JP6800686B2 - 汚染に対し過酸化水素を用いるＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓの培養方法 - Google Patents

汚染に対し過酸化水素を用いるＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓの培養方法 Download PDF

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Description

本発明は、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓの培養方法に関する。
ヘマトコッカス藻（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）は、アスタキサンチン、すなわち抗酸化特性を有する高価値なカロテノイドを生成可能な微細藻類である。培養プロセスの始めから終わりまでが、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）やナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）等の他の一般的な微細藻類と比較して相対的に長く、成長が遅い微細藻類としてのヘマトコッカス藻の性質によりヘマトコッカス藻細胞の生存には多くの課題が生じる。培養プロセスの経過にわたって、ヘマトコッカス藻細胞は、第２段階に入る前に、バイオマスを蓄積するために成長及び細胞分裂過程を経験する必要があり、この第２段階では、成長及び運動性が停止するが、採取前にアスタキサンチンが細胞内に蓄積される。開放培養としてのこの長期の多段階培養プロセスを実施すると、汚染（ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ）の危険、最適以下の環境、又は細胞の生存率を低下させ、且つ最終的にはアスタキサンチン採取の量及び質を低下させてしまうその他の条件に細胞が曝されることが増えてしまう。
アスタキサンチン抽出に使用されるＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ等の藻類細胞のシスト化を誘導する方法の１つとして、当該細胞の培養中に過酸化水素を添加することにより化学物質ストレスを与える方法が採用されている（特許文献１参照）。
また、微生物による汚染が問題となり得る溶液系等において、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ属等の微細藻類の増殖を調節するために、過酸化水素を含む抗菌性溶液を使用することが知られている（特許文献２参照）。
米国特許出願公開第２００７／０１９６３８３号明細書 国際公開第２００６／１３８２７１号明細書
ヘマトコッカス藻培養物の生存率を増加させるための処理を開発するには、異なる段階における細胞の感受性、バイオマスの成長に対する影響、及びアスタキサンチン生成に対する影響に加えて、長期培養プロセスにわたる処理の有効性を考慮に入れる必要がある。酸化剤による処理、又は商業的に入手可能な除草剤、殺菌剤及び殺虫剤による処理等、全バイオマス、脂質若しくはタンパク質の生成のために培養される成長度がより早い微細藻類のために開発された処理があるが、ヘマトコッカス藻培養プロセスの独特の段階、ヘマトコッカス藻細胞の感受性、及び人間の消費生産産業においてヘマトコッカス藻培養物の標的最終生産物（例えば、栄養補助食品、風味向上剤、治療用組成物）を使用したいという望みにより、この処理をヘマトコッカス藻培養物に容易に転移可能であるとは示されてこなかった。従って、本技術分野においては、細胞及び最終生産物の価値に悪影響を与えることなく、アスタキサンチン蓄積段階の前及びアスタキサンチン蓄積段階中におけるヘマトコッカス藻細胞の生存率を向上させるための処理方法の開発に対する要求がある。
本発明の態様を以下に記載する。
＜１＞ ａ．Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞の集団を液体培養培地において成長条件で培養して、主に緑色遊泳型段階にある前記Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞の培養物を得ること；
ｂ．前記主に緑色遊泳型段階の前記培養物を過酸化水素に接触させて、過酸化水素の計算濃度（ｍＬ／Ｌ）を前記液体培養培地１Ｌ当たり０．００５ｍＬ〜０．０２０ｍＬの範囲とすること；及び
ｃ．赤色化条件で前記Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞を培養して、カロテノイド類の蓄積のための赤色シスト型段階の細胞を形成すること、
を含むＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓの培養方法。
＜２＞ 過酸化水素の前記計算濃度が０．００５ｍＬ／Ｌ〜０．０１０ｍＬ／Ｌの範囲である＜１＞に記載の培養方法。
＜３＞ 過酸化水素の前記計算濃度が０．０１０ｍＬ／Ｌ〜０．０１５ｍＬ／Ｌの範囲である＜１＞に記載の培養方法。
＜４＞ 過酸化水素の前記計算濃度が０．０１５ｍＬ／Ｌ〜０．０２０ｍＬ／Ｌの範囲である＜１＞に記載の培養方法。
＜５＞ 前記成長条件が、３０モルｍ−２ｄ−１〜６０モルｍ−２ｄ−１の範囲の光合成有効放射強度と、前記液体培養培地における２０ｐｐｍ〜５０ｐｐｍの範囲の硝酸塩濃度と、前記液体培養培地における１ｐｐｔ未満の塩化ナトリウムと、を含む＜１＞に記載の培養方法。
＜６＞ 前記赤色化条件が、前記液体培養培地における１ｐｐｔ〜５ｐｐｔの塩化ナトリウムの存在を含む＜１＞に記載の培養方法。
＜７＞ 前記培養物における総細胞に対する感染細胞の割合として、前記Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞の前記培養物中のツボカビのレベルを決定することを更に含む、＜１＞に記載の培養方法。
＜８＞ ツボカビの前記レベルが２０％未満である場合に、前記Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞の前記培養物を過酸化水素に接触させる＜７＞に記載の培養方法。
＜９＞ ツボカビの前記レベルが少なくとも５％である場合に、前記Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞の前記培養物を過酸化水素に接触させる＜７＞に記載の培養方法。
＜１０＞ 前記Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞を赤色化条件で培養して、カロテノイド類の蓄積のための前記赤色シスト型段階の細胞を生成する間、前記培養物中のツボカビのレベルを過酸化水素への接触時のツボカビのレベル未満に維持する＜７＞に記載の培養方法。
＜１１＞ 前記培養物を過酸化水素に接触させた後のツボカビのレベルが、過酸化水素で処理されていない対照培養物よりも２０％〜９５％低い＜７＞に記載の培養方法。
＜１２＞ 前記細胞を過酸化水素に複数回接触させる＜１＞に記載の培養方法。
＜１３＞ 前記細胞を過酸化水素に６時間〜２４時間毎に接触させる＜１２＞に記載の培養方法。
＜１４＞ 前記細胞を過酸化水素に６時間〜１２時間毎に接触させる＜１３＞に記載の培養方法。
＜１５＞ 前記細胞を過酸化水素に１日〜１４日間にわたって毎日接触させる＜１２＞に記載の培養方法。
＜１６＞ 前記細胞を過酸化水素に３日〜１５日間にわたって１日おきに接触させる＜１２＞に記載の培養方法。
＜１７＞ 過酸化水素に接触させた前記Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞のバイオマス収量が、過酸化水素で処理されていない対照培養物に対して同等であるか、又はそれより大きい＜１＞に記載の培養方法。
＜１８＞ 過酸化水素に接触させた前記Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞のバイオマス収量が、過酸化水素で処理されていない対照培養物より０．０１ｇ／Ｌ〜０．２５ｇ／Ｌ大きい＜１７＞に記載の培養方法。
＜１９＞ 過酸化水素に接触させた前記Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞のカロテノイド収量が、過酸化水素で処理されていない対照培養物に対して同等であるか、又はそれより大きい＜１＞に記載の培養方法。
＜２０＞ 過酸化水素に接触させた前記Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞のカロテノイド収量が、過酸化水素で処理されていない対照培養物より０．１０％〜１．５０％大きい＜１９＞に記載の培養方法。
本発明の非限定的な一実施形態において、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓの培養方法は、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞の集団を液体培養培地において成長条件で培養して、主に緑色遊泳型段階（ｇｒｅｅｎ ｓｗｉｍｍｅｒ ｓｔａｇｅ）にある上記Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞の培養物を得ること；上記主に緑色遊泳型段階の上記培養物を過酸化水素に接触させて、過酸化水素の計算濃度（ｍＬ／Ｌ）を上記液体培養培地１Ｌ当たり０．００５ｍＬ〜０．０２０ｍＬの範囲とすること；及び赤色化条件で上記Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞を培養して、カロテノイド類の蓄積のための赤色シスト型段階（ｒｅｄ ｃｙｓｔ ｓｔａｇｅ）の細胞を形成すること、を含み得る。
いくつかの実施形態において、過酸化水素の上記計算濃度は、０．００５ｍＬ／Ｌ〜０．０１０ｍＬ／Ｌの範囲であってもよい。いくつかの実施形態において、過酸化水素の上記計算濃度は、０．０１０ｍＬ／Ｌ〜０．０１５ｍＬ／Ｌの範囲であってもよい。いくつかの実施形態において、過酸化水素の上記計算濃度は、０．０１５ｍＬ／Ｌ〜０．０２０ｍＬ／Ｌの範囲であってもよい。
いくつかの実施形態において、上記成長条件は、３０モルｍ−２ｄ−１〜６０モルｍ−２ｄ−１の範囲の光合成有効放射強度と、上記液体培養培地中における２０ｐｐｍ〜５０ｐｐｍの範囲の硝酸塩濃度と、上記液体培養培地中における１ｐｐｔ未満の塩化ナトリウムと、を含み得る。いくつかの実施形態において、赤色化条件は、上記液体培養培地中における１ｐｐｔ〜５ｐｐｔの塩化ナトリウムの存在を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態において、上記方法は、上記培養物中の総細胞に対する感染細胞の割合として、上記Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞の上記培養物中のツボカビのレベルを決定することを更に含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、ツボカビの上記レベルが２０％未満である場合に、上記Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞の上記培養物を過酸化水素に接触させてもよい。いくつかの実施形態において、ツボカビの上記レベルが少なくとも５％である場合に、上記Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞の上記培養物を過酸化水素に接触させてもよい。
いくつかの実施形態において、上記Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞を赤色化条件で培養して、カロテノイド類の蓄積のための上記赤色シスト型段階の細胞を生成する間、上記培養物中のツボカビのレベルを過酸化水素への接触時のツボカビのレベル未満に維持してもよい。いくつかの実施形態において、上記培養物を過酸化水素に接触させた後のツボカビのレベルは、過酸化水素で処理されていない対照培養物よりも２０％〜９５％低くてもよい。
いくつかの実施形態において、上記Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞を過酸化水素に複数回接触させてもよい。いくつかの実施形態において、上記Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞を過酸化水素に６時間〜２４時間毎に接触させてもよい。いくつかの実施形態において、上記Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞を過酸化水素に６時間〜１２時間毎に接触させてもよい。いくつかの実施形態において、上記Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞を過酸化水素に１日〜１４日間にわたって毎日接触させてもよい。いくつかの実施形態において、上記Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞を過酸化水素に３日〜１５日間にわたって１日おきに接触させてもよい。
いくつかの実施形態において、過酸化水素に接触させた上記Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞のバイオマス収量は、過酸化水素で処理されていない対照培養物に対して同等であるか、又はそれより大きくてもよい。いくつかの実施形態において、過酸化水素に接触させた上記Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞のバイオマス収量は、過酸化水素で処理されていない対照培養物より０．０１ｇ／Ｌ〜０．２５ｇ／Ｌ大きくてもよい。
いくつかの実施形態において、過酸化水素に接触させた上記Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞のカロテノイド収量は、過酸化水素で処理されていない対照培養物に対して同等であるか、又はそれより大きくてもよい。いくつかの実施形態において、過酸化水素に接触させた上記Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞のカロテノイド収量は、過酸化水素で処理されていない対照培養物より０．１０％〜１．５０％大きくてもよい。
概要
ヘマトコッカス（Ｈａｅｍａｔｏｄｏｃｃｕｓ）属は、真核生物ドメイン、緑色植物亜界、緑藻植物門、緑藻綱、クラミドモナス目、ヘマトコッカス科に分類される微細藻類の属である。Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ種は、典型的には光栄養条件で成長し、アスタキサンチン、すなわち強い抗酸化特性を有する高価値なカロテノイド（すなわち、有機色素）の生成のために商業的に特に興味深いものである。Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓはアスタキサンチンを生成するが、細胞中のアスタキサンチンのレベルは培養条件に依存し、細胞の生涯にわたって細胞中において一定のレベルで存在しているわけではない。
Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓは学問的に研究され、且つ商業的に生成されてきたので、従来の培養条件はパブリックドメインの文献において見出され得る。Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞の培養は成長条件で開始される。ここで、上記Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞は、主に（すなわち細胞の少なくとも８０％）、細胞が成長及び分裂することができるがアスタキサンチンのレベルは低い緑色遊泳型段階にある。「緑色遊泳型」という用語は、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞が、運動性状態にあり、繊毛を有し、カロテノイド類（すなわち、アスタキサンチン由来の赤色色素）より高い割合のクロロフィル（すなわち、緑色色素）を有する状態を指す。Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞は、細胞がカロテノイド類（すなわち、アスタキサンチン由来の赤色色素）より高い割合のクロロフィル（すなわち、緑色色素）を有する非運動性又はシスト型段階で存在する場合もあり、これは「緑色シスト」と呼ばれることがある。「成長条件」という用語は、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞の成長及び細胞分裂を促進し、且つ細胞が休止状態に入ることを引き起こす可能性があるストレッサを最小限に抑える培養条件を指す。Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞のための成長条件は、光合成有効放射（ＰＡＲ）波長の光、二酸化炭素、並びに、主に水、窒素、リン及び微量金属栄養素を含む液体培地を含み得る。
Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞は、成熟するにつれて、細胞分裂が停止するか又は遅くなるものの細胞が赤色化条件によってストレスを受けるにつれてアスタキサンチンが蓄積される赤色シスト型段階に移行する。「赤色シスト」という用語は、細胞が、休止状態にあり、繊毛を喪失し、クロロフィル（すなわち、緑色色素）より高い割合のカロテノイド類（すなわち、アスタキサンチン由来の赤色色素）を有するＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞の状態を指す。「赤色化条件」という用語は、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞にストレスをかけて、休止状態への移行と、細胞中のカロテノイド類（例えば、アスタキサンチン）の蓄積と、を促進する培養条件を指す。Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓに対する赤色化条件は、窒素又は他の栄養素の欠乏と、重炭酸塩の添加と、漂白剤の添加と、成長条件と比較して塩分、光強度及び／又は温度のレベルを高くすることと、を含み得る。
ヘマトコッカス藻細胞の大きさに起因して細胞がバイオリアクタの底部に沈降することを防ぎ、細胞を循環させて利用可能な光及び栄養素へ曝露させるために、当該技術分野で知られている手段、例えば、限定されるものではないが、パドルホイール、ガススパージャ（ｇａｓ ｓｐａｒｇｉｎｇ）、又は機械的攪拌機によって培養物を勢いよく混合する。Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓは、緑色遊泳型細胞のための剪断感受性要求を満たす、本技術分野で知られている多くのシステム、例えば、限定されるものではないが、ガススパージャ混合によるカラム型バイオリアクタ、パドルホイール混合によるレースウェイポンド型バイオリアクタ、又はガススパージャ混合によるバッグ型バイオリアクタの中で培養され得る。
小容量のヘマトコッカス藻培養物を、緑色遊泳型段階を経て大容量の赤色シスト型段階に培養するプロセスは、ヘマトコッカス藻が成長、分裂、及びカロテノイド類蓄積をする速度が遅いため、数週間かかかる場合がある。この期間の間、ヘマトコッカス藻細胞は、細胞の物理的統合性の脆弱化（例えば、溶解）、並びに緑色遊泳型段階及び赤色シスト型段階の両方におけるヘマトコッカス藻の生存の可能性を減少させる汚染（例えば、細菌、真菌、捕食生物、他の微細藻類）による攻撃の影響を受けやすい。「溶解」という用語は、細胞膜の統合性を喪失し、ハロー（ｈａｌｏ）の外側がこじ開けられた、又はハローが破壊されることなく内部の細胞質が溶解したＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞を指し、培養物中の総Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞の割合（％）で表現される。
例えば、緑色遊泳型段階での溶解の発生、並びに緑色及び赤色シスト型段階を含む非運動性細胞段階でのツボカビ感染によって、培養物中の大部分のヘマトコッカス藻細胞が速やかに死ぬことが観察された。ツボカビは、微細藻類細胞に付着し、微細藻類細胞内に成長し、細胞内で再生し、続いてより多くの微細藻類細胞を攻撃することによって機能する基礎的（ｂａｓａｌ）真菌である。数日間又は数週間細胞を培養するために資源を費やした後で、所望のアスタキサンチンレベルを有する細胞の採取物を得ることができる前に、このようにヘマトコッカス藻培養物を喪失することは、商業運転に対して破壊的であり得る。ヘマトコッカス藻細胞の脆弱性は、条件を制御することがより難しく、汚染がより容易に導入される開放培養（例えば、オープンポンド型バイオリアクタ）において更に増幅される。
ヘマトコッカス藻のための培養プロセスの長さに起因して、ヘマトコッカス藻細胞を損なうことのなく培養プロセスにわたる複数回の適用、又は長期間有効性を持続するが、初期の適用でヘマトコッカス藻細胞を損なうことのない高い初期濃度の適用が可能な、培養物に対する処理の必要性が増大している。時間と共に汚染に対して有効性を維持するのに充分に高い初期濃度での１回の適用に対してヘマトコッカス藻が耐容性を示すことができない場合における処理、又は複数回の適用がヘマトコッカス藻にとって有毒な濃度レベルを蓄積する場合における処理は、培養物を成功して採取するという目標を達成しない。更に、ヘマトコッカス藻細胞の感受性は細胞の段階又は状態に依存するが、緑色遊泳型細胞は、赤色シスト型細胞より感受性が高い。例えば、溶解は、赤色シスト型細胞の培養物の中よりも緑色遊泳型細胞の培養物の中で発生し易く、緑色遊泳型細胞は、赤色シスト型細胞よりも塩に対する耐容性が低い。一般的処理は、ヘマトコッカス藻培養物の１つの段階に対して有効であるだけあり得、又はある種の状態の細胞に対して有害であり得るため、ヘマトコッカス藻培養物の生涯にわたって成功する処理には、有効性を最大にし、細胞に対する悪影響を最小限に抑えるか又は無くすために、細胞の状態を考慮する必要がある。
