JP2017080115A - Hemostatic material - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、フィブロイン多孔質体を用いた止血材に関する。 The present invention relates to a hemostatic material using a fibroin porous material.
医療現場において止血は極めて重要な処置の１つであり、出血による患者の負担の軽減、予後改善、外科医の負担軽減等の観点から、止血に要する時間の短縮化、及び止血に至るまでの出血量を最小限に抑え、確実に止血することが要求される。
従来から、出血箇所に止血材を押し当てる方法、いわゆる圧迫法に用いられる止血材として、脱脂綿、コットンのガーゼ等を用いた製品が使用されてきた。
Hemostasis is one of the most important treatments in the medical field. From the viewpoint of reducing the burden on the patient due to bleeding, improving the prognosis, reducing the burden on the surgeon, etc., shortening the time required for hemostasis and bleeding until the hemostasis is reached. It is required to minimize hemorrhage and ensure hemostasis.
Conventionally, products using absorbent cotton, cotton gauze or the like have been used as a hemostatic material used in a method of pressing a hemostatic material against a bleeding site, that is, a so-called compression method.
止血効果を有する材料として、ウシ又は豚由来のアテロコラーゲンを原料としたコラーゲンのほか、ゼラチン、酸化セルロース、キチン誘導体等が知られている。
コラーゲンは血液と接触して血小板を活性化し、該活性化された血小板がコラーゲンに付着し、凝集塊を形成することで止血を可能とするものである（例えば、特許文献１参照）。また、ゼラチンは血液のような水分存在下においてゲルを形成し、出血部位の形状に沿って密着し得る柔軟性と、生体組織に対する高い接着性を示すことで、局所を圧迫して止血を可能とする止血材として用い得ることが知られている（例えば、特許文献２参照）。酸化セルロースは血液中のヘモグロビンと強い親和性を有するため、体内及び体外の創傷患部に施用することにより血液凝固作用、細胞拡張作用を促して自然治癒を図ることができ（例えば、特許文献３参照）、キチン誘導体は、血小板を活性化し、血液凝集を促すことで止血効果を発現することが知られている（例えば、特許文献４参照）。
As materials having a hemostatic effect, gelatin, oxidized cellulose, chitin derivatives and the like are known in addition to collagen made from bovine or porcine atelocollagen as a raw material.
Collagen comes into contact with blood to activate platelets, and the activated platelets adhere to collagen to form aggregates, thereby enabling hemostasis (see, for example, Patent Document 1). Gelatin forms a gel in the presence of water such as blood, and exhibits high flexibility to adhere to the shape of the bleeding site and high adhesion to living tissue, allowing for hemostasis by pressing locally. It is known that it can be used as a hemostatic material (see, for example, Patent Document 2). Oxidized cellulose has a strong affinity for hemoglobin in the blood, so that it can be applied to the affected part of the wound inside and outside the body to promote blood coagulation and cell expansion, thereby achieving natural healing (for example, see Patent Document 3). ), Chitin derivatives are known to exhibit a hemostatic effect by activating platelets and promoting blood aggregation (see, for example, Patent Document 4).
しかしながら、脱脂綿、ガーゼ等の従来から汎用される止血材は、多量の出血を即時止血できない上に、創傷部に対する固着性が大きいため、剥離するときに使用部位に多くの繊維を残してしまい、これらの繊維を取り除く必要があった。
また、特許文献１及び２に記載のコラーゲン、ゼラチンを用いた止血材は、生体内分解性及び吸収性に優れる一方で、抗原性を有するテロペプチド部分の除去が困難であるという問題があり、また、プリオン混入等の動物由来の感染症の危険性があるため、生体に使用することは避けたほうがよいことが分かってきている。
However, conventionally used hemostatic materials such as absorbent cotton, gauze, etc. cannot stop hemorrhage immediately, and have high adhesion to the wound part, leaving many fibers at the site of use when peeling off, It was necessary to remove these fibers.
In addition, the hemostatic material using collagen and gelatin described in Patent Documents 1 and 2 has a problem that it is difficult to remove a telopeptide portion having antigenicity while being excellent in biodegradability and absorbability, Also, it has been found that it is better to avoid using it in living organisms because of the risk of animal-derived infections such as prion contamination.
特許文献３に記載の酸化セルロースを用いた止血材は、材料が生体由来の材料ではないため、異物反応を誘発する問題があると共に、水溶性であるため取り扱い性にも問題がある。また、特許文献４に記載のキチン誘導体を用いた止血材は、血液を吸液することにより膨潤ゲル化するため、生体内で使用する場合に周辺組織を圧迫する危険性があると共に、ゲル化したときに機械的強度が低下するという問題もあった。
また、これらの止血材は、生体に対する固着力が大きいため、止血部が治癒した後、又は止血部を再処理するため該止血材を剥離しようとすると、その固着力に起因して、脆弱な新生組織を傷つける二次損傷が生じてしまい、生体に損傷を与えることなく止血材を除去することが困難であった。
The hemostatic material using oxidized cellulose described in Patent Document 3 has a problem of inducing a foreign body reaction since the material is not a living body-derived material, and also has a problem in handleability since it is water-soluble. In addition, since the hemostatic material using the chitin derivative described in Patent Document 4 swells and gels by sucking blood, there is a risk of pressing the surrounding tissue when used in vivo, and the gelation. There was also a problem that the mechanical strength was reduced.
In addition, since these hemostatic materials have a high adhesion force to a living body, when the hemostatic material is healed or when the hemostatic material is peeled off for reprocessing the hemostatic material, the hemostatic material is fragile due to the adhesion force. Secondary damage that damages the new tissue has occurred, and it has been difficult to remove the hemostatic material without damaging the living body.
本発明は、このような課題を解決するためになされたものであり、生体に対する安全性に優れ、止血時間が短く、生体から容易に除去することが可能であり、機械的強度及び柔軟性に優れる止血材を提供することを目的とする。 The present invention has been made in order to solve such problems, and is excellent in safety with respect to a living body, has a short hemostatic time, can be easily removed from a living body, and has high mechanical strength and flexibility. The object is to provide an excellent hemostatic material.
本発明者らは、前記課題を達成するために鋭意研究を重ねた結果、下記の発明により当該課題を解決できることを見出した。
すなわち、本発明の要旨は、以下の［１］〜［６］のとおりである。
［１］タンパク質換算分子量が１１０，０００〜３１０，０００であるフィブロインを含有してなるフィブロイン多孔質体を用いた止血材。
［２］前記フィブロインのタンパク質換算分子量が１８０，０００〜３１０，０００である、上記［１］に記載の止血材。
［３］前記フィブロイン多孔質体がシルクフィブロイン多孔質体である、上記［１］又は［２］に記載の止血材。
［４］前記フィブロイン多孔質体の引張ひずみが５２〜６７％である、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の止血材。
［５］前記フィブロイン多孔質体の引裂き強さが２０〜４５Ｎ／ｍｍである、上記［１］〜［４］のいずれかに記載の止血材。
［６］前記フィブロイン多孔質体の２５％圧縮応力が２０〜２５ｋＰａである、上記［１］〜［５］のいずれかに記載の止血材。
As a result of intensive studies to achieve the above problems, the present inventors have found that the problems can be solved by the following invention.
That is, the gist of the present invention is as follows [1] to [6].
[1] A hemostatic material using a fibroin porous material containing fibroin having a protein-equivalent molecular weight of 110,000 to 310,000.
[2] The hemostatic material according to [1], wherein the fibroin has a protein equivalent molecular weight of 180,000 to 310,000.
[3] The hemostatic material according to [1] or [2] above, wherein the fibroin porous material is a silk fibroin porous material.
[4] The hemostatic material according to any one of [1] to [3], wherein the fibroin porous body has a tensile strain of 52 to 67%.
[5] The hemostatic material according to any one of [1] to [4], wherein the fibroin porous body has a tear strength of 20 to 45 N / mm.
[6] The hemostatic material according to any one of [1] to [5], wherein the fibroin porous body has a 25% compressive stress of 20 to 25 kPa.
本発明によれば、生体に対する安全性に優れ、止血時間が短く、生体から容易に除去することが可能であり、機械的強度及び柔軟性に優れる止血材を提供することができる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, it is excellent in the safety | security with respect to a biological body, the hemostatic time is short, can be easily removed from a biological body, and the hemostatic material excellent in mechanical strength and a softness | flexibility can be provided.
［止血材］
本発明の止血材は、タンパク質換算分子量が１１０，０００〜３１０，０００であるフィブロインを含有してなるフィブロイン多孔質体を用いてなるものである。
以下、本発明に用いるフィブロイン多孔質体について詳述する。
[Hemostatic material]
The hemostatic material of the present invention uses a fibroin porous material containing fibroin having a protein-equivalent molecular weight of 110,000 to 310,000.
Hereinafter, the fibroin porous material used in the present invention will be described in detail.
＜フィブロイン多孔質体＞
本発明に用いるフィブロイン多孔質体は、タンパク質換算分子量が１１０，０００〜３１０，０００であるフィブロインを含有してなるフィブロイン多孔質体である。
本明細書において、タンパク質換算分子量とは、高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）を用いて得られる評価試料のクロマトグラムを、分子量マーカーとしてグルタミン酸脱水素酵素（分子量：２９０，０００）、豚心筋乳酸脱水素酵素（分子量：１４２，０００）、酵母エノラーゼ（分子量：６７，０００）を使用して作成した較正曲線を用いて、タンパク質の分子量に換算した分子量を意味し、実施例に記載の方法により測定することができる。本明細書において「分子量」は、特に断らない限り「タンパク質換算分子量」を意味する。
<Fibroin porous material>
The fibroin porous material used in the present invention is a fibroin porous material containing fibroin having a protein-equivalent molecular weight of 110,000 to 310,000.
In this specification, protein-converted molecular weight refers to chromatograms of evaluation samples obtained using high performance liquid chromatograph (HPLC), glutamate dehydrogenase (molecular weight: 290,000), porcine myocardial lactate dehydrogenation as molecular weight markers. It means the molecular weight converted to the molecular weight of the protein using a calibration curve prepared using an enzyme (molecular weight: 142,000) and yeast enolase (molecular weight: 67,000), and is measured by the method described in the examples. be able to. In the present specification, “molecular weight” means “protein equivalent molecular weight” unless otherwise specified.
フィブロイン多孔質体に含まれるフィブロインのタンパク質換算分子量は１１０，０００〜３１０，０００であり、１４０，０００〜３１０，０００であることが好ましく、１８０，０００〜３１０，０００であることがより好ましい。この範囲の分子量のフィブロインを含有するフィブロイン多孔質体は、機械的強度及び柔軟性に優れ、止血材として取り扱いが容易である。 The protein equivalent molecular weight of fibroin contained in the fibroin porous material is 110,000 to 310,000, preferably 140,000 to 310,000, and more preferably 180,000 to 310,000. A fibroin porous material containing a fibroin having a molecular weight in this range is excellent in mechanical strength and flexibility and easy to handle as a hemostatic material.
フィブロイン多孔質体中に含まれるフィブロインの含有量は、好ましくは８０質量％以上、より好ましくは９０質量％以上、さらに好ましくは９５質量％以上、特に好ましくは実質的に１００質量％である。 The content of fibroin contained in the fibroin porous material is preferably 80% by mass or more, more preferably 90% by mass or more, still more preferably 95% by mass or more, and particularly preferably substantially 100% by mass.
フィブロイン多孔質体の平均細孔径は、１〜５００μｍが好ましく、５〜３００μｍがより好ましく、１０〜１００μｍがさらに好ましい。平均細孔径が上記範囲内であると、優れた機械的強度と止血効果とを両立することができる。
ここで、フィブロイン多孔質体の平均細孔径は、多孔質体断面の走査型電子顕微鏡写真を５枚撮影し、さらに異なる日に作製した多孔質体断面の走査型電子顕微鏡写真を５枚撮影し、それら１０枚の走査型電子顕微鏡写真を画像解析ソフトを用いて画像処理し、算出した細孔径の平均値である。
The average pore diameter of the fibroin porous body is preferably 1 to 500 μm, more preferably 5 to 300 μm, and still more preferably 10 to 100 μm. When the average pore diameter is within the above range, both excellent mechanical strength and hemostatic effect can be achieved.
Here, the average pore size of the fibroin porous body was obtained by taking five scanning electron micrographs of the porous body cross section, and further taking five scanning electron micrographs of the porous body cross section prepared on different days. These 10 scanning electron micrographs are image processed using image analysis software, and are average values of pore diameters calculated.
