JP6733079B2 - Reagent for measuring anti-glycolipid antibody in sample and measuring method - Google Patents
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Description
本発明は、糖脂質抗原を用いた試料中の抗糖脂質抗体の測定に関するものである。
本発明は、糖脂質分野、生化学分野、分析化学分野、臨床検査分野及び生命科学分野等において重要なものであるが、特に神経疾患等の診断において重要なものである。
The present invention relates to the measurement of anti-glycolipid antibody in a sample using a glycolipid antigen.
INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention is important in the fields of glycolipids, biochemistry, analytical chemistry, clinical examinations, life sciences, etc., but is particularly important in the diagnosis of neurological diseases and the like.
糖脂質は、従来より神経組織に多く存在することが知られており、神経組織の糖脂質に反応する抗体が体液中に産生されると重篤な神経症状を起こすことが知られるようになってきた。
これらの自己抗体は、先行感染した菌体に対するものとして体内に産生され、これが神経組織の糖脂質抗原と交差反応し、自己抗体として神経を傷害する自己免疫型の神経疾患を起こすことが知られている。
Glycolipids have long been known to exist in nerve tissues, and it has become known that when antibodies that react with glycolipids in nerve tissues are produced in body fluids, severe neurological symptoms occur. Came.
It is known that these autoantibodies are produced in the body against the pre-infected bacterial cells, which cross-react with glycolipid antigens of nerve tissue and cause autoimmune neurological diseases that damage nerves as autoantibodies. ing.
例えば、糖脂質抗原に対する抗体（抗糖脂質抗体）の一つであるＩｇＧ型の抗ＧＭ１ａ抗体は、急性軸策型ギラン・バレー症候群などの運動神経疾患に関与することが知られている。
急性軸策型ギラン・バレー症候群の場合、食中毒菌として知られる菌体Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉが先行感染し、菌体のリポ多糖（ＬＰＳ）上のＧＭ１ａと類似の糖鎖構造部分に対する抗体が体内に産生されることにより発病する（例えば、非特許文献１）。
そして、この抗体は血液中に見い出されることが判明している（例えば、非特許文献２及び非特許文献３）。
For example, it is known that IgG type anti-GM1a antibody, which is one of the antibodies against glycolipid antigens (anti-glycolipid antibody), is involved in motor nerve diseases such as acute axon type Guillain-Barre syndrome.
In the case of acute axon type Guillain-Barre syndrome, a bacterium Campylobacter jejuni known as a food poisoning bacterium is pre-infected and an antibody against a sugar chain structure portion similar to GM1a on lipopolysaccharide (LPS) of the bacterium is produced in the body. It causes the disease (for example, Non-Patent Document 1).
It has been found that this antibody is found in blood (for example, Non-Patent
また、別の抗糖脂質抗体であるＩｇＧ型の抗ＧＱ１ｂ抗体は、フィッシャー症候群やビッカースタッフ型脳幹脳炎などの神経疾患に関与しており、その所見は脳幹梗塞などの他の中枢神経系疾患と類似しているが、その治療法は全く異なる。
そして、この抗体も患者血清中に見い出されることが判明している（例えば、非特許文献４及び非特許文献５）。
その他、感覚失調型ポリニューロパシーで抗ＧＤ２抗体、抗ＧＴ１ｂ抗体、抗ＧＱ１ｂ抗体が上昇するとの報告や感覚神経疾患で抗スルファチド抗体が高いとの報告がある。
また、糖脂質抗原と反応する抗体が癌患者由来試料より検出されるとの報告もある。
Another anti-glycolipid antibody, IgG-type anti-GQ1b antibody, is involved in neurological diseases such as Fisher's syndrome and Vickerstaff's brainstem encephalitis, and its findings are associated with other central nervous system diseases such as brainstem infarction. Although similar, the treatment is completely different.
It has been found that this antibody is also found in the serum of patients (for example, Non-Patent
In addition, there are reports that anti-GD2 antibody, anti-GT1b antibody and anti-GQ1b antibody are elevated in sensory ataxia-type polyneuropathy and that antisulfatide antibody is high in sensory nerve disease.
There are also reports that antibodies that react with glycolipid antigens are detected in cancer patient-derived samples.
以上のように、研究レベルでは各種疾患と抗糖脂質抗体の関係が解き明かされ、臨床現場で使用できる抗糖脂質抗体の測定方法として、ＥＬＩＳＡ法による測定が実用化されている（例えば、非特許文献６）。 As described above, at the research level, the relationship between various diseases and anti-glycolipid antibodies has been clarified, and the measurement by the ELISA method has been put into practical use as a measurement method for anti-glycolipid antibodies that can be used in clinical settings (for example, non-patent literature). Reference 6).
しかしながら、抗糖脂質抗体の測定方法として使用されているＥＬＩＳＡ法は、検体によっては、その測定の感度が十分でないという問題があった。このため、試料中の抗糖脂質抗体の測定値を疾患の検査に利用しようとする場合、この疾患の診断を誤らせる可能性があった。
従って、試料中の抗糖脂質抗体を、糖脂質抗原と抗原抗体反応させることにより測定を行う場合、更なる測定感度の改善が望まれていた。
However, the ELISA method used as a method for measuring an anti-glycolipid antibody has a problem that the measurement sensitivity is insufficient depending on the sample. Therefore, when the measured value of the anti-glycolipid antibody in the sample is to be used for the examination of the disease, there is a possibility that the diagnosis of the disease may be erroneous.
Therefore, when the measurement is carried out by reacting the anti-glycolipid antibody in the sample with the glycolipid antigen, the further improvement in measurement sensitivity has been desired.
従って、本発明の課題は、糖脂質抗原との抗原抗体反応による試料中の抗糖脂質抗体の測定を高感度に行えるようにし、正確な測定結果が得られる方法を提供することである。 Therefore, an object of the present invention is to provide a method which enables highly sensitive measurement of anti-glycolipid antibody in a sample by an antigen-antibody reaction with a glycolipid antigen and obtains accurate measurement results.
本発明者は、上記課題の解決を目指して鋭意検討を行った結果、試料中の抗糖脂質抗体を、糖脂質抗原と抗原抗体反応させることにより測定する測定試薬及び測定方法において、イオン強度を０．１７ｍｏｌ／Ｌ以下にすることで、測定の感度を改善できることを初めて見出し、本発明を完成するに至った。 The present inventor, as a result of intensive studies aimed at solving the above problems, the anti-glycolipid antibody in the sample, in the measuring reagent and the measuring method for measuring by reacting the glycolipid antigen and the antigen-antibody, in the ionic strength For the first time, the inventors have found that the sensitivity of measurement can be improved by setting the concentration to 0.17 mol/L or less, and completed the present invention.
すなわち、本発明は、以下の発明を提供する。
（１）試料中の抗糖脂質抗体を、糖脂質抗原と抗原抗体反応させることにより測定する測定試薬において、イオン強度が０．１７ｍｏｌ／Ｌ以下であることを特徴とする測定試薬。
（２）糖脂質抗原がガングリオシド抗原である、前記（１）記載の測定試薬。
（３）糖脂質抗原が担体に固定化されたものである、前記（１）又は（２）に記載の測定試薬。
（４）試料中の抗糖脂質抗体を、糖脂質抗原と抗原抗体反応させることにより測定する方法において、該抗原抗体反応の反応時のイオン強度が０．１７ｍｏｌ／Ｌ以下であることを特徴とする測定方法。
（５）糖脂質抗原がガングリオシド抗原である、前記（４）記載の測定方法。
（６）糖脂質抗原が担体に固定化されたものである、前記（４）又は（５）に記載の測定方法。
That is, the present invention provides the following inventions.
(1) A measurement reagent for measuring an anti-glycolipid antibody in a sample by reacting a glycolipid antigen with an antigen-antibody, which has an ionic strength of 0.17 mol/L or less.
(2) The measurement reagent according to (1) above, wherein the glycolipid antigen is a ganglioside antigen.
(3) The measurement reagent according to (1) or (2) above, wherein the glycolipid antigen is immobilized on a carrier.
(4) In a method for measuring an anti-glycolipid antibody in a sample by reacting a glycolipid antigen with an antigen-antibody, the ionic strength at the time of the antigen-antibody reaction is 0.17 mol/L or less, How to measure.
(5) The measurement method according to (4) above, wherein the glycolipid antigen is a ganglioside antigen.
(6) The measurement method according to (4) or (5) above, wherein the glycolipid antigen is immobilized on a carrier.
本発明によれば、試料中の抗糖脂質抗体を、糖脂質抗原と抗原抗体反応させることにより測定する測定試薬及び測定方法において、イオン強度を０．１７ｍｏｌ／Ｌ以下にすることで、抗糖脂質抗体の測定を高感度に行え、正確な測定結果が得られるものである。 According to the present invention, in the measuring reagent and the measuring method for measuring the anti-glycolipid antibody in the sample by reacting the glycolipid antigen with the antigen-antibody, the anti-sugar can be adjusted to have an ionic strength of 0.17 mol/L or less. The lipid antibody can be measured with high sensitivity and an accurate measurement result can be obtained.
以下、本発明を詳細に説明するが、以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明はこの実施の形態に限定されるものではない。また、本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施することができる。 Hereinafter, the present invention will be described in detail, but the following embodiments are examples for describing the present invention, and the present invention is not limited to these embodiments. Further, the present invention can be implemented in various forms without departing from the gist thereof.
〔１〕発明の基本要件
本発明の測定試薬及び測定方法では、試料中の抗糖脂質抗体の測定において、イオン強度を０．１７ｍｏｌ／Ｌ以下にすることが必須である。
このことにより、試料中の抗糖脂質抗体の測定に当たり、測定感度を上昇させることができる。
[1] Basic Requirements of the Invention In the measuring reagent and the measuring method of the present invention, it is essential that the ionic strength be 0.17 mol/L or less in the measurement of the anti-glycolipid antibody in the sample.
This makes it possible to increase the measurement sensitivity when measuring the anti-glycolipid antibody in the sample.
〔２〕糖脂質抗原
本発明において、糖脂質抗原とは、その分子内に水溶性糖鎖と脂溶性基の両者を含む物質（糖脂質）であり、測定を行おうとする抗糖脂質抗体と特異的に結合することが可能な物質のことである。
[2] Glycolipid antigen In the present invention, the glycolipid antigen is a substance (glycolipid) containing both a water-soluble sugar chain and a fat-soluble group in its molecule, and is an anti-glycolipid antibody to be measured. A substance that can be specifically bound.
本発明における糖脂質抗原には、スフィンゴ糖脂質、及びグリセロ糖脂質等が含まれるものである。 The glycolipid antigen in the present invention includes glycosphingolipid, glyceroglycolipid and the like.
また、本発明における糖脂質抗原には、シアル酸を含む糖脂質であるガングリオシド、硫酸を含む糖脂質であるスルファチド（スルホリピド）、ウロン酸を含む糖脂質、又はリン酸を含む糖脂質などの酸性糖脂質、及び中性糖脂質等が含まれるものである。 Further, the glycolipid antigen in the present invention includes a ganglioside, which is a glycolipid containing sialic acid, a sulfatide (sulpholipid), which is a glycolipid containing sulfuric acid, a glycolipid containing uronic acid, or a glycolipid containing phosphoric acid. It includes glycolipids and neutral glycolipids.
なお、ガングリオシド（シアロ糖脂質）は、シアル酸を含むスフィンゴ糖脂質の総称である。
このガングリオシドとしては、例えば、ＧＭ１、ＧＭ１ｂ、ＧＭ１−Ｆｕｃ、ＧＭ２、ＧＭ３、ＧＭ３（ＮｅｕＧｃ）、ＧＭ４、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＤ３（ＮｅｕＡｃ／ＮｅｕＧｃ）、ＧＤ３（ＮｅｕＧｃ）２、ＧＴ１ａ、ＧＴ１ｂ、ＧＴ１ｃ、ＧＱ１ａ、ＧＱ１ｂ、ＧＱ１ｃ、ＧＰ１ａ、ＧＰ１ｂ、ＧＰ１ｃ、又はＬＭ１等を挙げることができる。
Note that ganglioside (sialoglycolipid) is a general term for glycosphingolipids containing sialic acid.
Examples of this ganglioside include GM1, GM1b, GM1-Fuc, GM2, GM3, GM3(NeuGc), GM4, GD1a, GD1b, GD2, GD3, GD3(NeuAc/NeuGc), GD3(NeuGc1G2) and GD3(NeuGc). , GT1c, GQ1a, GQ1b, GQ1c, GP1a, GP1b, GP1c, LM1 and the like.
本発明においては、糖脂質抗原がガングリオシド（ガングリオシド抗原）である場合に好適である。 In the present invention, it is suitable when the glycolipid antigen is a ganglioside (ganglioside antigen).
〔３〕抗糖脂質抗体
本発明において、抗糖脂質抗体は、前記した糖脂質抗原に対して特異的に結合することができる抗体である。
[3] Anti-Glycolipid Antibody In the present invention, the anti-glycolipid antibody is an antibody capable of specifically binding to the glycolipid antigen described above.
本発明における抗糖脂質抗体としては、例えば、スフィンゴ糖脂質に対する抗体、又はグリセロ糖脂質に対する抗体等を挙げることができる。 Examples of the anti-glycolipid antibody in the present invention include an antibody against glycosphingolipid, an antibody against glyceroglycolipid, and the like.
更に、本発明において、抗糖脂質抗体としては、例えば、酸性糖脂質に対する抗体、又は中性糖脂質に対する抗体等を挙げることができる。 Furthermore, in the present invention, examples of the anti-glycolipid antibody include antibodies against acidic glycolipids and antibodies against neutral glycolipids.
そして、酸性糖脂質に対する抗体としては、例えば、ガングリオシドに対する抗体、スルファチドに対する抗体、ウロン酸を含む糖脂質に対する抗体、又はリン酸を含む糖脂質に対する抗体等を挙げることができる。 Examples of the antibody against acidic glycolipid include an antibody against ganglioside, an antibody against sulfatide, an antibody against glycolipid containing uronic acid, an antibody against glycolipid containing phosphoric acid, and the like.
