JP6963790B2 - Anti-ganglioside antibody measurement method, anti-ganglioside antibody measurement reagent kit, washing solution and method for improving sensitivity in anti-ganglioside antibody measurement - Google Patents
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Description
本発明は、担体に固定化したガングリオシドを使用した試料中の抗ガングリオシド抗体の測定に関するものである。
本発明は、糖脂質分野、生化学分野、分析化学分野、臨床検査分野及び生命科学分野等において重要なものであるが、特に神経疾患等の診断において重要なものである。
The present invention relates to the measurement of an anti-ganglioside antibody in a sample using a ganglioside immobilized on a carrier.
The present invention is important in the fields of glycolipids, biochemistry, analytical chemistry, clinical examinations, life sciences, etc., but is particularly important in the diagnosis of neurological diseases and the like.
ガングリオシド（シアロ糖脂質；シアル酸を含むスフィンゴ糖脂質の総称）は、従来より神経組織に多く存在することが知られており、神経組織のガングリオシドに反応する抗体が体液中に産生されると重篤な神経症状を起こすことが知られるようになってきた。
これらの自己抗体は、先行感染した菌体に対するものとして体内に産生され、これが神経組織のガングリオシドと交差反応し、自己抗体として神経を傷害する自己免疫型の神経疾患を起こすことが知られている。
Gangliosides (sialoglycolipids; a general term for sphingoglycolipids containing sialic acid) have been known to be abundant in nerve tissues, and when an antibody that reacts with gangliosides in nerve tissues is produced in body fluids, it is important. It has become known to cause serious neurological symptoms.
It is known that these autoantibodies are produced in the body against pre-infected cells, which cross-react with gangliosides in nerve tissue and cause autoimmune type neurological diseases that damage nerves as autoantibodies. ..
例えば、ガングリオシドに対する抗体（抗ガングリオシド抗体）の一つであるＩｇＧ型の抗ＧＭ１ａ抗体は、急性軸策型ギラン・バレー症候群などの運動神経疾患に関与することが知られている。
急性軸策型ギラン・バレー症候群の場合、食中毒菌として知られる菌体Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉが先行感染し、菌体のリポ多糖（ＬＰＳ）上のＧＭ１ａと類似のガングリオシド構造部分に対する抗体が体内に産生されることにより発病する（例えば、非特許文献１）。
そして、この抗体は血液中に見い出されることが判明している（例えば、非特許文献２及び非特許文献３）。
For example, IgG-type anti-GM1a antibody, which is one of the antibodies against ganglioside (anti-ganglioside antibody), is known to be involved in motor nerve diseases such as acute axon-type Guillain-Barré syndrome.
In the case of acute axon Guillain-Barré syndrome, the bacterium Campylobacter jejuni known as food poisoning bacterium is pre-infected, and an antibody against a ganglioside structural part similar to GM1a on the lipopolysaccharide (LPS) of the bacterium is produced in the body. (For example, Non-Patent Document 1).
Then, this antibody has been found to be found in blood (for example, Non-Patent Document 2 and Non-Patent Document 3).
また、別の抗ガングリオシド抗体であるＩｇＧ型の抗ＧＱ１ｂ抗体は、フィッシャー症候群やビッカースタッフ型脳幹脳炎などの神経疾患に関与しており、その所見は脳幹梗塞などの他の中枢神経系疾患と類似しているが、その治療法は全く異なる。
そして、この抗体も患者血清中に見い出されることが判明している（例えば、非特許文献４及び非特許文献５）。
その他、感覚失調型ポリニューロパシーで抗ＧＤ２抗体、抗ＧＴ１ｂ抗体、及び抗ＧＱ１ｂ抗体が上昇するとの報告がある。
また、ガングリオシドと反応する抗体が癌患者由来試料より検出されるとの報告もある。
In addition, another anti-ganglioside antibody, IgG-type anti-GQ1b antibody, is involved in neurological diseases such as Miller Fisher's syndrome and Bickerstaff-type brainstem encephalitis, and its findings are similar to those of other central nervous system diseases such as brainstem infarction. However, the treatment method is completely different.
This antibody has also been found to be found in patient sera (eg, Non-Patent Document 4 and Non-Patent Document 5).
In addition, it has been reported that anti-GD2 antibody, anti-GT1b antibody, and anti-GQ1b antibody are increased by ataxic polyneuropathy.
There is also a report that an antibody that reacts with ganglioside is detected in a sample derived from a cancer patient.
以上のように、研究レベルでは各種疾患と抗ガングリオシド抗体の関係が解き明かされ、臨床現場で使用できる抗ガングリオシド抗体の測定方法として、ＥＬＩＳＡ法による測定が実用化されている（例えば、特許文献１、特許文献２及び非特許文献６）。 As described above, the relationship between various diseases and anti-ganglioside antibodies has been clarified at the research level, and measurement by the ELISA method has been put into practical use as a method for measuring anti-ganglioside antibodies that can be used in clinical practice (for example, Patent Document 1, Patent Document 2 and Non-Patent Document 6).
しかしながら、抗ガングリオシド抗体の測定方法として使用されているＥＬＩＳＡ法は、検体によっては、その測定の感度が十分でないという問題があった。このため、試料中の抗ガングリオシド抗体の測定値を疾患の検査に利用しようとする場合、この疾患の診断を誤らせる可能性があった。
従って、試料中の抗ガングリオシド抗体を、ガングリオシドと抗原抗体反応させることにより測定を行う場合、更なる測定感度の改善が望まれていた。
However, the ELISA method used as a method for measuring an anti-ganglioside antibody has a problem that the sensitivity of the measurement is not sufficient depending on the sample. Therefore, when the measured value of the anti-ganglioside antibody in the sample is to be used for the examination of the disease, there is a possibility that the diagnosis of the disease may be misleading.
Therefore, when the measurement is performed by reacting the anti-ganglioside antibody in the sample with the ganglioside with an antigen-antibody reaction, further improvement in measurement sensitivity has been desired.
従って、本発明の課題は、担体に固定化したガングリオシドとの抗原抗体反応による試料中の抗ガングリオシド抗体の測定を高感度に行えるようにし、正確な測定結果が得られる方法、測定試薬キット及び洗浄液を提供することである。 Therefore, an object of the present invention is to enable highly sensitive measurement of an anti-ganglioside antibody in a sample by an antigen-antibody reaction with a ganglioside immobilized on a carrier, and to obtain an accurate measurement result, a measurement reagent kit and a washing solution. Is to provide.
