JP6810023B2 - 構造的に多様な複合脂質を分析するための方法、組成物およびキット - Google Patents
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Description
関連出願の相互参照
本出願は２０１４年７月３０日出願の米国仮特許出願第６２／０３１，０９９号の利益を主張し、その開示内容全体を参照により援用する。
本出願は２０１４年７月３０日出願の米国仮特許出願第６２／０３１，０９９号の利益を主張し、その開示内容全体を参照により援用する。
本開示に係る主題は、複合脂質の混合物を含む生体サンプルおよび他のサンプルを分析するために内部標準として複合脂質の混合物を合成および使用するための方法、組成物、および、キットに関する。
内部標準（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｓｔａｎｄａｒｄ；ＩＳ）を使用してサンプル中の標的化合物の濃度を較正することは広く受け入れられている定量方法である。簡単に説明すると、試験対象のサンプル中に存在しない化合物であって、（１）サンプル調製（抽出、クロマトグラフィーなど）の全段階で標的化合物と同様に振るまい、かつ（２）選択した検出方法によって標的化合物と識別できるという２つの基準を満たすものを添加する。よって、サンプルに添加した内部標準の濃度と、標的化合物および内部標準の両方に対する検出器の相対応答（ピーク面積など）がわかれば、元のサンプル中に存在してたであろう標的化合物の量を計算することができる。
生体サンプル中に存在する脂質は内部標準を用いた定量を行う場合に問題がある標的である。脂質は１種類の脂質クラス内でさえも多様な化学的性質を有するからである。また、脂質には組み合わせ論的複雑さがある。例えば、１２種類程度の骨格の１つに対して多くの潜在的な脂肪酸のうちの数種類がアシル化している。よって、内部標準が少ないと上記２つの基準の第１の基準を満たすことができない。一般的に、分析者は広範なクラスの脂質（リン脂質、中性脂質など）に対して、内標準化合物をほとんど使用せず、また、内部標準として１種類の化合物しか選択しないことも多い。広範な脂質クラスに対してどのような標準を選択するかは、歴史的に見て、その標準が標的分析対象物の化学的性質に類似していることよりも、その化合物が生体サンプル中に存在しないことと、その化合物が合成し易いことに基づいている。多くの脂質内部標準は、１つの奇数鎖または短鎖脂肪酸（例えば、ＰＣ１２：０／１２：０またはＴＡＧ１７：０／１７：０／１７：０）から構成されている。また、多くの内部標準混合物は広範な脂質クラス毎に単一の内部標準を使用する。しかしながら、現行の内部標準開発アプローチは、１）短鎖脂肪酸または完全飽和脂肪酸の内部標準はアッセイ中に標的化合物の様に振る舞わず、また２）単純な内部標準戦略では脂質の組み合わせ論的複雑さを表すことは困難であるため、制限されている。
各脂質クラスに対して適切な化学的性質を有する、内部標準として使用するための構造的に多様な標準セットに対するニーズがある。このような内部標準セットは広範な化学的多様性を提供するため、様々な分析をカバーできる。
質量分析に使用するための内部標準に関する方法、キットおよび組成物が記載される。複合脂質は、多様な脂肪酸が結合してなる脂質のクラスである。対象サンプルの１または２以上の複合脂質クラスの脂肪酸を効果的に表すのに十分多様な組成を有する内部標準としての脂質分子混合物の合成方法、該混合物を含む組成物の使用方法、および、該混合物を含むキットが提供される。上記内部標準は本願明細書に記載の特性を含むように合成される。そして、合成した内部標準はキットにパッケージされて脂質分析に使用され得る。本願明細書に記載の脂質内部標準は質量分析などの任意の用途に使用され得る。
本開示の一実施形態において、対象サンプル中の１または２以上の対応する脂質クラスに存在する脂質分子種の組成を表す１または２以上の脂質分子混合物の合成方法であって、アシル基を少なくとも２つ有する脂質クラスについて、同位体標識された脂肪酸を、脂質骨格上の第１の位置にアシル反応を介して付着させるステップ；および、少なくとも２種類の脂肪酸の混合物を、脂質骨格上の別位置にアシル化反応を介して付着させるステップを含み、脂肪酸の混合物は、対象サンプル中の対応する脂質クラスに存在する脂肪酸を表し、脂肪酸の混合物における各脂肪酸は、対象サンプル中の対応する脂質クラスに存在する脂質分子種中の脂肪酸の存在比率を表す比率で存在する、方法が提供される。
本開示の一実施形態において、対象サンプル中の１または２以上の対応する脂質クラスに存在する脂質分子種の組成を表す１または２以上の脂質分子混合物の合成方法であって、アシル基を少なくとも１つ有する脂質クラスについて、少なくとも２種類の脂肪酸の混合物を、同位体標識された脂質骨格上の単一位置にアシル化反応を介して付着させるステップを含み、脂肪酸の混合物は、対象サンプル中の対応する脂質クラスに存在する脂肪酸を表し、脂肪酸の混合物における各脂肪酸は、対象サンプル中の対応する脂質クラスに存在する脂質分子種中の脂肪酸の存在比率を表す比率で存在する、方法が提供される。
本開示の一実施形態において、対象サンプル中の１または２以上の対応する脂質クラスに存在する脂質分子種の組成を表す１または２以上の脂質分子混合物を含む、内部標準として使用するための組成物であって、各脂質分子混合物は、脂質骨格上の第１の位置に同位体標識された脂肪酸を有する脂質骨格であって、アシル基を少なくとも１つ有する脂質クラスのための脂質骨格；および、脂質骨格上の別位置に少なくとも２種類の脂肪酸の混合物を有し、脂肪酸の混合物は、対象サンプル中の対応する脂質クラスに存在する脂肪酸を表し、脂肪酸の混合物における各脂肪酸は、対象サンプル中の対応する脂質クラスに存在する脂質分子種中の脂肪酸の存在比率を表す比率で存在する、組成物が提供される。
本開示の一実施形態において、対象サンプル中の１または２以上の対応する脂質クラスに存在する脂質分子種の組成を表す１または２以上の脂質分子混合物を含む、内部標準として使用するための組成物であって、各脂質分子混合物は、１または２以上の同位体標識を有する脂質骨格であって、アシル基を少なくとも１つ有する脂質クラスのための脂質骨格；および、脂質骨格上の単一位置に存在する少なくとも２種類の脂肪酸の混合物を含み、脂肪酸の混合物は、対象サンプル中の脂質クラスに存在する脂肪酸を表し、混合物中の各脂肪酸は、対象サンプル中の対応する脂質クラスに存在する脂質分子種中の脂肪酸の存在比率を表す比率で存在する、組成物が提供される。
本開示の一実施形態において、ｉ）内部標準として使用するための１または２以上の脂質分子混合物であって、各脂質分子混合物は、対象サンプル中の１または２以上の対応する脂質クラスに存在する脂質分子種の組成を表し、各脂質分子混合物は、脂質骨格上の第１の位置に同位体標識された脂肪酸と、脂質骨格上の別位置に存在する少なくとも２種類の脂肪酸の混合物とを有する脂質骨格であって、アシル基を少なくとも２つ有する脂質クラスのための脂質骨格、または、１または２以上の同位体標識と、脂質骨格上の単一位置に存在する少なくとも２種類の脂肪酸の混合物とを有する脂質骨格であって、アシル基を少なくとも１つ有する脂質クラスのための脂質骨格を含み、脂肪酸の混合物は、対象サンプル中の対応する脂質クラスに存在する脂肪酸を表し、混合物中の各脂肪酸は、対象サンプル中の対応する脂質クラスに存在する脂質分子種中の脂肪酸の存在比率を表す比率で存在する、１または２以上の脂質分子混合物；および、ｉｉ）対象サンプル中の対応する脂質クラスに存在する脂質分子種を検出または定量するために、１または２以上の脂質分子混合物を内部標準として使用するための指示、を含むキットが提供される。
本開示の一実施形態において、対象サンプル中に存在する脂質分子を検出または定量する方法であって、対象サンプル中の１または２以上の対応する脂質クラスに存在する脂質分子種の組成を表す１または２以上の脂質分子混合物を有する既知量の組成物を対象サンプルに添加するステップであって、各脂質分子混合物は、ｉ）脂質骨格上の第１の位置に同位体標識された脂肪酸を有する脂質骨格であって、アシル基を少なくとも２つ有する脂質クラスのための脂質骨格；および、ｉｉ）脂質骨格上の別位置に存在する少なくとも２種類の脂肪酸の混合物を含み、脂肪酸の混合物は、対象サンプル中の対応する脂質クラスに存在する脂肪酸を表し、混合物中の各脂肪酸は、対象サンプル中の対応する脂質クラスに存在する脂質分子種中の脂肪酸の存在比率を表す比率で存在する、ステップ；および、脂質分子種の組成を表す脂質分子混合物を内部標準として使用して、対象サンプル中の対応する脂質クラスに存在する脂質分子種を検出または定量するステップ、を含む方法が提供される。
本開示の一実施形態において、対象サンプル中に存在する脂質分子を検出または定量する方法であって、対象サンプル中の１または２以上の対応する脂質クラスに存在する脂質分子種の組成を表す１または２以上の脂質分子混合物を有する既知量の組成物を対象サンプルに添加するステップであって、各脂質分子混合物は、ｉ）１または２以上の同位体標識を有する脂質骨格であって、アシル基を少なくとも１つ有する脂質クラスのための脂質骨格；および、ｉｉ）脂質骨格上の別位置に存在する少なくとも２種類の脂肪酸の混合物を含み、脂肪酸の混合物は、対象サンプル中の対応する脂質クラスに存在する脂肪酸を表し、混合物中の各脂肪酸は、対象サンプル中の対応する脂質クラスに存在する脂質分子種中の脂肪酸の存在比率を表す比率で存在する、ステップ；および、脂質分子種の組成を表す脂質分子混合物を内部標準として使用して、対象サンプル中の対応する脂質クラスに存在する脂質分子種を検出または定量するステップ、を含む方法が提供される。
本開示の一実施形態において、対象サンプル中の１または２以上の対応する脂質クラスに存在する脂質分子種の組成を表す内部標準として使用するための１または２以上の脂質分子混合物の合成方法であって、アシル基を少なくとも１つ有する脂質クラスについて、同位体標識された少なくとも２種類の脂肪酸の混合物を、脂質骨格上の単一位置にアシル化反応を介して付着させるステップ；アシル基を少なくとも１つ有する脂質クラスについて、少なくとも２種類の脂肪酸の混合物を、同位体標識された脂質骨格上の単一位置にアシル化反応を介して付着させるステップ；および、脂肪酸を少なくとも２つ有する脂質クラスについて、１つの同位体標識された脂肪酸を脂質骨格上の第１の位置にアシル化反応を介して付着させ、かつ、少なくとも２種類の脂肪酸の混合物を脂質骨格上の別位置にアシル化反応を介して付着させるステップ；のうちの１または２以上を含み、少なくとも２種類の脂肪酸の混合物は、対象サンプル中の対応する脂質クラスに存在する脂肪酸を表し、混合物中の各脂肪酸は、対象サンプル中の対応する脂質クラスに存在する脂質分子種中の脂肪酸の存在比率を表す比率で存在する、方法が提供される。
本開示の一実施形態において、対象サンプル中の１または２以上の対応する脂質クラスに存在する脂質分子種の組成を表す１または２以上の脂質分子混合物を含む、内部標準として使用するための組成物であって、各脂質分子混合物が、脂質骨格上の単一位置に少なくとも２種類の同位体標識された脂肪酸の混合物を有する脂質骨格であって、アシル基を少なくとも１つ有する脂質クラスのための脂質骨格；脂質骨格上の単一位置に少なくとも２種類の脂肪酸の混合物を有する同位体標識された脂質骨格であって、アシル基を少なくとも１つ有する脂質クラスのための脂質骨格；および、脂質骨格上の第１の位置に単一の同位体標識された脂肪酸を有し、かつ脂質骨格上の別位置に少なくとも２種類の脂肪酸の混合物を有する脂質骨格であって、脂肪酸を少なくとも２つ有する脂質クラスのための脂質骨格；のうちの１または２以上を含み、少なくとも２種類の脂肪酸の混合物は、対象サンプル中の対応する脂質クラスに存在する脂肪酸を表し、混合物中の各脂肪酸は、対象サンプル中の対応する脂質クラスに存在する脂質分子種中の脂肪酸の存在比率を表す比率で存在する、組成物が提供される。
本開示の一実施形態において、ｉ）内部標準として使用するための１または２以上の脂質分子混合物であって、１または２以上の脂質分子混合物は、それぞれ、対象サンプル中の１または２以上の対応する脂質クラスに存在する脂質分子種の組成を表し、各脂質分子混合物は、脂質骨格上の単一位置に少なくとも２種類の同位体標識された脂肪酸の混合物を有する脂質骨格であって、アシル基を少なくとも１つ有する脂質クラスのための脂質骨格；脂質骨格上の単一位置に少なくとも２種類の脂肪酸の混合物を有する同位体標識された脂質骨格であって、アシル基を少なくとも１つ有する脂質クラスのための脂質骨格；および、脂質骨格上の第１の位置に単一の同位体標識された脂肪酸を有し、かつ脂質骨格上の別位置に少なくとも２種類の脂肪酸の混合物を有する脂質骨格であって、アシル基を少なくとも２つ有する脂質クラスのための脂質骨格；のうちの１または２以上を含み、少なくとも２種類の脂肪酸の混合物は、対象サンプル中の脂質クラスに存在する脂肪酸を表し、混合物中の各脂肪酸は、対象サンプル中の対応する脂質クラスに存在する脂質分子種中の脂肪酸の存在比率を表す比率で存在する、１または２以上の脂質分子混合物；および、ｉｉ）対象サンプル中の対応する脂質クラスに存在する脂質分子種を検出または定量するために、１または２以上の脂質分子混合物を内部標準として使用するための指示、を含むキットが提供される。
本開示の一実施形態において、対象サンプル中に存在する脂質分子を検出または定量する方法であって、ｉ）対象サンプル中の１または２以上の対応する脂質クラスに存在する脂質分子種の組成を表す１または２以上の脂質分子混合物を有する既知量の組成物を対象サンプルに添加するステップであって、該組成物は、ａ）脂質骨格上の単一位置に少なくとも２種類の同位体標識された脂肪酸の混合物を有する脂質骨格であって、アシル基を少なくとも１つ有する脂質クラスのための脂質骨格；ｂ）脂質骨格上の単一位置に少なくとも２種類の脂肪酸の混合物を有する同位体標識された脂質骨格であって、アシル基を少なくとも１つ有する脂質クラスのための脂質骨格；および、ｃ）脂質骨格上の第１の位置に単一の同位体標識された脂肪酸を有し、かつ脂質骨格上の別位置に少なくとも２種類の脂肪酸の混合物を有する脂質骨格であって、脂肪酸を少なくとも２つ有する脂質クラスのための脂質骨格；のうちの１または２以上を含み、少なくとも２種類の脂肪酸の混合物は、対象サンプル中の脂質クラスに存在する脂肪酸を表し、混合物中の各脂肪酸は、対象サンプル中の脂質クラスに存在する脂質分子種中の脂肪酸の存在比率を表す比率で存在する、ステップ；および、ｉｉ）脂質分子種の組成を表す１または２以上の脂質分子混合物を有する組成物を内部標準として使用して、対象サンプル中の１または２以上の対応する脂質クラスのそれぞれに存在する脂質分子種を検出または定量するステップ、を含む方法が提供される。
以下、本開示の原理の理解を助けるために好ましい実施形態を説明し、また、特定の用語を使用してこれを説明する。なお、本開示の範囲がそれにより限定されることは意図していないことを理解されたい。本開示に関する技術分野の当業者が通常想到するように、本願明細書において説明する本開示は変更や更に修正されることが意図されている。
生体サンプル中に存在する脂質は内部標準を用いた定量を行う場合に問題がある標的である。脂質は１種類の脂質クラス内でさえも多様な化学的性質を有するからである。また、脂質には組み合わせ論的複雑さがある。例えば、１２種類程度の骨格の１つに対して多くの潜在的な脂肪酸のうちの数種類がアシル化している。よって、内部標準が少ないと上記２つの基準の第１の基準を満たすことができない。そこで、以下の内部標準セットを作る方法が必要とされている。すなわち、（１）複合脂質の化学的多様性を表し、かつ、（２）サンプル中の予想脂質組成を表すため内部標準として有用な内部標準混合物を比較的大量に創製する内部標準セットである。本開示の主題は、複合脂質の化学的多様性を表す内部標準のための方法および組成物を提供する。
各脂質クラスに対して適切な化学的性質および／または分析的性質を有する脂質標準の構造的に多様なセットのための試薬およびキットが開示される。本願明細書で使用する脂肪酸「脂質代謝物」（または「脂質分子」）の命名法について、「ＣＥ」、「ＤＧ」、「ＦＡ」、「ＰＣ」、「ＰＥ」、「ＬＰＣ」、「ＬＰＥ」、「Ｏ−ＰＣ」、「Ｐ−ＰＥ」、「ＳＭ」、「ＴＧ」または「ＣＥＲ」との接頭辞が付与された脂肪酸は、それぞれ、サンプル中の以下のものに存在する脂肪酸をいう：コレステリルエステル、ジアシルグリセロール（ジグリセリド）、遊離脂肪酸、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、１−エーテル結合ホスファチジルコリン、１−ビニルエーテル結合ホスファチジルエタノールアミン（プラズマロゲン）、スフィンゴミエリン、トリアシルグリセロール（トリグリセリド）、および、セラミド。いくつかの実施形態において、示された脂肪酸成分は、接頭辞で示された脂質クラス内の総脂肪酸に対する割合として定量される。接頭辞を付さない脂肪酸または特定の脂肪酸クラスの他の表示は、一般的に、サンプル中の全脂質中に存在する脂肪酸を示す。「ＣＥ」、「ＤＧ」、「ＦＡ」、「ＰＣ」、「ＰＥ」、「ＬＰＣ」、「ＬＰＥ」、「Ｏ−ＰＣ」、「Ｐ−ＰＥ」、「ＳＭ」、「ＴＧ」または「ＣＥＲ」との接頭辞の後の「ＬＣ」との語句は、サンプルにおける当該接頭辞が付された総脂質クラスの量（例えば、血清または血漿１ｇ当たりのｎモルとして表される、当該クラスの脂質濃度）を示す。例えば、血清または血漿から取った測定について、いくつかの実施形態では、「ＰＣ１８：２ｎ６」との略語は、血漿または血清中のリノール酸（１８：２ｎ６）から構成されるホスファチジルコリンの割合（％）を示し、「ＴＧＬＣ」との用語は、血漿または血清に存在するトリグリセリドの絶対量（例えば、ｎモル／ｇ）を示す。「ＭＵＦＡ」、「ＰＵＦＡ」および「ＳＦＡ」は、それぞれ、一価不飽和脂肪酸、多価不飽和脂肪酸および飽和脂肪酸をいう。
本願明細書において、「脂質骨格」は、脂質分子の脂肪酸基すなわちアシル基を除いた部分をいう。本願明細書において、「脂肪酸」および「アシル基」との用語は交換可能に使用される。本願明細書において、「脂質分子種」または「分子種」は、特定の脂質骨格に結合した特定の脂肪酸（アシル基）から構成される脂質分子（例えば、ＰＣ１８：２ｎ６、ＣＥ１６：１ｎ６など）をいう。
