JP6751025B2 - 慢性炎症性脱髄性多発神経炎の診断方法、キット及びバイオマーカー - Google Patents
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Description
本発明は、慢性炎症性脱髄性多発神経炎を特異的に診断するための診断方法、その診断に使用するためのキット及びバイオマーカーに関する。
慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ｃｈｒｏｎｉｃ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｎｇ ｐｏｌｙｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ：以下ＣＩＤＰともいう）は２ヶ月以上にわたる慢性進行性あるいは階段性、再発性の左右対称性の四肢の遠位、近位筋の筋力低下及び感覚障害を主徴とする末梢神経疾患である。ＣＩＤＰの病因は末梢神経ミエリンの構成成分に対する免疫異常により生ずる自己免疫性疾患と考えられているが、詳細は不明である。
現在のところ、ＣＩＤＰの診断としては、２０１０年に改訂された欧州神経学連合・国際末梢神経学会（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｎｅｒｖｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ：ＥＦＮＳＰＮＳ）により提唱されたガイドラインが用いられることが多く、臨床症状、電気生理学的基準、その他、髄液所見やＭＲＩでの神経根肥厚などを総合して行われている。
一方、ＣＩＤＰ疾患特異的なバイオマーカーは、現在まで報告されていない。なお、ミエリン関連糖タンパク質（ｍｙｅｌｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＡＧ））に対する自己抗体陽性のニューロパチーは、独立した疾患とされており、ＣＩＤＰからは除外されている。
ＣＩＤＰは、その経過、治療反応性及び予後が症例により異なることから、様々な病態を含む症候群であることが想定されており、それぞれの病態に応じた治療法を確立することが喫緊の課題である。
本発明者らはこれまでに、中枢神経系、末梢神経系のいずれの脱髄をもきたす稀な疾患である中枢・末梢連合脱髄症（ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｃｅｎｔｒａｌ ａｎｄ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ：ＣＣＰＤ）症例の血清が、抗ニューロファシン１５５（ＮＦ１５５）抗体陽性であることを見出している（非特許文献１）。また、ＣＩＤＰのごく一部（約４％）において抗ＮＦ１５５抗体が陽性になることも報告されている（非特許文献２及び非特許文献３）。
しかしながら上記の報告は少数例の検討に過ぎず、抗体陽性ＣＩＤＰと抗体陰性ＣＩＤＰとの比較もされていない。このため、ＣＩＤＰの中で特異な亜型が陽性になるのか否か、及び臨床像との関連は不明であった。
Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．２０１３ Ａｕｇ ２０；８１（８）：７１４−２２
Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．２０１２ Ｄｅｃ ４；７９（２３）：２２４１−８
Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．２０１４ Ｍａｒ １１；８２（１０）：８７９−８６
前述したように、従来のＣＩＤＰの診断は、２０１０年に改訂された欧州神経学連合・国際末梢神経学会（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｎｅｒｖｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ：ＥＦＮＳＰＮＳ）により提唱されたガイドラインを用いて行われることが多かった。
また、ＣＩＤＰの診断は、臨床症状、電気生理学的基準、その他、髄液所見やＭＲＩでの神経根肥厚などを総合して行われており、ＣＩＤＰに対して特異性の高いバイオマーカーはまだ報告されていない。また、ＣＩＤＰは様々な病態を含む症候群であると想定されており、それぞれの病態に対応したバイオマーカー及び治療法を確立することが喫緊の課題となっている。
また、末梢神経を急性に侵すギランバレー症候群（以下ＧＢＳともいう）は、初回発作時はＣＩＤＰとの鑑別は困難であり、また、両者は治療法も異なる。そのため、両者を鑑別するバイオマーカーが必要とされているが、そのようなバイオマーカーはこれまでに報告がない。
さらに、ＣＣＰＤが中枢神経病変で発症した場合、中枢神経のみを侵す脱髄性疾患である多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：以下ＭＳともいう）との鑑別が困難であった。ＭＳの治療ではインターフェロンベータ（ＩＦＮβ）製剤が有効であるが、ＣＣＰＤにおいては、ＩＦＮβ製剤は無効であるばかりか、３０％程度の症例において症状を憎悪させてしまう。そのため、両者を鑑別するためのバイオマーカーが必要とされている。
以上のことから、ＣＩＤＰの診断する方法を開発することは極めて重要であるが、これまでに、ＣＩＤＰを精度よく診断する方法は確立されていない。また、そのような方法に使用するためのバイオマーカーについても従来報告はなく、このようなＮＦ１５５と特異的に結合する抗体の存在の有無を決定することは、ＣＩＤＰを診断する上で重要である。したがって、本発明は、ＣＩＤＰを診断する方法、特にＣＩＤＰの中から特定の病態生理を有する一群を特異的に診断するための診断方法、その診断に使用するためのキット及びバイオマーカーを提供することを目的とする。
本発明者らは、一部のＣＩＤＰ患者の検体中にＮＦ１５５と反応する抗体が存在することを見出し、当該ＮＦ１５５と反応する抗体を測定することにより、ＣＩＤＰと診断できること見出した。すなわち、ＮＦ１５５と反応する抗体を測定することにより、様々な病態を含むＣＩＤＰについて、それぞれの病態に対応した治療法を確立することが可能となりうることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（１５）に関する。
（１）検体中に含まれる抗ニューロファシン１５５抗体を測定する工程を含む、慢性炎症性脱髄性多発神経炎の診断方法。
（２）検体中に含まれる抗ニューロファシン１８６抗体を測定する工程を更に含む、（１）に記載の診断方法。
（３）ニューロファシン１５５とは反応するが、ニューロファシン１８６とは反応しない抗体を検出する工程を含む、（２）に記載の診断方法。