フィブロイン多孔質体の大きさ、厚さに特に制限はなく、止血材の適用箇所等に応じて適切な大きさ、厚さのものを使用すればよい。また、加工によって所望の形状のフィブロイン多孔質体を得ることもできる。加工の方法に特に制限はなく、トムソン刃を使用した打ち抜き、バンドソーでのスライス加工等が挙げられる。 There is no particular limitation on the size and thickness of the fibroin porous body, and a material having an appropriate size and thickness may be used according to the application site of the hemostatic material. Moreover, the fibroin porous body of a desired shape can also be obtained by processing. There is no restriction | limiting in particular in the processing method, The punching using a Thomson blade, the slice processing with a band saw, etc. are mentioned.
フィブロイン多孔質体の２５％圧縮応力は、２０〜２５ｋＰａであることが好ましく、２０〜２３ｋＰａであることがより好ましい。２５％圧縮応力がこの範囲のフィブロイン多孔質体は、柔軟性に優れている。
フィブロイン多孔質体の引裂き強さは、２０〜５０Ｎ／ｍｍであることが好ましく、２５〜４５Ｎ／ｍｍであることがより好ましい。引裂き強さがこの範囲のフィブロイン多孔質体は、機械的強度、伸縮性及び柔軟性のバランスに優れる。
フィブロイン多孔質体の引張強さは、３５〜７５ｋＰａであることが好ましく、４０〜７０ｋＰａであることがより好ましい。引張強さがこの範囲のフィブロイン多孔質体は、機械的強度、伸縮性及び柔軟性のバランスに優れている。
フィブロイン多孔質体の引張ひずみは、５２〜６７％であることが好ましく、５６〜６５％であることがより好ましい。引張ひずみがこの範囲のフィブロイン多孔質体は、伸縮性に優れている。
なお、本明細書における引張強さ及び引張ひずみとは、試験片を万能試験機等で引っ張った際に、試験片が破断したときの応力及びひずみを意味し、引張ひずみ（％）の値は、［〔（変形後の長さ−変形前の長さ）／（変形前の長さ）〕×１００］で表される比率の値を意味する。
フィブロイン多孔質体の２５％圧縮応力、引裂き強さ及び引張ひずみは実施例に記載の方法により測定することができる。
The 25% compressive stress of the fibroin porous body is preferably 20 to 25 kPa, and more preferably 20 to 23 kPa. A fibroin porous material having a 25% compressive stress in this range is excellent in flexibility.
The tear strength of the fibroin porous body is preferably 20 to 50 N / mm, and more preferably 25 to 45 N / mm. A fibroin porous material having a tear strength in this range is excellent in the balance of mechanical strength, stretchability and flexibility.
The tensile strength of the fibroin porous body is preferably 35 to 75 kPa, and more preferably 40 to 70 kPa. A fibroin porous material having a tensile strength in this range is excellent in the balance of mechanical strength, stretchability and flexibility.
The tensile strain of the fibroin porous body is preferably 52 to 67%, and more preferably 56 to 65%. A fibroin porous material having a tensile strain in this range is excellent in stretchability.
In addition, the tensile strength and tensile strain in this specification mean the stress and strain when the test piece is broken when the test piece is pulled with a universal testing machine or the like, and the value of tensile strain (%) is , [[(Length after deformation−length before deformation) / (length before deformation)] × 100].
The 25% compressive stress, tear strength, and tensile strain of the fibroin porous material can be measured by the methods described in Examples.
フィブロイン多孔質体の血液凝固時間は、速やかな止血を可能とする観点から、２５分以下であることが好ましく、２０分以下であることがより好ましく、１５分以下であることがさらに好ましい。
なお、本発明において血液凝固時間は、下記の方法により測定された時間を意味し、具体的には、実施例に記載の方法により測定することができる。
３００ｍｍ３のフィブロイン多孔質体を投入した試験管を２本用意し、これらを３７℃に加温した後、採血直後の血液を１．５ｍＬ（２００ｍｍ３／ｍＬ）添加した。次いで、１本目の試験管を３０秒毎に傾け、血液の流動性を目視にて観察し、該１本目の試験管で血液凝固が観察された後、２本目の試験管を３０秒毎に傾け、血液の流動性を目視にて確認し、採血開始から２本目の試験管で血液凝固が観察されるまでの時間を血液凝固時間とした。
The blood coagulation time of the fibroin porous body is preferably 25 minutes or less, more preferably 20 minutes or less, and even more preferably 15 minutes or less from the viewpoint of enabling rapid hemostasis.
In the present invention, the blood coagulation time means a time measured by the following method, and can be specifically measured by the method described in the examples.
Two test tubes charged with 300 mm 3 of fibroin porous material were prepared, and after heating them to 37 ° C., 1.5 mL (200 mm 3 / mL) of blood immediately after blood collection was added. Next, the first test tube is tilted every 30 seconds, and the blood fluidity is visually observed. After blood coagulation is observed in the first test tube, the second test tube is moved every 30 seconds. The blood fluidity was confirmed visually, and the time from the start of blood collection until blood coagulation was observed in the second test tube was defined as the blood coagulation time.
また、本発明の止血材は、創傷治癒の促進、浸出液の発生する創への固着の抑制効果が期待できるため、出血を伴う創のみでなく、浸出液の発生する創の被覆材としても好適に使用することができる。このため、出血の伴う創を本発明の止血材で止血した後に、適宜交換しながら本発明の止血材を創部に貼付し続けることで、止血効果だけでなく、創部への固着を抑制しながら、創傷治癒促進の効果も期待できる。
フィブロイン多孔質体の、浸出液が発生する創部に対する平均固着強さは、生体から容易に除去することを可能とする観点から、１５ｇ以下であることが好ましく、１２ｇ以下であることがより好ましく、１０ｇ以下であることがさらに好ましい。
なお、本発明において平均固着強さは、下記の方法により測定された時間を意味し、具体的には、実施例に記載の方法により測定することができる。
被験物質の創部に対する固着強さは、褥瘡を作製したラットの褥瘡を被験物質で被覆した後固定し、吊り秤（天衡商事、高精度光デジタルフォースゲージ）で該被覆物質を垂直に引っ張って被検物質を剥がしたときの重さの最大値を読み取ることで測定することができる。本発明においては、被検物質は褥瘡が完全に治癒するまでの間、２日ごとに新しいものに交換し、褥瘡が治癒するまでの各被検物質交換時に吊り秤が示した重さの最大値から、下記式により求められる値を平均固着強さとした。
平均固着強さ（ｇ）＝（褥瘡が治癒するまでの各被検物質交換時に吊り秤が示した重さの最大値の合計（ｇ））／（各被検物質の交換回数）
なお、褥瘡が完全に治癒した状態とは、創部が完全に上皮化した状態を意味する。
In addition, the hemostatic material of the present invention can be expected to promote wound healing and suppress the adherence to the wound where exudate is generated, so it is suitable not only as a wound with bleeding but also as a covering material for wounds where exudate occurs Can be used. For this reason, after the wound with hemorrhage is stopped with the hemostatic material of the present invention, the hemostatic material of the present invention is continuously applied to the wound site while being appropriately replaced, thereby suppressing not only the hemostatic effect but also the adhesion to the wound site. In addition, the effect of promoting wound healing can be expected.
The average adhesion strength of the fibroin porous body to the wound site where the exudate is generated is preferably 15 g or less, more preferably 12 g or less, from the viewpoint that it can be easily removed from the living body. More preferably, it is as follows.
In the present invention, the average fixing strength means a time measured by the following method, and specifically can be measured by the method described in the examples.
The adhesion of the test substance to the wound is determined by covering the pressure ulcer of the rat from which the pressure ulcer has been prepared with the test substance, fixing it, and pulling the coated substance vertically with a suspension scale (Tenhoku Corporation, high-precision optical digital force gauge). It can be measured by reading the maximum weight when the test substance is peeled off. In the present invention, the test substance is replaced with a new one every two days until the pressure ulcer is completely healed, and the maximum weight indicated by the suspension scale at each test substance change until the pressure ulcer is healed. From the value, the value obtained by the following formula was defined as the average fixing strength.
Average sticking strength (g) = (total sum of weights shown by the hanging scale at the time of each test substance exchange until the pressure ulcer heals (g)) / (number of times each test substance is exchanged)
The state where the pressure ulcer has completely healed means a state in which the wound is completely epithelialized.
次に、フィブロイン多孔質体の製造に用いられるフィブロイン原料、及びフィブロイン多孔質体の製造方法について説明する。 Next, the fibroin raw material used for manufacturing the fibroin porous body and the method for manufacturing the fibroin porous body will be described.
（フィブロイン原料）
フィブロイン多孔質体の原料として用いられるフィブロイン原料は、フィブロインに加え、セリシンを含む繭、生糸等の絹原料を精練し、セリシンを除去することで得られる。
使用する絹原料に特に制限はなく、繭、切繭、生糸等を使用することができる。蚕の品種にも特に制限はなく、例えば、家蚕、野蚕、天蚕等の天然蚕、トランスジェニック蚕などから産生されるシルクフィブロインなどを使用することができる。本発明においては、乾燥状態でも柔らかく、乾燥後の外観、スライス加工性に優れるフィブロイン多孔質体を得る観点から、シルクフィブロインを原料とすることが好ましい。
(Fibroin raw material)
The fibroin raw material used as the raw material for the fibroin porous material is obtained by scouring silk raw materials such as silkworms and raw silk containing sericin in addition to fibroin and removing sericin.
There is no restriction | limiting in particular in the silk raw material to be used, A cocoon, a cut cocoon, raw silk, etc. can be used. There are no particular restrictions on the varieties of silkworms, and for example, silk fibroin produced from natural silkworms such as rabbits, wild silkworms, and tengu, transgenic silkworms, and the like can be used. In the present invention, it is preferable to use silk fibroin as a raw material from the viewpoint of obtaining a fibroin porous material that is soft even in a dry state and excellent in appearance after drying and slice processability.
通常、絹原料の精練は、アルカリ剤を溶解した水溶液中に絹原料を入れ、加熱するという工程で行われる。精練の方法に特に制限はなく、吊練り、機械練り、袋練り、泡練り等の手法を用いることができる。
精練に用いるアルカリ剤に特に制限はなく、マルセル石鹸、炭酸ナトリウム、重曹等を使用することができるが、石鹸の残留が懸念されることから、炭酸ナトリウム、重曹を用いることが好ましく、分子量の制御が容易なことから、炭酸ナトリウムを用いることがより好ましい。
水溶液中のアルカリ剤の濃度は、１５％ｏｗｆ〜２５％ｏｗｆであることが好ましい。アルカリ剤の濃度をこの範囲に設定することで、効率良くセリシンを除去することができると共に、フィブロイン多孔質体の形成に適した分子量のフィブロイン原料を得ることができる。
精練時の浴比（フィブロイン原料の質量に対するアルカリ剤を溶解した水溶液の質量の比）は、２０〜１００倍であることが好ましい。精練時の浴比をこの範囲に設定することで、効率良くセリシンを除去することができる。
精練時の加熱温度は、セリシンを十分に除去可能であれば特に制限はないが、常圧の場合、８５〜１００℃が好ましい。温度をこの範囲に設定することで、効率良くセリシンを除去することができる。
精練の時間はセリシンを十分除去可能であれば特に制限はないが、３時間〜５時間であることが好ましい。精練の時間をこの範囲に設定することで、効率良くセリシンを除去することができると共に、フィブロイン多孔質体の形成に適した分子量のフィブロイン原料を得ることができる。
精練後はフィブロイン原料に付着したアルカリ及びセリシンを除去するため、湯洗浄、水洗浄を行った後、脱水、乾燥することが好ましい。
Usually, the scouring of the silk raw material is performed in a step of heating the silk raw material in an aqueous solution in which an alkaline agent is dissolved. There is no particular limitation on the scouring method, and methods such as hanging kneading, mechanical kneading, bag kneading, and foam kneading can be used.
There is no particular limitation on the alkaline agent used for scouring, and Marcel soap, sodium carbonate, sodium bicarbonate, etc. can be used, but since there is a concern about residual soap, sodium carbonate, sodium bicarbonate is preferably used, and the molecular weight is controlled. Therefore, it is more preferable to use sodium carbonate.
The concentration of the alkaline agent in the aqueous solution is preferably 15% owf to 25% owf. By setting the concentration of the alkaline agent within this range, sericin can be efficiently removed and a fibroin raw material having a molecular weight suitable for forming a fibroin porous material can be obtained.
The bath ratio during scouring (ratio of the mass of the aqueous solution in which the alkaline agent is dissolved relative to the mass of the fibroin raw material) is preferably 20 to 100 times. By setting the bath ratio during scouring within this range, sericin can be efficiently removed.