本発明者らは、上記課題の解決を目指して鋭意検討を行った結果、試料中の抗ガングリオシド抗体を、担体に固定化したガングリオシドと抗原抗体反応させることにより測定する方法及び試薬キットにおいて、未反応の成分を除去するための洗浄液として、イオン強度が１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下である洗浄液を使用することにより、測定の感度を向上させることができることを初めて見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of diligent studies aimed at solving the above problems, the present inventors have not yet found a method and reagent kit for measuring an anti-ganglioside antibody in a sample by reacting it with an antigen-antibody reaction with a ganglioside immobilized on a carrier. For the first time, it has been found that the sensitivity of measurement can be improved by using a cleaning solution having an ion intensity of 150 mmol / L or less as a cleaning solution for removing the components of the reaction, and the present invention has been completed.
すなわち、本発明は、以下の発明よりなる。
［１］ 試料中の抗ガングリオシド抗体を、担体に固定化したガングリオシドと抗原抗体反応させることにより測定する方法において、未反応の成分を除去するための洗浄液として、イオン強度が６８ｍｍｏｌ／Ｌ以上かつ１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下である洗浄液を使用することを特徴とする試料中の抗ガングリオシド抗体の測定方法。
［２］ 試料中の抗ガングリオシド抗体を、担体に固定化したガングリオシドと抗原抗体反応させることにより測定する測定試薬キットにおいて、未反応の成分を除去するための洗浄液として、イオン強度が６８ｍｍｏｌ／Ｌ以上かつ１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下である洗浄液を含むことを特徴とする試料中の抗ガングリオシド抗体の測定試薬キット。
［３］ 試料中の抗ガングリオシド抗体を、担体に固定化したガングリオシドと抗原抗体反応させることにより測定する際に未反応の成分を除去するための洗浄液であって、イオン強度が６８ｍｍｏｌ／Ｌ以上かつ１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることを特徴とする洗浄液。
［４］ 試料中の抗ガングリオシド抗体を、担体に固定化したガングリオシドと抗原抗体反応させることにより測定する方法において、未反応の成分を除去するための洗浄液として、イオン強度が６８ｍｍｏｌ／Ｌ以上かつ１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下である洗浄液を使用することを特徴とする試料中の抗ガングリオシド抗体の測定の感度の向上方法。
That is, the present invention comprises the following invention.
[1] In a method of measuring by reacting an anti-ganglioside antibody in a sample with a ganglioside immobilized on a carrier by an antigen-antibody reaction, the ion intensity is 68 mmol / L or more and 150 mmol as a washing solution for removing unreacted components. A method for measuring an anti-ganglioside antibody in a sample, which comprises using a washing solution having a / L or less.
[2] In a measurement reagent kit for measuring by reacting an anti-ganglioside antibody in a sample with a ganglioside immobilized on a carrier with an antigen antibody, an ion intensity of 68 mmol / L or more is used as a cleaning solution for removing unreacted components. A reagent kit for measuring an anti-ganglioside antibody in a sample, which comprises a washing solution containing 150 mmol / L or less.
[3] A washing solution for removing unreacted components when measuring by reacting an anti-ganglioside antibody in a sample with a ganglioside immobilized on a carrier with an antigen-antibody, and having an ionic strength of 68 mmol / L or more. A cleaning solution characterized by being 150 mmol / L or less.
[4] In a method of measuring by reacting an anti-ganglioside antibody in a sample with a ganglioside immobilized on a carrier by an antigen-antibody reaction, the ion intensity is 68 mmol / L or more and 150 mmol as a washing solution for removing unreacted components. A method for improving the sensitivity of measurement of an anti-ganglioside antibody in a sample, which comprises using a washing solution having a / L or less.
本発明の抗ガングリオシド抗体測定方法、抗ガングリオシド抗体測定試薬キット、洗浄液及び抗ガングリオシド抗体測定における感度の向上方法は、試料中の抗ガングリオシド抗体の測定の感度を向上させたものである。
これにより、本発明においては、低値の抗ガングリオシド抗体までも再現性よく正確に測定することができるようになったものである。
The anti-ganglioside antibody measuring method, the anti-ganglioside antibody measuring reagent kit, the washing solution, and the method for improving the sensitivity in the anti-ganglioside antibody measuring of the present invention are those in which the sensitivity of measuring the anti-ganglioside antibody in the sample is improved.
As a result, in the present invention, even a low-value anti-ganglioside antibody can be measured accurately with good reproducibility.
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
Hereinafter, the present invention will be described in detail. The following embodiments are examples for explaining the present invention, and the present invention is not intended to be limited to this embodiment. The present invention can be implemented in various forms as long as it does not deviate from the gist thereof.
All publications cited herein, such as prior art documents, publications, patent gazettes and other patent documents, are incorporated herein by reference.
［１］洗浄液
１．総論
本発明の試料中の抗ガングリオシド抗体の測定方法においては、試料中の抗ガングリオシド抗体を、担体に固定化したガングリオシドと抗原抗体反応させることにより測定する方法において、未反応の成分を除去するための洗浄液として、イオン強度が１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下である洗浄液を使用することを特徴とするものである。
[1] Cleaning solution 1. General remarks In the method for measuring the anti-ganglioside antibody in the sample of the present invention, the unreacted component is removed in the method for measuring by reacting the anti-ganglioside antibody in the sample with the ganglioside immobilized on the carrier. The cleaning solution is characterized in that a cleaning solution having an ion intensity of 150 mmol / L or less is used.
また、本発明の試料中の抗ガングリオシド抗体の測定試薬キットにおいては、試料中の抗ガングリオシド抗体を、担体に固定化したガングリオシドと抗原抗体反応させることにより測定する測定試薬キットにおいて、未反応の成分を除去するための洗浄液として、イオン強度が１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下である洗浄液を含むことを特徴とするものである。 Further, in the measurement reagent kit for the anti-ganglioside antibody in the sample of the present invention, the unreacted component in the measurement reagent kit for measuring by reacting the anti-ganglioside antibody in the sample with the ganglioside immobilized on the carrier. The cleaning solution for removing the above is characterized by containing a cleaning solution having an ion intensity of 150 mmol / L or less.
また、本発明の洗浄液は、試料中の抗ガングリオシド抗体を、担体に固定化したガングリオシドと抗原抗体反応させることにより測定する際に未反応の成分を除去するための洗浄液であって、イオン強度が１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることを特徴とするものである。 Further, the cleaning solution of the present invention is a cleaning solution for removing unreacted components when measuring by reacting an anti-ganglioside antibody in a sample with a ganglioside immobilized on a carrier with an antigen-antibody reaction, and has an ionic strength. It is characterized by being 150 mmol / L or less.