また、ガングリオシドに対する抗体としては、例えば、抗ＧＭ１抗体、抗ＧＭ１ｂ抗体、抗ＧＭ１−Ｆｕｃ抗体、抗ＧＭ２抗体、抗ＧＭ３抗体、抗ＧＭ３（ＮｅｕＧｃ）抗体、抗ＧＭ４抗体、抗ＧＤ１ａ抗体、抗ＧＤ１ｂ抗体、抗ＧＤ２抗体、抗ＧＤ３抗体、抗ＧＤ３（ＮｅｕＡｃ／ＮｅｕＧｃ）抗体、抗ＧＤ３（ＮｅｕＧｃ）２抗体、抗ＧＴ１ａ抗体、抗ＧＴ１ｂ抗体、抗ＧＴ１ｃ抗体、抗ＧＱ１ａ抗体、抗ＧＱ１ｂ抗体、抗ＧＱ１ｃ抗体、抗ＧＰ１ａ抗体、抗ＧＰ１ｂ抗体、抗ＧＰ１ｃ抗体、又は抗ＬＭ１抗体等を挙げることができる。 Examples of the antibody against ganglioside include anti-GM1 antibody, anti-GM1b antibody, anti-GM1-Fuc antibody, anti-GM2 antibody, anti-GM3 antibody, anti-GM3 (NeuGc) antibody, anti-GM4 antibody, anti-GD1a antibody, anti-GD1b antibody. , Anti-GD2 antibody, anti-GD3 antibody, anti-GD3(NeuAc/NeuGc) antibody, anti-GD3(NeuGc)2 antibody, anti-GT1a antibody, anti-GT1b antibody, anti-GT1c antibody, anti-GQ1a antibody, anti-GQ1b antibody, anti-GQ1c antibody, Examples thereof include anti-GP1a antibody, anti-GP1b antibody, anti-GP1c antibody, anti-LM1 antibody and the like.
本発明においては、抗糖脂質抗体がガングリオシドに対する抗体である場合に好適である。 In the present invention, it is suitable when the anti-glycolipid antibody is an antibody against ganglioside.
〔４〕イオン強度
本発明では、試料中の抗糖脂質抗体の測定試薬及び測定方法において、イオン強度を０．１７ｍｏｌ／Ｌ以下とすることにより、測定感度を上昇させることができる。
[4] Ionic Strength In the present invention, the measurement sensitivity can be increased by setting the ionic strength to 0.17 mol/L or less in the measuring reagent and measuring method for the anti-glycolipid antibody in the sample.
そして、イオン強度を０．１５ｍｏｌ／Ｌ以下にすることが、測定感度をより上昇させることができるため好ましい。同じ理由により、イオン強度を０．１０ｍｏｌ／Ｌ以下にすることが更に好ましい。 It is preferable that the ionic strength is 0.15 mol/L or less because the measurement sensitivity can be further increased. For the same reason, it is more preferable that the ionic strength is 0.10 mol/L or less.
なお、本発明の試料中の抗糖脂質抗体の測定において、イオン強度を０．１７ｍｏｌ／Ｌ以下にするには、例えば、試料中の糖脂質抗体の測定試薬及び測定方法に、陽イオン及び陰イオンを含有又は存在させることにより行えばよい。 In the measurement of the anti-glycolipid antibody in the sample of the present invention, in order to reduce the ionic strength to 0.17 mol/L or less, for example, the measurement reagent and the measurement method for the glycolipid antibody in the sample should include cation and anion. It may be carried out by containing or existing ions.
また、本発明におけるイオン強度は、例えば、測定反応時に緩衝剤やアジ化ナトリウム等の防腐剤などが存在している場合は、それらのイオン強度を含めたトータルのイオン強度が０．１７ｍｏｌ／Ｌ以下となっていればよい。 The ionic strength in the present invention is, for example, when a buffering agent or a preservative such as sodium azide is present during the measurement reaction, the total ionic strength including those ionic strengths is 0.17 mol/L. It should be below.
〔５〕陽イオン及び陰イオン
本発明において、イオン強度の調整のために試料中の抗糖脂質抗体の測定試薬及び測定方法に含有又は存在させる陽イオン及び陰イオンについて、以下説明を行う。
[5] Cations and Anions In the present invention, the cations and anions contained or present in the measurement reagent and the measurement method for the anti-glycolipid antibody in the sample for adjusting the ionic strength will be described below.
（１）陽イオン
本発明において、陽イオンは、正の電荷を有するイオンであれば、特に限定されず用いることができる。
(1) Cation In the present invention, the cation can be used without particular limitation as long as it is an ion having a positive charge.
この陽イオンとしては、１価の陽イオンであってもよく、又は２価以上の多価の陽イオンであってもよい。 The cation may be a monovalent cation or a divalent or higher valent polyvalent cation.
そして、この陽イオンとしては、例えば、金属イオン、アンモニウムイオン、又はその他の陽イオン等を挙げることができる。 And as this cation, a metal ion, an ammonium ion, or another cation can be mentioned, for example.
この金属イオンとしては、例えば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、又はその他の金属イオン等を挙げることができる。
アルカリ金属イオンとしては、例えば、リチウムイオン、ナトリウムイオン、又はカリウムイオン等を挙げることができる。
アルカリ土類金属イオンとしては、例えば、ベリリウムイオン、マグネシウムイオン、又はカルシウムイオン等を挙げることができる。
その他の金属イオンとしては、例えば、マンガンイオン、鉄イオン、コバルトイオン、ニッケルイオン、銅イオン、亜鉛イオン、又はアルミニウムイオン等を挙げることができる。
Examples of this metal ion include alkali metal ions, alkaline earth metal ions, and other metal ions.
Examples of the alkali metal ion include lithium ion, sodium ion, potassium ion and the like.
Examples of the alkaline earth metal ion include beryllium ion, magnesium ion, calcium ion and the like.
Examples of other metal ions include manganese ion, iron ion, cobalt ion, nickel ion, copper ion, zinc ion, and aluminum ion.
アンモニウムイオンとしては、例えば、一級のアンモニウムイオン、二級のアンモニウムイオン、三級のアンモニウムイオン、又は四級のアンモニウムイオン等を挙げることができる。 Examples of ammonium ions include primary ammonium ions, secondary ammonium ions, tertiary ammonium ions, and quaternary ammonium ions.
その他の陽イオンとしては、例えば、炭素原子、ケイ素原子、ホウ素原子、窒素原子（アンモニウムイオン以外の場合において）、リン原子、若しくは硫黄原子などが正の電荷を帯びている原子、又は原子団等を挙げることができる。
この具体的な例としては、炭素原子が正の電荷を帯びているコリンイオン等を挙げることができる。
Other cations include, for example, carbon atoms, silicon atoms, boron atoms, nitrogen atoms (in the case other than ammonium ions), phosphorus atoms, sulfur atoms, or other atoms having a positive charge, or atomic groups, etc. Can be mentioned.
A concrete example of this is a choline ion in which a carbon atom has a positive charge.
なお、この陽イオンとしては、１種類のものだけを用いてもよいし、又は複数種類のものを同時に用いてもよい。 As the cation, only one kind may be used, or plural kinds may be used at the same time.
（２）陰イオン
本発明において、陰イオンは、負の電荷を有するイオンであれば、特に限定されず用いることができる。
(2) Anion In the present invention, the anion can be used without particular limitation as long as it is an ion having a negative charge.
この陰イオンとしては、１価の陰イオンであってもよく、又は２価以上の多価の陰イオンであってもよい。 The anion may be a monovalent anion or a polyvalent anion having two or more valences.
そして、この陰イオンとしては、例えば、有機化合物よりなる酸基、ハロゲンイオン、又はその他の無機化合物よりなる酸基等を挙げることができる。 And as this anion, the acid group which consists of an organic compound, a halogen ion, or the acid group which consists of other inorganic compounds can be mentioned, for example.
この有機化合物よりなる酸基としては、例えば、酢酸イオン、クエン酸イオン、グルコン酸イオン、又はシュウ酸イオン等を挙げることができる。 Examples of the acid group composed of this organic compound include acetate ion, citrate ion, gluconate ion, and oxalate ion.
ハロゲンイオンとしては、例えば、フッ素イオン、塩素イオン、臭素イオン、又はヨウ素イオン等を挙げることができる。 Examples of the halogen ion include a fluorine ion, a chlorine ion, a bromine ion, an iodine ion and the like.
その他の無機化合物よりなる酸基としては、例えば、硫酸イオン、亜硫酸イオン、ピロ亜硫酸イオン、亜二チオン酸イオン、チオ亜硫酸イオン、硝酸イオン、亜硝酸イオン、次亜硝酸イオン、ペルオキソ亜硝酸イオン、リン酸イオン、亜リン酸イオン、ピロ亜リン酸イオン、次亜リン酸イオン、二リン酸イオン、ホウ酸イオン、炭酸イオン、シアン酸イオン、イソシアン酸イオン、又はケイ酸イオン等を挙げることができる。 Examples of the acid group composed of other inorganic compounds include, for example, sulfate ion, sulfite ion, pyrosulfite ion, dithionite ion, thiosulfite ion, nitrate ion, nitrite ion, hyponitrite ion, peroxonitrite ion, Examples include phosphate ion, phosphite ion, pyrophosphite ion, hypophosphite ion, diphosphate ion, borate ion, carbonate ion, cyanate ion, isocyanate ion, or silicate ion. it can.
また、この陰イオンとしては、１種類のものだけを用いてもよいし、又は複数種類のものを同時に用いてもよい。 Further, as this anion, only one type may be used, or a plurality of types may be used simultaneously.
また、前記の陽イオン及び陰イオンを含有又は存在させる方法であるが、この陽イオン及び陰イオンを、糖脂質抗原と試料中の抗糖脂質抗体との抗原抗体反応が行われる測定反応時に、イオン強度を０．１７ｍｏｌ／Ｌ以下にすることができればいかなる方法でも良い。 Further, it is a method of containing or present the above-mentioned cation and anion, the cation and anion, during the measurement reaction in which the antigen-antibody reaction between the glycolipid antigen and the anti-glycolipid antibody in the sample is carried out, Any method can be used as long as the ionic strength can be set to 0.17 mol/L or less.
例えば、前記陽イオンを含む化合物と、前記陰イオンを含む化合物を別々に添加することにより含有又は存在させて、測定試薬を調製してもよい。
また、前記陽イオンと前記陰イオンの両方を含む化合物を添加することにより含有又は存在させて、測定試薬を調製してもよい。
そしてその結果として、前記陽イオン及び前記陰イオンを各々前記の試料中の抗糖脂質抗体の測定試薬及び測定方法にイオン強度が０．１７ｍｏｌ／Ｌ以下となるように存在させられればよい。
For example, the measurement reagent may be prepared by adding or containing the compound containing the cation and the compound containing the anion separately.
Further, the measurement reagent may be prepared by adding or containing a compound containing both the cation and the anion.
Then, as a result, the cation and the anion may be present in the measurement reagent and the measurement method for the anti-glycolipid antibody in the sample so that the ionic strength is 0.17 mol/L or less.
また、前記の陽イオンと陰イオンの両方を含む化合物としては、例えば、この陽イオン及び陰イオンよりなる塩等を挙げることができる。 Examples of the compound containing both the cation and the anion include salts of the cation and the anion.
なお、本発明においては、例えば、前記の陽イオン及び陰イオンをイオン強度が０．１７ｍｏｌ／Ｌ以下となるように含有させた試料希釈液を調製し、この試料希釈液と試料との混合物と、糖脂質抗原を固定化した担体を含む試薬とを混合することによって、担体に固定化された糖脂質抗原と試料に含まれていた抗糖脂質抗体との、抗原抗体反応が行われる測定反応時に、陽イオン及び陰イオンを存在させるようにするのが好ましい。 In the present invention, for example, a sample diluent containing the above-mentioned cations and anions so as to have an ionic strength of 0.17 mol/L or less is prepared, and a mixture of the sample diluent and the sample is prepared. , A measurement reaction in which an antigen-antibody reaction is performed between the glycolipid antigen immobilized on the carrier and the anti-glycolipid antibody contained in the sample by mixing the reagent containing the carrier on which the glycolipid antigen is immobilized Sometimes it is preferred to have cations and anions present.
〔６〕担体
本発明において、担体は、前記の糖脂質抗原を固定化することができるものであれば、特に制限なく用いることができる。
[6] Carrier In the present invention, any carrier can be used without particular limitation as long as it can immobilize the glycolipid antigen.
すなわち、糖脂質抗原との抗原抗体反応を利用して試料中の抗糖脂質抗体の測定を行う測定試薬及び測定方法に使用されている担体、又は使用することが可能な担体であればよい。 That is, any carrier may be used as long as it is a carrier that is used or can be used in a measurement reagent and a measurement method for measuring an anti-glycolipid antibody in a sample by utilizing an antigen-antibody reaction with a glycolipid antigen.
この担体の材質は、特に限定はなく、例えば、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ラテックス、リポソーム、ゼラチン、アガロース、セルロース、セファロース、ガラス、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなるマイクロカプセル、ビーズ、マイクロプレート（マイクロタイタープレート）、試験管、スティック又は試験片等の形状の固相担体を用いることができる。 The material of the carrier is not particularly limited, for example, polystyrene, polycarbonate, polyvinyltoluene, polypropylene, polyethylene, polyvinyl chloride, nylon, polymethacrylate, polyacrylamide, latex, liposome, gelatin, agarose, cellulose, sepharose, glass, It is possible to use solid phase carriers in the shape of microcapsules, beads, microplates (microtiter plates), test tubes, sticks, test pieces, or the like made of a material such as metal, ceramics or magnetic material.
本発明において、糖脂質抗原を担体に固定化することは、物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの併用等の公知の方法により行うことができる。 In the present invention, the glycolipid antigen can be immobilized on a carrier by a known method such as a physical adsorption method, a chemical binding method or a combination thereof.
例えば、化学的結合法により行う場合は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号 臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；日本生化学会編「新生化学実験講座１ タンパク質IV」，東京化学同人，１９９１年発行等に記載の公知の方法に従い、糖脂質抗原と、担体とを、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、糖脂質抗原と、担体の、それぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基又は水酸基等と前記の二価性の架橋試薬とを反応させること等により行うことができる。
For example, in the case of using the chemical binding method, "Clinical Pathology Extra Number Special Issue No. 53: Immunoassay for Clinical Testing -Technology and Application-", edited by The Japanese Society for Clinical Pathology, Clinical Pathology Publishing Association, 1983; Japan Biochemical Society According to a known method described in "Shinsei
更に、糖脂質抗原を固定化した担体の自然凝集や、非特異的反応等を抑制するために処理を行う必要があれば、糖脂質抗原を固定化した担体の表面又は内壁面に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カゼイン、ゼラチン、卵白アルブミン若しくはその塩などのタンパク質、界面活性剤又は脱脂粉乳等を接触させ被覆させること等の公知の方法により処理して、担体のブロッキング処理（マスキング処理）を行ってもよい。 Furthermore, if it is necessary to perform treatment for suppressing spontaneous aggregation of the carrier on which the glycolipid antigen is immobilized, non-specific reaction, etc., the surface or inner wall surface of the carrier on which the glycolipid antigen is immobilized may be treated with bovine serum. Albumin (BSA), human serum albumin (HSA), casein, gelatin, proteins such as ovalbumin or a salt thereof, a surfactant, a skim milk powder, etc. are treated by a known method such as contacting and coating to obtain a carrier. A blocking process (masking process) may be performed.
