JP6822760B2 - Hemostatic material - Google Patents
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Description
本発明は、フィブロイン多孔質体を用いた止血材に関する。 The present invention relates to a hemostatic material using a fibroin porous body.
医療現場において止血は極めて重要な処置の１つであり、出血による患者の負担の軽減、予後改善、外科医の負担軽減等の観点から、止血に要する時間の短縮化、及び止血に至るまでの出血量を最小限に抑え、確実に止血することが要求される。
従来から、出血箇所に止血材を押し当てる方法、いわゆる圧迫法に用いられる止血材として、脱脂綿、コットンのガーゼ等を用いた製品が使用されてきた。
Hemostasis is one of the extremely important treatments in the medical field, and from the viewpoint of reducing the burden on patients due to bleeding, improving the prognosis, reducing the burden on surgeons, etc., shortening the time required for hemostasis and bleeding leading to hemostasis. It is required to minimize the amount and ensure hemostasis.
Conventionally, products using absorbent cotton, cotton gauze, etc. have been used as a hemostatic material used in a method of pressing a hemostatic material against a bleeding site, that is, a so-called compression method.
止血効果を有する材料として、ウシ又は豚由来のアテロコラーゲンを原料としたコラーゲンのほか、ゼラチン、酸化セルロース、キチン誘導体等が知られている。
コラーゲンは血液と接触して血小板を活性化し、該活性化された血小板がコラーゲンに付着し、凝集塊を形成することで止血を可能とするものである（例えば、特許文献１参照）。また、ゼラチンは血液のような水分存在下においてゲルを形成し、出血部位の形状に沿って密着し得る柔軟性と、生体組織に対する高い接着性を示すことで、局所を圧迫して止血を可能とする止血材として用い得ることが知られている（例えば、特許文献２参照）。酸化セルロースは血液中のヘモグロビンと強い親和性を有するため、体内及び体外の創傷患部に施用することにより血液凝固作用、細胞拡張作用を促して自然治癒を図ることができ（例えば、特許文献３参照）、キチン誘導体は、血小板を活性化し、血液凝集を促すことで止血効果を発現することが知られている（例えば、特許文献４参照）。
As a material having a hemostatic effect, collagen made from bovine or porcine-derived atelocollagen, gelatin, oxidized cellulose, a chitin derivative and the like are known.
Collagen comes into contact with blood to activate platelets, and the activated platelets adhere to collagen to form agglomerates, thereby enabling hemostasis (see, for example, Patent Document 1). In addition, gelatin forms a gel in the presence of water such as blood, and by showing flexibility that can adhere along the shape of the bleeding site and high adhesion to living tissue, it is possible to press the local area and stop bleeding. It is known that it can be used as a hemostatic material (see, for example, Patent Document 2). Since cellulose oxide has a strong affinity for hemoglobin in blood, it can be applied to wound-affected areas inside and outside the body to promote blood coagulation and cell dilation to achieve natural healing (see, for example, Patent Document 3). ), The chitin derivative is known to exhibit a hemostatic effect by activating platelets and promoting blood coagulation (see, for example, Patent Document 4).
しかしながら、脱脂綿、ガーゼ等の従来から汎用される止血材は、多量の出血を即時止血できない上に、創傷部に対する固着性が大きいため、剥離するときに使用部位に多くの繊維を残してしまい、これらの繊維を取り除く必要があった。
また、特許文献１及び２に記載のコラーゲン、ゼラチンを用いた止血材は、生体内分解性及び吸収性に優れる一方で、抗原性を有するテロペプチド部分の除去が困難であるという問題があり、また、プリオン混入等の動物由来の感染症の危険性があるため、生体に使用することは避けたほうがよいことが分かってきている。
However, conventional hemostatic materials such as absorbent cotton and gauze cannot immediately stop a large amount of bleeding and have high adhesion to the wound, so that many fibers are left at the site of use when peeling. It was necessary to remove these fibers.
Further, the hemostatic material using collagen and gelatin described in Patent Documents 1 and 2 is excellent in biodegradability and absorbability, but has a problem that it is difficult to remove an antigenic terror peptide portion. In addition, it has been found that it is better to avoid using it in a living body because there is a risk of animal-derived infectious diseases such as prion contamination.
特許文献３に記載の酸化セルロースを用いた止血材は、材料が生体由来の材料ではないため、異物反応を誘発する問題があると共に、水溶性であるため取り扱い性にも問題がある。また、特許文献４に記載のキチン誘導体を用いた止血材は、血液を吸液することにより膨潤ゲル化するため、生体内で使用する場合に周辺組織を圧迫する危険性があると共に、ゲル化したときに機械的強度が低下するという問題もあった。
また、これらの止血材は、生体に対する固着力が大きいため、止血部が治癒した後、又は止血部を再処理するため該止血材を剥離しようとすると、その固着力に起因して、脆弱な新生組織を傷つける二次損傷が生じてしまい、生体に損傷を与えることなく止血材を除去することが困難であった。
The hemostatic material using cellulose oxide described in Patent Document 3 has a problem of inducing a foreign body reaction because the material is not a biological material, and also has a problem of handleability because it is water-soluble. Further, since the hemostatic material using the chitin derivative described in Patent Document 4 swells and gels by absorbing blood, there is a risk of pressing the surrounding tissue when used in a living body, and gelation occurs. There was also a problem that the mechanical strength was lowered when the gel was used.
In addition, since these hemostatic materials have a large adhesive force to the living body, when the hemostatic material is healed or when an attempt is made to peel off the hemostatic material in order to reprocess the hemostatic portion, the hemostatic material is fragile due to the adhesive force. Secondary damage that damages the new tissue occurs, and it is difficult to remove the hemostatic material without damaging the living body.
本発明は、このような課題を解決するためになされたものであり、生体に対する安全性に優れ、止血時間が短く、生体から容易に除去することが可能であり、機械的強度及び柔軟性に優れる止血材を提供することを目的とする。 The present invention has been made to solve such a problem, has excellent safety to a living body, has a short hemostasis time, can be easily removed from the living body, and has mechanical strength and flexibility. The purpose is to provide an excellent hemostatic material.
本発明者らは、前記課題を達成するために鋭意研究を重ねた結果、下記の発明により当該課題を解決できることを見出した。
すなわち、本発明の要旨は、以下の［１］〜［６］のとおりである。
［１］タンパク質換算分子量が１１０，０００〜３１０，０００であるフィブロインを含有してなるフィブロイン多孔質体を用いた止血材。
［２］前記フィブロインのタンパク質換算分子量が１８０，０００〜３１０，０００である、上記［１］に記載の止血材。
［３］前記フィブロイン多孔質体がシルクフィブロイン多孔質体である、上記［１］又は［２］に記載の止血材。
［４］前記フィブロイン多孔質体の引張ひずみが５２〜６７％である、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の止血材。
［５］前記フィブロイン多孔質体の引裂き強さが２０〜４５Ｎ／ｍｍである、上記［１］〜［４］のいずれかに記載の止血材。
［６］前記フィブロイン多孔質体の２５％圧縮応力が２０〜２５ｋＰａである、上記［１］〜［５］のいずれかに記載の止血材。
As a result of intensive studies to achieve the above-mentioned problems, the present inventors have found that the following inventions can solve the problems.
That is, the gist of the present invention is as follows [1] to [6].
[1] A hemostatic material using a fibroin porous body containing fibroin having a protein-equivalent molecular weight of 110,000 to 310,000.
[2] The hemostatic material according to the above [1], wherein the fibroin has a protein-equivalent molecular weight of 180,000 to 310,000.
[3] The hemostatic material according to the above [1] or [2], wherein the fibroin porous body is a silk fibroin porous body.
[4] The hemostatic material according to any one of the above [1] to [3], wherein the fibroin porous body has a tensile strain of 52 to 67%.
[5] The hemostatic material according to any one of the above [1] to [4], wherein the fibroin porous body has a tear strength of 20 to 45 N / mm.
[6] The hemostatic material according to any one of the above [1] to [5], wherein the 25% compressive stress of the fibroin porous body is 20 to 25 kPa.
本発明によれば、生体に対する安全性に優れ、止血時間が短く、生体から容易に除去することが可能であり、機械的強度及び柔軟性に優れる止血材を提供することができる。 According to the present invention, it is possible to provide a hemostatic material which is excellent in safety to a living body, has a short hemostatic time, can be easily removed from the living body, and has excellent mechanical strength and flexibility.
［止血材］
本発明の止血材は、タンパク質換算分子量が１１０，０００〜３１０，０００であるフィブロインを含有してなるフィブロイン多孔質体を用いてなるものである。
以下、本発明に用いるフィブロイン多孔質体について詳述する。
[Hemostatic material]
The hemostatic material of the present invention is made by using a fibroin porous body containing fibroin having a protein equivalent molecular weight of 110,000 to 310,000.
Hereinafter, the fibroin porous material used in the present invention will be described in detail.
＜フィブロイン多孔質体＞
本発明に用いるフィブロイン多孔質体は、タンパク質換算分子量が１１０，０００〜３１０，０００であるフィブロインを含有してなるフィブロイン多孔質体である。
本明細書において、タンパク質換算分子量とは、高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）を用いて得られる評価試料のクロマトグラムを、分子量マーカーとしてグルタミン酸脱水素酵素（分子量：２９０，０００）、豚心筋乳酸脱水素酵素（分子量：１４２，０００）、酵母エノラーゼ（分子量：６７，０００）を使用して作成した較正曲線を用いて、タンパク質の分子量に換算した分子量を意味し、実施例に記載の方法により測定することができる。本明細書において「分子量」は、特に断らない限り「タンパク質換算分子量」を意味する。
<Fibroin porous body>
The fibroin porous body used in the present invention is a fibroin porous body containing fibroin having a protein equivalent molecular weight of 110,000 to 310,000.
In the present specification, the protein-equivalent molecular weight refers to a chromatogram of an evaluation sample obtained by using a high-speed liquid chromatograph (HPLC), glutamate dehydrogenase (molecular weight: 290,000), and pig myocardial lactate dehydrogenase as molecular weight markers. Using a calibration curve created using an enzyme (molecular weight: 142,000) and yeast enolase (molecular weight: 67,000), it means the molecular weight converted to the molecular weight of the protein, and is measured by the method described in Examples. be able to. In the present specification, "molecular weight" means "protein-equivalent molecular weight" unless otherwise specified.
フィブロイン多孔質体に含まれるフィブロインのタンパク質換算分子量は１１０，０００〜３１０，０００であり、１４０，０００〜３１０，０００であることが好ましく、１８０，０００〜３１０，０００であることがより好ましい。この範囲の分子量のフィブロインを含有するフィブロイン多孔質体は、機械的強度及び柔軟性に優れ、止血材として取り扱いが容易である。 The protein-equivalent molecular weight of fibroin contained in the fibroin porous body is 110,000 to 310,000, preferably 140,000 to 310,000, and more preferably 180,000 to 310,000. A fibroin porous body containing fibroin having a molecular weight in this range is excellent in mechanical strength and flexibility, and is easy to handle as a hemostatic material.
フィブロイン多孔質体中に含まれるフィブロインの含有量は、好ましくは８０質量％以上、より好ましくは９０質量％以上、さらに好ましくは９５質量％以上、特に好ましくは実質的に１００質量％である。 The content of fibroin contained in the fibroin porous body is preferably 80% by mass or more, more preferably 90% by mass or more, still more preferably 95% by mass or more, and particularly preferably substantially 100% by mass.
フィブロイン多孔質体の平均細孔径は、１〜５００μｍが好ましく、５〜３００μｍがより好ましく、１０〜１００μｍがさらに好ましい。平均細孔径が上記範囲内であると、優れた機械的強度と止血効果とを両立することができる。
ここで、フィブロイン多孔質体の平均細孔径は、多孔質体断面の走査型電子顕微鏡写真を５枚撮影し、さらに異なる日に作製した多孔質体断面の走査型電子顕微鏡写真を５枚撮影し、それら１０枚の走査型電子顕微鏡写真を画像解析ソフトを用いて画像処理し、算出した細孔径の平均値である。
The average pore diameter of the fibroin porous body is preferably 1 to 500 μm, more preferably 5 to 300 μm, and even more preferably 10 to 100 μm. When the average pore diameter is within the above range, both excellent mechanical strength and hemostatic effect can be achieved.
Here, for the average pore diameter of the fibroin porous body, five scanning electron micrographs of the porous body cross section were taken, and five scanning electron micrographs of the porous body cross section prepared on different days were taken. , These 10 scanning electron micrographs are image-processed using image analysis software, and are the average values of the pore diameters calculated.
フィブロイン多孔質体の大きさ、厚さに特に制限はなく、止血材の適用箇所等に応じて適切な大きさ、厚さのものを使用すればよい。また、加工によって所望の形状のフィブロイン多孔質体を得ることもできる。加工の方法に特に制限はなく、トムソン刃を使用した打ち抜き、バンドソーでのスライス加工等が挙げられる。 The size and thickness of the fibroin porous body are not particularly limited, and those having an appropriate size and thickness may be used depending on the application location of the hemostatic material and the like. In addition, a fibroin porous body having a desired shape can be obtained by processing. The processing method is not particularly limited, and examples thereof include punching with a Thomson blade and slicing with a band saw.