また、本発明の試料中の抗ガングリオシド抗体の測定の感度の向上方法においては、試料中の抗ガングリオシド抗体を、担体に固定化したガングリオシドと抗原抗体反応させることにより測定する方法において、未反応の成分を除去するための洗浄液として、イオン強度が１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下である洗浄液を使用することを特徴とするものである。 Further, in the method for improving the sensitivity of measurement of the anti-ganglioside antibody in the sample of the present invention, the method of measuring by reacting the anti-ganglioside antibody in the sample with the ganglioside immobilized on the carrier by an antigen-antibody reaction is unreacted. As a cleaning solution for removing components, a cleaning solution having an ion intensity of 150 mmol / L or less is used.
本発明においては、以上のことにより、試料中の抗ガングリオシド抗体の測定の感度を向上させることができるものである。 In the present invention, the sensitivity of the measurement of the anti-ganglioside antibody in the sample can be improved by the above.
２．洗浄液の成分等
本発明において、洗浄液としては、水又は水溶液等を挙げることができる。
本発明における洗浄液が水溶液である場合、当該洗浄液は緩衝剤、塩類、界面活性剤、又は防腐剤等を含有することができる。
2. Components of cleaning liquid, etc. In the present invention, examples of the cleaning liquid include water, an aqueous solution, and the like.
When the cleaning liquid in the present invention is an aqueous solution, the cleaning liquid can contain a buffer, salts, surfactants, preservatives and the like.
（１）ｐＨ
本発明において、洗浄液のｐＨは特に限定はないものの、ｐＨ６．０［２０°Ｃ］以上とすることが好ましく、ｐＨ７．０［２０°Ｃ］以上とすることが特に好ましい。
(1) pH
In the present invention, the pH of the cleaning liquid is not particularly limited, but is preferably pH 6.0 [20 ° C] or higher, and particularly preferably pH 7.0 [20 ° C] or higher.
また、この洗浄液のｐＨは、ｐＨ９．０［２０°Ｃ］以下とすることが好ましく、ｐＨ８．０［２０°Ｃ］以下とすることが特に好ましい。 The pH of this cleaning solution is preferably pH 9.0 [20 ° C] or less, and particularly preferably pH 8.0 [20 ° C] or less.
（２）緩衝剤
本発明においては、洗浄液に、緩衝剤を適宜必要に応じて存在させることができる。
(2) Buffering agent In the present invention, a buffering agent can be appropriately present in the cleaning liquid as needed.
例えば、前記の「（１）ｐＨ」に記載のｐＨ域等において緩衝能を有する緩衝剤を、緩衝能を有する濃度において、洗浄液に含有させることができる。 For example, a buffer having a buffering ability in the pH range or the like described in the above "(1) pH" can be contained in the washing liquid at a concentration having a buffering ability.
このような緩衝剤としては、例えば、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプロパン、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＰＳ、ＭＥＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＨＥＰＰＳ、ＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳＯ、ＣＡＰＳ、リン酸、リン酸塩、ホウ酸、ホウ酸塩、グリシン、グリシルグリシン、イミダゾール、又はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン〔Ｔｒｉｓ〕等を挙げることができる。 Examples of such a buffer include MES, Bis-Tris, Bis-Tris propane, ADA, PIPES, ACES, MOPSO, MOPS, MES, BES, TES, HEPES, DIPSO, TAPSO, POPSO, HEPPSO, HEPPS, and EPPS. , Tricine, Bicine, TAPS, MES, CAPSO, CAPS, phosphoric acid, phosphate, boric acid, borate, glycine, glycylglycine, imidazole, tris (hydroxymethyl) aminomethane [Tris] and the like. Can be done.
なお、本発明の洗浄液においては、前記の「（１）ｐＨ」に記載のｐＨ域のｐＨとなるように、当該洗浄液のｐＨを設定することが好ましい。
このため、前記の「（１）ｐＨ」に記載のｐＨ域等において緩衝能を有する緩衝剤を、緩衝能を有する濃度において、洗浄液に含有させることが好ましい。
In the cleaning solution of the present invention, it is preferable to set the pH of the cleaning solution so that the pH is in the pH range described in "(1) pH" above.
Therefore, it is preferable to include a buffer having a buffering ability in the pH range or the like described in the above "(1) pH" in the washing liquid at a concentration having a buffering ability.
なお、本発明における緩衝剤としては、グッドの緩衝剤又はリン酸塩が好ましい。 As the buffer in the present invention, Good's buffer or phosphate is preferable.
（３）塩類
本発明においては、洗浄液に、塩類を適宜必要に応じて存在させることができる。
(3) Salts In the present invention, salts can be appropriately present in the cleaning liquid as needed.
この塩類としては、例えば、その陽イオンがアルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、アンモニウムイオン、又はその他の金属イオン等である塩類を挙げることができる。 Examples of the salts include salts whose cations are alkali metal ions, alkaline earth metal ions, ammonium ions, other metal ions and the like.
アルカリ金属イオンとしては、例えば、リチウムイオン、ナトリウムイオン、又はカリウムイオン等を挙げることができる。 Examples of the alkali metal ion include lithium ion, sodium ion, potassium ion and the like.
アルカリ土類金属イオンとしては、例えば、ベリリウムイオン、マグネシウムイオン、又はカルシウムイオン等を挙げることができる。 Examples of the alkaline earth metal ion include beryllium ion, magnesium ion, calcium ion and the like.
その他の金属イオンとしては、例えば、マンガンイオン、鉄イオン、コバルトイオン、ニッケルイオン、銅イオン、亜鉛イオン、又はアルミニウムイオン等を挙げることができる。 Examples of other metal ions include manganese ion, iron ion, cobalt ion, nickel ion, copper ion, zinc ion, aluminum ion and the like.
また、アンモニウムイオンとしては、例えば、一級のアンモニウムイオン、二級のアンモニウムイオン、三級のアンモニウムイオン、又は四級のアンモニウムイオン等を挙げることができる。 Examples of the ammonium ion include a primary ammonium ion, a secondary ammonium ion, a tertiary ammonium ion, a quaternary ammonium ion and the like.
その他の陽イオンとしては、例えば、炭素原子、ケイ素原子、ホウ素原子、窒素原子（アンモニウムイオン以外の場合において）、リン原子、若しくは硫黄原子などが正の電荷を帯びている原子、又は原子団等を挙げることができる。
この具体的な例としては、炭素原子が正の電荷を帯びているコリンイオン等を挙げることができる。
Other cations include, for example, carbon atoms, silicon atoms, boron atoms, nitrogen atoms (in the case other than ammonium ions), phosphorus atoms, sulfur atoms, etc., which are positively charged atoms, atomic groups, and the like. Can be mentioned.
