JP6744046B2 - cGMPアナログの標的化されたリポソーム送達 - Google Patents
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Description
(式中、R6及びR7の両方が水素であり、X1が−CF3又は−NR9R10若しくは−SR11基であり、R9が水素であり、R10及びR11の両方が末端NH2若しくはOH基を有するアルキル基であるか、又はR11が、
に示すように置換基Qを4位に有するフェニル基であり、
Qが、−F、−Cl、−Br、−I、−OH、−SH、NH2、NO2、−OCH3、CH3若しくはCF3であり、又は
R9及びR10の両方が互いに接続して環を形成するアルキル基であり、R8が水素、(トリ)アルキルシリル基又はアシル基であり、
Lが酸素、硫黄、ボラノ(BH3)若しくはさらに置換されたボラノ基であって、MがOHであるか、又は
LがOHであって、Mが酸素、硫黄、ボラノ(BH3)若しくはさらに置換されたボラノ基であり、
Kat+が、プロトン又は別の生理学的に許容される金属カチオン若しくはトリアルキルアンモニウムイオンであり、或いは、
R6及びR7が一緒になって、スチリレン基であり、式II:
による縮合三環式環系を形成し、
X2が、水素、−F、−Cl、−Br、−I、CF3、−NR9R10若しくは−SR11基又は4−クロロフェニルチオ基であり、R9が水素であり、R10及びR11の両方が末端NH2又はOH基を有するアルキル基であり、
R8が水素、(トリ)アルキルシリル基、又はアシル基であり、
Lが酸素、硫黄、ボラノ(BH3)若しくはさらに置換されたボラノ基であって、MがOHであるか、又は
LがOHであって、Mが酸素、硫黄、ボラノ(BH3)若しくはさらに置換されたボラノ基であり、
Kat+が、プロトン又は別の生理学的に許容される金属カチオン若しくはトリアルキルアンモニウムイオンである)
の環状グアノシン−3’,5’−モノホスフェートアナログである。
(式中、Z=CH2及びY=CH2、又はZ=O及びY=C=Oであり、
Ri及びR2が独立して、H、直鎖若しくは分岐のアルキル(1〜25C)、アラルキル(6〜26C)、シクロアルキル(6〜25C)、複素環(6〜20C)、エーテル又はポリエーテル(3〜25C)からなる群から選択され、ここでRi−R2が一緒になって、2〜20C原子を有し、式VIの残部と共に大環状分子を形成し、
R3が、H及びCH3からなる群から選択され、
R4が、6〜8Cアルキル、ベンジル、ナフチル及び治療的に活性な環状グアノシン−3’,5’−モノホスホロチオエートからなる群から選択され、
R5が、H、フェニル、CH3−及びCH2−フェニルからなる群から選択される)
のグルタチオン誘導体又はその薬学的に許容される塩からなる群から選択されるリガンドであり、式Iの誘導体において、R3がHであり、R4がベンジルであり、R5がフェニルであることが好ましい。
本発明のナノ容器に含まれる環状グアノシン−3’,5’−モノホスフェート(cGMP)アナログは、好ましくは、式I:
の環状グアノシン−3’,5’−モノホスフェート(cGMP)アナログである。
に示すように置換基Qを4位に有するフェニル基であり、
Qが、−F、−Cl、−Br、−I、−OH、−SH、NH2、NO2、−OCH3、CH3若しくはCF3であり、又は
R9及びR10の両方が互いに接続して環を形成するアルキル基であり、R8が水素、(トリ)アルキルシリル基又はアシル基であり、
Lが酸素、硫黄、ボラノ(BH3)若しくはさらに置換されたボラノ基であって、MがOHであるか、又は
LがOHであって、Mが酸素、硫黄、ボラノ(BH3)若しくはさらに置換されたボラノ基であり、
Kat+が、プロトン又は別の生理学的に許容される金属カチオン若しくはトリアルキルアンモニウムイオンであり、或いは、
R6及びR7が一緒になって、スチリレン基であり、式II:
による縮合三環式環系を形成し、
X2が、水素、−F、−Cl、−Br、−I、CF3、又は−NR9R10若しくは−SR11基又は4−クロロフェニルチオ基であり、R9が水素であり、R10及びR11の両方が末端NH2又はOH基を有するアルキル基であり、R8が水素、(トリ)アルキルシリル基、又はアシル基であり、
Lが酸素、硫黄、ボラノ(BH3)若しくはさらに置換されたボラノ基であって、MがOHであるか、又は
LがOHであって、Mが酸素、硫黄、ボラノ(BH3)若しくはさらに置換されたボラノ基であり、
Kat+が、プロトン又は別の生理学的に許容される金属カチオン若しくはトリアルキルアンモニウムイオンである。