フィブロイン多孔質体の２５％圧縮応力は、２０〜２５ｋＰａであることが好ましく、２０〜２３ｋＰａであることがより好ましい。２５％圧縮応力がこの範囲のフィブロイン多孔質体は、柔軟性に優れている。
フィブロイン多孔質体の引裂き強さは、２０〜５０Ｎ／ｍｍであることが好ましく、２５〜４５Ｎ／ｍｍであることがより好ましい。引裂き強さがこの範囲のフィブロイン多孔質体は、機械的強度、伸縮性及び柔軟性のバランスに優れる。
フィブロイン多孔質体の引張強さは、３５〜７５ｋＰａであることが好ましく、４０〜７０ｋＰａであることがより好ましい。引張強さがこの範囲のフィブロイン多孔質体は、機械的強度、伸縮性及び柔軟性のバランスに優れている。
フィブロイン多孔質体の引張ひずみは、５２〜６７％であることが好ましく、５６〜６５％であることがより好ましい。引張ひずみがこの範囲のフィブロイン多孔質体は、伸縮性に優れている。
なお、本明細書における引張強さ及び引張ひずみとは、試験片を万能試験機等で引っ張った際に、試験片が破断したときの応力及びひずみを意味し、引張ひずみ（％）の値は、［〔（変形後の長さ−変形前の長さ）／（変形前の長さ）〕×１００］で表される比率の値を意味する。
フィブロイン多孔質体の２５％圧縮応力、引裂き強さ及び引張ひずみは実施例に記載の方法により測定することができる。
The 25% compressive stress of the fibroin porous body is preferably 20 to 25 kPa, more preferably 20 to 23 kPa. A fibroin porous material having a 25% compressive stress in this range has excellent flexibility.
The tear strength of the fibroin porous body is preferably 20 to 50 N / mm, more preferably 25 to 45 N / mm. A fibroin porous material having a tear strength in this range has an excellent balance of mechanical strength, elasticity and flexibility.
The tensile strength of the fibroin porous body is preferably 35 to 75 kPa, more preferably 40 to 70 kPa. Fibroin porous bodies in this range of tensile strength have an excellent balance of mechanical strength, elasticity and flexibility.
The tensile strain of the fibroin porous body is preferably 52 to 67%, more preferably 56 to 65%. A fibroin porous material having a tensile strain in this range has excellent elasticity.
The tensile strength and tensile strain in the present specification mean the stress and strain when the test piece is broken when the test piece is pulled by a universal testing machine or the like, and the value of the tensile strain (%) is , [[(Length after deformation-length before deformation) / (length before deformation)] × 100] means the value of the ratio.
The 25% compressive stress, tear strength and tensile strain of the fibroin porous material can be measured by the methods described in Examples.
フィブロイン多孔質体の血液凝固時間は、速やかな止血を可能とする観点から、２５分以下であることが好ましく、２０分以下であることがより好ましく、１５分以下であることがさらに好ましい。
なお、本発明において血液凝固時間は、下記の方法により測定された時間を意味し、具体的には、実施例に記載の方法により測定することができる。
３００ｍｍ３のフィブロイン多孔質体を投入した試験管を２本用意し、これらを３７℃に加温した後、採血直後の血液を１．５ｍＬ（２００ｍｍ３／ｍＬ）添加した。次いで、１本目の試験管を３０秒毎に傾け、血液の流動性を目視にて観察し、該１本目の試験管で血液凝固が観察された後、２本目の試験管を３０秒毎に傾け、血液の流動性を目視にて確認し、採血開始から２本目の試験管で血液凝固が観察されるまでの時間を血液凝固時間とした。
The blood coagulation time of the fibroin porous body is preferably 25 minutes or less, more preferably 20 minutes or less, still more preferably 15 minutes or less, from the viewpoint of enabling rapid hemostasis.
In the present invention, the blood coagulation time means the time measured by the following method, and specifically, it can be measured by the method described in Examples.
Two test tubes containing a 300 mm 3 porous body of fibroin were prepared, heated to 37 ° C., and then 1.5 mL (200 mm 3 / mL) of blood immediately after blood collection was added. Next, the first test tube is tilted every 30 seconds, the blood fluidity is visually observed, and after blood coagulation is observed in the first test tube, the second test tube is placed every 30 seconds. The blood coagulation time was defined as the time from the start of blood collection to the observation of blood coagulation in the second test tube after tilting and visually confirming the fluidity of the blood.
また、本発明の止血材は、創傷治癒の促進、浸出液の発生する創への固着の抑制効果が期待できるため、出血を伴う創のみでなく、浸出液の発生する創の被覆材としても好適に使用することができる。このため、出血の伴う創を本発明の止血材で止血した後に、適宜交換しながら本発明の止血材を創部に貼付し続けることで、止血効果だけでなく、創部への固着を抑制しながら、創傷治癒促進の効果も期待できる。
フィブロイン多孔質体の、浸出液が発生する創部に対する平均固着強さは、生体から容易に除去することを可能とする観点から、１５ｇ以下であることが好ましく、１２ｇ以下であることがより好ましく、１０ｇ以下であることがさらに好ましい。
なお、本発明において平均固着強さは、下記の方法により測定された時間を意味し、具体的には、実施例に記載の方法により測定することができる。
被験物質の創部に対する固着強さは、褥瘡を作製したラットの褥瘡を被験物質で被覆した後固定し、吊り秤（天衡商事、高精度光デジタルフォースゲージ）で該被覆物質を垂直に引っ張って被検物質を剥がしたときの重さの最大値を読み取ることで測定することができる。本発明においては、被検物質は褥瘡が完全に治癒するまでの間、２日ごとに新しいものに交換し、褥瘡が治癒するまでの各被検物質交換時に吊り秤が示した重さの最大値から、下記式により求められる値を平均固着強さとした。
平均固着強さ（ｇ）＝（褥瘡が治癒するまでの各被検物質交換時に吊り秤が示した重さの最大値の合計（ｇ））／（各被検物質の交換回数）
なお、褥瘡が完全に治癒した状態とは、創部が完全に上皮化した状態を意味する。
Further, since the hemostatic material of the present invention can be expected to promote wound healing and suppress adhesion to wounds in which exudate is generated, it is suitable not only for wounds with bleeding but also as a covering material for wounds in which exudate is generated. Can be used. Therefore, after the wound accompanied by bleeding is stopped with the hemostatic material of the present invention, the hemostatic material of the present invention is continuously attached to the wound while being replaced as appropriate, thereby suppressing not only the hemostatic effect but also the adhesion to the wound. , The effect of promoting wound healing can also be expected.
The average adhesion strength of the fibroin porous body to the wound where the exudate is generated is preferably 15 g or less, more preferably 12 g or less, and more preferably 10 g, from the viewpoint of allowing easy removal from the living body. The following is more preferable.
In the present invention, the average fixing strength means the time measured by the following method, and specifically, it can be measured by the method described in Examples.
The adhesion strength of the test substance to the wound is determined by covering the pressure ulcer of the rat in which the pressure ulcer was prepared with the test substance, fixing the pressure ulcer, and then pulling the coating material vertically with a hanging scale (Tenpo Shoji, high-precision optical digital force gauge). It can be measured by reading the maximum value of the weight when the test substance is peeled off. In the present invention, the test substance is replaced with a new one every two days until the pressure ulcer is completely healed, and the maximum weight indicated by the suspension scale at each test substance replacement until the pressure ulcer is healed. From the values, the value obtained by the following formula was taken as the average fixing strength.
Average fixation strength (g) = (total of maximum weights indicated by the hanging scale at the time of exchanging each test substance until the pressure ulcer heals (g)) / (number of exchanges of each test substance)
The state in which the pressure ulcer is completely healed means the state in which the wound is completely epithelialized.
次に、フィブロイン多孔質体の製造に用いられるフィブロイン原料、及びフィブロイン多孔質体の製造方法について説明する。 Next, the fibroin raw material used for producing the fibroin porous body and the method for producing the fibroin porous body will be described.
（フィブロイン原料）
フィブロイン多孔質体の原料として用いられるフィブロイン原料は、フィブロインに加え、セリシンを含む繭、生糸等の絹原料を精練し、セリシンを除去することで得られる。
使用する絹原料に特に制限はなく、繭、切繭、生糸等を使用することができる。蚕の品種にも特に制限はなく、例えば、家蚕、野蚕、天蚕等の天然蚕、トランスジェニック蚕などから産生されるシルクフィブロインなどを使用することができる。本発明においては、乾燥状態でも柔らかく、乾燥後の外観、スライス加工性に優れるフィブロイン多孔質体を得る観点から、シルクフィブロインを原料とすることが好ましい。
(Fibroin raw material)
The fibroin raw material used as a raw material for the fibroin porous body is obtained by scouring a silk raw material such as a cocoon containing sericin and raw silk in addition to fibroin to remove sericin.
The silk raw material used is not particularly limited, and cocoons, cut cocoons, raw silk and the like can be used. The varieties of silk moth are not particularly limited, and for example, natural silk moths such as domestic silk moths, wild silk moths, and wild silk moths, silk fibroin produced from transgenic silk moths, and the like can be used. In the present invention, it is preferable to use silk fibroin as a raw material from the viewpoint of obtaining a fibroin porous body which is soft even in a dry state and has excellent appearance after drying and slice processability.
通常、絹原料の精練は、アルカリ剤を溶解した水溶液中に絹原料を入れ、加熱するという工程で行われる。精練の方法に特に制限はなく、吊練り、機械練り、袋練り、泡練り等の手法を用いることができる。
精練に用いるアルカリ剤に特に制限はなく、マルセル石鹸、炭酸ナトリウム、重曹等を使用することができるが、石鹸の残留が懸念されることから、炭酸ナトリウム、重曹を用いることが好ましく、分子量の制御が容易なことから、炭酸ナトリウムを用いることがより好ましい。
水溶液中のアルカリ剤の濃度は、１５％ｏｗｆ〜２５％ｏｗｆであることが好ましい。アルカリ剤の濃度をこの範囲に設定することで、効率良くセリシンを除去することができると共に、フィブロイン多孔質体の形成に適した分子量のフィブロイン原料を得ることができる。
精練時の浴比（フィブロイン原料の質量に対するアルカリ剤を溶解した水溶液の質量の比）は、２０〜１００倍であることが好ましい。精練時の浴比をこの範囲に設定することで、効率良くセリシンを除去することができる。
精練時の加熱温度は、セリシンを十分に除去可能であれば特に制限はないが、常圧の場合、８５〜１００℃が好ましい。温度をこの範囲に設定することで、効率良くセリシンを除去することができる。
精練の時間はセリシンを十分除去可能であれば特に制限はないが、３時間〜５時間であることが好ましい。精練の時間をこの範囲に設定することで、効率良くセリシンを除去することができると共に、フィブロイン多孔質体の形成に適した分子量のフィブロイン原料を得ることができる。
精練後はフィブロイン原料に付着したアルカリ及びセリシンを除去するため、湯洗浄、水洗浄を行った後、脱水、乾燥することが好ましい。
Usually, the scouring of the silk raw material is performed by putting the silk raw material in an aqueous solution in which an alkaline agent is dissolved and heating the silk raw material. The refining method is not particularly limited, and methods such as hanging kneading, mechanical kneading, bag kneading, and foam kneading can be used.
The alkaline agent used for scouring is not particularly limited, and Marcel soap, sodium carbonate, baking soda, etc. can be used. However, since there is a concern that soap may remain, it is preferable to use sodium carbonate, baking soda, etc., and the molecular weight is controlled. It is more preferable to use sodium carbonate because it is easy to use.
The concentration of the alkaline agent in the aqueous solution is preferably 15% owf to 25% owf. By setting the concentration of the alkaline agent in this range, sericin can be efficiently removed, and a fibroin raw material having a molecular weight suitable for forming a fibroin porous body can be obtained.
The bath ratio at the time of refining (the ratio of the mass of the aqueous solution in which the alkaline agent is dissolved to the mass of the fibroin raw material) is preferably 20 to 100 times. By setting the bath ratio at the time of refining within this range, sericin can be efficiently removed.
The heating temperature at the time of refining is not particularly limited as long as sericin can be sufficiently removed, but in the case of normal pressure, it is preferably 85 to 100 ° C. By setting the temperature in this range, sericin can be removed efficiently.
The refining time is not particularly limited as long as sericin can be sufficiently removed, but it is preferably 3 hours to 5 hours. By setting the refining time in this range, sericin can be efficiently removed, and a fibroin raw material having a molecular weight suitable for forming a fibroin porous body can be obtained.
After scouring, in order to remove alkali and sericin adhering to the fibroin raw material, it is preferable to perform washing with hot water and washing with water, and then dehydration and drying.