The heating temperature during scouring is not particularly limited as long as sericin can be sufficiently removed, but in the case of normal pressure, 85 to 100 ° C. is preferable. By setting the temperature within this range, sericin can be efficiently removed.
The scouring time is not particularly limited as long as sericin can be sufficiently removed, but it is preferably 3 hours to 5 hours. By setting the scouring time within this range, sericin can be efficiently removed and a fibroin raw material having a molecular weight suitable for forming a fibroin porous material can be obtained.
After scouring, in order to remove alkali and sericin adhering to the fibroin raw material, it is preferable to perform dehydration and drying after hot water washing and water washing.
フィブロイン原料は、タンパク質換算分子量が１６０，０００〜４１０，０００であることが好ましく、２００，０００〜３６０，０００であることがより好ましく、２４０，０００〜３１０，０００であることがさらに好ましい。この範囲の分子量のフィブロイン原料を使用してフィブロイン多孔質体を作製することで、機械的強度及び柔軟性に優れるフィブロイン多孔質体が得られる。
フィブロイン原料のタンパク質換算分子量は、実施例に記載の方法で測定することができる。
The fibroin raw material preferably has a protein-equivalent molecular weight of 160,000 to 410,000, more preferably 200,000 to 360,000, and even more preferably 240,000 to 310,000. By producing a fibroin porous body using a fibroin raw material having a molecular weight in this range, a fibroin porous body having excellent mechanical strength and flexibility can be obtained.
The protein equivalent molecular weight of the fibroin raw material can be measured by the method described in the examples.
（フィブロイン多孔質体の製造方法）
以下、フィブロイン原料として好ましいシルクフィブロインを例にとって、フィブロイン多孔質体の製造方法について説明する。
シルクフィブロイン多孔質体は、その製造方法は問わないが、例えば、シルクフィブロイン水溶液を急速冷凍した後、結晶化溶媒に浸漬し、融解と結晶化を同時進行することによって得る方法（例えば、特開平８−４１０９７号公報参照）、シルクフィブロイン水溶液を冷凍した後に長時間凍結状態を維持することで多孔質体を作製する手法（例えば、特開２００６−２４９１１５号公報参照）、シルクフィブロイン水溶液に対して少量の水溶性液状有機物質を添加した後に、一定時間冷凍して融解することによって多孔質体を得る手法（例えば、特許第３４１２０１４号公報参照）等が挙げられる。
(Method for producing fibroin porous material)
Hereinafter, a method for producing a fibroin porous material will be described by taking silk fibroin preferable as a fibroin raw material as an example.
The method for producing the silk fibroin porous material is not limited. For example, after rapidly freezing a silk fibroin aqueous solution, it is immersed in a crystallization solvent and simultaneously melted and crystallized (for example, Japanese Patent Laid-Open No. 8-410997), a method of producing a porous material by maintaining a frozen state for a long time after freezing the silk fibroin aqueous solution (see, for example, JP-A-2006-249115), A method of obtaining a porous material by adding a small amount of a water-soluble liquid organic substance and then freezing and thawing it for a certain time (see, for example, Japanese Patent No. 34122014), and the like.
〔シルクフィブロイン水溶液〕
シルクフィブロイン多孔質体の製造に用いるシルクフィブロイン水溶液を得る方法としては、公知のいかなる手法を用いてもよいが、シルクフィブロインは水に対する溶解性が低いため、例えば、前記シルクフィブロインを溶解液に溶解した後、溶解に使用した薬剤を除去する方法が好適である。具体的には、例えば、臭化リチウム水溶液、塩化カルシウム／エタノール水溶液等の中性塩溶液に溶解し、透析により脱塩する手法、過酸化水素水に溶解後、乾熱乾燥し、過酸化水素を除去する方法、銅エチレンジアミンに溶解し、銅イオン乖離剤を添加した後に透析する手法等を使用することができる。これらの中でも、後処理及び分子量調節の容易さから、中性塩溶液に溶解し、脱塩する手法が好ましい。
[Silk fibroin aqueous solution]
As a method for obtaining a silk fibroin aqueous solution used for the production of a silk fibroin porous material, any known method may be used. However, since silk fibroin has low solubility in water, for example, the silk fibroin is dissolved in a solution. Then, a method of removing the drug used for dissolution is preferable. Specifically, for example, a method of dissolving in a neutral salt solution such as an aqueous solution of lithium bromide or an aqueous solution of calcium chloride / ethanol and desalting by dialysis; And a method of dialysis after dissolving in copper ethylenediamine and adding a copper ion dissociator. Among these, the method of dissolving in a neutral salt solution and desalting is preferable because of easy post-treatment and molecular weight adjustment.
使用する中性塩溶液としては、臭化リチウム水溶液、塩化カルシウム／エタノール水溶液が好ましい。中性塩溶液中の中性塩の濃度は、臭化リチウム水溶液の場合、８〜１０ｍｏｌ／Ｌであることが好ましい。また、塩化カルシウム／エタノール水溶液の場合、塩化カルシウムとエタノールと水とをモル比１：２：８で混合した溶液を使用することが好ましい。中性塩の濃度をこの範囲に設定することで、シルクフィブロインを効率良く溶解することができる。 As a neutral salt solution to be used, a lithium bromide aqueous solution and a calcium chloride / ethanol aqueous solution are preferable. In the case of an aqueous lithium bromide solution, the concentration of the neutral salt in the neutral salt solution is preferably 8 to 10 mol / L. In the case of a calcium chloride / ethanol aqueous solution, it is preferable to use a solution in which calcium chloride, ethanol, and water are mixed at a molar ratio of 1: 2: 8. By setting the neutral salt concentration within this range, silk fibroin can be efficiently dissolved.
シルクフィブロインの溶解温度は、シルクフィブロインが溶解する温度であれば特に制限はないが、臭化リチウム水溶液の場合、１０〜４０℃であることが好ましい。また、塩化カルシウム／エタノール水溶液の場合、７０〜９０℃であることが好ましく、７５〜８５℃であることがより好ましい。溶解温度をこの範囲に設定することで、効率良くシルクフィブロインを溶解可能であると共に、シルクフィブロイン多孔質体の形成に適した分子量のシルクフィブロイン水溶液を得ることができる。 The melting temperature of silk fibroin is not particularly limited as long as it is a temperature at which silk fibroin is dissolved, but in the case of an aqueous lithium bromide solution, it is preferably 10 to 40 ° C. Moreover, in the case of calcium chloride / ethanol aqueous solution, it is preferable that it is 70-90 degreeC, and it is more preferable that it is 75-85 degreeC. By setting the dissolution temperature within this range, silk fibroin can be efficiently dissolved, and a silk fibroin aqueous solution having a molecular weight suitable for forming a silk fibroin porous material can be obtained.
シルクフィブロインの溶解時間に特に制限はないが、臭化リチウム水溶液の場合、３時間〜２４時間であることが好ましく、５時間〜１８時間であることがより好ましい。また、塩化カルシウム／エタノール水溶液の場合、１０分〜６０分であることが好ましく、１５分〜４０分であることがより好ましい。溶解時間をこの範囲に設定することで、シルクフィブロインが十分に溶解すると共に、シルクフィブロイン多孔質体の形成に適した分子量のシルクフィブロイン水溶液を得ることができる。 Although there is no restriction | limiting in particular in the melt | dissolution time of silk fibroin, In the case of lithium bromide aqueous solution, it is preferable that it is 3 to 24 hours, and it is more preferable that it is 5 to 18 hours. Moreover, in the case of calcium chloride / ethanol aqueous solution, it is preferably 10 minutes to 60 minutes, and more preferably 15 minutes to 40 minutes. By setting the dissolution time in this range, silk fibroin can be sufficiently dissolved and a silk fibroin aqueous solution having a molecular weight suitable for forming a silk fibroin porous material can be obtained.
シルクフィブロイン水溶液中におけるシルクフィブロインの濃度は、溶解液に溶解可能な濃度であれば特に制限はないが、５０ｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌであることが好ましく、１００ｇ／Ｌ〜１５０ｇ／Ｌであることがより好ましい。シルクフィブロインの濃度をこの範囲に設定することで、シルクフィブロイン多孔質体の作製に適した濃度のシルクフィブロイン水溶液が得られる。シルクフィブロイン水溶液中のシルクフィブロインの濃度調整の方法としては、風乾による濃縮を経る手法が簡便で好ましい。
シルクフィブロインの濃度は、シルクフィブロイン水溶液を容器に入れて完全に乾燥し、その質量減少から次式のように求めることができる。
（シルクフィブロイン濃度（ｇ／Ｌ））＝（シルクフィブロイン水溶液の乾燥後質量（ｇ））／（乾燥前のシルクフィブロイン水溶液の体積（Ｌ））
The concentration of silk fibroin in the silk fibroin aqueous solution is not particularly limited as long as it is a concentration that can be dissolved in the solution, but is preferably 50 g / L to 200 g / L, and preferably 100 g / L to 150 g / L. Is more preferable. By setting the concentration of silk fibroin within this range, a silk fibroin aqueous solution having a concentration suitable for producing a silk fibroin porous material can be obtained. As a method for adjusting the concentration of silk fibroin in the silk fibroin aqueous solution, a method through concentration by air drying is simple and preferable.
The concentration of silk fibroin can be obtained from the mass reduction by putting the silk fibroin aqueous solution in a container and completely drying, as shown in the following equation.
(Silk fibroin concentration (g / L)) = (mass after drying of silk fibroin aqueous solution (g)) / (volume of silk fibroin aqueous solution before drying (L))
脱塩の手法に特に制限はなく、透析膜を使用した透析、限外ろ過等により脱塩することができる。透析膜又は限外ろ過膜の分画分子量は５，０００〜４０，０００であることが好ましく、５，０００〜１０，０００であることがより好ましい。この範囲の分画分子量の透析膜又は限外ろ過膜を使用することで、脱塩効率とシルクフィブロインのロスの少なさとを両立することができる。 There is no particular limitation on the desalting method, and desalting can be performed by dialysis using a dialysis membrane, ultrafiltration, or the like. The fractional molecular weight of the dialysis membrane or ultrafiltration membrane is preferably 5,000 to 40,000, and more preferably 5,000 to 10,000. By using a dialysis membrane or ultrafiltration membrane with a molecular weight cut off in this range, it is possible to achieve both desalting efficiency and low silk fibroin loss.
シルクフィブロイン水溶液中のシルクフィブロインのタンパク質換算分子量は、１６０，０００〜４１０，０００であることが好ましく、２００，０００〜３５０，０００であることがより好ましく、２４０，０００〜３１０，０００であることがさらに好ましい。この範囲の分子量のシルクフィブロインを含むシルクフィブロイン水溶液を使用してシルクフィブロイン多孔質体を作製することで、機械的強度及び柔軟性に優れるシルクフィブロイン多孔質体が得られる。
シルクフィブロイン水溶液中のシルクフィブロインのタンパク質換算分子量は、実施例に記載の方法で測定することができる。
The protein equivalent molecular weight of silk fibroin in the silk fibroin aqueous solution is preferably 160,000 to 410,000, more preferably 200,000 to 350,000, and 240,000 to 310,000. Is more preferable. By producing a silk fibroin porous body using a silk fibroin aqueous solution containing silk fibroin having a molecular weight in this range, a silk fibroin porous body having excellent mechanical strength and flexibility can be obtained.
The protein-converted molecular weight of silk fibroin in the silk fibroin aqueous solution can be measured by the method described in the examples.
また、シルクフィブロイン多孔質体は、シルクフィブロイン水溶液に特定の添加剤を加えて、該水溶液を凍結させ、次いで、融解させることにより製造することが好ましい。 The silk fibroin porous body is preferably produced by adding a specific additive to a silk fibroin aqueous solution, freezing the aqueous solution, and then melting the aqueous solution.
（添加剤）
前記添加剤としては、カルボン酸類、アミノ酸、水溶性液状有機物質等が好ましく挙げられる。また、シルクフィブロイン多孔質体の製造において用いられるカルボン酸類としては、ｐＫａが、５．０以下のものが好ましく、３．０〜５．０のものがより好ましく、３．５〜５．０のものがさらに好ましい。
(Additive)
Preferred examples of the additive include carboxylic acids, amino acids, and water-soluble liquid organic substances. Moreover, as carboxylic acid used in manufacture of a silk fibroin porous body, pKa is preferably 5.0 or less, more preferably 3.0 to 5.0, and 3.5 to 5.0. More preferred.