化学的殺生物剤、天然有機ハーブの配合物、漂白剤、水酸化ナトリウム及び生物剤を含む利用可能な処理の試験は、実施例１３〜１７においてツボカビに対する様々なレベルの有効性を有することが分かった。しかし、これらの利用可能な処理のためのパブリックドメインの知識は、これらの処理が緑色遊泳型段階及び赤色シスト型段階のヘマトコッカス藻細胞にどのような影響を及ぼすかについて取り組んでおらず、従って、ヘマトコッカス藻を培養する際に直面する本願明細書に記載の課題に対する直ちに利用可能な解決策を提供するものではない。
マトコッカス藻細胞を改変して溶解又は汚染に対する耐性の向上させるために、適応又は遺伝子組換えの公知の方法を用いることができるが、このプロセスは長くなり費用がかかる場合がある。更に、遺伝子組換えは、ヘマトコッカス藻由来アスタキサンチンの使用に利用可能な製品市場を限定してしまう可能性がある。
本発明者らは、ヘマトコッカス藻培養物の溶解又は真菌感染の防止、及び既存のレベルの溶解又は真菌感染を伴うヘマトコッカス藻細胞の培養物の処理の文脈に用いるための、赤色シスト及び緑色シストを含む緑色遊泳型段階及びシスト型段階に特異的な本願明細書に記載の方法を開発した。上記方法の幾つかの実施形態は同一のヘマトコッカス藻培養物の処理に複数回用いてもよく、これには、ヘマトコッカス藻細胞のバイオマス収量及びカロテノイド収量に対する任意の悪影響を最小限に抑えるか、又は無くすと共に、同一の培養物を１日に複数回処理することが含まれる。
本発明者らは、驚くべきことに、過酸化水素によるＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ培養物の処理は、複数回施される場合であっても、ヘマトコッカス藻細胞のバイオマス蓄積及び生産性に悪影響を及ぼすことなく、ヘマトコッカス藻細胞の培養物における溶解の防止及び処理に成功することを見出した。また、本発明者らは、驚くべきことに、過酸化水素、塩、又は塩と過酸化水素との組み合わせによるＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ培養物の処理は、複数回施される場合であっても、バイオマス蓄積、生産性及びカロテノイド蓄積に悪影響を及ぼすことなく、ヘマトコッカス藻細胞の培養物におけるツボカビ感染の防止及び処理に成功することも見出した。また、過酸化水素は、ヘマトコッカス藻培養物内で速やかに消失する（例えば、適用の２時間以内に検出不可能なレベルに分解する）能力を有することにより、上記能力によって、最終採取生成物中の残留濃度の増大又は検出の危険が無く複数の適用を用いることができる点で好都合であることも分かった。培養物中の塩の濃度は、所望の濃度における単回投与又は所望の濃度に増大する複数回投与の結果である可能性があるが、ヘマトコッカス藻細胞又は採取生成物に対する決定因子無しで時間と共に有効であることを維持する可能性がある点で、塩による処理は好都合であることが分かった。
過酸化水素は、異なる貯蔵濃度で商業的に購入することが可能であり、従って、本発明の方法を記載するためには計算濃度を用いた。「計算濃度」という用語は、培養物の体積当たりの処理溶液の体積（例えば、過酸化水素のｍＬ／微細藻類培養培地のＬ）に、汚染処理溶液の割合による貯蔵濃度を掛けることによって計算される汚染処理溶液についての濃度値である。表現される計算濃度は、微細藻類培養物に適用される処理溶液の理論的１００％貯蔵濃度についての体積／体積（例えば、ｍＬ／Ｌ）の単位におけるものである。例えば、５０％の貯蔵濃度の過酸化水素溶液１０ｍＬで処理された１Ｌの微細藻類培養物は、計算濃度＝１０ｍＬ／Ｌ×０．５＝５ｍＬ／Ｌの汚染処理溶液を有する。
ヘマトコッカス藻の培養物に有効濃度の過酸化水素、塩又は過酸化水素と塩との組み合わせを適用する本明細書に記載の方法は、ヘマトコッカス藻細胞の生存率を向上させ、且つアスタキサンチンの蓄積に対するあらゆる悪影響を減少させるために、溶解の発生若しくはツボカビ感染を防ぎ、溶解若しくはツボカビ感染レベルの増加を防ぎ（すなわち、上記レベルを維持し）、溶解若しくはツボカビ感染レベルの増加を遅らせ、又は溶解若しくはツボカビ感染レベルを減少させ得る。ヘマトコッカス藻の培養物が有する溶解又はツボカビに対する耐容性のレベルは、菌株、培養条件及びバイオリアクタシステムに応じて変化し得る。一部の培養物は、５０％を上回る溶解又はツボカビ感染レベルで生存することが可能である場合があるが、他の培養物は、より低いレベル、例えば、３０％、２０％、１０％又は５％未満の場合で生存することができるだけである。
従来技術では、様々な機能のために、微細藻類又はシアノバクテリア培養物中における過酸化水素の存在が概して開示されているが、従来技術の教示は、アスタキサンチン生成物のためのヘマトコッカスの培養に直接転用可能ではない文脈における過酸化水素の使用、例えば、過酸化水素蒸気によるバイオリアクタの滅菌、及びバイオリアクタ滅菌ステップからの残留過酸化水素（０．００２４〜１．１７９０ｍＬ／Ｌ）に対する耐性のために遺伝子組換えされたシアノバクテリアの培養；過酸化水素の間欠的投与（０．００００１〜０．２ｍＬ／Ｌ、０．０５９０〜０．７０７４ｍＬ／Ｌ）による微細藻類培養物中の細菌の殺菌；過酸化水素（少なくとも０．１７６９ｍＬ／Ｌ）を用いた、遺伝子組換えされた微細藻類のプログラム死のための致死的ストレス条件の提供、に関する。従来技術で開示されている異なる目的のための広範囲に使用される過酸化水素は、緑色遊泳型段階及び赤色シスト型細胞段階のヘマトコッカス藻に対する悪影響を回避すると共に溶解及び真菌感染を処理（ｔｒｅａｔ）又は防止する有効濃度を対象にするものではない。この一般公開されている情報の不足に基づき、本発明者らによる２種の異なるヘマトコッカス藻株の広範囲にわたる実験によって、適切な過酸化水素濃度、並びに培養プロセスの各種段階のヘマトコッカス藻細胞に適用される適切な方法が決定された。更に、本発明者らによる広範囲にわたる実験によって、従来技術が対象としていない、商業的に重要性な更なるステップである、細胞のバイオマス蓄積、生産性及びカロテノイド蓄積にも悪影響を与えないと共に溶解及び真菌感染の防止及び処理によってヘマトコッカス藻細胞の生存を効果的に促進する方法が得られた。
＜方法の実施形態＞
非限定的な一実施形態において、ヘマトコッカス藻の培養物におけるツボカビ感染の防止及び／又は処理を行う方法は、ヘマトコッカス藻細胞の集団を液体培養培地中において成長条件で培養して、主に（すなわち、少なくとも８０％）緑色遊泳型段階にあるヘマトコッカス藻細胞の培養物を得ること；主に緑色遊泳型細胞段階の上記培養物を有効量の過酸化水素に接触させること；及び赤色化条件でヘマトコッカス細胞を培養して、アスタキサンチン等のカロテノイドの蓄積のための赤色シスト型段階の細胞を形成すること、を含み得る。
いくつかの実施形態において、ヘマトコッカス藻細胞を過酸化水素に接触させて、計算濃度を０．００５ｍＬ／Ｌ〜０．０２５ｍＬ／Ｌの範囲としてよい。いくつかの実施形態において、ヘマトコッカス藻細胞を過酸化水素に接触させて、計算濃度を０．００５ｍＬ／Ｌ〜０．０２０ｍＬ／Ｌの範囲としてよい。いくつかの実施形態において、ヘマトコッカス藻細胞を過酸化水素に接触させて、計算濃度を０．００５ｍＬ／Ｌ〜０．０１０ｍＬ／Ｌの範囲としてよい。いくつかの実施形態において、ヘマトコッカス藻細胞を過酸化水素に接触させて、計算濃度を０．０１０ｍＬ／Ｌ〜０．０１５ｍＬ／Ｌの範囲としてよい。いくつかの実施形態において、ヘマトコッカス藻細胞を過酸化水素に接触させて、計算濃度を０．０１５ｍＬ／Ｌ〜０．０２０ｍＬ／Ｌの範囲としてよい。いくつかの実施形態において、ヘマトコッカス藻細胞を過酸化水素に接触させて、計算濃度を０．０２０ｍＬ／Ｌ〜０．０２５ｍＬ／Ｌの範囲としてよい。
過酸化水素は、液体形態であってもよい。いくつかの実施形態において、過酸化水素は、勢いよく混合する位置で、例えば、限定されるものではないが、パドルホイール若しくは機械的攪拌の位置、又はガススパージによって引き起こされる高乱流の位置で、培養物に導入され得る。いくつかの実施形態において、過酸化水素は、単一の位置で全て加えられ得る。いくつかの実施形態において、過酸化水素は、表面積にわたって均一に適用され得る。
いくつかの実施形態において、細胞を過酸化水素に複数回接触させてよい。いくつかの実施形態において、細胞が緑色遊泳型段階にある間に、細胞を過酸化水素に複数回接触させてもよい。いくつかの実施形態において、細胞が赤色シスト型段階にある間に、細胞を過酸化水素に複数回接触させてもよい。いくつかの実施形態において、細胞段階が緑色遊泳型から赤色シスト型段階にまたがる間に、細胞を過酸化水素に複数回接触させてもよい。いくつかの実施形態において、培養物が成長条件にある間に、細胞を複数回接触させてもよい。いくつかの実施形態において、培養物が赤色化条件にある間に、細胞を複数回接触させてもよい。いくつかの実施形態において、培養条件が成長条件及び赤色化条件にまたがる間に、細胞を複数回接触させてもよい。
いくつかの実施形態において、細胞を過酸化水素に１日２〜４回接触させてもよい。いくつかの実施形態において、細胞を過酸化水素に６時間〜２４時間毎に接触させてもよい。いくつかの実施形態において、細胞を過酸化水素に６時間〜８時間毎に接触させてもよい。いくつかの実施形態において、細胞を過酸化水素に６時間〜１２時間毎に接触させてもよい。いくつかの実施形態において、細胞を過酸化水素に１２時間〜１８時間毎に接触させてもよい。いくつかの実施形態において、細胞を過酸化水素に１８時間〜２４時間毎に接触させてもよい。
いくつかの実施形態において、細胞を過酸化水素に１日〜１４日間にわたって毎日接触させてもよい。いくつかの実施形態において、細胞を過酸化水素に１日〜２日間にわたって毎日接触させてもよい。いくつかの実施形態において、細胞を過酸化水素に１日〜３日間にわたって毎日接触させてもよい。いくつかの実施形態において、細胞を過酸化水素に１日〜５日間にわたって毎日接触させてもよい。いくつかの実施形態において、細胞を過酸化水素に５日〜７日間にわたって毎日接触させてもよい。いくつかの実施形態において、細胞を過酸化水素に７日〜１０日間にわたって毎日接触させてもよい。いくつかの実施形態において、細胞を過酸化水素に１０日〜１２日間にわたって毎日接触させてもよい。いくつかの実施形態において、細胞を過酸化水素に１２日〜１４日間にわたって毎日接触させてもよい。
いくつかの実施形態において、細胞を過酸化水素に２４時間〜７２時間毎に接触させてもよい。いくつかの実施形態において、細胞を過酸化水素に３６時間〜６０時間毎に接触させてもよい。いくつかの実施形態において、細胞を過酸化水素に４２時間〜５４時間毎に接触させてもよい。いくつかの実施形態において、細胞を過酸化水素に３日〜１５日間にわたって１日おきに接触させてもよい。いくつかの実施形態において、細胞を過酸化水素に３日〜５日間にわたって１日おきに接触させてもよい。いくつかの実施形態において、細胞を過酸化水素に５日〜７日間にわたって１日おきに接触させてもよい。いくつかの実施形態において、細胞を過酸化水素に７日〜９日間にわたって１日おきに接触させてもよい。いくつかの実施形態において、細胞を過酸化水素に９日〜１１日間にわたって１日おきに接触させてもよい。いくつかの実施形態において、細胞を過酸化水素に１１日〜１３日間にわたって１日おきに接触させてもよい。いくつかの実施形態において、細胞を過酸化水素に１３日〜１５日間にわたって１日おきに接触させてもよい。
いくつかの実施形態において、延長した期間にわたる数日間の組み合わせにおいて細胞を過酸化水素に接触させてもよく、例えば、数日間は毎日、次いで数日間は１日おきで接触させてもよく、逆もまた同様である。例えば、１日〜５日間は毎日、次いで３日〜１５日間は１日おきで細胞を過酸化水素に接触させてもよい。他の実施形態において、適用の間の１日間超、例えば、限定されるものではないが、適用の間の２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、又は７日間以上、細胞を過酸化水素に接触させてもよい。いくつかの実施形態において、予定した時間（例えば、６時間後、２４時間後）における過酸化水素の適用を省くことが可能であり、適用を後で再開してもよい。
いくつかの実施形態において、ヘマトコッカス藻の培養物のための成長条件は、３０モルｍ−２ｄ−１〜６０モルｍ−２ｄ−１の範囲の光合成有効放射（ＰＡＲ）強度を含み得る。いくつかの実施形態において、ヘマトコッカス藻の培養物のための成長条件は、２０ｐｐｍ〜５０ｐｐｍの範囲の硝酸塩濃度を含み得る。いくつかの実施形態において、ヘマトコッカス藻の培養物のための成長条件は、培養培地中において１ｐｐｔ未満の濃度の塩、例えば塩化ナトリウムを含み得る。
いくつかの実施形態において、ヘマトコッカス藻の培養物のための赤色化条件は、培養培地中における塩の存在を含み得る。いくつかの実施形態において、赤色化条件における塩化ナトリウムの濃度は、１ｐｐｔ〜５ｐｐｔであってよい。いくつかの実施形態において、赤色化条件における塩化ナトリウムの濃度は、１ｐｐｔ〜２ｐｐｔであってよい。いくつかの実施形態において、赤色化条件における塩化ナトリウムの濃度は、１ｐｐｔ〜３ｐｐｔであってよい。塩は、塩化ナトリウムを含むことができるが、これに限定されるものではない。
いくつかの実施形態において、ヘマトコッカス藻の培養物中のツボカビ又はツボカビ感染のレベルは、培養物中の総細胞に対する感染細胞の割合として決定及び示され得る。いくつかの実施形態において、ツボカビのレベルが６０％未満である場合に、ヘマトコッカス藻細胞の培養物を過酸化水素に接触させてもよい。いくつかの実施形態において、ツボカビのレベルが５０％未満である場合に、ヘマトコッカス藻細胞の培養物を過酸化水素に接触させてもよい。いくつかの実施形態において、ツボカビのレベルが４０％未満である場合に、ヘマトコッカス藻細胞の培養物を過酸化水素に接触させてもよい。いくつかの実施形態において、ツボカビのレベルが３０％未満である場合に、ヘマトコッカス藻細胞の培養物を過酸化水素に接触させてもよい。いくつかの実施形態において、ツボカビのレベルが２０％未満である場合に、ヘマトコッカス藻細胞の培養物を過酸化水素に接触させてもよい。いくつかの実施形態において、ツボカビのレベルが１０％未満である場合に、ヘマトコッカス藻細胞の培養物を過酸化水素に接触させてもよい。いくつかの実施形態において、ツボカビのレベルが５％未満である場合に、ヘマトコッカス藻細胞の培養物を過酸化水素に接触させてもよい。いくつかの実施形態において、ツボカビのレベルが３％未満である場合に、ヘマトコッカス藻細胞の培養物を過酸化水素に接触させてもよい。いくつかの実施形態において、ツボカビのレベルが２％未満である場合に、ヘマトコッカス藻細胞の培養物を過酸化水素に接触させてもよい。いくつかの実施形態において、ツボカビのレベルが１％未満である場合に、ヘマトコッカス藻細胞の培養物を過酸化水素に接触させてもよい。いくつかの実施形態において、ツボカビのレベルが０％である場合に、ヘマトコッカス藻細胞の培養物を過酸化水素に接触させてもよい。
いくつかの実施形態において、ツボカビのレベルが少なくとも１％である場合に、ヘマトコッカス藻細胞の培養物を過酸化水素に接触させてもよい。いくつかの実施形態において、ツボカビのレベルが少なくとも２％である場合に、ヘマトコッカス藻細胞の培養物を過酸化水素に接触させてもよい。いくつかの実施形態において、ツボカビのレベルが少なくとも５％である場合に、ヘマトコッカス藻細胞の培養物を過酸化水素に接触させてもよい。いくつかの実施形態において、ツボカビのレベルが少なくとも１０％である場合に、ヘマトコッカス藻細胞の培養物を過酸化水素に接触させてもよい。いくつかの実施形態において、ツボカビのレベルが少なくとも２０％である場合に、ヘマトコッカス藻細胞の培養物を過酸化水素に接触させてもよい。いくつかの実施形態において、ツボカビのレベルが少なくとも３０％である場合に、ヘマトコッカス藻細胞の培養物を過酸化水素に接触させてもよい。いくつかの実施形態において、ツボカビのレベルが少なくとも４０％である場合に、ヘマトコッカス藻細胞の培養物を過酸化水素に接触させてもよい。いくつかの実施形態において、ツボカビのレベルが少なくとも５０％である場合に、ヘマトコッカス藻細胞の培養物を過酸化水素に接触させてもよい。いくつかの実施形態において、ヘマトコッカス藻細胞の培養物中のツボカビのレベルは、赤色化条件でヘマトコッカス藻細胞を培養して、カロテノイドの蓄積のための赤色シスト型段階の細胞を形成する間、過酸化水素に接触する際のツボカビのレベル未満に維持され得る。
いくつかの実施形態において、培養物を過酸化水素に接触させた後のツボカビレベルは、過酸化水素で処理されていない対照培養物より低いものであり得る。いくつかの実施形態において、培養物を過酸化水素に接触させた後のツボカビレベルは、過酸化水素で処理されていない対照培養物と比較して２０％〜９５％減少し得る。いくつかの実施形態において、培養物を過酸化水素に接触させた後のツボカビレベルは、過酸化水素で処理されていない対照培養物と比較して２０％〜３０％減少し得る。いくつかの実施形態において、培養物を過酸化水素に接触させた後のツボカビレベルは、過酸化水素で処理されていない対照培養物と比較して３０％〜４０％減少し得る。いくつかの実施形態において、培養物を過酸化水素に接触させた後のツボカビレベルは、過酸化水素で処理されていない対照培養物と比較して４０％〜５０％減少し得る。いくつかの実施形態において、培養物を過酸化水素に接触させた後のツボカビレベルは、過酸化水素で処理されていない対照培養物と比較して５０％〜６０％減少し得る。いくつかの実施形態において、培養物を過酸化水素に接触させた後のツボカビレベルは、過酸化水素で処理されていない対照培養物と比較して６０％〜７０％減少し得る。いくつかの実施形態において、培養物を過酸化水素に接触させた後のツボカビレベルは、過酸化水素で処理されていない対照培養物と比較して７０％〜８０％減少し得る。いくつかの実施形態において、培養物を過酸化水素に接触させた後のツボカビレベルは、過酸化水素で処理されていない対照培養物と比較して８０％〜９０％減少し得る。いくつかの実施形態において、培養物を過酸化水素に接触させた後のツボカビレベルは、過酸化水素で処理されていない対照培養物と比較して９０％〜９５％減少し得る。
いくつかの実施形態において、塩と過酸化水素との組み合わせに培養物を接触させた後のツボカビレベルは、処理されていない対照培養物より低いものであり得る。いくつかの実施形態において、塩と過酸化水素との組み合わせに培養物を接触させた後のツボカビレベルは、処理されていない対照培養物と比較して１０％〜９５％減少し得る。いくつかの実施形態において、塩と過酸化水素との組み合わせに培養物を接触させた後のツボカビレベルは、処理されていない対照培養物と比較して１０％〜３０％減少し得る。いくつかの実施形態において、塩と過酸化水素との組み合わせに培養物を接触させた後のツボカビレベルは、処理されていない対照培養物と比較して３０％〜６０％減少し得る。いくつかの実施形態において、塩と過酸化水素との組み合わせに培養物を接触させた後のツボカビレベルは、処理されていない対照培養物と比較して６０％〜９５％減少し得る。
いくつかの実施形態において、過酸化水素に接触させたヘマトコッカス藻細胞のバイオマス収量は、過酸化水素で処理されていない対照培養物に対して同等であるか、又はそれより大きい。いくつかの実施形態において、過酸化水素に接触させたヘマトコッカス藻細胞のバイオマス収量は、過酸化水素で処理されていない対照培養物より０．０１ｇ／Ｌ〜０．２５ｇ／Ｌ大きい。いくつかの実施形態において、過酸化水素に接触させたヘマトコッカス藻細胞のバイオマス収量は、過酸化水素で処理されていない対照培養物より０．０１ｇ／Ｌ〜０．０５ｇ／Ｌ大きい。いくつかの実施形態において、過酸化水素に接触させたヘマトコッカス藻細胞のバイオマス収量は、過酸化水素で処理されていない対照培養物より０．０５ｇ／Ｌ〜０．１０ｇ／Ｌ大きい。いくつかの実施形態において、過酸化水素に接触させたヘマトコッカス藻細胞のバイオマス収量は、過酸化水素で処理されていない対照培養物より０．１０ｇ／Ｌ〜０．１５ｇ／Ｌ大きい。いくつかの実施形態において、過酸化水素に接触させたヘマトコッカス藻細胞のバイオマス収量は、過酸化水素で処理されていない対照培養物より０．１５ｇ／Ｌ〜０．２０ｇ／Ｌ大きい。いくつかの実施形態において、過酸化水素に接触させたヘマトコッカス藻細胞のバイオマス収量は、過酸化水素で処理されていない対照培養物より０．２０ｇ／Ｌ〜０．２５ｇ／Ｌ大きい。
いくつかの実施形態において、塩と過酸化水素との組み合わせに接触させたヘマトコッカス藻細胞のバイオマス収量は、処理されていない対照培養物に対して同等であるか、又はそれより大きい。いくつかの実施形態において、塩と過酸化水素との組み合わせに接触させたヘマトコッカス藻細胞のバイオマス収量は、処理されていない対照培養物より０．０１ｇ／Ｌ〜０．３０ｇ／Ｌ大きい。いくつかの実施形態において、塩と過酸化水素との組み合わせに接触させたヘマトコッカス藻細胞のバイオマス収量は、処理されていない対照培養物より０．０１ｇ／Ｌ〜０．１０ｇ／Ｌ大きい。いくつかの実施形態において、塩と過酸化水素との組み合わせに接触させたヘマトコッカス藻細胞のバイオマス収量は、処理されていない対照培養物より０．１０ｇ／Ｌ〜０．２０ｇ／Ｌ大きい。いくつかの実施形態において、塩と過酸化水素との組み合わせに接触させたヘマトコッカス藻細胞のバイオマス収量は、処理されていない対照培養物より０．２０ｇ／Ｌ〜０．３０ｇ／Ｌ大きい。