〔７〕試料
本発明において、試料とは、抗糖脂質抗体が存在する可能性があり、かつ抗糖脂質抗体の存在の有無、又は含有量（濃度）の測定を行おうとするものであれば、どのようなものでもよい。
このような試料としては、例えば、ヒト又は動物の血液、血清、血漿、髄液若しくは腹水などの体液、又は臓器、組織、若しくは筋肉などの抽出液、細胞若しくは菌体などの抽出液等、抗糖脂質抗体が含まれる可能性のあるものを挙げることができる。
[7] Sample In the present invention, the sample means that there is a possibility that an anti-glycolipid antibody is present and whether the presence or absence of the anti-glycolipid antibody or the content (concentration) is to be measured. , It can be anything.
Examples of such samples include body fluids such as human or animal blood, serum, plasma, cerebrospinal fluid or ascites fluid, or extracts such as organs, tissues or muscles, extracts such as cells or fungi, and the like. Those that may include glycolipid antibodies may be mentioned.
〔８〕測定方法
本発明の測定方法は、試料中の抗糖脂質抗体を、糖脂質抗原と抗原抗体反応させることにより測定する方法において、該抗原抗体反応の反応時のイオン強度が０．１７ｍｏｌ／Ｌ以下であることを特徴とするものである。
[8] Measuring Method The measuring method of the present invention is a method of measuring an anti-glycolipid antibody in a sample by reacting a glycolipid antigen with an antigen-antibody, and the ionic strength during the reaction of the antigen-antibody reaction is 0.17 mol. /L or less.
本発明の測定方法において、試料中の抗糖脂質抗体を、糖脂質抗原と抗原抗体反応させることにより測定を行う方法の測定原理は、特に制限はなく、どのような測定原理のものであってもよい。 In the measuring method of the present invention, the measuring principle of the method of measuring the anti-glycolipid antibody in the sample by reacting the glycolipid antigen with the antigen-antibody is not particularly limited, and any measuring principle can be used. Good.
例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）、酵素抗体法、蛍光抗体法、イムノクロマトグラフィー法、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応測定法、赤血球凝集反応法、粒子凝集反応法、特開平９−２２９９３６号公報及び特開平１０−１３２８１９号公報などに記載された測定対象物質（被検物質）に対する特異的結合物質が固定され、これで被覆された面を有する担体、及び測定対象物質（被検物質）に対する特異的結合物質が固定された粒子を用いる測定法、又はＤａｈｌｂｅａｃｋらが示したＥＬＳＡ法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ Ｌｉｇａｎｄｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，７９巻，７６７〜７７２頁，１９９８年発行；ＷＯ９８／２３９６３）等を挙げることができる。 For example, enzyme immunoassay (ELISA, EIA), fluorescence immunoassay (FIA), radioimmunoassay (RIA), luminescence immunoassay (LIA), enzyme antibody method, fluorescent antibody method, immunochromatography method, immuno ratio Turbidity method, latex nephelometry, latex agglutination assay, erythrocyte agglutination assay, particle agglutination assay, substances to be measured described in JP-A-9-229936 and JP-A-10-132819, etc. (Specific substance), a carrier having a surface coated with the substance, and a measurement method using particles to which the specific binding substance for the substance to be measured (test substance) is immobilized, or Dahlbeack et al. The ELSA method (Enzyme-linked Ligandsorbent Assay) (Thromb. Haemost., 79, 767-772, 1998; WO98/23963) and the like can be mentioned.
そして、本発明の測定方法を、酵素免疫測定などの標識免疫測定法を測定原理とする方法により実施する場合、サンドイッチ法、競合法、又は均一系法（ホモジニアス系法）等のいずれの手法においても本発明を適用することができる。 When the measuring method of the present invention is carried out by a method using a labeled immunoassay such as an enzyme immunoassay as a measurement principle, any method such as a sandwich method, a competitive method, or a homogeneous method (homogeneous method) The present invention can also be applied.
なお、本発明の測定方法においては、測定は用手法により行ってもよいし、又は分析装置等の装置を用いて行ってもよい。 In addition, in the measuring method of the present invention, the measurement may be performed by a manual method or may be performed by using an apparatus such as an analyzer.
また、測定は、１ステップ法（１試薬法）により行ってもよいし、又は２ステップ法（２試薬法）等の複数の操作ステップにより行う方法によって実施してもよい。 Further, the measurement may be performed by a one-step method (one-reagent method), or may be performed by a method of performing a plurality of operation steps such as a two-step method (two-reagent method).
なお、本発明の測定方法においては、いずれの測定原理（測定法）に基づいて実施するにしても、その測定原理（測定法）の公知の手法に従って、測定を行えばよい。 In the measuring method of the present invention, whichever measuring principle (measuring method) is used, the measurement may be performed according to a known method of the measuring principle (measuring method).
本発明の測定方法を、酵素免疫測定法などの標識免疫測定法を測定原理とする方法により実施する場合を例にとって、以下具体的に説明を行う。
標識免疫測定法のサンドイッチ法により測定を行う場合の一例を示す。
The measurement method of the present invention will be specifically described below by taking as an example a case where a method using a labeled immunoassay such as an enzyme immunoassay as a measurement principle is performed.
An example of measurement by the sandwich method of labeled immunoassay will be shown.
（１）まず、以下のものを用意する。
担体：測定を行おうとする抗糖脂質抗体と特異的に結合することができる糖脂質抗原を固定化した担体（例えば、抗ＧＭ１抗体の測定においては、ＧＭ１をウェルに固定化したマイクロタイタープレート）
試料希釈液：イオン強度が０．１７ｍｏｌ／Ｌ以下である溶液
(1) First, the following items are prepared.
Carrier: A carrier on which a glycolipid antigen capable of specifically binding to the anti-glycolipid antibody to be measured is immobilized (for example, in the measurement of anti-GM1 antibody, a microtiter plate in which GM1 is immobilized on a well)
Sample diluent: A solution having an ionic strength of 0.17 mol/L or less
（２）試料（ヒト血清）と試料希釈液との混合物を、担体の糖脂質抗原を固定化した部位に一定量添加し、一定時間接触させる。
これにより、試料中に測定対象物質である抗糖脂質抗体が存在する場合には、抗原抗体反応により、「担体−糖脂質抗原−抗糖脂質抗体」の結合を形成させる。（例えば、「マイクロタイタープレートのウェル−ＧＭ１−抗ＧＭ１抗体」）
(2) A certain amount of a mixture of a sample (human serum) and a sample diluent is added to the site of the carrier on which the glycolipid antigen is immobilized, and the mixture is kept in contact for a certain period of time.
As a result, when the anti-glycolipid antibody that is the substance to be measured is present in the sample, the “carrier-glycolipid antigen-anti-glycolipid antibody” bond is formed by the antigen-antibody reaction. (For example, "well of microtiter plate-GM1-anti-GM1 antibody")
（３）この試料の添加、接触と同時に、若しくは一定時間のうちに、又は洗浄の後に、前記の抗糖脂質抗体と特異的に結合することができる物質に酵素等の標識物質を結合させたものの一定量を、担体の糖脂質抗原を固定化した部位に添加して、一定時間接触させる。 (3) A labeling substance such as an enzyme was bound to the substance capable of specifically binding to the anti-glycolipid antibody, at the same time as the addition, contact, or after washing of this sample. A certain amount of one is added to the site of the carrier on which the glycolipid antigen is immobilized, and contact is made for a certain time.
なお、抗糖脂質抗体と特異的に結合することができる物質としては、例えば、この抗糖脂質抗体に対する抗体、又はこの抗糖脂質抗体と結合することができる抗原等を挙げることができる。 The substance capable of specifically binding to the anti-glycolipid antibody may be, for example, an antibody against the anti-glycolipid antibody or an antigen capable of binding to the anti-glycolipid antibody.
より具体的には、この抗糖脂質抗体に対する抗体としては、例えば、抗ヒトＩｇＧ抗体、抗ヒトＩｇＡ抗体、抗ヒトＩｇＭ抗体、抗ヒトＩｇＤ抗体、及び抗ヒトＩｇＥ抗体より選ばれる１種又は２種以上の抗体等を挙げることができる。 More specifically, the antibody against the anti-glycolipid antibody is, for example, one or two selected from anti-human IgG antibody, anti-human IgA antibody, anti-human IgM antibody, anti-human IgD antibody, and anti-human IgE antibody. There may be mentioned more than one kind of antibody.
また、この抗糖脂質抗体と結合することができる抗原としては、例えば、この抗糖脂質抗体と結合することができる糖脂質抗原等を挙げることができる。（例えば、抗糖脂質抗体が抗ＧＭ１抗体である場合には、ＧＭ１を挙げることができる。） Examples of the antigen capable of binding to the anti-glycolipid antibody include glycolipid antigen capable of binding to the anti-glycolipid antibody. (For example, when the anti-glycolipid antibody is the anti-GM1 antibody, GM1 can be mentioned.)
この操作により、試料中に測定対象物質である抗糖脂質抗体が存在する場合には、「担体−糖脂質抗原−抗糖脂質抗体−抗糖脂質抗体と特異的に結合することができる物質−標識物質」の結合が形成される。（例えば「マイクロタイタープレートのウェル−ＧＭ１−抗ＧＭ１抗体−抗ヒトＩｇＧ抗体−標識酵素」） By this operation, when the anti-glycolipid antibody that is the substance to be measured is present in the sample, "the substance capable of specifically binding to the carrier-glycolipid antigen-anti-glycolipid antibody-anti-glycolipid antibody- A "labeling substance" bond is formed. (For example, "well of microtiter plate-GM1-anti-GM1 antibody-anti-human IgG antibody-labeling enzyme")
（４）次に、担体に結合していない未結合の「標識物質を結合した、抗糖脂質抗体と特異的に結合することができる物質」を洗浄し、除去する。 (4) Next, unbound "labeled substance-bound substance capable of specifically binding to the anti-glycolipid antibody" that is not bound to the carrier is washed and removed.
（５）そして、「担体−糖脂質抗原−抗糖脂質抗体−抗糖脂質抗体と特異的に結合することができる物質−標識物質」の結合により担体に結合した標識物質を検出することにより、試料に含まれていた抗糖脂質抗体の測定を行う。 (5) Then, by detecting the labeling substance bound to the carrier by the binding of "carrier-glycolipid antigen-antiglycolipid antibody-substance capable of specifically binding to antiglycolipid antibody-labeling substance", The anti-glycolipid antibody contained in the sample is measured.
この測定においては、担体と標識物質が、試料に含まれていた抗糖脂質抗体を介して、「担体−糖脂質抗原−抗糖脂質抗体−抗糖脂質抗体と特異的に結合することができる物質−標識物質」と結合するので、担体に結合した標識物質の量を測定することにより、試料に含まれていた抗糖脂質抗体の有無、又は量を測定することができるものである。 In this measurement, the carrier and the labeling substance can specifically bind to “carrier-glycolipid antigen-antiglycolipid antibody-antiglycolipid antibody” via the antiglycolipid antibody contained in the sample. Since it binds to the "substance-labeling substance", the presence or absence or the amount of the anti-glycolipid antibody contained in the sample can be measured by measuring the amount of the labeling substance bound to the carrier.
なお、前記（３）において用いる「標識物質を結合した、抗糖脂質抗体と特異的に結合することができる物質」として、「標識物質を結合した、クラス別のヒト免疫グロブリンに対する抗体」を使用することにより、試料中の抗糖脂質抗体を免疫グロブリンのクラス別に測定することが可能となる。
このクラス別のヒト免疫グロブリンに対する抗体としては、例えば、抗ヒトＩｇＧ抗体、抗ヒトＩｇＡ抗体、抗ヒトＩｇＭ抗体、抗ヒトＩｇＤ抗体、又は抗ヒトＩｇＥ抗体等を挙げることができる。
In addition, as the “substance capable of specifically binding to an anti-glycolipid antibody bound to a labeling substance” used in the above ( 3 ), “antibody against human immunoglobulin of each class bound to a labeling substance” is used. By doing so, it becomes possible to measure the anti-glycolipid antibody in the sample for each immunoglobulin class.
Examples of antibodies to human immunoglobulins of this class include anti-human IgG antibody, anti-human IgA antibody, anti-human IgM antibody, anti-human IgD antibody, anti-human IgE antibody, and the like.
また、これらの「標識物質を結合した、クラス別のヒト免疫グロブリンに対する抗体」を、適当な割合で混合して使用することにより、免疫グロブリンのクラスに依存しない抗糖脂質抗体の測定を行うことができる。 In addition, by using these "antibodies against human immunoglobulins classified by class bound to a labeling substance" at an appropriate ratio, the measurement of anti-glycolipid antibody that does not depend on the immunoglobulin class can be performed. You can
更に、前記（３）において用いる「標識物質を結合した、抗糖脂質抗体と特異的に結合することができる物質」として、「標識物質を結合した、サブクラス別のヒト免疫グロブリンに対する抗体」を使用することにより、試料中の抗糖脂質抗体を免疫グロブリンのサブクラス別に測定することが可能となる。
このサブクラス別のヒト免疫グロブリンに対する抗体としては、例えば、抗ヒトカッパー（κ）抗体、抗ヒトラムダ（λ）抗体、抗ヒトＩｇＧ１抗体、抗ヒトＩｇＧ２抗体、抗ヒトＩｇＧ３抗体、又は抗ヒトＩｇＧ４抗体等を挙げることができる。
Furthermore, as the “substance capable of specifically binding to an anti-glycolipid antibody bound to a labeling substance” used in the above ( 3 ), “an antibody to a human immunoglobulin by subclass bound to a labeling substance” is used. By doing so, it becomes possible to measure the anti-glycolipid antibody in the sample for each immunoglobulin subclass.
Antibodies against human immunoglobulins of each subclass include, for example, anti-human kappa (κ) antibody, anti-human lambda (λ) antibody, anti-human IgG1 antibody, anti-human IgG2 antibody, anti-human IgG3 antibody, anti-human IgG4 antibody, etc. Can be mentioned.