カルボン酸類としては、少なくとも分子中に一つのカルボキシ基を有する有機酸であれば特に制限はないが、例えば、モノカルボン酸、ジカルボン酸、トリカルボン酸等が挙げられる。カルボン酸類としては、脂肪族カルボン酸類が好ましく、炭素数１〜６の脂肪族カルボン酸がより好ましく、炭素数２〜５の脂肪族カルボン酸がさらに好ましい。これらの脂肪族カルボン酸は飽和であってもよく、不飽和であってもよい。このようなカルボン酸として、具体的には、例えば、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、乳酸、アクリル酸、２−ブテン酸等のモノカルボン酸；シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸等のジカルボン酸などが好ましく挙げられる。これらは単独で、又は複数種を組み合わせて用いることができる。人体への安全性を考慮すると、酢酸、乳酸及びコハク酸がより好ましい。 The carboxylic acids are not particularly limited as long as they are organic acids having at least one carboxy group in the molecule, and examples thereof include monocarboxylic acids, dicarboxylic acids, and tricarboxylic acids. As the carboxylic acids, aliphatic carboxylic acids are preferable, aliphatic carboxylic acids having 1 to 6 carbon atoms are more preferable, and aliphatic carboxylic acids having 2 to 5 carbon atoms are more preferable. These aliphatic carboxylic acids may be saturated or unsaturated. Specific examples of such carboxylic acids include monocarboxylic acids such as formic acid, acetic acid, propionic acid, butyric acid, lactic acid, acrylic acid, and 2-butenoic acid; oxalic acid, malonic acid, succinic acid, maleic acid, and the like. Of these, dicarboxylic acids are preferred. These can be used alone or in combination of two or more. In view of safety to the human body, acetic acid, lactic acid and succinic acid are more preferable.
前記アミノ酸としては、特に制限はなく、例えば、バリン、ロイシン、イソロイシン、グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、メチオニン等のモノアミノカルボン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸等のモノアミノジカルボン酸（酸性アミノ酸）などの脂肪族アミノ酸；フェニルアラニン等の芳香族アミノ酸；ヒドロキシプロリン等の複素環を有するアミノ酸などが好ましく挙げられ、中でも形状の調整が容易な観点から、酸性アミノ酸、及びヒドロキシプロリン、セリン、スレオニン等のオキシアミノ酸が好ましい。同様の観点から、酸性アミノ酸の中でもモノアミノカルボン酸がより好ましく、アスパラギン酸及びグルタミン酸が特に好ましく、オキシアミノ酸の中でもヒドロキシプロリンがより好ましい。これらのアミノ酸は、いずれか１種を単独で、又は２種以上組み合わせて使用することができる。
なお、アミノ酸には、Ｌ型とＤ型の光学異性体があるが、Ｌ型とＤ型を用いた場合に、得られる多孔質体に違いが見られないため、どちらのアミノ酸を用いてもよい。
The amino acid is not particularly limited, and examples thereof include monoaminocarboxylic acids such as valine, leucine, isoleucine, glycine, alanine, serine, threonine, and methionine, and monoaminodicarboxylic acids (acidic amino acids) such as aspartic acid and glutamic acid. Preferred examples include aliphatic amino acids; aromatic amino acids such as phenylalanine; and amino acids having a heterocyclic ring such as hydroxyproline. Among these, acidic amino acids and oxyamino acids such as hydroxyproline, serine, and threonine are particularly preferred from the viewpoint of easy shape adjustment. Is preferred. From the same viewpoint, monoaminocarboxylic acid is more preferable among acidic amino acids, aspartic acid and glutamic acid are particularly preferable, and hydroxyproline is more preferable among oxyamino acids. These amino acids can be used alone or in combination of two or more.
Amino acids include L-type and D-type optical isomers, but when L-type and D-type are used, there is no difference in the resulting porous material. Good.
前記水溶性液状有機物質は、常温（２０℃）で液状であり、常温（２０℃）で水と混合した際に、分離せずに溶解、又は混和するものをいう。水溶性液状有機物質としては、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール等のアルコール類；グリセリン、プロピレングリコール等の多価アルコール類；ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ピリジン、アセトン、アセトニトリルなどが好ましく挙げられる。これらは単独で、又は複数種を組み合わせて用いることができる。人体への安全性を考慮すると、エタノール、ジメチルスルホキシド、グリセリン及びアセトンが好ましく、エタノール及びグリセリンがより好ましい。 The water-soluble liquid organic substance is liquid at room temperature (20 ° C.) and is dissolved or mixed without separation when mixed with water at room temperature (20 ° C.). Examples of water-soluble liquid organic substances include alcohols such as methanol, ethanol, isopropanol, and butanol; polyhydric alcohols such as glycerin and propylene glycol; dimethyl sulfoxide (DMSO), dimethylformamide (DMF), pyridine, acetone, and acetonitrile. Etc. are preferred. These can be used alone or in combination of two or more. In consideration of safety to the human body, ethanol, dimethyl sulfoxide, glycerin and acetone are preferable, and ethanol and glycerin are more preferable.
シルクフィブロイン水溶液に添加剤を用いる場合の添加剤の含有量は、０．１〜１８体積％であることが好ましく、０．１〜５．０体積％であることがより好ましく、０．５〜４．０体積％であることがさらに好ましい。添加剤の含有量をこの範囲内に設定することで、十分な機械的強度を有するシルクフィブロイン多孔質体を製造することができる。 When the additive is used in the silk fibroin aqueous solution, the content of the additive is preferably 0.1 to 18% by volume, more preferably 0.1 to 5.0% by volume, More preferably, it is 4.0 volume%. By setting the content of the additive within this range, a silk fibroin porous material having sufficient mechanical strength can be produced.
シルクフィブロイン多孔質体は、例えば、前記シルクフィブロイン水溶液を型又は容器に流し込み、一定時間凍結した後に融解することで好適に得られる。
凍結温度としては、−１０〜−３０℃が好ましく、−１５〜−２５℃がより好ましい。凍結時間としては、添加剤を加えたシルクフィブロイン水溶液が十分に凍結し、かつ凍結状態を一定時間保持できるよう、４時間以上であることが好ましく、６時間以上であることがより好ましい。また、特に−１５〜−２５℃の温度条件下、６時間から１００時間保持して凍結することが機械的強度に優れるシルクフィブロイン多孔質体を再現良く形成する観点から好ましい。
The silk fibroin porous material can be suitably obtained by, for example, pouring the silk fibroin aqueous solution into a mold or container, freezing it for a certain time, and then thawing it.
The freezing temperature is preferably −10 to −30 ° C., more preferably −15 to −25 ° C. The freezing time is preferably 4 hours or more, and more preferably 6 hours or more so that the silk fibroin aqueous solution to which the additive is added can be sufficiently frozen and kept in a frozen state for a certain time. In particular, it is preferable that the silk fibroin porous material having excellent mechanical strength is reproducibly formed by freezing by holding for 6 to 100 hours under a temperature condition of -15 to -25 ° C.
ここで、前記シルクフィブロイン水溶液を一気に凍結温度まで下げて凍結してもよいが、凍結の前に過冷却状態を経ることが、均一な構造のシルクフィブロイン多孔質体を得る上で好ましい。例えば、添加剤を加えたシルクフィブロイン水溶液を一旦、−５℃で２時間保持して、その後、凍結温度まで下げて凍結することで、均一な構造のシルクフィブロイン多孔質体を得ることができる。 Here, the silk fibroin aqueous solution may be frozen at a freezing temperature at a stretch, but it is preferable to pass a supercooled state before freezing in order to obtain a silk fibroin porous body having a uniform structure. For example, a silk fibroin porous material having a uniform structure can be obtained by temporarily holding a silk fibroin aqueous solution to which an additive has been added at −5 ° C. for 2 hours and then freezing it to a freezing temperature.
上記の手法でシルクフィブロイン水溶液を凍結させた後、次いで、融解することによって、シルクフィブロイン多孔質体が得られる。融解の方法としては、特に制限はなく、自然融解、恒温槽での保管等の方法が好ましく挙げられる。 The silk fibroin porous material is obtained by freezing the silk fibroin aqueous solution by the above method and then thawing it. There is no restriction | limiting in particular as a melting method, Methods, such as natural melting and storage in a thermostat, are mentioned preferably.
上記のようにして得られたシルクフィブロイン多孔質体には添加剤が残存する。残存する添加剤は用途に応じてそのままの状態としてもよいし、除去してもよい。添加剤をシルクフィブロイン多孔質体から除去する方法としては、例えば、シルクフィブロイン多孔質体を純水中に浸漬して除去することが最も簡便な方法として挙げられる。 Additives remain in the silk fibroin porous material obtained as described above. The remaining additive may be left as it is or may be removed depending on the application. As a method for removing the additive from the silk fibroin porous material, for example, the simplest method is to immerse and remove the silk fibroin porous material in pure water.
このようにして得られたシルクフィブロイン多孔質体は吸水した状態である。乾燥状態のシルクフィブロイン多孔質体が必要な場合、吸水状態のシルクフィブロイン多孔質体を乾燥すればよい。シルクフィブロイン多孔質体の乾燥の手法としては特に制限はないが、収縮を抑えるという意味で凍結乾燥が好ましい。凍結乾燥の場合、水分を完全に昇華させずに乾燥を終えると、残った氷が融解して水になり、その表面張力の影響で空孔が潰れてしまうため、水分が完全に昇華するまで乾燥することが好ましい。 The silk fibroin porous material thus obtained is in a state of absorbing water. When the dried silk fibroin porous material is required, the water-absorbed silk fibroin porous material may be dried. The technique for drying the silk fibroin porous material is not particularly limited, but lyophilization is preferred in the sense of suppressing shrinkage. In the case of freeze-drying, if the drying is finished without completely sublimating the water, the remaining ice melts into water, and the pores are crushed due to the surface tension, so the water is completely sublimated. It is preferable to dry.
また、凍結乾燥の際、予めシルクフィブロイン多孔質体をグリセリン水溶液に浸漬することが、乾燥時のひび割れを防止すると共に、乾燥後にも柔軟な多孔質体が得られる観点から好ましい。
この場合、シルクフィブロイン多孔質体を浸漬するグリセリン水溶液におけるグリセリンの濃度は、０．５〜１０体積％が好ましく、１〜８体積％がより好ましく、１．５〜６体積％がさらに好ましい。グリセリン濃度をこの範囲に設定することで、質感が良く、ひび割れの無い乾燥シルクフィブロイン多孔質体を得ることができる。このようにして得られる乾燥シルクフィブロイン多孔質体はグリセリンを含有することを特徴とする。
In addition, it is preferable to immerse the silk fibroin porous body in an aqueous glycerin solution at the time of freeze-drying from the viewpoint of preventing cracks during drying and obtaining a flexible porous body after drying.
In this case, the concentration of glycerin in the glycerin aqueous solution in which the silk fibroin porous material is immersed is preferably 0.5 to 10% by volume, more preferably 1 to 8% by volume, and even more preferably 1.5 to 6% by volume. By setting the glycerin concentration within this range, it is possible to obtain a dry silk fibroin porous material with good texture and no cracks. The dry silk fibroin porous material obtained in this way is characterized by containing glycerin.
乾燥シルクフィブロイン多孔質体中のグリセリンの含有量は、２０〜７０質量％であることが好ましく、２５〜６０質量％であることがより好ましく、３０〜５０質量％であることがさらに好ましい。グリセリンの含有量をこの範囲とすることで、乾燥シルクフィブロイン多孔質体に適度な柔軟性を付与することができる。
乾燥シルクフィブロイン多孔質体中のグリセリンの含有量（質量％）は、乾燥シルクフィブロイン多孔質体に導入されたグリセリンの質量を、グリセリンが導入された後の乾燥シルクフィブロイン多孔質体の質量で割ったものとし、以下の式で算出した。
（乾燥シルクフィブロイン多孔質体中のグリセリンの含有量（質量％））＝（（グリセリンを導入した乾燥シルクフィブロイン多孔質体の質量）−（グリセリンを未導入の乾燥シルクフィブロイン多孔質体の質量））／（グリセリンを導入後の乾燥シルクフィブロイン多孔質体の質量）×１００
The content of glycerin in the dried silk fibroin porous body is preferably 20 to 70% by mass, more preferably 25 to 60% by mass, and further preferably 30 to 50% by mass. By setting the content of glycerin within this range, moderate flexibility can be imparted to the dried silk fibroin porous material.
The content (mass%) of glycerin in the dried silk fibroin porous material is obtained by dividing the mass of glycerin introduced into the dried silk fibroin porous material by the mass of the dried silk fibroin porous material after the glycerin is introduced. And calculated by the following formula.