いくつかの実施形態において、過酸化水素に接触させたヘマトコッカス藻細胞のカロテノイド収量は、過酸化水素で処理されていない対照培養物に対して同等であるか、又はそれより大きい。いくつかの実施形態において、過酸化水素に接触させたヘマトコッカス藻細胞のカロテノイド収量は、過酸化水素で処理されていない対照培養物より０．１０％〜１．５０％大きい。いくつかの実施形態において、過酸化水素に接触させたヘマトコッカス藻細胞のカロテノイド収量は、過酸化水素で処理されていない対照培養物より０．１０％〜０．２５％大きい。いくつかの実施形態において、過酸化水素に接触させたヘマトコッカス藻細胞のカロテノイド収量は、過酸化水素で処理されていない対照培養物より０．２５％〜０．５０％大きい。いくつかの実施形態において、過酸化水素に接触させたヘマトコッカス藻細胞のカロテノイド収量は、過酸化水素で処理されていない対照培養物より０．５０％〜０．７５％大きい。いくつかの実施形態において、過酸化水素に接触させたヘマトコッカス藻細胞のカロテノイド収量は、過酸化水素で処理されていない対照培養物より０．７５％〜１．００％大きい。いくつかの実施形態において、過酸化水素に接触させたヘマトコッカス藻細胞のカロテノイド収量は、過酸化水素で処理されていない対照培養物より１．００％〜１．２５％大きい。いくつかの実施形態において、過酸化水素に接触させたヘマトコッカス藻細胞のカロテノイド収量は、過酸化水素で処理されていない対照培養物より１．２５％〜１．５０％大きい。
いくつかの実施形態において、上記方法は、ヘマトコッカス藻細胞の培養物を過酸化水素に接触させた後で、この培養物を新しい培養容器に移動することを更に含んでもよい。いくつかの実施形態において、培養物が最適温度である場合に、培養物を過酸化水素に接触させてもよい。いくつかの実施形態において、培養物が最適培養密度である場合に、培養物を過酸化水素に接触させてもよい。
他の非限定的な実施形態において、ヘマトコッカス藻の培養物におけるツボカビ感染の防止及び／又は処理を行う方法は、１ｐｐｔ〜５ｐｐｔの塩を含む液体培養培地中において赤色化条件でヘマトコッカス藻細胞の集団を培養して、細胞が主に（すなわち、少なくとも８０％）アスタキサンチン等のカロテノイドの蓄積のための赤色シスト型段階にあるヘマトコッカス藻細胞の培養物を得ること；及び主に赤色シスト型細胞段階の培養物を有効量の過酸化水素に接触させることを含み得る。いくつかの実施形態においては、ヘマトコッカス藻細胞は、有効量の過酸化水素に接触させる際、赤色化条件における主に（すなわち、少なくとも８０％）緑色シスト型段階、赤色化条件における緑色及び赤色シストの組み合わせ、又は赤色化条件における非運動性状態であり得る。
他の非限定的な実施形態において、ヘマトコッカスの培養物におけるツボカビ感染を処理する方法は、液体培養培地中において赤色化条件でヘマトコッカス藻細胞の集団を培養して、細胞が主に（すなわち、少なくとも８０％）アスタキサンチン等のカロテノイド類の蓄積のための赤色シスト型段階にあるヘマトコッカス藻細胞の培養物を得ること；培養物中におけるツボカビの存在を検出すること；及びツボカビと主に赤色のシスト型細胞とを含む培養物を有効量の塩に接触させること、を含み得る。いくつかの実施形態において、ヘマトコッカス藻細胞は、有効量の塩に接触させる際、主に（すなわち、少なくとも８０％）赤色化条件における緑色シスト型段階、赤色化条件における緑色及び赤色シストの組み合わせ、又は赤色化条件における非運動性状態であり得る。
いくつかの実施形態において、ツボカビ及び赤色シスト型細胞に接触する塩は、塩化ナトリウムであってもよい。いくつかの実施形態において、有効量の塩化ナトリウムは、典型的な赤色化条件で見出される塩化ナトリウムの量の少なくとも１．５倍であり、最高１０倍であってもよい。いくつかの実施形態において、ツボカビ及び赤色シスト型細胞に接触する塩化ナトリウムの濃度は、１ｐｐｔ〜２０ｐｐｔであってもよい。いくつかの実施形態において、ツボカビ及び赤色シスト型細胞に接触する塩化ナトリウムの濃度は、１ｐｐｔ〜２ｐｐｔであってもよい。いくつかの実施形態において、ツボカビ及び赤色シスト型細胞に接触する塩化ナトリウムの濃度は、１ｐｐｔ〜３ｐｐｔであってもよい。いくつかの実施形態において、ツボカビ及び赤色シスト型細胞に接触する塩化ナトリウムの濃度は、１ｐｐｔ〜５ｐｐｔであってもよい。いくつかの実施形態において、ツボカビ及び赤色シスト型細胞に接触する塩化ナトリウムの濃度は、５ｐｐｔ〜１０ｐｐｔであってもよい。いくつかの実施形態において、ツボカビ及び赤色シスト型細胞に接触する塩化ナトリウムの濃度は、１０ｐｐｔ〜１５ｐｐｔであってもよい。いくつかの実施形態において、ツボカビ及び赤色シスト型細胞に接触する塩化ナトリウムの濃度は、１５ｐｐｔ〜２０ｐｐｔであってもよい。
いくつかの実施形態において、ツボカビに感染したヘマトコッカス藻細胞のレベルが６０％未満である場合に、ヘマトコッカス藻細胞の培養物を塩に接触させてもよい。いくつかの実施形態において、ツボカビに感染したヘマトコッカス藻細胞のレベルが５０％未満である場合に、ヘマトコッカス藻細胞の培養物を塩に接触させてもよい。いくつかの実施形態において、ツボカビに感染したヘマトコッカス藻細胞のレベルが４０％未満である場合に、ヘマトコッカス細胞の培養物を塩に接触させてもよい。いくつかの実施形態において、ツボカビに感染したヘマトコッカス藻細胞のレベルが３０％未満である場合に、ヘマトコッカス細胞の培養物を塩に接触させてもよい。いくつかの実施形態において、ツボカビに感染したヘマトコッカス藻細胞のレベルが２０％未満である場合に、ヘマトコッカス細胞の培養物を塩に接触させてもよい。いくつかの実施形態において、ツボカビに感染したヘマトコッカス藻細胞のレベルが１０％未満である場合に、ヘマトコッカス細胞の培養物を塩に接触させてもよい。いくつかの実施形態において、ツボカビに感染したヘマトコッカス藻細胞のレベルが５％未満である場合に、ヘマトコッカス細胞の培養物を塩に接触させてもよい。いくつかの実施形態において、ツボカビに感染したヘマトコッカス藻細胞のレベルが４％未満である場合に、ヘマトコッカス細胞の培養物を塩に接触させてもよい。いくつかの実施形態において、ツボカビに感染したヘマトコッカス藻細胞のレベルが３％未満である場合に、ヘマトコッカス細胞の培養物を塩に接触させてもよい。いくつかの実施形態において、ツボカビに感染したヘマトコッカス藻細胞のレベルが２％未満である場合に、ヘマトコッカス細胞の培養物を塩に接触させてもよい。いくつかの実施形態において、ツボカビに感染したヘマトコッカス藻細胞のレベルが１％未満である場合に、ヘマトコッカス細胞の培養物を塩に接触させてもよい。いくつかの実施形態において、ツボカビに感染したヘマトコッカス藻細胞のレベルが０％である場合に、ヘマトコッカス細胞の培養物を塩に接触させてもよい。いくつかの実施形態において、培養物中のツボカビのレベルは、赤色化条件でヘマトコッカス藻細胞を培養してカロテノイドの蓄積のための赤色シスト型段階の細胞を形成する間、塩に接触させる際のツボカビのレベル未満に維持され得る。
いくつかの実施形態において、ツボカビに感染したヘマトコッカス藻細胞のレベルが少なくとも１％である場合に、ヘマトコッカス藻細胞の培養物を塩に接触させてもよい。いくつかの実施形態において、ツボカビに感染したヘマトコッカス細胞のレベルが少なくとも２％である場合に、ヘマトコッカス細胞の培養物を塩に接触させてもよい。いくつかの実施形態において、ツボカビに感染したヘマトコッカス細胞のレベルが少なくとも５％である場合に、ヘマトコッカス細胞の培養物を塩に接触させてもよい。いくつかの実施形態において、ツボカビに感染したヘマトコッカス細胞のレベルが少なくとも１０％である場合に、ヘマトコッカス細胞の培養物を塩に接触させてもよい。いくつかの実施形態において、ツボカビに感染したヘマトコッカス細胞のレベルが少なくとも２０％である場合に、ヘマトコッカス細胞の培養物を塩に接触させてもよい。いくつかの実施形態において、ツボカビに感染したヘマトコッカス細胞のレベルが少なくとも３０％である場合に、ヘマトコッカス細胞の培養物を塩に接触させてもよい。いくつかの実施形態において、ツボカビに感染したヘマトコッカス細胞のレベルが少なくとも４０％である場合に、ヘマトコッカス細胞の培養物を塩に接触させてもよい。いくつかの実施形態において、ツボカビに感染したヘマトコッカス細胞のレベルが少なくとも５０％である場合に、ヘマトコッカス細胞の培養物を塩に接触させてもよい。
他の非限定的な実施形態において、ヘマトコッカス藻の培養物におけるツボカビ感染を防止する方法は、液体培養培地中でヘマトコッカス藻細胞の集団を培養すること；培養物におけるツボカビに感染したヘマトコッカス藻細胞の数を決定すること；ツボカビに感染したヘマトコッカス藻細胞の割合が総細胞の閾値レベル未満である場合に培養物を有効量の過酸化水素に接触させること；ヘマトコッカス藻細胞の培養を継続すること；及びツボカビに感染したヘマトコッカス藻細胞の割合が過酸化水素に接触した後の総細胞の閾値レベルより低いことを確認すること、を含み得る。
いくつかの実施形態において、ツボカビに感染した細胞の閾値レベルは、総細胞の１％であってもよい。いくつかの実施形態において、ツボカビに感染した細胞の閾値レベルは、総細胞の２％であってもよい。いくつかの実施形態において、ツボカビに感染した細胞の閾値レベルは、総細胞の３％であってもよい。いくつかの実施形態において、ツボカビに感染した細胞の閾値レベルは、総細胞の４％であってもよい。いくつかの実施形態において、ツボカビに感染した細胞の閾値レベルは、総細胞の５％であってもよい。いくつかの実施形態において、ツボカビに感染した細胞の閾値レベルは、総細胞の１０％であってもよい。いくつかの実施形態において、ツボカビに感染した細胞の閾値レベルは、総細胞の１５％であってもよい。いくつかの実施形態において、ツボカビに感染した細胞の閾値レベルは、総細胞の２０％であってもよい。いくつかの実施形態において、ツボカビに感染した細胞の閾値レベルは、総細胞の２５％であってもよい。いくつかの実施形態において、ツボカビに感染した細胞の閾値レベルは、総細胞の３０％であってもよい。
他の非限定的な実施形態において、ヘマトコッカス藻の培養物における溶解の防止及び／又は処理を行う方法は、成長条件で液体培養培地中においてヘマトコッカス藻細胞の集団を培養して、細胞が主に（すなわち、少なくとも８０％）緑色遊泳型段階にあるヘマトコッカス藻細胞の培養物を得ること；細胞シストの形成前に主に緑色遊泳型細胞段階の培養物を有効量の過酸化水素に接触させること；及び成長条件におけるヘマトコッカス藻細胞の培養を継続すること、を含み得る。
いくつかの実施形態において、上記方法は、ヘマトコッカス藻細胞の培養物における溶解のレベルを培養物中の総細胞に対する割合として決定することを更に含んでもよい。いくつかの実施形態において、溶解のレベルが３０％未満である場合に、ヘマトコッカス藻細胞の培養物を過酸化水素に接触させてもよい。いくつかの実施形態において、溶解のレベルが２５％未満である場合に、ヘマトコッカス藻細胞の培養物を過酸化水素に接触させてもよい。いくつかの実施形態において、溶解のレベルが２０％未満である場合に、ヘマトコッカス藻細胞の培養物を過酸化水素に接触させてもよい。いくつかの実施形態において、溶解のレベルが１５％未満である場合に、ヘマトコッカス藻細胞の培養物を過酸化水素に接触させてもよい。いくつかの実施形態において、溶解のレベルが１０％未満である場合に、ヘマトコッカス藻細胞の培養物を過酸化水素に接触させてもよい。いくつかの実施形態において、溶解のレベルが５％未満である場合に、ヘマトコッカス藻細胞の培養物を過酸化水素に接触させてもよい。いくつかの実施形態において、溶解のレベルが４％未満である場合に、ヘマトコッカス藻細胞の培養物を過酸化水素に接触させてもよい。いくつかの実施形態において、溶解のレベルが３％未満である場合に、ヘマトコッカス藻細胞の培養物を過酸化水素に接触させてもよい。いくつかの実施形態において、溶解のレベルが２％未満である場合に、ヘマトコッカス藻細胞の培養物を過酸化水素に接触させてもよい。いくつかの実施形態において、溶解のレベルが１％未満である場合に、ヘマトコッカス藻細胞の培養物を過酸化水素に接触させてもよい。いくつかの実施形態において、溶解のレベルが０％である場合に、ヘマトコッカス藻細胞の培養物を過酸化水素に接触させてもよい。
いくつかの実施形態において、培養物における溶解のレベルは、成長条件におけるヘマトコッカス細胞の培養を継続する間、過酸化水素に接触させた際の溶解のレベル以下に維持され得る。いくつかの実施形態において、過酸化水素に接触させた後の培養物の溶解レベルは、過酸化水素で処理されていない対照培養物の溶解レベルより１％〜８０％低くてもよい。いくつかの実施形態において、過酸化水素に接触させた後の培養物の溶解レベルは、過酸化水素で処理されていない対照培養物の溶解レベルより１％〜３％低くてもよい。いくつかの実施形態において、過酸化水素に接触させた後の培養物の溶解レベルは、過酸化水素で処理されていない対照培養物の溶解レベルより３％〜６％低くてもよい。いくつかの実施形態において、過酸化水素に接触させた後の培養物の溶解レベルは、過酸化水素で処理されていない対照培養物の溶解レベルより６％〜１０％低くてもよい。いくつかの実施形態において、過酸化水素に接触させた後の培養物の溶解レベルは、過酸化水素で処理されていない対照培養物の溶解レベルより１０％〜２０％低くてもよい。いくつかの実施形態において、過酸化水素に接触させた後の培養物の溶解レベルは、過酸化水素で処理されていない対照培養物の溶解レベルより２０％〜４０％低くてもよい。いくつかの実施形態において、過酸化水素に接触させた後の培養物の溶解レベルは、過酸化水素で処理されていない対照培養物の溶解レベルより４０％〜６０％低くてもよい。いくつかの実施形態において、過酸化水素に接触させた後の培養物の溶解レベルは、過酸化水素で処理されていない対照培養物の溶解レベルより６０％〜８０％低くてもよい。
いくつかの実施形態において、上記方法は、ヘマトコッカス藻細胞の培養物中の生細菌数を決定することを含み得る。いくつかの実施形態において、生細菌数は、過酸化水素との接触の後、１０〜２５×１０５ＣＦＵ／ｍＬ減少してもよい。いくつかの実施形態において、生細菌数は、過酸化水素と接触させた後、１０〜１５×１０５ＣＦＵ／ｍＬ減少してもよい。いくつかの実施形態において、生細菌数は、過酸化水素と接触させた後、１５〜２０×１０５ＣＦＵ／ｍＬ減少してもよい。いくつかの実施形態において、生細菌数は、過酸化水素と接触させた後、２０〜２５×１０５ＣＦＵ／ｍＬ減少してもよい。いくつかの実施形態において、生細菌数は、過酸化水素と接触させた後、１０７ＣＦＵ／ｍＬ未満に維持され得る。
他の非限定的な実施形態において、ヘマトコッカス藻の培養物における溶解を防止する方法は、ヘマトコッカス細胞の集団を成長条件において液体培養培地中で培養して、細胞が主に（すなわち、少なくとも８０％）緑色遊泳型段階であるヘマトコッカス藻細胞の培養物を得ること；ヘマトコッカス藻細胞についての細胞溶解のレベルを決定すること；ヘマトコッカス藻細胞の溶解レベルが閾値レベルより低い場合に、細胞シストの形成前に、主に緑色遊泳型細胞段階の培養物を有効量の過酸化水素に接触させること；成長条件におけるヘマトコッカス藻細胞の培養を継続すること；及びヘマトコッカス藻細胞の溶解のレベルが、過酸化水素に接触させた後、閾値レベルより低いことを確認すること、を含み得る。
いくつかの実施形態において、閾値溶解レベルは総細胞の１％であってもよい。いくつかの実施形態において、閾値溶解レベルは総細胞の２％であってもよい。いくつかの実施形態において、閾値溶解レベルは総細胞の３％であってもよい。いくつかの実施形態において、閾値溶解レベルは総細胞の４％であってもよい。いくつかの実施形態において、閾値溶解レベルは総細胞の５％であってもよい。いくつかの実施形態において、閾値溶解レベルは総細胞の１０％であってもよい。いくつかの実施形態において、閾値溶解レベルは総細胞の１５％であってもよい。いくつかの実施形態において、閾値溶解レベルは総細胞の２０％であってもよい。いくつかの実施形態において、閾値溶解レベルは総細胞の２５％であってもよい。いくつかの実施形態において、閾値溶解レベルは総細胞の３０％であってもよい。
いくつかの実施形態において、記載の方法は、ヘマトコッカス藻の開放培養に適用され得る。いくつかの実施形態において、記載の方法は、ヘマトコッカス藻の屋外培養に適用され得る。いくつかの実施形態において、記載の方法は、ヘマトコッカス藻の閉鎖培養に適用され得る。いくつかの実施形態において、記載の方法は、ヘマトコッカス藻の屋内培養に適用され得る。
本明細書に記載の方法における過酸化水素及び／又は塩の使用は、アスタキサンチンの蓄積のためのヘマトコッカス藻細胞に対する更なるストレスとして機能するものではなく、むしろ、溶解及びツボカビ感染の防止及び処理を行って、ヘマトコッカス藻細胞の生存を増加させる機能を提供するものである。また、バッチプロセスでのヘマトコッカス藻の培養物に対する本明細書に記載の方法の適用は、積極的に活動する細胞の選択に結び付けられた何世代にわたる多くの適用を必要とする溶解又は真菌感染に対する耐性の増大のために、ヘマトコッカス藻細胞を適応させるために必要な期間を提供するものではない。
溶解のレベル、ツボカビ感染のレベル、及びヘマトコッカス藻細胞の段階は、本技術分野で知られている手段、例えば、限定されるものではないが、顕微鏡下での目視観察、又はカメラ及び視覚認識ソフトウェアによる自動モニタリング、分光計又は蛍光計によって評価され得る。ヘマトコッカス藻培養物のモニタリング及び検出は、手動であるか、自動化されているかにかかわらず、手動手段、自動手段及びそれらの組み合わせによって記載の方法の過酸化水素及び／又は塩を培養物に投与する時を決定するために使用され得る。細胞の培養物への過酸化水素及び／又は塩の適用を制御するために、プログラム可能論理制御装置によって自動モニタリング及び検出データを記録又は利用することができる。試験において本明細書に記載の方法を用いたヘマトコッカス藻培養物の顕微鏡下の目視観察によって、上記方法が、糸状真菌の分解と、溶解に寄与する可能性がある培養物のバックグラウンド細菌集団の減少とに効果があることも示された。
いくつかの実施形態において、微細藻類培養物組成物は、液体培養培地中におけるヘマトコッカス藻細胞の集団と；先立つ１２０分間に過酸化水素を培養培地に加えた、培養培地１Ｌ当たり０．００５ｍＬ〜０．０２５ｍＬの範囲の過酸化水素の計算濃度（ｍＬ／Ｌ）の過酸化水素と、を含み得る。更なる実施形態において、上記培養物は、１ｐｐｔ〜２０ｐｐｔの濃度の塩化ナトリウムを含むことができる。いくつかの実施形態において、培養物組成物のヘマトコッカス藻細胞は、主に（すなわち、少なくとも８０％）緑色遊泳型段階であってもよい。いくつかの実施形態において、培養物組成物のヘマトコッカス藻細胞は、主に（すなわち、少なくとも８０％）赤色シスト型段階であってもよい。
以下の実施例において、本発明の実施形態を示し、更なる実施形態を更に詳細に開示するが、それらは、いかなる形であれ、本明細書に記載される本発明のあらゆる態様の範囲を限定することを意図するものではない。これらの実施例の中で、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓの２つの異なる株を試験し、それぞれ「株１」及び「株２」と同定した。
＜実施例１＞
Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓの培養物中における過酸化水素の分解率を決定するために実験を行った。ライフテクノロジーズ社（ニューヨーク州グランドアイランド）から商業的に入手可能なＡｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ Ｈｙｄｒｏｇｅｎ Ｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｋｉｔ（カタログ番号Ａ２２１８８）を用いて、過酸化水素の存在下における試薬の酸化において形成される蛍光生成物の検出により、過酸化水素濃度をアッセイした。パドルホイール混合を行いながら温室内に配置されたオープンレースウェイポンドバイオリアクタ（非無菌条件）における培養物、及びカーボイ（ｃａｒｂｏｙ）バイオリアクタ（無菌条件）における培養物から、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ（株１）の試料をそれぞれ採取した。両培養物由来の試料に０．０６ｍＬ／Ｌの２５％ストック濃度（有効濃度０．０１５ｍＬ／Ｌ）の過酸化水素を投与し、Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ Ｈｙｄｒｏｇｅｎ Ｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｋｉｔを用いて過酸化水素濃度を３０分毎に１８０分間モニタした。両培養物に由来する各試料の過酸化水素濃度は指数関数的減少を示し、３０分後には単鞭毛生物類（例えば、真菌類遊走子）に対して有効であると期待されるレベル［すなわち、２５％ストックの０．０３ｍＬ／Ｌを超える（０．００７５ｍＬ／Ｌより高い計算濃度）］を下回る濃度になり、１２０分間後には検出可能限界を下回る濃度になった。これらの結果は、培養物を０．０１５ｍＬ／Ｌの計算濃度の過酸化水素で処理することによって、短期間（すなわち、３０分未満）では汚染（例えば、単鞭毛生物類）に対して有効であることが期待されるレベルを上回る濃度が維持されるが、その後は、ヘマトコッカス藻細胞を含む培養物中における所望の微生物のいずれにも有害でないレベルに消失してしまうことを示す。また、それらの結果は、時間と共に過酸化水素を反復投与することによって、ヘマトコッカス藻に有害な、又は採取された最終生産物において検出可能な残留濃度を増加させるリスクが生じないことを示す。
＜実施例２＞
Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓの過酸化水素耐容性のレベルを評価するために実験を行った。Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓの１つ目の株（株１）の緑色遊泳型細胞をウェルプレート内に入れ、この細胞の培養物２ｍＬに２５％ストック濃度の単一用量（０．０６ｍＬ／Ｌ、０．１０ｍＬ／Ｌ、０．１３ｍＬ／Ｌ、０．１６ｍＬ／Ｌ）の過酸化水素を加えることによって試験した。試験した過酸化水素用量の計算濃度は、０．０１５０ｍＬ／Ｌ、０．０２５０ｍＬ／Ｌ、０．０３２５ｍＬ／Ｌ、及び０．０４００ｍＬ／Ｌであった。過酸化水素の投与から１８時間後に、顕微鏡下における目視観察を用いて細胞溶解の量を定量した。結果を表１に示すが、標準誤差は「ＳＥ」で表される。