また、これらの「標識物質を結合した、サブクラス別のヒト免疫グロブリンに対する抗体」を、適当な割合で混合して使用することにより、免疫グロブリンのサブクラスに依存しない抗糖脂質抗体の測定を行うことができる。 In addition, by using these "antibodies against human immunoglobulins by subclass bound to a labeling substance" at an appropriate ratio, an anti-glycolipid antibody that does not depend on the immunoglobulin subclass can be measured. You can
なお、「担体−糖脂質抗原−抗糖脂質抗体−抗糖脂質抗体と特異的に結合することができる物質−標識物質」の結合により担体に結合した標識物質の検出であるが、酵素免疫測定法等の標識物質として酵素を用いて測定を行う方法及び試薬においては、標識酵素にその至適条件下で基質を反応させ、その反応生成物の量を反応促進物質の吸光度を測るなどの光学的方法等により測定を行う。 The detection of the labeling substance bound to the carrier by the binding of "carrier-glycolipid antigen-antiglycolipid antibody-substance capable of specifically binding with antiglycolipid antibody-labeling substance" is carried out by enzyme immunoassay. In the method and reagent for performing measurement using an enzyme as a labeling substance such as a method, the labeling enzyme is allowed to react with a substrate under the optimal conditions, and the amount of the reaction product is measured by an optical method such as measuring the absorbance of the reaction promoting substance. The measurement is performed by a statistical method.
蛍光免疫測定法等の標識物質として蛍光物質を用いて測定を行う方法及び試薬においては、標識蛍光物質による蛍光強度を測定することにより測定を行う。 In the method and reagent for performing measurement using a fluorescent substance as a labeling substance such as a fluorescent immunoassay, the measurement is performed by measuring the fluorescence intensity of the labeling fluorescent substance.
放射免疫測定法等の標識物質として放射性物質を用いて測定を行う方法及び試薬においては、標識放射性物質による放射線量を測定することにより測定を行う。 In the method and reagent for measuring using a radioactive substance as a labeling substance such as radioimmunoassay, the measurement is performed by measuring the radiation dose of the labeled radioactive substance.
発光免疫測定法等の標識物質として発光反応に係わる物質を用いて測定を行う方法及び試薬においては、標識物質が係わる発光反応系における発光量を測定することにより測定を行う。 In the method and reagent for performing measurement using a substance related to a luminescence reaction as a labeling substance such as a luminescent immunoassay, the measurement is performed by measuring the amount of luminescence in a luminescence reaction system involving the labeling substance.
なお、前記の標識物質であるが、標識物質として酵素を用いる酵素免疫測定法等により測定を行う場合には、パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸脱水素酵素、又はα−アミラーゼ等の酵素を用いることができる。 In addition, although it is the above-mentioned labeling substance, when measurement is performed by an enzyme immunoassay method using an enzyme as the labeling substance, peroxidase (POD), alkaline phosphatase (ALP), β-galactosidase, urease, catalase, glucose An enzyme such as oxidase, lactate dehydrogenase, or α-amylase can be used.
また、標識物質として蛍光物質を用いる蛍光免疫測定法等により測定を行う場合には、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、置換ローダミンイソチオシアネート、又はジクロロトリアジンイソチオシアネート等の蛍光物質を用いることができる。 Further, when the measurement is performed by a fluorescence immunoassay method using a fluorescent substance as a labeling substance, it is preferable to use a fluorescent substance such as fluorescein isothiocyanate, tetramethylrhodamine isothiocyanate, substituted rhodamine isothiocyanate, or dichlorotriazine isothiocyanate. it can.
そして、標識物質として放射性物質を用いる放射免疫測定法等により測定を行う場合には、トリチウム、ヨウ素１２５、又はヨウ素１３１等の放射性物質を用いることができる。 When the measurement is performed by a radioimmunoassay method using a radioactive substance as a labeling substance, a radioactive substance such as tritium, iodine 125, or iodine 131 can be used.
また、測定を発光免疫測定法により行う場合には、アクリジニウムエステル、アルカリ性ホスファターゼ、パーオキシダーゼ、又はグルコースオキシダーゼ等を標識物質として用い、アクリジニウムエステル系、ジオキセタン化合物系、ルミノール−過酸化水素−ＰＯＤ系、又はＮＡＤＨ−ＦＭＮＨ２−ルシフェラーゼ系等により担体に結合した標識物質の検出を行うことができる。 When the measurement is carried out by a luminescent immunoassay, acridinium ester, alkaline phosphatase, peroxidase, glucose oxidase or the like is used as a labeling substance, and acridinium ester-based, dioxetane compound-based, luminol-hydrogen peroxide is used. The labeled substance bound to the carrier can be detected by the -POD system, the NADH-FMNH2-luciferase system, or the like.
〔９〕測定試薬
本発明の測定試薬は、試料中の抗糖脂質抗体を、糖脂質抗原と抗原抗体反応させることにより測定する測定試薬において、イオン強度が０．１７ｍｏｌ／Ｌ以下であることを特徴とするものである。
[9] Measurement Reagent The measurement reagent of the present invention is a measurement reagent for measuring an anti-glycolipid antibody in a sample by reacting a glycolipid antigen with an antigen-antibody, and has an ionic strength of 0.17 mol/L or less. It is a feature.
本発明のイオン強度が０．１７ｍｏｌ／Ｌ以下の試薬を用いることにより、試料中の抗糖脂質抗体の測定に当たり、測定感度を上昇させることができる。 By using the reagent of the present invention having an ionic strength of 0.17 mol/L or less, the measurement sensitivity can be increased in the measurement of the anti-glycolipid antibody in the sample.
なお、陽イオン及び陰イオンについては、前記〔４〕及び〔５〕に記載した通りであり、試料中の抗糖脂質抗体の測定方法については、前記〔８〕に記載した通りである。 The cation and anion are as described in [4] and [5] above, and the method for measuring the anti-glycolipid antibody in the sample is as described in [8] above.
また、本発明の測定試薬においては、糖脂質抗原がガングリオシド（ガングリオシド抗原）である場合に好適である。 Further, in the measuring reagent of the present invention, it is suitable when the glycolipid antigen is a ganglioside (ganglioside antigen).
そして、本発明の測定試薬においては、糖脂質抗原が担体に固定化されている場合に好適である。 The measuring reagent of the present invention is suitable when the glycolipid antigen is immobilized on the carrier.
なお、本発明の試料中の抗糖脂質抗体の測定試薬は、そのもの単独にて、販売し、又は試料中の抗糖脂質抗体の測定に使用することができる。
また、本発明の試料中の抗糖脂質抗体の測定試薬は、他の試薬と組み合わせて、販売し、又は試料中の抗糖脂質抗体の測定に使用することもできる。
The measuring reagent for anti-glycolipid antibody in the sample of the present invention can be sold alone or used for measuring the anti-glycolipid antibody in the sample.
In addition, the reagent for measuring anti-glycolipid antibody in the sample of the present invention can be sold in combination with other reagents or used for measuring anti-glycolipid antibody in the sample.
前記の他の試薬としては、例えば、緩衝液、試料希釈液、試薬希釈液、標識物質を含有する試薬、発色などのシグナルを生成する物質を含有する試薬、又は校正（キャリブレーション）を行うための物質を含有する物質の試薬等を挙げることができる。 Examples of the other reagents include buffer solutions, sample diluents, reagent diluents, reagents containing labeling substances, reagents containing substances that generate signals such as color development, or for performing calibration. Examples of the reagent include a substance containing the substance.
〔１０〕測定時の他の成分
本発明における、試料中の抗糖脂質抗体の測定においては、溶媒として、各種の水系溶媒を用いることができる。
この水系溶媒としては、例えば、精製水、生理食塩水、又は、トリス緩衝液、リン酸緩衝液若しくはリン酸緩衝生理食塩水などの各種緩衝液等を挙げることができる。
この緩衝液のｐＨについては、適宜適当なｐＨを選択して用いればよく、特に制限はないものの、通常は、ｐＨ３〜１２の範囲内のｐＨを選択して用いることが一般的である。
[10] Other components at the time of measurement In the measurement of the anti-glycolipid antibody in the sample in the present invention, various aqueous solvents can be used as the solvent.
Examples of the aqueous solvent include purified water, physiological saline, and various buffers such as Tris buffer, phosphate buffer or phosphate buffered saline.
The pH of the buffer solution may be appropriately selected and used, and there is no particular limitation, but it is common to select and use a pH within the range of
また、本発明における測定においては、前記の糖脂質抗原、前記の陽イオン並びに陰イオン、前記の糖脂質抗原を固定化した担体、及び／又は前記の抗糖脂質抗体等の抗体と酵素などの標識物質を結合させた標識抗体等の試薬成分の他に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カゼイン若しくはその塩などのタンパク質；各種塩類；各種糖類；脱脂粉乳；正常ウサギ血清などの各種動物血清；アジ化ナトリウムもしくは抗生物質などの各種防腐剤；活性化物質；反応促進物質；ポリエチレングリコールなどの感度増加物質；非特異的反応抑制物質；又は、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤若しくは陰イオン性界面活性剤などの各種界面活性剤等の１種又は２種以上を適宜用いてもよい。
そして、これらを測定に用いる際の濃度は特に限定されるものではないが、０．００１〜１０％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、特に０．０１〜５％（Ｗ／Ｖ）が好ましい。
In the measurement of the present invention, the glycolipid antigen, the cation and anion, the carrier on which the glycolipid antigen is immobilized, and/or the antibody such as the anti-glycolipid antibody and the enzyme are used. Protein components such as bovine serum albumin (BSA), human serum albumin (HSA), casein or salts thereof, in addition to reagent components such as labeled antibodies to which a labeling substance is bound; various salts; various sugars; skim milk; normal rabbit serum Various animal sera such as; a variety of preservatives such as sodium azide or antibiotics; activators; reaction accelerating substances; sensitivity increasing substances such as polyethylene glycol; nonspecific reaction suppressing substances; or nonionic surfactants, One or two or more kinds of various surfactants such as amphoteric surfactants or anionic surfactants may be appropriately used.
The concentration when these are used for measurement is not particularly limited, but 0.001 to 10% (W/V) is preferable, and 0.01 to 5% (W/V) is particularly preferable.
なお、前記の界面活性剤としては、例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、デカグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンフィトステロール、フィトスタノール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油、硬化ヒマシ油若しくはポリオキシエチレンラノリンなどの非イオン性界面活性剤；酢酸ベタインなどの両性界面活性剤；又は、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩若しくはポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸塩などの陰イオン性界面活性剤等を挙げることができる。 As the surfactant, for example, sorbitan fatty acid ester, glycerin fatty acid ester, decaglycerin fatty acid ester, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, polyoxyethylene glycerin fatty acid ester, polyethylene glycol fatty acid ester, polyoxyethylene alkyl ether, Nonionic surfactants such as polyoxyethylene phytosterols, phytostanols, polyoxyethylene polyoxypropylene alkyl ethers, polyoxyethylene alkyl phenyl ethers, polyoxyethylene castor oil, hydrogenated castor oil or polyoxyethylene lanolin; betaine acetate etc. And an anionic surfactant such as polyoxyethylene alkyl ether sulfate or polyoxyethylene alkyl ether acetate.
〔１１〕測定感度を上昇させる方法
本発明における、試料中の抗糖脂質抗体測定の、測定感度を上昇させる方法は、試料中の抗糖脂質抗体測定において、イオン強度を０．１７ｍｏｌ／Ｌ以下とすることによるものである。
この、試料中の抗糖脂質抗体の測定において、イオン強度が０．１７ｍｏｌ／Ｌ以下で測定を行うことにより、抗糖脂質抗体の測定感度を上昇させることができる。
また、本発明における測定感度を上昇させる方法を実施する際の試薬の構成成分や試料や条件等は、前記した通りである。
[11] Method of increasing measurement sensitivity In the present invention, the method of increasing the measurement sensitivity of the anti-glycolipid antibody measurement in a sample has an ionic strength of 0.17 mol/L or less in the anti-glycolipid antibody measurement in a sample. It is due to
In this measurement of the anti-glycolipid antibody in the sample, the measurement sensitivity of the anti-glycolipid antibody can be increased by measuring at an ionic strength of 0.17 mol/L or less.
Further, the constituent components of the reagent, the sample, the conditions and the like when carrying out the method of increasing the measurement sensitivity in the present invention are as described above.
以下、実施例により本発明をより具体的に詳述するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited to these Examples.
〔実施例１〕（異なるイオン強度での抗糖脂質抗体の測定）
塩化ナトリウム濃度を変えることによりイオン強度を変え、標識免疫測定法により試料中の抗ＧＭ１抗体（抗糖脂質抗体）の測定を行った。
[Example 1] (Measurement of anti-glycolipid antibody at different ionic strengths)
The ionic strength was changed by changing the sodium chloride concentration, and the anti-GM1 antibody (anti-glycolipid antibody) in the sample was measured by the labeled immunoassay method.
１．試薬の調製 1. Preparation of reagents
（１）試料希釈液の調製
１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する１０ｍＭリン酸緩衝液〔ｐＨ７．５〕を調製した。ここに、塩化ナトリウムを５０ｍＭ、１００ｍＭ、１５０ｍＭ及び２００ｍＭの濃度となるように添加し、塩化ナトリウム濃度の異なる４種類の試料希釈液の調製を行った。
(1) Preparation of Sample Diluting Solution A 10 mM phosphate buffer solution (pH 7.5) containing 1% (w/v) bovine serum albumin (BSA) was prepared. Sodium chloride was added thereto so as to have a concentration of 50 mM, 100 mM, 150 mM and 200 mM to prepare four kinds of sample diluents having different sodium chloride concentrations.
（２）ＧＭ１抗原固相化担体の調製
ガングリオシドＧＭ１（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ Ｌｉｍｉｔｅｄ社）を１ウェル当たり２００ｎｇずつポリスチレンプレート〔ＰｏｌｙＳｏｒｐ〕（ヌンク社）のウェルに分注し、一定時間放置して、前記ガングリオシドＧＭ１を前記ポリスチレンプレートの各ウェルに固相化した。
(2) Preparation of GM1 antigen-immobilized carrier Ganglioside GM1 (Carbosynth Limited) was dispensed in an amount of 200 ng per well to a well of a polystyrene plate [PolySorp] (Nunc), and left for a certain period of time to allow the ganglioside GM1 to be prepared. Each well of the polystyrene plate was solid-phased.
次に、このガングリオシドＧＭ１が固相化されたウェル内に１．５％ＢＳＡ溶液（ｐＨ７．７）を１ウェル当たり２００μＬずつ分注し、一定時間放置してブロッキング処理を行い、ＧＭ１抗原固相化担体を調製した。 Next, 200 μL of 1.5% BSA solution (pH 7.7) was dispensed into each well in which the ganglioside GM1 was immobilized, and the blocking treatment was performed by leaving it for a certain period of time to solidify the GM1 antigen. A modified carrier was prepared.