Specific examples of this include choline ions in which carbon atoms are positively charged.
なお、この陽イオンとしては、１種類のものだけを用いてもよいし、又は複数種類のものを同時に用いてもよい。 As the cation, only one kind may be used, or a plurality of kinds may be used at the same time.
また、本発明における塩類としては、例えば、その陰イオンが、例えば、有機化合物よりなる酸基、ハロゲンイオン、又はその他の無機化合物よりなる酸基等を挙げることができる。 In addition, examples of the salts in the present invention include, for example, an acid group whose anion is composed of an organic compound, a halogen ion, or an acid group composed of another inorganic compound.
この有機化合物よりなる酸基としては、例えば、酢酸イオン、クエン酸イオン、グルコン酸イオン、又はシュウ酸イオン等を挙げることができる。 Examples of the acid group composed of this organic compound include acetate ion, citrate ion, gluconate ion, oxalate ion and the like.
ハロゲンイオンとしては、例えば、フッ素イオン、塩素イオン、臭素イオン、又はヨウ素イオン等を挙げることができる。 Examples of the halogen ion include fluorine ion, chlorine ion, bromine ion, iodine ion and the like.
その他の無機化合物よりなる酸基としては、例えば、硫酸イオン、亜硫酸イオン、ピロ亜硫酸イオン、亜二チオン酸イオン、チオ亜硫酸イオン、硝酸イオン、亜硝酸イオン、次亜硝酸イオン、ペルオキソ亜硝酸イオン、リン酸イオン、亜リン酸イオン、ピロ亜リン酸イオン、次亜リン酸イオン、二リン酸イオン、ホウ酸イオン、炭酸イオン、シアン酸イオン、イソシアン酸イオン、又はケイ酸イオン等を挙げることができる。 Examples of the acid group composed of other inorganic compounds include sulfate ion, sulfite ion, pyrosulfite ion, dithionate ion, thio sulfite ion, nitrate ion, nitrite ion, hyponitrite ion, peroxonitrite ion, and the like. Phosphate ion, phosphite ion, pyrophosphate ion, hypophosphite ion, diphosphate ion, borate ion, carbonate ion, cyanate ion, isocyanate ion, silicate ion and the like can be mentioned. can.
また、この陰イオンとしては、１種類のものだけを用いてもよいし、又は複数種類のものを同時に用いてもよい。 Further, as the anion, only one type may be used, or a plurality of types may be used at the same time.
本発明における塩類としては、アルカリ金属とハロゲンイオンとの塩類、又はアルカリ土類金属とハロゲンイオンとの塩類が好ましく、アルカリ金属とハロゲンイオンとの塩類がより好ましく、塩化ナトリウム、塩化カリウム若しくは塩化リチウムが更に好ましく、塩化ナトリウムが特に好ましい。 As the salts in the present invention, salts of alkali metal and halogen ion, salts of alkaline earth metal and halogen ion are preferable, salts of alkali metal and halogen ion are more preferable, and sodium chloride, potassium chloride or lithium chloride are more preferable. Is more preferable, and sodium chloride is particularly preferable.
（４）界面活性剤
本発明においては、洗浄液に、界面活性剤を適宜必要に応じて存在させることができる。
この界面活性剤としては、例えば、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、及び両性界面活性剤等を挙げることができる。
(4) Surfactant In the present invention, a surfactant can be appropriately present in the cleaning liquid as needed.
Examples of the surfactant include nonionic surfactants, anionic surfactants, cationic surfactants, amphoteric surfactants and the like.
〔１〕非イオン性界面活性剤としては、例えば、以下のもの等を挙げることができる。
（ａ） ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシプロピレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリスチリルフェニルエーテル、又はポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールなどのポリオキシアルキレンエーテル化合物。
[1] Examples of the nonionic surfactant include the following.
(A) Polyoxyalkylene such as polyoxyethylene alkyl ether, polyoxypropylene alkyl ether, polyoxyethylene alkyl phenyl ether, polyoxypropylene alkyl phenyl ether, polyoxyethylene polystyryl phenyl ether, or polyoxyethylene polyoxy propylene glycol. Ether compound.
（ｂ） グリセリン脂肪酸部分エステル、ソルビタン脂肪酸部分エステル、ペンタエリスリトール脂肪酸部分エステル、プロピレングリコールモノ脂肪酸エステル、又はショ糖脂肪酸部分エステルなどの多価アルコール部分エステル化合物。 (B) A polyhydric alcohol partial ester compound such as a glycerin fatty acid partial ester, a sorbitan fatty acid partial ester, a pentaerythritol fatty acid partial ester, a propylene glycol monofatty acid ester, or a sucrose fatty acid partial ester.
（ｃ） ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸部分エステル、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸部分エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸部分エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸部分エステル、又はポリオキシエチレン化ひまし油などのポリオキシエチレン化多価アルコール脂肪酸エステル。 (C) Polyoxyethylene sorbitan fatty acid partial ester, polyoxyethylene sorbitol fatty acid partial ester, polyoxyethylene glycerin fatty acid partial ester, polyethylene glycol fatty acid ester, polyglycerin fatty acid partial ester, or polyoxyethylene acidified castor oil. Polyhydric alcohol fatty acid ester.
（ｄ） 脂肪酸ジエタノールアミド、Ｎ，Ｎ−ビス−２−ヒドロキシアルキルアミン、ポリオキシエチレンアルキルアミン、トリエタノールアミン脂肪酸エステル、又はトリアルキルアミンオキシドなどのアミド若しくはアミン化合物。 (D) An amide or amine compound such as fatty acid diethanolamide, N, N-bis-2-hydroxyalkylamine, polyoxyethylenealkylamine, triethanolamine fatty acid ester, or trialkylamine oxide.
〔２〕陰イオン性界面活性剤としては、例えば、以下のもの等を挙げることができる。
（ａ） 脂肪族モノカルボン酸塩、Ｎ−アシロイルサルコシン塩、Ｎ−アシロイル−β−アラニン塩、若しくはＮ−アシロイルグルタミン酸塩などの脂肪族化合物カルボン酸塩；又はアビエチン酸塩などの環式化合物カルボン酸塩。
[2] Examples of the anionic surfactant include the following.