フィブロイン原料は、タンパク質換算分子量が１６０，０００〜４１０，０００であることが好ましく、２００，０００〜３６０，０００であることがより好ましく、２４０，０００〜３１０，０００であることがさらに好ましい。この範囲の分子量のフィブロイン原料を使用してフィブロイン多孔質体を作製することで、機械的強度及び柔軟性に優れるフィブロイン多孔質体が得られる。
フィブロイン原料のタンパク質換算分子量は、実施例に記載の方法で測定することができる。
The fibroin raw material preferably has a protein equivalent molecular weight of 160,000 to 410,000, more preferably 200,000 to 360,000, and even more preferably 240,000 to 310,000. By producing a fibroin porous body using a fibroin raw material having a molecular weight in this range, a fibroin porous body having excellent mechanical strength and flexibility can be obtained.
The protein-equivalent molecular weight of the fibroin raw material can be measured by the method described in Examples.
（フィブロイン多孔質体の製造方法）
以下、フィブロイン原料として好ましいシルクフィブロインを例にとって、フィブロイン多孔質体の製造方法について説明する。
シルクフィブロイン多孔質体は、その製造方法は問わないが、例えば、シルクフィブロイン水溶液を急速冷凍した後、結晶化溶媒に浸漬し、融解と結晶化を同時進行することによって得る方法（例えば、特開平８−４１０９７号公報参照）、シルクフィブロイン水溶液を冷凍した後に長時間凍結状態を維持することで多孔質体を作製する手法（例えば、特開２００６−２４９１１５号公報参照）、シルクフィブロイン水溶液に対して少量の水溶性液状有機物質を添加した後に、一定時間冷凍して融解することによって多孔質体を得る手法（例えば、特許第３４１２０１４号公報参照）等が挙げられる。
(Manufacturing method of fibroin porous body)
Hereinafter, a method for producing a porous fibroin will be described by taking silk fibroin, which is preferable as a raw material for fibroin, as an example.
The method for producing the porous silk fibroin is not limited, but for example, a method obtained by rapidly freezing an aqueous solution of silk fibroin and then immersing it in a crystallization solvent to simultaneously proceed with melting and crystallization (for example, JP-A-Pla). 8-41097 (see, for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2006-249115), a method for producing a porous body by maintaining a frozen state for a long time after freezing the silk fibroin aqueous solution, for the silk fibroin aqueous solution. Examples thereof include a method of obtaining a porous body by adding a small amount of a water-soluble liquid organic substance and then freezing and thawing for a certain period of time (see, for example, Japanese Patent No. 3412014).
〔シルクフィブロイン水溶液〕
シルクフィブロイン多孔質体の製造に用いるシルクフィブロイン水溶液を得る方法としては、公知のいかなる手法を用いてもよいが、シルクフィブロインは水に対する溶解性が低いため、例えば、前記シルクフィブロインを溶解液に溶解した後、溶解に使用した薬剤を除去する方法が好適である。具体的には、例えば、臭化リチウム水溶液、塩化カルシウム／エタノール水溶液等の中性塩溶液に溶解し、透析により脱塩する手法、過酸化水素水に溶解後、乾熱乾燥し、過酸化水素を除去する方法、銅エチレンジアミンに溶解し、銅イオン乖離剤を添加した後に透析する手法等を使用することができる。これらの中でも、後処理及び分子量調節の容易さから、中性塩溶液に溶解し、脱塩する手法が好ましい。
[Silk fibroin aqueous solution]
Any known method may be used as a method for obtaining an aqueous solution of silk fibroin used for producing a porous silk fibroin, but since silk fibroin has low solubility in water, for example, the silk fibroin is dissolved in a solution. After that, a method of removing the drug used for dissolution is preferable. Specifically, for example, a method of dissolving in a neutral salt solution such as an aqueous solution of lithium bromide or an aqueous solution of calcium chloride / ethanol and desalting by dialysis, dissolving in a hydrogen peroxide solution, drying by dry heat, and hydrogen peroxide. , A method of dissolving in copper ethylenediamine, adding a copper ion dissociator, and then dialysis can be used. Among these, a method of dissolving in a neutral salt solution and desalting is preferable because of ease of post-treatment and molecular weight adjustment.
使用する中性塩溶液としては、臭化リチウム水溶液、塩化カルシウム／エタノール水溶液が好ましい。中性塩溶液中の中性塩の濃度は、臭化リチウム水溶液の場合、８〜１０ｍｏｌ／Ｌであることが好ましい。また、塩化カルシウム／エタノール水溶液の場合、塩化カルシウムとエタノールと水とをモル比１：２：８で混合した溶液を使用することが好ましい。中性塩の濃度をこの範囲に設定することで、シルクフィブロインを効率良く溶解することができる。 As the neutral salt solution to be used, an aqueous solution of lithium bromide and an aqueous solution of calcium chloride / ethanol are preferable. The concentration of the neutral salt in the neutral salt solution is preferably 8 to 10 mol / L in the case of the lithium bromide aqueous solution. Further, in the case of a calcium chloride / ethanol aqueous solution, it is preferable to use a solution in which calcium chloride, ethanol and water are mixed at a molar ratio of 1: 2: 8. By setting the concentration of the neutral salt in this range, silk fibroin can be efficiently dissolved.
シルクフィブロインの溶解温度は、シルクフィブロインが溶解する温度であれば特に制限はないが、臭化リチウム水溶液の場合、１０〜４０℃であることが好ましい。また、塩化カルシウム／エタノール水溶液の場合、７０〜９０℃であることが好ましく、７５〜８５℃であることがより好ましい。溶解温度をこの範囲に設定することで、効率良くシルクフィブロインを溶解可能であると共に、シルクフィブロイン多孔質体の形成に適した分子量のシルクフィブロイン水溶液を得ることができる。 The dissolution temperature of silk fibroin is not particularly limited as long as it is the temperature at which silk fibroin dissolves, but in the case of an aqueous solution of lithium bromide, it is preferably 10 to 40 ° C. Further, in the case of a calcium chloride / ethanol aqueous solution, the temperature is preferably 70 to 90 ° C, more preferably 75 to 85 ° C. By setting the dissolution temperature in this range, silk fibroin can be efficiently dissolved, and an aqueous solution of silk fibroin having a molecular weight suitable for forming a porous silk fibroin can be obtained.
シルクフィブロインの溶解時間に特に制限はないが、臭化リチウム水溶液の場合、３時間〜２４時間であることが好ましく、５時間〜１８時間であることがより好ましい。また、塩化カルシウム／エタノール水溶液の場合、１０分〜６０分であることが好ましく、１５分〜４０分であることがより好ましい。溶解時間をこの範囲に設定することで、シルクフィブロインが十分に溶解すると共に、シルクフィブロイン多孔質体の形成に適した分子量のシルクフィブロイン水溶液を得ることができる。 The dissolution time of silk fibroin is not particularly limited, but in the case of an aqueous solution of lithium bromide, it is preferably 3 hours to 24 hours, and more preferably 5 hours to 18 hours. In the case of a calcium chloride / ethanol aqueous solution, it is preferably 10 to 60 minutes, more preferably 15 to 40 minutes. By setting the dissolution time in this range, silk fibroin can be sufficiently dissolved and an aqueous solution of silk fibroin having a molecular weight suitable for forming a porous silk fibroin can be obtained.
シルクフィブロイン水溶液中におけるシルクフィブロインの濃度は、溶解液に溶解可能な濃度であれば特に制限はないが、５０ｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌであることが好ましく、１００ｇ／Ｌ〜１５０ｇ／Ｌであることがより好ましい。シルクフィブロインの濃度をこの範囲に設定することで、シルクフィブロイン多孔質体の作製に適した濃度のシルクフィブロイン水溶液が得られる。シルクフィブロイン水溶液中のシルクフィブロインの濃度調整の方法としては、風乾による濃縮を経る手法が簡便で好ましい。
シルクフィブロインの濃度は、シルクフィブロイン水溶液を容器に入れて完全に乾燥し、その質量減少から次式のように求めることができる。
（シルクフィブロイン濃度（ｇ／Ｌ））＝（シルクフィブロイン水溶液の乾燥後質量（ｇ））／（乾燥前のシルクフィブロイン水溶液の体積（Ｌ））
The concentration of silk fibroin in the aqueous silk fibroin solution is not particularly limited as long as it can be dissolved in the solution, but is preferably 50 g / L to 200 g / L, and is preferably 100 g / L to 150 g / L. Is more preferable. By setting the concentration of silk fibroin in this range, an aqueous silk fibroin solution having a concentration suitable for producing a porous silk fibroin can be obtained. As a method for adjusting the concentration of silk fibroin in the aqueous silk fibroin solution, a method of concentration by air drying is convenient and preferable.
The concentration of silk fibroin can be calculated by putting an aqueous solution of silk fibroin in a container, completely drying it, and reducing its mass by the following equation.
(Silk fibroin concentration (g / L)) = (mass of silk fibroin aqueous solution after drying (g)) / (volume of silk fibroin aqueous solution before drying (L))
脱塩の手法に特に制限はなく、透析膜を使用した透析、限外ろ過等により脱塩することができる。透析膜又は限外ろ過膜の分画分子量は５，０００〜４０，０００であることが好ましく、５，０００〜１０，０００であることがより好ましい。この範囲の分画分子量の透析膜又は限外ろ過膜を使用することで、脱塩効率とシルクフィブロインのロスの少なさとを両立することができる。 The desalting method is not particularly limited, and desalting can be performed by dialysis using a dialysis membrane, ultrafiltration, or the like. The molecular weight cut-off of the dialysis membrane or the ultrafiltration membrane is preferably 5,000 to 40,000, more preferably 5,000 to 10,000. By using a dialysis membrane or an ultrafiltration membrane having a molecular weight cut off in this range, it is possible to achieve both desalination efficiency and low loss of silk fibroin.
シルクフィブロイン水溶液中のシルクフィブロインのタンパク質換算分子量は、１６０，０００〜４１０，０００であることが好ましく、２００，０００〜３５０，０００であることがより好ましく、２４０，０００〜３１０，０００であることがさらに好ましい。この範囲の分子量のシルクフィブロインを含むシルクフィブロイン水溶液を使用してシルクフィブロイン多孔質体を作製することで、機械的強度及び柔軟性に優れるシルクフィブロイン多孔質体が得られる。
シルクフィブロイン水溶液中のシルクフィブロインのタンパク質換算分子量は、実施例に記載の方法で測定することができる。
The protein-equivalent molecular weight of silk fibroin in the aqueous silk fibroin solution is preferably 160,000 to 410,000, more preferably 200,000 to 350,000, and 240,000 to 310,000. Is even more preferable. By producing a silk fibroin porous body using a silk fibroin aqueous solution containing silk fibroin having a molecular weight in this range, a silk fibroin porous body having excellent mechanical strength and flexibility can be obtained.
The protein-equivalent molecular weight of silk fibroin in an aqueous solution of silk fibroin can be measured by the method described in Examples.
また、シルクフィブロイン多孔質体は、シルクフィブロイン水溶液に特定の添加剤を加えて、該水溶液を凍結させ、次いで、融解させることにより製造することが好ましい。 Further, the silk fibroin porous body is preferably produced by adding a specific additive to the silk fibroin aqueous solution, freezing the aqueous solution, and then thawing.
（添加剤）
前記添加剤としては、カルボン酸類、アミノ酸、水溶性液状有機物質等が好ましく挙げられる。また、シルクフィブロイン多孔質体の製造において用いられるカルボン酸類としては、ｐＫａが、５．０以下のものが好ましく、３．０〜５．０のものがより好ましく、３．５〜５．０のものがさらに好ましい。
(Additive)
Preferred examples of the additive include carboxylic acids, amino acids, and water-soluble liquid organic substances. Further, as the carboxylic acids used in the production of the porous silk fibroin, those having a pKa of 5.0 or less are preferable, those having a pKa of 3.0 to 5.0 are more preferable, and those having a pKa of 3.5 to 5.0 are more preferable. Those are more preferable.
カルボン酸類としては、少なくとも分子中に一つのカルボキシ基を有する有機酸であれば特に制限はないが、例えば、モノカルボン酸、ジカルボン酸、トリカルボン酸等が挙げられる。カルボン酸類としては、脂肪族カルボン酸類が好ましく、炭素数１〜６の脂肪族カルボン酸がより好ましく、炭素数２〜５の脂肪族カルボン酸がさらに好ましい。これらの脂肪族カルボン酸は飽和であってもよく、不飽和であってもよい。このようなカルボン酸として、具体的には、例えば、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、乳酸、アクリル酸、２−ブテン酸等のモノカルボン酸；シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸等のジカルボン酸などが好ましく挙げられる。これらは単独で、又は複数種を組み合わせて用いることができる。人体への安全性を考慮すると、酢酸、乳酸及びコハク酸がより好ましい。 The carboxylic acids are not particularly limited as long as they are organic acids having at least one carboxy group in the molecule, and examples thereof include monocarboxylic acids, dicarboxylic acids, and tricarboxylic acids. As the carboxylic acids, aliphatic carboxylic acids are preferable, aliphatic carboxylic acids having 1 to 6 carbon atoms are more preferable, and aliphatic carboxylic acids having 2 to 5 carbon atoms are further preferable. These aliphatic carboxylic acids may be saturated or unsaturated. Specific examples of such carboxylic acids include monocarboxylic acids such as formic acid, acetic acid, propionic acid, butyric acid, lactic acid, acrylic acid and 2-butenoic acid; oxalic acid, malonic acid, succinic acid, maleic acid and the like. Dicarboxylic acid and the like are preferably mentioned. These can be used alone or in combination of two or more. Acetic acid, lactic acid and succinic acid are more preferable in consideration of safety to the human body.