(Content of glycerin in dry silk fibroin porous material (% by mass)) = ((mass of dry silk fibroin porous material into which glycerin has been introduced) − (mass of dry silk fibroin porous material into which glycerin has not been introduced) ) / (Mass of dried silk fibroin porous material after introduction of glycerin) × 100
上記のようにして得られた乾燥シルクフィブロイン多孔質体は、水分を実質的に含まないものである。シルクフィブロイン多孔質体は、シルクフィブロイン水溶液を凍結し、融解して得られるので、通常、細孔部に水分等が存在した状態となっている。通常のシルクフィブロイン多孔質体と乾燥シルクフィブロイン多孔質体とは、細孔部に存在する水等の量の点で状態は異なるものとなる。 The dried silk fibroin porous material obtained as described above is substantially free of moisture. Since the silk fibroin porous material is obtained by freezing and thawing a silk fibroin aqueous solution, it is usually in a state where moisture or the like is present in the pores. A normal silk fibroin porous body and a dried silk fibroin porous body are different in terms of the amount of water or the like present in the pores.
シルクフィブロイン多孔質体は、シルクフィブロイン水溶液を流し込む容器を適宜選択することにより、シート状、ブロック状、管状等、目的に応じた形状とすることができる。
また、原料として用いるシルクフィブロイン及び添加剤の種類及び添加量を調節することで、シルクフィブロイン多孔質体の内部構造と固さを調整することができ、種々の固さを有するゲル状、シート状又はブロック状のシルクフィブロイン多孔質体を得ることができる。
The silk fibroin porous material can be made into a shape according to the purpose such as a sheet shape, a block shape, a tubular shape, etc. by appropriately selecting a container into which the silk fibroin aqueous solution is poured.
In addition, the internal structure and hardness of the silk fibroin porous material can be adjusted by adjusting the type and amount of the silk fibroin and additive used as raw materials. Alternatively, a block-like silk fibroin porous body can be obtained.
本発明の止血材は、必要な大きさに加工したフィブロイン多孔質体をそのまま用いてもよく、シート状のフィブロイン多孔質体を、ドレッシングフィルム、包帯、粘着テープ等で固定する形態で用いてもよい。
フィブロイン多孔質体は、乾燥状態でも柔らかいため、そのまま用いることもできるし、また、保湿剤を含ませて用いることもできる。保湿剤としては、グリセリン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール等を使用することができる。なお、保湿剤を含ませた状態の場合には、使用直前まで、水分量を保った状態で、乾燥を防ぐように密閉状態にしておくことが好ましい。
The hemostatic material of the present invention may be a fibroin porous material processed to a required size as it is, or may be used in a form in which a sheet-like fibroin porous material is fixed with a dressing film, a bandage, an adhesive tape or the like. Good.
Since the fibroin porous material is soft even in a dry state, it can be used as it is, or it can be used by adding a humectant. As the humectant, glycerin, polyvinyl pyrrolidone, polyvinyl alcohol, polyethylene glycol and the like can be used. In the case where the moisturizing agent is included, it is preferable that the moisture content is kept until just before use in a sealed state so as to prevent drying.
本発明の止血材として、フィブロイン多孔質体からなる多孔質層と、その一方の面のみに細孔を有しないフィルム層を有するフィブロイン多孔質体を用いてもよい。その場合、止血部に多孔質層が接し、止血部とは反対側の対向面にフィルム層が存在する状態で使用することが好ましい。このような方法で使用することにより、多孔質層による止血効果と機械的強度とを高度に両立させることができる。なお、フィルム層の細孔の数は制御することができ、必要に応じて少量の細孔を有するフィルム層とすることもできる。 As the hemostatic material of the present invention, a fibroin porous body having a porous layer composed of a fibroin porous body and a film layer having no pores only on one surface thereof may be used. In that case, the porous layer is preferably in contact with the hemostatic part, and the film layer is preferably present on the opposite surface opposite to the hemostatic part. By using it in such a method, the hemostatic effect and mechanical strength by the porous layer can be made highly compatible. In addition, the number of pores of the film layer can be controlled, and a film layer having a small amount of pores can be formed as necessary.
以下に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例によってなんら限定されるものではない。
なお、以下の実施例において、フィブロイン原料のタンパク質換算分子量を測定するために調製したフィブロイン水溶液を「フィブロイン水溶液（Ａ）」と称し、フィブロイン多孔質体の作製に用いるフィブロイン水溶液を「フィブロイン水溶液（Ｂ）」と称し、フィブロイン多孔質体に含まれるフィブロインのタンパク質換算分子量を測定するために調製したフィブロイン水溶液を「フィブロイン水溶液（Ｃ）」と称する。
また、フィブロインのタンパク質換算分子量は以下の方法により測定した。
EXAMPLES The present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples.
In the following examples, the fibroin aqueous solution prepared for measuring the protein-converted molecular weight of the fibroin raw material is referred to as “fibroin aqueous solution (A)”, and the fibroin aqueous solution used for the production of the fibroin porous material is referred to as “fibroin aqueous solution (B). The fibroin aqueous solution prepared for measuring the protein-converted molecular weight of fibroin contained in the fibroin porous material is referred to as “fibroin aqueous solution (C)”.
Moreover, the protein conversion molecular weight of fibroin was measured by the following method.
〔フィブロイン原料の分子量測定準備〕
フィブロイン原料のタンパク質換算分子量を測定するために、まず下記の手法でフィブロイン水溶液（Ａ）を調製した。
フィブロイン原料を２０℃の９ｍｏｌ／Ｌ臭化リチウム水溶液に濃度が１００ｇ／Ｌになるよう投入し、１０時間攪拌することで完全に溶解した。次いで、溶解液を遠心分離（回転数：１２，０００ｍｉｎ−１、５分間）して、デカンテーションで沈殿物を除去した後、透析チューブ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．製、商品名：Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ １ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｍｅｍｂｒａｎｅ、ＭＷＣＯ６，０００−８，０００）に注入し、超純水製造装置（ＰＲＯ−０５００及びＦＰＣ−０５００（以上、型番）、オルガノ株式会社製）から採水した超純水５Ｌに対して１２時間の透析を５回繰り返して脱塩した。次に、得られた溶液を再度遠心分離（回転数：１２，０００ｍｉｎ−１、３０分間）することで、フィブロイン水溶液（Ａ）を得た。フィブロイン水溶液（Ａ）中におけるフィブロイン濃度を前述の方法により測定した。得られたフィブロイン水溶液（Ａ）をフィブロイン原料の分子量測定溶液とした。
[Preparation of molecular weight of fibroin raw material]
In order to measure the protein equivalent molecular weight of the fibroin raw material, first, an aqueous fibroin solution (A) was prepared by the following method.
The fibroin raw material was poured into a 9 mol / L lithium bromide aqueous solution at 20 ° C. so as to have a concentration of 100 g / L, and completely dissolved by stirring for 10 hours. Next, the lysate was centrifuged (rotation speed: 12,000 min −1 , 5 minutes), the precipitate was removed by decantation, and then a dialysis tube (manufactured by Spectrum Laboratories, Inc., trade name: Spectra / Por 1). Injecting into Dialysis Membrane, MWCO 6,000-8,000), for ultrapure water 5L sampled from ultrapure water production equipment (PRO-0500 and FPC-0500 (above, model number), manufactured by Organo Corporation) The dialysis for 12 hours was repeated 5 times for desalting. Next, the obtained solution was centrifuged again (rotation speed: 12,000 min −1 , 30 minutes) to obtain an aqueous fibroin solution (A). The fibroin concentration in the aqueous fibroin solution (A) was measured by the method described above. The obtained fibroin aqueous solution (A) was used as a molecular weight measurement solution of a fibroin raw material.
〔フィブロイン水溶液（Ｂ）のタンパク質換算分子量の測定準備〕
フィブロイン水溶液（Ｂ）は、後述の実施例に記載の方法により調製し、分子量測定溶液とした。
[Preparation for measurement of protein equivalent molecular weight of aqueous fibroin solution (B)]
The aqueous fibroin solution (B) was prepared by the method described in the examples below and used as a molecular weight measurement solution.
〔フィブロイン多孔質体に含まれるフィブロインの分子量測定準備〕
フィブロイン多孔質体に含まれるフィブロインの分子量を測定するために、下記の手法でフィブロイン水溶液（Ｃ）を調製した。
フィブロイン多孔質体を２０℃の９ｍｏｌ／Ｌ臭化リチウム水溶液に濃度が１００ｇ／Ｌになるよう投入し、１０時間攪拌することで完全に溶解した。次いで、溶解液を遠心分離（回転数：１２，０００ｍｉｎ−１、５分間）して、デカンテーションで沈殿物を除去した後、透析チューブ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．製、商品名：Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ １ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｍｅｍｂｒａｎｅ、ＭＷＣＯ６，０００−８，０００）に注入し、超純水製造装置（ＰＲＯ−０５００及びＦＰＣ−０５００（以上、型番）、オルガノ株式会社製）から採水した超純水５Ｌに対して１２時間の透析を５回繰り返して脱塩した。次に、得られた溶液を再度遠心分離（回転数：１２，０００ｍｉｎ―１、３０分間）することでフィブロイン水溶液（Ｃ）を得た。フィブロイン水溶液（Ｃ）中におけるフィブロイン濃度を前述の方法により測定した。得られたフィブロイン水溶液（Ｃ）をフィブロイン多孔質体に含まれるフィブロインの分子量測定溶液とした。
[Preparation of molecular weight measurement of fibroin contained in fibroin porous material]
In order to measure the molecular weight of fibroin contained in the fibroin porous material, an aqueous fibroin solution (C) was prepared by the following method.
The fibroin porous material was poured into a 9 mol / L lithium bromide aqueous solution at 20 ° C. to a concentration of 100 g / L and completely dissolved by stirring for 10 hours. Next, the lysate was centrifuged (rotation speed: 12,000 min −1 , 5 minutes), the precipitate was removed by decantation, and then a dialysis tube (manufactured by Spectrum Laboratories, Inc., trade name: Spectra / Por 1). Injecting into Dialysis Membrane, MWCO 6,000-8,000), for ultrapure water 5L sampled from ultrapure water production equipment (PRO-0500 and FPC-0500 (above, model number), manufactured by Organo Corporation) The dialysis for 12 hours was repeated 5 times for desalting. Next, the resulting solution was centrifuged again (rotation speed: 12,000 min −1 , 30 minutes) to obtain an aqueous fibroin solution (C). The fibroin concentration in the fibroin aqueous solution (C) was measured by the method described above. The obtained fibroin aqueous solution (C) was used as a molecular weight measurement solution for fibroin contained in the fibroin porous material.
〔移動相の調製〕
ガラスビーカーに超純水を７００ｍＬ入れ、そこに硫酸ナトリウム（無水物、和光純薬工業株式会社製、試薬特級）１４．２ｇと尿素（和光純薬工業株式会社製、試薬特級）１２０．１ｇを加えて得た溶液をビーカーごと超音波洗浄機に漬けて超音波処理し、完全に溶解させた。この溶液にさらにリン酸緩衝剤粉末（１．１５ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．０、和光純薬工業株式会社製、生化学用）２０ｇを加え、再度超音波処理をして溶解した。次いで、溶解後の溶液をメスフラスコに移し、１Ｌにメスアップした後に攪拌して均一な溶液とした。この溶液を分子量測定に使用する移動相とした。
(Preparation of mobile phase)
Put 700 mL of ultrapure water in a glass beaker, and put sodium sulfate (anhydride, Wako Pure Chemical Industries, Ltd., reagent special grade) 14.2 g and urea (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., reagent special grade) 120.1 g. The solution thus obtained was immersed in an ultrasonic cleaner with a beaker and subjected to ultrasonic treatment to completely dissolve the solution. 20 g of phosphate buffer powder (1.15 mol / L, pH 7.0, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., for biochemistry) was further added to this solution, and ultrasonic treatment was performed again to dissolve. Next, the solution after dissolution was transferred to a measuring flask, made up to 1 L, and stirred to obtain a uniform solution. This solution was used as a mobile phase used for molecular weight measurement.