(A) Aliphatic compound carboxylates such as aliphatic monocarboxylates, N-acyloyl sarcosin salts, N-acyloyl-β-alanine salts, or N-acyloyl glutamate; or cyclics such as avietate. Compound carboxylate.
（ｂ） ジアルキルスルホコハク酸塩、アルカンスルホン酸塩、若しくはヒドロキシアルカンスルホン酸塩などの脂肪族化合物スルホン酸塩；直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル（分岐鎖）ベンゼンスルホン酸塩、アルキルナフタレンスルホン酸塩、アルキルフェノキシポリオキシエチレンプロピルスルホン酸塩、ポリオキシエチレンアルキルフェノールスルホン酸塩、若しくはナフタレンスルホン酸塩−ホルムアルデヒド縮合物などの環式化合物スルホン酸塩；又はＮ−メチル−Ｎ−オレイルタウリンナトリウム、若しくはＮ−アルキルスルホコハク酸モノアミド二ナトリウム塩などの含窒素化合物スルホン酸塩。 (B) aliphatic compound sulfonates such as dialkyl sulfosuccinate, alkane sulfonate, or hydroxyalcan sulfonate; linear alkyl benzene sulfonate, alkyl (branched chain) benzene sulfonate, alkyl naphthalene sulfonate. , Alkylphenoxypolyoxyethylenepropyl sulfonate, polyoxyethylene alkylphenol sulfonate, or cyclic compound sulfonate such as naphthalene sulfonate-formaldehyde condensate; or N-methyl-N-oleyl taurine sodium, or N -Nitrogen-containing compound sulfonates such as alkyl sulfosuccinic acid monoamide disodium salts.
（ｃ） 硫酸化ひまし油、硫酸化牛脚油、脂肪酸アルキルエステル・硫酸エステル塩、アルキル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステル塩、脂肪酸モノグリセリド硫酸エステル塩、若しくはポリオキシエチレンアルキロイルアミド硫酸塩などの脂肪族化合物硫酸エステル塩；又はポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩、若しくはポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテル硫酸エステル塩などの環式化合物硫酸エステル塩。 (C) Sulfated castor oil, sulfated cow leg oil, fatty acid alkyl ester / sulfate ester salt, alkyl sulfate ester salt, polyoxyethylene alkyl ether sulfate ester salt, fatty acid monoglyceride sulfate ester salt, or polyoxyethylene alkylylamide sulfate. Such as aliphatic compound sulfate ester salts; or polyoxyethylene alkylphenyl ether sulfate ester salts, or cyclic compound sulfate ester salts such as polyoxyethylene styrylphenyl ether sulfate ester salts.
（ｄ） アルキルリン酸エステル塩、若しくはポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸エステル塩などの脂肪族化合物リン酸エステル塩；又はポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルリン酸エステル塩などの環式化合物リン酸エステル塩。 (D) An aliphatic compound phosphoric acid ester salt such as an alkyl phosphate ester salt or a polyoxyethylene alkyl ether phosphoric acid ester salt; or a cyclic compound phosphoric acid ester salt such as a polyoxyethylene alkyl phenyl ether phosphoric acid ester salt.
（ｅ） スチレン−無水マレイン酸共重合物の部分けん化物、又はオレフィン−無水マレイン酸共重合物の部分けん化物などの重合型高分子化合物のけん化物。 (E) A saponified product of a polymerizable polymer compound such as a partially saponified product of a styrene-maleic anhydride copolymer or a partially saponified product of an olefin-maleic anhydride copolymer.
（ｆ） ナフタレンスルホン酸塩−ホルマリン縮合物などの重縮合型高分子化合物。 (F) A polycondensation type polymer compound such as a naphthalene sulfonate-formalin condensate.
〔３〕陽イオン性界面活性剤としては、例えば、以下のもの等を挙げることができる。
（ａ） モノアルキルアミン塩、ジアルキルアミン塩、又はトリアルキルアミン塩などの脂肪族化合物アミン塩。
[3] Examples of the cationic surfactant include the following.
(A) Aliphatic compound amine salts such as monoalkylamine salts, dialkylamine salts, or trialkylamine salts.
（ｂ） テトラアルキルアンモニウム塩などの脂肪族化合物第四級アンモニウム塩；又はトリアルキルベンジルアンモニウム塩、アルキルピリジニウム塩、２−アルキル−１−アルキル−１−ヒドロキシエチルイミダゾリニウム塩、若しくはＮ，Ｎ−ジアルキルモルホリニウム塩などの環状化合物第四級アンモニウム塩。 (B) Quaternary ammonium salts of aliphatic compounds such as tetraalkylammonium salts; or trialkylbenzylammonium salts, alkylpyridinium salts, 2-alkyl-1-alkyl-1-hydroxyethylimidazolinium salts, or N, N -Cyclic compound quaternary ammonium salt such as dialkylmorpholinium salt.
（ｃ） ポリエチレンポリアミン脂肪族アミド塩、ポリエチレンポリアミン脂肪族アミドの尿素縮合物の塩、又はポリエチレンポリアミン脂肪族アミド尿素縮合物の第四級アンモニウム塩などのポリエチレンポリアミン誘導体。 (C) A polyethylene polyamine derivative such as a polyethylene polyamine aliphatic amide salt, a salt of a urea condensate of a polyethylene polyamine aliphatic amide, or a quaternary ammonium salt of a polyethylene polyamine aliphatic amide urea condensate.
〔４〕両性界面活性剤としては、例えば、以下のもの等を挙げることができる。
（ａ） Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−アルキル−Ｎ−カルボキシアルキレンアンモニウムベタインなどのカルボキシベタイン化合物。
[4] Examples of the amphoteric surfactant include the following.
(A) A carboxybetaine compound such as N, N-dimethyl-N-alkyl-N-carboxyalkyleneammonium betaine.
（ｂ） Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノアルキレンカルボン酸塩などのアミノカルボン酸化合物。 (B) Aminocarboxylic acid compounds such as N, N-dialkylaminoalkylene carboxylate.
（ｃ） Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリアルキル−Ｎ−スルホアルキレンアンモニウムベタインなどのスルホベタイン化合物。 (C) A sulfobetaine compound such as N, N, N-trialkyl-N-sulfoalkyleneammonium betaine.
（ｄ） Ｎ−アルキル−Ｎ，Ｎ−ビスポリオキシエチレン硫酸エステル塩などのアミノ硫酸エステル化合物。 (D) Amino sulfate ester compounds such as N-alkyl-N and N-bispolyoxyethylene sulfate ester salts.