前記アミノ酸としては、特に制限はなく、例えば、バリン、ロイシン、イソロイシン、グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、メチオニン等のモノアミノカルボン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸等のモノアミノジカルボン酸（酸性アミノ酸）などの脂肪族アミノ酸；フェニルアラニン等の芳香族アミノ酸；ヒドロキシプロリン等の複素環を有するアミノ酸などが好ましく挙げられ、中でも形状の調整が容易な観点から、酸性アミノ酸、及びヒドロキシプロリン、セリン、スレオニン等のオキシアミノ酸が好ましい。同様の観点から、酸性アミノ酸の中でもモノアミノカルボン酸がより好ましく、アスパラギン酸及びグルタミン酸が特に好ましく、オキシアミノ酸の中でもヒドロキシプロリンがより好ましい。これらのアミノ酸は、いずれか１種を単独で、又は２種以上組み合わせて使用することができる。
なお、アミノ酸には、Ｌ型とＤ型の光学異性体があるが、Ｌ型とＤ型を用いた場合に、得られる多孔質体に違いが見られないため、どちらのアミノ酸を用いてもよい。
The amino acid is not particularly limited, and examples thereof include monoaminocarboxylic acids such as valine, leucine, isoleucine, glycine, alanine, serine, threonine and methionine, and monoaminodicarboxylic acids (acidic amino acids) such as aspartic acid and glutamic acid. Amino acids; aromatic amino acids such as phenylalanine; amino acids having a heterocycle such as hydroxyproline are preferable, and among them, acidic amino acids and oxyamino acids such as hydroxyproline, serine, and threonine are easily adjusted in shape. Is preferable. From the same viewpoint, monoaminocarboxylic acid is more preferable among acidic amino acids, aspartic acid and glutamic acid are particularly preferable, and hydroxyproline is more preferable among oxyamino acids. Any one of these amino acids can be used alone or in combination of two or more.
There are L-type and D-type optical isomers of amino acids, but when L-type and D-type are used, there is no difference in the obtained porous body, so whichever amino acid is used Good.
前記水溶性液状有機物質は、常温（２０℃）で液状であり、常温（２０℃）で水と混合した際に、分離せずに溶解、又は混和するものをいう。水溶性液状有機物質としては、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール等のアルコール類；グリセリン、プロピレングリコール等の多価アルコール類；ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ピリジン、アセトン、アセトニトリルなどが好ましく挙げられる。これらは単独で、又は複数種を組み合わせて用いることができる。人体への安全性を考慮すると、エタノール、ジメチルスルホキシド、グリセリン及びアセトンが好ましく、エタノール及びグリセリンがより好ましい。 The water-soluble liquid organic substance is liquid at room temperature (20 ° C.) and dissolves or mixes without separation when mixed with water at room temperature (20 ° C.). Examples of the water-soluble liquid organic substance include alcohols such as methanol, ethanol, isopropanol and butanol; polyhydric alcohols such as glycerin and propylene glycol; dimethyl sulfoxide (DMSO), dimethylformamide (DMF), pyridine, acetone and acetonitrile. Etc. are preferably mentioned. These can be used alone or in combination of two or more. Considering the safety to the human body, ethanol, dimethyl sulfoxide, glycerin and acetone are preferable, and ethanol and glycerin are more preferable.
シルクフィブロイン水溶液に添加剤を用いる場合の添加剤の含有量は、０．１〜１８体積％であることが好ましく、０．１〜５．０体積％であることがより好ましく、０．５〜４．０体積％であることがさらに好ましい。添加剤の含有量をこの範囲内に設定することで、十分な機械的強度を有するシルクフィブロイン多孔質体を製造することができる。 When the additive is used in the silk fibroin aqueous solution, the content of the additive is preferably 0.1 to 18% by volume, more preferably 0.1 to 5.0% by volume, and 0.5 to 5.0% by volume. More preferably, it is 4.0% by volume. By setting the content of the additive within this range, a silk fibroin porous body having sufficient mechanical strength can be produced.
シルクフィブロイン多孔質体は、例えば、前記シルクフィブロイン水溶液を型又は容器に流し込み、一定時間凍結した後に融解することで好適に得られる。
凍結温度としては、−１０〜−３０℃が好ましく、−１５〜−２５℃がより好ましい。凍結時間としては、添加剤を加えたシルクフィブロイン水溶液が十分に凍結し、かつ凍結状態を一定時間保持できるよう、４時間以上であることが好ましく、６時間以上であることがより好ましい。また、特に−１５〜−２５℃の温度条件下、６時間から１００時間保持して凍結することが機械的強度に優れるシルクフィブロイン多孔質体を再現良く形成する観点から好ましい。
The silk fibroin porous body is preferably obtained, for example, by pouring the silk fibroin aqueous solution into a mold or a container, freezing it for a certain period of time, and then thawing it.
The freezing temperature is preferably −10 to −30 ° C., more preferably -15 to −25 ° C. The freezing time is preferably 4 hours or more, and more preferably 6 hours or more so that the silk fibroin aqueous solution to which the additive is added can be sufficiently frozen and the frozen state can be maintained for a certain period of time. Further, it is particularly preferable to hold and freeze for 6 to 100 hours under a temperature condition of -15 to -25 ° C. from the viewpoint of forming a silk fibroin porous body having excellent mechanical strength with good reproducibility.
ここで、前記シルクフィブロイン水溶液を一気に凍結温度まで下げて凍結してもよいが、凍結の前に過冷却状態を経ることが、均一な構造のシルクフィブロイン多孔質体を得る上で好ましい。例えば、添加剤を加えたシルクフィブロイン水溶液を一旦、−５℃で２時間保持して、その後、凍結温度まで下げて凍結することで、均一な構造のシルクフィブロイン多孔質体を得ることができる。 Here, the silk fibroin aqueous solution may be lowered to a freezing temperature at once to freeze, but it is preferable to go through a supercooled state before freezing in order to obtain a silk fibroin porous body having a uniform structure. For example, a silk fibroin porous body having a uniform structure can be obtained by temporarily holding an aqueous solution of silk fibroin to which an additive has been added at −5 ° C. for 2 hours, and then lowering the temperature to a freezing temperature to freeze.
上記の手法でシルクフィブロイン水溶液を凍結させた後、次いで、融解することによって、シルクフィブロイン多孔質体が得られる。融解の方法としては、特に制限はなく、自然融解、恒温槽での保管等の方法が好ましく挙げられる。 A silk fibroin porous body is obtained by freezing the silk fibroin aqueous solution by the above method and then thawing. The melting method is not particularly limited, and methods such as natural melting and storage in a constant temperature bath are preferable.
上記のようにして得られたシルクフィブロイン多孔質体には添加剤が残存する。残存する添加剤は用途に応じてそのままの状態としてもよいし、除去してもよい。添加剤をシルクフィブロイン多孔質体から除去する方法としては、例えば、シルクフィブロイン多孔質体を純水中に浸漬して除去することが最も簡便な方法として挙げられる。 Additives remain in the silk fibroin porous body obtained as described above. The remaining additive may be left as it is or may be removed depending on the intended use. As a method for removing the additive from the porous silk fibroin, for example, the simplest method is to immerse the porous silk fibroin in pure water to remove the additive.
このようにして得られたシルクフィブロイン多孔質体は吸水した状態である。乾燥状態のシルクフィブロイン多孔質体が必要な場合、吸水状態のシルクフィブロイン多孔質体を乾燥すればよい。シルクフィブロイン多孔質体の乾燥の手法としては特に制限はないが、収縮を抑えるという意味で凍結乾燥が好ましい。凍結乾燥の場合、水分を完全に昇華させずに乾燥を終えると、残った氷が融解して水になり、その表面張力の影響で空孔が潰れてしまうため、水分が完全に昇華するまで乾燥することが好ましい。 The silk fibroin porous body thus obtained is in a state of absorbing water. When a dry silk fibroin porous body is required, the water-absorbing silk fibroin porous body may be dried. The method for drying the porous silk fibroin is not particularly limited, but freeze-drying is preferable in terms of suppressing shrinkage. In the case of freeze-drying, if the drying is completed without completely sublimating the water, the remaining ice melts into water, and the pores are crushed due to the influence of its surface tension, so until the water is completely sublimated. It is preferable to dry.
また、凍結乾燥の際、予めシルクフィブロイン多孔質体をグリセリン水溶液に浸漬することが、乾燥時のひび割れを防止すると共に、乾燥後にも柔軟な多孔質体が得られる観点から好ましい。
この場合、シルクフィブロイン多孔質体を浸漬するグリセリン水溶液におけるグリセリンの濃度は、０．５〜１０体積％が好ましく、１〜８体積％がより好ましく、１．５〜６体積％がさらに好ましい。グリセリン濃度をこの範囲に設定することで、質感が良く、ひび割れの無い乾燥シルクフィブロイン多孔質体を得ることができる。このようにして得られる乾燥シルクフィブロイン多孔質体はグリセリンを含有することを特徴とする。
Further, it is preferable to immerse the silk fibroin porous body in the glycerin aqueous solution in advance during freeze-drying from the viewpoint of preventing cracks during drying and obtaining a flexible porous body even after drying.
In this case, the concentration of glycerin in the aqueous solution of glycerin in which the porous silk fibroin is immersed is preferably 0.5 to 10% by volume, more preferably 1 to 8% by volume, and even more preferably 1.5 to 6% by volume. By setting the glycerin concentration in this range, it is possible to obtain a dry silk fibroin porous body having a good texture and no cracks. The dried silk fibroin porous body thus obtained is characterized by containing glycerin.
乾燥シルクフィブロイン多孔質体中のグリセリンの含有量は、２０〜７０質量％であることが好ましく、２５〜６０質量％であることがより好ましく、３０〜５０質量％であることがさらに好ましい。グリセリンの含有量をこの範囲とすることで、乾燥シルクフィブロイン多孔質体に適度な柔軟性を付与することができる。
乾燥シルクフィブロイン多孔質体中のグリセリンの含有量（質量％）は、乾燥シルクフィブロイン多孔質体に導入されたグリセリンの質量を、グリセリンが導入された後の乾燥シルクフィブロイン多孔質体の質量で割ったものとし、以下の式で算出した。
（乾燥シルクフィブロイン多孔質体中のグリセリンの含有量（質量％））＝（（グリセリンを導入した乾燥シルクフィブロイン多孔質体の質量）−（グリセリンを未導入の乾燥シルクフィブロイン多孔質体の質量））／（グリセリンを導入後の乾燥シルクフィブロイン多孔質体の質量）×１００
The content of glycerin in the dry silk fibroin porous body is preferably 20 to 70% by mass, more preferably 25 to 60% by mass, and even more preferably 30 to 50% by mass. By setting the content of glycerin in this range, it is possible to impart appropriate flexibility to the dried silk fibroin porous body.
The content (% by mass) of glycerin in the dry silk fibroin porous body is obtained by dividing the mass of glycerin introduced into the dry silk fibroin porous body by the mass of the dry silk fibroin porous body after the introduction of glycerin. It was calculated by the following formula.
(Content of glycerin in dried silk fibroin porous body (% by mass)) = ((mass of dried silk fibroin porous body with glycerin introduced)-(mass of dried silk fibroin porous body without glycerin introduced)) ) / (Mass of dried silk fibroin porous body after introduction of glycerin) × 100
上記のようにして得られた乾燥シルクフィブロイン多孔質体は、水分を実質的に含まないものである。シルクフィブロイン多孔質体は、シルクフィブロイン水溶液を凍結し、融解して得られるので、通常、細孔部に水分等が存在した状態となっている。通常のシルクフィブロイン多孔質体と乾燥シルクフィブロイン多孔質体とは、細孔部に存在する水等の量の点で状態は異なるものとなる。 The dried silk fibroin porous body obtained as described above is substantially free of water. Since the silk fibroin porous body is obtained by freezing and thawing the silk fibroin aqueous solution, it is usually in a state where water or the like is present in the pores. The normal silk fibroin porous body and the dried silk fibroin porous body are in different states in terms of the amount of water and the like present in the pores.
シルクフィブロイン多孔質体は、シルクフィブロイン水溶液を流し込む容器を適宜選択することにより、シート状、ブロック状、管状等、目的に応じた形状とすることができる。
また、原料として用いるシルクフィブロイン及び添加剤の種類及び添加量を調節することで、シルクフィブロイン多孔質体の内部構造と固さを調整することができ、種々の固さを有するゲル状、シート状又はブロック状のシルクフィブロイン多孔質体を得ることができる。
The silk fibroin porous body can be formed into a sheet shape, a block shape, a tubular shape, or the like according to the purpose by appropriately selecting a container into which the silk fibroin aqueous solution is poured.