（３）洗浄液の調製
０．０５％ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．５）を調製し、洗浄液とした。
(3) Preparation of Washing Solution Phosphate buffered saline (pH 7.5) containing 0.05% Tween 20 (Tween 20) was prepared and used as a washing solution.
（４）酵素標識抗体
ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体〔Ｐ０２１４〕（ダコ社）を、酵素標識抗体として用いた。
(4) Enzyme-labeled antibody Peroxidase-labeled rabbit anti-human IgG polyclonal antibody [P0214] (Dako) was used as the enzyme-labeled antibody.
（５）発色液
０．０２％ペルオキシダーゼ基質液〔３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン〕（同仁化学研究所）を含有する２．５ｍＭ過酸化水素を発色液として用いた。
(5) Color developing solution 2.5 mM hydrogen peroxide containing 0.02% peroxidase substrate solution [3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine] (Dojindo Laboratories) was used as a color developing solution.
２．試料
抗ＧＭ１抗体陽性血清：
抗ＧＭ１抗体を含むことが確認されている１１種類の血清を、抗ＧＭ１抗体陽性血清として用意した。
2. Sample Anti-GM1 antibody positive serum:
Eleven types of sera confirmed to contain anti-GM1 antibody were prepared as anti-GM1 antibody-positive sera.
３．試料中の抗糖脂質抗体の測定
（１）試料である本実施例の２の１１種類の抗ＧＭ１抗体陽性血清を本実施例の１の（１）の４種類の試料希釈液により、それぞれ１００倍に希釈して混合液を調製した。
3. Measurement of Anti-Glycolipid Antibody in Sample (1) The 11 kinds of anti-GM1 antibody-positive sera of Example 2 (2) of the present Example were each diluted to 100 with each of the four types of sample diluents of (1) of Example 1. A mixed solution was prepared by doubling the dilution.
（２）前記（１）で調製した混合液の各々を、本実施例の（２）のＧＭ１抗原固相化担体の各ウェルに１００μＬずつ分注し、これを４℃にて一晩静置した。
これにより、担体に固相化されているＧＭ１抗原と試料に含まれていた抗ＧＭ１抗体を接触させ、反応させた。
(2) 100 μL of each of the mixed solutions prepared in (1) above was dispensed into each well of the GM1 antigen-immobilized carrier of (2) of this example, and the mixture was allowed to stand at 4° C. overnight. did.
As a result, the GM1 antigen immobilized on the carrier and the anti-GM1 antibody contained in the sample were brought into contact with each other and reacted.
（３）次に、前記のウェルより、前記の混合液を吸引して除去した。
そして、このウェルを、本実施例の１の（３）の洗浄液で洗浄した。
(3) Next, the mixed solution was aspirated and removed from the well.
Then, this well was washed with the washing solution of (3) of 1 of this Example.
（４）本実施例の１の（４）の酵素標識抗体を、１％ＢＳＡを含むトリス緩衝液で２，０００倍希釈した。次にこれを、前記の洗浄操作を行ったウェルに１００μＬずつ分注して、室温で２時間反応させた。 (4) The enzyme-labeled antibody of (4) of 1 of this Example was diluted 2000 times with a Tris buffer containing 1% BSA. Next, 100 μL of this was dispensed into each well subjected to the above washing operation, and reacted at room temperature for 2 hours.
（５）その後、前記のウェルより、未結合の酵素標識抗体を吸引して除去した。そして、このウェルを、本実施例の１の（３）の洗浄液で洗浄した。 (5) Then, the unbound enzyme-labeled antibody was removed by suction from the well. Then, this well was washed with the washing solution of (3) of 1 of this Example.
（６）次に、本実施例の１の（５）の発色液の１００μＬを、前記のウェルに分注し、室温で２０分間反応させた。
これにより、担体に固定化された標識酵素（ペルオキシダーゼ）と、発色液を反応させて、色素を生成させた。
(6) Next, 100 μL of the color-developing solution of (5) of 1 of this Example was dispensed into the wells and reacted at room temperature for 20 minutes.
As a result, the labeling enzyme (peroxidase) immobilized on the carrier was allowed to react with the color-developing solution to generate a dye.
（７）前記の発色液の添加２０分後に、０．３５Ｍ硫酸の１００μＬを、前記のウェルに分注して、前記の反応を停止させた。 (7) Twenty minutes after the addition of the color-developing solution, 100 μL of 0.35M sulfuric acid was dispensed into the well to stop the reaction.
（８）マイクロプレートリーダー〔６８０型〕（バイオラッド社）にて、前記のウェル中の液の吸光度（主波長：４５０ｎｍ、副波長：５５０ｎｍ）を測定して、吸光度測定値を得た。 (8) Absorbance (main wavelength: 450 nm, subwavelength: 550 nm) of the solution in the well was measured with a microplate reader [680 type] (Bio-Rad) to obtain an absorbance measurement value.
４．測定結果
これらの測定結果（吸光度測定値）を表１及び図１に示した。なお、表１において、かっこ内の数値は、各濃度の塩化ナトリウムを含有する試薬のイオン強度（ｍｏｌ／Ｌ）を示す。
4. Measurement Results The measurement results (absorbance measurement values) are shown in Table 1 and FIG. In Table 1, the value in parentheses indicates the ionic strength (mol/L) of the reagent containing sodium chloride at each concentration.
５．考察
表１から明らかなように、塩化ナトリウム濃度が２００ｍＭ（すなわちイオン強度が０．２２６ｍｏｌ／Ｌ）の場合は、塩化ナトリウム濃度が１５０ｍＭ（すなわちイオン強度が０．１７６ｍｏｌ／Ｌ）の場合に比較して、全ての試料で、測定により得られる測定値（吸光度）が減少してしまっていることが分かる。すなわち、シグナルの生成が大きく減少し、測定の感度が低下してしまっていることが分かる。
5. Discussion As is apparent from Table 1, when the sodium chloride concentration is 200 mM (that is, the ionic strength is 0.226 mol/L), it is compared with when the sodium chloride concentration is 150 mM (that is, the ionic strength is 0.176 mol/L). Thus, it can be seen that the measured value (absorbance) obtained by the measurement has decreased in all the samples. In other words, it can be seen that the signal generation is greatly reduced and the measurement sensitivity is reduced.
これに対して、塩化ナトリウム濃度が１００ｍＭ（すなわちイオン強度が０．１２６ｍｏｌ／Ｌ）の場合は、塩化ナトリウム濃度が１５０ｍＭ（すなわちイオン強度が０．１７６ｍｏｌ／Ｌ）の場合に比較して、測定により得られる測定値（吸光度）の減少が小さくなっており、生成するシグナルの増加、すなわち測定の感度が上昇していることが分かる。 On the other hand, when the sodium chloride concentration is 100 mM (that is, the ionic strength is 0.126 mol/L), it is measured by comparison with when the sodium chloride concentration is 150 mM (that is, the ionic strength is 0.176 mol/L). It can be seen that the decrease in the measured value (absorbance) obtained is small, and the generated signal is increased, that is, the measurement sensitivity is increased.
また、塩化ナトリウム濃度が５０ｍＭ（すなわちイオン強度が０．０７６ｍｏｌ／Ｌ）の場合は、塩化ナトリウム濃度が１５０ｍＭ（すなわちイオン強度が０．１７６ｍｏｌ／Ｌ）の場合に比較して、測定により得られる測定値（吸光度）は、いずれも減少しておらず、生成するシグナルの増加、すなわち測定の感度の上昇が顕著であることが分かる。 Further, when the sodium chloride concentration is 50 mM (that is, the ionic strength is 0.076 mol/L), the measurement obtained by the measurement is compared to when the sodium chloride concentration is 150 mM (that is, the ionic strength is 0.176 mol/L). None of the values (absorbance) decreased, and it can be seen that the increase in the signal generated, that is, the increase in the measurement sensitivity is remarkable.
これらのことより、試料中の抗糖脂質抗体を、糖脂質抗原と抗原抗体反応させることにより測定する測定試薬及び測定方法において、イオン強度を０．１７ｍｏｌ／Ｌ以下にすることにより、試料中の抗糖脂質抗体を感度高く測定できることが確かめられた。
よって、本発明の試料中の抗糖脂質抗体測定試薬及び測定方法は、生成するシグナルの減少を防ぎ、測定の感度を上昇させ、正確な測定結果を得ることができることが確かめられた。
From these facts, in the measuring reagent and the measuring method for measuring the anti-glycolipid antibody in the sample by reacting the glycolipid antigen with the antigen-antibody, by setting the ionic strength to 0.17 mol/L or less, It was confirmed that the anti-glycolipid antibody can be measured with high sensitivity.
Therefore, it was confirmed that the antiglycolipid antibody measuring reagent in the sample and the measuring method of the present invention can prevent the decrease of the generated signal, increase the sensitivity of the measurement, and obtain accurate measurement results.
〔実施例２〕（異なるイオン強度での抗糖脂質抗体の測定）
塩化ナトリウム濃度を変えることによりイオン強度を変え、標識免疫測定法により試料中の抗ＧＱ１ｂ抗体（抗糖脂質抗体）の測定を行った。
[Example 2] (Measurement of anti-glycolipid antibody at different ionic strengths)
The ionic strength was changed by changing the sodium chloride concentration, and the anti-GQ1b antibody (anti-glycolipid antibody) in the sample was measured by the labeled immunoassay method.
１．試薬の調製 1. Preparation of reagents
（１）試料希釈液の調製
前記実施例１の１の（１）で調製した試料希釈液をそのまま使用した。
(1) Preparation of sample diluent The sample diluent prepared in (1) of 1 of Example 1 was used as it was.
（２）ＧＱ１ｂ抗原固相化担体の調製
ガングリオシドＧＱ１ｂ（Ｈｙｔｅｓｔ社）を１ウェル当たり２００ｎｇずつポリスチレンプレート〔ＰｏｌｙＳｏｒｐ〕（ヌンク社）のウェルに分注し、一定時間放置して、前記ガングリオシドＧＱ１ｂを前記ポリスチレンプレートの各ウェルに固相化した。
(2) Preparation of GQ1b antigen-immobilized carrier Ganglioside GQ1b (Hytest) was dispensed in an amount of 200 ng per well to a well of a polystyrene plate [PolySorp] (Nunc) and left for a certain period of time to allow the ganglioside GQ1b to be treated as described above. Each well of a polystyrene plate was immobilized.
次に、このガングリオシドＧＱ１ｂが固相化されたウェルに１．５％ＢＳＡ溶液（ｐＨ７．７）を１ウェル当たり２００μＬずつ分注し、一定時間放置してブロッキング処理を行い、ＧＱ１ｂ抗原固相化担体を調製した。 Next, 200 μL of 1.5% BSA solution (pH 7.7) was dispensed into each well in which the ganglioside GQ1b was immobilized, and the blocking treatment was performed by leaving it for a certain period of time to immobilize the GQ1b antigen. A carrier was prepared.
（３）洗浄液の調製
前記実施例１の１の（３）で調製した洗浄液をそのまま使用した。
(3) Preparation of Cleaning Solution The cleaning solution prepared in (3) of 1 of Example 1 was used as it was.
（４）酵素標識抗体
前記実施例１の１の（４）の酵素標識抗体をそのまま使用した。
(4) Enzyme-labeled antibody The enzyme-labeled antibody of (4) of 1 of Example 1 was used as it was.
（５）発色液
前記実施例１の１の（５）の酵素標識抗体をそのまま使用した。
(5) Color developing solution The enzyme-labeled antibody of (5) of 1 of Example 1 was used as it was.
２．試料
抗ＧＱ１ｂ抗体陽性血清：
抗ＧＱ１ｂ抗体を含むことが確認されている１０種類の血清を、抗ＧＱ１ｂ抗体陽性血清として用意した。
2. Sample Anti-GQ1b antibody-positive serum:
Ten types of sera confirmed to contain anti-GQ1b antibody were prepared as anti-GQ1b antibody-positive sera.
３．試料中の抗糖脂質抗体の測定
（１）試料である本実施例の２の１０種類の抗ＧＱ１ｂ抗体陽性血清を本実施例の１の（１）の４種類の試料希釈液により、それぞれ１００倍に希釈して混合液を調製した。
3. Measurement of Anti-Glycolipid Antibody in Sample (1) Ten kinds of anti-GQ1b antibody-positive sera of Example 2 (2) of this Example were diluted to 100 with each of the four kinds of sample dilution solutions of (1) of Example 1. A mixed solution was prepared by doubling the dilution.
（２）前記（１）で調製した混合液の各々を、本実施例の１の（２）のＧＱ１ｂ抗原固相化担体の各ウェルに１００μＬずつ分注し、これを４℃にて一晩静置した。
これにより、担体に固相化されているＧＱ１ｂ抗原と試料に含まれていた抗ＧＱ１ｂ抗体を接触させ、反応させた。
(2) 100 μL of each of the mixed solutions prepared in (1) above was dispensed into each well of the GQ1b antigen-immobilized carrier in (2) of 1 of this example, and this was overnight at 4° C. I let it stand.
As a result, the GQ1b antigen immobilized on the carrier and the anti-GQ1b antibody contained in the sample were brought into contact with each other and reacted.
（３）次に、前記のウェルより、前記の混合液を吸引して除去した。
そして、このウェルを、本実施例の１の（３）の洗浄液で洗浄した。
(3) Next, the mixed solution was aspirated and removed from the well.
Then, this well was washed with the washing solution of (3) of 1 of this Example.
（４）本実施例の１の（４）の酵素標識抗体を、１％ＢＳＡを含むトリス緩衝液で２，０００倍希釈した。次にこれを、前記の洗浄操作を行ったウェルに１００μＬずつ分注して、室温で２時間反応させた。 (4) The enzyme-labeled antibody of (4) of 1 of this Example was diluted 2000 times with a Tris buffer containing 1% BSA. Next, 100 μL of this was dispensed into each well subjected to the above washing operation, and reacted at room temperature for 2 hours.
（５）その後、前記のウェルより、未結合の酵素標識抗体を吸引して除去した。そして、このウェルを、本実施例の１の（３）の洗浄液で洗浄した。 (5) Then, the unbound enzyme-labeled antibody was removed by suction from the well. Then, this well was washed with the washing solution of (3) of 1 of this Example.