本願明細書において「同位体標識（された）」とは、任意の適切な構造（例えば、重水素（２Ｈ）、１３Ｃ、１５Ｎ）を使用して測定するためにマークされた内部標準または内部標準の任意の部分をいう。内部標準の任意の原子、または、任意の数の原子が同位体で標識され得る。例えば、同位体は重水素であり内部標準は９個の重水素原子を含み得る。他の一例では、同位体は重水素であり内部標準は１１個、１３個、１５個、１７個、１９個、２１個、２３個、２５個、２７個、２９個または３１個の重水素原子を含み得る。
本願明細書に記載の方法の１つの用途は、質量分析装置、または、タンデム型の複数の質量分析装置（すなわち「プラットフォーム」）の較正または較正補助である。一例において、２種類の較正が要求される。すなわち、１つは脂質クラス濃度用であり、もう１つは脂質クラスの脂肪酸組成用である。対照サンプルまたは結果の定量データベースとの比較のいずれかを使用して、プラットフォーム較正の結果が計算により較正され得る。
内部標準混合物を生成するための本願明細書に記載の方法は、任意の脂質または脂質クラスに適用され得る。本願明細書において、「脂質クラス」との用語は、例えば、トリアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、コレステリルエステル、遊離脂肪酸、ホスファチジルコリン、ｏ−ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ｐ−ホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、カルジオリピン、ホスファチジルセリン、リゾホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、リゾホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、リゾホスファチジン酸、ＣＤＰ−ジアシルグリセロール、リゾＣＤＰ−ジアシルグリセロール、セラミド、ラクトシルセラミド、グルコシルセラミド、フィトセラミド、６−ヒドロキシセラミド、セレブロシド、ガングリオシド、ワックスエステル、ワックスジエステル、および、１−モノアシルグリセロールなどの脂質のクラスをいう。トリアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、コレステリルエステル、遊離脂肪酸は広く中性脂質である。ホスファチジルコリン、ｏ−ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ｐ−ホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、カルジオリピン、ホスファチジルセリン、リゾホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、リゾホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、リゾホスファチジン酸、ＣＤＰ−ジアシルグリセロール、リゾＣＤＰ−ジアシルグリセロールは、広くリン脂質である。
内部標準混合物はリン脂質を含んでよく、各リン脂質頭部基（例えば、ＰＣ、ＰＥ、ＳＭ）は、ａ）ｓｎ−１位またはｓｎ−２位に存在する同位体標識された脂肪酸と、ｂ）別位置（すなわち、同位体標識された脂肪酸により占領されていない位置）に存在するアシル化脂肪酸混合物とを有し、アシル化脂肪酸混合物は、標的複合脂質内の脂肪酸の濃度に近似する。
一例において、同位体標識された脂肪酸は飽和脂肪酸であり、アシル化脂肪酸混合物は、不飽和脂肪酸および多価不飽和脂肪酸の所定の混合物である。一例において、同位体標識された脂肪酸はｓｎ−１位のパルミテート（１６：０）であり、不飽和脂肪酸および多価不飽和脂肪酸のアシル化混合物はｓｎ−２位の所定の混合物である。一例において、アシル化混合物は不飽和脂肪酸から構成される。一例において、リン脂質はリゾホスファチジルコリンであり、リン脂質頭部基は同位体標識されたパルミテート（１６：０）をｓｎ−１位に有する。他の一例おいて、リン脂質はリゾホスファチジルエタノールアミンであり、リン脂質頭部基は同位体標識されたステアレート（１８：０）をｓｎ−１位に有する。脂肪酸の混合物の製造方法は以下のとおりである：１）所定のサンプルタイプ中の脂肪酸の濃度を決定する（濃度は既知のものでも脂肪酸組成分析により決定したものでもよい）；２）１または２以上の代表的な不飽和度（例えば、モノエン、ジエン、トリエン、テトラエン、ペンタエン、ヘキサエン）から１つ脂肪酸を選択する（脂質クラス中で最も多く存在する脂肪酸を選択する）；３）サンプルタイプ中の上記脂肪酸の濃度に基づいて、混合物中の各脂肪酸に「高」存在量または「小」存在量を割り当てる；４）「高」存在量か「小」存在量かに応じて混合物中の脂肪酸の割合（％）値を割り当てる（例えば、「高」存在量の脂肪酸は混合物の２０％を構成し、「小」存在量の脂肪酸は混合物の５％を構成する）；５）混合物の残りの割合（％）については、不飽和脂肪酸の中で最も多く存在する脂肪酸を決定し、上述のように「高」存在量または「小」存在量を割り当て、混合物を完成する。
内部標準混合物はリン脂質を含んでよく、各リン脂質クラス（例えば、ＰＣ、ＰＥ、ＳＭ）の頭部基は、ａ）ｓｎ−１位またはｓｎ−２位に存在する未標識脂肪酸と、ｂ）未標識脂肪酸により占領されていない位置に存在するＭＵＦＡまたはＰＵＦＡを有する。一例において、頭部基はａ）ｓｎ−１位に存在する未標識奇数鎖飽和脂肪酸と、ｂ）ｓｎ−２位に存在する奇数鎖ＭＵＦＡまたはＰＵＦＡを有する。
内部標準混合物は中性脂質を含んでよく、該中性脂質は同位体標識されたＭＵＦＡまたは奇数鎖ＭＵＦＡ（例えば、１７：１、１９：１など）の混合物を含む。
いくつかの実施形態において、定量的脂肪酸分析により内部標準混合物の正確な組成が決定され得る。リン脂質の一例において、各リン脂質頭部基のｓｎ−１位は１つの重水素化飽和脂肪酸（例えば、ｄ１６：０）で完全に標識されており、そのため、脂肪酸の残りはｓｎ−２位に存在する。式は下記のとおりである。すなわち、１＝Ａ／Ｘ＋Ｂ／Ｘ＋Ｃ／Ｘ・・・（式中、Ｘは混合物中の単一の重水素化飽和脂肪酸の割合（％）であり、Ａ、Ｂ、Ｃ・・・は混合物中の脂肪酸であり、内部標準混合物中の脂肪酸Ａ、Ｂ、Ｃ・・・の割合（％）はＸに対して既知である）。さらに、Ａ／Ｘは、Ａからなる混合物の量である。例えば、ＦＡＭＥ分析で決定したＰＣ用内部標準の組成がｄ１６：０−５０％、１８：１ｎ９−１０％、１８：２ｎ６−２０％、２０：４ｎ６−２０％である場合、１＝（０．１／０．５）＋（０．２／０．５）＋（０．２／０．５）、０．１／０．５＝０．２；０．２／．５＝０．４；０．２／０．５＝０．４であり、混合物は２０％ ＰＣｄ１６：０／１８：１ｎ９、４０％ ＰＣｄ１６：０／１８：２ｎ６，および、４０％ＰＣｄ１６：０／２０：４ｎ６から構成される。
遊離脂肪酸は、内部標準混合物を構成し得る中性脂質の１種である。遊離脂肪酸は任意の遊離脂肪酸であってよく、例えば、単一の奇数鎖脂肪酸（例えば、１７：１、１７：２、１７：０）および／または同位体標識された脂肪酸（例えば、１６：０、１６：１、１７：０）を含む。遊離脂肪酸はＭＵＦＡであり得るか、ＰＵＦＡであり得る。
コレステリルエステルは内部標準混合物を構成し得る中性脂質の１種である。コレステリルエステルは任意のコレステリルエステルであってよく、例えば、サンプル中のコレステリルエステルに予想される組成を示す脂肪酸の混合物にエステル化した標識コレステロール分子から構成されるコレステリルエステルが含まれる（表１を参照）。
ジアシルグリセロールは内部標準混合物を構成し得る中性脂質の１種である。ジアシルグリセロールは任意のジアシルグリセロールであってよく、例えば、一つの奇数鎖脂肪酸または同位体標識された脂肪酸を含む。ジアシルグリセロールの脂肪酸鎖は、ａ）ｓｎ−１位またはｓｎ−２位（第１の位置）に存在する同位体標識された脂肪酸と、ｂ）別位置（すなわち、同位体標識された脂肪酸により占領されていない位置）に存在するアシル化脂肪酸混合物とを含み得る。一例において、同位体標識された脂肪酸は飽和脂肪酸である。一例において、同位体標識された脂肪酸は第１の位置に存在するパルミテート（１６：０）であり、アシル化脂肪酸混合物は別位置に存在し、１６：０、１８：０、１８：１ｎ９、１８：２ｎ６、１８：３ｎ３、２０：４ｎ６、２０：５ｎ３、および、２２：６ｎ３を含み得る。一例において、同位体標識された脂肪酸は第１の位置に存在するパルミテート（１６：０）であり、別位置に存在するアシル化脂肪酸混合物は不飽和脂肪酸および多価不飽和脂肪酸の混合物である。他の一例において、内部標準混合物中のジアシルグリセロールの脂肪酸鎖は、ａ）第１の位置に存在する未標識奇数鎖飽和脂肪酸と、ｂ）別位置に存在する奇数鎖であるＭＵＦＡまたはＰＵＦＡを含み得る。内部標準中のジアシルグリセロールは、複数の均質な内部標準（例えば、ＤＧ１７：０／１７：０、および、ＤＧ１７：１／１７：１）を使用し得る。
トリアシルグリセロールは内部標準混合物を構成し得る中性脂質の１種である。トリアシルグリセロールは任意のトリアシルグリセロールであってよく、例えば、混合標準を作る奇数鎖脂肪酸および／または同位体標識された脂肪酸の混合物を含む。トリアシルグリセロールの脂肪酸鎖は、ａ）１つの位置に存在する標識された脂肪酸と、ｂ）別位置に存在する未標識脂肪酸と、ｃ）他の別位置に存在するアシル化脂肪酸混合物とを含み得る。一例において、標識された脂肪酸は飽和脂肪酸であって未標識脂肪酸は不飽和脂肪酸であり得る。一例において、標識は重水素標識であり得る。一例において、内部標準混合物中のトリアシルグリセロールの脂肪酸鎖は、ａ）１つの位置（例えば、ｓｎ−１位）に存在する同位体標識されたパルミテート（１６：０）と、ｂ）別位置、すなわち第２の位置（例えば、ｓｎ−２位）に存在するオレエート（１８：１ｎ９）と、ｃ）他の別位置、すなわち第３の位置（例えば、ｓｎ−３位）に存在するアシル化脂肪酸混合物とを含む。第３の位置（例えば、ｓｎ−３位）のアシル化脂肪酸混合物は、例えば、１６：０、１８：０、１８：１ｎ９、１８：２ｎ６、１８：３ｎ３、２０：３ｎ６、２０：４ｎ６、および、２２：６ｎ３を含み得る。
内部標準混合物は、ａ）ｓｎ−１位に同位体標識されたパルミテート（１６：０）を有し、ｓｎ−２位にＭＵＦＡとＰＵＦＡとの混合物を有するホスファチジルコリン脂質クラス； ｂ）ｓｎ−１位に同位体標識されたパルミテート（１６：０）またはステアレート（１８：０）を有し、ｓｎ−２位にＭＵＦＡとＰＵＦＡとの混合物を有するホスファチジルエタノールアミン脂質クラス；ｃ）ｓｎ−１位に同位体標識されたパルミテート（１６：０）を有するリゾホスファチジルコリン脂質クラス；ｄ）ｓｎ−１位に同位体標識されたパルミテート（１６：０）またはステアレート（１８：０）を有するリゾホスファチジルエタノールアミン脂質クラス；ｅ）同位体標識されたスフィンゴイド骨格、および、ｓｎ−２位に脂肪酸の混合物を有するスフィンゴミエリン脂質クラス；ｆ）ｓｎ−１位に同位体標識されたパルミテートを有し、ｓｎ−２位に未標識のオレエート（または他の脂肪酸）を有し、ｓｎ−３位に脂肪酸の混合物を有するトリアシルグリセロール脂質クラス；ｇ）脂肪酸の混合物にアシル化した同位体標識されたコレステロール頭部基を有するコレステリルエステル脂質クラス；ｈ）ｓｎ−１位に同位体標識されたパルミテート（１６：０）を有し、ｓｎ−２位に脂肪酸の混合物を有するジアシルグリセロール脂質クラス；ｉ）同位体標識された脂肪酸または１５：１または１７：１を有する遊離脂肪酸脂質クラス；および／または、ｊ）同位体標識されたスフィンゴ脂質骨格、および、そのセラミドクラスに適切な脂肪酸混合物を有するセラミド脂質クラスを含み得る。
一例において、セラミド脂質クラスは以下のスフィンゴ脂質骨格から構成され得る：スフィンゴシン、ジヒドロスフィンゴシン、フィトスフィンゴシン、または、６−ヒドロキシスフィンゴシン。
本願明細書に記載の試薬は、例えばキットとして、製品として組み合わされ得る。
複合脂質はクラスにより分類され、各クラスは脂質上の頭部基部分により定義される（例えば、ＰＣはホスホコリン頭部基を有し、ＣＥはコレステロール頭部基を有する）。ある１つの脂質クラス内で、頭部基に結合する脂肪酸によって定義される分子種が多数存在する。脂肪酸は多様な化学構造を有するため各脂質クラスは多数の多様な成分から構成され、独特な脂質分子種が生じることになる。ある１つの脂質クラスを定量するためには、それら分子種をそれぞれ定量し、正確にその量を合計する必要がある。
広範な脂質クラス（例えば、リン脂質）毎に単一の内部標準のみを通常使用する従来のリピドミクス戦略とは対照的に、本発明では、脂肪酸の混合物（脂質クラス毎に最大１０個の脂肪酸）を含む内部標準の合成方法が提供される。本方法では、内部標準混合物（ＩＳ混合物）中の脂肪酸は、分析対象のサンプルタイプに存在する脂質クラスに見出される化学構造（脂質分子種）の多様性を示すように選択される。表１は、本開示の方法に従って測定した各対応する脂質クラスの各脂肪酸の濃度を示す。各脂質クラス中の残りの脂肪酸は最も近い内部標準アナログに割り当て、その測定値を割り当てた。各脂質クラスについての総濃度は、その脂質クラスについての全ての分子種の値（測定値および割り当て値）を足すことにより計算した。
一実施形態において、表１に示す脂肪酸の組成に従って、１０種類の脂質クラスのそれぞれに対して内部標準が提供される。内部標準の脂質クラスを下記表１の第１行目に示し、脂肪酸「Ｒ」基を表１の第１列目に示す。表１中、「ｄ」は重水素標識の付加を示す。例えば、１６：０−ｄ９とは、９個の重水素が付加されたパルミテートをいう。
一実施形態において、ホスファチジルコリンおよびｏ−ホスファチジルコリンについて例示の内部標準成分が提供される。これらの内部標準用のｓｎ−２位の脂肪酸（ｓｎ−２脂肪酸）の組成を表２に示す。内部標準混合物を構成するホスファチジルコリンおよびｓｎ−２脂肪酸の構造を図２に示す。ｓｎ−１位に重水素化パルミテート（１６：０）を有し、ｓｎ−２位に脂肪酸（「Ｒ」と表示）を有するホスファチジルコリンの構造を（Ａ）に示す。ｓｎ−１位に重水素化パルミテート（１６：０）を有し、ｓｎ−２位に例示の脂肪酸としてオレエート（１８：１ｎ９）を有するホスファチジルコリンの構造を（Ｂ）に示す。ホスファチジルコリンのｓｎ−２位にアシル化するための脂肪酸混合物中の１０種類の脂肪酸（１６：１ｎ７、１８：１ｎ９、１８：２ｎ６、１８：３ｎ３、２０：３ｎ６、２０：４ｎ６、２０：５ｎ３、２２：４ｎ６、２２：５ｎ３、２２：６ｎ３）の構造を（Ｃ）に示す。
一実施形態において、例示のリゾホスファチジルコリン内部標準が提供される。構造を図３に示す。
ホスファチジルエタノールアミン内部標準およびｐ−ホスファチジルエタノールアミン内部標準について、ｓｎ−２脂肪酸の組成を表３に示す。内部標準混合物を構成するホスファチジルエタノールアミンおよびｓｎ−２脂肪酸の構造を図４に示す。ｓｎ−１位に重水素化ステアレート（１８：０）を有し、ｓｎ−２位に脂肪酸（「Ｒ」と表示）を有するホスファチジルエタノールアミンの構造を（Ａ）に示す。ｓｎ−１位に重水素化ステアレート（１８：０）を有し、ｓｎ−２位に例示の脂肪酸としてオレエート（１８：１ｎ９）を有するホスファチジルエタノールアミンの構造を（Ｂ）に示す。ホスファチジルエタノールアミンのｓｎ−２位にアシル化するための脂肪酸ミックス中の８種類の脂肪酸（１８：１ｎ９、１８：２ｎ６、１８：３ｎ３、２０：３ｎ６、２０：４ｎ６、２０：５ｎ３、２２：５ｎ３、２２：６ｎ３）の構造を（Ｃ）に示す。
一実施形態において、リゾホスファチジルエタノールアミンについて例示の内部標準が提供される。構造を図５に示す。
一実施形態において、スフィンゴミエリンについて例示の内部標準が提供される。脂肪酸の組成を表４に示す。内部標準混合物を構成するスフィンゴミエリンおよびｓｎ−２脂肪酸の構造を図６に示す。第１の位置に重水素標識スフィンゴシンを有し、ｓｎ−２位に脂肪酸（「Ｒ」と表示）を有するスフィンゴミエリンの構造を（Ａ）に示す。第１の位置に重水素標識スフィンゴシンを有し、ｓｎ−２位に例示の脂肪酸としてパルミテート（１６：０）を有するスフィンゴミエリンの構造を（Ｂ）に示す。スフィンゴミエリンのｓｎ−２位にアシル化するための脂肪酸ミックス中の４種類の脂肪酸（１６：０、１８：１ｎ９、２４：０、２４：１ｎ９）の構造を（Ｃ）に示す。
一実施形態において、トリアシルグリセロールについて例示の内部標準が提供される。ｓｎ−３脂肪酸の組成を表５に示す。内部標準混合物を構成するトリアシルグリセロールおよびｓｎ−３脂肪酸の構造を図７に示す。ｓｎ−１位に重水素標識パルミテート（１６：０）を有し、ｓｎ−２位にオレエート（１８：１ｎ９）を有し、ｓｎ−３位に脂肪酸「Ｒ」を有するトリアシルグリセロールの構造を（Ａ）に示す。ｓｎ−１位に重水素標識パルミテート（１６：０）を有し、ｓｎ−２位にオレエート（１８：１ｎ９）を有し、ｓｎ−３位に例示の脂肪酸としてパルミテート（１６：０）有するトリアシルグリセロールの構造を（Ｂ）に示す。トリアシルグリセロールのｓｎ−３位を標識するための脂肪酸ミックス中の８種類の脂肪酸（１６：０、１８：０、１８：１ｎ９、１８：２ｎ６、１８：３ｎ３、２０：３ｎ６、２０：４ｎ６、２２：６ｎ３）の構造を（Ｃ）に示す。
一実施形態において、ジアシルグリセロールについて例示の内部標準が提供される。ｓｎ−２脂肪酸の組成を表６に示す。内部標準混合物を構成するジアシルグリセロールおよびｓｎ−２脂肪酸の構造を図８に示す。ｓｎ−１位に重水素標識パルミテート（１６：０）を有し、ｓｎ−２位に脂肪酸（「Ｒ」と表示）を有するジアシルグリセロールの構造を（Ａ）に示す。ｓｎ−１位に重水素標識パルミテート（１６：０）を有し、ｓｎ−２位に例示の脂肪酸としてパルミテート（１６：０）を有するジアシルグリセロールの構造を（Ｂ）に示す。ジアシルグリセロールのｓｎ−２位を標識するための脂肪酸混合物中の８種類の脂肪酸（１６：０、１８：０、１８：１ｎ９、１８：２ｎ６、１８：３ｎ３、２０：４ｎ６、２０：５ｎ３、２２：６ｎ３）の構造を（Ｃ）に示す。
一実施形態において、コレステリルエステルについて例示の内部標準が提供される。脂肪酸の組成を表７に示す。内部標準混合物を構成するコレステリルエステルおよび脂肪酸の構造を図９に示す。ｎ６位に重水素標識を有し、脂肪酸「Ｒ」が水酸基にアシル化したコレステリルエステルの構造を（Ａ）に示す。ｎ６位に重水素標識を有し、例示の脂肪酸としてリノレート（１８：２ｎ６）が水酸基にアシル化したコレステリルエステルの構造を（Ｂ）に示す。コレステリルエステルの水酸基のアシル化に使用される脂肪酸ミックス中の８種類の脂肪酸（１６：０、１６：１ｎ７、１８：１ｎ９、１８：２ｎ６、２０：３ｎ６、２０：４ｎ６、２０：５ｎ３、２２：６ｎ３）の構造を（Ｃ）に示す。