(式中、ナトリウムカチオンは、任意の他の薬学的に許容されるカチオンでありえ、例えば、プロトン又は別の生理学的に許容される金属カチオン若しくはトリアルキルアンモニウムイオンでありうる)の環状グアノシン−3’,5’−モノホスホロチオエートである。式IIIは、「β−フェニル−1,N2−エテノ」(PET)修飾を有する化合物も例示している。
本発明によるナノ容器は、トランスポーターを発現している細胞へ、細胞内へ及び/又は細胞を渡してナノ容器を標的化するための、グルタチオン(GSH)トランスポーターに対するリガンドを含む。したがって、GSHトランスポーターは、リガンド及びリガンドを含むナノ容器の、トランスポーターを発現している標的細胞内への及び/又は同細胞を通じた特異的結合、エンドサイトーシス及びトランスサイトーシスのうちの少なくとも1つを媒介することが好ましい。トランスポーター又は受容体媒介送達は、近年開発された有望な標的化薬物送達技術の1つである。この技術は、薬物又は薬物担体にコンジュゲートされるリガンドに対する受容体/トランスポーターを発現している標的細胞に特異性の高い送達を行うという潜在的利点を有する。低分子量でポリペプチド及び核酸ベースの治療剤又は診断剤並びにこれらの治療剤又は診断剤を含むナノ容器の、細胞及び組織への特異的標的化は、トランスポーター/受容体媒介送達の使用を介して大きく増強されうる。
(式中、Z=CH2及びY=CH2、又はZ=O及びY=C=Oであり、
Ri及びR2が独立して、H、直鎖若しくは分岐のアルキル(1〜25C)、アラルキル(6〜26C)、シクロアルキル(6〜25C)、複素環(6〜20C)、エーテル又はポリエーテル(3〜25C)からなる群から選択され、ここでR1−R2は一緒になって、2〜20C原子を有し、式1の残部と共に大環状分子を形成し、
R3が、H及びCH3からなる群から選択され、
R4が、6〜8Cアルキル、ベンジル、ナフチル及び治療的に活性な化合物からなる群から選択され、
R5が、H、フェニル、CH3−及びCH2−フェニルからなる群から選択される)
のGSH誘導体又はその薬学的に許容される塩からなる群から選択されるリガンドが挙げられる。
本発明のナノ容器内のリガンドは、好ましくは、治療剤又は診断剤を含む薬学的に許容されるナノ容器にコンジュゲートされる。そのようなコンジュゲートでは、治療剤又は診断剤は、例えば、ナノ粒子、リポソーム又はナノゲルなどのナノ容器内に封入されていてもよく、リガンドは、そのようなナノ容器に、好ましくはコンジュゲートして結合されている。ナノ容器へのコンジュゲーションは、直接的であってもよく、又は周知のポリマーコンジュゲーション剤、例えば、スフィンゴミエリン、ポリエチレングリコール(PEG)若しくは他の有機ポリマーのいずれかを介するものであってもよい。硝子体内注射ナノ容器では、コンジュゲートされるリガンドを有しないナノ容器も使用することができる。標的化(PEG)リポソームを含む医薬組成物の製造の詳細は、例えば、米国特許第6,372,250号に記載されている。したがって、好ましい実施形態では、本発明によるナノ容器は、担体タンパク質、リポソーム、ポリプレックスシステム、リポプレックスシステム、及びポリエチレングリコールのうちの少なくとも1つである。
さらなる態様では、本発明のナノ容器は、医薬として使用する。
本発明のナノ容器は、好ましくは、cGMP作動性細胞標的の調節不全に関連する病理、状態又は障害の処置及び/又は予防のために使用され、好ましくは、標的は、cGMP依存性プロテインキナーゼ(PKG)及びcGMP開口性チャネル(CNGC)のうちの少なくとも1つである。Schlossmann and Schinner(2012、Arch Pharmacol、385:243−252)及びWolfertstetterら(2013、Pharmaceuticals 2013、6:269−286)は、PKG及びCNGCのうちの少なくとも1つ又は両方の阻害又は活性化が、特定の病理、状態又は障害の処置における適切な生物学的課題であるかを検討している。これに従って、様々なアナログに対して、上記に示した生物学的課題を実施することができるcGMPアナログが選択されうる。本明細書において、病理、状態又は障害の処置は、特に他のことが指示されない限り、明確に言及されていない場合でも、病理、状態又は障害の予防も含まれると理解されるべきである。
1.1 cGMPSを封入するGSH−コンジュゲートされたリポソームの製造