表１に示されているように、計算濃度が０．０３２５ｍＬ／Ｌを上回る過酸化水素投与レベルで細胞の顕著な溶解（すなわち、５％超）が生じた。
Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓの２つ目の株（株２）の緑色遊泳型細胞及び赤色シスト型細胞をウェルプレート内に入れ、緑色遊泳型細胞及び赤色シスト型細胞の両方の細胞の各培養物２ｍＬに３５％ストック濃度の用量（０．０３ｍＬ／Ｌ、０．０４ｍＬ／Ｌ、０．０５ｍＬ／Ｌ、０．０６ｍＬ／Ｌ、０．０７ｍＬ／Ｌ）の過酸化水素を１日３回（すなわち、朝、昼及び晩）加えることによって試験した。試験した過酸化水素用量の計算濃度は、０．０１０５ｍＬ／Ｌ、０．０１４０ｍＬ／Ｌ、０．０１７５ｍＬ／Ｌ、０．０２１０ｍＬ／Ｌ、及び０．０２４５ｍＬ／Ｌであった。２４時間後、４８時間後及び７２時間後に顕微鏡下における目視観察を用いて細胞溶解の量を定量した。結果を表２〜表３に示すが、標準誤差は「ＳＥ」で表される。


表２に示すように、緑色遊泳型細胞は、０．０１０５ｍＬ／Ｌの計算濃度の過酸化水素が投与された場合、１０％未満の細胞溶解レベルを少なくとも７２時間維持した。計算濃度が０．０２１０ｍＬ／Ｌでは、緑色遊泳型細胞は、１０％未満の溶解レベルを４８時間維持した。これらの結果は、より低い濃度の用量で処理した細胞には、全期間にわたって低レベルの溶解（すなわち、１０％未満）が生じたが、より高い濃度の用量が与えられた培養物は、４８時間以下しか低レベルの溶解（すなわち、１０％未満）を維持しなかったことを示している。従って、このことは、上記方法における過酸化水素の濃度が重要であり、単により多く加えれば緑色遊泳型細胞における溶解に関する結果がより良好になるわけではないことを示している。
表３に示すように、赤色シスト型細胞は、０．０１７５ｍＬ／Ｌ未満の計算濃度の過酸化水素の投与量された場合、１０％未満の細胞溶解レベルを少なくとも９６時間維持したが、０．０１７５ｍＬ／Ｌ以上の計算濃度の投与量では、４８〜９６時間後に１０％を上回る細胞溶解が生じた。これらの結果もまた、単に過酸化水素の投与量を増加させても赤色シスト型細胞の溶解に関するより良好な結果が得られるわけではないことを示すが、緑色遊泳型細胞及び赤色シスト型細胞に適用した場合の濃度についての結果は厳密に同じではなかった。従って、表２及び表３の結果は共に、細胞の状態と、過酸化水素の濃度と、処理が適用される時間の長さとが、細胞溶解を許容し得るレベルに維持するために又は溶解を防ぐために、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓの培養物を処理するために過酸化水素を用いる際に考えるべき因子であることを示す。
＜実施例３＞
細菌集団が検出可能なパターンをシフト又は生成するのか決定するために、過酸化水素処理中、溶解事象中、及びツボカビ（ｃｈｙｔｒｉｄ）感染中に、培養物の細菌集団を分析するために、細菌集団配列決定（ＳＳＵ ｒＲＮＡ１６ｓ）を用いて、一連のＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ（株１）培養物を比較した。
パドルホイール混合を用いた、リアクタ容積が１６，０００Ｌ；１日の光合成有効放射（ＰＡＲ）が５７モルｍ−２ｄ−１；ｐＨが７．５；パドルホイール速度が４０％の条件で作動する、温室内に配置されたオープンレースウェイポンド型バイオリアクタ［識別番号（＃）２２１０及び２２２０］内における緑色遊泳型細胞を含むＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ培養物を同日中に接種し、成長条件で培養した。バイオリアクタ＃２２１０内の培養物は、バイオリアクタ＃２３１０への移動前又は移動後に過酸化水素で処理しなかった。バイオリアクタ＃２２２０内の培養物については、オープンレースウェイポンド型バイオリアクタ＃２３２０に移動する前後に、０．０３ｍＬ／Ｌの２５％ストック濃度（計算濃度０．００７５ｍＬ／Ｌ）の過酸化水素で２４時間毎に処理した。オープンレースウェイポンド型バイオリアクタ＃２３２０は、リアクタ容積が５０，０００Ｌ；１日のＰＡＲが５４モルｍ−２ｄ−１；ｐＨが７．５；パドルホイール速度が４０％の条件で作動し、上記温室内に配置され、パドルホイール混合を用いたものであった。結果から、バイオリアクタ＃２２２０内の処理培養物はバイオリアクタ＃２２１０内の未処理培養物より１日長く高運動性（９５％）を保持し、バイオリアクタ＃２３２０内の処理培養物中のツボカビはバイオリアクタ＃２３１０の未処理培養物中のツボカビよりも３日遅く検出されたことが示された。
Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｅｍｔｉｃｉｃｉａ属及びＳｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属を含む窒素固定細菌が、培養物の細菌集団分析における優占種であると同定され、各培養物の培養期間の初期及び中期に存在した。しかし、バイオリアクタ＃２３２０内における過酸化水素処理の後、窒素固定細菌の相対量は、優占細菌集団の２０〜４０％から１０％未満に減少した。多量の細胞溶解が処理培養物（バイオリアクタ＃２３２０）において目視観察されたが、処理の終了の５日後までは観察されなかった。Ｒｕｎｅｌｌａ属は、２回目の過酸化水素処理の前から始まり、溶解の事象の期間の間まで、バイオリアクタ＃２３２０内の培養物の細菌集団における優占種であった。
温室内に配置され、パドルホイール混合を用い、リアクタ容積が５５，０００Ｌ；１日のＰＡＲが５５モルｍ−２ｄ−１；ｐＨが７．５；パドルホイール速度が４０％の条件で作動するオープンレースウェイポンド型バイオリアクタ＃２３３０内の緑色遊泳型細胞を含むＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ培養物を、０．０３ｍＬ／Ｌの２５％ストック濃度（計算濃度０．００７５ｍＬ／Ｌ）の過酸化水素で、移動の２日前に１回処理し、温室内に配置され、パドルホイール混合を用い、リアクタ容積が１４０，０００Ｌ；１日のＰＡＲが５５モルｍ−２ｄ−１；ｐＨが７．３；パドルホイール速度が７０％の条件で作動するオープンレースウェイ型バイオリアクタ＃２４３０への移動後に２回処理した。多量の細胞溶解が１回目の処理の前に目視観察され、４日間維持された。溶解を防止又は抑制させるという過酸化水素処理の効果は、溶解が生じた後で処理が始まったという事実のため、限定的となったように見受けられた。ツボカビ胞子嚢は、培養物中に検出されなかった。Ｒｈｅｉｎｈｅｉｍｅｒａ属、Ｆｌｅｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｒｕｎｅｌｌａ属及びＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属は、溶解開始中の培養物の細菌集団分析において他の細菌に対して相対的に増加し始めたが、Ｒｕｎｅｌｌａ属だけが、溶解期間の終了時に近くなると優占種になった。
リアクタ容積が６０，０００Ｌ；１日のＰＡＲが５７モルｍ−２ｄ−１；ｐＨが７．５；パドルホイール速度が４０％の条件で作動するオープンレースウェイポンド型バイオリアクタ＃２３３０内の緑色遊泳型細胞を含む他のＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ培養物を、他のバイオリアクタに移動する前に、０．０３ｍＬ／Ｌの２５％ストック濃度（計算濃度０．００７５ｍＬ／Ｌ）の過酸化水素で２回処理した。このバイオリアクタ＃２３３０の培養物を、温室内に配置され、パドルホイール混合を用い、リアクタ容積が１４０，０００Ｌ；１日のＰＡＲが５８モルｍ−２ｄ−１；ｐＨが７．３；パドルホイール速度が７０％の条件で作動するオープンレースウェイポンド型バイオリアクタ＃２４２０に移動したが、移動後には培養物を処理しなかった。この培養物は、バイオリアクタ＃２４２０に移動後にも細胞分裂を継続することが観察された。観測結果から、１回目の処理後に運動性が約３０％減少し、２回目の処理後に６０％の溶解が生じたことが示された。ツボカビ胞子嚢が、培養期間の終了時、すなわち過酸化水素処理が終了して７日後に存在していることが観察された。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｆｌｅｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属及びＣｙｔｏｐｈａｇａ属を含む細菌が、バイオリアクタ＃２３３０及び＃２４２０の両方における細菌集団中に存在した。培養物中のカロテノイド類の割合は、約３．５％（ＵＶ法によって定量された）であった。
＜実施例４＞
Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓの培養物を過酸化水素で処理することが生細菌数に影響を及ぼすかどうかを決定するために、実験を行った。パドルホイール混合を行い、倉庫内に配置されたオープンレースウェイポンド（容積２５０Ｌ）内の緑色遊泳型細胞を含むＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ（株１）の培養物を、温室内で配置され、パドルホイール混合を用い、リアクタ容積が１６，０００Ｌ；１日のＰＡＲが５０モルｍ−２ｄ−１；ｐＨが７．５；パドルホイール速度が４０％の条件で作動するオープンポンド型バイオリアクタ＃２２１０及び２２３０の２つに分けた。バイオリアクタ＃２２１０内の培養物を、培養物の緑色遊泳型段階の間（９０時間）、６時間毎に、０．３３ｍＬ／Ｌの３％ストック濃度（計算濃度０．００９９ｍＬ／Ｌ）の過酸化水素で処理した。バイオリアクタ＃２２３０内の培養物は、比較用の対照の役割を果たすために処理されなかった。１１時間、３４時間、５２時間及び６６時間の時点で運動性、溶解、及び培養物中の生細菌数を評価するために試料を採取した。生細菌数は、３Ｍ社（ミネソタ州セントポール）から入手可能なＰｅｔｒｉｆｉｌｍを用いた平板計数によって得られ、結果を表４に示す。