（６）次に、本実施例の〔１〕の１の（５）の発色液の１００μＬを、前記のウェルに分注し、室温で２０分間反応させた。
これにより、担体に固定化された標識酵素（ペルオキシダーゼ）と、発色液を反応させて、色素を生成させた。
(6) Next, 100 μL of the color-developing solution of (5) of 1) of [1] of this example was dispensed into the wells and reacted at room temperature for 20 minutes.
As a result, the labeling enzyme (peroxidase) immobilized on the carrier was allowed to react with the color-developing solution to generate a dye.
（７）前記の発色液の添加２０分後に、０．３５Ｍ硫酸の１００μＬを、前記のウェルに分注して、前記の反応を停止させた。 (7) Twenty minutes after the addition of the color-developing solution, 100 μL of 0.35M sulfuric acid was dispensed into the well to stop the reaction.
（８）マイクロプレートリーダー〔６８０型〕（バイオラッド社）にて、前記のウェル中の液の吸光度（主波長：４５０ｎｍ、副波長：５５０ｎｍ）を測定して、吸光度測定値を得た。 (8) Absorbance (main wavelength: 450 nm, subwavelength: 550 nm) of the solution in the well was measured with a microplate reader [680 type] (Bio-Rad) to obtain an absorbance measurement value.
４．測定結果
これらの測定結果（吸光度測定値）を表２及び図２に示した。なお、表２において、かっこ内の数値は、各濃度の塩化ナトリウムを含有する試薬のイオン強度（ｍｏｌ／Ｌ）を示す。
4. Measurement Results The measurement results (absorbance measurement values) are shown in Table 2 and FIG. In Table 2, the value in parentheses indicates the ionic strength (mol/L) of the reagent containing sodium chloride at each concentration.
５．考察
表２から明らかなように、塩化ナトリウム濃度が２００ｍＭの場合（すなわちイオン強度が０．２２６ｍｏｌ／Ｌ）は、塩化ナトリウム濃度が１５０ｍＭの場合（すなわちイオン強度が０．１７６ｍｏｌ／Ｌ）に比較して、全ての試料で、測定により得られる測定値（吸光度）が減少してしまっていることが分かる。すなわち、シグナルの生成が大きく減少し、測定の感度が低下してしまっていることが分かる。
5. As is clear from Table 2, when the sodium chloride concentration is 200 mM (that is, the ionic strength is 0.226 mol/L), the sodium chloride concentration is 150 mM (that is, the ionic strength is 0.176 mol/L). Thus, it can be seen that the measured value (absorbance) obtained by the measurement has decreased in all the samples. In other words, it can be seen that the signal generation is greatly reduced and the measurement sensitivity is reduced.
これに対して、塩化ナトリウム濃度が１００ｍＭの場合（すなわちイオン強度が０．１２６ｍｏｌ／Ｌ）は、塩化ナトリウム濃度が１５０ｍＭの場合（すなわちイオン強度が０．１７６ｍｏｌ／Ｌ）に比較して、測定により得られる測定値（吸光度）の減少が小さくなっており、生成するシグナルの増加、すなわち測定の感度が上昇していることが分かる。 On the other hand, when the sodium chloride concentration is 100 mM (that is, the ionic strength is 0.126 mol/L), the sodium chloride concentration is 150 mM (that is, the ionic strength is 0.176 mol/L). It can be seen that the decrease in the measured value (absorbance) obtained is small, and the generated signal is increased, that is, the measurement sensitivity is increased.
また、塩化ナトリウム濃度が５０ｍＭの場合は、塩化ナトリウム濃度が１５０ｍＭ（すなわちイオン強度が０．１７６ｍｏｌ／Ｌ）の場合に比較して、測定により得られる測定値（吸光度）は、いずれも減少しておらず、生成するシグナルの増加、すなわち測定の感度の上昇が顕著であることが分かる。 In addition, when the sodium chloride concentration is 50 mM, the measured values (absorbance) obtained by the measurement are both reduced as compared with the case where the sodium chloride concentration is 150 mM (that is, the ionic strength is 0.176 mol/L). Therefore, it can be seen that the increase in the generated signal, that is, the increase in the sensitivity of the measurement is remarkable.
これらのことより、試料中の抗糖脂質抗体を、糖脂質抗原と抗原抗体反応させることにより測定する測定試薬及び測定方法において、イオン強度を０．１７ｍｏｌ／Ｌ以下にすることにより、試料中の抗糖脂質抗体を感度高く測定できることが確かめられた。
よって、本発明の試料中の抗糖脂質抗体測定試薬及び測定方法は、生成するシグナルの減少を防ぎ、測定の感度を上昇させ、正確な測定結果を得ることができることが確かめられた。
From these facts, in the measuring reagent and the measuring method for measuring the anti-glycolipid antibody in the sample by reacting the glycolipid antigen with the antigen-antibody, by setting the ionic strength to 0.17 mol/L or less, It was confirmed that the anti-glycolipid antibody can be measured with high sensitivity.
Therefore, it was confirmed that the antiglycolipid antibody measuring reagent in the sample and the measuring method of the present invention can prevent the decrease of the generated signal, increase the sensitivity of the measurement, and obtain accurate measurement results.
〔実施例３〕（異なるイオン強度での抗糖脂質抗体の測定）
試料希釈液中の緩衝液の濃度を変え、標識免疫測定法により試料中の抗ＧＭ１抗体（抗糖脂質抗体）の測定を行った。
[Example 3] (Measurement of anti-glycolipid antibody at different ionic strengths)
The concentration of the buffer solution in the sample diluent was changed, and the anti-GM1 antibody (anti-glycolipid antibody) in the sample was measured by the labeled immunoassay method.
１．試薬の調製
（１）試料希釈液の調製
５ｍＭ、１０ｍＭ、５０ｍＭ及び１００ｍＭのリン酸緩衝液〔ｐＨ７．５〕に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を１％（ｗ／ｖ）、塩化ナトリウムを１００ｍＭとなるように添加し、緩衝液濃度の異なる４種類の試料希釈液の調製を行った。
1. Preparation of Reagents (1) Preparation of
（２）ＧＭ１抗原固相化担体の調製
前記実施例１の１の（２）で調製したＧＭ１抗原固相化担体をそのまま使用した。
(2) Preparation of GM1 antigen-immobilized carrier The GM1 antigen-immobilized carrier prepared in (2) of 1 of Example 1 was used as it was.
（３）洗浄液の調製
前記実施例１の１の（３）で調製した洗浄液をそのまま使用した。
(3) Preparation of Cleaning Solution The cleaning solution prepared in (3) of 1 of Example 1 was used as it was.
（４）酵素標識抗体
前記実施例１の１の（４）の酵素標識抗体をそのまま使用した。
(4) Enzyme-labeled antibody The enzyme-labeled antibody of (4) of 1 of Example 1 was used as it was.
（５）発色液
前記実施例１の１の（５）の酵素標識抗体をそのまま使用した。
(5) Color developing solution The enzyme-labeled antibody of (5) of 1 of Example 1 was used as it was.
２．試料
（１）抗ＧＭ１抗体陽性血清
抗ＧＭ１抗体を含むことが確認されている６種類の血清を、抗ＧＭ１抗体陽性血清として用意した。
2. Sample (1) Anti-GM1 antibody-positive serum Six types of sera confirmed to contain anti-GM1 antibody were prepared as anti-GM1 antibody-positive sera.
３．試料中の抗糖脂質抗体の測定
（１）試料である本実施例の２の６種類の抗ＧＭ１抗体陽性血清を本実施例の１の（１）の４種類の試料希釈液により、それぞれ１００倍に希釈して混合液を調製した。
3. Measurement of Anti-Glycolipid Antibody in Sample (1) Six kinds of anti-GM1 antibody-positive sera of Example 2 (2) of the present Example were each diluted to 100 with 4 kinds of sample diluents of (1) of Example 1. A mixed solution was prepared by doubling the dilution.
（２）前記（１）で調製した混合液の各々を、本実施例の１の（２）のＧＭ１抗原固相化担体の各ウェルに１００μＬずつ分注し、これを４℃にて一晩静置した。
これにより、担体に固相化されているＧＭ１抗原と試料に含まれていた抗ＧＭ１抗体を接触させ、反応させた。
(2) 100 μL of each of the mixed solutions prepared in the above (1) was dispensed into each well of the GM1 antigen-immobilized carrier in (2) of 1 of this example, and this was overnight at 4° C. I let it stand.
As a result, the GM1 antigen immobilized on the carrier and the anti-GM1 antibody contained in the sample were brought into contact with each other and reacted.
（３）次に、前記のウェルより、前記の混合液を吸引して除去した。
そして、このウェルを、本実施例の１の（３）の洗浄液で洗浄した。
(3) Next, the mixed solution was aspirated and removed from the well.
Then, this well was washed with the washing solution of (3) of 1 of this Example.
（４）本実施例の１の（４）の酵素標識抗体を、１％ＢＳＡを含むトリス緩衝液で２，０００倍希釈した。次にこれを、前記（２）の洗浄操作を行ったウェルに１００μＬずつ分注して、室温で２時間反応させた。 (4) The enzyme-labeled antibody of (4) of 1 of this Example was diluted 2000 times with a Tris buffer containing 1% BSA. Next, 100 μL of this was dispensed into each well that had been subjected to the washing operation of (2) above, and reacted at room temperature for 2 hours.
（５）その後、前記のウェルより、未結合の酵素標識抗体を吸引して除去した。そして、このウェルを、本実施例の１の（３）の洗浄液で洗浄した。 (5) Then, the unbound enzyme-labeled antibody was removed by suction from the well. Then, this well was washed with the washing solution of (3) of 1 of this Example.
（６）次に、本実施例の１の（５）の発色液の１００μＬを、前記のウェルに分注し、室温で２０分間反応させた。
これにより、担体に固定化された標識酵素（ペルオキシダーゼ）と、発色液を反応させて、色素を生成させた。
(6) Next, 100 μL of the color-developing solution of (5) of 1 of this Example was dispensed into the wells and reacted at room temperature for 20 minutes.
As a result, the labeling enzyme (peroxidase) immobilized on the carrier was allowed to react with the color-developing solution to generate a dye.
（７）前記の発色液の添加２０分後に、０．３５Ｍ硫酸の１００μＬを、前記のウェルに分注して、前記の反応を停止させた。 (7) Twenty minutes after the addition of the color-developing solution, 100 μL of 0.35M sulfuric acid was dispensed into the well to stop the reaction.
（８）マイクロプレートリーダー〔６８０型〕（バイオラッド社）にて、前記のウェル中の液の吸光度（主波長：４５０ｎｍ、副波長：５５０ｎｍ）を測定して、吸光度測定値を得た。 (8) Absorbance (main wavelength: 450 nm, subwavelength: 550 nm) of the solution in the well was measured with a microplate reader [680 type] (Bio-Rad) to obtain an absorbance measurement value.
４．測定結果
これらの測定結果（吸光度測定値）を表３及び図３に示した。なお、表３において、かっこ内の数値は、各濃度の緩衝液を含有する試薬のイオン強度（ｍｏｌ／Ｌ）を示す。
4. Measurement Results These measurement results (absorbance measurement values) are shown in Table 3 and FIG. In Table 3, the value in parentheses indicates the ionic strength (mol/L) of the reagent containing the buffer solution at each concentration.
５．考察
表３から明らかなように、緩衝液濃度が１００ｍＭ（すなわちイオン強度が０．３５６ｍｏｌ／Ｌ）の場合は、緩衝液濃度が５０ｍＭ（すなわちイオン強度が０．２２８ｍｏｌ／Ｌ）の場合に比較して、全ての試料で、測定により得られる測定値（吸光度）が減少してしまっていることが分かる。すなわち、シグナルの生成が大きく減少し、測定の感度が低下してしまっていることが分かる。
5. Discussion As is clear from Table 3, when the buffer concentration is 100 mM (that is, ionic strength is 0.356 mol/L), it is compared with when the buffer concentration is 50 mM (that is, ionic strength is 0.228 mol/L). Thus, it can be seen that the measured value (absorbance) obtained by the measurement has decreased in all the samples. In other words, it can be seen that the signal generation is greatly reduced and the measurement sensitivity is reduced.
これに対して、緩衝液濃度が１０ｍＭ（すなわちイオン強度が０．１２６ｍｏｌ／Ｌ）の場合は、緩衝液濃度が５０ｍＭ（すなわちイオン強度が０．２２８ｍｏｌ／Ｌ）の場合に比較して、測定により得られる測定値（吸光度）の減少が小さくなっており、生成するシグナルの増加、すなわち測定の感度が上昇していることが分かる。 On the other hand, when the buffer solution concentration is 10 mM (that is, the ionic strength is 0.126 mol/L), the measurement is performed in comparison with when the buffer solution concentration is 50 mM (that is, the ionic strength is 0.228 mol/L). It can be seen that the decrease in the measured value (absorbance) obtained is small, and the generated signal is increased, that is, the measurement sensitivity is increased.
更に、緩衝液濃度が５ｍＭ（すなわちイオン強度が０．１１３ｍｏｌ／Ｌ）の場合は、緩衝液濃度が５０ｍＭ（すなわちイオン強度が０．２２８ｍｏｌ／Ｌ）の場合に比較して、測定により得られる測定値（吸光度）は、いずれも減少しておらず、生成するシグナルの増加、すなわち測定の感度の上昇が顕著であることが分かる。 Furthermore, when the buffer concentration is 5 mM (that is, the ionic strength is 0.113 mol/L), the measurement obtained by the measurement is compared to when the buffer concentration is 50 mM (that is, the ionic strength is 0.228 mol/L). None of the values (absorbance) decreased, and it can be seen that the increase in the signal generated, that is, the increase in the measurement sensitivity is remarkable.
これらのことより、試料中の抗糖脂質抗体を、糖脂質抗原と抗原抗体反応させることにより測定する測定試薬及び測定方法において、イオン強度を０．１７ｍｏｌ／Ｌ以下にすることにより、試料中の抗糖脂質抗体を感度高く測定できることが確かめられた。また、本発明におけるイオン強度は、測定反応時に存在している緩衝剤のイオン強度を含めたトータルのイオン強度が０．１７ｍｏｌ／Ｌ以下となっていればよいことが確かめられた。
よって、本発明の試料中の抗糖脂質抗体測定試薬及び測定方法は、生成するシグナルの減少を防ぎ、測定の感度を上昇させ、正確な測定結果を得ることができることが確かめられた。
From these facts, in the measuring reagent and the measuring method for measuring the anti-glycolipid antibody in the sample by reacting the glycolipid antigen with the antigen-antibody, by setting the ionic strength to 0.17 mol/L or less, It was confirmed that the anti-glycolipid antibody can be measured with high sensitivity. Further, it was confirmed that the ionic strength in the present invention should be such that the total ionic strength including the ionic strength of the buffering agent present during the measurement reaction is 0.17 mol/L or less.