（ｅ） ２−アルキル−１−ヒドロキシエチル−１−カルボキシメチルイミダゾリニウム塩などのイミダゾリン化合物。 (E) An imidazoline compound such as 2-alkyl-1-hydroxyethyl-1-carboxymethylimidazolinium salt.
本発明においては、１種類の界面活性剤だけを用いてもよく、又は２種類以上の界面活性剤を組み合わせて用いてもよい。 In the present invention, only one type of surfactant may be used, or two or more types of surfactants may be used in combination.
本発明において、界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤が好ましい。 In the present invention, the surfactant is preferably a nonionic surfactant.
本発明において、洗浄液に含有させる界面活性剤の濃度としては、０．００１％（ｗ／ｖ）以上とすることが好ましく、０．０１％（ｗ／ｖ）以上とすることが特に好ましい。 In the present invention, the concentration of the surfactant contained in the cleaning liquid is preferably 0.001% (w / v) or more, and particularly preferably 0.01% (w / v) or more.
また、洗浄液に含有させる界面活性剤の濃度としては、１．０％（ｗ／ｖ）以下とすることが好ましく、０．１％（ｗ／ｖ）以下とすることが特に好ましい。 The concentration of the surfactant contained in the cleaning liquid is preferably 1.0% (w / v) or less, and particularly preferably 0.1% (w / v) or less.
（５）成分等まとめ
本発明における洗浄剤は、それに含まれる緩衝剤、塩類、及び界面活性剤の全ての成分を含めても、そのイオン強度は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であり、そのようになっていれば良い。
なお、本発明における洗浄剤のイオン強度は、１２０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることが好ましく、１００ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることがより好ましく、７０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることが更に好ましい。
(5) Summary of components, etc. The cleaning agent in the present invention has an ionic strength of 150 mmol / L or less even if all the components of the buffer, salts, and surfactant contained therein are included. I just need to be there.
The ionic strength of the cleaning agent in the present invention is preferably 120 mmol / L or less, more preferably 100 mmol / L or less, and further preferably 70 mmol / L or less.
［２］ガングリオシド
本発明において、ガングリオシドとは、シアル酸を含む糖脂質（シアロ糖脂質）のことであり、シアル酸を含むスフィンゴ糖脂質の総称である。
このガングリオシドとしては、例えば、ＧＭ１、ＧＭ１ｂ、ＧＭ１−Ｆｕｃ、ＧＭ２、ＧＭ３、ＧＭ３（ＮｅｕＧｃ）、ＧＭ４、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＤ３（ＮｅｕＡｃ／ＮｅｕＧｃ）、ＧＤ３（ＮｅｕＧｃ）２、ＧＴ１ａ、ＧＴ１ｂ、ＧＴ１ｃ、ＧＱ１ａ、ＧＱ１ｂ、ＧＱ１ｃ、ＧＰ１ａ、ＧＰ１ｂ、ＧＰ１ｃ、又はＬＭ１等を挙げることができる。
[2] Ganglioside In the present invention, ganglioside is a glycolipid containing sialic acid (sialoglycolipid), and is a general term for sphingoglycolipids containing sialic acid.
Examples of the ganglioside include GM1, GM1b, GM1-Fuc, GM2, GM3, GM3 (NeuGc), GM4, GD1a, GD1b, GD2, GD3, GD3 (NeuAc / NeuGc), GD3 (NeuGc) 2, TG1. , GT1c, GQ1a, GQ1b, GQ1c, GP1a, GP1b, GP1c, LM1 and the like.
［３］抗ガングリオシド抗体
本発明において、抗ガングリオシド抗体は、前記したガングリオシドに対して特異的に結合することができる抗体である。
[3] Anti-ganglioside antibody In the present invention, the anti-ganglioside antibody is an antibody capable of specifically binding to the above-mentioned ganglioside.
なお、抗ガングリオシド抗体としては、例えば、抗ＧＭ１抗体、抗ＧＭ１ｂ抗体、抗ＧＭ１−Ｆｕｃ抗体、抗ＧＭ２抗体、抗ＧＭ３抗体、抗ＧＭ３（ＮｅｕＧｃ）抗体、抗ＧＭ４抗体、抗ＧＤ１ａ抗体、抗ＧＤ１ｂ抗体、抗ＧＤ２抗体、抗ＧＤ３抗体、抗ＧＤ３（ＮｅｕＡｃ／ＮｅｕＧｃ）抗体、抗ＧＤ３（ＮｅｕＧｃ）２抗体、抗ＧＴ１ａ抗体、抗ＧＴ１ｂ抗体、抗ＧＴ１ｃ抗体、抗ＧＱ１ａ抗体、抗ＧＱ１ｂ抗体、抗ＧＱ１ｃ抗体、抗ＧＰ１ａ抗体、抗ＧＰ１ｂ抗体、抗ＧＰ１ｃ抗体、又は抗ＬＭ１抗体等を挙げることができる。 Examples of the anti-ganglioside antibody include anti-GM1 antibody, anti-GM1b antibody, anti-GM1-Fuc antibody, anti-GM2 antibody, anti-GM3 antibody, anti-GM3 (NeuGc) antibody, anti-GM4 antibody, anti-GD1a antibody, and anti-GD1b antibody. , Anti-GD2 antibody, anti-GD3 antibody, anti-GD3 (NeuAc / NeuGc) antibody, anti-GD3 (NeuGc) 2 antibody, anti-GT1a antibody, anti-GT1b antibody, anti-GT1c antibody, anti-GQ1a antibody, anti-GQ1b antibody, anti-GQ1c antibody, Examples thereof include anti-GP1a antibody, anti-GP1b antibody, anti-GP1c antibody, anti-LM1 antibody and the like.
本発明においては、特に、抗ＧＭ１抗体、及び抗ＧＱ１ｂ抗体の測定において好適である。 In the present invention, it is particularly suitable for the measurement of anti-GM1 antibody and anti-GQ1b antibody.
［４］担体
本発明において、担体は、前記のガングリオシドを固定化することができるものであれば、特に制限なく用いることができる。
[4] Carrier In the present invention, the carrier can be used without particular limitation as long as it can immobilize the ganglioside.
すなわち、ガングリオシドとの抗原抗体反応を利用して試料中の抗ガングリオシド抗体の測定を行う測定試薬及び測定方法に使用されている担体、又は使用することが可能な担体であればよい。 That is, any carrier may be used as a measuring reagent and a measuring method for measuring an anti-ganglioside antibody in a sample by utilizing an antigen-antibody reaction with a ganglioside, or a carrier that can be used.