運動性は、実験全体にわたって６０％を上回って維持されたが、未処理対照培養物においてはわずかに高かった。１５％を超える溶解は、いずれの培養物でも生じなかった。表４に示すように、過酸化水素処理を行った培養物は、細菌数が約１ｌｏｇ減少した。先の実験からの知見が、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓの培養物における１０７個／ｍＬを超える細菌濃度と溶解の発生との間の相関性を示したので、この結果は培養物における溶解の可能性を分析する際に有用であり得る。従って、過酸化水素処理を行ってＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ培養物の生細菌数を減らすことは、溶解に好適な条件を阻止し、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞を溶解により喪失するリスクを低下させるために用いることができる。
＜実施例５＞
Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓの培養物を過酸化水素で処理することが溶解を防ぐかどうかを決定するために、一連の実験を行った。温室内に配置され、パドルホイール混合を用い、リアクタ容積が６０，０００Ｌ；１日のＰＡＲが５７モルｍ−２ｄ−１；ｐＨが７．５；パドルホイール速度が４０％の条件で作動するオープンレースウェイポンド型バイオリアクタ＃２３３０から、緑色遊泳型細胞を含むＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ（株１）の培養物の試料を採取した。その後、この培養物を、温室内に配置され、パドルホイール混合を用い、リアクタ容積が１４０，０００Ｌ；１日のＰＡＲが５８モルｍ−２ｄ−１；ｐＨが７．３；パドルホイール速度が７０％の条件で作動するオープンレースウェイポンド型バイオリアクタ＃２４３０に移動し、また、バイオリアクタ＃２４３０への移動の２４時間後及び４８時間後にも試料を採取した。これら試料をフラスコに分け、一部のフラスコは０．０２８ｍＬ／Ｌの２５％ストック濃度（計算濃度０．００７ｍＬ／Ｌ）の過酸化水素で１日３回処理され、一部のフラスコは、比較用の対照の役割を果たすために処理されなかった。顕微鏡下における試料の目視観察によって溶解を毎日定量した。結果を表５〜表７に示すが、標準偏差は「ＳＤ」で表される。



表５に示すように、溶解は、対照培養物及び過酸化水素処理培養物の両方で低レベルを維持した。表６及び表７における結果から、対照培養物においては高レベル（８０％超）で溶解が生じ、過酸化水素処理では溶解はより低いレベル（３０％未満）に保たれたことが示された。このことは、過酸化水素による処理によって溶解を首尾よく６０％〜８０％低減し得ることを示している。
次いで、フラスコ試験試料からの知見をＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ（株１）の商業規模の培養物に適用した。このＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ（株１）培養物は、温室内に配置され、パドルホイール混合を用い、リアクタ容積が５５，０００Ｌ；１日のＰＡＲが４２モルｍ−２ｄ−１；ｐＨが７．５；パドルホイール速度が４０％の条件で作動するオープンレースウェイポンド型バイオリアクタ＃２３１０から、温室内に配置され、パドルホイール混合を用い、リアクタ容積が１４０，０００Ｌ；１日のＰＡＲが４０モルｍ−２ｄ−１；ｐＨが７．３；パドルホイール速度が７０％の条件で作動するオープンレースウェイポンド型バイオリアクタ＃２４２０に移動した緑色遊泳型細胞を含むＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ（株１）の商業規模の培養物であった。同様に、リアクタ容積が６０，０００Ｌ；１日のＰＡＲが４２モルｍ−２ｄ−１；ｐＨが７．５；パドルホイール速度が４０％の条件で作動するバイオリアクタ＃２３２０内の培養物を、リアクタ容積が１５０，０００Ｌ；１日のＰＡＲが４０モルｍ−２ｄ−１；ｐＨが７．３；パドルホイール速度が７０％の条件で作動するポンド型バイオリアクタ＃２４１０及び＃２４３０に分けて移動した。ポンド型バイオリアクタ＃２３１０及び＃２３２０内の培養物に対しては、０．０２ｍＬ／Ｌの３５％ストック濃度（計算濃度０．００７ｍＬ／Ｌ）の過酸化水素の処理がすでに６時間毎に行われており、その処理は、培養物を移動した後、処理の４日目まで継続した。顕微鏡下における試料の目視観察によって、培養物の採取の際に溶解を定量した。採取の際にＵＶ法によって細胞のカロテノイド含量を測定し、定期的乾燥重量試料に基づいて培養物の平均成長率を計算した。結果を、同じバイオリアクタ又は同じ場所で同じ月（２０１４年９月）の間の同様の作動条件のバイオリアクタにおける以前の培養の実施からのデータと比較した。結果を表８〜表１０に示す。



表８に示すように、溶解は、過酸化水素で処理した商業規模の培養物の内の２つで２０％〜３５％の範囲を維持したが、これは、未処理培養物が８０％を超える溶解レベルに達し得ることを示した過去のデータを超える向上であった。表９及び表１０に示すように、過酸化水素で処理した培養物は、未処理培養物より高いレベルのカロテノイドを生成し、より高い平均成長率を有したが、このことは、過酸化水素処理が、成長及びカロテノイド蓄積を直接向上させることができるか、又は溶解が抑制された環境を作ることによって成長及びカロテノイド蓄積を間接的に向上させることができることを示している。フラスコ試験及び商業的規模の培養物からの結果を合わせて考察すると、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ緑色遊泳型細胞の培養物を少なくとも０．００７ｍＬ／Ｌの計算濃度の過酸化水素で６時間毎に処理することによって、培養物成長速度（すなわち、バイオマス蓄積）及びカロテノイドの蓄積に悪影響を及ぼすことなく細胞溶解のレベルを少なくとも６０％減少させることができる。
＜実施例６＞
Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ培養物におけるツボカビ感染を制御するための処理としての、過酸化水素単独、及び過酸化水素といくつかの濃度の塩との組み合わせの有効性を評価するために、一連の実験を行った。温室内に配置され、パドルホィールで混合され、リアクタ容積が１７０，０００Ｌ；１日のＰＡＲが５３モルｍ−２ｄ−１；ｐＨが７．３；パドルホイール速度が７０％の条件で作動するオープンレースウェイ型バイオリアクタ＃２４２０から、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ（株１）培養物の培養試料を採取し、フラスコ内に配置した。バイオリアクタ＃２４２０には、１ｐｐｔの濃度の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含む培養培地を含む赤色化条件中に、緑色遊泳型段階の細胞を接種したばかりであった。フラスコ実験は、二重の未処理対照及び二重の処理から成った。処理フラスコ培養物には、０．０３ｍＬ／Ｌの２５％ストック濃度（計算濃度０．００７５ｍＬ／Ｌ）の過酸化水素を１日２〜３回投与した。約９日間（２１７時間）の間、顕微鏡を用いた目視観察と、細胞乾燥重量（ｇ／Ｌ）の測定とによって培養物の総細胞中のツボカビの割合（ツボカビ感染の割合（％））をモニタするために、試料をフラスコ培養物から毎日採取した。結果を表１１〜表１２に示す。


結果から、未処理対照におけるツボカビ感染の割合（％）は、６日目（１４４時間）から広範囲にわたって変化し（１５％〜９０％）、その平均は、残りの日にわたって４０％超まで徐々に増加したことが示された（表１１に示される）。処理培養物においては、ツボカビ感染の割合（％）は、９日間の期間全体にわたって０％であった。表１２に示すように、乾燥細胞重量は、対照及び処理培養物の両方において増加した。
温室内に配置され、パドルホィールで混合され、リアクタ容積が１７５，０００Ｌ；１日のＰＡＲが４０モルｍ−２ｄ−１；ｐＨが７．３；パドルホイール速度が７０％の条件で作動するオープンレースウェイ型バイオリアクタ＃２４４０から、第２の実験のための培養試料を、接種の３日後であり塩濃度が１ｐｐｔであったときに採取した。二重の未処理対照及び二重の処理から成る培養用フラスコ内に試料を配置した。処理フラスコ培養物には、０．０３ｍＬ／Ｌの２５％ストック濃度（計算濃度０．００７５ｍＬ／Ｌ）の過酸化水素を１日２〜３回投与した。フラスコ培養物は、緑色遊泳型段階及び初期の赤色シスト型段階のＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ（株１）細胞を含んでいた。約６日間（１４４時間）の期間、ツボカビ感染の割合（％）及び細胞乾燥重量を定量するために、フラスコ培養物から試料を毎日採取した。結果を表１３〜表１４に示す。


表１３に示すように、ツボカビ感染の割合（％）は、対照では６７％に達し、処理培養物では減少した。表１４に示すように、乾燥細胞重量は、対照及び処理培養物の両方において増加した。
温室内に配置され、パドルホイールで混合され、リアクタ容積が１８，０００Ｌ；１日のＰＡＲが４８モルｍ−２ｄ−１；ｐＨが７．５；パドルホイール速度が４０％の条件で作動するオープンレースウェイ型バイオリアクタ＃２２１０から、第３の実験のためのＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ（株１）の培養試料を回収した。回収した試料に、緑色遊泳型段階において成長条件で［すなわち、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）の非存在下で］接種した。二重の未処理対照及び二重の処理から成るフラスコ内に試料を分配した。処理フラスコ培養物には、０．０３ｍＬ／Ｌの２５％ストック濃度（計算濃度０．００７５ｍＬ／Ｌ）の過酸化水素を１日２回投与した。約１１日間（２６４時間）の期間、ツボカビ感染の割合（％）及び細胞乾燥重量を定量するために、試料をフラスコ培養物から毎日採取した。結果を表１５〜表１６に示す。


表１５に示すように、ツボカビ感染の割合（％）は、最初の８日間（１９２時間）において広範囲にわたって変化したが、処理した場合においては、１１日目（２６４時間）までには対照と比較して減少した。表１６に示すように、乾燥細胞重量は、対照及び処理培養物の両方において増加したが、実験の終了まで非常にばらつきがあった。
温室内に配置され、パドルホイールで混合され、リアクタ容積が４８，０００Ｌ；１日のＰＡＲが５０モルｍ−２ｄ−１；ｐＨが７．５；パドルホイール速度が４０％の条件で作動するオープンレースウェイ型バイオリアクタ＃２３１０から、第４の実験のためのＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ（株１）の培養試料を回収した。培養試料に、緑色遊泳型段階において成長条件で［すなわち、１ｐｐｔ未満の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）］接種した。次いで、フラスコ培養物を硝酸塩不含ＨＭＢ培地により３：１で希釈して、ＮａＣｌの濃度を１ｐｐｔとし、二重の未処理対照及び二重の処理とした。処理フラスコ培養物には、０．０３ｍＬ／Ｌの２５％ストック濃度（計算濃度０．００７５ｍＬ／Ｌ）の過酸化水素を１日３回投与した。約９日間（２１６時間）の期間、ツボカビ感染の割合（％）及び細胞乾燥重量を分析するために、フラスコ培養物から試料を毎日採取した。結果を表１７〜表１８に示す。


