（３）（２）で得られたＰＬＧＡをコートしたスタンプを、（１）で得られたＰＶＡをコートしたガラス基板に押し付けて９０秒間加温した。

（４）スタンプを基板から剥がしてガラス基板を水に浸しＰＶＡを溶解させて、目的の形状を有するナノ薄膜を遊離させた。

（５）遊離したナノ薄膜を水中で、上記「２−２．電極基板の作製」で作製した表面にＬ‐システインからなるＳＡＭを備える電極基板上にピンセットを用いて載せ、水中より取り出し乾燥・吸着させ、ナノ薄膜がＳＡＭを介して電極基板上に配設されてなる細胞培養基材を得た（図４）。

２−５．ナノ薄膜の剥離試験
上記「２−４．細胞培養基材の作製」で作製した細胞培養基材、及び−１．５Ｖの乾電池に接続したカウンター電極（Ｐｔ電極）をＰＢＳ中に浸し、当該乾電池で電極基板に電位を３０〜５０秒間印加した。

その結果、ナノ薄膜の黒く見える部分の面積が増大した（図５）。これはＳＡＭが電極基板より剥離し、電極基板との間にＰＢＳが入り込んだことを示す。この状態でピペットを用いてナノ薄膜に軽く水流を当てると、ナノ薄膜は電極基板より容易に遊離した。

一方、電位を印加しない状態で水流を当ててもナノ薄膜は電極基板から剥がれなかった。

これらの結果より、ＳＡＭの還元脱離を用いることでナノ薄膜を電極基板から遊離させることができることが確認され、そのタイミングは電位印加の操作によって調節できることが示された。

３．細胞・ナノ薄膜複合体の剥離試験
本試験においては、細胞・ナノ薄膜複合体を基板より剥離する手段（ＳＡＭ、ＰＶＡ、温度応答性高分子）について比較検討した。
（１）ＳＡＭを用いた剥離試験
本実験においては、上記「２−４．細胞培養基材の作製」にて作製した細胞培養基材を利用した。細胞培養に際して、細胞培養基材はナノ薄膜上にＩ型コラーゲン（５ｍｇ／ｍＬ）をスピンコート（４０００ｒｐｍ，４０秒）して細胞の接着性を高めた後に利用した。

ラット由来の網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ−Ｊ細胞）を３×１０^６細胞／ｍＬ程度に調製して前記細胞培養基材のナノ薄膜上に細胞の懸濁液を４００μＬ滴下した。細胞がナノ薄膜に沈着するまで１時間程度インキュベータ（朝日ライフサイエンス，ミニＣＯ_２インキュベータ４０２０型）内で静置した後、培地を抜き、ＰＢＳ（−）を静かに加えて洗浄した。ＰＢＳ（−）を抜き、培地（５００ｍＬのＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ，Ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ，和光純薬））に５ｍＬの抗生物質＆抗真菌剤（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ，Ｇｉｂｃｏ）及び２０ｍＬの非働化牛胎児血清（ＦＢＳ，Ｂｉｏ Ｗｅｓｔ）を添加したものを加えて、３３℃の条件下インキュベータ内で培養した。

２日間培養した後、電極基板に「２−５．ナノ薄膜の剥離試験」に記載した手法と同様に、−１．５Ｖの乾電池で電位を３０〜５０秒間印加した。

ピペットを用いて細胞培養基材に軽く水流を当てると、電極基板から細胞・ナノ薄膜複合体が容易に遊離した（図６：電位の印加後、ナノ薄膜の黒く見える部分の面積が増大した（ｃ））。また、Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ及びＰＩを用いた細胞の生死判定により、得られた細胞・ナノ薄膜複合体における細胞の生存も確認された。細胞・ナノ薄膜複合体を電極基板から脱着させる前後で組織形態に変化は無く、細胞生存率もともにほぼ100％であった（図７）。この結果より、SAMの還元脱離を利用した脱着操作がナノ薄膜上の細胞に与える影響はほとんど無いことがわかった。

（２）犠牲層のＰＶＡを用いた剥離試験
培養中の細胞・ナノ薄膜複合体の基板としてＰＶＡ層を用いて実験を行った。培養液中にて、ＰＶＡ層が徐々に溶解することによって、細胞・ナノ薄膜複合体を基板より遊離させることを試みた。