一実施形態において、遊離脂肪酸について例示の内部標準が提供される。脂肪酸の組成を表８に示す。内部標準混合物を構成する遊離脂肪酸の構造を図１０に示す。重水素標識を有する遊離脂肪酸パルミテート（１６：０）を（Ａ）に示す。遊離脂肪酸１７：１ｎ７の構造を（Ｂ）に示す。
脂質内部標準の生成方法
本開示の一実施形態において、対象サンプル中の１または２以上の対応する脂質クラスに存在する脂質分子種の組成を表す内部標準として使用するための１または２以上の脂質分子混合物の合成方法であって、アシル基を少なくとも１つ有する脂質クラスについて、同位体標識された少なくとも２種類の脂肪酸の混合物を、脂質骨格上の単一位置にアシル化反応を介して付着させるステップ；アシル基を少なくとも１つ有する脂質クラスについて、少なくとも２種類の脂肪酸の混合物を、同位体標識された脂質骨格上の単一位置にアシル化反応を介して付着させるステップ；および、脂肪酸を少なくとも２つ有する脂質クラスについて、１つの同位体標識された脂肪酸を脂質骨格上の第１の位置にアシル化反応を介して付着させ、かつ、少なくとも２種類の脂肪酸の混合物を脂質骨格上の別位置にアシル化反応を介して付着させるステップ；のうちの１または２以上を含み、少なくとも２種類の脂肪酸の混合物は、対象サンプル中の対応する脂質クラスに存在する脂肪酸を表し、混合物中の各脂肪酸は、対象サンプル中の対応する脂質クラスに存在する脂質分子種中の脂肪酸の存在比率を表す比率で存在する、方法が提供される。対応する脂質クラスは、トリアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、１−モノアシルグリセロール、リン脂質、ホスファチジルコリン、ｏ−ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ｐ−ホスファチジルエタノールアミン、コレステリルエステル、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルセリン、リゾホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルグリセロール、リゾホスファチジン酸、リゾＣＤＰ−ジアシルグリセロール、ＣＤＰ−ジアシルグリセロール、スフィンゴミエリン、カルジオリピン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、セラミド、ラクトシルセラミド、グルコシルセラミド、フィトセラミド、６−ヒドロキシセラミド、セレブロシド、ガングリオシド、ワックスエステル、および、ワックスジエステルの１または２以上を含み得る。１または２以上の脂質分子混合物のそれぞれにおける１または２以上の脂肪酸混合物は、表１、表２、表３、表４、表５、表６または表７に記載の１または２以上の脂質分子種混合物を含み得る。１または２以上の脂質分子混合物のそれぞれにおける１または２以上の脂肪酸混合物は、表１、表２、表３、表４、表５、表６または表７に記載の１または２以上の脂質分子種混合物からなり得る。
本開示の一実施形態において、対象サンプル中の１または２以上の対応する脂質クラスに存在する脂質分子種の組成を表す内部標準として使用するための１または２以上の脂質分子混合物の合成方法であって、アシル基を少なくとも１つ有する脂質クラスについて、同位体標識された少なくとも２種類の脂肪酸の混合物を、脂質骨格上の単一位置にアシル化反応を介して付着させるステップ；アシル基を少なくとも１つ有する脂質クラスについて、少なくとも２種類の脂肪酸の混合物を、同位体標識された脂質骨格上の単一位置にアシル化反応を介して付着させるステップ；および、脂肪酸を少なくとも２つ有する脂質クラスについて、１つの同位体標識された脂肪酸を脂質骨格上の第１の位置にアシル化反応を介して付着させ、かつ、少なくとも２種類の脂肪酸の混合物を脂質骨格上の別位置にアシル化反応を介して付着させるステップ；のうちの１または２以上を含み、少なくとも２種類の脂肪酸の混合物は、対象サンプル中の対応する脂質クラスに存在する脂肪酸を表し、混合物中の各脂肪酸は、対象サンプル中の対応する脂質クラスに存在する脂質分子種中の脂肪酸の存在比率を表す比率で存在する、方法が提供される。対応する脂質クラスは、トリアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、１−モノアシルグリセロール、リン脂質、ホスファチジルコリン、ｏ−ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ｐ−ホスファチジルエタノールアミン、コレステリルエステル、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルセリン、リゾホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルグリセロール、リゾホスファチジン酸、リゾＣＤＰ−ジアシルグリセロール、ＣＤＰ−ジアシルグリセロール、スフィンゴミエリン、カルジオリピン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、セラミド、ラクトシルセラミド、グルコシルセラミド、フィトセラミド、６−ヒドロキシセラミド、セレブロシド、ガングリオシド、ワックスエステル、および、ワックスジエステルの１または２以上を含み得る。１または２以上の脂質分子混合物のそれぞれにおける１または２以上の脂肪酸混合物は、表１、表２、表３、表４、表５、表６または表７に記載の１または２以上の脂質分子種混合物を含み得る。１または２以上の脂質分子混合物のそれぞれにおける１または２以上の脂肪酸混合物は、表１、表２、表３、表４、表５、表６または表７に記載の１または２以上の脂質分子種混合物からなり得る。
本開示の一実施形態において、対象サンプル中の１または２以上の対応する脂質クラスに存在する脂質分子種の組成を表す１または２以上の脂質分子混合物の合成方法であって、アシル基を少なくとも２つ有する脂質クラスについて、同位体標識された脂肪酸を、脂質骨格上の第１の位置にアシル化反応を介して付着させるステップ；および、少なくとも２種類の脂肪酸の混合物を、脂質骨格上の別位置にアシル化反応を介して付着させるステップを含み、脂肪酸の混合物は、対象サンプル中の対応する脂質クラスに存在する脂肪酸を表し、脂肪酸の混合物における各脂肪酸は、対象サンプル中の対応する脂質クラスに存在する脂質分子中の脂肪酸の存在比率を表す比率で存在する、方法が提供される。本方法において、アシル基を少なくとも２つ有する１または２以上の脂質クラスは、トリアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、リン脂質、ホスファチジルコリン、ｏ−ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ｐ−ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、カルジオリピン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ＣＤＰ−ジアシルグリセロール、セラミド、ラクトシルセラミド、グルコシルセラミド、フィトセラミド、６−ヒドロキシセラミド、セレブロシド、ガングリオシド、または、ワックスジエステルを含み得る。１または２以上の脂質分子混合物のそれぞれにおける１または２以上の脂肪酸混合物は、表１、表２、表３、表４、表５または表６に記載の１または２以上の脂質分子種混合物を含み得る。１または２以上の脂質分子混合物のそれぞれにおける１または２以上の脂肪酸混合物は、表１、表２、表３、表４、表５または表６に記載の１または２以上の脂質分子種混合物からなり得る。
本開示の一実施形態において、対象サンプル中の１または２以上の対応する脂質クラスに存在する脂質分子種の組成を表す１または２以上の脂質分子混合物の合成方法であって、アシル基を少なくとも１つ有する脂質クラスについて、少なくとも２種類の脂肪酸の混合物を、同位体標識された脂質骨格上の単一位置にアシル化反応を介して付着させるステップを含み、脂肪酸の混合物は、対象サンプル中の対応する脂質クラスに存在する脂肪酸を表し、脂肪酸の混合物における各脂肪酸は、対象サンプル中の対応する脂質クラスに存在する脂質分子種中の脂肪酸の存在比率を表す比率で存在する、方法が提供される。本方法において、アシル基を少なくとも１つ有する１または２以上の脂質クラスは、トリアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、１−モノアシルグリセロール、リン脂質、ホスファチジルコリン、ｏ−ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ｐ−ホスファチジルエタノールアミン、コレステリルエステル、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルセリン、リゾホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルグリセロール、リゾホスファチジン酸、リゾＣＤＰ−ジアシルグリセロール、ＣＤＰ−ジアシルグリセロール、スフィンゴミエリン、カルジオリピン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、セラミド、ラクトシルセラミド、グルコシルセラミド、フィトセラミド、６−ヒドロキシセラミド、セレブロシド、ガングリオシド、ワックスエステル、または、ワックスジエステルを含み得る。１または２以上の脂質分子混合物のそれぞれにおける１または２以上の脂肪酸混合物は、表１、表２、表３、表４、表５、表６または表７に記載の１または２以上の脂質分子種混合物を含み得る。１または２以上の脂質分子混合物のそれぞれにおける１または２以上の脂肪酸混合物は、表１、表２、表３、表４、表５、表６または表７に記載の１または２以上の脂質分子種混合物からなり得る。
上述の各方法において、対象サンプルは、脂質分子から構成される複合混合物や、植物サンプルまたは動物サンプルなどの生体サンプルであり得る。動物サンプルは、ヒト、マウス、ヒト以外の霊長類、ウサギなどの哺乳類から由来するものでもよく、あるいは、ゼブラフィッシュサンプルなどの非哺乳類サンプルでもよい。対象の生体サンプルは、血液、血漿、血清、単離リポタンパク質分画、唾液、尿、リンパ液、脳脊髄液、組織サンプル、細胞サンプルまたは皮膚サンプルを含み得る。
上述の各方法は、混合物中の各脂肪酸の量を定量するために脂肪酸の定量分析を行うステップを更に含み得る。
上述の各方法において、脂肪酸は飽和脂肪酸であり得る。
上述の各方法において、同位体標識は、２Ｈ、１３Ｃまたは１５Ｎを含む、任意の同位体標識を含み得る。
上述の各方法の一実施形態において、脂質骨格上の第１の位置はｓｎ−１位であり得る。脂質骨格上の第１の位置はｓｎ−１位であり脂質骨格上の別位置はｓｎ−２位またはｓｎ−３位であり得る。代替的の一実施形態において、脂質骨格上の第１の位置はｓｎ−２位であり得る。第１の位置はｓｎ−２位であり別位置はｓｎ−１位またはｓｎ−３位であり得る。他の一実施形態において、脂質骨格上の第１の位置はｓｎ−３位であり得る。第１の位置はｓｎ−３位であり別位置はｓｎ−１位またはｓｎ−２位であり得る。
上述の各方法において、アシル基を少なくとも２つ有する１または２以上の脂質クラスは、ホスファチジルコリンまたはｏ−ホスファチジルコリンからなり得、第１の位置はｓｎ−１位であり別位置はｓｎ−２位であり得るか、あるいは、第１の位置はｓｎ−２位であり別位置はｓｎ−１位であり得、重水素標識ヘキサデカノイル−ｄ９（１６：０−ｄ９）が第１の位置に存在し得、別位置の脂肪酸の混合物は、９Ｚ−ヘキサデセノイル（１６：１ｎ７）、９Ｚ−オクタデセノイル（１８：１ｎ９）、９Ｚ，１２Ｚ−オクタデカジエノイル（１８：２ｎ６）、９Ｚ，１２Ｚ，１５Ｚ−オクタデカトリエノイル（１８：３ｎ３）、８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−エイコサトリエノイル（２０：３ｎ６）、５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−エイコサテトラエノイル（２０：４ｎ６）、５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ，１７Ｚ−エイコサペンタエノイル（２０：５ｎ３）、７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ−ドコサテトラエノイル（２２：４ｎ６）、７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ−ドコサペンタエノイル（２２：５ｎ３）、および、４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ−ドコサヘキサエノイル（２２：６ｎ３）を含み得る。ｓｎ−２位の脂肪酸の混合物は表２に示す比率で存在し得る。
上述の各方法において、アシル基を少なくとも２つ有する１または２以上の脂質クラスは、ホスファチジルエタノールアミンおよびｐ−ホスファチジルエタノールアミンからなり得、第１の位置はｓｎ−１位であり別位置はｓｎ−２位であり得るか、あるいは、第１の位置はｓｎ−２位であり別位置はｓｎ−１位であり得、重水素標識オクタデカノイル−ｄ９（１８：０−ｄ９）が第１の位置に存在し得、別位置の脂肪酸の混合物は、９Ｚ−オクタデセノイル（１８：１ｎ９）、９Ｚ，１２Ｚ−オクタデカジエノイル（１８：２ｎ６）、９Ｚ，１２Ｚ，１５Ｚ−オクタデカトリエノイル（１８：３ｎ３）、８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−エイコサトリエノイル（２０：３ｎ６）、５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−エイコサテトラエノイル（２０：４ｎ６）、５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ，１７Ｚ−エイコサペンタエノイル（２０：５ｎ３）、７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ−ドコサペンタエノイル（２２：５ｎ３）、および、４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ−ドコサヘキサエノイル（２２：６ｎ３）を含み得る。別位置の脂肪酸の混合物は表３に示す比率で存在し得る。
上述の各方法において、アシル基を少なくとも２つ有する１または２以上の脂質クラスはスフィンゴミエリンからなり得、重水素標識スフィンゴシンが第１の位置に存在し得、別位置の脂肪酸の混合物は、ヘキサデカノイル（１６：０）、９Ｚ−オクタデセノイル（１８：１ｎ９）、テトラコサノイル（２４：０）、および、１５Ｚ−テトラコセノイル（２４：１ｎ９）を含み得る。別位置の脂肪酸の混合物は表４に示す比率で存在し得る。
上述の各方法において、アシル基を少なくとも２つ有する１または２以上の脂質クラスはジアシルグリセロールからなり得、第１の位置はｓｎ−１位であり別位置はｓｎ−２位であり得るか、あるいは、第１の位置はｓｎ−２位であり別位置はｓｎ−１位であり得、重水素標識パルミテート（１６：０−ｄ９）が第１の位置に存在し得、別位置の脂肪酸の混合物は、ヘキサデカノイル（１６：０）、オクタデカノイル（１８：０）、９Ｚ−オクタデセノイル（１８：１ｎ９）、９Ｚ，１２Ｚ−オクタデカジエノイル（１８：２ｎ６）、９Ｚ，１２Ｚ，１５Ｚ−オクタデカトリエノイル（１８：３ｎ３）、５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−エイコサテトラエノイル（２０：４ｎ６）、５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ，１７Ｚ−エイコサペンタエノイル（２０：５ｎ３）、および、４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ−ドコサヘキサエノイル（２２：６ｎ３）を含み得る。別位置の脂肪酸の混合物は表６に示す比率で存在し得る。
上述の各方法において、アシル基を少なくとも２つ有する１または２以上の脂質クラスはトリアシルグリセロールからなり得、第１の位置はｓｎ−１位であり別位置はｓｎ−２位またはｓｎ−３位であり得るか、第１の位置はｓｎ−２位であり別位置はｓｎ−１位またはｓｎ−３位であり得るか、あるいは、第１の位置はｓｎ−３位であり別位置はｓｎ−１位またはｓｎ−２位であり得、重水素標識パルミテート（１６：０−ｄ９）が第１の位置に存在し得、オレエート（１８：１ｎ９）が１つの別位置に存在し得、他の別位置の脂肪酸の混合物が、ヘキサデカノイル（１６：０）、オクタデカノイル（１８：０）、９Ｚ−オクタデセノイル（１８：１ｎ９）、９Ｚ，１２Ｚ−オクタデカジエノイル（１８：２ｎ６）、９Ｚ，１２Ｚ，１５Ｚ−オクタデカトリエノイル（１８：３ｎ３）、８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−エイコサトリエノイル（２０：３ｎ６）、５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−エイコサテトラエノイル（２０：４ｎ６）、および、４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ−ドコサヘキサエノイル（２２：６ｎ３）を含み得る。別位置の脂肪酸の混合物は、表５に示す比率で存在し得る。
上述の各方法において、アシル基を少なくとも１つ有する１または２以上の脂質クラスはコレステリルエステルからなり得、単一位置は水酸基であり得、水酸基に付着する脂肪酸の混合物は、ヘキサデカノエート（１６：０）、９Ｚ−ヘキサデカノエート（１６：１ｎ７）、９Ｚ−オクタデセノエート（１８：１ｎ９）、９Ｚ，１２Ｚ−オクタデカジエノエート（１８：２ｎ６）、８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−エイコサトリエノエート（２０：３ｎ６）、５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−エイコサテトラエノエート（２０：４ｎ６）、５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ，１７Ｚ−エイコサペンタエノエート（２０：５ｎ３）、および、４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ−ドコサヘキサエノエート（２２：６ｎ３）を含み得る。水酸基における脂肪酸の混合物は、表７に示す比率で存在し得る。