〔タンパク質換算分子量の測定〕
フィブロイン原料のタンパク質換算分子量を測定する場合はフィブロイン水溶液（Ａ）を、フィブロイン水溶液（Ｂ）に含まれるフィブロインのタンパク質換算分子量を測定する場合はフィブロイン水溶液（Ｂ）自体を、フィブロイン多孔質体に含まれるフィブロインのタンパク質換算分子量を測定する場合はフィブロイン水溶液（Ｃ）を用いて、下記の方法により、それぞれのタンパク質換算分子量を測定した。
以下、フィブロイン水溶液（Ａ）〜（Ｃ）を「分子量測定溶液」と称する。
分子量測定溶液にフィブロイン濃度が１０ｇ／Ｌになるよう超純水を加えて混合し、続いてそこに移動相を加えて５倍に希釈し、得られた溶液を０．４５μｍのフィルタ（東洋濾紙株式会社製、商品名：２５ＨＰ０４５ＡＮ）に通してろ過し、クロマトグラフ評価試料とした。
測定には高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）本体（株式会社日立ハイテクノロジーズ製、商品名：Ｃｈｒｏｍａｓｔｅｒ（登録商標））と、そのオプションであるＵＶ検出器（株式会社日立ハイテクノロジーズ製、型番：５４１０）、ポンプ（株式会社日立ハイテクノロジーズ製、型番：５１１０）、オートサンプラ（株式会社日立ハイテクノロジーズ製、型番：５２１０）、カラムオーブン（株式会社日立ハイテクノロジーズ製、型番：５３１０）に加え、カラム（昭和電工株式会社製、商品名：ＳＨＯＤＥＸ（登録商標） ＰＲＯＴＥＩＮ ＫＷ−８０４）を組み合わせたＨＰＬＣ装置を使用した。測定条件は移動相流量０．５ｍＬ／ｓｅｃ、カラム温度３０℃、検出波長ＵＶ２２０ｎｍとした。
得られたクロマトグラムをタンパク質分子量に換算するための較正曲線の作成には、分子量マーカーとしてＨＰＬＣ用分子量マーカータンパク質である酵母由来グルタミン酸脱水素酵素（分子量：２９０，０００、Ｏｒｉｅｎｔａｌ Ｙｅａｓｔ Ｃｏ．，ＬＴＤ．製、商品名：ＭＷ−Ｍａｒｋｅｒ（ＨＰＬＣ））、豚心筋由来乳酸脱水素酵素（分子量：１４２，０００、Ｏｒｉｅｎｔａｌ Ｙｅａｓｔ Ｃｏ．，ＬＴＤ製、商品名：ＭＷ−Ｍａｒｋｅｒ（ＨＰＬＣ））、酵母由来エノラーゼ（分子量：６７，０００、Ｏｒｉｅｎｔａｌ Ｙｅａｓｔ Ｃｏ．，ＬＴＤ製、商品名：ＭＷ−Ｍａｒｋｅｒ（ＨＰＬＣ））を使用した。
ＨＰＬＣ装置に移動相を１時間流しベースラインが安定するのを待った。ベースライン安定後に、各分子量マーカーが水溶液中でそれぞれ０．０５質量％となるように溶解した分子量マーカー水溶液を２２μＬ注入して、得られたクロマトグラムのピークトップと分子量マーカーの分子量から較正曲線を作成した。較正曲線を図１に示す。次いで、クロマトグラフ評価試料を２２μＬ注入して得られるクロマトグラムのピークトップの位置から較正曲線を使用してフィブロインのタンパク質換算分子量を測定した。
[Measurement of protein equivalent molecular weight]
When measuring the protein equivalent molecular weight of the fibroin raw material, the fibroin aqueous solution (A) is contained in the fibroin porous material, and when measuring the protein equivalent molecular weight of fibroin contained in the fibroin aqueous solution (B), the fibroin aqueous solution (B) itself is contained in the fibroin porous material. When measuring the protein-equivalent molecular weight of fibroin, each protein-equivalent molecular weight was measured by the following method using an aqueous fibroin solution (C).
Hereinafter, the fibroin aqueous solutions (A) to (C) are referred to as “molecular weight measurement solutions”.
To the molecular weight measurement solution, ultrapure water is added and mixed so that the fibroin concentration becomes 10 g / L, and then the mobile phase is added thereto to dilute it 5 times. The resulting solution is filtered with a 0.45 μm filter (Toyo Roshi). The product was filtered through a trade name, 25HP045AN, manufactured by Co., Ltd., and used as a chromatographic evaluation sample.
For the measurement, a high-performance liquid chromatograph (HPLC) main body (manufactured by Hitachi High-Technologies Corporation, trade name: Chromamaster (registered trademark)) and an optional UV detector (manufactured by Hitachi High-Technologies Corporation, model number: 5410), In addition to pumps (manufactured by Hitachi High-Technologies Corporation, model number: 5110), autosamplers (manufactured by Hitachi High-Technologies Corporation, model number: 5210), column ovens (manufactured by Hitachi High-Technologies Corporation, model number: 5310), columns (Showa Denko) The HPLC apparatus which combined the product name, SHODEX (trademark) PROTEIN KW-804) by the corporation | Co., Ltd. | KK was used. The measurement conditions were a mobile phase flow rate of 0.5 mL / sec, a column temperature of 30 ° C., and a detection wavelength of UV 220 nm.
In order to prepare a calibration curve for converting the obtained chromatogram into protein molecular weight, yeast-derived glutamate dehydrogenase (molecular weight: 290,000, Oriental Yeast Co., LTD. Manufactured, trade name: MW-Marker (HPLC)), porcine myocardium-derived lactate dehydrogenase (molecular weight: 142,000, manufactured by Oriental Yeast Co., LTD, trade name: MW-Marker (HPLC)), yeast-derived enolase ( Molecular weight: 67,000, manufactured by Oriental Yeast Co., LTD, trade name: MW-Marker (HPLC)) was used.
The mobile phase was passed through the HPLC apparatus for 1 hour and waited for the baseline to stabilize. After the baseline was stabilized, 22 μL of an aqueous solution of molecular weight marker dissolved so that each molecular weight marker was 0.05% by mass in the aqueous solution was injected, and a calibration curve was calculated from the peak top of the obtained chromatogram and the molecular weight of the molecular weight marker. Created. The calibration curve is shown in FIG. Subsequently, the protein equivalent molecular weight of fibroin was measured using the calibration curve from the position of the peak top of the chromatogram obtained by injecting 22 μL of the chromatographic evaluation sample.
［フィブロイン多孔質体の製造］
実施例１
（アルカリ精練）
炭酸ナトリウム水溶液２Ｌを精練液として使用し、表１に記載の条件で切繭の精練を行った。精練容器には３Ｌのガラスビーカーを使用し、精練の加熱はホットスターラー（アズワン株式会社製、商品名：ＣＴ−５ＨＴ）をＫ熱電対で温度制御しながら行い、攪拌はガラス棒で適宜行った。得られた精練後の切繭を６０℃のお湯で十分に洗浄した後に、純水でも洗浄を行った。洗浄後の切繭を２４℃の室内で２週間かけて自然乾燥し、完全に乾燥させて、フィブロイン原料とした。次いで、練減率を下記式に従って算出した。結果を表１に示す。
練減率（質量％）＝（精練前質量−精練後質量）÷精練前質量×１００
また、得られたフィブロイン原料を用いて、前述の方法でフィブロイン水溶液（Ａ）を調製し、フィブロイン原料のタンパク質換算分子量を測定した結果を表１に示す。
[Production of porous fibroin]
Example 1
(Alkali scouring)
2 L of sodium carbonate aqueous solution was used as a scouring solution, and scouring of sardines was performed under the conditions shown in Table 1. A 3 L glass beaker was used for the scouring container, and heating of scouring was performed while controlling the temperature of a hot stirrer (manufactured by As One Co., Ltd., trade name: CT-5HT) with a K thermocouple, and stirring was appropriately performed with a glass rod. . The obtained scoured slag was thoroughly washed with hot water at 60 ° C. and then washed with pure water. The washed cuttings were naturally dried in a room at 24 ° C. for 2 weeks and completely dried to obtain a fibroin raw material. Next, the reduction rate was calculated according to the following formula. The results are shown in Table 1.
Reduction rate (% by mass) = (mass before scouring−mass after scouring) ÷ mass before scouring × 100
In addition, Table 1 shows the results of preparing the fibroin aqueous solution (A) by the above-described method using the obtained fibroin raw material and measuring the protein equivalent molecular weight of the fibroin raw material.
（フィブロイン水溶液（Ｂ）の調製）
フィブロイン水溶液（Ｂ）を調製するにあたって、まず、上記のアルカリ精練を行って得られたシルクフィブロイン原料を、２０℃の９ｍｏｌ／Ｌ臭化リチウム水溶液１Ｌに濃度が１００ｇ／Ｌになるよう投入し、１０時間攪拌することで完全に溶解した。次いで、溶解液を遠心分離（回転数：１２，０００ｍｉｎ−１、５分間）して、デカンテーションで沈殿物を除去した後、透析チューブ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．製、商品名：Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標） １ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｍｅｍｂｒａｎｅ、ＭＷＣＯ６，０００−８，０００）に注入し、超純水製造装置（ＰＲＯ−０５００及びＦＰＣ−０５００（以上、型番）、オルガノ株式会社製、）から採水した超純水５Ｌに対して１２時間の透析を５回繰り返して脱塩した。次に、得られた溶液を再度遠心分離（回転数：１２，０００ｍｉｎ−１、３０分間）することでフィブロイン水溶液（Ｂ）を得た。フィブロイン水溶液（Ｂ）中におけるフィブロイン濃度を前述の方法により測定した。
また、前述の方法でフィブロイン水溶液（Ｂ）中のフィブロインのタンパク質換算分子量を測定した結果を表１に示す。
(Preparation of aqueous fibroin solution (B))
In preparing the fibroin aqueous solution (B), first, the silk fibroin raw material obtained by performing the above alkali scouring is added to 1 L of a 9 mol / L lithium bromide aqueous solution at 20 ° C. so that the concentration becomes 100 g / L. It was completely dissolved by stirring for 10 hours. Next, the lysate was centrifuged (rotation speed: 12,000 min −1 , 5 minutes), the precipitate was removed by decantation, and then a dialysis tube (manufactured by Spectrum Laboratories, Inc., trade name: Spectra / Por ( (Registered trademark) 1 Dialysis Membrane, MWCO 6,000-8,000), and ultrapure water collected from ultrapure water production equipment (PRO-0500 and FPC-0500 (above, model number), manufactured by Organo Corporation) Desalting was performed by repeating dialysis for 12 hours against 5 L of water 5 times. Next, the obtained solution was centrifuged again (rotation speed: 12,000 min −1 , 30 minutes) to obtain an aqueous fibroin solution (B). The fibroin concentration in the aqueous fibroin solution (B) was measured by the method described above.
Table 1 shows the results of measuring the protein-equivalent molecular weight of fibroin in the fibroin aqueous solution (B) by the above-described method.
（フィブロイン多孔質体の作製）
フィブロイン水溶液（Ｂ）に、フィブロイン濃度３０ｇ／Ｌ、酢酸濃度２．０％（ｖ／ｖ）となるように酢酸及び超純水を加えた。次に、得られた溶液をアルミ板で作製した型（内側サイズ；４００ｍｍ×３００ｍｍ×１０ｍｍ）に流し込み、予め−５℃に冷却しておいた液冷式低温恒温槽（株式会社前川製作所製）に入れて−５℃で２時間静置した。冷媒としてはナイブライン（登録商標）Ｚ１（株式会社ＭＯＲＥＳＣＯ製、商品名）を使用した。その後、−３℃／時間の速度で−２０℃まで冷却し、そのままの温度で５時間保持して凍結した。
凍結した試料を自然解凍で室温に戻し、型から取り出した後、超純水に浸漬し、超純水を１日２回、３日間交換することによって、使用した酢酸を除去し、フィブロイン多孔質体を得た。得られたフィブロイン多孔質体に含まれるフィブロインのタンパク質換算分子量を前述の方法で測定した結果を表１に示す。
(Production of porous fibroin)
Acetic acid and ultrapure water were added to the fibroin aqueous solution (B) so that the fibroin concentration was 30 g / L and the acetic acid concentration was 2.0% (v / v). Next, the obtained solution was poured into a mold made of an aluminum plate (inside size: 400 mm × 300 mm × 10 mm) and cooled to −5 ° C. in advance. And allowed to stand at −5 ° C. for 2 hours. Nybrine (registered trademark) Z1 (trade name, manufactured by MORESCO Co., Ltd.) was used as the refrigerant. Then, it cooled to -20 degreeC with the speed | rate of -3 degreeC / hour, and hold | maintained at the same temperature for 5 hours, and frozen.
The frozen sample is returned to room temperature by natural thawing, removed from the mold, immersed in ultrapure water, and the acetic acid used is removed by exchanging the ultrapure water twice a day for 3 days. Got the body. Table 1 shows the results of measuring the protein-equivalent molecular weight of fibroin contained in the obtained fibroin porous material by the method described above.
実施例２〜５、比較例１及び２
実施例１において精練時間を、表１に示すとおりに変えた以外は実施例１と同様にして、フィブロイン多孔質体を得た。得られたフィブロイン原料、フィブロイン水溶液（Ｂ）及びフィブロイン多孔質体に含まれるフィブロインのタンパク質換算分子量を前述の方法で測定した結果を表１に示す。
Examples 2-5, Comparative Examples 1 and 2
A fibroin porous material was obtained in the same manner as in Example 1 except that the scouring time in Example 1 was changed as shown in Table 1. Table 1 shows the results of measuring the protein-converted molecular weight of fibroin contained in the obtained fibroin raw material, fibroin aqueous solution (B) and fibroin porous material by the method described above.