表１７に示すように、処理したものにおけるツボカビ感染の割合（％）は、接種の５日後（１４４時間）から対照と比較して５０％〜９０％減少したことが観察された。結果の変動性は、１つの処理フラスコが感染したが、その他は感染しなかったという事実に起因すると考えられた。表１８に示すように、乾燥細胞重量は、対照及び処理培養物の両方で増加したが、処理フラスコの方が高かった。
リアクタ容積が６６，０００Ｌ；１日のＰＡＲが４８モルｍ−２ｄ−１；ｐＨが７．５；パドルホイール速度が４０％の条件で作動するオープンレースウェイ型バイオリアクタ＃２３１０から、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ（株１）の培養試料を、第５の実験のために回収した。二重の未処理の対照及び二重の処理から成る培養用フラスコに培養試料を分配した。次いで、１ｐｐｔのＮａＣｌ又は２ｐｐｔのＮａＣｌを含む赤色化培地（３３．３ｍＬ及び６６．６ｍＬの培養培地）中にフラスコ培養物を１：３で希釈した。処理フラスコ培養物には、０．０３ｍＬ／Ｌの２５％ストック濃度（計算濃度０．００７５ｍＬ／Ｌ）の過酸化水素を１日３回投与した。約８日間（１９２時間）の期間、ツボカビ感染の割合（％）及び細胞乾燥重量を分析するために、フラスコ培養物から試料を毎日採取した。結果を表１９〜表２０に示す。


表１９に示すように、対照培養物において、ツボカビ感染は５日（１２０時間）以内に現れ、７日目（１６８時間）までに９０％超のツボカビ感染に増加した。処理培養物において、ツボカビ感染の割合（％）は、８日間の期間全体にわたって０％であった。表２０に示すように、乾燥細胞重量は、対照と処理培養物の間で同等であった。全ての実験全体において、過酸化水素による処理は、塩と共に用いるかどうかに関係なく、ツボカビ感染の減少に有効であることが示された。
＜実施例７＞
Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓの感染培養物におけるツボカビを減少させる処理方法としての塩及び過酸化水素の組み合わせの有効性を評価するために、実験を行った。屋外に配置されパドルホイール混合を行う３，０００Ｌのオープンレースウェイポンド型バイオリアクタ＃ＭＰ１から、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ（株２）の培養試料を回収した。試料を採取した際、培養物は、緑色遊泳型細胞及びツボカビ（培養物の１００％感染）を含んだ。この感染培養物１ｍＬを、１ｐｐｔ又は３ｐｐｔの塩（ＮａＣｌ）を含む３部の培地に対して１部の培養物で赤色化培地中に希釈されたカーボイバイオリアクタ培養物から無菌緑色遊泳型を含む重複フラスコ（１００ｍＬの容積）内に接種した。１ｐｐｔの塩を含むフラスコ培養物には、０．０２４ｍＬ／Ｌ又は０．０４ｍＬ／Ｌの３５％ストック濃度（計算濃度０．００７ｍＬ／Ｌ又は０．０１４ｍＬ／Ｌ）の過酸化水素を１日３回（朝、昼及び晩）投与した。３ｐｐｔの塩を含むフラスコ培養物には、０．０２ｍＬ／Ｌの３５％ストック濃度（計算濃度０．００７ｍＬ／Ｌ）の過酸化水素を１日３回（朝、正午及び夕方）投与した。培養物をフラスコ内に接種してから７２時間後及び９６時間後に、顕微鏡下の目視観察によりツボカビに感染した細胞の割合を定量した。結果を表２１に示す。

表２１に示すように、１ｐｐｔの塩を含む培養物に対する過酸化水素処理は、７２時間後では、未処理対照及び３ｐｐｔの塩を含む処理と比較してツボカビ感染の割合（％）の減少を示したが、０．０１４ｍＬ／Ｌの過酸化水素処理では０．００７ｍＬ／Ｌの過酸化水素処理よりも減少が大きかった。９６時間後では、１ｐｐｔの塩及び０．０１４ｍＬ／Ｌの過酸化水素の処理は、ツボカビの減少のための有効な処理として継続するように見受けられなかった。このことは、塩及び過酸化水素の組み合わせは、限定された期間、既に感染したＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ培養物におけるツボカビの減少に有効である可能性があり、その期間の後は、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞を採取する、又は異なる処理方法を利用する形で更なる作業を行う必要があり得ることを示している。
＜実施例８＞
Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓの感染培養物におけるツボカビを減少させる処理方法としての塩及び過酸化水素の組み合わせの有効性を評価するために、実験を行った。屋外に配置され、パドルホイール混合を行う３つの３，０００Ｌ容のオープンレースウェイポンド型バイオリアクタ＃ＭＰ１、＃ＭＰ２及び＃ＭＰ３に、１ｐｐｔの塩（ＮａＣｌ）を含む３部の赤色化培地に対して１部の培養試料の希釈率で、屋外のリアクタ＃２３１０からの緑色遊泳型Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ（株２）細胞の培養物を接種した。培養物が自身で感染することに失敗した後、６日後に他の屋外のリアクタ（＃２４２０）から５Ｌの感染培養物を加えることによってツボカビ感染を促進させた。０．０３ｍＬ／Ｌの３５％ストック濃度（計算濃度０．０１０５ｍＬ／Ｌ）の過酸化水素で６時間毎に＃ＭＰ１及び＃ＭＰ３を処理した。比較目的用の未処理対照の役割を果たすために、＃ＭＰ２は過酸化水素で処理しなかった。ツボカビに感染した細胞の割合を、ツボカビを導入した２４時間後に顕微鏡下の目視観察を用いて定量し、＃ＭＰ１では２０％、＃ＭＰ２では＃１０％、＃ＭＰ３では５％未満であると測定した。過酸化水素処理が始まった後、ツボカビに感染した培養物の割合、ＵＶ法によるカロテノイドの割合、及び細胞乾燥重量（ｇ／Ｌ）を毎日定量した。結果を表２２〜表２４に示す。



表２２に示すように、過酸化水素及び塩の処理は、処理を開始した際に５％未満であった＃ＭＰ３培養物におけるツボカビ感染レベルを、５％未満に維持するのに有効だった。また、過酸化水素及び塩の処理は、未処理対照（＃ＭＰ２）と比較して、中程度のレベル（２０％）で開始した＃ＭＰ１培養物のツボカビ感染を遅らせることにも有効だった。顕微鏡下の赤色シスト型細胞の目視観察によって、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞が緑色遊泳型段階から赤色シスト型段階に移行する際に、シストが完全に生じる前に感染しやすいことも示された。
表２３及び表２４に示すように、塩の存在下での過酸化水素による連続処理は、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞におけるカロテノイド類及びバイオマスの蓄積を阻害しなかった。これらの結果は共に、ツボカビに感染したＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞の培養物を低量の塩（１ｐｐｔ）の存在下において過酸化水素で連続的に処理することは、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ藻によるカロテノイド（例えば、アスタキサンチン）及びバイオマスの蓄積に悪影響を及ぼすことなく、処理開始時に感染が低いレベル（５％未満）である場合に感染の増加を防止することに有効であり、少なくとも処理開始時に上記既に中程度のレベル（例えば、２０％）である感染の増加を遅くすることに有効であることを示す。
＜実施例９＞
Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓの感染培養物におけるツボカビを減少させる処理方法として、より高い濃度［０．０３ｍＬ／Ｌ超の、３５％のストック（０．０１０５ｍＬ／Ｌ超の計算濃度）］の過酸化水素を用いることができるのかについて評価するために、実験を行った。リアクタ容積が１７０，０００Ｌ；１日のＰＡＲが測定されない；ｐＨが７．３；パドルホイール速度が７０％の条件で作動するオープンレースウェイ型バイオリアクタ＃２４２０から、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ（株２）の培養試料を培養の５日目に回収した。二重の未処理対照及び二重の処理から成る培養用フラスコに培養試料を分配した。処理は、より高い濃度（０．０４ｍＬ／Ｌ及び０．０５ｍＬ／Ｌ）の３５％ストック濃度（計算濃度０．０１４０ｍＬ／Ｌ及び０．０１７５ｍＬ／Ｌ）の過酸化水素の異なる頻度の用量（１日１回〜３回）と、これまでの標準処理（０．０１０５ｍＬ／Ｌの計算濃度を１日３回）とを比較した。約１１日間の期間、溶解の割合（％）、ツボカビ感染の割合（％）、及び細胞乾燥重量を定量するために、数日毎にフラスコ培養物から試料を採取した。５日目までに全ての処理において溶解率が１０％を超えたため、処理を中止し、溶解からの回収をモニタした。結果を表２５〜２７に示す。



表２５に示すように、溶解の割合は、０．０１４ｍＬ／Ｌを１日３回投与した場合において４０％の溶解であった場合を除いて、５日目までに過酸化水素で処理された全培養物において１０％に達した。この時点で処理を中止し、溶解率は、６〜１１日目を通して安定した状態を維持した。表２６に示すように、ツボカビ感染は、未処理対照において１００％に増大したが、処理したフラスコの全てにおいては、処理が終了してから４〜６日後まで１０％未満を維持した。事前に０．０１４０ｍＬ／Ｌ及び０．０１７５ｍＬ／Ｌを１日１回投与したフラスコにおいて、最終的な感染率は最も低かった。表２７に示すように、培養物乾燥重量は、１日１回処理した培養物においては９日目に最も高かった。結果から、処理は溶解に対する悪影響を示さなかったことが示されたが、処理は、乾燥重量に悪影響を及ぼすことなくツボカビ感染に対して有効だった。
＜実施例１０＞
０．０３ｍＬ／Ｌ〜０．０５ｍＬ／Ｌの３５％ストック濃度（計算濃度０．０１０５ｍＬ／Ｌ〜０．０１７５ｍＬ／Ｌ）の過酸化水素の１日１回の処理を、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓの感染培養物においてツボカビを減少させるための処理方法として用いることができるかどうかについて評価するために、第２のフラスコ実験を行った。リアクタ容積が１７０，０００Ｌ；１日のＰＡＲが測定されない；ｐＨが７．３；パドルホイール速度が７０％の条件で作動するオープンレースウェイ型バイオリアクタ＃２４３０から、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ（株２）の培養試料を培養の２日目に回収した。二重の未処理対照及び二重の処理から成る培養用フラスコに培養試料を分配した。処理は、０．０３ｍＬ／Ｌ、０．０４ｍＬ／Ｌ及び０．０５ｍＬ／Ｌの３５％ストック濃度（計算濃度０．０１０５ｍＬ／Ｌ、０．０１４０ｍＬ／Ｌ及び０．０１７５ｍＬ／Ｌ）の過酸化水素の異なる頻度の用量（１日１回、及び１日１回の後１日おき）を比較した。１１日間の期間、溶解の割合（％）及びツボカビ感染の割合（％）を定量するために、フラスコ培養物から試料を毎日採取し、細胞乾燥重量を１日おきに定量した。結果を表２８〜表３０に示す。



表２８に示すように、溶解の割合は、１１日間、対照培養物及び０．０１０５ｍＬ／Ｌの過酸化水素を投与した培養物については、１０％未満の状態を維持した。０．０１４０ｍＬ／Ｌの過酸化水素で処理された培養物では、７日目までに２０％の溶解に達し、０．０１７５ｍＬ／Ｌで処理された培養物では、２回だけ投与した後３日目までに３０％の溶解に達した。これらのフラスコ培養物を６日目に廃棄した。このセットにおける培養物は、過酸化水素に対する耐容性がより低い可能性があったが、これは、以前の実験（実施例９）においては、培養試料は親の接種の５日後に回収され、シスト型段階に更に進んでいた一方、このセットにおける培養物は接種の２日以内に親リアクタから回収されたことによるものと思われた。表２９に示すように、ツボカビ感染は、未処理対照においては２０％〜４０％に達したが、全ての処理フラスコにおいては１０％未満を維持した。表３０に示すように、培養物乾燥重量は、対照及び３日間毎日、次いで１日おきに処理したフラスコと比較して、毎日処理されたフラスコにおいてわずかに減少した。結果から、過酸化水素濃度が低くなると、溶解及びツボカビ感染の両方が減少する可能性があるが、高い過酸化水素濃度は、溶解よりもツボカビ感染を減少させることに有効であったことが示される。
＜実施例１１＞
Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓの感染培養物におけるツボカビを減少させるため、０．０３ｍＬ／Ｌの３５％ストック濃度（計算濃度０．０１０５ｍＬ／Ｌ）の過酸化水素の処理を微調整するために、第２のフラスコ実験を行った。リアクタ容積が１５０，０００Ｌ；１日のＰＡＲが９．７７モルｍ−２ｄ−１；ｐＨが７．３；パドルホイール速度が７０％の条件で作動するオープンレースウェイ型バイオリアクタ＃２４１０から、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ（株２）の培養試料を培養の２日目に回収した。二重の未処理対照及び二重の処理から成る培養用フラスコに培養試料を分配した。処理は、０．０３ｍＬ／Ｌの３５％ストック濃度（計算濃度０．０１０５ｍＬ／Ｌ）の過酸化水素の異なる頻度の用量（１日１回、１日おきに１回、及び３日間だけ１日１回）を比較した。１１日間の期間、溶解の割合（％）及びツボカビ感染の割合（％）を定量するために、フラスコ培養物から試料を毎日採取し、細胞乾燥重量を１日おきに定量した。結果を表３１〜表３３に示す。



表３１に示すように、処理全体にわたって、フラスコ内における細胞溶解は１０％未満の状態を維持した。表３２に示すように、ツボカビ感染は、全ての処理されたフラスコ内において５％未満の状態を維持したが、未処理対照においては、４日目の後、９０％超の感染まで増大した。表３３に示すように、培養物乾燥重量は、全ての処理において増加したが、６日目の後、感染対照において顕著に減少した。これらの結果から、毎日、１日おき、又は３日間に亘って毎日適用された０．０１０５ｍＬ／Ｌの過酸化水素の保存処理だけで、バイオマス蓄積に影響を及ぼすことなく、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓの赤色化培養物におけるツボカビの防止に充分であることが示唆される。
＜実施例１２＞
過酸化水素を加えることなく、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓの感染培養物におけるツボカビを減少させる処理方法としての塩の有効性を評価するために、実験を行った。この試験は、フラスコ（０．１Ｌ）内と、温室内に配置され、リアクタ容積が２３０Ｌ；１日のＰＡＲが２０モルｍ−２ｄ−１；ｐＨ（測定せず）；パドルホイール速度が２１ｒｐｍ（ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎｓ ｐｅｒ ｍｉｎｕｔｅ）の条件で作動するリアクタ内と、において一緒に行った。フラスコ（容積１００ｍＬ）には、リアクタ容積が１９３，７５０Ｌ；ｐＨが７．３；パドルホイール速度が７０％の条件で作動し、塩（ＮａＣｌ）を２ｐｐｔの濃度に上昇させたオープンレースウェイポンド型屋外リアクタ＃２４１０からの緑色遊泳型段階のＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ（株２）細胞の培養物に由来する試料を接種した。フラスコ培養物は、１４０ｒｐｍで振盪によって混合され、１２時間の光サイクル及び２．５％のＣＯ２の一定供給における３００μｍｏｌ／ｍ２ｓ〜４００μｍｏｌ／ｍ２ｓの光合成有効放射（ＰＡＲ）を受けた。培養物の運動性を顕微鏡下で目視観察によってモニタした。細胞の運動性が１０％未満であることが観察されたら、塩のレベルを、重複して４ｐｐｔ〜１１ｐｐｔまで上昇させ、２ｐｐｔの塩で維持した２つのフラスコ内の培養物と比較した。９つの２３０Ｌ容リアクタにも、上記フラスコの場合と同じ日にバイオリアクタ＃２４１０からの培養物を播種し、２ｐｐｔの濃度の塩とした。細胞の運動性が１０％未満に減少したら（フラスコについては培養の３日目、２３０Ｌ容リアクタについては２日目）、塩のレベルを４ｐｐｔ〜１８ｐｐｔの間の点に上昇させ、２ｐｐｔの塩で維持した２つのリアクタ内の培養物と比較した。顕微鏡下の目視観察による細胞溶解の割合、培養物乾燥重量（ｇ／Ｌにおけるバイオマス蓄積）及び顕微鏡下の目視観察によるツボカビ感染の割合について、フラスコ及び２３０Ｌ容リアクタをモニタした。ＵＶ法を用いて２３０Ｌ容リアクタ内における培養の１日おきにカロテノイド生成、すなわちアスタキサンチンを決定するための代用を定量した。結果を表３４〜表４０に示す。