脂質内部標準として使用するための組成物
本開示の一実施形態において、対象サンプル中の１または２以上の対応する脂質クラスに存在する脂質分子種の組成を表す１または２以上の脂質分子混合物を含む、内部標準として使用するための組成物であって、各脂質分子混合物は、脂質骨格上の単一位置に少なくとも２種類の同位体標識された脂肪酸の混合物を有する脂質骨格であって、アシル基を少なくとも１つ有する脂質クラスのための脂質骨格；脂質骨格上の単一位置に少なくとも２種類の脂肪酸の混合物を有する同位体標識された脂質骨格であって、アシル基を少なくとも１つ有する脂質クラスのための脂質骨格；および、脂質骨格上の第１の位置に単一の同位体標識された脂肪酸を有し、かつ脂質骨格上の別位置に少なくとも２種類の脂肪酸の混合物を有する脂質骨格であって、脂肪酸を少なくとも２つ有する脂質クラスのための脂質骨格；のうちの１または２以上を含み、少なくとも２種類の脂肪酸の混合物は、対象サンプル中の対応する脂質クラスに存在する脂肪酸を表し、混合物中の各脂肪酸は、対象サンプル中の対応する脂質クラスに存在する脂質分子種中の脂肪酸の存在比率を表す比率で存在する、組成物が提供される。脂質クラスは、トリアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、１−モノアシルグリセロール、リン脂質、ホスファチジルコリン、ｏ−ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ｐ−ホスファチジルエタノールアミン、コレステリルエステル、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルセリン、リゾホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルグリセロール、リゾホスファチジン酸、リゾＣＤＰ−ジアシルグリセロール、ＣＤＰ−ジアシルグリセロール、スフィンゴミエリン、カルジオリピン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、セラミド、ラクトシルセラミド、グルコシルセラミド、フィトセラミド、６−ヒドロキシセラミド、セレブロシド、ガングリオシド、ワックスエステル、および、ワックスジエステルの１または２以上を含み得る。１または２以上の脂質分子混合物のそれぞれにおける１または２以上の脂肪酸混合物は、表１、表２、表３、表４、表５、表６または表７に記載の１または２以上の脂質分子種混合物を含み得る。１または２以上の脂質分子混合物のそれぞれにおける１または２以上の脂肪酸混合物は、表１、表２、表３、表４、表５、表６または表７に記載の１または２以上の脂質分子種混合物からなり得る。
本開示の一実施形態において、対象サンプル中の１または２以上の対応する脂質クラスに存在する脂質分子種の組成を表す１または２以上の脂質分子混合物を含む、内部標準として使用するための組成物であって、各脂質分子混合物は、脂質骨格上の単一位置に少なくとも２種類の同位体標識された脂肪酸の混合物を有する脂質骨格であって、アシル基を少なくとも１つ有する脂質クラスのための脂質骨格；脂質骨格上の単一位置に少なくとも２種類の脂肪酸の混合物を有する同位体標識された脂質骨格であって、アシル基を少なくとも１つ有する脂質クラスのための脂質骨格；および、脂質骨格上の第１の位置に単一の同位体標識された脂肪酸を有し、かつ脂質骨格上の別位置に少なくとも２種類の脂肪酸の混合物を有する脂質骨格であって、脂肪酸を少なくとも２つ有する脂質クラスのための脂質骨格；のうちの１または２以上を含み、少なくとも２種類の脂肪酸の混合物は、対象サンプル中の対応する脂質クラスに存在する脂肪酸を表し、混合物中の各脂肪酸は、対象サンプル中の対応する脂質クラスに存在する脂質分子種中の脂肪酸の存在比率を表す比率で存在する、組成物が提供される。脂質クラスは、トリアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、１−モノアシルグリセロール、リン脂質、ホスファチジルコリン、ｏ−ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ｐ−ホスファチジルエタノールアミン、コレステリルエステル、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルセリン、リゾホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルグリセロール、リゾホスファチジン酸、リゾＣＤＰ−ジアシルグリセロール、ＣＤＰ−ジアシルグリセロール、スフィンゴミエリン、カルジオリピン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、セラミド、ラクトシルセラミド、グルコシルセラミド、フィトセラミド、６−ヒドロキシセラミド、セレブロシド、ガングリオシド、ワックスエステル、および、ワックスジエステルの１または２以上を含み得る。１または２以上の脂質分子混合物のそれぞれにおける１または２以上の脂肪酸混合物は、表１、表２、表３、表４、表５、表６または表７に記載の１または２以上の脂質分子種混合物を含み得る。１または２以上の脂質分子混合物のそれぞれにおける１または２以上の脂肪酸混合物は、表１、表２、表３、表４、表５、表６または表７に記載の１または２以上の脂質分子種混合物からなり得る。
本開示の一実施形態において、対象サンプル中の１または２以上の対応する脂質クラスに存在する脂質分子種の組成を表す１または２以上の脂質分子混合物を含む、内部標準として使用するための組成物であって、各脂質分子混合物は、脂質骨格上の第１の位置に同位体標識された脂肪酸を有する脂質骨格であって、アシル基を少なくとも２つ有する脂質クラスのための脂質骨格；および、脂質骨格上の別位置に存在する少なくとも２種類の脂肪酸の混合物を含み、脂肪酸の混合物は、対象サンプル中の脂質クラスに存在する脂肪酸を表し、混合物中の各脂肪酸は、対象サンプル中の対応する脂質クラスに存在する脂質分子種中の脂肪酸の存在比率を表す比率で存在する、組成物が提供される。本組成物において、脂質クラスは、トリアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、リン脂質、ホスファチジルコリン、ｏ−ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ｐ−ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、カルジオリピン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ＣＤＰ−ジアシルグリセロール、セラミド、ラクトシルセラミド、グルコシルセラミド、フィトセラミド、６−ヒドロキシセラミド、セレブロシド、ガングリオシド、および、ワックスジエステルの１または２以上を含み得る。１または２以上の脂質分子混合物のそれぞれにおける１または２以上の脂肪酸混合物は、表１、表２、表３、表４、表５または表６に記載の１または２以上の脂質分子種混合物を含み得る。１または２以上の脂質分子混合物のそれぞれにおける１または２以上の脂肪酸混合物は、表１、表２、表３、表４、表５または表６に記載の１または２以上の脂質分子種混合物からなり得る。
本開示の一実施形態において、対象サンプル中の１または２以上の対応する脂質クラスに存在する脂質分子種の組成を表す１または２以上の脂質分子混合物を含む、内部標準として使用するための組成物であって、各脂質分子混合物は、１または２以上の同位体標識を有する脂質骨格であって、アシル基を少なくとも１つ有する脂質クラスのための脂質骨格；および、脂質骨格上の単一位置に存在する少なくとも２種類の脂肪酸の混合物を含み、脂肪酸の混合物は、対象サンプル中の脂質クラスに存在する脂肪酸を表し、混合物中の各脂肪酸は、対象サンプル中の対応する脂質クラスに存在する脂質分子種中の脂肪酸の存在比率を表す比率で存在する、組成物が提供される。本組成物において、脂質クラスは、トリアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、１−モノアシルグリセロール、リン脂質、ホスファチジルコリン、ｏ−ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ｐ−ホスファチジルエタノールアミン、コレステリルエステル、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルセリン、リゾホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルグリセロール、リゾホスファチジン酸、リゾＣＤＰ−ジアシルグリセロール、ＣＤＰ−ジアシルグリセロール、スフィンゴミエリン、カルジオリピン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、セラミド、ラクトシルセラミド、グルコシルセラミド、フィトセラミド、６−ヒドロキシセラミド、セレブロシド、ガングリオシド、ワックスエステル、および、ワックスジエステルの１または２以上を含み得る。１または２以上の脂質分子混合物のそれぞれにおける１または２以上の脂肪酸混合物は、表１、表２、表３、表４、表５、表６または表７に記載の１または２以上の脂質分子種混合物を含み得る。１または２以上の脂質分子混合物のそれぞれにおける１または２以上の脂肪酸混合物は、表１、表２、表３、表４、表５、表６または表７に記載の１または２以上の脂質分子種混合物からなり得る。
上記各組成物において、対象サンプルは、脂質分子から構成される複合混合物や、植物サンプルまたは動物サンプルなどの生体サンプルであり得る。動物サンプルは、ヒト、マウス、ヒト以外の霊長類、ウサギなどの哺乳類から由来するものでもよく、あるいは、ゼブラフィッシュサンプルなどの非哺乳類サンプルでもよい。対象の生体サンプルは、血液、血漿、血清、単離リポタンパク質分画、唾液、尿、リンパ液、脳脊髄液、組織サンプル、細胞サンプルまたは皮膚サンプルを含み得る。
上記各組成物において、同位体標識は、２Ｈ、１３Ｃまたは１５Ｎを含む、任意の同位体標識を含み得る。
上記各組成物において、脂肪酸は飽和脂肪酸であり得る。
上記各組成物において、脂質骨格上の第１の位置はｓｎ−１位であり得る。脂質骨格上の第１の位置はｓｎ−１位であり脂質骨格上の別位置はｓｎ−２位またはｓｎ−３位であり得る。代替的な一実施形態において、脂質骨格上の第１の位置はｓｎ−２位であり得る。第１の位置はｓｎ−２位であり別位置はｓｎ−１位またはｓｎ−３位であり得る。他の一実施形態において、脂質骨格上の第１の位置はｓｎ−３位であり得る。第１の位置はｓｎ−３位であり別位置はｓｎ−１位またはｓｎ−２位であり得る。
上記各組成物において、脂質クラスの１つはホスファチジルコリンまたはｏ−ホスファチジルコリンからなり得、第１の位置はｓｎ−１位であり別位置はｓｎ−２位であり得るか、あるいは、第１の位置はｓｎ−２位であり別位置はｓｎ−１位であり得、重水素標識ヘキサデカノイル−ｄ９（１６：０−ｄ９）が第１の位置に存在し得、別位置の脂肪酸の混合物は、９Ｚ−ヘキサデセノイル（１６：１ｎ７）、９Ｚ−オクタデセノイル（１８：１ｎ９）、９Ｚ，１２Ｚ−オクタデカジエノイル（１８：２ｎ６）、９Ｚ，１２Ｚ，１５Ｚ−オクタデカトリエノイル（１８：３ｎ３）、８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−エイコサトリエノイル（２０：３ｎ６）、５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−エイコサテトラエノイル（２０：４ｎ６）、５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ，１７Ｚ−エイコサペンタエノイル（２０：５ｎ３）、７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ−ドコサテトラエノイル（２２：４ｎ６）、７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ−ドコサペンタエノイル（２２：５ｎ３）、および、４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ−ドコサヘキサエノイル（２２：６ｎ３）を含み得る。別位置の脂肪酸の混合物は表２に示す比率で存在し得る。
上記各組成物において、脂質クラスの１つはホスファチジルエタノールアミンおよびｐ−ホスファチジルエタノールアミンからなり得、第１の位置はｓｎ−１位であり別位置はｓｎ−２位であり得るか、あるいは、第１の位置はｓｎ−２位であり別位置はｓｎ−１位であり得、重水素標識オクタデカノイル−ｄ９（１８：０−ｄ９）が第１の位置に存在し得、別位置の脂肪酸の混合物は、９Ｚ−オクタデセノイル（１８：１ｎ９）、９Ｚ，１２Ｚ−オクタデカジエノイル（１８：２ｎ６）、９Ｚ，１２Ｚ，１５Ｚ−オクタデカトリエノイル（１８：３ｎ３）、８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−エイコサトリエノイル（２０：３ｎ６）、５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−エイコサテトラエノイル（２０：４ｎ６）、５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ，１７Ｚ−エイコサペンタエノイル（２０：５ｎ３）、７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ−ドコサペンタエノイル（２２：５ｎ３）、および、４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ−ドコサヘキサエノイル（２２：６ｎ３）を含み得る。別位置の脂肪酸の混合物は表３に示す比率で存在し得る。
上記各組成物において、脂質クラスの１つはスフィンゴミエリンからなり得、第１の位置に重水素標識スフィンゴシンが存在し得、別位置の脂肪酸の混合物は、ヘキサデカノイル（１６：０）、９Ｚ−オクタデセノイル（１８：１ｎ９）、テトラコサノイル（２４：０）、および、１５Ｚ−テトラコセノイル（２４：１ｎ９）を含み得る。別位置の脂肪酸の混合物は表４に示す比率で存在し得る。
上記各組成物において、脂質クラスの１つはジアシルグリセロールからなり得、第１の位置はｓｎ−１位であり別位置はｓｎ−２位であり得るか、あるいは、第１の位置はｓｎ−２位であり別位置はｓｎ−１位であり得、重水素標識パルミテート（１６：０−ｄ９）が第１の位置に存在し得、別位置の脂肪酸の混合物は、ヘキサデカノイル（１６：０）、オクタデカノイル（１８：０）、９Ｚ−オクタデセノイル（１８：１ｎ９）、９Ｚ，１２Ｚ−オクタデカジエノイル（１８：２ｎ６）、９Ｚ，１２Ｚ，１５Ｚ−オクタデカトリエノイル（１８：３ｎ３）、５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−エイコサテトラエノイル（２０：４ｎ６）、５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ，１７Ｚ−エイコサペンタエノイル（２０：５ｎ３）、および、４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ−ドコサヘキサエノイル（２２：６ｎ３）を含み得る。別位置の脂肪酸の混合物は表６に示す比率で存在し得る。
上記各組成物において、脂質クラスの１つはトリアシルグリセロールからなり得、第１の位置はｓｎ−１位であり別位置はｓｎ−２位またはｓｎ−３位であり得るか、第１の位置はｓｎ−２位であり別位置はｓｎ−１位またはｓｎ−３位であり得るか、あるいは、第１の位置はｓｎ−３位であり別位置はｓｎ−１位またはｓｎ−２位であり得、重水素標識パルミテート（１６：０−ｄ９）が第１の位置に存在し得、オレエート（１８：１ｎ９）がｓｎ−２位に存在し得、別位置の脂肪酸の混合物は、ヘキサデカノイル（１６：０）、オクタデカノイル（１８：０）、９Ｚ−オクタデセノイル（１８：１ｎ９）、９Ｚ，１２Ｚ−オクタデカジエノイル（１８：２ｎ６）、９Ｚ，１２Ｚ，１５Ｚ−オクタデカトリエノイル（１８：３ｎ３）、８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−エイコサトリエノイル（２０：３ｎ６）、５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−エイコサテトラエノイル（２０：４ｎ６）、および、４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ−ドコサヘキサエノイル（２２：６ｎ３）を含み得る。別位置の脂肪酸の混合物は表５に示す比率で存在し得る。
上記各組成物において、脂質クラスの１つはコレステリルエステルからなり得、単一位置は水酸基であり得、水酸基に付着する脂肪酸の混合物は、ヘキサデカノエート（１６：０）、９Ｚ−ヘキサデカノエート（１６：１ｎ７）、９Ｚ−オクタデセノエート（１８：１ｎ９）、９Ｚ，１２Ｚ−オクタデカジエノエート（１８：２ｎ６）、８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−エイコサトリエノエート（２０：３ｎ６）、５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−エイコサテトラエノエート（２０：４ｎ６）、５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ，１７Ｚ−エイコサペンタエノエート（２０：５ｎ３）、および、４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ−ドコサヘキサエノエート（２２：６ｎ３）を含み得る。水酸基における脂肪酸の混合物は表７に示す比率で存在し得る。
対象サンプル中の脂質分子の検出および定量方法