（４）ニューロファシン１５５を強制発現させた細胞及びニューロファシン１８６を強制発現させた細胞と、検体とを接触させ、抗ニューロファシン１５５抗体及び／又は抗ニューロファシン１８６抗体の存在を、蛍光標識された抗ヒトＩｇＧ抗体を用いて測定する、（１）〜（３）のいずれか１に記載の診断方法。
（５）フローサイトメトリー法により行う、（４）に記載の診断方法。
（６）ギランバレー症候群又は多発性硬化症と、慢性炎症性脱髄性多発神経炎とを識別する、（１）〜（５）のいずれか１に記載の診断方法。
（７）検体が血液または髄液である、（１）〜（６）のいずれか１に記載の診断方法。
（８）検体中の抗ニューロファシン１５５抗体及び／又は抗ニューロファシン１８６抗体を測定する方法であって、ニューロファシン１５５を強制発現させた細胞及びニューロファシン１８６を強制発現させた細胞と、検体とを接触させた後、蛍光標識された抗ヒトＩｇＧ抗体を用いて、抗ニューロファシン１５５抗体及び抗ニューロファシン１８６抗体を測定する方法。
（９）フローサイトメトリー法により行う、（８）に記載の方法。
（１０）抗ニューロファシン１５５抗体が存在するが、抗ニューロファシン１８６抗体が存在しない検体を選択することを含む、（８）又は（９）に記載の方法。
（１１）検体が血液または髄液である、（８）〜（１０）のいずれか１項に記載の方法。
（１２）ニューロファシン１５５を強制発現させた細胞株を含む、慢性炎症性脱髄性多発神経炎診断用キット。
（１３）ニューロファシン１８６を強制発現させた細胞株を更に含む（１２）に記載のキット。
（１４）蛍光標識された抗ヒトＩｇＧ抗体を更に含む、（１２）又は（１３）に記載のキット。
（１５）抗ニューロファシン１５５抗体からなる、慢性炎症性脱髄性多発神経炎を診断するためのバイオマーカー。
（１）検体中に含まれる抗ニューロファシン１５５抗体を測定する工程を含む、慢性炎症性脱髄性多発神経炎の診断方法。
（２）検体中に含まれる抗ニューロファシン１８６抗体を測定する工程を更に含む、（１）に記載の診断方法。
（３）ニューロファシン１５５とは反応するが、ニューロファシン１８６とは反応しない抗体を検出する工程を含む、（２）に記載の診断方法。
（４）ニューロファシン１５５を強制発現させた細胞及びニューロファシン１８６を強制発現させた細胞と、検体とを接触させ、抗ニューロファシン１５５抗体及び／又は抗ニューロファシン１８６抗体の存在を、蛍光標識された抗ヒトＩｇＧ抗体を用いて測定する、（１）〜（３）のいずれか１に記載の診断方法。
（５）フローサイトメトリー法により行う、（４）に記載の診断方法。
（６）ギランバレー症候群又は多発性硬化症と、慢性炎症性脱髄性多発神経炎とを識別する、（１）〜（５）のいずれか１に記載の診断方法。
（７）検体が血液または髄液である、（１）〜（６）のいずれか１に記載の診断方法。
（８）検体中の抗ニューロファシン１５５抗体及び／又は抗ニューロファシン１８６抗体を測定する方法であって、ニューロファシン１５５を強制発現させた細胞及びニューロファシン１８６を強制発現させた細胞と、検体とを接触させた後、蛍光標識された抗ヒトＩｇＧ抗体を用いて、抗ニューロファシン１５５抗体及び抗ニューロファシン１８６抗体を測定する方法。
（９）フローサイトメトリー法により行う、（８）に記載の方法。
（１０）抗ニューロファシン１５５抗体が存在するが、抗ニューロファシン１８６抗体が存在しない検体を選択することを含む、（８）又は（９）に記載の方法。
（１１）検体が血液または髄液である、（８）〜（１０）のいずれか１項に記載の方法。
（１２）ニューロファシン１５５を強制発現させた細胞株を含む、慢性炎症性脱髄性多発神経炎診断用キット。
（１３）ニューロファシン１８６を強制発現させた細胞株を更に含む（１２）に記載のキット。
（１４）蛍光標識された抗ヒトＩｇＧ抗体を更に含む、（１２）又は（１３）に記載のキット。
（１５）抗ニューロファシン１５５抗体からなる、慢性炎症性脱髄性多発神経炎を診断するためのバイオマーカー。
本発明によれば、検体中の抗ＮＦ１５５抗体を検出することによって、ＣＩＤＰの診断が可能となる。特に、本発明によれば、炎症性脱髄性疾患症例の検体中の抗ＮＦ１５５抗体及び抗ＮＦ１８６抗体を測定し、ＮＦ１５５とのみ反応する陽性例を抽出することにより、同一な病態生理を有する患者群を抽出することが可能となる。そして、様々な病態を有する疾患群であったＣＩＤＰでは各症例において治療効果も様々であったが、抗ＮＦ１５５抗体を有する症例を選別することにより、より適切な治療法を提供することができるようになる。
また、本発明により、ＧＢＳ及びＣＩＤＰとの識別や、ＭＳ及びＣＣＰＤとの識別も可能である。
そして、検体（例えば血清・髄液）中の抗ＮＦ１５５特異抗体を測定することにより診断や治療効果判定の指標となる。抗ＮＦ１５５抗体の意義が世界的に認知されれば、抗ＭＡＧ抗体陽性ニューロパチーと同様、抗ＮＦ１５５抗体陽性ニューロパチーがＣＩＤＰから独立した疾患概念として確立される可能性がある。
［慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）］
本発明は、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）を診断する方法を提供する。本発明で診断できるＣＩＤＰとは、上述したように様々な病態を含む症候群であり、典型的ＣＩＤＰと、非典型的ＣＩＤＰに大きく分けられる。典型的ＣＩＤＰは、２カ月以上進行する対称性の運動感覚障害を呈し、近位筋と遠位筋が同時に侵され、腱反射は四肢で低下・消失する。脳神経が障害されることがある。非典型的ＣＩＤＰとしては、ＤＡＤＳ、ＭＡＤＳＡＭ、ｆｏｃａｌ ｔｙｐｅ、ｐｕｒｅ ｓｅｎｓｏｒｙ ｔｙｐｅ、ｐｕｒｅ Ｍｏｔｏｒ ｔｙｐｅ等が挙げられる。
本発明は、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）を診断する方法を提供する。本発明で診断できるＣＩＤＰとは、上述したように様々な病態を含む症候群であり、典型的ＣＩＤＰと、非典型的ＣＩＤＰに大きく分けられる。典型的ＣＩＤＰは、２カ月以上進行する対称性の運動感覚障害を呈し、近位筋と遠位筋が同時に侵され、腱反射は四肢で低下・消失する。脳神経が障害されることがある。非典型的ＣＩＤＰとしては、ＤＡＤＳ、ＭＡＤＳＡＭ、ｆｏｃａｌ ｔｙｐｅ、ｐｕｒｅ ｓｅｎｓｏｒｙ ｔｙｐｅ、ｐｕｒｅ Ｍｏｔｏｒ ｔｙｐｅ等が挙げられる。
本発明の診断方法によれば、このような数ある不均一な疾患が混在したＣＩＤＰ症例から、均一な、あるいは関連する病態生理を有する疾患を抽出することができる。これにより、より適切な治療法を提供することができるようになる。
［診断対象］
本発明の診断方法において、診断対象はヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、又はマウスなど、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）に罹患し得る任意の動物とする。以下、ヒトを対象として説明するが、他の動物においても同様である。
［診断対象］