ナノ薄膜上でＲＰＥ−Ｊ細胞がコンフルエントになるまでに約２日かかるため、約５０時間程度で完全にＰＶＡ層が溶解するようにＰＶＡ量を調製して基板を作製した。すなわち、上記「２−４．細胞培養基材の作製」に記載する手法と同様に、ＰＶＡを蒸留水に１０ｍｇ／ｍＬ，１５ｍｇ／ｍＬ，２０ｍｇ／ｍＬ，３０ｍｇ／ｍＬ，５０ｍｇ／ｍＬ，又は１００ｍｇ／ｍＬにて溶かしてＰＶＡ溶液を調製し、これを用いてＰＶＡをコートしたガラス基板を作製した。これにＰＬＧＡをコートしたスタンプを押し付けて９０秒加温し、スタンプを基板から剥がし、Ｉ型コラーゲンをコーティングして、ナノ薄膜・ＰＶＡ細胞培養基材を作製した。この上に細胞を播種し培養した。

結果、１００ｍｇ／ｍＬのＰＶＡ溶液を用いて調製されたナノ薄膜・ＰＶＡ細胞培養基材においては培養開始から約１時間後に、２０ｍｇ／ｍＬ，３０ｍｇ／ｍＬ，５０ｍｇ／ｍＬのＰＶＡ溶液を用いて調製された場合には約２時間後に、１５ｍｇ／ｍＬのＰＶＡ溶液を用いて調製された場合には約２４時間後に、１０ｍｇ／ｍＬのＰＶＡ溶液を用いて調製されたされた場合には約３６時間後に、それぞれナノ薄膜が完全に遊離して基板を失い、細胞がコンフルエントになるまでの間（約２日間）、基板にナノ薄膜を接着させておくことはできなかった。

ナノ薄膜の大きさ、用いるＰＶＡ溶液の濃度、培養期間等の要因によって、ＰＶＡの溶解速度やナノ薄膜の遊離のタイミングは変化し得るため、基板としてＰＶＡ層を利用する本手法によって、所望のタイミングでナノ薄膜を基板より遊離させることは困難であるといえる。

（３）温度応答性高分子を用いた剥離試験
培養中の細胞・ナノ薄膜複合体の基板として、温度応答性高分子を用いて実験を行った。培養温度を変化させることによって、温度応答性高分子の接着特性を変化させ、細胞・ナノ薄膜複合体を基板より遊離させることを試みた。

上記「２−４．細胞培養基材の作製」において、工程（４）で得られたナノ薄膜を、温度応答性高分子であるポリイソプロピルアクリルアミドが培養表面に固定された市販の培養皿Ｕｐ Ｃｅｌｌ（Ｗａｋｏ）に載せ、Ｉ型コラーゲンをコーティングした後、この上で細胞を培養し、細胞・ナノ薄膜複合体を作製した。なお、Ｕｐ Ｃｅｌｌは３２℃を境にして、それより高温環境では疎水性となり接着表面を作り、それより低温環境では親水性となり遊離表面を作る。

２日間の培養後、温度を２０℃に下げた環境下で数十分静置したが、Ｕｐ Ｃｅｌｌから細胞・ナノ薄膜複合体を遊離させることはできなかった。また、ピペッティングにより水流を当てたが、Ｕｐ Ｃｅｌｌから剥がれたものは細胞のみで細胞・ナノ薄膜複合体は遊離しなかった。これは細胞の培養環境が３３℃で、Ｕｐ Ｃｅｌｌの境界の温度である３２℃に近く適切な温度変化を生じさせることができなかったこと、また、ＰＬＧＡからなるナノ薄膜とＵｐ Ｃｅｌｌとの間で強い分子間力働いたこと等が要因として考えられる。

以上の結果より、ＳＡＭの還元脱離を利用することで細胞・ナノ薄膜複合体を基板より任意のタイミングで、容易に遊離させることが可能であることが示された。すなわち、他の手法と比べて、ＳＡＭを利用する本発明の手法が、細胞・ナノ薄膜複合体を得る上で顕著な有用性を有することが明らかとなった。