最初に、DSPE−PEG2000−マレイミド(NOF、Grobbendonk、ベルギー、36.72mLのDI水中916mg)とグルタチオン(Sigma−Aldrich、Zwijndrecht、オランダ、4.42mLのDI水中144mg)と(モル比1:1.5)を室温で2時間混合することによって、ミセルを調製した。次いで、ミセルを酢酸カルシウム水和物(57.36mLのDI水中4094mg、最終濃度200mM)に加え、60℃で30分間維持した。
初代網膜細胞培養物の調製のための動物は、モデナ・レッジョ・エミリア(Modena and Reggio Emilia)大学のCSSI(Centra Servizi Stabulario Interdipartimentale)で飼育されたものであった。手順は、モデナ・レッジョ・エミリア大学の倫理委員会(Prot.N.106 22/11/2012)及びイタリア衛生省(Italian Ministero della Salute)により承認を受けた。in vitro網膜外植試験のための動物は、ルンド(Lund)大学の臨床化学部門(department for clinical sciences)で飼育されたものであった。我々は、rd1及びrd2網膜色素変性症モデルマウスと共に対応する野生型(wt)対照も使用した。動物は、標準的な白色周期性照明下(white cyclic lighting)に飼育され、食事及び水は自由に摂取可能とし、性別に関係なく使用した。全ての手順は、スウェーデン動物実験及び倫理委員会(Swedish animal care and ethics committee)に従って実施した。使用した動物の数を維持し、動物の苦痛が最小になるように努めた。
様々な用量のDF003及びLP−DF003を、rd1モデルマウス由来の網膜細胞の初代培養物に対してin vitroで試験した。初代細胞の約20〜30%が、桿体光受容体(Demontisら、2012、PLoS One.7、e33338;Giordanoら、2007、Mol.Vis.13、1842−1850)に分化されうる。成体wt及びrd1マウス由来の網膜幹細胞を、2mg/mlのディスパーゼ(20分)、続いて1.33mg/mlのトリプシン、0.67mg/ml、ヒアルロニダーゼ、及び0.13mg/mlのキヌレン酸(10分)で処置した後の毛様体上皮から単離し、DMEM−F12中に20ng/mlの塩基性FGF、2μg/mlのヘパリン、0.6%グルコース、N2ホルモンミックスを含む無血清培地で1週間培養し、ニューロスフェア(Giordanoら、2007、上掲)を形成させた。次いで、網膜ニューロスフェアを、20ng/mlのFGFを補足したDMEM−F12中細胞外マトリックス(ECM、Sigma)で被覆したガラススライド上で4日間平板培養した。1%FBSを補足したDMEM−F12中で細胞を分化させた。rd1分化網膜細胞は、先に開示されているように(Sangesら、2006、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.103、17366−17371)、分化の11日目で細胞死プログラムを活性化させた。分化の10日目(細胞死経路の活性化の1日前)に、細胞を様々な用量のLP−DF003に曝露させた。LP−DF003を用いた処置の16時間後、細胞を、4%パラホルムアルデヒドを用いて室温で10分間固定した。細胞死は、2μMのエチジウムホモダイマーを用いて細胞を2分間染色し、DAPI(4’,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール、Sigma)を用いて核を対比染色することにより評価した。スライドを、mowioll 4−88(Sigma)を用いてマウントし、Zeiss Axioskop40蛍光顕微鏡で解析した。エチジウムホモダイマー陽性細胞を、各スライドで計数し、1スライドあたりの全細胞数(DAPI染色)に対する割合(%)として表した。対応Studentt検定分析により、少なくとも3種の異なる未処置及び少なくとも3種の異なる処置rd1網膜細胞から誘導されたデータを比較した。
生化学解析並びにモデル及びwt組織間の比較について、我々は、典型的に、網膜変性の開始に相当する時期からの材料を使用している。網膜組織を、生後5日目(PN5)の動物から取得し、屠殺後、眼を眼球摘出し、網膜を網膜外植として培養する。簡単に述べると、網膜色素上皮(RPE)がまだ付着している網膜を単離し、続いてMillicell培養皿フィルターインサート(Millipore AB、Solna、スウェーデン;PIHA03050)に移し、RPE層を培養膜に向ける。次いで、外植をカスタムメードのR16栄養培地中37℃でインキュベートする。栄養培地は、1皿あたり1.5mlの体積とし、培養期間中、通常(実際の培養パラダイムが別途要求しない限り)2日ごとに新鮮培地に置き換える。