本発明の診断方法において、診断対象はヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、又はマウスなど、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）に罹患し得る任意の動物とする。以下、ヒトを対象として説明するが、他の動物においても同様である。
なお、以下の説明において、ニューロファシン１５５（ＮＦ１５５）、ニューロファシン１８６（ＮＦ１８６）という場合には、ヒトＮＦ１５５、ヒトＮＦ１８６を意味し、抗ＮＦ１５５抗体、抗ＮＦ１８６抗体という場合には、ヒトＮＦ１５５、ヒトＮＦ１８６と結合する抗体を意味する。
［ニューロファシンＮＦ１５５（ＮＦ１５５）］
ニューロファシンＮＦ１５５（ＮＦ１５５）はパラノード（ｐａｒａｎｏｄｅ）の髄鞘側に局在する、１５５ｋＤａの分子量のタンパク質である。末梢神経系においてはシュワン細胞、中枢神経系においてはオリゴデンドロサイトの細胞膜突起が幾重にもループのように軸索を取り巻くことで髄鞘が形成され、その部分が絶縁体の構造をとることで神経軸索における電気的信号の跳躍伝導に寄与している。軸索と髄鞘の接着部分はパラノード（ｐａｒａｎｏｄｅ）、傍パラノード（ｊｕｘｔａｐａｒａｎｏｄｅ）、インターノード（ｉｎｔｅｒｎｏｄｅ）に分けられる。
ニューロファシンＮＦ１５５（ＮＦ１５５）はパラノード（ｐａｒａｎｏｄｅ）の髄鞘側に局在する、１５５ｋＤａの分子量のタンパク質である。末梢神経系においてはシュワン細胞、中枢神経系においてはオリゴデンドロサイトの細胞膜突起が幾重にもループのように軸索を取り巻くことで髄鞘が形成され、その部分が絶縁体の構造をとることで神経軸索における電気的信号の跳躍伝導に寄与している。軸索と髄鞘の接着部分はパラノード（ｐａｒａｎｏｄｅ）、傍パラノード（ｊｕｘｔａｐａｒａｎｏｄｅ）、インターノード（ｉｎｔｅｒｎｏｄｅ）に分けられる。
［ニューロファシンＮＦ１８６（ＮＦ１８６）］
ニューロファシンＮＦ１８６（ＮＦ１８６）は、絞輪部に集積している１８６ｋＤａの分子量のタンパク質である。隣り合う髄鞘の間は絞輪部（ノード：ｎｏｄｅ）と呼ばれる。
ニューロファシンＮＦ１８６（ＮＦ１８６）は、絞輪部に集積している１８６ｋＤａの分子量のタンパク質である。隣り合う髄鞘の間は絞輪部（ノード：ｎｏｄｅ）と呼ばれる。
それぞれのアミノ酸配列を配列番号１（ＮＦ１５５）及び配列番号２（ＮＦ１８６）に示す。
［検体］
本発明において診断対象とする検体は、診断対象の血液（全血、血清、血漿）、唾液、髄液、その他の体液、各種組織等のいずれでもよい。検体は血清または髄液が好ましい。
本発明において診断対象とする検体は、診断対象の血液（全血、血清、血漿）、唾液、髄液、その他の体液、各種組織等のいずれでもよい。検体は血清または髄液が好ましい。
［測定方法］
検体中の各抗体の測定方法は、免疫学的測定法として、抗体を検出し測定するために使用される方法であれば特に制限されない。例えば、酵素、蛍光物質、放射性物質、着色物質などを標識物質とする慣用の測定方法がいずれも使用可能であり、フローサイトメトリー法を好ましく使用することができる。
検体中の各抗体の測定方法は、免疫学的測定法として、抗体を検出し測定するために使用される方法であれば特に制限されない。例えば、酵素、蛍光物質、放射性物質、着色物質などを標識物質とする慣用の測定方法がいずれも使用可能であり、フローサイトメトリー法を好ましく使用することができる。
［診断方法］
本発明の慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）の診断方法は、検体中に含まれる抗ＮＦ１５５抗体を測定する工程を含む。また、本発明の慢性炎症性脱髄性多発神経炎の診断方法は、検体中に含まれる抗ＮＦ１８６抗体を測定する工程を更に含んでいることが好ましい。抗ＮＦ１５５抗体が陽性である場合に、検体中に含まれる抗ＮＦ１８６抗体を測定し、抗ＮＦ１８６抗体が陰性であれば、抗ＮＦ１５５抗体はＮＦ１８６にはないＮＦ１５５の特定のエピトープに結合していることがわかり、より確実に慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）と診断することが可能であるからである。
本発明の慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）の診断方法は、検体中に含まれる抗ＮＦ１５５抗体を測定する工程を含む。また、本発明の慢性炎症性脱髄性多発神経炎の診断方法は、検体中に含まれる抗ＮＦ１８６抗体を測定する工程を更に含んでいることが好ましい。抗ＮＦ１５５抗体が陽性である場合に、検体中に含まれる抗ＮＦ１８６抗体を測定し、抗ＮＦ１８６抗体が陰性であれば、抗ＮＦ１５５抗体はＮＦ１８６にはないＮＦ１５５の特定のエピトープに結合していることがわかり、より確実に慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）と診断することが可能であるからである。
抗ＮＦ１５５抗体及び抗ＮＦ１８６抗体を測定するには、上述のフローサイトメトリー法を用いて行うことが好ましい。フローサイトメトリー法を用いる場合、ＮＦ１５５を強制発現させた細胞及びＮＦ１８６を強制発現させた細胞と、二次抗体を用いて測定することができる。二次抗体としては特に制限されないが、実施例に挙げるような蛍光標識された抗体が好ましく、蛍光標識された抗ヒトＩｇＧ抗体がさらに好ましい。
フローサイトメトリー法は周知の方法により容易に実施することができる。本発明において使用されるフローサイトメトリー法では、例えば、蛍光標識した抗ヒトＩｇＧ抗体を用いており、細胞及び検体と接触させた後、検体中に抗体が存在する場合には、抗原抗体反応により、検体中に含まれる抗体を介して細胞に蛍光標識抗体が結合した細胞数を計数することができる。それにより、検体中に抗体が存在するか否かを判定することが可能である。フローサイトメトリー法の装置及び必要な試薬類は市販されており、当業者が容易に実施することが可能である。
すなわち、検体を、ＮＦ１５５を強制発現させた細胞及びＮＦ１８６を強制発現させた細胞と接触させる。なお本発明においては、実施例において詳述するように、ＮＦ１５５又はＮＦ１８６を強制発現させた細胞は、ヒトＮＦ１５５又はＮＦ１８６のｃＤＮＡが組み込まれたベクターを、ＮＦ１５５又はＮＦ１８６を発現するのに適した細胞に導入することによって作製することができる。
本発明によれば、ＮＦ１５５及びＮＦ１８６を強制発現させた細胞をそれぞれ抗原としたフローサイトメトリー法が提供され、ＮＦ１５５と反応する抗体が、ＣＩＤＰ陽性となる可能性が高いことがわかる。
また、本発明者らは、抗ＮＦ１５５抗体陽性ＣＩＤＰ症例は、若年発症で、末梢神経遠位部と神経根から著明な脱髄（神経伝導の遅延）をきたし、ＭＲＩで神経根の高度の肥厚を呈し、髄液蛋白が高度に上昇するという特徴的な病像を呈することを見出した。このタイプのＣＩＤＰは、発症初期から不可逆性の顕著な神経肥厚を呈することから、初発時から抗ＮＦ１５５抗体が陽性の場合は、積極的な免疫療法の適応となる。