Therefore, it was confirmed that the antiglycolipid antibody measuring reagent in the sample and the measuring method of the present invention can prevent the decrease of the generated signal, increase the sensitivity of the measurement, and obtain accurate measurement results.
〔実施例４〕（異なるイオン強度での抗糖脂質抗体の測定）
緩衝液の濃度を変え、標識免疫測定法により試料中の抗ＧＭ１抗体（抗糖脂質抗体）の測定を行った。
[Example 4] (Measurement of anti-glycolipid antibody at different ionic strengths)
The concentration of the buffer solution was changed, and the anti-GM1 antibody (anti-glycolipid antibody) in the sample was measured by the labeled immunoassay method.
１．試薬の調製 1. Preparation of reagents
（１）試料希釈液の調製
５ｍＭ、１０ｍＭ、５０ｍＭ及び１００ｍＭのトリス緩衝液〔ｐＨ７．５〕に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を１％（ｗ／ｖ）、塩化ナトリウムを１００ｍＭとなるように添加し、緩衝液濃度の異なる４種類の試料希釈液の調製を行った。
(1) Preparation of Sample Diluting Solution To 5 mM, 10 mM, 50 mM and 100 mM Tris buffer [pH 7.5], bovine serum albumin (BSA) was added at 1% (w/v) and sodium chloride was added at 100 mM. Then, four types of sample diluents having different buffer concentrations were prepared.
（２）ＧＭ１抗原固相化担体の調製
前記実施例１の１の（２）で調製したＧＭ１抗原固相化担体をそのまま使用した。
(2) Preparation of GM1 antigen-immobilized carrier The GM1 antigen-immobilized carrier prepared in (2) of 1 of Example 1 was used as it was.
（３）洗浄液の調製
前記実施例１の１の（３）で調製した洗浄液をそのまま使用した。
(3) Preparation of Cleaning Solution The cleaning solution prepared in (3) of 1 of Example 1 was used as it was.
（４）酵素標識抗体
前記実施例１の１の（４）の酵素標識抗体をそのまま使用した。
(4) Enzyme-labeled antibody The enzyme-labeled antibody of (4) of 1 of Example 1 was used as it was.
（５）発色液
前記実施例１の１の（５）の発色液をそのまま使用した。
(5) was used as the coloring solution coloring solution above in Example 1 1 (5).
２．試料
（１）抗ＧＭ１抗体陽性血清
前記実施例３の２の試料をそのまま使用した。
2. Sample (1) Anti-GM1 antibody positive serum The sample of Example 3-2 was used as it was.
３．試料中の抗糖脂質抗体の測定
（１）試料である本実施例の２の６種類の抗ＧＭ１抗体陽性血清を本実施例の１の（１）の４種類の試料希釈液により、それぞれ１００倍に希釈して混合液を調製した。
3. Measurement of Anti-Glycolipid Antibody in Sample (1) Six kinds of anti-GM1 antibody-positive sera of Example 2 (2) of the present Example were each diluted to 100 with 4 kinds of sample diluents of (1) of Example 1. A mixed solution was prepared by doubling the dilution.
試料希釈液として、本実施例の１の（１）の４種類の試料希釈液を用いる以外は実施例３の３の（１）〜（８）と同様にして試料中の抗ＧＭ１抗体の測定を行った。 Measurement of anti-GM1 antibody in a sample in the same manner as in (3) of Example 3 (1) to (8) except that four kinds of sample diluents of (1) of Example 1 were used as the sample diluent. I went.
４．測定結果
これらの測定結果（吸光度測定値）を表４及び図４に示した。なお、表４において、かっこ内の数値は、各濃度の緩衝液を含有する試薬のイオン強度（ｍｏｌ／Ｌ）を示す。
4. Measurement Results These measurement results (absorbance measurement values) are shown in Table 4 and FIG. In Table 4, the value in parentheses indicates the ionic strength (mol/L) of the reagent containing the buffer solution at each concentration.
５．考察
表４から明らかなように、緩衝液濃度が１００ｍＭ（すなわちイオン強度が０．１８０ｍｏｌ／Ｌ）の場合は、緩衝液濃度が５０ｍＭ（すなわちイオン強度が０．１４０ｍｏｌ／Ｌ）の場合に比較して、全ての試料で、測定により得られる測定値（吸光度）が減少してしまっていることが分かる。すなわち、シグナルの生成が大きく減少し、測定の感度が低下してしまっていることが分かる。
5. Discussion As is clear from Table 4, when the buffer concentration is 100 mM (that is, ionic strength is 0.180 mol/L), it is compared with when the buffer concentration is 50 mM (that is, ionic strength is 0.140 mol/L). Thus, it can be seen that the measured value (absorbance) obtained by the measurement has decreased in all the samples. In other words, it can be seen that the signal generation is greatly reduced and the measurement sensitivity is reduced.
これに対して、緩衝液濃度が１０ｍＭ（すなわちイオン強度が０．１０８ｍｏｌ／Ｌ）の場合は、緩衝液濃度が５０ｍＭ（すなわちイオン強度が０．１４０ｍｏｌ／Ｌ）の場合に比較して、測定により得られる測定値（吸光度）の減少が小さくなっており、生成するシグナルの増加、すなわち測定の感度が上昇していることが分かる。 On the other hand, when the buffer solution concentration is 10 mM (that is, the ionic strength is 0.108 mol/L), the measurement is carried out in comparison with when the buffer solution concentration is 50 mM (that is, the ionic strength is 0.140 mol/L). It can be seen that the decrease in the measured value (absorbance) obtained is small, and the generated signal is increased, that is, the measurement sensitivity is increased.
更に、緩衝液濃度が５ｍＭ（すなわちイオン強度が０．１０４ｍｏｌ／Ｌ）の場合は、緩衝液濃度が５０ｍＭ（すなわちイオン強度が０．１４０ｍｏｌ／Ｌ）の場合に比較して、測定により得られる測定値（吸光度）は、いずれも減少しておらず、生成するシグナルの増加、すなわち測定の感度の上昇が顕著であることが分かる。 Furthermore, when the buffer concentration is 5 mM (that is, the ionic strength is 0.104 mol/L), the measurement obtained by the measurement is compared to when the buffer concentration is 50 mM (that is, the ionic strength is 0.140 mol/L). None of the values (absorbance) decreased, and it can be seen that the increase in the signal generated, that is, the increase in the measurement sensitivity is remarkable.
これらのことより、試料中の抗糖脂質抗体を、糖脂質抗原と抗原抗体反応させることにより測定する測定試薬及び測定方法において、イオン強度を０．１７ｍｏｌ／Ｌ以下にすることにより、試料中の抗糖脂質抗体を感度高く測定できることが確かめられた。また、本発明におけるイオン強度は、測定反応時に存在している緩衝剤のイオン強度を含めたトータルのイオン強度が０．１７ｍｏｌ／Ｌ以下となっていればよいことが確かめられた。
よって、本発明の試料中の抗糖脂質抗体測定試薬及び測定方法は、生成するシグナルの減少を防ぎ、測定の感度を上昇させ、正確な測定結果を得ることができることが確かめられた。
From these facts, in the measuring reagent and the measuring method for measuring the anti-glycolipid antibody in the sample by reacting the glycolipid antigen with the antigen-antibody, by setting the ionic strength to 0.17 mol/L or less, It was confirmed that the anti-glycolipid antibody can be measured with high sensitivity. Further, it was confirmed that the ionic strength in the present invention should be such that the total ionic strength including the ionic strength of the buffering agent present during the measurement reaction is 0.17 mol/L or less.
Therefore, it was confirmed that the antiglycolipid antibody measuring reagent in the sample and the measuring method of the present invention can prevent the decrease of the generated signal, increase the sensitivity of the measurement, and obtain accurate measurement results.
〔実施例５〕（異なるイオン強度での抗糖脂質抗体の測定）
塩化ナトリウム濃度を変えることによりイオン強度を変え、標識免疫測定法により試料中の抗ＧＤ１ａ抗体（抗糖脂質抗体）の測定を行った。
[Example 5] (Measurement of anti-glycolipid antibody at different ionic strengths)
The ionic strength was changed by changing the sodium chloride concentration, and the anti-GD1a antibody (anti-glycolipid antibody) in the sample was measured by the labeled immunoassay method.
１．試薬の調製 1. Preparation of reagents
（１）試料希釈液の調製
前記実施例１の１の（１）で調製した試料希釈液をそのまま使用した。
(1) Preparation of sample diluent The sample diluent prepared in (1) of 1 of Example 1 was used as it was.
（２）ＧＤ１ａ抗原固相化担体の調製
ガングリオシドＧＤ１ａ（シグマ社）を１ウェル当たり２００ｎｇずつポリスチレンプレート〔ＰｏｌｙＳｏｒｐ〕（ヌンク社）のウェルに分注し、一定時間放置して、前記ガングリオシドＧＤ１ａを前記ポリスチレンプレートの各ウェルに固相化した。
(2) Preparation of GD1a antigen-immobilized carrier Ganglioside GD1a (Sigma) was dispensed in an amount of 200 ng per well into a well of a polystyrene plate [PolySorp] (Nunc Co.), and left for a certain period of time to allow the ganglioside GD1a to be treated as described above. Each well of a polystyrene plate was immobilized.
次に、このガングリオシドＧＤ１ａが固相化されたウェル内の液を除去した後、このウェルに１．５％ＢＳＡ溶液（ｐＨ７．７）を１ウェル当たり２００μＬずつ分注し、一定時間放置してブロッキング処理を行い、ＧＤ１ａ抗原固相化担体を調製した。 Next, after removing the liquid in the well in which the ganglioside GD1a was immobilized, 200 μL of 1.5% BSA solution (pH 7.7) was dispensed into each well and left for a certain period of time. Blocking treatment was performed to prepare a GD1a antigen-immobilized carrier.
（３）洗浄液の調製
前記実施例１の１の（３）で調製した洗浄液をそのまま使用した。
(3) Preparation of Cleaning Solution The cleaning solution prepared in (3) of 1 of Example 1 was used as it was.
（４）酵素標識抗体
前記実施例１の１の（４）の酵素標識抗体をそのまま使用した。
(4) Enzyme-labeled antibody The enzyme-labeled antibody of (4) of 1 of Example 1 was used as it was.
（５）発色液
前記実施例１の１の（５）の発色液をそのまま使用した。
(5) Coloring liquid The coloring liquid of (5) of 1 of Example 1 was used as it was.
２．試料
抗ＧＤ１ａ抗体陽性血清：
抗ＧＤ１ａ抗体を含むことが確認されている３種類の血清を、抗ＧＤ１ａ抗体陽性血清として用意した。
2. Sample Anti-GD1a antibody-positive serum:
Three types of sera confirmed to contain anti-GD1a antibody were prepared as anti-GD1a antibody-positive sera.
３．試料中の抗糖脂質抗体の測定
（１）試料である本実施例の２の３種類の抗ＧＤ１ａ抗体陽性血清を本実施例の１の（１）の４種類の試料希釈液により、それぞれ１００倍に希釈して混合液を調製した。
3. Measurement of Anti-Glycolipid Antibody in Sample (1) Three kinds of anti-GD1a antibody-positive sera of Example 2 (2) of this Example were diluted to 100 with each of four kinds of sample diluents of (1) of Example 1 of the present invention. A mixed solution was prepared by doubling the dilution.
（２）前記（１）で調製した４種類の混合液の各々を、本実施例の（２）のＧＤ１ａ抗原固相化担体の各ウェルに１００μＬずつ分注し、これを４℃にて一晩静置した。
これにより、担体に固相化されているＧＤ１ａ抗原と試料に含まれていた抗ＧＤ１ａ抗体を接触させ、反応させた。
(2) 100 μL of each of the four types of mixed solutions prepared in (1) above was dispensed into each well of the GD1a antigen-immobilized carrier in (2) of this example, and the mixture was mixed at 4° C. Let stand overnight.
As a result, the GD1a antigen immobilized on the carrier and the anti-GD1a antibody contained in the sample were brought into contact with each other and reacted.
（３）次に、前記のウェルより、前記の混合液を吸引して除去した。
そして、このウェルを、本実施例の１の（３）の洗浄液で洗浄した。
(3) Next, the mixed solution was aspirated and removed from the well.
Then, this well was washed with the washing solution of (3) of 1 of this Example.
（４）本実施例の１の（４）の酵素標識抗体を、１％ＢＳＡを含むトリス緩衝液で２，０００倍希釈した。次にこれを、前記の洗浄操作を行ったウェルに１００μＬずつ分注して、室温で２時間反応させた。 (4) The enzyme-labeled antibody of (4) of 1 of this Example was diluted 2000 times with a Tris buffer containing 1% BSA. Next, 100 μL of this was dispensed into each well subjected to the above washing operation, and reacted at room temperature for 2 hours.
（５）その後、前記のウェルより、未結合の酵素標識抗体を吸引して除去した。そして、このウェルを、本実施例の１の（３）の洗浄液で洗浄した。 (5) Then, the unbound enzyme-labeled antibody was removed by suction from the well. Then, this well was washed with the washing solution of (3) of 1 of this Example.
（６）次に、本実施例の１の（５）の発色液の１００μＬを、前記のウェルに分注し、室温で２０分間反応させた。
これにより、担体に固定化された標識酵素（ペルオキシダーゼ）と、発色液を反応させて、色素を生成させた。
(6) Next, 100 μL of the color-developing solution of (5) of 1 of this Example was dispensed into the wells and reacted at room temperature for 20 minutes.
As a result, the labeling enzyme (peroxidase) immobilized on the carrier was allowed to react with the color-developing solution to generate a dye.
（７）前記の発色液の添加２０分後に、０．３５Ｍ硫酸の１００μＬを、前記のウェルに分注して、前記の反応を停止させた。 (7) Twenty minutes after the addition of the color-developing solution, 100 μL of 0.35M sulfuric acid was dispensed into the well to stop the reaction.
（８）マイクロプレートリーダー〔６８０型〕（バイオラッド社）にて、前記のウェル中の液の吸光度（主波長：４５０ｎｍ、副波長：５５０ｎｍ）を測定して、吸光度測定値を得た。 (8) Absorbance (main wavelength: 450 nm, subwavelength: 550 nm) of the solution in the well was measured with a microplate reader [680 type] (Bio-Rad) to obtain an absorbance measurement value.