この担体の材質は、特に限定はなく、例えば、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ラテックス、リポソーム、ゼラチン、アガロース、セルロース、セファロース、ガラス、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなるマイクロカプセル、ビーズ、マイクロタイタープレート（マイクロプレート）、試験管、スティック又は試験片等の形状の固相担体を用いることができる。 The material of this carrier is not particularly limited, and for example, polystyrene, polycarbonate, polyvinyltoluene, polypropylene, polyethylene, polyvinyl chloride, nylon, polymethacrylate, polyacrylamide, latex, liposome, gelatin, agarose, cellulose, sepharose, glass, etc. Solid-state carriers in the form of microcapsules, beads, microtiter plates (microplates), test tubes, sticks, test pieces, etc. made of materials such as metal, ceramics, and magnetic materials can be used.
本発明において、担体としては、マイクロタイタープレートが好ましい。 In the present invention, the carrier is preferably a microtiter plate.
本発明において、ガングリオシド（ガングリオシド抗原）を担体に固定化することは、物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの併用等の公知の方法により行うことができる。 In the present invention, ganglioside (ganglioside antigen) can be immobilized on a carrier by a known method such as a physical adsorption method, a chemical binding method, or a combination thereof.
例えば、化学的結合法により行う場合は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号 臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；日本生化学会編「新生化学実験講座１ タンパク質IV」，東京化学同人，１９９１年発行等に記載の公知の方法に従い、ガングリオシドと、担体とを、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、ガングリオシドと、担体の、それぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基又は水酸基等と前記の二価性の架橋試薬とを反応させること等により行うことができる。 For example, when using the chemical binding method, "Clinical Pathology Extraordinary Special Issue No. 53: Immunoassays for Clinical Examinations-Technology and Applications-", Clinical Pathology Publishing Society, 1983; Japan Biochemical Society Divalent cross-linking of ganglioside and carrier with glutaaldehyde, carbodiimide, imide ester, maleimide, etc. according to the known method described in "New Chemistry Experiment Course 1 Protein IV", Tokyo Kagaku Dojin, published in 1991, etc. It can be carried out by mixing and contacting with a reagent, and reacting the ganglioside with the respective amino group, carboxyl group, thiol group, aldehyde group, hydroxyl group and the like of the carrier and the above-mentioned divalent cross-linking reagent.
更に、ガングリオシドを固定化した担体の自然凝集や、非特異的反応等を抑制するために処理を行う必要があれば、ガングリオシドを固定化した担体の表面又は内壁面に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カゼイン、ゼラチン、卵白アルブミン若しくはその塩などのタンパク質、界面活性剤又は脱脂粉乳等を接触させ被覆させること等の公知の方法により処理して、担体のブロッキング処理（マスキング処理）を行ってもよい。 Further, if it is necessary to perform treatment to suppress spontaneous aggregation of the carrier on which ganglioside is immobilized, non-specific reaction, etc., bovine serum albumin (BSA) is applied to the surface or inner wall surface of the carrier on which ganglioside is immobilized. , Human serum albumin (HSA), casein, gelatin, proteins such as ovalbumin or salts thereof, surfactants, defatted milk powder, etc. are treated by a known method such as contacting and coating, and the carrier is blocked (masking). Processing) may be performed.
［５］試料
本発明において、試料とは、抗ガングリオシド抗体が存在する可能性があり、かつ抗ガングリオシド抗体の存在の有無、又は量の測定を行おうとするものであれば、どのようなものでもよい。
このような試料としては、例えば、ヒト又は動物の血液、血清、血漿、髄液若しくは腹水などの体液、又は臓器、組織、若しくは筋肉などの抽出液、細胞若しくは菌体などの抽出液等、抗ガングリオシド抗体が含まれる可能性のあるものを挙げることができる。
[5] Sample In the present invention, the sample is any sample as long as there is a possibility that an anti-ganglioside antibody is present and the presence or absence of the anti-ganglioside antibody or the amount of the anti-ganglioside antibody is to be measured. good.
Examples of such a sample include body fluids such as human or animal blood, serum, plasma, cerebrospinal fluid or ascites, extracts such as organs, tissues or muscles, extracts such as cells or bacterial cells, and the like. Examples include those that may contain ganglioside antibodies.
本発明における試料としては、ヒトの血液、血清又は血漿が好ましい。 As the sample in the present invention, human blood, serum or plasma is preferable.
［６］測定方法
本発明の試料中の抗ガングリオシド抗体の測定方法は、試料中の抗ガングリオシド抗体を、担体に固定化したガングリオシドと抗原抗体反応させることにより測定する方法において、未反応の成分を除去するための洗浄液として、イオン強度が１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下である洗浄液を使用することを特徴とするものである。
[6] Measurement method The method for measuring the anti-ganglioside antibody in the sample of the present invention is a method for measuring the anti-ganglioside antibody in the sample by reacting the anti-ganglioside antibody immobilized on the carrier with an antigen-antibody reaction. As the cleaning liquid for removing, a cleaning liquid having an ion intensity of 150 mmol / L or less is used.
本発明の測定方法において、試料中の抗ガングリオシド抗体を、ガングリオシドと抗原抗体反応させることにより測定を行う方法の測定原理は、特に制限はなく、どのような測定原理のものであってもよい。 In the measuring method of the present invention, the measuring principle of the method of measuring by reacting the anti-ganglioside antibody in the sample with the ganglioside with the antigen-antibody is not particularly limited, and any measuring principle may be used.
例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）、酵素抗体法、蛍光抗体法、イムノクロマトグラフィー法、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応測定法、赤血球凝集反応法、粒子凝集反応法、特開平９−２２９９３６号公報及び特開平１０−１３２８１９号公報などに記載された測定対象物質（被検物質）に対する特異的結合物質が固定され、これで被覆された面を有する担体、及び測定対象物質（被検物質）に対する特異的結合物質が固定された粒子を用いる測定法、又はＤａｈｌｂｅａｃｋらが示したＥＬＳＡ法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ Ｌｉｇａｎｄｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，７９巻，７６７〜７７２頁，１９９８年発行；ＷＯ９８／２３９６３）等を挙げることができる。 For example, enzyme immunoassay (ELISA, EIA), fluorescence immunoassay (FIA), radioimmunoassay (RIA), luminescence immunoassay (LIA), enzyme antibody method, fluorescent antibody method, immunochromatography method, immunoassay. Substances to be measured (tests) described in turbidity method, latex turbidimetric method, latex aggregation reaction measurement method, hemagglutination reaction method, particle aggregation reaction method, JP-A-9-229936 and JP-A-10-132819. A measurement method using a carrier having a surface coated with a specific binding substance to a substance) and particles to which a specific binding substance to a substance to be measured (test substance) is fixed, or Dahlbeck et al. Shown. The ELSA method (Enzyme-linked Antibody Association) (Thromb. Haemost., Vol. 79, pp. 767-772, 1998; WO98 / 23963) and the like can be mentioned.