また、抗ＮＦ１５５抗体陽性ＣＩＤＰは、抗ＮＦ１５５抗体のサブクラスがＩｇＧ４主体なので、抗ＮＦ１５５抗体のＩｇＧサブクラスを測定した結果ＩｇＧ４が主体であれば、より神経肥厚をきたしやすいので、積極的な免疫療法を初期から導入することが可能になる。ここで、「ＩｇＧ４が主体である」とは、ＭＦＩ比率およびデルタＭＦＩがＩｇＧサブクラスの中で最も高いことを意図する。
また、本発明の診断方法によれば、ＣＩＤＰとギランバレー症候群（ＧＢＳ）との鑑別も可能となる。ＣＩＤＰの初発発作は、単相性の経過をとるギランバレー症候群（ＧＢＳ）との識別が困難である。しかしながら、本発明により検体が抗ＮＦ１５５抗体に陽性の結果となれば、その後に再発性・進行性の経過をとり、ＧＢＳではなくＣＩＤＰとなる可能性が高いことがわかった。抗ＮＦ１５５抗体に陽性の結果となり、ＧＢＳではなくＣＩＤＰである可能性が高いことがわかれば、経静脈的免疫グロブリン療法（ＩＶＩｇ）、単純血漿交換膜（ＰＥ）、副腎皮質ステロイド薬、その他の免疫抑制薬による継続的な治療が必要となってくる。
また、抗ＮＦ１５５抗体陽性ＣＩＤＰの一部は中枢神経病変を合併し、この場合はＣＣＰＤの範疇にも含まれ、抗ＮＦ１５５抗体陽性ＣＩＤＰ／ＣＣＰＤという一連のスペクトルムを構成すると考えられる。中枢神経病変で発症した場合は、中枢神経のみを侵す脱髄性疾患である多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：ＭＳ）との識別が困難であり、ＭＳで有効なインターフェロンベータ（ＩＦＮβ）製剤がＣＣＰＤでは無効であるばかりか３０％程度で症状を増悪させる。しかしながら、本発明により検体が抗ＮＦ１５５抗体に陽性の結果となれば、ＭＳではなくＣＩＤＰと診断できる可能性が高いことがわかった。したがってＭＳ例においても、ＩＦＮβをはじめとする疾患修飾薬の導入時には、抗ＮＦ１５５抗体を測定する意義がある。また、中枢と末梢と両者を侵すＣＣＰＤでは、抗ＮＦ１５５抗体の測定が必要である。
本発明はまた、検体中の抗ＮＦ１５５抗体及び／又は抗ＮＦ１８６抗体を測定する方法であって、ＮＦ１５５を強制発現させた細胞及びＮＦ１８６を強制発現させた細胞と、検体とを接触させた後、蛍光標識された抗ヒトＩｇＧ抗体を用いて、抗ＮＦ１５５抗体及び抗ＮＦ１８６抗体の存在を測定する方法を提供する。
検体、ＮＦ１５５を強制発現させた細胞、ＮＦ１８６を強制発現させた細胞等については上述した通りである。該方法によれば、検体中にＮＦ１５５及び／又はＮＦ１８６が存在するか否かを測定することが可能であり、慢性炎症性脱髄性多発神経炎の診断に有用である。また、該方法によれば、ギランバレー症候群（ＧＢＳ）及び多発性硬化症（ＭＳ）と、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）とを識別することができる。
［ＣＩＤＰ診断用キット］
次に、本発明のキットについて説明する。
本発明の慢性炎症性脱髄性多発神経炎診断用キットは、ＮＦ１５５を強制発現させた細胞株を含む。また、ＮＦ１８６を強制発現させた細胞株を更に含んでいてもよい。
このようなキットを用いることにより、上述したような、本発明の慢性炎症性脱髄性多発神経炎の診断方法、抗ＮＦ１５５抗体及び抗ＮＦ１８６抗体の存在を測定する方法を容易に実施することが可能である。
次に、本発明のキットについて説明する。
本発明の慢性炎症性脱髄性多発神経炎診断用キットは、ＮＦ１５５を強制発現させた細胞株を含む。また、ＮＦ１８６を強制発現させた細胞株を更に含んでいてもよい。
このようなキットを用いることにより、上述したような、本発明の慢性炎症性脱髄性多発神経炎の診断方法、抗ＮＦ１５５抗体及び抗ＮＦ１８６抗体の存在を測定する方法を容易に実施することが可能である。
本発明の慢性炎症性脱髄性多発神経炎診断用キットは、蛍光標識された抗ヒトＩｇＧ抗体を更に含んでいてもよい。このような蛍光標識された抗ヒトＩｇＧ抗体を含むことにより、上述したようにフローサイトメトリー法により、本発明の慢性炎症性脱髄性多発神経炎の診断方法、抗ＮＦ１５５抗体及び抗ＮＦ１８６抗体の存在を測定する方法を実施することができる。
上記のように、フローサイトメトリーにより、上記方法を実施するために、本発明の慢性炎症性脱髄性多発神経炎診断用キットは、フローサイトメトリー法を実施するのに必要な試薬を含んでいてもよい。
上記のように、フローサイトメトリーにより、上記方法を実施するために、本発明の慢性炎症性脱髄性多発神経炎診断用キットは、フローサイトメトリー法を実施するのに必要な試薬を含んでいてもよい。
［バイオマーカー］
次に、本発明のバイオマーカーについて説明する。本発明のバイオマーカーは、抗ＮＦ１５５抗体からなり、ＣＩＤＰを診断するために用いることができる。この抗ＮＦ１５５抗体には、例えば以下のような応用例が考えられる。
次に、本発明のバイオマーカーについて説明する。本発明のバイオマーカーは、抗ＮＦ１５５抗体からなり、ＣＩＤＰを診断するために用いることができる。この抗ＮＦ１５５抗体には、例えば以下のような応用例が考えられる。
本発明のバイオマーカーは、慢性炎症性脱髄性多発神経炎の診断に使用できる他、慢性炎症性脱髄性多発神経炎の予防又は治療薬のスクリーニングに使用することもできる。
また、例えば、慢性炎症性脱髄性多発神経炎の薬剤をテーラーメイド医療で使用する際に、その薬物が、特定の患者に対して有効であるかどうかについて、バイオマーカーを使用することにより簡便に知ることができる。
すなわち、その薬剤を投与する前後で、患者検体中のバイオマーカーの量を比較する。投与後のバイオマーカーの量が投与前より低下した場合には、その薬剤が、その患者に有効であると判断することができ、投与前後でバイオマーカーの量が同じであるか、又は投与後のバイオマーカーの量が投与前より高い場合には、その薬剤がその患者に対して無効であると判断することができる。
また、本発明のバイオマーカーは、慢性炎症性脱髄性多発神経炎の有無又は進行度の指標として用いることができる。
また、本発明のバイオマーカーは、慢性炎症性脱髄性多発神経炎の有無又は進行度の指標として用いることができる。
以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の例示であり、本発明の範囲を限定するものではない。
以下の実施例において、検体として使用する対象としては、２００４年〜２０１４年に九州大学病院を受診および入院した症例のうち、ＥＦＮＳ／ＰＮＳのＣＩＤＰ診断基準の電気生理学的診断基準を、ｄｅｆｉｎｉｔｅで満たすＣＩＤＰ症例５０例を使用した。なお、ＣＣＰＤ症例については、いずれも脱髄性末梢神経障害を有し、ＣＩＤＰの診断基準を満たすことから今回はＣＩＤＰとして扱った。対照群としては、多発性硬化症（ＭＳ）３２例、ギランバレー症候群（ＧＢＳ）・フィッシャー症候群（ＦＳ）２６例を含むＣＩＤＰ以外の末梢神経障害４０例、健常者（ＨＣｓ）３０例を用いた。