In addition, by adjusting the type and amount of silk fibroin and additives used as raw materials, the internal structure and hardness of the porous silk fibroin can be adjusted, and gel-like and sheet-like materials having various hardnesses can be adjusted. Alternatively, a block-shaped silk fibroin porous body can be obtained.
本発明の止血材は、必要な大きさに加工したフィブロイン多孔質体をそのまま用いてもよく、シート状のフィブロイン多孔質体を、ドレッシングフィルム、包帯、粘着テープ等で固定する形態で用いてもよい。
フィブロイン多孔質体は、乾燥状態でも柔らかいため、そのまま用いることもできるし、また、保湿剤を含ませて用いることもできる。保湿剤としては、グリセリン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール等を使用することができる。なお、保湿剤を含ませた状態の場合には、使用直前まで、水分量を保った状態で、乾燥を防ぐように密閉状態にしておくことが好ましい。
As the hemostatic material of the present invention, the fibroin porous body processed to a required size may be used as it is, or the sheet-shaped fibroin porous body may be used in the form of being fixed with a dressing film, a bandage, an adhesive tape or the like. Good.
Since the fibroin porous body is soft even in a dry state, it can be used as it is, or it can be used by adding a moisturizer. As the moisturizer, glycerin, polyvinylpyrrolidone, polyvinyl alcohol, polyethylene glycol and the like can be used. In the case of containing a moisturizer, it is preferable to keep the water content in a sealed state to prevent drying until just before use.
本発明の止血材として、フィブロイン多孔質体からなる多孔質層と、その一方の面のみに細孔を有しないフィルム層を有するフィブロイン多孔質体を用いてもよい。その場合、止血部に多孔質層が接し、止血部とは反対側の対向面にフィルム層が存在する状態で使用することが好ましい。このような方法で使用することにより、多孔質層による止血効果と機械的強度とを高度に両立させることができる。なお、フィルム層の細孔の数は制御することができ、必要に応じて少量の細孔を有するフィルム層とすることもできる。 As the hemostatic material of the present invention, a fibroin porous body having a porous layer made of a fibroin porous body and a film layer having no pores on only one surface thereof may be used. In that case, it is preferable to use the film in a state where the porous layer is in contact with the hemostatic portion and the film layer is present on the facing surface opposite to the hemostatic portion. By using it in such a method, the hemostatic effect of the porous layer and the mechanical strength can be highly compatible with each other. The number of pores in the film layer can be controlled, and a film layer having a small amount of pores can be used if necessary.
以下に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例によってなんら限定されるものではない。
なお、以下の実施例において、フィブロイン原料のタンパク質換算分子量を測定するために調製したフィブロイン水溶液を「フィブロイン水溶液（Ａ）」と称し、フィブロイン多孔質体の作製に用いるフィブロイン水溶液を「フィブロイン水溶液（Ｂ）」と称し、フィブロイン多孔質体に含まれるフィブロインのタンパク質換算分子量を測定するために調製したフィブロイン水溶液を「フィブロイン水溶液（Ｃ）」と称する。
また、フィブロインのタンパク質換算分子量は以下の方法により測定した。
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited to these Examples.
In the following examples, the fibroin aqueous solution prepared for measuring the protein-equivalent molecular weight of the fibroin raw material is referred to as "fibroin aqueous solution (A)", and the fibroin aqueous solution used for producing the fibroin porous body is referred to as "fibroin aqueous solution (B)". ) ”, And the fibroin aqueous solution prepared for measuring the protein-equivalent molecular weight of fibroin contained in the fibroin porous body is referred to as“ fibroin aqueous solution (C) ”.
The protein-equivalent molecular weight of fibroin was measured by the following method.
〔フィブロイン原料の分子量測定準備〕
フィブロイン原料のタンパク質換算分子量を測定するために、まず下記の手法でフィブロイン水溶液（Ａ）を調製した。
フィブロイン原料を２０℃の９ｍｏｌ／Ｌ臭化リチウム水溶液に濃度が１００ｇ／Ｌになるよう投入し、１０時間攪拌することで完全に溶解した。次いで、溶解液を遠心分離（回転数：１２，０００ｍｉｎ−１、５分間）して、デカンテーションで沈殿物を除去した後、透析チューブ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．製、商品名：Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ １ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｍｅｍｂｒａｎｅ、ＭＷＣＯ６，０００−８，０００）に注入し、超純水製造装置（ＰＲＯ−０５００及びＦＰＣ−０５００（以上、型番）、オルガノ株式会社製）から採水した超純水５Ｌに対して１２時間の透析を５回繰り返して脱塩した。次に、得られた溶液を再度遠心分離（回転数：１２，０００ｍｉｎ−１、３０分間）することで、フィブロイン水溶液（Ａ）を得た。フィブロイン水溶液（Ａ）中におけるフィブロイン濃度を前述の方法により測定した。得られたフィブロイン水溶液（Ａ）をフィブロイン原料の分子量測定溶液とした。
[Preparation for measuring the molecular weight of fibroin raw material]
In order to measure the protein-equivalent molecular weight of the fibroin raw material, first, an aqueous fibroin solution (A) was prepared by the following method.
The fibroin raw material was added to a 9 mol / L lithium bromide aqueous solution at 20 ° C. so as to have a concentration of 100 g / L, and the mixture was completely dissolved by stirring for 10 hours. Next, the lysate was centrifuged (rotation speed: 12,000 min -1 , 5 minutes) to remove the precipitate by decantation, and then a dialysis tube (Spectrum Laboratory, Inc., trade name: Spectra / Por 1). For 5 L of ultra-pure water injected into a dialysis laboratory, MWCO 6,000-8,000) and sampled from an ultra-pure water production device (PRO-0500 and FPC-0500 (above, model number), manufactured by Organo Co., Ltd.). The 12-hour dialysis was repeated 5 times to desalt. Next, the obtained solution was centrifuged again (rotation speed: 12,000 min- 1 , 30 minutes) to obtain an aqueous fibroin solution (A). The fibroin concentration in the fibroin aqueous solution (A) was measured by the method described above. The obtained fibroin aqueous solution (A) was used as a molecular weight measurement solution for the fibroin raw material.
〔フィブロイン水溶液（Ｂ）のタンパク質換算分子量の測定準備〕
フィブロイン水溶液（Ｂ）は、後述の実施例に記載の方法により調製し、分子量測定溶液とした。
[Preparation for measurement of protein-equivalent molecular weight of fibroin aqueous solution (B)]
The fibroin aqueous solution (B) was prepared by the method described in Examples described later and used as a molecular weight measurement solution.
〔フィブロイン多孔質体に含まれるフィブロインの分子量測定準備〕
フィブロイン多孔質体に含まれるフィブロインの分子量を測定するために、下記の手法でフィブロイン水溶液（Ｃ）を調製した。
フィブロイン多孔質体を２０℃の９ｍｏｌ／Ｌ臭化リチウム水溶液に濃度が１００ｇ／Ｌになるよう投入し、１０時間攪拌することで完全に溶解した。次いで、溶解液を遠心分離（回転数：１２，０００ｍｉｎ−１、５分間）して、デカンテーションで沈殿物を除去した後、透析チューブ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．製、商品名：Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ １ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｍｅｍｂｒａｎｅ、ＭＷＣＯ６，０００−８，０００）に注入し、超純水製造装置（ＰＲＯ−０５００及びＦＰＣ−０５００（以上、型番）、オルガノ株式会社製）から採水した超純水５Ｌに対して１２時間の透析を５回繰り返して脱塩した。次に、得られた溶液を再度遠心分離（回転数：１２，０００ｍｉｎ―１、３０分間）することでフィブロイン水溶液（Ｃ）を得た。フィブロイン水溶液（Ｃ）中におけるフィブロイン濃度を前述の方法により測定した。得られたフィブロイン水溶液（Ｃ）をフィブロイン多孔質体に含まれるフィブロインの分子量測定溶液とした。
[Preparation for measuring the molecular weight of fibroin contained in the fibroin porous body]
In order to measure the molecular weight of fibroin contained in the fibroin porous body, an aqueous fibroin solution (C) was prepared by the following method.
The fibroin porous body was added to a 9 mol / L lithium bromide aqueous solution at 20 ° C. to a concentration of 100 g / L, and the mixture was completely dissolved by stirring for 10 hours. Next, the lysate was centrifuged (rotation speed: 12,000 min -1 , 5 minutes) to remove the precipitate by decantation, and then a dialysis tube (Spectrum Laboratory, Inc., trade name: Spectra / Por 1). For 5 L of ultra-pure water injected into a dialysis laboratory, MWCO 6,000-8,000) and sampled from an ultra-pure water production device (PRO-0500 and FPC-0500 (above, model number), manufactured by Organo Co., Ltd.). The 12-hour dialysis was repeated 5 times to desalt. Next, the obtained solution was centrifuged again (rotation speed: 12,000 min- 1 , 30 minutes) to obtain an aqueous fibroin solution (C). The fibroin concentration in the fibroin aqueous solution (C) was measured by the method described above. The obtained aqueous fibroin solution (C) was used as a solution for measuring the molecular weight of fibroin contained in the porous fibroin.
〔移動相の調製〕
ガラスビーカーに超純水を７００ｍＬ入れ、そこに硫酸ナトリウム（無水物、和光純薬工業株式会社製、試薬特級）１４．２ｇと尿素（和光純薬工業株式会社製、試薬特級）１２０．１ｇを加えて得た溶液をビーカーごと超音波洗浄機に漬けて超音波処理し、完全に溶解させた。この溶液にさらにリン酸緩衝剤粉末（１．１５ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．０、和光純薬工業株式会社製、生化学用）２０ｇを加え、再度超音波処理をして溶解した。次いで、溶解後の溶液をメスフラスコに移し、１Ｌにメスアップした後に攪拌して均一な溶液とした。この溶液を分子量測定に使用する移動相とした。
[Preparation of mobile phase]
Put 700 mL of ultrapure water in a glass beaker, and add 14.2 g of sodium sulfate (anhydrous, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., special grade reagent) and 120.1 g of urea (special grade reagent manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). The obtained solution was immersed in an ultrasonic cleaner together with the beaker and treated with ultrasonic waves to completely dissolve it. Further, 20 g of phosphate buffer powder (1.15 mol / L, pH 7.0, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., for biochemistry) was added to this solution, and the solution was dissolved by sonication again. Then, the dissolved solution was transferred to a volumetric flask, and the solution was adjusted to 1 L and then stirred to obtain a uniform solution. This solution was used as the mobile phase used for molecular weight measurement.
〔タンパク質換算分子量の測定〕
フィブロイン原料のタンパク質換算分子量を測定する場合はフィブロイン水溶液（Ａ）を、フィブロイン水溶液（Ｂ）に含まれるフィブロインのタンパク質換算分子量を測定する場合はフィブロイン水溶液（Ｂ）自体を、フィブロイン多孔質体に含まれるフィブロインのタンパク質換算分子量を測定する場合はフィブロイン水溶液（Ｃ）を用いて、下記の方法により、それぞれのタンパク質換算分子量を測定した。
以下、フィブロイン水溶液（Ａ）〜（Ｃ）を「分子量測定溶液」と称する。
分子量測定溶液にフィブロイン濃度が１０ｇ／Ｌになるよう超純水を加えて混合し、続いてそこに移動相を加えて５倍に希釈し、得られた溶液を０．４５μｍのフィルタ（東洋濾紙株式会社製、商品名：２５ＨＰ０４５ＡＮ）に通してろ過し、クロマトグラフ評価試料とした。
測定には高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）本体（株式会社日立ハイテクノロジーズ製、商品名：Ｃｈｒｏｍａｓｔｅｒ（登録商標））と、そのオプションであるＵＶ検出器（株式会社日立ハイテクノロジーズ製、型番：５４１０）、ポンプ（株式会社日立ハイテクノロジーズ製、型番：５１１０）、オートサンプラ（株式会社日立ハイテクノロジーズ製、型番：５２１０）、カラムオーブン（株式会社日立ハイテクノロジーズ製、型番：５３１０）に加え、カラム（昭和電工株式会社製、商品名：ＳＨＯＤＥＸ（登録商標） ＰＲＯＴＥＩＮ ＫＷ−８０４）を組み合わせたＨＰＬＣ装置を使用した。測定条件は移動相流量０．５ｍＬ／ｓｅｃ、カラム温度３０℃、検出波長ＵＶ２２０ｎｍとした。
得られたクロマトグラムをタンパク質分子量に換算するための較正曲線の作成には、分子量マーカーとしてＨＰＬＣ用分子量マーカータンパク質である酵母由来グルタミン酸脱水素酵素（分子量：２９０，０００、Ｏｒｉｅｎｔａｌ Ｙｅａｓｔ Ｃｏ．，ＬＴＤ．製、商品名：ＭＷ−Ｍａｒｋｅｒ（ＨＰＬＣ））、豚心筋由来乳酸脱水素酵素（分子量：１４２，０００、Ｏｒｉｅｎｔａｌ Ｙｅａｓｔ Ｃｏ．，ＬＴＤ製、商品名：ＭＷ−Ｍａｒｋｅｒ（ＨＰＬＣ））、酵母由来エノラーゼ（分子量：６７，０００、Ｏｒｉｅｎｔａｌ Ｙｅａｓｔ Ｃｏ．，ＬＴＤ製、商品名：ＭＷ−Ｍａｒｋｅｒ（ＨＰＬＣ））を使用した。
ＨＰＬＣ装置に移動相を１時間流しベースラインが安定するのを待った。ベースライン安定後に、各分子量マーカーが水溶液中でそれぞれ０．０５質量％となるように溶解した分子量マーカー水溶液を２２μＬ注入して、得られたクロマトグラムのピークトップと分子量マーカーの分子量から較正曲線を作成した。較正曲線を図１に示す。次いで、クロマトグラフ評価試料を２２μＬ注入して得られるクロマトグラムのピークトップの位置から較正曲線を使用してフィブロインのタンパク質換算分子量を測定した。
[Measurement of protein equivalent molecular weight]
The fibroin aqueous solution (A) is contained in the fibroin porous body when measuring the protein equivalent molecular weight of the fibroin raw material, and the fibroin aqueous solution (B) itself is contained in the fibroin aqueous solution (B) when measuring the protein equivalent molecular weight of fibroin contained in the fibroin aqueous solution (B). When measuring the protein-equivalent molecular weight of fibroin, each protein-equivalent molecular weight was measured by the following method using an aqueous fibroin solution (C).