本開示の一実施形態において、対象サンプル中に存在する脂質分子を検出または定量する方法であって、ｉ）対象サンプル中の１または２以上の対応する脂質クラスに存在する脂質分子種の組成を表す１または２以上の脂質分子混合物を有する既知量の組成物を対象サンプルに添加するステップであって、該組成物は、ａ）脂質骨格上の単一位置に少なくとも２種類の同位体標識された脂肪酸の混合物を有する脂質骨格であって、アシル基を少なくとも１つ有する脂質クラスのための脂質骨格；ｂ）脂質骨格上の単一位置に少なくとも２種類の脂肪酸の混合物を有する同位体標識された脂質骨格であって、アシル基を少なくとも１つ有する脂質クラスのための脂質骨格；および、ｃ）脂質骨格上の第１の位置に単一の同位体標識された脂肪酸を有し、かつ脂質骨格上の別位置に少なくとも２種類の脂肪酸の混合物を有する脂質骨格であって、脂肪酸を少なくとも２つ有する脂質クラスのための脂質骨格；のうちの１または２以上を含み、少なくとも２種類の脂肪酸の混合物は、対象サンプル中の対応する脂質クラスに存在する脂肪酸を表し、混合物中の各脂肪酸は、対象サンプル中の対応する脂質クラスに存在する脂質分子種中の脂肪酸の存在比率を表す比率で存在する、ステップ；および、ｉｉ）脂質分子種の組成を表す１または２以上の脂質分子混合物を有する組成物を内部標準として使用して、対象サンプル中の１または２以上の対応する脂質クラスのそれぞれに存在する脂質分子種を検出または定量するステップ、を含む方法が提供される。
本開示の一実施形態において、対象サンプル中に存在する脂質分子を検出または定量する方法であって、ｉ）対象サンプル中の１または２以上の対応する脂質クラスに存在する脂質分子種の組成を表す１または２以上の脂質分子混合物を有する既知量の組成物を対象サンプルに添加するステップであって、該組成物は、ａ）脂質骨格上の単一位置に少なくとも２種類の同位体標識された脂肪酸の混合物を有する脂質骨格であって、アシル基を少なくとも１つ有する脂質クラスのための脂質骨格；ｂ）脂質骨格上の単一位置に少なくとも２種類の脂肪酸の混合物を有する同位体標識された脂質骨格であって、アシル基を少なくとも１つ有する脂質クラスのための脂質骨格；および、ｃ）脂質骨格上の第１の位置に単一の同位体標識された脂肪酸を有し、かつ脂質骨格上の別位置に少なくとも２種類の脂肪酸の混合物を有する脂質骨格であって、脂肪酸を少なくとも２つ有する脂質クラスのための脂質骨格；のうちの１または２以上を含み、少なくとも２種類の脂肪酸の混合物は、対象サンプル中の対応する脂質クラスに存在する脂肪酸を表し、混合物中の各脂肪酸は、対象サンプル中の対応する脂質クラスに存在する脂質分子種中の脂肪酸の存在比率を表す比率で存在する、ステップ；および、ｉｉ）脂質分子種の組成を表す１または２以上の脂質分子混合物を有する組成物を内部標準として使用して、対象サンプル中の１または２以上の対応する脂質クラスのそれぞれに存在する脂質分子種を検出または定量するステップ、を含む方法が提供される。
本開示の一実施形態において、対象サンプル中に存在する脂質分子を検出または定量する方法であって、対象サンプル中の１または２以上の対応する脂質クラスに存在する脂質分子種の組成を表す１または２以上の脂質分子混合物を有する既知量の組成物を対象サンプルに添加するステップであって、各脂質分子混合物は、ｉ）脂質骨格上の第１の位置に同位体標識された脂肪酸を有する脂質骨格であって、アシル基を少なくとも２つ有する脂質クラスのための脂質骨格；および、ｉｉ）脂質骨格上の別位置に存在する少なくとも２種類の脂肪酸の混合物を含み、脂肪酸の混合物は、対象サンプル中の対応する脂質クラスに存在する脂肪酸を表し、混合物中の各脂肪酸は、対象サンプル中の対応する脂質クラスに存在する脂質分子種中の脂肪酸の存在比率を表す比率で存在する、ステップ；および、脂質分子種の組成を表す脂質分子混合物を内部標準として使用して、対象サンプル中の対応する脂質クラスに存在する脂質分子種を検出または定量するステップ、を含む方法が提供される。
本開示の一実施形態において、対象サンプル中に存在する脂質分子を検出または定量する方法であって、対象サンプル中の１または２以上の対応する脂質クラスに存在する脂質分子種の組成を表す１または２以上の脂質分子混合物を有する既知量の組成物を対象サンプルに添加するステップであって、各脂質分子混合物は、ｉ）１または２以上の同位体標識を有する脂質骨格であって、アシル基を少なくとも１つ有する脂質クラスのための脂質骨格；および、ｉｉ）脂質骨格上の単一位置に存在する少なくとも２種類の脂肪酸の混合物を含み、脂肪酸の混合物は、対象サンプル中の対応する脂質クラスに存在する脂肪酸を表し、混合物中の各脂肪酸は、対象サンプル中の対応する脂質クラスに存在する脂質分子種中の脂肪酸の存在比率を表す比率で存在する、ステップ；および、脂質分子種の組成を表す脂質分子混合物を内部標準として使用して、対象サンプル中の対応する脂質クラスに存在する脂質分子種を検出または定量するステップ、を含む方法が提供される。
対象サンプル中に存在する脂質分子種を検出および／または定量する方法は、質量分析（ＭＳ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、イソクラティックＨＰＬＣ、グラジエントＨＰＬＣ、順相クロマトグラフィー、逆相ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、マイクロフルイディクス技術、クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、および、これらの組み合わせを含み得る。生体サンプル中に存在する脂質分子種を検出および／または定量する方法は、質量分析（ＭＳ）の使用を含み得る。
対象サンプル中に存在する脂質分子種を検出および／または定量する方法において、対象サンプルは、脂質分子から構成される複合混合物や、植物サンプルまたは動物サンプルなどの生体サンプルであり得る。動物サンプルは、ヒト、マウス、ヒト以外の霊長類、ウサギなどの哺乳類から由来するものでもよく、あるいは、ゼブラフィッシュサンプルなどの非哺乳類サンプルでもよい。対象の生体サンプルは、血液、血漿、血清、単離リポタンパク質分画、唾液、尿、リンパ液、脳脊髄液、組織サンプル、細胞サンプルまたは皮膚サンプルを含み得る。
対象サンプル中に存在する脂質分子種を検出および／または定量する方法において、１または２以上の脂質分子混合物のそれぞれにおける１または２以上の脂肪酸混合物は、表１、表２、表３、表４、表５、表６または表７に記載の１または２以上の脂質分子種混合物を含み得る。１または２以上の脂質分子混合物のそれぞれにおける１または２以上の脂肪酸混合物は、表１、表２、表３、表４、表５、表６または表７に記載の１または２以上の脂質分子種混合物からなり得る。
キット
一般的に、本開示のキットは、１または２以上の内部標準と、対象サンプル中の脂質を検出および／または定量するために内部標準を使用するための指示書とを含む。キットは、１または２以上の対照サンプルおよびサンプル収集レセプタクルを更に含み得る。キット中の各内部標準組成物は、１または２以上の脂質クラスの様々な組み合わせで一緒にパッケージ化され得るか、あるいは、それぞれ別個のバイアルまたは容器内にパッケージ化され得る。キットは、調製・使用のための指示を記載したラベルおよび／または添付文書、試料収集用レセプタクル、輸送用容器、および／または、出荷用封筒を含み得る。別個に梱包される更なるキットのコンポーネントには、対象サンプル中の脂質を検出および／または定量するためのバッファーおよび他の試薬が含まれ得る。
一般的に、本開示のキットは、１または２以上の内部標準と、対象サンプル中の脂質を検出および／または定量するために内部標準を使用するための指示書とを含む。キットは、１または２以上の対照サンプルおよびサンプル収集レセプタクルを更に含み得る。キット中の各内部標準組成物は、１または２以上の脂質クラスの様々な組み合わせで一緒にパッケージ化され得るか、あるいは、それぞれ別個のバイアルまたは容器内にパッケージ化され得る。キットは、調製・使用のための指示を記載したラベルおよび／または添付文書、試料収集用レセプタクル、輸送用容器、および／または、出荷用封筒を含み得る。別個に梱包される更なるキットのコンポーネントには、対象サンプル中の脂質を検出および／または定量するためのバッファーおよび他の試薬が含まれ得る。
上記キットは１または２以上の内部標準混合物を含み得る。一実施形態において、キットは、同位体標識された脂肪酸を含む内部標準混合物であって、対象サンプル中の各脂質クラスに由来する、少なくとも１つの同位体標識された脂肪酸が存在するものを含み得る。一実施形態において、キットは、表１に示す脂質クラスおよび同位体標識された脂肪酸を含む内部標準セットを含み得る。更なる一実施形態において、内部標準セットにおける同位体標識された脂肪酸は表１に示す比率で存在する。
上記キットは全量容器（volumetric container）を更に含み得る。全量容器は、液体サンプルの保持に適した任意の容器（すなわち、カップ、バイアル、マイクロ遠心チューブ、マイクロタイタープレートなど）であり得る。全量容器は、サンプルまたは他の試薬の所望量を計量するのに有用であろう目盛りを有し得る。全量容器は任意の材料（例えば、プラスチック、アルミニウム、ステンレス鋼）からなり得る。全量容器の内部容積は収集対象のサンプルの種類に依存する。いくつかの実施形態において、内部標準材料はキャップに付着され得る。いくつかの実施形態において、内部標準材料は全量容器本体内部にコーティングされ得る。
いくつかの実施形態において、全量容器はまた、想定されるサンプル収集の種類に応じて構成されて試料の収集に使用され得る。他の態様において、試料収集レセプタクルがキット中に別個に提供され、これはカップ、バイアル、マイクロ遠心チューブの形態であり得る。
上記キットは任意で輸送用容器を含み得る。輸送用容器はサンプルの輸送に適した任意の構造であり得る。この容器はサンプル材料を容器中に詰めることができるように構成され、また、シールされ得る。
上記キットは任意で抽出溶液を含み得る。
本開示の一実施形態において、ｉ）内部標準として使用するための１または２以上の脂質分子混合物であって、１または２以上の脂質分子混合物は、それぞれ、対象サンプル中の１または２以上の対応する脂質クラスに存在する脂質分子種の組成を表し、各脂質分子混合物は、脂質骨格上の単一位置に少なくとも２種類の同位体標識された脂肪酸の混合物を有する脂質骨格であって、アシル基を少なくとも１つ有する脂質クラスのための脂質骨格；脂質骨格上の単一位置に少なくとも２種類の脂肪酸の混合物を有する同位体標識された脂質骨格であって、アシル基を少なくとも１つ有する脂質クラスのための脂質骨格；および、脂質骨格上の第１の位置に単一の同位体標識された脂肪酸を有し、かつ脂質骨格上の別位置に少なくとも２種類の脂肪酸の混合物を有する脂質骨格であって、アシル基を少なくとも２つ有する脂質クラスのための脂質骨格；のうちの１または２以上を含み、少なくとも２種類の脂肪酸の混合物は、対象サンプル中の対応する脂質クラスに存在する脂肪酸を表し、混合物中の各脂肪酸は、対象サンプル中の対応する脂質クラスに存在する脂質分子種中の脂肪酸の存在比率を表す比率で存在する、１または２以上の脂質分子混合物と、ｉｉ）対象サンプル中の脂質クラスに存在する脂質分子種を検出または定量するために、１または２以上の脂質分子混合物を内部標準として使用するための指示と、を含むキットが提供される。脂質クラスは、トリアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、１−モノアシルグリセロール、リン脂質、ホスファチジルコリン、ｏ−ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ｐ−ホスファチジルエタノールアミン、コレステリルエステル、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルセリン、リゾホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルグリセロール、リゾホスファチジン酸、リゾＣＤＰ−ジアシルグリセロール、ＣＤＰ−ジアシルグリセロール、スフィンゴミエリン、カルジオリピン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、セラミド、ラクトシルセラミド、グルコシルセラミド、フィトセラミド、６−ヒドロキシセラミド、セレブロシド、ガングリオシド、ワックスエステル、および、ワックスジエステルの１または２以上を含み得る。
本開示の一実施形態において、ｉ）内部標準として使用するための１または２以上の脂質分子混合物であって、１または２以上の脂質分子混合物は、それぞれ、対象サンプル中の１または２以上の対応する脂質クラスのそれぞれに存在する脂質分子種の組成を表し、各脂質分子混合物は、脂質骨格上の第１の位置に同位体標識された脂肪酸と、脂質骨格上の別位置に存在する少なくとも２種類の脂肪酸の混合物とを含む脂質骨格であって、アシル基を少なくとも２つ有する脂質クラスのための脂質骨格；または、１または２以上の同位体標識と、脂質骨格上の単一位置に存在する少なくとも２種類の脂肪酸の混合物とを有する脂質骨格であって、アシル基を少なくとも１つ有する脂質クラスのための脂質骨格を含み、脂肪酸の混合物は、対象サンプル中の脂質クラスに存在する脂肪酸を表し、混合物中の各脂肪酸は、対象サンプル中の対応する脂質クラスに存在する脂質分子種中の脂肪酸の存在比率を表す比率で存在する、１または２以上の脂質分子混合物と、ｉｉ）対象サンプル中の対応する脂質クラスに存在する脂質分子種を検出または定量するために、１または２以上の脂質分子混合物を内部標準として使用するための指示と、を含むキットが提供される。アシル基を少なくとも２つ有する脂質クラスは、トリアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、リン脂質、ホスファチジルコリン、ｏ−ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ｐ−ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、カルジオリピン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ＣＤＰ−ジアシルグリセロール、セラミド、ラクトシルセラミド、グルコシルセラミド、フィトセラミド、６−ヒドロキシセラミド、セレブロシド、ガングリオシド、および、ワックスジエステルの１または２以上を含み得る。アシル基を少なくとも１つ有する脂質クラスは、トリアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、リン脂質、ホスファチジルコリン、ｏ−ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ｐ−ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、カルジオリピン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ＣＤＰ−ジアシルグリセロール、セラミド、ラクトシルセラミド、グルコシルセラミド、フィトセラミド、６−ヒドロキシセラミド、セレブロシド、ガングリオシド、ワックスジエステル、コレステリルエステル、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルセリン、リゾホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルグリセロール、リゾホスファチジン酸、リゾＣＤＰ−ジアシルグリセロール、ワックスエステル、１−モノアシルグリセロールの１または２以上を含み得る。
上記各キットは、対象サンプル中の２以上の対応する脂質クラスに存在する脂質分子種の組成を表す２以上の脂質分子混合物を含み得る。２以上の脂質分子混合物は単一のコンポーネントとしてパッケージ化することができる。また、２以上の脂質分子混合物はそれぞれ別個のコンポーネントとしてパッケージ化することもできる。
上記各キットは検出および定量用の試薬を更に含み得る。
上記各キットは、既知濃度の脂質分子種の組成物を有する対照サンプルを更に有し得る。
上記各キットは、対象サンプル中の遊離脂肪酸の組成を表す、内部標準として使用するための遊離脂肪酸混合物を更に有し得る。キットに使用されるこれらの遊離脂肪酸は表８に示す遊離脂肪酸を含み得る。
上記各キットにおいて、対象サンプルは、脂質分子から構成される複合混合物や、植物サンプルまたは動物サンプルなどの生体サンプルであり得る。動物サンプルは、ヒト、マウス、ヒト以外の霊長類、ウサギなどの哺乳類から由来するものでもよく、あるいは、ゼブラフィッシュサンプルなどの非哺乳類サンプルでもよい。対象の生体サンプルは、血液、血漿、血清、単離リポタンパク質分画、唾液、尿、リンパ液、脳脊髄液、組織サンプル、細胞サンプルまたは皮膚サンプルを含み得る。
上記各キットにおいて、脂肪酸は飽和脂肪酸であり得る。
上記各キットにおいて、同位体標識は２Ｈ、１３Ｃまたは１５Ｎを含み得る。
上記各キットにおいて、１または２以上の脂質分子混合物のそれぞれにおける１または２以上の脂肪酸混合物は、表１、表２、表３、表４、表５、表６、表７および表８の１または２以上に記載の脂質分子種混合物を含み得る。上記各キットにおいて、１または２以上の脂質分子混合物のそれぞれにおける１または２以上の脂肪酸混合物は、表１、表２、表３、表４、表５、表６、表７および表８の１または２以上に記載の脂質分子種混合物からなり得る。
上記キットにおいて、脂質骨格上の第１の位置はｓｎ−１位であり得る。脂質骨格上の第１の位置はｓｎ−１位であり脂質骨格上の別位置はｓｎ−２位またはｓｎ−３位であり得る。