上記症例から血清を採取し、実施例において使用した。ＣＩＤＰ症例５０名のうち、典型的な症例は３６名、非典型的症例は１４名であり、１４名の内、ＤＡＤＳは５名、多巣性脱髄性感覚運動型（ｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｎｇ ｓｅｎｓｏｒｙ）（ＭＡＤＳＡＭ）は４名、限局型が２名、純粋運動型が１名、純粋感覚型が２名であった。次いで、他の診療所からの抗ＮＦ１５５抗体を有する４名の患者を加え、それぞれの臨床兆候により評価した。結果は、典型的症例が３７名、非典型的症例が１７名であり、そのうち、ＤＡＤＳが８名、ＭＡＤＳＡＭは４例、限局型が２名、純粋運動型が１名、純粋感覚型が２名であった。合計５４名のうち、抗ＮＦ１５５を有しないＣＩＤＰ患者は４１名であり、抗ＮＦ１５５抗体を有する患者は１３名であった。
上記症例から血清を採取し、実施例において使用した。ＣＩＤＰ症例５０名のうち、典型的な症例は３６名、非典型的症例は１４名であり、１４名の内、ＤＡＤＳは５名、多巣性脱髄性感覚運動型（ｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｎｇ ｓｅｎｓｏｒｙ）（ＭＡＤＳＡＭ）は４名、限局型が２名、純粋運動型が１名、純粋感覚型が２名であった。次いで、他の診療所からの抗ＮＦ１５５抗体を有する４名の患者を加え、それぞれの臨床兆候により評価した。結果は、典型的症例が３７名、非典型的症例が１７名であり、そのうち、ＤＡＤＳが８名、ＭＡＤＳＡＭは４例、限局型が２名、純粋運動型が１名、純粋感覚型が２名であった。合計５４名のうち、抗ＮＦ１５５を有しないＣＩＤＰ患者は４１名であり、抗ＮＦ１５５抗体を有する患者は１３名であった。
［実施例１］
ヒトＮＦ１５５を強制発現させた細胞株、及びヒトＮＦ１８６を強制発現させた細胞株の作製
ヒトＮＦ１５５ｃＤＮＡが含まれるベクター、及びヒトＮＦ１８６ｃＤＮＡが含まれるベクターは、それぞれＯｒｉｇｅｎｅ社から購入した。いずれのベクターにもＴｕｒｂｏ−ＧＦＰをコードする配列が各蛋白のＣ末端に組み込まれている。
次いで、上記ベクターを、制限酵素ＳｃａＩを使用して直鎖化した。具体的には、ＳｃａＩとしてはタカラバイオ株式会社製のＳｃａＩを用い、反応は、タカラバイオ株式会社の添付文書に記載された通りに行った。具体的には、ＳｃａＩ ２μＬ、１０×Ｈバッファー ４μＬ、基質ＤＮＡ １．５μｇ、滅菌精製水で合計４０μＬの溶液とし、３７℃にて反応を行った。
ヒトＮＦ１５５を強制発現させた細胞株、及びヒトＮＦ１８６を強制発現させた細胞株の作製
ヒトＮＦ１５５ｃＤＮＡが含まれるベクター、及びヒトＮＦ１８６ｃＤＮＡが含まれるベクターは、それぞれＯｒｉｇｅｎｅ社から購入した。いずれのベクターにもＴｕｒｂｏ−ＧＦＰをコードする配列が各蛋白のＣ末端に組み込まれている。
次いで、上記ベクターを、制限酵素ＳｃａＩを使用して直鎖化した。具体的には、ＳｃａＩとしてはタカラバイオ株式会社製のＳｃａＩを用い、反応は、タカラバイオ株式会社の添付文書に記載された通りに行った。具体的には、ＳｃａＩ ２μＬ、１０×Ｈバッファー ４μＬ、基質ＤＮＡ １．５μｇ、滅菌精製水で合計４０μＬの溶液とし、３７℃にて反応を行った。
上述のようにして直鎖化したベクターを、Ｆｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いたリポフェクションにより、添付文書に準じてＨＫ２９３細胞にトランスフェクションした。次いで、Ｇ４１８（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）１ｍｇ／ｍｌを添加してＤＭＥＭで培養し、Ｇ４１８耐性株を選択した。増殖したコロニーを、クローニングシリンダーを用いて単離し、それぞれヒトＮＦ１５５を強制発現させた細胞株、及びヒトＮＦ１８６細胞を強制発現させた細胞株とした。
［実施例２］
フローサイトメトリー法を利用した抗ＮＦ１５５抗体測定
ＦＡＣＳバッファー１（ＤＭＥＭ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＦＢＳ）を用い、ＨＥＫ２９３細胞及びＮＦ１５５発現細胞をそれぞれ１×１０６／ｍｌとなるように混合した。９６穴のマイクロタイタープレートに４７．５μＬずつ細胞溶液を入れ、次いでＣＩＤＰ患者血清２．５μＬを加えて混合した（血清希釈倍率１：２０）。次いで、マイクロタイタープレートを４℃で６０分間インキュベーションし、２００μＬのＦＡＣＳバッファー１で２回洗浄した後、２次抗体（Ａｌｅｘａ ６４７−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｌｉｆｅ Ｔｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）（希釈倍率１：５００）と抗原抗体反応を起こさせた後、４℃で６０分間インキュベーションした。次いで、２００μＬのＦＡＣＳバッファー２（ＰＢＳ、５ｍＭ ＥＤＴＡ）で２回洗浄し、それぞれの細胞群における蛍光２次抗体（Ａｌｅｘａ ６４７）の平均蛍光強度（ＭＦＩ：Ｍｅａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）の比（ｒａｔｉｏ）または差（ｄｅｌｔａ）を評価した
上記と同様の方法で、抗ＮＦ１５５抗体陽性の一部において、抗ＮＦ１８６抗体の有無を、ＮＦ１８６発現細胞株を用いたフローサイトメトリー法及び免疫染色法で評価した。
なお、カットオフ値は、ＭＦＩ比、ｄｅｌｔａ ＭＦＩ比について、それぞれ１０及び１００とした。
フローサイトメトリー法を利用した抗ＮＦ１５５抗体測定
ＦＡＣＳバッファー１（ＤＭＥＭ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＦＢＳ）を用い、ＨＥＫ２９３細胞及びＮＦ１５５発現細胞をそれぞれ１×１０６／ｍｌとなるように混合した。９６穴のマイクロタイタープレートに４７．５μＬずつ細胞溶液を入れ、次いでＣＩＤＰ患者血清２．５μＬを加えて混合した（血清希釈倍率１：２０）。次いで、マイクロタイタープレートを４℃で６０分間インキュベーションし、２００μＬのＦＡＣＳバッファー１で２回洗浄した後、２次抗体（Ａｌｅｘａ ６４７−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｌｉｆｅ Ｔｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）（希釈倍率１：５００）と抗原抗体反応を起こさせた後、４℃で６０分間インキュベーションした。次いで、２００μＬのＦＡＣＳバッファー２（ＰＢＳ、５ｍＭ ＥＤＴＡ）で２回洗浄し、それぞれの細胞群における蛍光２次抗体（Ａｌｅｘａ ６４７）の平均蛍光強度（ＭＦＩ：Ｍｅａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）の比（ｒａｔｉｏ）または差（ｄｅｌｔａ）を評価した