表３４及び表３５に示すように、細胞溶解は、全ての処理についてフラスコ内では１０％未満を維持し、１０ｐｐｔ以外の全ての処理にわたって２３０Ｌ容リアクタ内では３０％未満を維持した。溶解は塩濃度が４ｐｐｔ、１０ｐｐｔ及び１８ｐｐｔである場合に最も高かった。表３６及び３７表に示すように、フラスコ及び２３０Ｌ容リアクタの両方について塩分濃度が増加するにつれて、ツボカビ感染は減少した。ツボカビ感染は、フラスコ内においては７ｐｐｔ〜１０ｐｐｔの間の処理、及び２３０Ｌ容リアクタ内においては７ｐｐｔ以上の処理について、５％〜１０％未満を維持した。表３８に示すように、培養物乾燥重量で測定されるバイオマス蓄積は、２つの最も高い塩分濃度で減少した以外、全ての処理について同様であった。表３９に示すように、バイオマス蓄積は、５ｐｐｔ〜８ｐｐｔの間の処理について、７日目の後の２３０Ｌ容リアクタ内において最も高かった。表４０に示すように、カロテノイドの蓄積は、２３０Ｌ容リアクタ内において５ｐｐｔ〜８ｐｐｔの間の処理について最も高かった。顕微鏡下の目視観察によって、フラスコ及び２３０Ｌ容リアクタの両方において、８ｐｐｔに設定された培養物におけるシストが、最も健康で、最もきれいに見える（例えば、大きく、赤色で、最も汚染されていない）ことが示された。これらの知見によって、過酸化水素処理に代わるものとして、８ｐｐｔの塩を、バイオマス及びアスタキサンチンの蓄積を維持しつつツボカビ感染を減少させるために用いることができることが示唆される。
＜実施例１３＞
ツボカビに対する処理としての評価のために漂白剤、塩、ルフェヌロン（化学的殺生物剤）及びＲｉｄ Ｆｕｎｇｕｓ（登録商標）（Ｋｏｒｄｏｎ社の天然有機ハーブの配合物）に対するツボカビ耐容性を決定するために、実験を行った。ウェルプレート内のツボカビ純粋培養物を２４時間毎に処理し、顕微鏡下で観察して効果を決定した。未処理の培養物を比較用の対照として用いた。顕微鏡下の目視観察によって、質的評価及び定量的推定を行った。
対照培養物において、尾部のない遊走子及び胞子嚢が１時間後に観察された。２４時間後に遊泳する遊走子が観察され、４８時間後に胞子嚢及び遊泳する遊走子（８０％〜１００％の運動性）が観察され、７２時間後に遊泳する遊走子（９０％〜１００％の運動性）が観察された。対照培養物の観察から、実行可能な処理として、遊走子の形成又は運動性を低下させる処理を更に検討する余地がある。
０．０３ｍＬ／Ｌの１２．５％ストック濃度（計算濃度０．００３７５ｍＬ／Ｌ）の漂白剤が投与された培養物では、２４時間後に胞子嚢及び遊走子が観察された。４８時間後に胞子嚢及び遊泳する遊走子（１００％の運動性）が観察され、７２時間後に遊泳する遊走子（１００％の運動性）が観察された。
０．１ｍＬ／Ｌの１２．５％ストック濃度（計算濃度０．０１２５ｍＬ／Ｌ）の漂白剤が投与された培養物では、１時間後に胞子嚢だけが観察された。２４時間後に細菌だけが観察され、４８時間後に細菌及びいくつかの遊走子が観察され、７２時間後には、遊走子は観察されないが、いくつかの胞子嚢と共に細菌が観察された。
０．２ｍＬ／Ｌの１２．５％ストック濃度（計算濃度０．０２５ｍＬ／Ｌ）の漂白剤が投与された培養物では、１時間後に胞子嚢及び遊走子が観察された。２４時間後に遊泳する遊走子が観察され、４８時間及び７２時間後に細菌及び胞子嚢のみ（遊走子は無し）が観察された。０．０１２５ｍＬ／Ｌ及び０．０２５ｍＬ／Ｌの漂白剤の処理について７２時間後に遊走子が存在しなくなったことは、上記処理がツボカビに対して有効である可能性があることを示すが、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ（株１）の公知の耐容性は０．００３７５ｍＬ／Ｌであり、より高い濃度は培養中の処理として実行可能ではないであろう。
２０ｐｐｔの塩（ＮａＣｌ）が投与された培養物では、１時間後に、凝集した胞子嚢及び遊走子が観察された。２４時間後に弱った胞子嚢が観察されたが遊走子は観察されず、４８時間後にしなびた遊走子及び胞子嚢と共に細菌が観察され、７２時間後には遊走子も胞子嚢も観察されなかった。結果から、高レベルの塩はツボカビに対して有効であるが、上記このような高レベルは、培養中にＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ藻のいくつかの株に対して悪影響を及ぼすことを示した閾値を超えることが示される。
４０ｐｐｍのルフェヌロンが投与された培養物では、１時間後に遊泳する遊走子が観察された。２４時間後に遊泳する遊走子が再び観察され、４８時間後及び７２時間後に胞子嚢及び遊走子と共に多量の（ｈｅａｖｙ）細菌が観察された。結果として遊走子の増殖が生じたことは、ルフェヌロンがツボカビ処理として有効でないことを示している。
０．０１％のＲｉｄ Ｆｕｎｇｕｓが投与された培養物では、２４時間後に遊泳する遊走子が観察された。４８時間後及び７２時間後には、細菌だけが観察された。
０．１％のＲｉｄ Ｆｕｎｇｕｓが投与された培養物では、１時間後に胞子嚢及び遊走子が観察された。２４時間後に細菌及び遊走子が観察され、４８時間後に細菌及び運動性が無いいくつかの遊走子が観察され、７２時間後には細菌だけが観察された。結果から、Ｒｉｄ Ｆｕｎｇｕｓは、ツボカビの処理に有効である可能性があるが、培養中の処理としてＲｉｄ Ｆｕｎｇｕｓを用いる場合、Ｈｅａｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ細胞に対する効果を決定する必要があることが示された。
＜実施例１４＞
実施例１３と同様に、塩及びＲｉｄ Ｆｕｎｇｕｓ（有機ハーブの配合物）のいくつかの濃度をツボカビ処理として更に検討した。ウェルプレート内のツボカビ純粋培養物を処理し、顕微鏡の下で目視観察して効果を決定した。未処理の培養物を比較用に対照として用いた。
対照培養物において、１時間後及び４．５時間後に、運動性を有し密集した遊走子が観察された。対照培養物の観察から、実行可能な処理として、遊走子の形成又は運動性を低下させる処理を更に検討する余地がある。
５ｐｐｔの塩（ＮａＣｌ）が投与された培養物では、１時間後、一部が運動性はあるが緩慢である遊走子のあまり密集していない塊が観察された。４．５時間後には、非運動性及び運動性の遊走子の混合物が観察された。
１０ｐｐｔの塩（ＮａＣｌ）が投与された培養物では、１時間後、５ｐｐｔの処理と同じ密度であるが全てが非運動性である遊走子の塊が観察された。４．５時間後には、非運動性の遊走子だけが観察された。
２０ｐｐｔの塩（ＮａＣｌ）が投与された培養物では、１時間後、５ｐｐｔ及び１０ｐｐｔでの処理の塊より密集していないが、全てが非運動性である遊走子の塊が観察された。４．５時間後には、非運動性の遊走子だけが観察された。結果から、高レベルの塩はツボカビに対して有効であるが、上記レベルは、培養中にＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ藻のいくつかの株に悪影響を及ぼすことを示した閾値を超えることが示される。
０．１０％のＲｉｄ Ｆｕｎｇｕｓが投与された培養物では、１時間後、対照より密集していないが高い運動性を有する遊走子の塊が観察された。４．５時間後には、運動性の遊走子が観察された。
０．２５％のＲｉｄ Ｆｕｎｇｕｓが投与された培養物では、１時間後、対照より密集していないが０．１％の処理より運動性が小さい遊走子の塊が観察された。４．５時間後には、いくつかの運動性遊走子及び死んだ可能性がある胞子嚢が観察された。
０．５０％のＲｉｄ Ｆｕｎｇｕｓが投与された培養物では、１時間後、いくつかの運動性の遊走子が観察された。４．５時間後には、いくつかの運動性の遊走子及び死んだ胞子嚢が観察された。結果から、高レベルのＲｉｄ Ｆｕｎｇｕｓは、ツボカビ遊走子の減少に有効である可能性があるが、培養中の処理としてＲｉｄ Ｆｕｎｇｕｓを用いる場合、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ細胞に対する効果を決定する必要があることが示された。
＜実施例１５＞
培養中のＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓに対するツボカビ処理としての漂白剤及びルフェヌロンのいくつかの濃度の有効性について更に検討した。漂白剤又はルフェヌロンを混入処理として用いる場合におけるＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ細胞に対する効果を評価するために、ツボカビに感染したＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ（株１）赤色シスト型細胞の培養物を、漂白剤又はルフェヌロンを有するウェルプレート（容積０．５ｍＬ）内で処理した。処理に対する比較として、ツボカビが存在しないＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ赤色シスト型細胞の第１の対照培養物と、ツボカビを接種した健康なＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ赤色シスト型細胞の第２の対照培養物と、を用いた。Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓの耐容性レベル以下の漂白剤、すなわち０．０１ｍＬ／Ｌ、０．０２ｍＬ／Ｌ及び０．０３ｍＬ／Ｌの１２．５％ストック濃度（計算濃度０．００１２５ｍＬ／Ｌ、０．００２５ｍＬ／Ｌ及び０．００３７５ｍＬ／Ｌ）の漂白剤、又は異なる濃度のルフェヌロン（培養体積の０．０１％、０．１％及び１％）で培養物を処理した。実験中に顕微鏡下で培養物を観察して、有効性を決定した。
第１の対照培養物において、細胞は、接種時には健康な赤色シストであることが観察された。２４時間後、健康な赤色シスト及び細菌が観察された。４８時間後には、健康な赤色シスト及びいくつかの凝集が観察された。７２時間後には、健康な赤色シストが観察された。
第２の対照培養物において、接種時に、赤色シスト上の遊泳する遊走子及び胞子嚢が観察された。２４時間後には、遊泳する遊走子及び赤色シスト型細胞の陽性の感染が観察された。４８時間後には、細菌、遊泳する遊走子及び赤色シスト型細胞の陽性の感染が観察された。７２時間後には、多量の（ｈｅａｖｙ）細菌、少数の遊泳する遊走子及び赤色シスト型細胞の感染の減少が観察された。
０．０１ｍＬ／Ｌの１２．５％ストック濃度（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓの耐容性レベルを下回る濃度である計算濃度０．００１２５ｍＬ／Ｌ）の漂白剤が投与された培養物では、２４時間後及び４８時間後に遊泳する遊走子及び陽性の感染が観察された。７２時間後には、いくつかの遊泳する遊走子、高い細菌（ｈｉｇｈ ｂａｃｔｅｒｉａ）及び死んだ胞子嚢が観察された。
０．０２ｍＬ／Ｌの１２．５％ストック濃度（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓの耐容性レベル未満の濃度である計算濃度０．００２５ｍＬ／Ｌ）の漂白剤が投与された培養物では、２４時間後及び４８時間後に遊泳する遊走子及び陽性の感染が観察された。７２時間後には、いくつかの遊泳する遊走子及び死んだ胞子嚢が観察された。
０．０３ｍＬ／Ｌの１２．５％ストック濃度（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓの耐容性レベルの濃度である計算濃度０．００３７５ｍＬ／Ｌ）の漂白剤が投与された培養物では、２４時間後、遊泳する遊走子及び陽性の感染が観察された。４８時間後には、遊泳する遊走子、陽性の感染、及び溶解した／死んだＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ細胞が観察された。７２時間後には、いくつかの遊泳する遊走子、高い細菌（ｈｉｇｈ ｂａｃｔｅｒｉａ）及び活動性感染が観察された。結果に基づくと、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓの耐容性レベル未満の漂白剤の濃度は、ツボカビを処理するのに無効だった。
０．０１％のルフェヌロンが投与された培養物では、２４時間後及び４８時間後に遊泳する遊走子及び陽性の感染が観察された。７２時間後には、いくつかの遊泳する遊走子、Ｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ属（単細胞の、運動性の金色〜茶色の藻類）及び活動性感染が観察された。
０．１０％のルフェヌロンが投与された培養物では、２４時間後及び４８時間後に死んだ胞子嚢、いくつかの感染及び活動性遊走子が観察された。７２時間後には、いくつかの遊泳する遊走子及び活動性感染が観察された。
１．００％のルフェヌロンが投与された培養物では、２４時間後に死んだ胞子嚢とシスト型細胞に付着した遊走子とが観察された。４８時間後には、Ｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ属と、細菌と、死んだ胞子嚢と、シスト型細胞に付着した遊走子と、少数の遊泳する遊走子とが観察された。７２時間後には、Ｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ属が観察されたが、活動性感染及び遊走子は観察されなかった。結果に基づくと、１％のルフェヌロンの濃度は、Ｈａｔｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ培養物におけるツボカビに対する有効な処理である可能性があるが、バイオマス及びカロテノイドの蓄積に対する効果を決定する必要がある。
＜実施例１６＞
後続のバッチのために空のリアクタを洗浄するために、空のリアクタに適用され得るツボカビに対する処理として、５０％の水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を含む溶液を評価した。２５℃、４０℃及び５０℃の温度の５０％のＮａＯＨを含む溶液を１％の用量で、ツボカビ遊走子及び胞子嚢の純粋培養物を処理した。次いで、ツボカビ遊走子又は胞子嚢の数の減少、又はツボカビ細胞の統合性の減少について、培養物を顕微鏡下で観察した。結果から、処理のいずれについても、ツボカビ遊走子、胞子嚢の数、又は統合性の減少はなかったことが示された。
＜実施例１７＞
微細藻類の培養物におけるツボカビを制御するための生物剤の使用を評価するために、実験を行った。Ｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ属は、細菌及び小さな真核生物を摂食することが知られている単細胞の、運動性の金色〜茶色の藻類であり、ツボカビ遊走子捕食者としてのその特性について評価された。Ｊａｎｔｈｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属は、ツボカビ遊走子を捕食することが知られているグラム陰性土壌細菌であり、そのようなものとしてのその特性について評価された。ツボカビの純粋培養物をウェルプレートに接種した。対照を未処理のままとし、Ｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ属及びＪａｎｔｈｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属で処理された培養物と比較した。３日後、ツボカビ遊走子密度を顕微鏡下の目視観察によって定量した。結果から、Ｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ属で処理された培養物では、遊走子の平均数が、Ｊａｎｔｈｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属で処理された培養物の約半分、対照の約１／３であったことが示された。培養処理として用いる前にＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ細胞に対する効果を決定するために、更なる試験を行う必要があった。
＜本発明の態様＞
本発明の非限定的な一実施形態において、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓの培養方法は、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞の集団を液体培養培地において成長条件で培養して、上記細胞が主に緑色遊泳型段階にある上記Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞の培養物を得ること；上記主に緑色遊泳型段階の上記培養物を過酸化水素に接触させて、過酸化水素の計算濃度（ｍＬ／Ｌ）を上記液体培養培地１Ｌ当たり０．００５ｍＬ〜０．０２０ｍＬの範囲とすること；及び赤色化条件で上記Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞を培養して、カロテノイド類の蓄積のための赤色シスト型段階の細胞を形成すること、を含み得る。
いくつかの実施形態において、過酸化水素の上記計算濃度は、０．００５ｍＬ／Ｌ〜０．０１０ｍＬ／Ｌの範囲であってもよい。いくつかの実施形態において、過酸化水素の上記計算濃度は、０．０１０ｍＬ／Ｌ〜０．０１５ｍＬ／Ｌの範囲であってもよい。いくつかの実施形態において、過酸化水素の上記計算濃度は、０．０１５ｍＬ／Ｌ〜０．０２０ｍＬ／Ｌの範囲であってもよい。
いくつかの実施形態において、上記成長条件は、３０モルｍ−２ｄ−１〜６０モルｍ−２ｄ−１の範囲の光合成有効放射強度と、上記液体培養培地中における２０ｐｐｍ〜５０ｐｐｍの範囲の硝酸塩濃度と、上記液体培養培地中における１ｐｐｔ未満の塩化ナトリウムと、を含んでいてよい。いくつかの実施形態において、上記赤色化条件は、上記液体培養培地中における１ｐｐｔ〜５ｐｐｔの塩化ナトリウムの存在を含んでいてよい。
いくつかの実施形態において、上記方法は、上記培養物中の総細胞に対する感染細胞の割合として、上記Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞の上記培養物中のツボカビのレベルを決定することを更に含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、ツボカビの上記レベルが２０％未満である場合に、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞の上記培養物を過酸化水素に接触させてもよい。いくつかの実施形態においては、ツボカビの上記レベルが少なくとも５％である場合に、上記Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞の上記培養物を過酸化水素に接触させる。
いくつかの実施形態において、上記Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞を赤色化条件で培養して、カロテノイド類の蓄積のための上記赤色シスト型段階の細胞を生成する間、上記培養物中のツボカビのレベルを過酸化水素への接触時のツボカビのレベル未満に維持してもよい。いくつかの実施形態において、上記培養物を過酸化水素に接触させた後のツボカビのレベルは、過酸化水素で処理されていない対照培養物よりも２０％〜９５％低くてもよい。
いくつかの実施形態において、上記細胞を過酸化水素に複数回接触させてもよい。いくつかの実施形態において、上記細胞を過酸化水素に６時間〜２４時間毎に接触させてもよい。いくつかの実施形態において、上記細胞を過酸化水素に６時間〜１２時間毎に接触させてもよい。いくつかの実施形態において、上記細胞を過酸化水素に６時間〜８時間毎に接触させてもよい。いくつかの実施形態において、上記細胞を過酸化水素に１日〜１４日間にわたって毎日接触させてもよい。いくつかの実施形態において、上記細胞を過酸化水素に３日〜１５日間にわたって１日おきに接触させてもよい。
いくつかの実施形態において、過酸化水素に接触させた上記Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞のバイオマス収量は、過酸化水素で処理されていない対照培養物に対して同等であるか、又はそれより大きくてもよい。いくつかの実施形態において、過酸化水素に接触させた上記Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞のバイオマス収量は、過酸化水素で処理されていない対照培養物より０．０１ｇ／Ｌ〜０．２５ｇ／Ｌ大きくてもよい。
いくつかの実施形態において、過酸化水素に接触させた上記Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞のカロテノイド収量は、過酸化水素で処理されていない対照培養物に対して同等であるか、又はそれより大きくてもよい。いくつかの実施形態において、過酸化水素に接触させた上記Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞のカロテノイド収量は、過酸化水素で処理されていない対照培養物より０．１０％〜１．５０％大きくてもよい。
いくつかの実施形態において、上記方法は、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞の上記培養物を、上記培養物を過酸化水素に接触させた後で新しい培養容器に移動することを更に含んでいてもよい。
本発明の非限定的な一実施形態において、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓの培養方法は、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞の集団を１ｐｐｔ〜５ｐｐｔの塩を含む液体培養培地中において赤色化条件で培養して、上記細胞が主にシストにある上記Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞の培養物を得ること；及び上記主にシスト型段階の培養物を過酸化水素に接触させて、過酸化水素の計算濃度（ｍＬ／Ｌ）を培養培地１Ｌ当たり０．００５ｍＬ〜０．０２０ｍＬの範囲とすることを含み得る。いくつかの実施形態において、上記シスト型段階は、緑色シスト及びカロテノイド類を蓄積する赤色シストから成る群から選択される少なくとも１つを含んでいてよい。
いくつかの実施形態において、上記塩は塩化ナトリウムであってもよい。いくつかの実施形態において、上記塩化ナトリウムは、１ｐｐｔ〜３ｐｐｔの濃度で上記液体培養培地中に存在してもよい。いくつかの実施形態において、上記塩化ナトリウムは、１ｐｐｔ〜２ｐｐｔの濃度で上記液体培養培地中に存在してもよい。
いくつかの実施形態において、過酸化水素に上記培養物を接触させた後のツボカビレベルは、過酸化水素で処理されていない対照培養物より１０％〜９５％低くてもよい。いくつかの実施形態において、過酸化水素に接触させた上記Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞のバイオマス収量は、過酸化水素で処理されていない対照培養物より０．０１ｇ／Ｌ〜０．３０ｇ／Ｌ大きくてもよい。
本発明の非限定的な一実施形態において、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓの培養方法は、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞の集団を液体培養培地中において赤色化条件で培養して、上記細胞が主にシスト型段階にあるＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞の培養物を得ること；上記培養物中におけるツボカビの存在を検出すること；及びツボカビと赤色シスト型細胞とを含む上記培養物を５ｐｐｔ〜２０ｐｐｔの塩に接触させることを含み得る。いくつかの実施形態において、上記シスト型段階は、緑色シスト及びカロテノイド類を蓄積する赤色シストから成る群から選択される少なくとも１つを含んでいてもよい。
いくつかの実施形態において、上記塩は塩化ナトリウムであってもよい。いくつかの実施形態において、上記培養培地中の塩化ナトリウムの濃度は、５ｐｐｔ〜１０ｐｐｔの範囲であってもよい。いくつかの実施形態において、上記培養培地中の塩化ナトリウムの濃度は、１０ｐｐｔ〜１５ｐｐｔの範囲であってもよい。いくつかの実施形態において、上記培養培地中の塩化ナトリウムの濃度は、１５ｐｐｔ〜２０ｐｐｔの範囲であってもよい。
いくつかの実施形態において、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞の上記培養物を、ツボカビに感染した細胞のレベルが総細胞の２０％未満である場合に塩に接触させてもよい。いくつかの実施形態において、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞の上記培養物を、ツボカビに感染した細胞のレベルが総細胞の少なくとも５％である場合に塩に接触させてもよい。
いくつかの実施形態において、上記Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞を赤色化条件で培養して、カロテノイド類の蓄積のための上記赤色シスト型段階の細胞を形成する間、上記培養物中のツボカビのレベルを、上記塩への接触時のツボカビのレベル未満に維持してもよい。
本発明の非限定的な一実施形態において、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓの培養物におけるツボカビ感染を防止する方法は、液体培養培地中でＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞の集団を培養すること；上記培養物においてツボカビに感染したＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞の数を決定すること；ツボカビに感染したＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞の割合が総細胞の１０％未満である場合に上記培養物を過酸化水素に接触させること；上記Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞の培養を継続すること；及びツボカビに感染したＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞の割合が過酸化水素に接触した後の総細胞の１０％未満であることを確認すること、を含み得る。
非限定的な一実施形態において、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓの培養方法は、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞の集団を成長条件で液体培養培地中において培養して、上記細胞が主に緑色遊泳型段階にあるＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞の培養物を得ること；上記主に緑色遊泳型細胞段階の培養物を過酸化水素に接触させて、細胞シストの形成前に過酸化水素の計算濃度（ｍＬ／Ｌ）を培養培地１Ｌ当たり０．００５ｍＬ〜０．０２５ｍＬの範囲とすること；及び成長条件におけるＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞の培養を継続すること、を含み得る。実施形態によって、過酸化水素の上記計算濃度は、０．００５ｍＬ／Ｌ〜０．０１０ｍＬ／Ｌ、０．０１０ｍＬ／Ｌ〜０．０１５ｍＬ／Ｌ、０．０１５ｍＬ／Ｌ〜０．０２０ｍＬ／Ｌ、又は０．０２０ｍＬ／Ｌ〜０．０２５ｍＬ／Ｌの範囲であってもよい。
いくつかの実施形態において、上記方法は、上記培養物中の総Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞の割合として、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞の上記培養物中の溶解のレベルを決定することを更に含んでもよい。いくつかの実施形態において、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞の上記培養物を、溶解のレベルが２０％未満である場合に過酸化水素に接触させてもよい。いくつかの実施形態において、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞の上記培養物を、溶解のレベルが５％未満である場合に過酸化水素に接触させてもよい。
いくつかの実施形態において、上記培養物における溶解のレベルは、成長条件におけるＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞の培養を継続する間、過酸化水素に接触した際の溶解のレベル以下に維持され得る。いくつかの実施形態において、過酸化水素に接触した後の上記Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ培養物の溶解レベルは、過酸化水素で処理されていない対照培養物の溶解レベルより１％〜８０％低くてもよい。
いくつかの実施形態において、上記方法は、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞の上記培養物中の生細菌数を決定することを更に含んでもよい。いくつかの実施形態において、上記生細菌数は、過酸化水素と接触の後、１０〜１５×１０５ＣＦＵ／ｍＬ減少し得る。いくつかの実施形態において、上記生細菌数は、過酸化水素と接触した後、１０７ＣＦＵ／ｍＬ未満で維持され得る。
非限定的な一実施形態において、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓの培養物における溶解を防止する方法は、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞の集団を成長条件において液体培養培地中で培養して、細胞が主に緑色遊泳型段階にあるＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞の培養物を得ること；上記Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞についての細胞溶解のレベルを決定すること；上記Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞の溶解レベルが５％未満である場合に、シストの形成前に、主に緑色遊泳型細胞段階の上記培養物を過酸化水素に接触させること；成長条件における上記Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞の培養を継続すること；及び上記Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞の溶解のレベルが、過酸化水素に接触した後、５％未満であることを確認すること、を含み得る。
非限定的な一実施形態において、微細藻類培養物組成物は、液体培養培地中におけるＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞の集団と；上記培養培地に先だって１２０分以内に加えられ、培養培地１Ｌ当たり０．００５ｍＬ〜０．０２５ｍＬの範囲の計算濃度（ｍＬ／Ｌ）の過酸化水素と、を含み得る。
本明細書に引用される刊行物、特許出願及び特許を含む全ての参照は、本明細書の他の場所でなされる特定の文書の取り込みが別々に提供されるかどうかにかかわらず、各参照が参照により取り込まれていることが個別にかつ具体的に示され、その全体が本明細書に（法律に違反しない範囲で）記載されたのと同程度に、それらの全体が本明細書に参照により取り込まれている。
本発明を記載する文脈における「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」及び「前記、上記（ｔｈｅ）」という用語並びに同様の指示物の使用は、本明細書において特に指示しない限り、又は文脈と明確に矛盾しない限り、単数及び複数の両方を包摂するものと解釈するべきである。
特に明記しない限り、本明細書で提供される全ての厳密な値は、対応する近似値を表す（例えば、特定の因数又は測定値に関して提供される全ての厳密な例示的な値は、必要に応じて「約」で修飾される対応する近似の測定値も提供するものと考えることができる）。全ての提供された値の範囲は、その範囲の端点と、端点間の値とを含むことが意図される。
１つの要素又は複数の要素に関して「含む」、「有する」、「含有する」（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ、ｈａｖｉｎｇ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ、ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）等の用語を用いた本発明のいずれかの態様又は実施形態の本明細書における記載は、特に明記しない限り、又は文脈と明確に矛盾しない限り、その特定の１つの要素又は複数の要素から「成る」、「基本的に成る」又は「実質的に含む」本発明の同様の態様又は実施形態に対するサポートを提供することが意図される（例えば、特定の要素を含むとして本明細書に記載される組成物は、特に明記しない限り、又は文脈と明確に矛盾しない限り、その要素から成る組成物も記載するとして理解するべきである）。
全ての見出し及び小見出しは、単に便宜上のためだけに本明細書において用いられ、いかなる形であれ本発明を限定するものとして解釈されてはならない。
本明細書に提供されるあらゆる例又は例示的な語（例えば、「等」、「など」）の使用は、単に本発明をより良好に明らかにすることを意図するものであって、特に主張されない限り、本発明の範囲に対する限定をもたらすものではない。本明細書の語は、本発明の実施に欠かせないとして主張されないいずれの要素も示すものとして解釈されてはならない。本発明のいずれの主張された実施形態も、本明細書の「態様」又は「実施形態」の全てを必ずしも含むわけではない。
本明細書における特許文献の引用及び取り込みは、単に便宜上のためだけのものであって、そのような特許文献の妥当性、特許性及び／又は法的拘束力のいずれの見解も反映するものではない。
本発明は、適用可能な法によって許可される場合、本明細書に添付される請求項及び／又は態様に列挙される内容の全ての変更及び均等物を含む。
＜付記＞
＜１＞ ａ．Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞の集団を液体培養培地において成長条件で培養して、主に緑色遊泳型段階にある前記Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞の培養物を得ること；
ｂ．前記主に緑色遊泳型段階の前記培養物を、前記液体培養培地１Ｌ当たりの計算濃度（ｍＬ／Ｌ）が０．００５ｍＬ〜０．０２０ｍＬの範囲の過酸化水素に接触させること；及び
ｃ．赤色化条件で前記Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞を培養して、アスタキサンチンの蓄積のための赤色シスト型段階の細胞を形成すること、
を含み、
前記成長条件が、３０モルｍ−２ｄ−１〜６０モルｍ−２ｄ−１の範囲の光合成有効放射強度と、前記液体培養培地における２０ｐｐｍ〜５０ｐｐｍの範囲の硝酸塩濃度と、前記液体培養培地における１ｐｐｔ未満の塩化ナトリウムと、を含み、
前記赤色化条件が、前記液体培養培地における１ｐｐｔ〜５ｐｐｔの塩化ナトリウムの存在を含む、
Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓの培養方法。
＜２＞ 過酸化水素の前記計算濃度が０．００５ｍＬ／Ｌ〜０．０１０ｍＬ／Ｌの範囲である＜１＞に記載の培養方法。
＜３＞ 過酸化水素の前記計算濃度が０．０１０ｍＬ／Ｌ〜０．０１５ｍＬ／Ｌの範囲である＜１＞に記載の培養方法。
＜４＞ 過酸化水素の前記計算濃度が０．０１５ｍＬ／Ｌ〜０．０２０ｍＬ／Ｌの範囲である＜１＞に記載の培養方法。
＜５＞ 前記培養物における総細胞に対する感染細胞の割合として、前記Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞の前記培養物中のツボカビのレベルを決定することを更に含む、＜１＞に記載の培養方法。
＜６＞ ツボカビの前記レベルが２０％未満である場合に、前記Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞の前記培養物を過酸化水素に接触させる＜５＞に記載の培養方法。
＜７＞ ツボカビの前記レベルが少なくとも５％である場合に、前記Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞の前記培養物を過酸化水素に接触させる＜５＞に記載の培養方法。
＜８＞ 前記Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞を赤色化条件で培養して、アスタキサンチンの蓄積のための前記赤色シスト型段階の細胞を生成する間、前記培養物中のツボカビのレベルを過酸化水素への接触時のツボカビのレベル未満に維持する＜５＞に記載の培養方法。
＜９＞ 前記培養物を過酸化水素に接触させた後のツボカビのレベルが、過酸化水素で処理されていない対照培養物よりも２０％〜９５％低い＜５＞に記載の培養方法。
＜１０＞ 前記ｂを複数回行う＜１＞に記載の培養方法。
＜１１＞ 前記ｃにおいて、前記Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞を、前記液体培養培地１Ｌ当たりの計算濃度（ｍＬ／Ｌ）が０．００５ｍＬ〜０．０２０ｍＬの範囲の過酸化水素に複数回接触させることを含む＜１＞に記載の培養方法。
＜１２＞ 前記ｂを６時間〜２４時間毎に行う＜１０＞に記載の培養方法。
＜１３＞ 前記ｂを６時間〜１２時間毎に行う＜１２＞に記載の培養方法。
＜１４＞ 前記ｂを１日〜１４日間にわたって毎日行う＜１０＞に記載の培養方法。
＜１５＞ 前記ｂを３日〜１５日間にわたって１日おきに行う＜１０＞に記載の培養方法。
＜１６＞ 過酸化水素に接触させた前記Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞のバイオマス収量が、過酸化水素で処理されていない対照培養物に対して同等であるか、又はそれより大きい＜１＞に記載の培養方法。
＜１７＞ 過酸化水素に接触させた前記Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞のバイオマス収量が、過酸化水素で処理されていない対照培養物より０．０１ｇ／Ｌ〜０．２５ｇ／Ｌ大きい＜１６＞に記載の培養方法。
＜１８＞ 過酸化水素に接触させた前記Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞のアスタキサンチン収量が、過酸化水素で処理されていない対照培養物に対して同等であるか、又はそれより大きい＜１＞に記載の培養方法。
＜１９＞ 過酸化水素に接触させた前記Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞のアスタキサンチン収量が、過酸化水素で処理されていない対照培養物より０．１０％〜１．５０％大きい＜１８＞に記載の培養方法。