実施例６
フィブロイン水溶液（Ｂ）の調製方法を以下に記載した方法とした以外は実施例１と同様にして、フィブロイン多孔質体を得た。得られたフィブロイン原料、フィブロイン水溶液（Ｂ）及びフィブロイン多孔質体に含まれるフィブロインのタンパク質換算分子量を前述の方法で測定した結果を表１に示す。
Example 6
A fibroin porous material was obtained in the same manner as in Example 1 except that the method for preparing the fibroin aqueous solution (B) was changed to the method described below. Table 1 shows the results of measuring the protein-converted molecular weight of fibroin contained in the obtained fibroin raw material, fibroin aqueous solution (B) and fibroin porous material by the method described above.
（フィブロイン水溶液（Ｂ）の調製−２）
フィブロイン水溶液（Ｂ）は、アルカリ精練を行って得られたシルクフィブロイン原料を２０℃の塩化カルシウムとエタノールと水とをモル比１：２：８で混合した溶液１Ｌにフィブロインの濃度が１００ｇ／Ｌになるよう投入し、８０℃で４０分間加熱、攪拌することで完全に溶解した。次いで、溶解液を遠心分離（回転数：１２，０００ｍｉｎ−１、５分間）して、デカンテーションで沈殿物を除去した後、透析チューブ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．製、商品名：Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ １ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｍｅｍｂｒａｎｅ、ＭＷＣＯ６，０００−８，０００）に注入し、超純水製造装置（ＰＲＯ−０５００及びＦＰＣ−０５００（以上、型番）、オルガノ株式会社製）から採水した超純水５Ｌに対して１２時間の透析を５回繰り返して脱塩した。次に、得られた溶液を再度遠心分離（回転数：１２，０００ｍｉｎ−１、３０分間）することでフィブロイン水溶液（Ｂ）を得た。フィブロイン水溶液（Ｂ）中におけるフィブロイン濃度を前述の方法により測定した。
(Preparation of fibroin aqueous solution (B) -2)
The fibroin aqueous solution (B) has a fibroin concentration of 100 g / L in 1 L of a solution obtained by mixing silk fibroin raw material obtained by alkali scouring with calcium chloride, ethanol and water at 20 ° C. in a molar ratio of 1: 2: 8. The solution was completely dissolved by heating and stirring at 80 ° C. for 40 minutes. Next, the lysate was centrifuged (rotation speed: 12,000 min −1 , 5 minutes), the precipitate was removed by decantation, and then a dialysis tube (manufactured by Spectrum Laboratories, Inc., trade name: Spectra / Por 1). Injecting into Dialysis Membrane, MWCO 6,000-8,000), for ultrapure water 5L sampled from ultrapure water production equipment (PRO-0500 and FPC-0500 (above, model number), manufactured by Organo Corporation) The dialysis for 12 hours was repeated 5 times for desalting. Next, the obtained solution was centrifuged again (rotation speed: 12,000 min −1 , 30 minutes) to obtain an aqueous fibroin solution (B). The fibroin concentration in the aqueous fibroin solution (B) was measured by the method described above.
［機械特性の評価］
上記で得られたフィブロイン多孔質体について、以下の条件により２５％圧縮応力、引裂き強さ、引張強さ及び引張ひずみを測定した。結果を表１に示す。
[Evaluation of mechanical properties]
About the fibroin porous body obtained above, 25% compressive stress, tear strength, tensile strength, and tensile strain were measured under the following conditions. The results are shown in Table 1.
（２５％圧縮応力の測定）
フィブロイン多孔質体について、万能試験機（型番：ＥＺ−（Ｎ）Ｓ、株式会社島津製作所製）を用い、ロードセルは５０Ｎ、治具として直径８ｍｍの円形の圧縮板を用いて、圧縮速度１ｍｍ／ｍｉｎ、室温２２℃の条件下で、材料の厚さの２５％を圧縮板で押し込んだときのロードを測定し、以下の式により算出した値を２５％圧縮応力（ｋＰａ）とした。
２５％圧縮応力（ｋＰａ）＝材料の厚さの２５％を圧縮板で押し込んだときのロード／圧縮板の面積（ｍｍ２）×１０００
(Measurement of 25% compressive stress)
For the fibroin porous material, a universal testing machine (model number: EZ- (N) S, manufactured by Shimadzu Corporation) was used, the load cell was 50 N, a circular compression plate having a diameter of 8 mm was used as a jig, and the compression speed was 1 mm / Under the conditions of min and room temperature of 22 ° C., the load when 25% of the thickness of the material was pressed with a compression plate was measured, and the value calculated by the following formula was 25% compression stress (kPa).
25% compressive stress (kPa) = Load / compression plate area (mm 2 ) × 1000 when 25% of the thickness of the material is pressed with the compression plate
（引裂き強さの測定）
１００ｍｍ×１５ｍｍの大きさで、かつ長さ４０ｍｍの切込みを入れた、トラウザ形に打ち抜いたフィブロイン多孔質体の試験片について、万能試験機（型番：ＥＺ−（Ｎ）Ｓ、株式会社島津製作所製）を用い、ロードセルは５０Ｎ、つかみ具は引張試験用の冶具を用い、引裂き速度２００ｍｍ／ｍｉｎ、初期つかみ具間距離４０ｍｍ、室温２２℃の条件下で、引裂き力の中央値を測定し、以下の式により算出した値を引裂き強さとした。
引裂き強さ＝引裂き力の中央値（Ｎ）／試験片の厚さ（ｍｍ）
(Measurement of tear strength)
About a test piece of fibroin porous material punched into a trouser shape with a size of 100 mm × 15 mm and a cut of 40 mm in length, a universal testing machine (model number: EZ- (N) S, manufactured by Shimadzu Corporation) ), The load cell is 50 N, the gripping tool is a jig for tensile testing, the tearing speed is 200 mm / min, the initial gripping distance is 40 mm, and the median tearing force is measured at a room temperature of 22 ° C. The value calculated by the equation was used as the tear strength.
Tearing strength = median tearing force (N) / test specimen thickness (mm)
（引張強さ及び引張ひずみの測定）
５０ｍｍ×５ｍｍの大きさに打ち抜いたフィブロイン多孔質体の試験片について、万能試験機（型番：ＥＺ−（Ｎ）Ｓ、株式会社島津製作所製）を用い、ロードセルは５０Ｎ、つかみ具は引張試験用の冶具を用い、引張速度５ｍｍ／ｍｉｎ、初期つかみ具間距離３０ｍｍ、室温２２℃の条件下で試験片を引張り、試験片が破断した時の応力とひずみをそれぞれ引張強さ、引張ひずみとした。
(Measurement of tensile strength and tensile strain)
Using a universal testing machine (model number: EZ- (N) S, manufactured by Shimadzu Corporation) for a test piece of fibroin porous material punched into a size of 50 mm × 5 mm, the load cell is 50 N, and the gripping tool is for tensile test The test piece was pulled under the conditions of a tensile speed of 5 mm / min, a distance between initial grips of 30 mm, and a room temperature of 22 ° C., and the stress and strain when the test piece broke were taken as tensile strength and tensile strain, respectively. .
表１より、実施例１から６においてはいずれも練減率は３１質量％前後であり、セリシンがほぼ完全に除去されていることが分かった。
表１より、実施例１から６においてフィブロイン多孔質体の２５％圧縮応力は、分子量が高すぎる比較例２と比べて低く、柔軟性に優れていることが分かった。
表１より、実施例１から６においてはフィブロイン多孔質体の引裂き強さは、分子量が低すぎる比較例１と比べて高く、機械的強度に優れていることが分かった。
表１より、実施例１から６においてはフィブロイン多孔質体の引張強さは、分子量が低すぎる比較例１と比べて高く、機械的強度に優れていることが分かった。
表１より、実施例１から６においてはフィブロイン多孔質体の引張ひずみは、適切な分子量でない比較例１、比較例２と比べて高く、伸縮性に優れていることが分かった。
表１より、実施例１から６においてはフィブロイン原料及びフィブロイン水溶液のタンパク質換算分子量は１６８，０００〜４０３，０００であったが、精練時間の長い比較例１では１２６，０００、精練時間の短い比較例２では７３１，０００であり、精練時間が長くなるにつれ分子量が低下していることが分かった。
表１より、実施例１から６においてはフィブロイン多孔質体のタンパク質換算分子量は１１９，０００〜３０８，０００であったが、精練時間の長い比較例１では９２，０００、精練時間の短い比較例２では５９２，０００であり、精練時間が長くなるにつれ分子量が低下していることが分かった。
以上より、タンパク質換算分子量が１６０，０００〜４１０，０００のフィブロイン原料を使用して作製したフィブロイン水溶液のタンパク質換算分子量は１６０，０００〜４１０，０００であり、また、そのフィブロイン水溶液を使用して作製したフィブロイン多孔質体のタンパク質換算分子量は１１０，０００〜３１０，０００であり、これらのフィブロイン多孔質体は、いずれも機械的強度、伸縮性及び柔軟性に優れていることが分かった。このように、本発明の止血材は、優れた機械的強度を有するため、取り扱いが容易であり、止血部の圧迫等にも利用できる。また、十分な柔軟性を有するため、出血部位の形状に沿って密着させることが可能であり、止血を効果的に行うことができる。
From Table 1, in Examples 1 to 6, the reduction rate was about 31% by mass, and it was found that sericin was almost completely removed.
From Table 1, it was found that the 25% compressive stress of the fibroin porous material in Examples 1 to 6 was lower than that of Comparative Example 2 in which the molecular weight was too high and excellent in flexibility.
From Table 1, it was found that in Examples 1 to 6, the tear strength of the fibroin porous material was higher than that of Comparative Example 1 in which the molecular weight was too low and excellent in mechanical strength.
From Table 1, it was found that in Examples 1 to 6, the tensile strength of the fibroin porous material was higher than that of Comparative Example 1 in which the molecular weight was too low, and was excellent in mechanical strength.
From Table 1, in Examples 1 to 6, it was found that the tensile strain of the fibroin porous material was higher than those of Comparative Examples 1 and 2 that were not of appropriate molecular weight and excellent in stretchability.
From Table 1, in Examples 1 to 6, the protein equivalent molecular weights of the fibroin raw material and the fibroin aqueous solution were 168,000 to 403,000, but in Comparative Example 1 with a long scouring time, 126,000, a comparison with a short scouring time. In Example 2, it was 731,000, and it was found that the molecular weight was decreased as the scouring time was increased.
From Table 1, the protein equivalent molecular weight of the fibroin porous material in Examples 1 to 6 was 119,000 to 308,000, but in Comparative Example 1 having a long scouring time, 92,000, a comparative example having a short scouring time. 2 was 592,000, and it was found that the molecular weight decreased as the scouring time increased.
As mentioned above, the protein conversion molecular weight of the fibroin aqueous solution produced using the fibroin raw material having a protein conversion molecular weight of 160,000 to 410,000 is 160,000 to 410,000, and produced using the fibroin aqueous solution. The protein equivalent molecular weight of the fibroin porous material was 110,000 to 310,000, and it was found that all of these fibroin porous materials were excellent in mechanical strength, stretchability and flexibility. Thus, since the hemostatic material of the present invention has excellent mechanical strength, it is easy to handle and can be used for compression of the hemostatic part. Moreover, since it has sufficient softness | flexibility, it can be made to contact | adhere along the shape of a bleeding part, and hemostasis can be performed effectively.