４．電極基板としてのポーラス電極基板（ポーラス膜）の利用
SAMの還元脱離反応を促進するためには、電極表面への電解質溶液の迅速な供給が必要である。そこで、電極基板としてポーラス膜の利用を検討した。図８は、金をコートしたポーラス薄膜（ポアサイズ１μm）の写真（図８a）とSEM画像（図８b)である。この電極表面にL-システインのSAMを形成させた後、電極上にナノ薄膜を吸着させた。SAMの還元脱離反応を進行させると、１分程度で電極基板からナノ薄膜が脱着することが確認された（図９）。図９Ａ、Ｂ及びＣは、それぞれ、０秒後、５０秒後及び６０秒後の状態を示す。図１０に電極基板からナノ薄膜が脱着するのに要した時間を示す。ナノ薄膜の直径が10、20mmのいずれの場合も、脱着に要する時間はポーラス電極の方がノンポーラス電極に比べて明らかに短かった。

これは、ポーラス電極では、電解質溶液が電極表面のエッジからのみならず、ポアを通して裏側からも電極表面に供給されるため、速やかに還元脱離反応が進行したためだと考えられる。

５．細胞・ナノ薄膜複合体のラット眼球網膜下への送達 電極基板から脱着させた細胞・ナノ薄膜複合体のラット眼球網膜下への送達を検討した。ナノ薄膜上でRPE細胞（網膜色素上皮細胞：Retinal Pigment Epithelium）がモノレイヤー組織を形成した後、SAMの還元脱離により、モノレイヤー組織を細胞・ナノ薄膜複合体として電極基板から脱着させた。続いて、ガラスキャピラリーニードル中に細胞・ナノ薄膜複合体を吸引し、その後、ニードルを射出する方法を示す図である。挿入して細胞・ナノ薄膜複合体を射出した（図１１）。図１２に網膜下に細胞・ナノ薄膜複合体を送達した後の光干渉断層計（OCT）画像を示す。網膜下にシート様構造の影が観察された一方で、コントロールの網膜ではそのような影は確認されなかった。また、眼球を摘出すると、後眼部に円形のナノ薄膜が確認された（図１３）。図１４は摘出眼球の凍結切片画像であり、ナノ薄膜が網膜下に送達され展開していることが確認できる。さらに、別のサンプルで行ったヘマトキシン・エオシン染色画像による組織学的検査からナノ薄膜による網膜下への細胞の局所送達が示唆された（図１５）。

Claims (12)

1. 細胞・ナノ薄膜複合体の製造方法であって
   ナノ薄膜がシステインからなる自己組織化単分子膜を介して電極基板に配設されてなる細胞培養基材において、該ナノ薄膜上にて細胞を培養する工程、
   該電極基板に、該自己組織化単分子膜が該電極基板より還元脱離する電位を印加して、該自己組織化単分子膜を該電極基板より剥離する工程、ならびに
   該自己組織化単分子膜の剥離に伴い、該電極基板より遊離した細胞・ナノ薄膜複合体を回収する工程、を含む、上記方法。
2. ナノ薄膜が、生体適合性高分子からなる、請求項１に記載の方法。
3. 生体適合性高分子が、ポリ乳酸グリコール酸共重合体である、請求項２に記載の方法。
4. 電極基板が多孔質体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 電極基板である多孔質体がポーラス膜である、請求項４記載の方法。
6. ナノ薄膜がシステインからなる自己組織化単分子膜を介して電極基板に配設されてなる細胞培養基材。
7. 電極基板が多孔質体である、請求項６記載の細胞培養基材。
8. 電極基板である多孔質体がポーラス膜である、請求項７記載の細胞培養基材。
9. ナノ薄膜がシステインからなる自己組織化単分子膜を介して電極基板に配設されてなる細胞培養基材、ならびに該電極基板へ電位を印加するために用いられるカウンター電極及び電源を含む、細胞培養装置。
10. 電極基板が多孔質体である、請求項９に記載の細胞培養装置。
11. 電極基板である多孔質体がポーラス膜である、請求項１０記載の細胞培養装置。
12. システインからなる自己組織化単分子膜、ナノ薄膜、及び細胞が、この順で積層されてなる、細胞・ナノ薄膜複合体。

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