上記キットにおいて、脂質クラスの１つはホスファチジルコリンまたはｏ−ホスファチジルコリンからなり得、第１の位置はｓｎ−１位であり別位置はｓｎ−２位であり得るか、あるいは、第１の位置はｓｎ−２位であり別位置はｓｎ−１位であり得、重水素標識ヘキサデカノイル−ｄ９（１６：０−ｄ９）が第１の位置に存在し得、別位置の脂肪酸の混合物は、９Ｚ−ヘキサデセノイル（１６：１ｎ７）、９Ｚ−オクタデセノイル（１８：１ｎ９）、９Ｚ、１２Ｚ−オクタデカジエノイル（１８：２ｎ６）、９Ｚ，１２Ｚ，１５Ｚ−オクタデカトリエノイル（１８：３ｎ３）、８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−エイコサトリエノイル（２０：３ｎ６）、５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−エイコサテトラエノイル（２０：４ｎ６）、５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ，１７Ｚ−エイコサペンタエノイル（２０：５ｎ３）、７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ−ドコサテトラエノイル（２２：４ｎ６）、７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ−ドコサペンタエノイル（２２：５ｎ３）、および、４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ−ドコサヘキサエノイル（２２：６ｎ３）を含み得る。別位置の脂肪酸基の混合物は表２に示す比率で存在し得る。
上記キットにおいて、脂質クラスの１つはホスファチジルエタノールアミンおよびｐ−ホスファチジルエタノールアミンからなり得、第１の位置はｓｎ−１位であり別位置はｓｎ−２位であり得るか、あるいは、第１の位置はｓｎ−２位であり別位置はｓｎ−１位であり得、重水素標識オクタデカノイル−ｄ９（１８：０−ｄ９）が第１の位置に存在し得、別位置の脂肪酸の混合物は、９Ｚ−オクタデセノイル（１８：１ｎ９）、９Ｚ，１２Ｚ−オクタデカジエノイル（１８：２ｎ６）、９Ｚ，１２Ｚ，１５Ｚ−オクタデカトリエノイル（１８：３ｎ３）、８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−エイコサトリエノイル（２０：３ｎ６）、５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−エイコサテトラエノイル（２０：４ｎ６）、５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ，１７Ｚ−エイコサペンタエノイル（２０：５ｎ３）、７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ−ドコサペンタエノイル（２２：５ｎ３）、および、４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ−ドコサヘキサエノイル（２２：６ｎ３）を含み得る。別位置の脂肪酸基の混合物は表３に示す比率で存在し得る。
上記キットにおいて、脂質クラスの１つはスフィンゴミエリンからなり得、第１の位置に重水素標識スフィンゴシンが存在し得、別位置の脂肪酸の混合物は、ヘキサデカノイル（１６：０）、９Ｚ−オクタデセノイル（１８：１ｎ９）、テトラコサノイル（２４：０）、および、１５Ｚ−テトラコセノイル（２４：１ｎ９）を含み得る。別位置の脂肪酸基の混合物は表４に示す比率で存在し得る。
上記キットにおいて、脂質クラスの１つはジアシルグリセロールからなり得、第１の位置はｓｎ−１位であり別位置はｓｎ−２位であり得るか、あるいは、第１の位置はｓｎ−２位であり別位置はｓｎ−１位であり得、重水素標識パルミテート（１６：０−ｄ９）が第１の位置に存在し得、別位置の脂肪酸基の混合物は、ヘキサデカノイル（１６：０）、オクタデカノイル（１８：０）、９Ｚ−オクタデセノイル（１８：１ｎ９）、９Ｚ，１２Ｚ−オクタデカジエノイル（１８：２ｎ６）、９Ｚ，１２Ｚ，１５Ｚ−オクタデカトリエノイル（１８：３ｎ３）、５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−エイコサテトラエノイル（２０：４ｎ６）、５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ，１７Ｚ−エイコサペンタエノイル（２０：５ｎ３）、および、４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ−ドコサヘキサエノイル（２２：６ｎ３）を含み得る。別位置の脂肪酸基の混合物は表６に示す比率で存在し得る。
上記キットにおいて、脂質クラスの１つはトリアシルグリセロールからなり得、第１の位置はｓｎ−１位であり別位置はｓｎ−２位またはｓｎ−３位であり得るか、第１の位置はｓｎ−２位であり別位置はｓｎ−１位またはｓｎ−３位であり得るか、あるいは、第１の位置はｓｎ−３位であり別位置はｓｎ−１位またはｓｎ−２位であり得、重水素標識パルミテート（１６：０−ｄ９）が第１の位置に存在し得、オレエート（１８：１ｎ９）が１つの別位置に存在し得、他の別位置の脂肪酸基の混合物は、ヘキサデカノイル（１６：０）、オクタデカノイル（１８：０）、９Ｚ−オクタデセノイル（１８：１ｎ９）、９Ｚ，１２Ｚ−オクタデカジエノイル（１８：２ｎ６）、９Ｚ，１２Ｚ，１５Ｚ−オクタデカトリエノイル（１８：３ｎ３）、８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−エイコサトリエノイル（２０：３ｎ６）、５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−エイコサテトラエノイル（２０：４ｎ６）、および、４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ−ドコサヘキサエノイル（２２：６ｎ３）を含み得る。別位置の脂肪酸基の混合物は表５に示す比率で存在し得る。
上記キットにおいて、脂質クラスの１つは、コレステリルエステル、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルセリン、リゾホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルグリセロール、リゾホスファチジン酸、リゾＣＤＰ−ジアシルグリセロール、ワックスエステル、または、１−モノアシルグリセロールを含み得る。
上記キットにおいて、脂質クラスの１つはコレステリルエステルからなり得、単一位置は水酸基であり得、水酸基に付着する脂肪酸の混合物は、ヘキサデカノエート（１６：０）、９Ｚ−ヘキサデカノエート（１６：１ｎ７）、９Ｚ−オクタデセノエート（１８：１ｎ９）、９Ｚ，１２Ｚ−オクタデカジエノエート（１８：２ｎ６）、８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−エイコサトリエノエート（２０：３ｎ６）、５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−エイコサテトラエノエート（２０：４ｎ６）、５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ，１７Ｚ−エイコサペンタエノエート（２０：５ｎ３）、および、４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ−ドコサヘキサエノエート（２２：６ｎ３）を含み得る。水酸基におけるアシル基の混合物は表７に示す比率で存在し得る。
脂質分子の測定方法
脂質代謝物含有量または脂質分子含有量のアッセイは、体液サンプル（例えば、血液、血漿、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ））、組織サンプル、細胞サンプル、皮膚サンプル、溶液、複合混合物、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養細胞、および、細胞培地などの任意のサンプルタイプについて実施され得る。いくつかの実施形態において、脂質分子の量は、脂質の複合混合物、血液、血漿、血清、単離リポタンパク質分画、唾液、尿、リンパ液、および、脳脊髄液からなる群から選択される１または２以上のサンプルから決定される。いくつかの実施形態において、アッセイは、全血液、血漿、血清または単離リポタンパク質分画について行われ得る。またいくつかの実施形態において、１または２以上のサンプルは血漿または血清である。
脂質代謝物含有量または脂質分子含有量のアッセイは、体液サンプル（例えば、血液、血漿、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ））、組織サンプル、細胞サンプル、皮膚サンプル、溶液、複合混合物、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養細胞、および、細胞培地などの任意のサンプルタイプについて実施され得る。いくつかの実施形態において、脂質分子の量は、脂質の複合混合物、血液、血漿、血清、単離リポタンパク質分画、唾液、尿、リンパ液、および、脳脊髄液からなる群から選択される１または２以上のサンプルから決定される。いくつかの実施形態において、アッセイは、全血液、血漿、血清または単離リポタンパク質分画について行われ得る。またいくつかの実施形態において、１または２以上のサンプルは血漿または血清である。
いくつかの実施形態において、複数種の脂質分子が同一サンプル中で測定される。いくつかの他の実施形態において、複数の脂質分子はそれぞれ異なるサンプルから測定される。複数のサンプルを使用する場合、これらのサンプルは、対象の同一の体液から得られたものでも、異なる体液から得られたものでもよい。
脂質分子および他のバイオマーカーは当業者に公知の方法により容易に単離および／または定量され得る。これらの方法には、限定されないが、質量分析（ＭＳ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、イソクラティックＨＰＬＣ、グラジエントＨＰＬＣ、順相クロマトグラフィー、逆相ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、マイクロフルイディクス技術、クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、親和性クロマトグラフィー、免疫アッセイ、および／または、比色アッセイを利用する方法が含まれる。いくつかの実施形態において、本発明の方法はＭＳを利用して脂質分子含有量を決定する。
脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）分析を行うために、クロロホルム：メタノール（２：１ ｖ／ｖ）を使用したＦｏｌｃｈ ｅｔ ａｌ．（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２２６：４９７−５０９）の方法により脂質を抽出した。中性脂質は、固相クロマトグラフィーにより極性脂質から単離した。Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １１００ Ｓｅｒｉｅｓ ＬＣを使用して極性脂質分画を個々の脂質クラスに分離し、次いで、収集して各脂質クラスの分画を脂肪酸分析した。石油エーテル／ジエチルエーテル／酢酸（８０：２０：１）溶媒系を用いた薄層クロマトグラフィーにより中性脂質を個々の脂質クラスに分離し、各脂質クラスの分画を収集して脂肪酸分析した。各脂質クラスについて、封止バイアルに入れた１％硫酸メタノール溶液中、窒素雰囲気下、１００℃で４５分間エステル交換を行った。得られた脂肪酸メチルエステルを、０．０５％ブチル化ヒドロキシトルエンを含むヘキサンを用いて混合物から抽出し、このヘキサン抽出物を窒素下で封止してＧＣ分析用サンプルを調製した。３０ｍ ＤＢ ８８キャピラリーカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および水素炎イオン化検出器を装着したキャピラリーＧＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ６８９０ Ｓｅｒｉｅｓ ＧＣ）により、脂肪酸メチルエステルを単離・定量した。
様々な分析方法が当業者に周知であり、これらは、その内容全体を本願明細書に援用する下記文献に更に記載されている。
質量分析（ＭＳ）の文献：Cyr D, et al. A GCIMS validated method for the nanomolar range determination of succinylacetone in amniotic fluid and plasma: an analytical tool for tyrosinemia type I. J Chromatogr B Analyt Techno) Biomed Life Sci. 2006 Feb 17;832(1):24- 9; Vogeser M. Abstract Liquid chromatography-tandem mass spectrometry--application in the clinical laboratory. Clin Chern Lab Med. 2003 Feb;41(2):117-26
ＨＰＬＣの文献： Khalil PN, et al. Validation and application of a high-performance liquid chromatographic-based assay for determination of the inosine 5'-monophosphate dehydrogenase activity in erythrocytes. J Chromatogr B Analyt Techno) Biomed Life Sci. 2006 May 23; Fouassier M, et al. Determination of serotonin release from platelets by HPLC and ELISA in the diagnosis of heparin-induced thrombocytopenia: comparison with reference method by [C)-serotonin release assay; J Thromb Haemost. 2006 May;4(5): 1136-9; Badiou S, et al. Determination of plasma amino acids by fluorescent derivatization and reversed-phase liquid chromatographic separation. Clin Lab. 2004;50(3-4): 153-8; Brunelli T, et al. Comparison of three methods for total homocysteine plasma determination. Clin Lab. 200 I ;47(7-8):393-7
キャピラリー電気泳動（ＣＥ）の文献：Zinellu A, et al. Assay for the simultaneous determination of guanidinoacetic acid, creatinine and creatine in plasma and urine by capillary electrophoresis UV -detection. J Sep Sci. 2006 Mar;29(5):704-8; Jabeen R, et al. Capillary electrophoresis and the clinical laboratory. Electrophoresis. 2006 May 23; Gao P, et al. Rapid detection of Staphylococcus aureus by a combination of monoclonal antibody-coated latex and capillary electrophoresis. Electrophoresis. 2006 May;27(9):1784-9
マイクロフルイディクス技術の文献：Johannessen EA, et al. A suspended membrane nanocalorimeter for ultralow volume bioanalysis. IEEE Trans Nanobioscience. 2002 Mar;l(l):29-36; Herrmann M, et al. Enzymatically-generated fluorescent detection in micro-channels with internal magnetic mixing for the development of parallel microfluidic ELISA; Lab Chip. 2006 Apr;6(4):555-60. Epub 2006 Mar 3; Yang S, et al. Blood plasma separation in microfluidic channels using flow rate control. ASAIO J. 2005 Sep-Oct;51 (5):585-90; Dupuy AM, et al. Protein biochip systems for the clinical laboratory; Clin Chern Lab Med. 2005;43{12):1291-302
クロマトグラフィーの文献： Paterson S, et al. Validation of techniques to detect illicit heroin use in patients prescribed pharmaceutical heroin for the management of opioid dependence. Addiction. 2005 Dec; 1 00( 12): 1832-9; Bottcher M, et al. Evaluation of buprenorphine CEDIA assay versus GC-MS and ELISA using urine samples from patients in substitution treatment. J Anal Toxicol. 2005 Nov-Dec;29(8):769-76; Julak J. Chromatographic analysis in bacteriologic diagnostics of blood cultures, exudates, and bronchoalveolar lavages. Prague Med Rep. 2005; 1 06(2): 175-94; Boettcher M, et al. Precision and comparability of Abuscreen OnLine assays for drugs of abuse screening in urine on Hitachi 917 with other immunochemical tests and with GC/MS. Clin Lab. 2000;46(1-2):49-52