Hereinafter, the fibroin aqueous solutions (A) to (C) will be referred to as "molecular weight measurement solutions".
Ultrapure water is added to the molecular weight measurement solution so that the fibroin concentration becomes 10 g / L and mixed, and then a mobile phase is added thereto to dilute the solution 5 times, and the obtained solution is filtered by 0.45 μm (Toyo filter paper). It was filtered through a product manufactured by Co., Ltd., trade name: 25HP045AN) to prepare a chromatographic evaluation sample.
For measurement, a high performance liquid chromatograph (HPLC) main unit (manufactured by Hitachi High-Technologies Corporation, trade name: Chromaster (registered trademark)) and its optional UV detector (manufactured by Hitachi High-Technologies Co., Ltd., model number: 5410), In addition to pumps (Hitachi High Technologies America, model number: 5110), auto samplers (Hitachi High Technologies America, model number: 5210), column ovens (Hitachi High Technologies America, model number: 5310), columns (Showa Denko) An HPLC apparatus combined with SHODEX (registered trademark) PROTEIN KW-804) manufactured by Hitachi, Ltd. was used. The measurement conditions were a mobile phase flow rate of 0.5 mL / sec, a column temperature of 30 ° C., and a detection wavelength of UV 220 nm.
To prepare a calibration curve for converting the obtained chromatogram into a protein molecular weight, a yeast-derived glutamate dehydrogenase (molecular weight: 290,000, Original Yast Co., LTD.), Which is a molecular weight marker protein for HPLC as a molecular weight marker, was used. , Trade name: MW-Marker (HPLC)), Porcine myocardial-derived lactic acid dehydrogenase (molecular weight: 142,000, Original Yast Co., manufactured by LTD, Trade name: MW-Marker (HPLC)), Yeast-derived enolase ( Molecular weight: 67,000, manufactured by Original Yast Co., LTD, trade name: MW-Marker (HPLC)) was used.
The mobile phase was run through the HPLC apparatus for 1 hour and waited for the baseline to stabilize. After stabilizing the baseline, inject 22 μL of a molecular weight marker aqueous solution dissolved so that each molecular weight marker is 0.05% by mass in the aqueous solution, and obtain a calibration curve from the peak top of the obtained chromatogram and the molecular weight of the molecular weight marker. Created. The calibration curve is shown in FIG. Then, 22 μL of the chromatograph evaluation sample was injected, and the protein-equivalent molecular weight of fibroin was measured from the position of the peak top of the chromatogram using a calibration curve.
［フィブロイン多孔質体の製造］
実施例１
（アルカリ精練）
炭酸ナトリウム水溶液２Ｌを精練液として使用し、表１に記載の条件で切繭の精練を行った。精練容器には３Ｌのガラスビーカーを使用し、精練の加熱はホットスターラー（アズワン株式会社製、商品名：ＣＴ−５ＨＴ）をＫ熱電対で温度制御しながら行い、攪拌はガラス棒で適宜行った。得られた精練後の切繭を６０℃のお湯で十分に洗浄した後に、純水でも洗浄を行った。洗浄後の切繭を２４℃の室内で２週間かけて自然乾燥し、完全に乾燥させて、フィブロイン原料とした。次いで、練減率を下記式に従って算出した。結果を表１に示す。
練減率（質量％）＝（精練前質量−精練後質量）÷精練前質量×１００
また、得られたフィブロイン原料を用いて、前述の方法でフィブロイン水溶液（Ａ）を調製し、フィブロイン原料のタンパク質換算分子量を測定した結果を表１に示す。
[Manufacture of fibroin porous material]
Example 1
(Alkaline refining)
Using 2 L of an aqueous sodium carbonate solution as a smelting solution, the cocoons were smelted under the conditions shown in Table 1. A 3 L glass beaker was used for the scouring container, and the scouring was heated by using a hot stirrer (manufactured by AS ONE Corporation, trade name: CT-5HT) while controlling the temperature with a K thermocouple, and stirring was appropriately performed with a glass rod. .. The obtained cocoon after smelting was thoroughly washed with hot water at 60 ° C., and then washed with pure water. The washed cocoons were air-dried in a room at 24 ° C. for 2 weeks and completely dried to obtain a fibroin raw material. Next, the lapse rate was calculated according to the following formula. The results are shown in Table 1.
Lapse rate (mass%) = (mass before refining-mass after refining) / mass before refining x 100
In addition, Table 1 shows the results of preparing an aqueous fibroin solution (A) by the above-mentioned method using the obtained fibroin raw material and measuring the protein-equivalent molecular weight of the fibroin raw material.
（フィブロイン水溶液（Ｂ）の調製）
フィブロイン水溶液（Ｂ）を調製するにあたって、まず、上記のアルカリ精練を行って得られたシルクフィブロイン原料を、２０℃の９ｍｏｌ／Ｌ臭化リチウム水溶液１Ｌに濃度が１００ｇ／Ｌになるよう投入し、１０時間攪拌することで完全に溶解した。次いで、溶解液を遠心分離（回転数：１２，０００ｍｉｎ−１、５分間）して、デカンテーションで沈殿物を除去した後、透析チューブ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．製、商品名：Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標） １ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｍｅｍｂｒａｎｅ、ＭＷＣＯ６，０００−８，０００）に注入し、超純水製造装置（ＰＲＯ−０５００及びＦＰＣ−０５００（以上、型番）、オルガノ株式会社製、）から採水した超純水５Ｌに対して１２時間の透析を５回繰り返して脱塩した。次に、得られた溶液を再度遠心分離（回転数：１２，０００ｍｉｎ−１、３０分間）することでフィブロイン水溶液（Ｂ）を得た。フィブロイン水溶液（Ｂ）中におけるフィブロイン濃度を前述の方法により測定した。
また、前述の方法でフィブロイン水溶液（Ｂ）中のフィブロインのタンパク質換算分子量を測定した結果を表１に示す。
(Preparation of fibroin aqueous solution (B))
In preparing the fibroin aqueous solution (B), first, the silk fibroin raw material obtained by the above alkaline scouring was added to 1 L of a 9 mol / L lithium bromide aqueous solution at 20 ° C. so as to have a concentration of 100 g / L. It was completely dissolved by stirring for 10 hours. Next, the lysate is centrifuged (rotation speed: 12,000 min -1 , 5 minutes) to remove the precipitate by decantation, and then a dialysis tube (Spectrum Laboratory, Inc., trade name: Spectra / Por (manufactured by Spectrum Laboratories, Inc.) Registered trademark) 1 Ultra-pure water sampled from a dialysis laboratory, MWCO 6,000-8,000) and ultra-pure water production equipment (PRO-0500 and FPC-0500 (above, model number), manufactured by Organo Co., Ltd.). Dialysis for 12 hours was repeated 5 times with respect to 5 L of water to desalt. Next, the obtained solution was centrifuged again (rotation speed: 12,000 min- 1 , 30 minutes) to obtain an aqueous fibroin solution (B). The fibroin concentration in the fibroin aqueous solution (B) was measured by the method described above.
Table 1 shows the results of measuring the protein-equivalent molecular weight of fibroin in the fibroin aqueous solution (B) by the above-mentioned method.
（フィブロイン多孔質体の作製）
フィブロイン水溶液（Ｂ）に、フィブロイン濃度３０ｇ／Ｌ、酢酸濃度２．０％（ｖ／ｖ）となるように酢酸及び超純水を加えた。次に、得られた溶液をアルミ板で作製した型（内側サイズ；４００ｍｍ×３００ｍｍ×１０ｍｍ）に流し込み、予め−５℃に冷却しておいた液冷式低温恒温槽（株式会社前川製作所製）に入れて−５℃で２時間静置した。冷媒としてはナイブライン（登録商標）Ｚ１（株式会社ＭＯＲＥＳＣＯ製、商品名）を使用した。その後、−３℃／時間の速度で−２０℃まで冷却し、そのままの温度で５時間保持して凍結した。
凍結した試料を自然解凍で室温に戻し、型から取り出した後、超純水に浸漬し、超純水を１日２回、３日間交換することによって、使用した酢酸を除去し、フィブロイン多孔質体を得た。得られたフィブロイン多孔質体に含まれるフィブロインのタンパク質換算分子量を前述の方法で測定した結果を表１に示す。
(Preparation of fibroin porous body)
Acetic acid and ultrapure water were added to the fibroin aqueous solution (B) so that the fibroin concentration was 30 g / L and the acetic acid concentration was 2.0% (v / v). Next, the obtained solution was poured into a mold (inner size; 400 mm x 300 mm x 10 mm) made of an aluminum plate and cooled to -5 ° C in advance in a liquid-cooled low-temperature constant temperature bath (manufactured by Mayekawa Mfg. Co., Ltd.). And let stand at −5 ° C. for 2 hours. As the refrigerant, Nybrine (registered trademark) Z1 (manufactured by MORESCO Co., Ltd., trade name) was used. Then, it was cooled to −20 ° C. at a rate of -3 ° C./hour, kept at the same temperature for 5 hours, and frozen.
The frozen sample is naturally thawed to room temperature, taken out of the mold, then immersed in ultrapure water, and the ultrapure water is replaced twice a day for 3 days to remove the acetic acid used and the fibroin porous. I got a body. Table 1 shows the results of measuring the protein-equivalent molecular weight of fibroin contained in the obtained porous fibroin by the above-mentioned method.
実施例２〜５、比較例１及び２
実施例１において精練時間を、表１に示すとおりに変えた以外は実施例１と同様にして、フィブロイン多孔質体を得た。得られたフィブロイン原料、フィブロイン水溶液（Ｂ）及びフィブロイン多孔質体に含まれるフィブロインのタンパク質換算分子量を前述の方法で測定した結果を表１に示す。
Examples 2-5, Comparative Examples 1 and 2
A fibroin porous body was obtained in the same manner as in Example 1 except that the smelting time in Example 1 was changed as shown in Table 1. Table 1 shows the results of measuring the protein-equivalent molecular weight of fibroin contained in the obtained fibroin raw material, fibroin aqueous solution (B) and fibroin porous body by the above-mentioned method.
実施例６
フィブロイン水溶液（Ｂ）の調製方法を以下に記載した方法とした以外は実施例１と同様にして、フィブロイン多孔質体を得た。得られたフィブロイン原料、フィブロイン水溶液（Ｂ）及びフィブロイン多孔質体に含まれるフィブロインのタンパク質換算分子量を前述の方法で測定した結果を表１に示す。
Example 6
A fibroin porous body was obtained in the same manner as in Example 1 except that the method for preparing the aqueous fibroin solution (B) was the method described below. Table 1 shows the results of measuring the protein-equivalent molecular weight of fibroin contained in the obtained fibroin raw material, fibroin aqueous solution (B) and fibroin porous body by the above-mentioned method.