上記と同様の方法で、抗ＮＦ１５５抗体陽性の一部において、抗ＮＦ１８６抗体の有無を、ＮＦ１８６発現細胞株を用いたフローサイトメトリー法及び免疫染色法で評価した。
なお、カットオフ値は、ＭＦＩ比、ｄｅｌｔａ ＭＦＩ比について、それぞれ１０及び１００とした。
［結果］
フローサイトメトリー法による、抗ＮＦ１５５抗体測定（実施例２）の結果を図１Ａに示す。グラフの縦軸及び横軸は、それぞれＡｌｅｘａ６４７及びＴｕｒｂｏ−ＧＦＰの蛍光強度を示す。図１Ａの左側の図は、血清を含まない系での結果を示す。図１Ａから明らかなように、ヒトＮＦ１５５を発現しているＨＥＫ２９３細胞と発現していないＨＥＫ２９３細胞はＴｕｒｂｏ−ＧＦＰの蛍光強度により２つの細胞集団に分離することができた。左図は患者血清を投与せず、二次抗体のみ付加した例であるが、いずれの細胞集団もＡｌｅｘａ６４７の蛍光強度は低い値であることを示している。
図１Ａの中央の図は陰性例である。血清を投与することにより、いずれの細胞集団も非特異的にＡｌｅｘａ６４７の蛍光強度が上昇しているが、ＭＦＩ ｒａｔｉｏ及びｄｅｌｔａ ＭＦＩの値は、それぞれ１．３７及び１．８８であり、いずれも低い値であった。
また、図１Ａの右側の図は陽性例を示す。ＭＦＩ比及びｄｅｌｔａ ＭＦＩはそれぞれ４８及び２７６であり、図１Ａの中央の図に示す陰性例と比較して顕著に上昇していた。
また、段階希釈した血清を用いて測定も行った。その結果を図１Ｂに示す。図から明らかなように連続的に値が変化することを確認した。
また、図２Ａ及び図２Ｂは、抗ＮＦ１５５抗体陽性又は陰性のＣＩＤＰ患者の血清を、ヒトＮＦ１５５またはヒトＮＦ１８６を発現する細胞と反応させたときの免疫組織学的結果である。抗ＮＦ１５５抗体陽性のＣＩＤＰ患者の血清が、ヒトＮＦ１８６を発現する細胞ではなく、ヒトＮＦ１５５を発現する細胞で反応したことを示している。
フローサイトメトリー法による、抗ＮＦ１５５抗体測定（実施例２）の結果を図１Ａに示す。グラフの縦軸及び横軸は、それぞれＡｌｅｘａ６４７及びＴｕｒｂｏ−ＧＦＰの蛍光強度を示す。図１Ａの左側の図は、血清を含まない系での結果を示す。図１Ａから明らかなように、ヒトＮＦ１５５を発現しているＨＥＫ２９３細胞と発現していないＨＥＫ２９３細胞はＴｕｒｂｏ−ＧＦＰの蛍光強度により２つの細胞集団に分離することができた。左図は患者血清を投与せず、二次抗体のみ付加した例であるが、いずれの細胞集団もＡｌｅｘａ６４７の蛍光強度は低い値であることを示している。
図１Ａの中央の図は陰性例である。血清を投与することにより、いずれの細胞集団も非特異的にＡｌｅｘａ６４７の蛍光強度が上昇しているが、ＭＦＩ ｒａｔｉｏ及びｄｅｌｔａ ＭＦＩの値は、それぞれ１．３７及び１．８８であり、いずれも低い値であった。
また、図１Ａの右側の図は陽性例を示す。ＭＦＩ比及びｄｅｌｔａ ＭＦＩはそれぞれ４８及び２７６であり、図１Ａの中央の図に示す陰性例と比較して顕著に上昇していた。
また、段階希釈した血清を用いて測定も行った。その結果を図１Ｂに示す。図から明らかなように連続的に値が変化することを確認した。
また、図２Ａ及び図２Ｂは、抗ＮＦ１５５抗体陽性又は陰性のＣＩＤＰ患者の血清を、ヒトＮＦ１５５またはヒトＮＦ１８６を発現する細胞と反応させたときの免疫組織学的結果である。抗ＮＦ１５５抗体陽性のＣＩＤＰ患者の血清が、ヒトＮＦ１８６を発現する細胞ではなく、ヒトＮＦ１５５を発現する細胞で反応したことを示している。
［実施例３］
抗ＮＦ１５５抗体ＩｇＧサブクラスの検出
ＦＡＣＳバッファー１（ＤＭＥＭ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＦＢＳ）を用い、ＨＥＫ２９３細胞及びＮＦ１５５発現細胞をそれぞれ１×１０６／ｍｌとなるよう混合した。９６穴のマイクロタイタープレートに４７．５μＬずつ細胞溶液を入れ、次いで患者血清２．５μＬを加えて混合した（血清希釈倍率１：２０）。次いで、マイクロタイタープレートを４℃で６０分間インキュベーションし、２００μＬのＦＡＣＳバッファー１で２回洗浄した後、以下の２次抗体を希釈倍率１：５００で細胞と混合し、抗原抗体反応を起こさせた。
抗ＮＦ１５５抗体ＩｇＧサブクラスの検出
ＦＡＣＳバッファー１（ＤＭＥＭ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＦＢＳ）を用い、ＨＥＫ２９３細胞及びＮＦ１５５発現細胞をそれぞれ１×１０６／ｍｌとなるよう混合した。９６穴のマイクロタイタープレートに４７．５μＬずつ細胞溶液を入れ、次いで患者血清２．５μＬを加えて混合した（血清希釈倍率１：２０）。次いで、マイクロタイタープレートを４℃で６０分間インキュベーションし、２００μＬのＦＡＣＳバッファー１で２回洗浄した後、以下の２次抗体を希釈倍率１：５００で細胞と混合し、抗原抗体反応を起こさせた。
使用した２次抗体
ＰＥ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ−ＩｇＧ１ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｅｌｌ Ｌａｂ、７３３１７９）
ＰＥ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ−ＩｇＧ２ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｅｌｌ Ｌａｂ、７３６４０８）
ＰＥ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ−ＩｇＧ３ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｅｌｌ Ｌａｂ、７３６４８７）
ＰＥ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ−ＩｇＧ４ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｅｌｌ Ｌａｂ、７３３２１９）
次いで、４℃で６０分間インキュベーションした後、２００μＬのＦＡＣＳバッファー２（ＰＢＳ、５ｍＭ ＥＤＴＡ）で２回洗浄し、それぞれの細胞群における蛍光２次抗体（ＰＥ）の平均蛍光強度（ＭＦＩ：Ｍｅａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）の比（ｒａｔｉｏ）もしくは差（ｄｅｌｔａ）で評価した。
ＰＥ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ−ＩｇＧ１ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｅｌｌ Ｌａｂ、７３３１７９）
ＰＥ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ−ＩｇＧ２ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｅｌｌ Ｌａｂ、７３６４０８）