免疫アッセイの文献：Boettcher M, et al. Precision and comparability of Abuscreen OnLine assays for drugs of abuse screening in urine on Hitachi 917 with other immunochemical tests and with GC/MS. Clin Lab. 2000;46(1-2):49-52; Westermann J, et al. Simple, rapid and sensitive determination of epinephrine and norepinephrine in urine and plasma by non-competitive enzyme immunoassay, compared with HPLC method. Clin Lab. 2002;48(1-2):61-71; Aoyagi K, et al. Performance of a conventional enzyme immunoassay for hepatitis C virus core antigen in the early phases of hepatitis C infection. Clin Lab. 200 I ;47(3-4): 119-27; Hub I W, et al. A multi-center quality control study of different CA 15-3 immunoassays. Clin Lab. 2005;51(11-12):641-5; Haller CA, et al. Comparison of an automated and point-of-care immunoassay to GC-MS for urine oxycodone testing in the clinical laboratory. J Anal Toxicol. 2006 Mar;30(2): 106-11; Bayer M, et al. Evaluation of a new enzyme-linked immunosorbent assay for the determination of neopterin. Clin Lab. 2005 ;51 (9-1 0):495-504; Groche D, et al. Standardization of two immunological HbA 1 c routine assays according to the new IFCC reference method. Clin Lab. 2003;49( 11-12):657-6 1; Ivan 0, et al; German KIMS Board. Applicability of recently established reference values for serum insulin-like growth factor I: A comparison of two assays--an (automated) chemiluminescence immunoassay and an enzyme-linked immunosorbent assay. Clin Lab. 2005;51(7-8):381-7
比色アッセイの文献： Kramer KA, et al. Automated spectrophotometric analysis of mitochondrial respiratory chain complex enzyme activities in cultured skin fibroblasts. Clin Chern. 2005 Nov;51(11):2110-6; Groche D, et al. Standardization of two immunological HbA 1 c routine assays according to the new IFCC reference method. Clin Lab. 2003;49(11-12):657-61; WolfPL. History of diagnostic enzymology: A review of significant investigations. Clin Chim Acta. 2006 Mar 24
ＴＲＵＥＭＡＳＳ分析プラットフォームも本発明の方法に使用され得る。ＴＲＵＥＭＡＳＳは、トリグリセリド、コレステロールエステルおよびリン脂質の代謝などの構造脂質・エネルギー脂質代謝に関わる約４００種類の個々の代謝物についてサンプルから定量データを得るために使用され得る分析プラットフォームである。このプラットフォームは病気のプロファイリングに有用である。構造脂質・エネルギー脂質は代謝の中心的な成分であり、体内の全ての生物学的プロセスに実質的に組み込まれているからである。血漿、血清または他の生体サンプルなどのサンプルのデータセットは、遊離コレステロールや、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルコリン、トリグリセリド、ジグリセリド、遊離脂肪酸およびコレステロールエステルに由来する以下の脂肪酸の定量測定値を含む：すなわち、１４：０、１５：０、１６：０、１８：０、２０：０、２２：０、２４：０、１４：１ｎ５、ｌ６：１ｎ７、ｔ１６：１ｎ７、１８：１ｎ９、ｔ１８：１ｎ９、１８：ｌｎ７、１８：２ｎ６、ｔ１８：２ｎ６、１８：３ｎ６、１８：３ｎ３、１８：４ｎ３、２０：ｌｎ９、２０：２ｎ６、２０：３ｎ９、２０：３ｎ６、２０：４ｎ６、２０：３ｎ３、２０：４ｎ３、２０：５ｎ３、２２：１ｎ９、２２：２ｎ６、２２：４ｎ６、２２：５ｎ３、２２：６ｎ３、２４：１ｎ９、２４：６ｎ３、ならびに、１６：０、１８：０、１８：１ｎ９および１８：１ｎ７のプラズマロゲン誘導体。ＴＲＵＥＭＡＳＳの使用方法は当業者に周知であり、これはまた、その内容全体を本願明細書に援用する下記文献に記載されている。米国特許出願第１１／２９６８２９号明細書（２０１２年６月５日出願）；Mutch DM, et al. An integrative metabolism approach identifies stearoyi-CoA desaturase as a target for an arachidonate-enriched diet. FASEB J. 2005 Apr;19(6):599-601. Epub 2005 Jan 24；Stone SJ, et al. Lipopenia and skin barrier abnormalities in DGAT2-deficient mice. J Bioi Chern. 2004 Mar 19;279(12):11767-76；Watkins SM, et al. Phosphatidylethanolamine-N-methyltransferase activity and dietary choline regulate liver-plasma lipid flux and essential fatty acid metabolism in mice.J Nutr. 2003 Nov; 133(11 ):3386-91；Watkins SM, et al. Lipid metabolome-wide effects of the PPARgamma agonist rosiglitazone. Lipid Res. 2002 Nov;43(11):1809-17
下記実施例は例示を目的としており、限定することを目的としない。
実施例１：内部標準混合物の合成組成物
広範な脂質クラス（例えば、リン脂質）毎に単一の内部標準のみを通常使用する従来のリピドミクス戦略とは対照的に、本発明では、脂肪酸の混合物（脂質クラス毎に最大１０個の脂肪酸）を含む内部標準を合成した。内部標準混合物（ＩＳ混合物）中の脂肪酸は、分析対象のサンプルタイプに存在する脂質クラスに見出される化学構造（脂質分子種）の多様性を表すように選択した。表１に示す各脂肪酸の濃度は各脂質クラスについて測定したものであり、脂質クラス内の残りの全ての脂肪酸は最も近い内部標準アナログに割り当て、また、その測定値を割り当てた。各脂質クラスについての総濃度は、その脂質クラスについての全ての分子種の値（測定値および割り当て値）を足すことにより計算した。
実施例１：内部標準混合物の合成組成物
広範な脂質クラス（例えば、リン脂質）毎に単一の内部標準のみを通常使用する従来のリピドミクス戦略とは対照的に、本発明では、脂肪酸の混合物（脂質クラス毎に最大１０個の脂肪酸）を含む内部標準を合成した。内部標準混合物（ＩＳ混合物）中の脂肪酸は、分析対象のサンプルタイプに存在する脂質クラスに見出される化学構造（脂質分子種）の多様性を表すように選択した。表１に示す各脂肪酸の濃度は各脂質クラスについて測定したものであり、脂質クラス内の残りの全ての脂肪酸は最も近い内部標準アナログに割り当て、また、その測定値を割り当てた。各脂質クラスについての総濃度は、その脂質クラスについての全ての分子種の値（測定値および割り当て値）を足すことにより計算した。
表１に示す脂肪酸組成に従って、１０種類の脂質クラスのそれぞれの内部標準を合成した。内部標準の脂質クラスを表１の第１行目に示し、脂肪酸「Ｒ」基を表１の第１列目に示す。表１中、「ｄ」は重水素標識の付加を示す。例えば、１６：０−ｄ９とは、９個の重水素が付加されたパルミテートをいう。
実施例２：内部標準およびその混合物の合成および説明
リン酸グリセロール頭部基から出発して、重水素標識パルミテート（１６：０）をｓｎ−１位にアシル化し、そして不飽和脂肪酸混合物をｓｎ−２位にアシル化することにより、ホスファチジルコリン、ｏ−ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミンおよびｐ−ホスファチジルエタノールアミンについて例示のリン脂質内部標準を合成した。リン脂質、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンの標識戦略を図１に示す。
リン酸グリセロール頭部基から出発して、重水素標識パルミテート（１６：０）をｓｎ−１位にアシル化し、そして不飽和脂肪酸混合物をｓｎ−２位にアシル化することにより、ホスファチジルコリン、ｏ−ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミンおよびｐ−ホスファチジルエタノールアミンについて例示のリン脂質内部標準を合成した。リン脂質、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンの標識戦略を図１に示す。
例示のホスファチジルコリン内部標準成分およびｏ−ホスファチジルコリン内部標準成分について、ｓｎ−２位の脂肪酸（ｓｎ−２脂肪酸）の組成を表２に示す。内部標準混合物を構成するホスファチジルコリンおよびｓｎ−２脂肪酸の構造を図２に示す。ｓｎ−１位に重水素化パルミテート（１６：０）を有し、ｓｎ−２位に脂肪酸（「Ｒ」と表示）を有するホスファチジルコリンの構造を（Ａ）に示す。ｓｎ−１位に重水素化パルミテート（１６：０）を有し、ｓｎ−２位に例示の脂肪酸としてオレエート（１８：１ｎ９）を有するホスファチジルコリンの構造を（Ｂ）に示す。ホスファチジルコリンのｓｎ−２位にアシル化するための脂肪酸混合物中の１０種類の脂肪酸（１６：１ｎ７、１８：１ｎ９、１８：２ｎ６、１８：３ｎ３、２０：３ｎ６、２０：４ｎ６、２０：５ｎ３、２２：４ｎ６、２２：５ｎ３、２２：６ｎ３）の構造を（Ｃ）に示す。
リン脂質頭部基から出発して、重水素標識パルミテート（１６：０）をアシル化して、例示のリゾホスファチジルコリン内部標準を合成した。構造を図３に示す。
ホスファチジルエタノールアミン内部標準およびｐ−ホスファチジルエタノールアミン内部標準について、ｓｎ−２脂肪酸の組成を表３に示す。内部標準混合物を構成するホスファチジルエタノールアミンおよびｓｎ−２脂肪酸の構造を図４に示す。ｓｎ−１位に重水素化ステアレート（１８：０）を有し、ｓｎ−２位に脂肪酸（「Ｒ」と表示）を有するホスファチジルエタノールアミンの構造を（Ａ）に示す。ｓｎ−１位に重水素化ステアレート（１８：０）を有し、ｓｎ−２位に例示の脂肪酸としてオレエート（１８：１ｎ９）を有するホスファチジルエタノールアミンの構造を（Ｂ）に示す。ホスファチジルエタノールアミンのｓｎ−２位にアシル化するための脂肪酸ミックス中の８種類の脂肪酸（１８：１ｎ９、１８：２ｎ６、１８：３ｎ３、２０：３ｎ６、２０：４ｎ６、２０：５ｎ３、２２：５ｎ３、２２：６ｎ３）の構造を（Ｃ）に示す。
リン脂質頭部基から出発して、重水素標識ステアレート（１８：０）をアシル化して、リゾホスファチジルエタノールアミン内部標準を合成した。構造を図５に示す。
ホスホコリン頭部基から出発して、ｓｎ−１位に重水素標識スフィンゴシンをアシル化し、ｓｎ−２位に脂肪酸の混合物をアシル化することにより、スフィンゴミエリン内部標準を合成した。ｓｎ−２位のアシル化脂肪酸混合物は、例えば、１６：０、１８：１ｎ９、２４：０、および、２４：１ｎ９を含み得る。
例示のスフィンゴミエリン内部標準成分について、脂肪酸の組成を表４に示す。内部標準混合物を構成するスフィンゴミエリンおよびｓｎ−２脂肪酸の構造を図６に示す。第１の位置に重水素標識スフィンゴシンを有し、ｓｎ−２位に脂肪酸（「Ｒ」と表示）を有するスフィンゴミエリンの構造を（Ａ）に示す。第１の位置に重水素標識スフィンゴシンを有し、ｓｎ−２位に例示の脂肪酸としてパルミテート（１６：０）を有するスフィンゴミエリンの構造を（Ｂ）に示す。スフィンゴミエリンのｓｎ−２位にアシル化するための脂肪酸ミックス中の４種類の脂肪酸（１６：０、１８：１ｎ９、２４：０、２４：１ｎ９）の構造を（Ｃ）に示す。
ジアシルグリセロール骨格から出発して、ｓｎ−１位に重水素標識パルミテート（１６：０）をアシル化し、ｓｎ−２位にオレエート（１８：１ｎ９）をアシル化し、ｓｎ−３位に脂肪酸の混合物をアシル化することにより、トリアシルグリセロール内部標準を合成した。ｓｎ−３位のアシル化脂肪酸混合物は、例えば、１６：０、１８：０、１８：１ｎ９、１８：２ｎ６、１８：３ｎ３、２０：３ｎ６、２０：４ｎ６、および、２２：６ｎ３を含み得る。
例示のトリアシルグリセロール内部標準について、ｓｎ−３脂肪酸の組成を表５に示す。内部標準混合物を構成するトリアシルグリセロールおよびｓｎ−３脂肪酸の構造を図７に示す。ｓｎ−１位に重水素標識パルミテート（１６：０）を有し、ｓｎ−２位にオレエート（１８：１ｎ９）を有し、ｓｎ−３位に脂肪酸「Ｒ」を有するトリアシルグリセロールの構造を（Ａ）に示す。ｓｎ−１位に重水素標識パルミテート（１６：０）を有し、ｓｎ−２位にオレエート（１８：１ｎ９）を有し、ｓｎ−３位に例示の脂肪酸としてパルミテート（１６：０）有するトリアシルグリセロールの構造を（Ｂ）に示す。トリアシルグリセロールのｓｎ−３位を標識するための脂肪酸ミックス中の８種類の脂肪酸（１６：０、１８：０、１８：１ｎ９、１８：２ｎ６、１８：３ｎ３、２０：３ｎ６、２０：４ｎ６、２２：６ｎ３）の構造を（Ｃ）に示す。
グリセロール骨格から出発して、ｓｎ−１位に重水素標識パルミテート（１６：０）をアシル化し、ｓｎ−２位に脂肪酸の混合物をアシル化することにより、例示のジアシルグリセロール内部標準を合成した。ｓｎ−２位のアシル化脂肪酸混合物は、例えば、１６：０、１８：０、１８：１ｎ９、１８：２ｎ６、１８：３ｎ３、２０：４ｎ６、２０：５ｎ３、および、２２：６ｎ３を含み得る。
例えば、ジアシルグリセロールについて、ｓｎ−２脂肪酸の組成を表６に示す。内部標準混合物を構成するジアシルグリセロールおよびｓｎ−２脂肪酸の構造を図８に示す。ｓｎ−１位に重水素標識パルミテート（１６：０）を有し、ｓｎ−２位に脂肪酸（「Ｒ」と表示）を有するジアシルグリセロールの構造を（Ａ）に示す。ｓｎ−１位に重水素標識パルミテート（１６：０）を有し、ｓｎ−２位に例示の脂肪酸としてパルミテート（１６：０）を有するジアシルグリセロールの構造を（Ｂ）に示す。ジアシルグリセロールのｓｎ−２位を標識するための脂肪酸混合物中の８種類の脂肪酸（１６：０、１８：０、１８：１ｎ９、１８：２ｎ６、１８：３ｎ３、２０：４ｎ６、２０：５ｎ３、２２：６ｎ３）の構造を（Ｃ）に示す。
コレステロール骨格から出発して、ｎ６位に重水素標識を付加し、水酸基に脂肪酸の混合物をアシル化することにより、例示のコレステリルエステル内部標準を合成した。水酸基のアシル化脂肪酸混合物は、例えば、１６：０、１６：１ｎ７、１８：１ｎ９、１８：２ｎ６、２０：３ｎ６、２０：４ｎ６、２０：５ｎ３、および、２２：６ｎ３を含み得る。
例えば、コレステリルエステルについて、脂肪酸の組成を表７に示す。内部標準混合物を構成するコレステリルエステルおよび脂肪酸の構造を図９に示す。ｎ６位に重水素標識を有し、脂肪酸「Ｒ」が水酸基にアシル化したコレステリルエステルの構造を（Ａ）に示す。ｎ６位に重水素標識を有し、例示の脂肪酸としてリノレート（１８：２ｎ６）が水酸基にアシル化したコレステリルエステルの構造を（Ｂ）に示す。コレステリルエステルの水酸基のアシル化に使用される脂肪酸ミックス中の８種類の脂肪酸（１６：０、１６：１ｎ７、１８：１ｎ９、１８：２ｎ６、２０：３ｎ６、２０：４ｎ６、２０：５ｎ３、２２：６ｎ３）の構造を（Ｃ）に示す。
遊離脂肪酸内部標準は、５０％の重水素標識脂肪酸および５０％の単一の奇数鎖脂肪酸からなる５０：５０混合物を合成することにより製造した。重水素標識脂肪酸は、例えば、パルミテート（１６：０）であり得る。また、奇数鎖脂肪酸は、例えば、１７：１ｎ７であり得る。
例えば、遊離脂肪酸について、脂肪酸の組成を表８に示す。内部標準混合物を構成する遊離脂肪酸の構造を図１０に示す。重水素標識を有する遊離脂肪酸であるパルミテート（１６：０）を（Ａ）に示す。遊離脂肪酸である１７：１ｎ７の構造を（Ｂ）に示す。
実施例３：脂質内部標準混合物の検証および評価