４．測定結果
これらの測定結果（吸光度測定値）を表５及び図５に示した。なお、表５において、かっこ内の数値は、各濃度の塩化ナトリウムを含有する試薬のイオン強度（ｍｏｌ／Ｌ）を示す。
4. Measurement results These measurement results (absorbance measurement values) are shown in Table 5 and FIG. In Table 5, the value in parentheses indicates the ionic strength (mol/L) of the reagent containing sodium chloride at each concentration.
５．考察
表５から明らかなように、塩化ナトリウム濃度が２００ｍＭ（すなわちイオン強度が０．２２６ｍｏｌ／Ｌ）の場合は、塩化ナトリウム濃度が１５０ｍＭ（すなわちイオン強度が０．１７６ｍｏｌ／Ｌ）の場合に比較して、全ての試料で、測定により得られる測定値（吸光度）が減少してしまっていることが分かる。すなわち、シグナルの生成が大きく減少し、測定の感度が低下してしまっていることが分かる。
5. Discussion As is clear from Table 5, when the sodium chloride concentration is 200 mM (that is, the ionic strength is 0.226 mol/L), it is compared with when the sodium chloride concentration is 150 mM (that is, the ionic strength is 0.176 mol/L). Thus, it can be seen that the measured value (absorbance) obtained by the measurement has decreased in all the samples. In other words, it can be seen that the signal generation is greatly reduced and the measurement sensitivity is reduced.
これに対して、塩化ナトリウム濃度が１００ｍＭ（すなわちイオン強度が０．１２６ｍｏｌ／Ｌ）の場合は、塩化ナトリウム濃度が１５０ｍＭ（すなわちイオン強度が０．１７６ｍｏｌ／Ｌ）の場合に比較して、測定により得られる測定値（吸光度）の減少が小さくなっており、生成するシグナルの増加、すなわち測定の感度が上昇していることが分かる。 On the other hand, when the sodium chloride concentration is 100 mM (that is, the ionic strength is 0.126 mol/L), it is measured by comparison with when the sodium chloride concentration is 150 mM (that is, the ionic strength is 0.176 mol/L). It can be seen that the decrease in the measured value (absorbance) obtained is small, and the generated signal is increased, that is, the measurement sensitivity is increased.
また、塩化ナトリウム濃度が５０ｍＭ（すなわちイオン強度が０．０７６ｍｏｌ／Ｌ）の場合は、塩化ナトリウム濃度が１５０ｍＭ（すなわちイオン強度が０．１７６ｍｏｌ／Ｌ）の場合に比較して、測定により得られる測定値（吸光度）は、いずれも減少しておらず、生成するシグナルの増加、すなわち測定の感度の上昇が顕著であることが分かる。 Further, when the sodium chloride concentration is 50 mM (that is, the ionic strength is 0.076 mol/L), the measurement obtained by the measurement is compared to when the sodium chloride concentration is 150 mM (that is, the ionic strength is 0.176 mol/L). None of the values (absorbance) decreased, and it can be seen that the increase in the signal generated, that is, the increase in the measurement sensitivity is remarkable.
これらのことより、試料中の抗糖脂質抗体を、糖脂質抗原と抗原抗体反応させることにより測定する測定試薬及び測定方法において、イオン強度を０．１７ｍｏｌ／Ｌ以下にすることにより、試料中の抗糖脂質抗体を感度高く測定できることが確かめられた。
よって、本発明の試料中の抗糖脂質抗体測定試薬及び測定方法は、生成するシグナルの減少を防ぎ、測定の感度を上昇させ、正確な測定結果を得ることができることが確かめられた。
From these facts, in the measuring reagent and the measuring method for measuring the anti-glycolipid antibody in the sample by reacting the glycolipid antigen with the antigen-antibody, by setting the ionic strength to 0.17 mol/L or less, It was confirmed that the anti-glycolipid antibody can be measured with high sensitivity.
Therefore, it was confirmed that the antiglycolipid antibody measuring reagent in the sample and the measuring method of the present invention can prevent the decrease of the generated signal, increase the sensitivity of the measurement, and obtain accurate measurement results.
〔実施例６〕（異なるイオン強度での抗糖脂質抗体の測定）
塩化ナトリウム濃度を変えることによりイオン強度を変え、標識免疫測定法により試料中の抗ＧＤ１ｂ抗体（抗糖脂質抗体）の測定を行った。
[Example 6] (Measurement of anti-glycolipid antibody at different ionic strengths)
The ionic strength was changed by changing the sodium chloride concentration, and the anti-GD1b antibody (anti-glycolipid antibody) in the sample was measured by the labeled immunoassay method.
１．試薬の調製 1. Preparation of reagents
（１）試料希釈液の調製
前記実施例１の１の（１）で調製した試料希釈液をそのまま使用した。
(1) Preparation of sample diluent The sample diluent prepared in (1) of 1 of Example 1 was used as it was.
（２）ＧＤ１ｂ抗原固相化担体の調製
ガングリオシドＧＤ１ｂ（シグマ社）を１ウェル当たり２００ｎｇずつポリスチレンプレート〔ＰｏｌｙＳｏｒｐ〕（ヌンク社）のウェルに分注し、一定時間放置して、前記ガングリオシドＧＤ１ｂを前記ポリスチレンプレートの各ウェルに固相化した。
(2) Preparation of GD1b antigen-immobilized carrier Ganglioside GD1b (Sigma) was dispensed in an amount of 200 ng per well to a well of a polystyrene plate [PolySorp] (Nunc) and left for a certain period of time to allow the ganglioside GD1b to be treated as described above. Each well of a polystyrene plate was immobilized.
次に、このガングリオシドＧＤ１ｂが固相化されたウェルに１．５％ＢＳＡ溶液（ｐＨ７．７）を１ウェル当たり２００μＬずつ分注し、一定時間放置してブロッキング処理を行い、ＧＤ１ｂ抗原固相化担体を調製した。 Next, 200 μL of 1.5% BSA solution (pH 7.7) was dispensed to each well in which the ganglioside GD1b was immobilized, 200 μL per well, and allowed to stand for a certain period of time for blocking treatment to immobilize the GD1b antigen. A carrier was prepared.
（３）洗浄液の調製
前記実施例１の１の（３）で調製した洗浄液をそのまま使用した。
(3) Preparation of Cleaning Solution The cleaning solution prepared in (3) of 1 of Example 1 was used as it was.
（４）酵素標識抗体
前記実施例１の１の（４）の酵素標識抗体をそのまま使用した。
(4) Enzyme-labeled antibody The enzyme-labeled antibody of (4) of 1 of Example 1 was used as it was.
（５）発色液
前記実施例１の１の（５）の発色液をそのまま使用した。
(5) was used as the coloring solution coloring solution above in Example 1 1 (5).
２．試料
抗ＧＤ１ｂ抗体陽性血清：
抗ＧＤ１ｂ抗体を含むことが確認されている２種類の血清を、抗ＧＤ１ｂ抗体陽性血清として用意した。
2. Sample Anti-GD1b antibody-positive serum:
Two types of sera confirmed to contain anti-GD1b antibody were prepared as anti-GD1b antibody-positive sera.
３．試料中の抗糖脂質抗体の測定
（１）試料である本実施例の２の２種類の抗ＧＤ１ｂ抗体陽性血清を本実施例の１の（１）の４種類の試料希釈液により、それぞれ１００倍に希釈して混合液を調製した。
3. Measurement of Anti-Glycolipid Antibody in Sample (1) Two kinds of anti-GD1b antibody-positive sera of Example 2 (2) of the present Example were diluted to 100 with each of the four kinds of sample diluents of (1) of Example 1 of the present invention. A mixed solution was prepared by doubling the dilution.
（２）前記（１）で調製した混合液の各々を、本実施例の１の（２）のＧＤ１ｂ抗原固相化担体の各ウェルに１００μＬずつ分注し、これを４℃にて一晩静置した。
これにより、担体に固相化されているＧＤ１ｂ抗原と試料に含まれていた抗ＧＤ１ｂ抗体を接触させ、反応させた。
(2) 100 μL of each of the mixed solutions prepared in (1) above was dispensed into each well of the GD1b antigen-immobilized carrier of (2) of 1 of this example, and this was overnight at 4° C. I let it stand.
As a result, the GD1b antigen immobilized on the carrier and the anti-GD1b antibody contained in the sample were brought into contact with each other and reacted.
（３）次に、前記のウェルより、前記の混合液を吸引して除去した。
そして、このウェルを、本実施例の１の（３）の洗浄液で洗浄した。
(3) Next, the mixed solution was aspirated and removed from the well.
Then, this well was washed with the washing solution of (3) of 1 of this Example.
（４）本実施例の１の（４）の酵素標識抗体を、１％ＢＳＡを含むトリス緩衝液で２，０００倍希釈した。次にこれを、前記の洗浄操作を行ったウェルに１００μＬずつ分注して、室温で２時間反応させた。 (4) The enzyme-labeled antibody of (4) of 1 of this Example was diluted 2000 times with a Tris buffer containing 1% BSA. Next, 100 μL of this was dispensed into each well subjected to the above washing operation, and reacted at room temperature for 2 hours.
（５）その後、前記のウェルより、未結合の酵素標識抗体を吸引して除去した。そして、このウェルを、本実施例の１の（３）の洗浄液で洗浄した。 (5) Then, the unbound enzyme-labeled antibody was removed by suction from the well. Then, this well was washed with the washing solution of (3) of 1 of this Example.
（６）次に、本実施例の１の（５）の発色液の１００μＬを、前記のウェルに分注し、室温で２０分間反応させた。
これにより、担体に固定化された標識酵素（ペルオキシダーゼ）と、発色液を反応させて、色素を生成させた。
(6) Next, 100 μL of the color-developing solution of (5) of 1 of this Example was dispensed into the wells and reacted at room temperature for 20 minutes.
As a result, the labeling enzyme (peroxidase) immobilized on the carrier was allowed to react with the color-developing solution to generate a dye.
（７）前記の発色液の添加２０分後に、０．３５Ｍ硫酸の１００μＬを、前記のウェルに分注して、前記の反応を停止させた。 (7) Twenty minutes after the addition of the color-developing solution, 100 μL of 0.35M sulfuric acid was dispensed into the well to stop the reaction.
（８）マイクロプレートリーダー〔６８０型〕（バイオラッド社）にて、前記のウェル中の液の吸光度（主波長：４５０ｎｍ、副波長：５５０ｎｍ）を測定して、吸光度測定値を得た。 (8) Absorbance (main wavelength: 450 nm, subwavelength: 550 nm) of the solution in the well was measured with a microplate reader [680 type] (Bio-Rad) to obtain an absorbance measurement value.
４．測定結果
これらの測定結果（吸光度測定値）を表６及び図６に示した。なお、表６において、かっこ内の数値は、各濃度の塩化ナトリウムを含有する試薬のイオン強度（ｍｏｌ／Ｌ）を示す。
4. Measurement Results These measurement results (absorbance measurement values) are shown in Table 6 and FIG. In Table 6, the value in parentheses indicates the ionic strength (mol/L) of the reagent containing sodium chloride at each concentration.
５．考察
表６から明らかなように、塩化ナトリウム濃度が２００ｍＭ（すなわちイオン強度が０．２２６ｍｏｌ／Ｌ）の場合は、塩化ナトリウム濃度が１５０ｍＭ（すなわちイオン強度が０．１７６ｍｏｌ／Ｌ）の場合に比較して、いずれの試料も、測定により得られる測定値（吸光度）が減少してしまっていることが分かる。すなわち、シグナルの生成が大きく減少し、測定の感度が低下してしまっていることが分かる。
5. Discussion As is clear from Table 6, when the sodium chloride concentration is 200 mM (that is, the ionic strength is 0.226 mol/L), it is compared with when the sodium chloride concentration is 150 mM (that is, the ionic strength is 0.176 mol/L). Thus, it can be seen that the measured value (absorbance) obtained by the measurement is decreased in all the samples. In other words, it can be seen that the signal generation is greatly reduced and the measurement sensitivity is reduced.
これに対して、塩化ナトリウム濃度が１００ｍＭ（すなわちイオン強度が０．１２６ｍｏｌ／Ｌ）の場合は、塩化ナトリウム濃度が１５０ｍＭ（すなわちイオン強度が０．１７６ｍｏｌ／Ｌ）の場合に比較して、測定により得られる測定値（吸光度）の減少が小さくなっており、生成するシグナルの増加、すなわち測定の感度が上昇していることが分かる。 On the other hand, when the sodium chloride concentration is 100 mM (that is, the ionic strength is 0.126 mol/L), it is measured by comparison with when the sodium chloride concentration is 150 mM (that is, the ionic strength is 0.176 mol/L). It can be seen that the decrease in the measured value (absorbance) obtained is small, and the generated signal is increased, that is, the measurement sensitivity is increased.
また、塩化ナトリウム濃度が５０ｍＭ（すなわちイオン強度が０．０７６ｍｏｌ／Ｌ）の場合は、塩化ナトリウム濃度が１５０ｍＭ（すなわちイオン強度が０．１７６ｍｏｌ／Ｌ）の場合に比較して、測定により得られる測定値（吸光度）は、いずれも減少しておらず、生成するシグナルの増加、すなわち測定の感度の上昇が顕著であることが分かる。 Further, when the sodium chloride concentration is 50 mM (that is, the ionic strength is 0.076 mol/L), the measurement obtained by the measurement is compared to when the sodium chloride concentration is 150 mM (that is, the ionic strength is 0.176 mol/L). None of the values (absorbance) decreased, and it can be seen that the increase in the signal generated, that is, the increase in the measurement sensitivity is remarkable.
これらのことより、試料中の抗糖脂質抗体を、糖脂質抗原と抗原抗体反応させることにより測定する測定試薬及び測定方法において、イオン強度を０．１７ｍｏｌ／Ｌ以下にすることにより、試料中の抗糖脂質抗体を感度高く測定できることが確かめられた。
よって、本発明の試料中の抗糖脂質抗体測定試薬及び測定方法は、生成するシグナルの減少を防ぎ、測定の感度を上昇させ、正確な測定結果を得ることができることが確かめられた。
From these facts, in the measuring reagent and the measuring method for measuring the anti-glycolipid antibody in the sample by reacting the glycolipid antigen with the antigen-antibody, by setting the ionic strength to 0.17 mol/L or less, It was confirmed that the anti-glycolipid antibody can be measured with high sensitivity.
Therefore, it was confirmed that the antiglycolipid antibody measuring reagent in the sample and the measuring method of the present invention can prevent the decrease of the generated signal, increase the sensitivity of the measurement, and obtain accurate measurement results.
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