ＰＥ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ−ＩｇＧ３ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｅｌｌ Ｌａｂ、７３６４８７）
ＰＥ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ−ＩｇＧ４ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｅｌｌ Ｌａｂ、７３３２１９）
次いで、４℃で６０分間インキュベーションした後、２００μＬのＦＡＣＳバッファー２（ＰＢＳ、５ｍＭ ＥＤＴＡ）で２回洗浄し、それぞれの細胞群における蛍光２次抗体（ＰＥ）の平均蛍光強度（ＭＦＩ：Ｍｅａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）の比（ｒａｔｉｏ）もしくは差（ｄｅｌｔａ）で評価した。
［結果］
結果を図３に示す。図３に示されるように、実験を行った１３例全てにおいて、ＩｇＧ４が主体であることが確認できた。一方、抗ＮＦ１５５抗体に陽性であったＧＢＳ症例においては、ＩｇＧ４が主体ではなかった。以上の結果により、抗ＮＦ１５５抗体のＩｇＧサブクラスを検出することで、より高確率にＣＩＤＰの診断を行うことができることが分かった。
結果を図３に示す。図３に示されるように、実験を行った１３例全てにおいて、ＩｇＧ４が主体であることが確認できた。一方、抗ＮＦ１５５抗体に陽性であったＧＢＳ症例においては、ＩｇＧ４が主体ではなかった。以上の結果により、抗ＮＦ１５５抗体のＩｇＧサブクラスを検出することで、より高確率にＣＩＤＰの診断を行うことができることが分かった。
［実施例４］
実施例２に記載した同様の方法を用いて、電気生理学的基準による定義によってＣＩＤＰと診断された５０例、対照群として、他の診療所の抗ＮＦ１５５抗体陽性ＣＩＤＰ患者４例、ＭＳ３２例、ＯＮ（ＧＢＳ／ＦＳ、血管炎によるニューロパチー、ＰＯＥＭＳ、ＨＭＳＮ、及び抗ＭＡＧ抗体陽性ニューロパチー）４０例、及びＨＣｓ（健常者）３０例において、抗ＮＦ１５５抗体の測定を行った。結果を図４および下記表１に示す。全体の陽性率は１８．０％（９／５０）であった。ＣＩＤＰの中では、ＤＡＤＳ型で３／５（６０％）と高い陽性率であったが、それ以外の９例の非典型的ＣＩＤＰでは陽性例はなかった。典型的ＣＩＤＰでは、１６．７％（６／３６）の陽性率であった。対象群では、多発性硬化症（ＭＳ）で０％（０／３２）、ギランバレー症候群（ＧＢＳ）・フィッシャー症候群（ＦＳ）で３．８％（１／２６）、健常者（ＨＣ）で０％（０／３０）であった。
また、抗ＮＦ１８６抗体はいずれの症例においても陰性であった。
実施例２に記載した同様の方法を用いて、電気生理学的基準による定義によってＣＩＤＰと診断された５０例、対照群として、他の診療所の抗ＮＦ１５５抗体陽性ＣＩＤＰ患者４例、ＭＳ３２例、ＯＮ（ＧＢＳ／ＦＳ、血管炎によるニューロパチー、ＰＯＥＭＳ、ＨＭＳＮ、及び抗ＭＡＧ抗体陽性ニューロパチー）４０例、及びＨＣｓ（健常者）３０例において、抗ＮＦ１５５抗体の測定を行った。結果を図４および下記表１に示す。全体の陽性率は１８．０％（９／５０）であった。ＣＩＤＰの中では、ＤＡＤＳ型で３／５（６０％）と高い陽性率であったが、それ以外の９例の非典型的ＣＩＤＰでは陽性例はなかった。典型的ＣＩＤＰでは、１６．７％（６／３６）の陽性率であった。対象群では、多発性硬化症（ＭＳ）で０％（０／３２）、ギランバレー症候群（ＧＢＳ）・フィッシャー症候群（ＦＳ）で３．８％（１／２６）、健常者（ＨＣ）で０％（０／３０）であった。
また、抗ＮＦ１８６抗体はいずれの症例においても陰性であった。
上記表１中、ＣＩＤＰ＝慢性炎症性脱髄性多発神経炎、ＤＡＤＳ＝遠位対称型慢性炎症性脱髄性多発神経炎、ＦＳ＝Ｆｉｓｈｅｒ症候群、ＧＢＳ＝Ｇｕｉｌｌａｉｎ−Ｂａｒｒe症候群、ＨＣｓ＝健常対照、ＨＭＳＮ＝遺伝性運動感覚性ニューロパチー、ＭＡＤＳＡＭ＝多巣性脱髄性感覚運動型慢性炎症性脱髄性多発神経炎、ＭＡＧ＝ミエリン関連糖蛋白、ＭＳ＝多発性硬化症、ｎ＝陽性症例数、Ｎ＝照合された症例数、ＰＯＥＭＳ＝ｐｏｌｙｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ，ｏｒｇａｎｏｍｅｇａｌｙ，ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｐａｔｈｙ，Ｍ ｐｒｏｔｅｉｎ，ａｎｄ ｓｋｉｎ ｃｈａｎｇｅｓ（ＰＯＥＭＳ）症候群 である。
抗ＮＦ１５５抗体陽性例において抗ＮＦ１８６抗体はいずれにおいても陰性であったのは、ＮＦ１５５及びＮＦ１８６の差異は選択的スプライシングにより発生するため、考えられるエピトープはＮＦ１５５にあってＮＦ１８６にないアミノ酸配列であると想定される。
［実施例５］
抗ＮＦ１５５陽性ＣＩＤＰ及び陰性例について、臨床データの比較を行った。その結果を表２に示す。抗ＮＦ１５５抗体陽性ＣＩＤＰ（ｎ＝１３）では陰性ＣＩＤＰ（ｎ＝４１）と比較して、発症年齢が低い（４７．９±１７．０に対して２５．２±１０．７、ｐ＜０．０００１）、末梢優位に筋力低下が目立つＤＡＤＳ型が多い（４．９％に対して４６．２％、ｐ＝０．００１４）、下垂足を呈する割合が多い（３１．７％に対して６９．２％、ｐ＝０．０２４２）、歩行障害の割合が多い（７３．２％に対して１００％、ｐ＝０．０４８４）、振戦の割合が多い（１９．５％に対して５３．８％、ｐ＝０．０３００）、髄液蛋白値が高い（１０３．８±７５．８に対して３１７．０±１４１．１、ｐ＜０．０００１）という特徴がみられた。
また、患者の神経根ＭＲＩの結果を図５Ａ及び図５Ｂに示す。図５Ａ及び図５Ｂから明らかなように、撮像し得た７例の抗ＮＦ１５５抗体陽性ＣＩＤＰおいて、いずれも頚部および腰部神経根、近位末梢神経の顕著な肥厚が認められ、髄液蛋白が高度に上昇するという特徴的な病像を呈することがわかった。
また、脳ＭＲＩについても撮像し、その結果を図６Ａ〜図６Ｃに示す。図６Ａ〜図６Ｃに示すように、脳ＭＲＩについては脱髄性病変を認める症例もみられた。
抗ＮＦ１５５陽性ＣＩＤＰ及び陰性例について、臨床データの比較を行った。その結果を表２に示す。抗ＮＦ１５５抗体陽性ＣＩＤＰ（ｎ＝１３）では陰性ＣＩＤＰ（ｎ＝４１）と比較して、発症年齢が低い（４７．９±１７．０に対して２５．２±１０．７、ｐ＜０．０００１）、末梢優位に筋力低下が目立つＤＡＤＳ型が多い（４．９％に対して４６．２％、ｐ＝０．００１４）、下垂足を呈する割合が多い（３１．７％に対して６９．２％、ｐ＝０．０２４２）、歩行障害の割合が多い（７３．２％に対して１００％、ｐ＝０．０４８４）、振戦の割合が多い（１９．５％に対して５３．８％、ｐ＝０．０３００）、髄液蛋白値が高い（１０３．８±７５．８に対して３１７．０±１４１．１、ｐ＜０．０００１）という特徴がみられた。
また、患者の神経根ＭＲＩの結果を図５Ａ及び図５Ｂに示す。図５Ａ及び図５Ｂから明らかなように、撮像し得た７例の抗ＮＦ１５５抗体陽性ＣＩＤＰおいて、いずれも頚部および腰部神経根、近位末梢神経の顕著な肥厚が認められ、髄液蛋白が高度に上昇するという特徴的な病像を呈することがわかった。