メタノール：ジクロロメタン抽出手順を使用して脂質をサンプルから抽出した。ジクロロメタン：メタノール（５０：５０）中の内部標準を抽出液に添加し、その後、一連の遠心・沈殿層回収工程を行った。１つに合わせた沈殿層のアリコートを窒素下で濃縮し、次いで１０ｍＭ酢酸アンモニウムジクロロメタン：メタノール（５０：５０）０．２５ｍＬで戻した。インフュージョンＭＳを使用した分析のために、抽出物をインサートに移し、バイアルに入れた。インフュージョンＭＳ分析を、Ｓｃｉｅｘ ＳｅｌｅｘＩｏｎおよび５００ ＱＴＲＡＰを組み合わせたｎａｎｏ ＰＥＥｋ ｔｕｂｉｎｇを用いたＳｈｉｍａｚｄｕ ＬＣで行った。サンプルはポジティブ・モードエレクトロスプレーおよびネガティブ・モードエレクトロスプレーの両方で分析した。５５００ ＱＴＲＡＰスキャンをＭＲＭモードで行ったところ、内部標準を含めて合計＋１１００ＭＲＭであった。
メタノール：ジクロロメタン抽出手順を使用して脂質をサンプルから抽出した。ジクロロメタン：メタノール（５０：５０）中の内部標準を抽出液に添加し、その後、一連の遠心・沈殿層回収工程を行った。１つに合わせた沈殿層のアリコートを窒素下で濃縮し、次いで１０ｍＭ酢酸アンモニウムジクロロメタン：メタノール（５０：５０）０．２５ｍＬで戻した。インフュージョンＭＳを使用した分析のために、抽出物をインサートに移し、バイアルに入れた。インフュージョンＭＳ分析を、Ｓｃｉｅｘ ＳｅｌｅｘＩｏｎおよび５００ ＱＴＲＡＰを組み合わせたｎａｎｏ ＰＥＥｋ ｔｕｂｉｎｇを用いたＳｈｉｍａｚｄｕ ＬＣで行った。サンプルはポジティブ・モードエレクトロスプレーおよびネガティブ・モードエレクトロスプレーの両方で分析した。５５００ ＱＴＲＡＰスキャンをＭＲＭモードで行ったところ、内部標準を含めて合計＋１１００ＭＲＭであった。
表９に示す成分を含む例示の内部標準混合物を合成し、この合成内部標準混合物を評価してその濃度および純度を求めた。標識標準混合物および未標識標準混合物は１０．３ｍｇｓ／ｍＬであった。内部標準混合物中の各内部標準の実際の濃度はＮＭＲおよび定量的脂肪酸分析に基づいて求めた。これら２つの分析結果の差は２％以内であった。表９の第２列は内部標準混合物の各内部標準成分の標的濃度を示す。表９の第３列および第４列は示された各成分の実際の濃度を示す。第３列は標識標準について得られた濃度を示し、第４列は未標識標準について得られた濃度を示す。サンプルの完璧な脂肪酸分析により、内部標準混合物の純度が＞９９％であることが確認された。
標識の存在によってクロマトグラフ保持時間がシフトするかどうかを確認するために例示の標識内部標準混合物および未標識内部標準混合物の性能を評価した。標識標準は、未標識アナログと比較してクロマトグラフ保持時間を実質的にシフトさせなかった。
標識内部標準混合物および未標識内部標準混合物の定量性能を、未標識標準溶液中および血清中で実験的に評価した。未標識内部標準混合液サンプルおよび血清サンプルから、いずれも標識内部標準混合物およびＰＣ１７：０／１７：０（従来のリピドミクス内部標準）の存在下で、脂質を抽出した。各サンプルを５回抽出し、合計１０個のサンプル（５個の血清サンプルおよび５個の未標識標準混合物サンプル）を得た。各サンプルから抽出した脂質を上述の方法を使用して分析した。各ホスファチジルコリン種の濃度を出発物質１ｍｌ当たりのｎモルとして計算した。内部標準混合物および従来の内部標準ＰＣ１７：０／１７：０の両方を使用して、濃度を計算した。血清では、分析変動係数（ＣＶ）を計算して求めた精度が、従来の内部標準ＰＣ１７：０／１７：０では２０％であり、内部標準混合物では１１％であった。未標識内部標準混合物のサンプルでは、分析ＣＶを計算して求めた全体精度が、従来の内部標準ＰＣ１７：０／１７：０では１１％であり、内部標準混合物では３％であった。
内部標準混合物および従来の内部標準を使用して脂肪酸の組成（モル％）を計算し、サンプル中の脂肪酸の実際の濃度と比較した。内部標準混合物を使用して得られた計算値は、従来の内部標準を使用して得られた値よりも実際値に近かった。結果を図１１に図示する。
実施例４：ヒトサンプルにおける内部標準混合物の評価
内部標準混合物の定量性能を評価するために、表１に示す内部標準の混合物を使用して、１５個のヒト血清サンプル中の脂質分子種を測定した（トリプリケートで実施）。標識内部標準混合物下で血清サンプルから脂質を抽出し、上述の方法で脂質抽出物を分析した。トリプリケートサンプル中の１１００個の測定脂質分子種のそれぞれの平均濃度を、内部標準混合物を使用して計算し、また、分析ＣＶを計算して精度を求めた。１５個のトリプリケートサンプルの平均濃度およびＣＶ値を１１００個の測定脂質分子種全てに対してプロットした。ＣＶ（％）と脂質分子種濃度との関係を示す散布図を図１２に図示する。ＣＶは最高濃度域における脂質分子種では低かったが、非常に低濃度（例えば、０．００１μＭ）における所定の脂質分子種では１０％と高かった。
内部標準混合物の定量性能を評価するために、表１に示す内部標準の混合物を使用して、１５個のヒト血清サンプル中の脂質分子種を測定した（トリプリケートで実施）。標識内部標準混合物下で血清サンプルから脂質を抽出し、上述の方法で脂質抽出物を分析した。トリプリケートサンプル中の１１００個の測定脂質分子種のそれぞれの平均濃度を、内部標準混合物を使用して計算し、また、分析ＣＶを計算して精度を求めた。１５個のトリプリケートサンプルの平均濃度およびＣＶ値を１１００個の測定脂質分子種全てに対してプロットした。ＣＶ（％）と脂質分子種濃度との関係を示す散布図を図１２に図示する。ＣＶは最高濃度域における脂質分子種では低かったが、非常に低濃度（例えば、０．００１μＭ）における所定の脂質分子種では１０％と高かった。
全ての血清サンプルから得られたＣＥ脂質クラスの平均濃度は３６７６．７２であり、平均ＣＶは１．２２％であった。これらの結果は図１３に箱ヒゲ図で示す。血清サンプル中のＣＥ脂質クラスの濃度のブランクに対する比であるシグナルは１７２９．０２であった。ＴＡＧ脂質クラスの平均濃度は４１０５．８であり、平均ＣＶは２．７９％であった。これらの結果は図１４に箱ヒゲ図で示す。ＴＡＧ脂質クラスのシグナルは１３４８．３３であった。
他の例において、従来の内部標準と比較した内部標準混合物の性能を２５個のヒト血漿サンプルにおいて評価した。本願明細書に記載の方法および表１に記載の内部標準組成物を使用して、３つの例示の脂質クラス（ＣＥ、ＰＣ、ＰＥ）の脂肪酸組成を計算した。これらの結果を、脂質クラス毎に１つの内部標準を使用する従来法による計算値と比較し、また、定量値とも比較した。
各脂質クラスに対して単一の内部標準を使用した定量（従来法）では、コレステリルエステルについてはｄＣＥ（１６：０）内部標準を、ホスファチジルコリンについてはｄＰＣ（１６：０／１８：１）内部標準を、ホスファチジルエタノールアミンについてはｄＰＥ（１８：０／１８：１）内部標準をそれぞれ使用した。単一内部標準による定量では、ＣＥ脂質クラス、ＰＣ脂質クラスまたはＰＥ脂質クラス内の脂肪酸を、それぞれ、これらの単一のＣＥ内部標準、ＰＣ内部標準またはＰＥ内部標準に割り当てた。
例示の内部標準混合物を使用した定量では、各脂質クラスについて内部標準全てを使用した（表１）。全てのケースにおいて、定量対象の脂質分子種は、脂肪酸組成中同じ数の二重結合を有する内部標準に割り当てた。例えば、分子種ＰＣ（１６：０／２２：５）、ＰＣ（１８：０／２２：５）およびＰＣ（１４：０／２２：５）は、全て、内部標準ｄＰＣ（１６：０／２２：５）に割り当てた。
コレステリルエステル脂質クラスの総濃度（ＣＥＬＣ）、ホスファチジルコリン脂質クラスの総濃度（ＰＣＬＣ）、および、ホスファチジルエタノールアミン脂質クラスの総濃度（ＰＥＬＣ）を、各脂質クラスについて、単一内部標準および内部標準混合物（複数ＩＳ）を使用した計算により、２５個のヒト血漿サンプルから求めた（図１５）。結果を定量的ＧＣ−ＦＩＤ分析（上述のＴｒｕｅＭａｓｓ）で得た値と比較した。バイアス（偏り）は下記式により計算した：
（（計算値−ＴｒｕｅＭａｓｓ値）／ＴｒｕｅＭａｓｓ値）×１００
（（計算値−ＴｒｕｅＭａｓｓ値）／ＴｒｕｅＭａｓｓ値）×１００
シングル内部標準法およびマルチ内部標準法についてバイアスを計算した。結果を表１０に示す。
次に、ＣＥ脂質クラス、ＰＣ脂質クラスおよびＰＥ脂質クラスの脂肪酸組成を求めた。全ての値はモル（％）で表した。これは各脂質クラスに存在する脂肪酸の全脂肪酸に対する相対量を与えるデータ形式である。一例として、シングル内部標準法（ｄＣＥ（１６：０））およびマルチ内部標準法の場合の定量的（ＴｒｕｅＭａｓｓ）値に対するコレステリルエステル（ＣＥ）の脂肪酸組成の比較を図１６に示す。ｙ＝ｘ線はバイアスがゼロに等しい値を示す。２５個の対象全てを、ＣＥ脂質クラスで測定された２２個の脂肪酸のそれぞれに対してプロットした。単一内部標準で効果的に測定された脂肪酸もあるが、著しいバイアスを示す脂肪酸もあった。しかしながら、複数の内部標準を使用するとバイアスは低い。
特に、シングル内部標準法では多価不飽和脂肪酸のバイアスが大きいと考えられた。ＣＥ脂質クラスおよびＰＣ脂質クラスに由来する多価不飽和脂肪酸に対するバイアスの具体例を下記に示す。上述の通り計算したバイアスを表１１に示す。ＰＣ脂質クラスおよびＣＥ脂質クラスの例示の脂肪酸についての真の（定量）値（μＭ）および推定値（内部標準を使用して計算）（μＭ）を、２５個の血漿サンプルのそれぞれに対してプロットした。結果を図１７に示す。
このように、脂質クラス毎に単一の内部標準を使用すると、測定結果に定量的・組成的なバイアスが生じ得ることが示される。単一の内部標準では１つの脂質クラス内の全ての分子種を正確に定量できなかったからである。本願明細書に記載の方法を使用すると、リピドミクス・アッセイの定量的・組成的なバイアスが顕著かつ実質的に低減した。
本願明細書に記載した全ての特許または刊行物は本願発明が属する技術分野の当業者の水準を示すものである。これらの特許または刊行物は、それぞれが参照により援用されることが具体的かつ個別に明示されている場合と同程度に、本願明細書に参照により援用される。
当業者は、本願発明が本願明細書に記載された目的を実行することができ、かつ、本願明細書に記載された目的および利点、ならびに、本願明細書に記載されているに等しい目的および利点を得ることができるように十分に構成されていることを容易に理解するであろう。本願明細書に記載の方法と共に本願の例は、好ましい実施形態を代表するものであり、また例示的なものであって、発明の範囲を限定することは意図されない。当業者は、添付の特許請求の範囲により定められる本発明に要旨に包含される変更およびその他の用途に想到するであろう。
Claims (9)
- 異なる脂肪酸残基を含むコレステリルエステル（ＣＥ）の、同位体標識された内部標準組成物であって、
前記異なる脂肪酸残基は、１６：０、１６：１ｎ７、１８：１ｎ９、１８：２ｎ６、２０：３ｎ６、２０：４ｎ６、２０：５ｎ３、および２２：６ｎ３を含む、内部標準組成物。 - ２以上の脂質クラスからの脂質分子種を含む、同位体標識された内部標準組成物であって、
前記脂質分子種のそれぞれは、
脂質骨格、１または２以上の脂肪酸残基、および、１または２以上の同位体標識を含み、
前記脂質分子種のそれぞれについて、
ａ）前記脂質骨格が１または２以上の同位体標識を含むか；または
ｂ）前記１または２以上の脂肪酸残基が同位体標識を含み、
前記脂質分子種の前記２以上の脂質クラスは、
（ｉ）異なる脂肪酸残基を含むコレステリルエステルであって、当該脂質分子種の脂質骨格に結合する前記異なる脂肪酸残基は１６：０、１６：１ｎ７、１８：１ｎ９、１８：２ｎ６、２０：３ｎ６、２０：４ｎ６、２０：５ｎ３、および２２：６ｎ３を含む、コレステリルエステルと、
（ｉｉ）下記（ａ）〜（ｅ）のうちの１つ以上と、を含む、内部標準組成物：
（ａ）異なる脂肪酸残基を含むホスファチジルコリンまたはエーテル結合型ホスファチジルコリンであって、パルミテート（１６：０）残基が当該脂質分子種の脂質骨格に第１の位置において結合し、かつ、脂質骨格の別位置に結合する前記異なる脂肪酸残基は１６：１ｎ７、１８：１ｎ９、１８：２ｎ６、１８：３ｎ３、２０：３ｎ６、２０：４ｎ６、２０：５ｎ３、２２：４ｎ６、２２：５ｎ３、および２２：６ｎ３を含む、ホスファチジルコリンまたはエーテル結合型ホスファチジルコリン；
（ｂ）異なる脂肪酸残基を含むホスファチジルエタノールアミンまたはプラズマローゲン型ホスファチジルエタノールアミンであって、ステアレート（１８：０）残基が当該脂質分子種の脂質骨格に第１の位置において結合し、かつ、脂質骨格の別位置に結合する前記異なる脂肪酸残基は１８：１ｎ９、１８：２ｎ６、１８：３ｎ３、２０：３ｎ６、２０：４ｎ６、２０：５ｎ３、２２：５ｎ３、および２２：６ｎ３を含む、ホスファチジルエタノールアミンまたはプラズマローゲン型ホスファチジルエタノールアミン；
（ｃ）異なる脂肪酸残基を含むスフィンゴミエリンであって、当該脂質分子種の脂質骨格に結合する前記異なる脂肪酸残基は１６：０、２４：０、１８：１ｎ９、および２４：１ｎ９を含む、スフィンゴミエリン；
（ｄ）異なる脂肪酸残基を含むジアシルグリセロールであって、脂質骨格は未標識であり、同位体標識パルミテート（１６：０）残基が当該脂質分子種の脂質骨格に第１の位置において結合し、かつ、脂質骨格の別位置に結合する前記異なる脂肪酸残基は１６：０、１８：０、１８：１ｎ９、１８：２ｎ６、１８：３ｎ３、２０：４ｎ６、２０：５ｎ３、および２２：６ｎ３を含む、ジアシルグリセロール；および
（ｅ）異なる脂肪酸残基を含むトリアシルグリセロールであって、脂質骨格は未標識であり、同位体標識パルミテート（１６：０）残基が当該脂質分子種の脂質骨格に第１の位置において結合し、かつ、脂質骨格の別位置に結合する前記異なる脂肪酸残基は１６：０、１８：０、１８：１ｎ９、１８：２ｎ６、１８：３ｎ３、２０：３ｎ６、２０：４ｎ６、および２２：６ｎ３を含む、トリアシルグリセロール。 - 同位体標識が２Ｈ、１３Ｃまたは１５Ｎを含む、請求項１または２に記載の内部標準組成物。
- ５％ＣＥ１６：０
５％ＣＥ１６：１ｎ７
２０％ＣＥ１８：１ｎ９
５０％ＣＥ１８：２ｎ６
５％ＣＥ２０：３ｎ６
５％ＣＥ２０：４ｎ６
５％ＣＥ２０：５ｎ３
５％ＣＥ２２：６ｎ３
を含む、請求項１に記載の内部標準組成物。 - 異なる脂肪酸残基を含むコレステリルエステル（ＣＥ）の、同位体標識された内部標準組成物の合成方法であって、
異なる脂肪酸残基を、１または２以上の同位体標識を有するコレステロール頭部基にアシル化反応を介して付着させるステップを含み、
前記異なる脂肪酸残基は、１６：０、１６：１ｎ７、１８：１ｎ９、１８：２ｎ６、２０：３ｎ６、２０：４ｎ６、２０：５ｎ３、および２２：６ｎ３を含む、方法。 - ２以上の脂質クラスからの脂質分子種を含む同位体標識された内部標準組成物の合成方法であって、前記脂質分子種のそれぞれは、脂質骨格、１または２以上の脂肪酸残基、および、１または２以上の同位体標識を含み、前記脂質分子種のそれぞれについて、
前記１または２以上の脂肪酸残基を、前記脂質骨格上の単一位置にアシル化反応を介して付着させるステップであって、前記１または２以上の脂肪酸残基が同位体標識されているステップ；および
前記１または２以上の脂肪酸残基を、前記脂質骨格上の単一位置にアシル化反応を介して付着させるステップであって、前記脂質骨格が同位体標識されているステップ；のうちの１以上を含み、
前記脂質分子種の前記２以上の脂質クラスは、
（ｉ）異なる脂肪酸残基を含むコレステリルエステルであって、当該脂質分子種の脂質骨格に結合する前記異なる脂肪酸残基は１６：０、１６：１ｎ７、１８：１ｎ９、１８：２ｎ６、２０：３ｎ６、２０：４ｎ６、２０：５ｎ３、および２２：６ｎ３を含む、コレステリルエステルと、
（ｉｉ）下記（ａ）〜（ｅ）のうちの１つ以上と、を含む、内部標準組成物の合成方法：
（ａ）異なる脂肪酸残基を含むホスファチジルコリンまたはエーテル結合型ホスファチジルコリンであって、パルミテート（１６：０）残基が当該脂質分子種の脂質骨格に第１の位置において結合し、かつ、脂質骨格の別位置に結合する前記異なる脂肪酸残基は１６：１ｎ７、１８：１ｎ９、１８：２ｎ６、１８：３ｎ３、２０：３ｎ６、２０：４ｎ６、２０：５ｎ３、２２：４ｎ６、２２：５ｎ３、および２２：６ｎ３を含む、ホスファチジルコリンまたはエーテル結合型ホスファチジルコリン；
（ｂ）異なる脂肪酸残基を含むホスファチジルエタノールアミンまたはプラズマローゲン型ホスファチジルエタノールアミンであって、ステアレート（１８：０）残基が当該脂質分子種の脂質骨格に第１の位置において結合し、かつ、脂質骨格の別位置に結合する前記異なる脂肪酸残基は１８：１ｎ９、１８：２ｎ６、１８：３ｎ３、２０：３ｎ６、２０：４ｎ６、２０：５ｎ３、２２：５ｎ３、および２２：６ｎ３を含む、ホスファチジルエタノールアミンまたはプラズマローゲン型ホスファチジルエタノールアミン；
（ｃ）異なる脂肪酸残基を含むスフィンゴミエリンであって、当該脂質分子種の脂質骨格に結合する前記異なる脂肪酸残基は１６：０、２４：０、１８：１ｎ９、および２４：１ｎ９を含む、スフィンゴミエリン；
（ｄ）異なる脂肪酸残基を含むジアシルグリセロールであって、脂質骨格は未標識であり、同位体標識パルミテート（１６：０）残基が当該脂質分子種の脂質骨格に第１の位置において結合し、かつ、脂質骨格の別位置に結合する前記異なる脂肪酸残基は１６：０、１８：０、１８：１ｎ９、１８：２ｎ６、１８：３ｎ３、２０：４ｎ６、２０：５ｎ３、および２２：６ｎ３を含む、ジアシルグリセロール；および
（ｅ）異なる脂肪酸残基を含むトリアシルグリセロールであって、脂質骨格は未標識であり、同位体標識パルミテート（１６：０）残基が当該脂質分子種の脂質骨格に第１の位置において結合し、かつ、脂質骨格の別位置に結合する前記異なる脂肪酸残基は１６：０、１８：０、１８：１ｎ９、１８：２ｎ６、１８：３ｎ３、２０：３ｎ６、２０：４ｎ６、および２２：６ｎ３を含む、トリアシルグリセロール。 - 前記内部標準組成物は、
５％ＣＥ１６：０
５％ＣＥ１６：１ｎ７
２０％ＣＥ１８：１ｎ９
５０％ＣＥ１８：２ｎ６
５％ＣＥ２０：３ｎ６
５％ＣＥ２０：４ｎ６
５％ＣＥ２０：５ｎ３
５％ＣＥ２２：６ｎ３
を含む、請求項５に記載の方法。 - （ｉ）請求項１または２に記載の内部標準組成物の１または２以上と；、
（ｉｉ）対象サンプル中に存在する脂質分子種を検出または定量するために、請求項１に記載の前記コレステリルエステルおよび／または請求項２に記載の前記脂質分子種を内部標準として使用するための指示と、を含むキット。 - 前記脂質分子種の少なくとも１つは、１または２以上の同位体標識を有する脂質骨格を含み、前記脂質分子種の少なくとも１つは、１または２以上の同位体標識を有する脂肪酸残基を含む、請求項２に記載の内部標準組成物。
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