（フィブロイン水溶液（Ｂ）の調製−２）
フィブロイン水溶液（Ｂ）は、アルカリ精練を行って得られたシルクフィブロイン原料を２０℃の塩化カルシウムとエタノールと水とをモル比１：２：８で混合した溶液１Ｌにフィブロインの濃度が１００ｇ／Ｌになるよう投入し、８０℃で４０分間加熱、攪拌することで完全に溶解した。次いで、溶解液を遠心分離（回転数：１２，０００ｍｉｎ−１、５分間）して、デカンテーションで沈殿物を除去した後、透析チューブ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．製、商品名：Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ １ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｍｅｍｂｒａｎｅ、ＭＷＣＯ６，０００−８，０００）に注入し、超純水製造装置（ＰＲＯ−０５００及びＦＰＣ−０５００（以上、型番）、オルガノ株式会社製）から採水した超純水５Ｌに対して１２時間の透析を５回繰り返して脱塩した。次に、得られた溶液を再度遠心分離（回転数：１２，０００ｍｉｎ−１、３０分間）することでフィブロイン水溶液（Ｂ）を得た。フィブロイン水溶液（Ｂ）中におけるフィブロイン濃度を前述の方法により測定した。
(Preparation of Fibroin Aqueous Solution (B) -2)
The fibroin aqueous solution (B) has a fibroin concentration of 100 g / L in 1 L of a solution obtained by mixing the silk fibroin raw material obtained by alkaline scouring with calcium chloride at 20 ° C., ethanol and water at a molar ratio of 1: 2: 8. It was completely dissolved by heating and stirring at 80 ° C. for 40 minutes. Next, the lysate was centrifuged (rotation speed: 12,000 min -1 , 5 minutes) to remove the precipitate by decantation, and then a dialysis tube (Spectrum Laboratory, Inc., trade name: Spectra / Por 1). For 5 L of ultra-pure water injected into a dialysis laboratory, MWCO 6,000-8,000) and sampled from an ultra-pure water production device (PRO-0500 and FPC-0500 (above, model number), manufactured by Organo Co., Ltd.). The 12-hour dialysis was repeated 5 times to desalt. Next, the obtained solution was centrifuged again (rotation speed: 12,000 min- 1 , 30 minutes) to obtain an aqueous fibroin solution (B). The fibroin concentration in the fibroin aqueous solution (B) was measured by the method described above.
［機械特性の評価］
上記で得られたフィブロイン多孔質体について、以下の条件により２５％圧縮応力、引裂き強さ、引張強さ及び引張ひずみを測定した。結果を表１に示す。
[Evaluation of mechanical properties]
With respect to the fibroin porous body obtained above, 25% compressive stress, tear strength, tensile strength and tensile strain were measured under the following conditions. The results are shown in Table 1.
（２５％圧縮応力の測定）
フィブロイン多孔質体について、万能試験機（型番：ＥＺ−（Ｎ）Ｓ、株式会社島津製作所製）を用い、ロードセルは５０Ｎ、治具として直径８ｍｍの円形の圧縮板を用いて、圧縮速度１ｍｍ／ｍｉｎ、室温２２℃の条件下で、材料の厚さの２５％を圧縮板で押し込んだときのロードを測定し、以下の式により算出した値を２５％圧縮応力（ｋＰａ）とした。
２５％圧縮応力（ｋＰａ）＝材料の厚さの２５％を圧縮板で押し込んだときのロード／圧縮板の面積（ｍｍ２）×１０００
(Measurement of 25% compressive stress)
For the fibroin porous body, a universal testing machine (model number: EZ- (N) S, manufactured by Shimadzu Corporation) is used, the load cell is 50 N, and a circular compression plate with a diameter of 8 mm is used as a jig, and the compression speed is 1 mm / The load when 25% of the thickness of the material was pushed by the compression plate was measured under the condition of min and room temperature of 22 ° C., and the value calculated by the following formula was taken as 25% compressive stress (kPa).
25% compressive stress (kPa) = load / compression plate area (mm 2 ) x 1000 when 25% of the material thickness is pushed by the compression plate
（引裂き強さの測定）
１００ｍｍ×１５ｍｍの大きさで、かつ長さ４０ｍｍの切込みを入れた、トラウザ形に打ち抜いたフィブロイン多孔質体の試験片について、万能試験機（型番：ＥＺ−（Ｎ）Ｓ、株式会社島津製作所製）を用い、ロードセルは５０Ｎ、つかみ具は引張試験用の冶具を用い、引裂き速度２００ｍｍ／ｍｉｎ、初期つかみ具間距離４０ｍｍ、室温２２℃の条件下で、引裂き力の中央値を測定し、以下の式により算出した値を引裂き強さとした。
引裂き強さ＝引裂き力の中央値（Ｎ）／試験片の厚さ（ｍｍ）
(Measurement of tear strength)
A universal testing machine (model number: EZ- (N) S, manufactured by Shimazu Seisakusho Co., Ltd.) for a test piece of a fibroin porous body punched into a load cell shape with a size of 100 mm × 15 mm and a notch of 40 mm in length. ), The load cell is 50N, the gripping tool is a jig for tensile test, and the median tearing force is measured under the conditions of a tearing speed of 200 mm / min, an initial distance between gripping tools of 40 mm, and a room temperature of 22 ° C. The value calculated by the formula of was taken as the tear strength.
Tear strength = median tear force (N) / specimen thickness (mm)
（引張強さ及び引張ひずみの測定）
５０ｍｍ×５ｍｍの大きさに打ち抜いたフィブロイン多孔質体の試験片について、万能試験機（型番：ＥＺ−（Ｎ）Ｓ、株式会社島津製作所製）を用い、ロードセルは５０Ｎ、つかみ具は引張試験用の冶具を用い、引張速度５ｍｍ／ｍｉｎ、初期つかみ具間距離３０ｍｍ、室温２２℃の条件下で試験片を引張り、試験片が破断した時の応力とひずみをそれぞれ引張強さ、引張ひずみとした。
(Measurement of tensile strength and tensile strain)
A universal testing machine (model number: EZ- (N) S, manufactured by Shimadzu Corporation) was used for a test piece of a fibroin porous body punched to a size of 50 mm x 5 mm, the load cell was 50 N, and the grip was for tensile testing. The test piece was pulled under the conditions of a tensile speed of 5 mm / min, an initial grip distance of 30 mm, and a room temperature of 22 ° C., and the stress and strain when the test piece broke were defined as tensile strength and tensile strain, respectively. ..
表１より、実施例１から６においてはいずれも練減率は３１質量％前後であり、セリシンがほぼ完全に除去されていることが分かった。
表１より、実施例１から６においてフィブロイン多孔質体の２５％圧縮応力は、分子量が高すぎる比較例２と比べて低く、柔軟性に優れていることが分かった。
表１より、実施例１から６においてはフィブロイン多孔質体の引裂き強さは、分子量が低すぎる比較例１と比べて高く、機械的強度に優れていることが分かった。
表１より、実施例１から６においてはフィブロイン多孔質体の引張強さは、分子量が低すぎる比較例１と比べて高く、機械的強度に優れていることが分かった。
表１より、実施例１から６においてはフィブロイン多孔質体の引張ひずみは、適切な分子量でない比較例１、比較例２と比べて高く、伸縮性に優れていることが分かった。
表１より、実施例１から６においてはフィブロイン原料及びフィブロイン水溶液のタンパク質換算分子量は１６８，０００〜４０３，０００であったが、精練時間の長い比較例１では１２６，０００、精練時間の短い比較例２では７３１，０００であり、精練時間が長くなるにつれ分子量が低下していることが分かった。
表１より、実施例１から６においてはフィブロイン多孔質体のタンパク質換算分子量は１１９，０００〜３０８，０００であったが、精練時間の長い比較例１では９２，０００、精練時間の短い比較例２では５９２，０００であり、精練時間が長くなるにつれ分子量が低下していることが分かった。
以上より、タンパク質換算分子量が１６０，０００〜４１０，０００のフィブロイン原料を使用して作製したフィブロイン水溶液のタンパク質換算分子量は１６０，０００〜４１０，０００であり、また、そのフィブロイン水溶液を使用して作製したフィブロイン多孔質体のタンパク質換算分子量は１１０，０００〜３１０，０００であり、これらのフィブロイン多孔質体は、いずれも機械的強度、伸縮性及び柔軟性に優れていることが分かった。このように、本発明の止血材は、優れた機械的強度を有するため、取り扱いが容易であり、止血部の圧迫等にも利用できる。また、十分な柔軟性を有するため、出血部位の形状に沿って密着させることが可能であり、止血を効果的に行うことができる。
From Table 1, it was found that in each of Examples 1 to 6, the kneading rate was around 31% by mass, and sericin was almost completely removed.
From Table 1, it was found that the 25% compressive stress of the fibroin porous material in Examples 1 to 6 was lower than that of Comparative Example 2 in which the molecular weight was too high, and the fibroin was excellent in flexibility.
From Table 1, it was found that in Examples 1 to 6, the tear strength of the fibroin porous body was higher than that of Comparative Example 1 in which the molecular weight was too low, and the mechanical strength was excellent.
From Table 1, it was found that in Examples 1 to 6, the tensile strength of the fibroin porous body was higher than that of Comparative Example 1 in which the molecular weight was too low, and the mechanical strength was excellent.
From Table 1, it was found that in Examples 1 to 6, the tensile strain of the fibroin porous body was higher than that of Comparative Examples 1 and 2 which did not have an appropriate molecular weight, and the fibroin was excellent in elasticity.
From Table 1, the protein-equivalent molecular weights of the fibroin raw material and the fibroin aqueous solution were 168,000 to 403,000 in Examples 1 to 6, but in Comparative Example 1 having a long smelting time, 126,000 and a short smelting time were compared. In Example 2, it was 731,000, and it was found that the molecular weight decreased as the refining time became longer.
From Table 1, the protein-equivalent molecular weight of the fibroin porous body was 119,000 to 308,000 in Examples 1 to 6, but 92,000 in Comparative Example 1 having a long smelting time and Comparative Example having a short smelting time. In 2, it was 592,000, and it was found that the molecular weight decreased as the refining time became longer.
From the above, the protein-equivalent molecular weight of the fibroin aqueous solution prepared using the fibroin raw material having a protein-equivalent molecular weight of 160,000 to 410,000 is 160,000 to 410,000, and the fibroin aqueous solution is used to prepare the fibroin aqueous solution. The protein-equivalent molecular weight of the fibroin porous body was 110,000 to 310,000, and it was found that all of these fibroin porous bodies were excellent in mechanical strength, elasticity and flexibility. As described above, since the hemostatic material of the present invention has excellent mechanical strength, it is easy to handle and can be used for pressing the hemostatic portion and the like. In addition, since it has sufficient flexibility, it can be brought into close contact with the shape of the bleeding site, and hemostasis can be effectively performed.
［血液凝固時間の測定］
実施例７、比較例３〜６
（１）乾燥フィブロイン多孔質体の調製
実施例４で作製したフィブロイン多孔質体を３体積％グリセリン水溶液に４８時間浸漬した後、−２５℃の冷凍庫中で１０時間静置して完全に凍結させた。凍結したフィブロイン多孔質体の水分を凍結乾燥機を用いて完全に昇華させ、乾燥フィブロイン多孔質体を作製した。
（２）被検物質
被検物質として、上記で作製した乾燥フィブロイン多孔質体（多孔質体Ａ）、ゼラチンスポンジ（アステラス製薬株式会社製、商品名：スポンゼル）、キチンスポンジ（ニプロ株式会社製、商品名：ベスキチンＦ（Ｎ））、アルギン酸塩不織布（スミスアンドネフュー社製、商品名：アルゴダームトリオニック）を準備した。
（３）試料血液
インフォームドコンセントを行い、健常者３人から、抗凝固剤の非存在下で約４０ｍｌの血液を採取し、採取された血液をそれぞれ血液Ａ、Ｂ及びＣとした。試料血液は保存せず、採血直後、速やかに使用した。
（４）血液凝固時間の測定
はじめに、４種類の被験物質から、それぞれ３００ｍｍ３の試料２セットを切り出し、シリコナイズ処理をした試験管２本に、それぞれの被験物質を１セットずつ入れた。また、空の試験管２本をブランクとして用いた。
あらかじめ、それぞれの試験管を３７℃で加温した後、それぞれの試験管に採血直後の血液Ａを１．５ｍＬ（２００ｍｍ３／ｍＬ）添加し、タイマーをスタートさせた。それぞれの被験物質１本目の試験管を３０秒毎に傾け、血液の流動性を目視にて観察した。さらに１本目の試験管で血液凝固が観察された後、２本目の試験管を３０秒毎に傾け、血液の流動性を目視にて確認した。
採血開始から２本目の試験管で血液凝固が観察されるまでの時間を血液凝固時間とした。血液Ｂ及びＣについても同様の操作を繰り返し、血液凝固時間を測定した。血液Ａ〜Ｃの平均値を、各被験物質の血液凝固時間とした。結果を表２に示す。
[Measurement of blood coagulation time]
Example 7, Comparative Examples 3 to 6
(1) Preparation of dried fibroin porous body The fibroin porous body prepared in Example 4 was immersed in a 3% by volume glycerin aqueous solution for 48 hours, and then allowed to stand in a freezer at -25 ° C for 10 hours to be completely frozen. It was. The water content of the frozen fibroin porous body was completely sublimated using a freeze-dryer to prepare a dried fibroin porous body.