また、脳ＭＲＩについても撮像し、その結果を図６Ａ〜図６Ｃに示す。図６Ａ〜図６Ｃに示すように、脳ＭＲＩについては脱髄性病変を認める症例もみられた。
上記表２中、ＣＩＤＰ＝慢性炎症性脱髄性多発神経炎、ＤＡＤＳ＝遠位対称型慢性炎症性脱髄性多発神経炎、ＭＡＤＳＡＭ＝多巣性脱髄性感覚運動型慢性炎症性脱髄性多発神経炎、ｎ＝関連する症例数、Ｎ＝照合された症例数、ＮＳ＝有意でない、ＳＤ＝標準偏差 である。
［実施例６］
抗ＮＦ１５５抗体陽性ＣＩＤＰ及び陰性例において、末梢神経伝導検査を行った。
抗ＮＦ１５５抗体陽性ＣＩＤＰ及び陰性例のＮＣＳ（神経伝導速度）所見の比較を行った結果を表３に示す。
抗ＮＦ１５５抗体陽性ＣＩＤＰ及び陰性例において、末梢神経伝導検査を行った。
抗ＮＦ１５５抗体陽性ＣＩＤＰ及び陰性例のＮＣＳ（神経伝導速度）所見の比較を行った結果を表３に示す。
上記表３中、ＣＩＤＰ＝慢性炎症性脱髄性多発神経炎、ＣＭＡＰ＝複合筋活動電位；ＭＣＶ＝運動神経伝導速度；Ｎ＝検査を実施された神経の数；ＮＦ＝ニューロファシン；ＳＣＶ＝感覚神経伝導速度；ＳＮＡＰ＝感覚神経活動電位；ＴＬＩ＝ｔｅｒｍｉｎａｌ ｌａｔｅｎｃｙ ｉｎｄｅｘ、ｎ＝関連する症例数、Ｎ＝照合された症例数、ＮＳ＝有意でない、ＳＤ＝標準偏差 である。
全ての連続変数は平均±ＳＤで示し，括弧内には誘発された神経の数／施行した神経の数を記載している．
全ての連続変数は平均±ＳＤで示し，括弧内には誘発された神経の数／施行した神経の数を記載している．
遠位潜時の基準値：正中神経，３．４９±０．３４ｍｓ；尺骨神経，２．５９±０．３９ｍｓ；脛骨神経，３．９６±１．００ｍｓ．ＭＣＶの基準値ＭＣＶ：正中神経，５７．７±４．９ｍ／ｓ；尺骨神経，５８．７±５．１ｍ／ｓ；脛骨神経，４８．５±３．６ｍ／ｓ．ＣＭＡＰ振幅の基準値：正中神経，７．０±３．０ｍＶ；尺骨神経，５．７±２．０ｍＶ；脛骨神経，５．８±１．９ｍＶ．Ｆ波潜時の基準値：正中神経，２６．２±２．２ｍｓ；尺骨神経，２７．６±２．２ｍｓ；脛骨神経，４７．７±５．０ｍｓ．遠位潜時の正常上限：正中神経，４．２ｍｓ；尺骨神経，３．４ｍｓ；脛骨神経６．０ｍｓ．ＭＣＶの正常下限：正中神経，４８ｍ／ｓ；尺骨神経，４９ｍ／ｓ；脛骨神経，４１ｍ／ｓ．ＣＭＡＰ振幅の正常下限：正中神経，３．５ｍＶ；尺骨神経，２．８ｍＶ；脛骨神経，２．９ｍＶ．Ｆ波潜時の正常上限：正中神経，３１ｍｓ；尺骨神経，３２ｍｓ；脛骨神経，５８ｍｓ．ＳＣＶの正常下限：正中神経，４４ｍ／ｓ；尺骨神経，４４ｍ／ｓ；腓腹神経，４５ｍ／ｓ。
表３から明らかなように、抗ＮＦ１５５陽性ＣＩＤＰでは、陰性ＣＩＤＰと比較して尺骨神経、脛骨神経において遠位潜時が、正中神経、尺骨神経、脛骨神経においてＦ波の潜時が有意に延長していることがわかった。
さらにまた、ＣＣＰＤ（中枢・抹消連合脱髄症）には、主にＣＩＤＰ（慢性炎症性脱髄性多発神経炎）及びＭＳ（多発性硬化症）があるが、検体中の抗−ＮＦ１５５抗体の有無で、ＣＩＤＰとＭＳとを識別できることが分かった。
また、ＣＩＤＰとギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）においても、検体中の抗ＮＦ１５５抗体の有無で、両者を識別できることが分かった。すなわち、従来、末梢神経を急性に侵す脱髄性疾患であるギラン・バレー症候群は、初回発作時はＣＩＤＰとの鑑別が困難であったが、上記結果により、本発明の抗ＮＦ１５５抗体が陽性であれば、再発しＣＩＤＰとなる可能性が高いことがわかり、ＧＢＳと再発するＣＩＤＰとの鑑別において抗ＮＦ１５５抗体の測定は有用であることがわかった。
本発明を特定の態様を用いて詳細に説明したが、本発明の意図と範囲を離れることなく様々な変更及び変形が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお本出願は、２０１５年１月２０日付で出願された米国仮出願（ＵＳ６２／１０５，３１３）に基づいており、その全体が引用により援用される。
Claims (11)
- 検体中に含まれる、ＩｇＧ４が主体である抗ニューロファシン１５５抗体を測定し、抗ニューロファシン１５５抗体陽性又は陰性を判定する工程を含み、
抗ニューロファシン１５５抗体陽性の場合に、抗ニューロファシン１５５抗体陰性の場合と比較して、末梢神経遠位部及び神経根における神経伝導速度が低く、近位末梢神経及び神経根の肥厚が大きく、かつ髄液蛋白値が高いと判定する、
慢性炎症性脱髄性多発神経炎の診断を補助する方法。 - 検体中に含まれる抗ニューロファシン１８６抗体を測定する工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
- ニューロファシン１５５とは反応するが、ニューロファシン１８６とは反応しない抗体を検出する工程を含む、請求項２に記載の方法。
- ニューロファシン１５５を強制発現させた細胞及びニューロファシン１８６を強制発現させた細胞と、検体とを接触させ、抗ニューロファシン１５５抗体及び／又は抗ニューロファシン１８６抗体の存在を、蛍光標識された抗ヒトＩｇＧ抗体を用いて測定する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
- フローサイトメトリー法により行う、請求項４に記載の方法。
- ギランバレー症候群又は多発性硬化症と、慢性炎症性脱髄性多発神経炎とを識別する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
- 検体が血液または髄液である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
- ニューロファシン１５５を強制発現させた細胞株を含み、抗ニューロファシン１５５抗体陽性又は陰性を判定するための慢性炎症性脱髄性多発神経炎診断用キットであって、
抗ニューロファシン１５５抗体陽性の場合に、抗ニューロファシン１５５抗体陰性の場合と比較して、末梢神経遠位部及び神経根における神経伝導速度が低く、近位末梢神経及び神経根の肥厚が大きく、かつ髄液蛋白値が高いと診断するための、
慢性炎症性脱髄性多発神経炎診断用キット。 - ニューロファシン１８６を強制発現させた細胞株を更に含む、請求項８に記載のキット。
- 蛍光標識された抗ヒトＩｇＧ抗体を更に含む、請求項８又は９に記載のキット。
- ＩｇＧ４が主体である抗ニューロファシン１５５抗体からなり、抗ニューロファシン１５５抗体陽性又は陰性を判定することにより慢性炎症性脱髄性多発神経炎を診断するためのバイオマーカーであって、
抗ニューロファシン１５５抗体陽性の場合に、抗ニューロファシン１５５抗体陰性の場合と比較して、末梢神経遠位部及び神経根における神経伝導速度が低く、近位末梢神経及び神経根の肥厚が大きく、かつ髄液蛋白値が高いと診断するための、
バイオマーカー。
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