Claims (20)

  1. ａ．Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞の集団を液体培養培地中で培養すること；
    ｂ．培養物においてツボカビに感染したＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞の数を決定すること；
    ｃ．ツボカビに感染したＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞の割合が総細胞の１０％未満である場合に、前記培養物を過酸化水素に接触させること；
    ｄ．Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞の培養を継続すること；及び
    過酸化水素との接触後において、ツボカビに感染したＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞の割合が総細胞の１０％未満に維持されていることを確認すること、
    を含む、
    Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓの培養物におけるツボカビ感染を防止する方法。
  2. 前記ｃにおいて前記培養物を過酸化水素に接触させて、過酸化水素の計算濃度（ｍＬ／Ｌ）を前記液体培養培地１Ｌ当たり０．００５ｍＬ〜０．０２０ｍＬの範囲とする請求項１に記載の方法。
  3. 過酸化水素の前記計算濃度が０．００５ｍＬ／Ｌ〜０．０１０ｍＬ／Ｌの範囲である請求項２に記載の方法。
  4. 過酸化水素の前記計算濃度が０．０１０ｍＬ／Ｌ〜０．０１５ｍＬ／Ｌの範囲である請求項２に記載の方法。
  5. 過酸化水素の前記計算濃度が０．０１５ｍＬ／Ｌ〜０．０２０ｍＬ／Ｌの範囲である請求項２に記載の方法。
  6. 前記ｃを複数回行う請求項１に記載の方法。
  7. 前記ｃを６時間〜２４時間毎に行う請求項６に記載の方法。
  8. 前記ｃを６時間〜１２時間毎に行う請求項７に記載の方法。
  9. 前記ｃを６時間〜８時間毎に行う請求項８に記載の方法。
  10. 前記ｃを１日〜１４日間にわたって毎日行う請求項６に記載の方法。
  11. 前記ｃを３日〜１５日間にわたって１日おきに行う請求項６に記載の方法。
  12. 過酸化水素に接触させた前記Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞のバイオマス収量が、過酸化水素で処理されていない対照培養物に対して同等であるか、又はそれより大きい請求項１に記載の方法。
  13. 過酸化水素に接触させた前記Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞のバイオマス収量が、過酸化水素で処理されていない対照培養物より０．０１ｇ／Ｌ〜０．２５ｇ／Ｌ大きい請求項１２に記載の方法。
  14. 過酸化水素に接触させた前記Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞のアスタキサンチン収量が、過酸化水素で処理されていない対照培養物に対して同等であるか、又はそれより大きい請求項１に記載の方法。
  15. 過酸化水素に接触させた前記Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞のアスタキサンチン収量が、過酸化水素で処理されていない対照培養物より０．１０％〜１．５０％大きい請求項１４に記載の方法。
  16. 前記Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞が、主に緑色遊泳型段階である請求項１に記載の方法。
  17. 前記Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞が、主にシスト型段階である請求項１に記載の方法。
  18. 前記シスト型段階が主に緑色シストを含む請求項１７に記載の方法。
  19. 前記シスト型段階が主に赤色シストを含む請求項１７に記載の方法。
  20. 前記Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ細胞の培養物を過酸化水素と接触させた後に、前記培養物を新たな培養容器に移すことをさらに含む請求項１に記載の方法。
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