薬物又は薬物/DDS組合せで処置する前に、動物をジエチルエーテルで麻酔した。全身処置では、リポソームDDS/薬物製剤を含有する0.9%NaCl溶液を、麻酔動物の尾静脈内(尾部静脈;静脈内;i.v.;50μl)又は腹膜内(腹腔内;i.p.;200μl)のいずれかで注射した。rd10マウスでは、局所硝子体内(IVT)処置も試験した。ここで動物は、一方の眼の硝子体内に0.5μlの注射を受け、他方の眼は未処置のまま、対側性対照とした。i.p.及びIVT処置の両方で、DF003を含まないリポソーム製剤(つまり「空の」リポソーム)をさらなる対照として使用した。
in vitro及びin vivo処置実験についての読取りは、標準の組織化学組織染色で見られるように、細胞死マーカーTUNELで陽性染色された光受容体細胞の定量及び/又は生存光受容体の列の計数で構成した。いずれの場合においても、結果を顕微鏡及びデジタルカメラで取り、手動又は半自動で解析し、次いで、先に開示された原理(Arango−Gonzalezら、2014、PLoS One.9、e112142)で、記録されたデータの統計学的有意性について計算した。
2.1 LP−DF003による光受容体のin vitro及びin vivo保護
200を超える新規cGMPアナログを生成し、このうち140を、無細胞アッセイでPKGに結合する能力について試験した(Zegzoutiら、2009、Assay.Drug Dev.Technol.7、560−572)。これらのうち、強力なPKG結合を示した33の化合物を、網膜色素変性症変異マウスから誘導された661W細胞株及び光受容体様細胞培養(Sangesら、2006、上掲)でさらにin vitro解析して選択した。この細胞ベースのスクリーニングアッセイにより、網膜色素変性症変異により引き起こされる細胞死を減少させることができ、したがって光受容体保護活性を示した、11の化合物を特定した。次いで、これらの11の化合物を、野生型、rd1(Sanyal and Bal 1973、Z.Anat.Entwicklungsgesch.142、219−238)又はrd2マウス(Sanyal and Jansen 1981、Neurosci.Lett.21、23−26)のいずれかから誘導された器官型網膜外植培養(Sahabogluら、2013、Cell Death & Disease 4)でさらに試験した。網膜組織培養により、有望な神経保護効果を有するcGMPアナログの数を、in vitroでrd1及びrd2光受容体の細胞死を顕著に減少させることが分かった4つの化合物に絞り込んだ。
活性化合物DF003は、cGMPのアナログであり、PKG活性を非常に特異的に阻害する。この阻害は特にPKG1a及びPKGipアイソフォームに当てはまる一方で、PKG2はあまり阻害されない。2つの他の潜在標的CNGC及びプロテインキナーゼA(PKA)アイソフォーム1及び2の阻害定数は、PKGアイソフォームの阻害定数よりも2〜3log単位高い(表2)。cGMP及びそのアナログは、PKG及びCNGCを標的とするが、PKA、PDE又はさらにHCNチャネル活性も干渉しうる。表に、これらの標的に対するDF003の阻害定数(K)及び(入手可能な場合に)IC50値を示す。
遊離DF003又はLP−DF003のいずれかの単回注射を初回用量20mg/kgで受けた成体ラット(3ヶ月齢)において、薬物動態試験を実施した。結果を図4に示す。遊離DF003は、非常に迅速に血流から排出されるが(推定半減期:10〜15分)、LP−DF003を投与したときは、DF003が高レベルで血流内に留まる。ここで推定半減期は、90〜100倍の半減期延長に相当する24時間であった。
最大2ヶ月間LP−DF003(i.p.)で処置したマウス及びラット並びに未処置対照を、in vivoで死後にルーチン的に検査したが、薬物の毒性作用について何ら肉眼的証拠は見られなかった。
Claims (13)
- cGMP作動性細胞標的の調節不全に関連する病理、状態又は障害を処置するための治療剤を含む、薬学的に許容されるナノ容器であって、
治療剤が、式II:
(式中、X 2 が、水素、−F、−Cl、−Br、−I、CF 3 、又は−NR 9 R 10 若しくは−SR 11 基であり、R 9 が水素であり、R 10 及びR 11 の両方が末端NH 2 又はOH基を有するアルキル基であり、
R 8 が水素、(トリ)アルキルシリル基、又はアシル基であり、
Lが酸素、硫黄、ボラノ(BH3)若しくはさらに置換されたボラノ基であって、MがOHであるか、又は