(2) Test substance As the test substance, the dried fibroin porous body (porous body A) prepared above, gelatin sponge (manufactured by Astellas Pharmaceutical Co., Ltd., trade name: Sponzel), chitin sponge (manufactured by Nipro Co., Ltd., Product name: Vesquitin F (N)) and alginate non-woven fabric (manufactured by Smith and Nephew, product name: Argodarm Trionic) were prepared.
(3) Sample blood Informed consent was performed, and about 40 ml of blood was collected from three healthy subjects in the absence of an anticoagulant, and the collected blood was designated as blood A, B, and C, respectively. The sample blood was not stored and was used immediately after blood collection.
(4) Measurement of blood coagulation time First, two sets of 300 mm 3 samples were cut out from each of the four types of test substances, and one set of each test substance was placed in two silicate-treated test tubes. Also, two empty test tubes were used as blanks.
After warming each test tube at 37 ° C. in advance, 1.5 mL (200 mm 3 / mL) of blood A immediately after blood collection was added to each test tube to start the timer. The first test tube of each test substance was tilted every 30 seconds, and the fluidity of blood was visually observed. Furthermore, after blood coagulation was observed in the first test tube, the second test tube was tilted every 30 seconds to visually confirm the fluidity of blood.
The time from the start of blood collection to the observation of blood coagulation in the second test tube was defined as the blood coagulation time. The same operation was repeated for blood B and C, and the blood coagulation time was measured. The average value of blood A to C was taken as the blood coagulation time of each test substance. The results are shown in Table 2.
表２より、フィブロイン多孔質体を用いた本発明の止血材は、止血材を使用しなかった比較例３に比べて血液凝固時間を短縮できており、止血効果を有することが分かる。また、本発明の止血材は、既存の止血材として知られるゼラチンスポンジより血液凝固時間が短く、キチンスポンジ、アルギン酸不織布と同等の止血効果を有することが分かる。 From Table 2, it can be seen that the hemostatic material of the present invention using the fibroin porous body can shorten the blood coagulation time as compared with Comparative Example 3 in which the hemostatic material is not used, and has a hemostatic effect. Further, it can be seen that the hemostatic material of the present invention has a shorter blood coagulation time than the existing gelatin sponge known as a hemostatic material, and has the same hemostatic effect as the chitin sponge and the alginic acid non-woven fabric.
［生体への固着力測定］
実施例８、比較例７〜１１
（１）被検物質
被検物質として、実施例７で作製した乾燥フィブロイン多孔質体、ウレタンスポンジ（スミスアンドネフュー社製、商品名：ハイドロサイトプラス）、アルギン酸塩不織布（スミスアンドネフュー社製、商品名：アルゴダームトリオニック）、非固着性ガーゼ（スミスアンドネフュー社製、商品名：メロリン（滅菌済））及びハイドロコロイドドレッシング（３Ｍ社製、商品名：テガダームハイドロコロイド）を準備した。
（２）試験方法
（２−１）褥瘡モデルの作製
ラット（Ｓｌｃ：ＳＤ（ＳＰＦ）８週齢、日本エスエルシー株式会社）を試験に用いた。予め右第三転子上の皮膚を広範囲に電気バリカン（大東電機工業株式会社製、商品名：ＥＬＥＣＴＲＩＣ ＣＬＩＰＰＥＲ ＭＯＤＥＬ５５００）及び電気シェーバー（セイコーエスヤード株式会社製、商品名：Ｃｌｅａｎｃｕｔ ＥＳ−４１２）を用いて除毛した上記ラットに、ペントバルビタールナトリウム５０ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与し、更に、アロバルビタール２０ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与して麻酔し、木製固定板上に腹位に固定した。大腿部と前記固定板との間にクッションとして脱脂綿を入れ、右第三転子上の皮膚に、ゴム栓（直径１２ｍｍ）をつけた１．０２〜１．０３ｋｇのステンレス棒（直径１９ｍｍ、長さ５０ｃｍ）をのせて２４時間圧負荷（９０２．３〜９１１．２ｇ／ｃｍ２）した。圧負荷時間中、ペントバルビタールナトリウム及びアロバルビタールの追加麻酔を施した。２４時間後に圧負荷を解除し、５％ブドウ糖水溶液を経口投与した後、圧負荷解除２日後にイソフルラン麻酔下にて壊死した皮膚を外科的に除去し、褥瘡モデルとした。
（２−２）創部の処置及び被験物質の投与
ラットに作製した褥瘡に２ｃｍ角に裁断した被検物質を被せ、その上から３ｃｍ角に裁断したガーゼ（白十字株式会社製）で覆い、４ｃｍ角に裁断したドレッシングフィルム（スミスアンドネフュー社製、商品名：オプサイトジェントルロール）で固定した。更に、５ｃｍ角に裁断した伸縮性包帯エラストポアＮｏ．５０（ニチバン株式会社製）２枚を交叉して貼り、伸縮性包帯エラストポアＮｏ．１２（ニチバン株式会社製、１．２×６０ｃｍ）で固定した。ハイドロコロイドドレッシングについては、離型紙を剥がし粘着面が創傷面に当たるように投与し、その上からガーゼを被せ、更に、伸縮性包帯で固定した。被検物質は褥瘡が完全に治癒するまでの間、２日ごとに新しいものに交換した。被検物質交換時には、以下の方法で創部への固着の強さを測定した。また、新しい被検物質を貼付する前には、生理食塩液（株式会社大塚製薬工場製）に浸した脱脂綿で創部を清拭した。また、創部が完全に上皮化したタイミングを治癒と判定した。
（２−３）創部への固着の強さの測定
被験物質の創部に対する固着の強さを、吊り秤（天衡商事、高精度光デジタルフォースゲージ）で測定した。被験物質交換時に被検物質を剥がさないように固定している伸縮性包帯類を除去した後に、吊り秤で被検物質を垂直に引っ張って被検物質を剥がした。その時の重さの最大値を読み取って記録し、以下の式に従って、各被検物質の交換時の創部に対する平均固着強さを算出した。
平均固着強さ（ｇ）＝（褥瘡が治癒するまでの各被検物質交換時に吊り秤が示した重さの最大値の合計（ｇ））／（各被検物質の交換回数）
結果を表３に示す。なお、治癒に要した日数とは、各被検物質の貼付を始めた日から、創部が完全に上皮化した日までの日数を表す。
[Measurement of adhesion to living body]
Example 8, Comparative Examples 7 to 11
(1) Test substance As the test substance, the dry fibroin porous body prepared in Example 7, urethane sponge (manufactured by Smith & Nephew, trade name: Hydrosite Plus), alginate non-woven fabric (manufactured by Smith & Nephew, Co., Ltd., Product name: Alginderm trionic), non-woven gauze (Smith & Nephew, product name: Mellorine (sterilized)) and hydrocolloid dressing (3M, product name: Tegaderm hydrocolloid) were prepared.
(2) Test method (2-1) Preparation of pressure ulcer model Rats (Slc: SD (SPF) 8 weeks old, Nippon SLC Co., Ltd.) were used for the test. A wide range of skin on the right third trochanter is used with an electric clipper (manufactured by Daito Denki Kogyo Co., Ltd., trade name: ELECTRIC CLIPPER MODEL5500) and an electric shaver (manufactured by Seiko Esyard Co., Ltd., trade name: Cleancut ES-412). Pentobarbital sodium 50 mg / kg was intraperitoneally administered to the hair-removed rat, and allobarbital 20 mg / kg was intraperitoneally administered to anesthetize the rat, and the rat was fixed in the abdominal position on a wooden fixing plate. A 1.02 to 1.03 kg stainless steel rod (19 mm in diameter, 19 mm in diameter) with cotton wool as a cushion between the thigh and the fixing plate and a rubber stopper (12 mm in diameter) attached to the skin on the right third trochanter. A pressure load (902.3 to 911.2 g / cm 2 ) was applied for 24 hours with a 50 cm length. During the pressure loading time, additional anesthesia was given with sodium pentobarbital and allobarbital. After 24 hours, the pressure load was released, and a 5% aqueous glucose solution was orally administered. Then, 2 days after the pressure load was released, the necrotic skin was surgically removed under isoflurane anesthesia to prepare a pressure ulcer model.
(2-2) Treatment of wounds and administration of test substance A pressure ulcer prepared on a rat is covered with a test substance cut into 2 cm squares, covered with gauze (manufactured by Hakujuji Co., Ltd.) cut into 3 cm squares, and 4 cm. It was fixed with a dressing film (manufactured by Smith and Nephew, trade name: Opsite Gentle Roll) cut into corners. Furthermore, the elastic bandage Elastopore No. cut into 5 cm squares. Two 50 (manufactured by Nichiban Co., Ltd.) are crossed and pasted, and elastic bandage Elastopore No. It was fixed at 12 (manufactured by Nichiban Co., Ltd., 1.2 x 60 cm). For the hydrocolloid dressing, the release paper was peeled off and the dressing was administered so that the adhesive surface touched the wound surface, covered with gauze, and further fixed with an elastic bandage. The test substance was replaced with a new one every two days until the pressure ulcer was completely healed. At the time of exchanging the test substance, the strength of adhesion to the wound was measured by the following method. In addition, before applying the new test substance, the wound was wiped with absorbent cotton soaked in physiological saline (manufactured by Otsuka Pharmaceutical Factory, Ltd.). In addition, the timing when the wound was completely epithelialized was judged to be healing.
(2-3) Measurement of Adhesion Strength to Wound The adhesion strength of the test substance to the wound was measured with a hanging scale (Tenpo Shoji, high-precision optical digital force gauge). After removing the elastic bandages that were fixed so as not to peel off the test substance at the time of exchanging the test substance, the test substance was peeled off by pulling the test substance vertically with a hanging scale. The maximum value of the weight at that time was read and recorded, and the average adhesion strength to the wound at the time of replacement of each test substance was calculated according to the following formula.
Average fixation strength (g) = (total of maximum weights indicated by the hanging scale at the time of exchanging each test substance until the pressure ulcer heals (g)) / (number of exchanges of each test substance)
The results are shown in Table 3. The number of days required for healing represents the number of days from the day when each test substance was applied to the day when the wound was completely epithelialized.
表３より、フィブロイン多孔質体を用いた本発明の止血材は、創部に対する固着力が小さく、生体から容易に除去することが可能であることが分かる。
本発明の止血材を貼付した場合には、ガーゼ類を創部に貼付した場合と比較して治癒に要する日数が短いことが確認された。また、比較例８、９及び１１の既存の湿潤療法向け創傷被覆材として知られる材料と比較しても遜色ないことが分かった。このように。本発明の止血材は、止血のみならず、創部に貼付することで、創傷治癒促進効果が期待できる。
From Table 3, it can be seen that the hemostatic material of the present invention using the fibroin porous body has a small adhesive force to the wound and can be easily removed from the living body.
It was confirmed that when the hemostatic material of the present invention was applied, the number of days required for healing was shorter than when the gauze was applied to the wound. It was also found that it was comparable to the existing materials known as wound dressings for hydrocolloid dressing in Comparative Examples 8, 9 and 11. in this way. The hemostatic material of the present invention can be expected to have an effect of promoting wound healing by not only stopping bleeding but also by attaching it to a wound.
Claims (6)
前記フィブロイン多孔質体を、その濃度が１００ｇ／Ｌになるように、２０℃の９ｍｏｌ／Ｌ臭化リチウム水溶液に溶解させた溶解液を、１２，０００ｍｉｎ −１ の回転数で５分間遠心分離して、デカンテーションで沈殿物を除去した後、透析により脱塩し、再度１２，０００ｍｉｎ −１ の回転数で３０分間遠心分離して得られたフィブロイン水溶液を分子量測定溶液として準備し、
高速液体クロマトグラフを用いて前記分子量測定溶液のクロマトグラムを得て、
該クロマトグラムのピークトップを、
分子量マーカーとして、分子量２９０，０００の酵母由来グルタミン酸脱水素酵素、分子量１４２，０００の豚心筋由来乳酸脱水素酵素及び分子量６７，０００の酵母由来エノラーゼを使用して作成した較正曲線を用いて、タンパク質の分子量に換算したタンパク質換算分子量が１７１，０００〜２２０，０００である、止血材。 A hemostatic material using a fibroin porous body.
A solution prepared by dissolving the fibroin porous body in a 9 mol / L lithium bromide aqueous solution at 20 ° C. at a concentration of 100 g / L was centrifuged at a rotation speed of 12,000 min- 1 for 5 minutes. After removing the precipitate by decantation, the solution was desalted by dialysis and centrifuged again at a rotation speed of 12,000 min- 1 for 30 minutes to prepare an aqueous fibroin solution as a molecular weight measurement solution.
Obtain a chromatogram of the molecular weight measurement solution using a high performance liquid chromatograph.
The peak top of the chromatogram
As a molecular weight marker, a protein using a calibration curve prepared using a yeast-derived glutamate dehydrogenase having a molecular weight of 290,000, a pig myocardial lactate dehydrogenase having a molecular weight of 142,000, and a yeast-derived enolase having a molecular weight of 67,000. protein molecular weight calculated in terms of the molecular weight of a 171,000～220,000, stop Chizai.
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