［血液凝固時間の測定］
実施例７、比較例３〜６
（１）乾燥フィブロイン多孔質体の調製
実施例４で作製したフィブロイン多孔質体を３体積％グリセリン水溶液に４８時間浸漬した後、−２５℃の冷凍庫中で１０時間静置して完全に凍結させた。凍結したフィブロイン多孔質体の水分を凍結乾燥機を用いて完全に昇華させ、乾燥フィブロイン多孔質体を作製した。
（２）被検物質
被検物質として、上記で作製した乾燥フィブロイン多孔質体（多孔質体Ａ）、ゼラチンスポンジ（アステラス製薬株式会社製、商品名：スポンゼル）、キチンスポンジ（ニプロ株式会社製、商品名：ベスキチンＦ（Ｎ））、アルギン酸塩不織布（スミスアンドネフュー社製、商品名：アルゴダームトリオニック）を準備した。
（３）試料血液
インフォームドコンセントを行い、健常者３人から、抗凝固剤の非存在下で約４０ｍｌの血液を採取し、採取された血液をそれぞれ血液Ａ、Ｂ及びＣとした。試料血液は保存せず、採血直後、速やかに使用した。
（４）血液凝固時間の測定
はじめに、４種類の被験物質から、それぞれ３００ｍｍ３の試料２セットを切り出し、シリコナイズ処理をした試験管２本に、それぞれの被験物質を１セットずつ入れた。また、空の試験管２本をブランクとして用いた。
あらかじめ、それぞれの試験管を３７℃で加温した後、それぞれの試験管に採血直後の血液Ａを１．５ｍＬ（２００ｍｍ３／ｍＬ）添加し、タイマーをスタートさせた。それぞれの被験物質１本目の試験管を３０秒毎に傾け、血液の流動性を目視にて観察した。さらに１本目の試験管で血液凝固が観察された後、２本目の試験管を３０秒毎に傾け、血液の流動性を目視にて確認した。
採血開始から２本目の試験管で血液凝固が観察されるまでの時間を血液凝固時間とした。血液Ｂ及びＣについても同様の操作を繰り返し、血液凝固時間を測定した。血液Ａ〜Ｃの平均値を、各被験物質の血液凝固時間とした。結果を表２に示す。
[Measurement of blood clotting time]
Example 7, Comparative Examples 3-6
(1) Preparation of dry fibroin porous body The fibroin porous body produced in Example 4 was immersed in a 3% by volume glycerin aqueous solution for 48 hours, and then left to stand in a freezer at -25 ° C for 10 hours to completely freeze it. It was. The water of the frozen fibroin porous body was completely sublimated using a freeze dryer to prepare a dried fibroin porous body.
(2) Test substance As the test substance, the dried fibroin porous material (porous material A) prepared above, gelatin sponge (manufactured by Astellas Pharma Inc., trade name: Sponzel), chitin sponge (manufactured by Nipro Corporation), Trade name: Besquitin F (N)) and alginate nonwoven fabric (manufactured by Smith & Nephew, trade name: Algodame Trionic) were prepared.
(3) Sample blood Informed consent was performed, and about 40 ml of blood was collected from 3 healthy subjects in the absence of anticoagulant, and the collected blood was designated as blood A, B, and C, respectively. The sample blood was not stored and was used immediately after blood collection.
(4) Measurement of blood coagulation time First, two sets of 300 mm 3 samples were cut out from each of the four types of test substances, and one set of each test substance was placed in two test tubes subjected to siliconization treatment. Two empty test tubes were used as blanks.
After each test tube was heated at 37 ° C. in advance, 1.5 mL (200 mm 3 / mL) of blood A immediately after blood collection was added to each test tube, and a timer was started. The first test tube of each test substance was tilted every 30 seconds, and the blood fluidity was visually observed. Furthermore, after blood coagulation was observed in the first test tube, the second test tube was tilted every 30 seconds, and the blood fluidity was visually confirmed.
The time from the start of blood collection to the time when blood coagulation was observed in the second test tube was defined as the blood coagulation time. The same operation was repeated for blood B and C, and the blood coagulation time was measured. The average value of blood A to C was taken as the blood clotting time of each test substance. The results are shown in Table 2.
表２より、フィブロイン多孔質体を用いた本発明の止血材は、止血材を使用しなかった比較例３に比べて血液凝固時間を短縮できており、止血効果を有することが分かる。また、本発明の止血材は、既存の止血材として知られるゼラチンスポンジより血液凝固時間が短く、キチンスポンジ、アルギン酸不織布と同等の止血効果を有することが分かる。 From Table 2, it can be seen that the hemostatic material of the present invention using the fibroin porous material has a blood coagulation time shorter than that of Comparative Example 3 in which no hemostatic material was used, and has a hemostatic effect. In addition, it can be seen that the hemostatic material of the present invention has a shorter blood coagulation time than gelatin sponge known as an existing hemostatic material, and has the hemostatic effect equivalent to chitin sponge and alginate nonwoven fabric.
［生体への固着力測定］
実施例８、比較例７〜１１
（１）被検物質
被検物質として、実施例７で作製した乾燥フィブロイン多孔質体、ウレタンスポンジ（スミスアンドネフュー社製、商品名：ハイドロサイトプラス）、アルギン酸塩不織布（スミスアンドネフュー社製、商品名：アルゴダームトリオニック）、非固着性ガーゼ（スミスアンドネフュー社製、商品名：メロリン（滅菌済））及びハイドロコロイドドレッシング（３Ｍ社製、商品名：テガダームハイドロコロイド）を準備した。
（２）試験方法
（２−１）褥瘡モデルの作製
ラット（Ｓｌｃ：ＳＤ（ＳＰＦ）８週齢、日本エスエルシー株式会社）を試験に用いた。予め右第三転子上の皮膚を広範囲に電気バリカン（大東電機工業株式会社製、商品名：ＥＬＥＣＴＲＩＣ ＣＬＩＰＰＥＲ ＭＯＤＥＬ５５００）及び電気シェーバー（セイコーエスヤード株式会社製、商品名：Ｃｌｅａｎｃｕｔ ＥＳ−４１２）を用いて除毛した上記ラットに、ペントバルビタールナトリウム５０ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与し、更に、アロバルビタール２０ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与して麻酔し、木製固定板上に腹位に固定した。大腿部と前記固定板との間にクッションとして脱脂綿を入れ、右第三転子上の皮膚に、ゴム栓（直径１２ｍｍ）をつけた１．０２〜１．０３ｋｇのステンレス棒（直径１９ｍｍ、長さ５０ｃｍ）をのせて２４時間圧負荷（９０２．３〜９１１．２ｇ／ｃｍ２）した。圧負荷時間中、ペントバルビタールナトリウム及びアロバルビタールの追加麻酔を施した。２４時間後に圧負荷を解除し、５％ブドウ糖水溶液を経口投与した後、圧負荷解除２日後にイソフルラン麻酔下にて壊死した皮膚を外科的に除去し、褥瘡モデルとした。
（２−２）創部の処置及び被験物質の投与
ラットに作製した褥瘡に２ｃｍ角に裁断した被検物質を被せ、その上から３ｃｍ角に裁断したガーゼ（白十字株式会社製）で覆い、４ｃｍ角に裁断したドレッシングフィルム（スミスアンドネフュー社製、商品名：オプサイトジェントルロール）で固定した。更に、５ｃｍ角に裁断した伸縮性包帯エラストポアＮｏ．５０（ニチバン株式会社製）２枚を交叉して貼り、伸縮性包帯エラストポアＮｏ．１２（ニチバン株式会社製、１．２×６０ｃｍ）で固定した。ハイドロコロイドドレッシングについては、離型紙を剥がし粘着面が創傷面に当たるように投与し、その上からガーゼを被せ、更に、伸縮性包帯で固定した。被検物質は褥瘡が完全に治癒するまでの間、２日ごとに新しいものに交換した。被検物質交換時には、以下の方法で創部への固着の強さを測定した。また、新しい被検物質を貼付する前には、生理食塩液（株式会社大塚製薬工場製）に浸した脱脂綿で創部を清拭した。また、創部が完全に上皮化したタイミングを治癒と判定した。
（２−３）創部への固着の強さの測定
被験物質の創部に対する固着の強さを、吊り秤（天衡商事、高精度光デジタルフォースゲージ）で測定した。被験物質交換時に被検物質を剥がさないように固定している伸縮性包帯類を除去した後に、吊り秤で被検物質を垂直に引っ張って被検物質を剥がした。その時の重さの最大値を読み取って記録し、以下の式に従って、各被検物質の交換時の創部に対する平均固着強さを算出した。
平均固着強さ（ｇ）＝（褥瘡が治癒するまでの各被検物質交換時に吊り秤が示した重さの最大値の合計（ｇ））／（各被検物質の交換回数）
結果を表３に示す。なお、治癒に要した日数とは、各被検物質の貼付を始めた日から、創部が完全に上皮化した日までの日数を表す。
[Measurement of adherence to living body]
Example 8, Comparative Examples 7-11
(1) Test substance As the test substance, the dried fibroin porous material produced in Example 7, urethane sponge (manufactured by Smith & Nephew, trade name: Hydrosite Plus), alginate nonwoven fabric (manufactured by Smith & Nephew, Non-adhesive gauze (manufactured by Smith & Nephew, trade name: meroline (sterilized)) and hydrocolloid dressing (manufactured by 3M, trade name: tegaderm hydrocolloid) were prepared.
(2) Test method (2-1) Production of pressure ulcer model Rats (Slc: SD (SPF) 8 weeks old, Japan SLC Co., Ltd.) were used for the test. Use an electric clipper (trade name: ELECTRIC CLIPPER MODEL5500, manufactured by Daito Denki Kogyo Co., Ltd.) and an electric shaver (trade name: Cleancut ES-412, manufactured by Seiko Syard Co., Ltd.) over the skin on the right third trochanter in advance. The above-mentioned rats that had been depilated were intraperitoneally administered with 50 mg / kg of pentobarbital sodium, further anesthetized by intraperitoneal administration of 20 mg / kg of allobarbital, and fixed in the abdominal position on a wooden fixing plate. Absorbent cotton is put as a cushion between the thigh and the fixing plate, and a 1.02 to 1.03 kg stainless steel rod (diameter 19 mm, diameter 12 mm) is attached to the skin on the right third trochanter. The pressure was applied (902.3 to 911.2 g / cm 2 ) for 24 hours. During the pressure loading time, additional anesthesia of sodium pentobarbital and allobarbital was performed. After 24 hours, the pressure load was released and a 5% glucose aqueous solution was orally administered. Then, 2 days after the release of the pressure load, the necrotic skin was removed surgically under isoflurane anesthesia to obtain a pressure ulcer model.
(2-2) Treatment of wound and administration of test substance A test substance cut into a 2 cm square is covered with a pressure ulcer prepared on a rat, and covered with a gauze (made by White Cross Co., Ltd.) cut into a 3 cm square from above, and 4 cm It was fixed with a dressing film (trade name: Opsite Gentle Roll, manufactured by Smith & Nephew Corp.) cut into corners. Furthermore, the elastic bandage elastic pore No. cut to 5 cm square. Two 50 (made by Nichiban Co., Ltd.) were crossed and pasted, and elastic bandage Elastopore No. 12 (Nichiban Co., Ltd., 1.2 × 60 cm). For the hydrocolloid dressing, the release paper was peeled off and the adhesive surface was administered so that it touched the wound surface, covered with gauze, and further fixed with an elastic bandage. The test substance was replaced with a new one every two days until the pressure ulcer was completely healed. At the time of exchanging the test substance, the strength of fixation to the wound was measured by the following method. In addition, before applying a new test substance, the wound was wiped with absorbent cotton soaked in physiological saline (manufactured by Otsuka Pharmaceutical Factory). The timing at which the wound was completely epithelialized was determined to be healing.
(2-3) Measurement of strength of adhesion to wound part The strength of adhesion of the test substance to the wound part was measured with a hanging balance (Tenhoku Corporation, high-precision optical digital force gauge). After removing the elastic bandages that were fixed so as not to peel off the test substance when the test substance was exchanged, the test substance was peeled off by pulling the test substance vertically with a hanging balance. The maximum value of the weight at that time was read and recorded, and the average adhesion strength to the wound at the time of replacement of each test substance was calculated according to the following formula.
Average sticking strength (g) = (total sum of weights shown by the hanging scale at the time of each test substance exchange until the pressure ulcer heals (g)) / (number of times each test substance is exchanged)
The results are shown in Table 3. The number of days required for healing represents the number of days from the day when each test substance was applied to the day when the wound was completely epithelialized.
表３より、フィブロイン多孔質体を用いた本発明の止血材は、創部に対する固着力が小さく、生体から容易に除去することが可能であることが分かる。
本発明の止血材を貼付した場合には、ガーゼ類を創部に貼付した場合と比較して治癒に要する日数が短いことが確認された。また、比較例８、９及び１１の既存の湿潤療法向け創傷被覆材として知られる材料と比較しても遜色ないことが分かった。このように。本発明の止血材は、止血のみならず、創部に貼付することで、創傷治癒促進効果が期待できる。
From Table 3, it can be seen that the hemostatic material of the present invention using a fibroin porous body has a small adhesive force to the wound and can be easily removed from the living body.
When the hemostatic material of the present invention was affixed, it was confirmed that the number of days required for healing was shorter than when gauze was affixed to the wound. Moreover, it turned out that even if it compares with the material known as the wound dressing material for the existing wet therapy of the comparative examples 8, 9, and 11, it is inferior. in this way. The hemostatic material of the present invention can be expected not only to stop hemostasis but also to promote wound healing by being applied to the wound.
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