LがOHであって、Mが酸素、硫黄、ボラノ(BH3)若しくはさらに置換されたボラノ基であり、
Kat + が、プロトン又は別の生理学的に許容される金属カチオン若しくはトリアルキルアンモニウムイオンである)
に従う環状グアノシン−3’,5’−モノホスフェートアナログである、ナノ容器。 - グルタチオントランスポーターに対するリガンドにコンジュゲートされている、請求項1に記載のナノ容器。
- リガンドが、グルタチオン、S−(p−ブロモベンジル)グルタチオン、ガンマ−(L−ガンマ−アザグルタミル)−S−(p−ブロモベンジル)−L−システイニルグリシン、S−ブチルグルタチオン、S−デシルグルタチオン、還元型グルタチオンエチルエステル、グルタチオンスルホン酸、S−ヘキシルグルタチオン、S−ラクトイルグルタチオン、S−メチルグルタチオン、S−(4−ニトロベンジル)グルタチオン、S−オクチルグルタチオン、S−プロピルグルタチオン、n−ブタノイルガンマ−グルタミルシステイニルグリシン、エタノイルガンマ−グルタミルシステイニルグリシン、ヘキサノイルガンマ−グルタミルシステイニルグリシン、オクタノイルガンマ−グルタミルシステイニルグリシン、ドデカノイルガンマ−グルタミルシステイニルグリシン、GSHモノイソプロピルエステル(N−(N−L−グルタミル−L−システイニル)グリシン1−イソプロピルエステル硫酸塩一水和物)、並びに式V:
(式中、Z=CH2及びY=CH2、又はZ=O及びY=C=Oであり、
Ri及びR2が独立して、H、直鎖若しくは分岐のアルキル(1〜25C)、アラルキル(6〜26C)、シクロアルキル(6〜25C)、複素環(6〜20C)、エーテル又はポリエーテル(3〜25C)からなる群から選択され、ここでR1−R2は一緒になって、2〜20C原子を有し、式VIの残部と共に大環状分子を形成し、
R3が、H及びCH3からなる群から選択され、
R4が、6〜8Cアルキル、ベンジル、ナフチル及び治療的に活性な環状グアノシン−3’,5’−モノホスホロチオエートからなる群から選択され、
R5が、H、フェニル、CH3−及びCH2−フェニルからなる群から選択される)
のグルタチオン誘導体又はその薬学的に許容される塩からなる群から選択され、
好ましくは式Iの誘導体において、R3がHであり、R4がベンジルであり、R5がフェニルである、請求項2又は3に記載のナノ容器。 - ナノ容器が、治療剤又は診断剤を封入するリポソームであり、グルタチオントランスポーターに対するリガンドは、コンジュゲーション剤の1端に結合されたビタミンE誘導体若しくはリン脂質とコンジュゲーション剤の他端に結合されたグルタチオントランスポーターに対するリガンドとを含む二官能性コンジュゲーション剤を介してリポソームにコンジュゲートされており、好ましくは、コンジュゲーション剤が約6〜210の重合数(n)を有するポリエチレングリコールであり、より好ましくは、ポリエチレングリコールが1,000〜5,000Daの分子量を有する、請求項1〜4のいずれか一項に記載のナノ容器。
- コンジュゲーション剤が、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール−マレイミド(DSPE−PEG−MAL)を、マレイミド反応性チオール基を有するグルタチオン受容体に対するリガンドと反応させることにより取得可能であり、好ましくは、DSPE−PEG−MALが約2,000Daの分子量を有する、請求項5に記載のナノ容器。
- グルタチオン受容体に対するリガンドが、グルタチオンである、請求項1〜6のいずれか一項に記載のナノ容器。
- 請求項1〜7のいずれか一項に記載のナノ容器と薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
- 網膜色素変性症の処置に使用するための、請求項1〜7のいずれか一項に記載のナノ容器。
- 全身又は局所的に投与される、請求項9に記載の使用のためのナノ容器。
- a)硝子体内、静脈内、腹腔内及び動脈内経路のうちの少なくとも1つによる注射又は注入、並びに
b)表面適用又は眼適用
のうちの少なくとも1つにより投与される、請求項10に記載の使用のためのナノ容器。 - 0.1〜1000mg/kgの用量で、1又は2日あたり1回投与される、請求項9に記載の使用のためのナノ容器。
- 0.0005〜0.02mg/kgの用量で、2週間に1回又は6週間に1回、硝子体内投与される、請求項9に記載の使用のためのナノ容器。
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