そして、本発明の測定方法を、酵素免疫測定法などの標識免疫測定法を測定原理とする方法により実施する場合、サンドイッチ法、又は競合法等のいずれの手法においても本発明を適用することができる。 When the measuring method of the present invention is carried out by a method based on a labeled immunoassay such as an enzyme immunoassay, the present invention can be applied to any method such as a sandwich method or a competitive method. can.
なお、本発明の測定方法においては、測定は用手法により行ってもよいし、又は分析装置等の装置を用いて行ってもよい。 In the measuring method of the present invention, the measurement may be carried out by a manual method, or may be carried out by using an apparatus such as an analyzer.
なお、本発明においては、標識免疫測定法が好ましく、酵素免疫測定法又は発光免疫測定法が特に好ましい。 In the present invention, a labeled immunoassay method is preferable, and an enzyme immunoassay method or a radioimmunoassay method is particularly preferable.
なお、本発明の測定方法においては、いずれの測定原理（測定法）に基づいて実施するにしても、その測定原理（測定法）の公知の手法に従って、測定を行えばよい。 In the measurement method of the present invention, regardless of which measurement principle (measurement method) is used for the measurement, the measurement may be performed according to a known method of the measurement principle (measurement method).
［７］測定の例
本発明の測定方法を、酵素免疫測定法などの標識免疫測定法を測定原理とする方法により実施する場合を例にとって、以下具体的に説明を行う。
標識免疫測定法のサンドイッチ法により測定を行う場合の例を示す。
[7] Example of measurement A specific description will be given below, taking as an example the case where the measurement method of the present invention is carried out by a method based on a labeled immunoassay such as an enzyme immunoassay.
An example of the case where the measurement is performed by the sandwich method of the labeled immunoassay method is shown.
〔例１〕
（１）まず、以下のものを用意する。
担体：測定を行おうとする抗ガングリオシド抗体と特異的に結合することができるガングリオシドを固定化した担体（例えば、抗ＧＭ１抗体の測定においては、ＧＭ１をウェルに固定化したマイクロタイタープレート）
試料希釈液：緩衝剤を含有する水溶液
洗浄液：塩類を含有する水溶液であって、イオン強度が１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であるもの
[Example 1]
(1) First, prepare the following items.
Carrier: A carrier on which a ganglioside capable of specifically binding to the anti-ganglioside antibody to be measured is immobilized (for example, in the measurement of an anti-GM1 antibody, a microtiter plate in which GM1 is immobilized in a well).
Sample diluent: Aqueous solution containing a buffer Cleaning solution: An aqueous solution containing salts having an ionic strength of 150 mmol / L or less.
（２）試料（ヒト血清）と試料希釈液との混合物を、担体のガングリオシドを固定化した部位に一定量添加し、一定時間接触させる。
これにより、試料中に測定対象物質である抗ガングリオシド抗体が存在する場合には、抗原抗体反応により、「担体−ガングリオシド−抗ガングリオシド抗体」の結合を形成させる。（例えば、「マイクロタイタープレートのウェル−ＧＭ１−抗ＧＭ１抗体」）
(2) A mixture of the sample (human serum) and the sample diluent is added in a fixed amount to the site where the ganglioside of the carrier is immobilized, and is contacted for a certain period of time.
As a result, when an anti-ganglioside antibody, which is a substance to be measured, is present in the sample, a “carrier-ganglioside-anti-ganglioside antibody” bond is formed by an antigen-antibody reaction. (For example, "well of microtiter plate-GM1-anti-GM1 antibody")
（３）この試料の添加、接触の後、担体のガングリオシドを固定化した部位を洗浄液で洗浄することにより、未反応の成分（この場合、未結合の試料成分）を除去する。（例えば、マイクロタイタープレートのウェルに洗浄液を添加し、そして除去することにより、担体に固定化したガングリオシドに結合していない成分を除去する。） (3) After the addition and contact of this sample, the unreacted component (in this case, the unbound sample component) is removed by washing the site on which the ganglioside of the carrier is immobilized with a washing solution. (For example, by adding and removing the cleaning solution to the wells of the microtiter plate, the components not bound to the ganglioside immobilized on the carrier are removed.)
（４）この洗浄の後に、前記の抗ガングリオシド抗体と特異的に結合することができる物質に酵素等の標識物質を結合させたものの一定量を、担体のガングリオシドを固定化した部位に添加して、一定時間接触させる。 (4) After this washing, a certain amount of a substance capable of specifically binding to the anti-ganglioside antibody bound to a labeling substance such as an enzyme is added to the site where the ganglioside of the carrier is immobilized. , Contact for a certain period of time.
なお、抗ガングリオシド抗体と特異的に結合することができる物質としては、例えば、この抗ガングリオシド抗体に対する抗体、又はこの抗ガングリオシド抗体と結合することができるガングリオシド抗原等を挙げることができる。 Examples of the substance capable of specifically binding to the anti-ganglioside antibody include an antibody against the anti-ganglioside antibody, a ganglioside antigen capable of binding to the anti-ganglioside antibody, and the like.
より具体的には、この抗ガングリオシド抗体に対する抗体としては、例えば、抗ヒトＩｇＧ抗体、抗ヒトＩｇＡ抗体、抗ヒトＩｇＭ抗体、抗ヒトＩｇＤ抗体、及び抗ヒトＩｇＥ抗体より選ばれる１種又は２種以上の抗体等を挙げることができる。 More specifically, as the antibody against this anti-ganglioside antibody, for example, one or two selected from anti-human IgG antibody, anti-human IgA antibody, anti-human IgM antibody, anti-human IgD antibody, and anti-human IgE antibody. The above antibodies and the like can be mentioned.
また、この抗ガングリオシド抗体と結合することができる抗原としては、例えば、この抗ガングリオシド抗体と結合することができるガングリオシド抗原等を挙げることができる。（例えば、抗ガングリオシド抗体が抗ＧＭ１抗体である場合には、ＧＭ１を挙げることができる。） In addition, examples of the antigen capable of binding to this anti-ganglioside antibody include a ganglioside antigen capable of binding to this anti-ganglioside antibody. (For example, when the anti-ganglioside antibody is an anti-GM1 antibody, GM1 can be mentioned.)
この操作により、試料中に測定対象物質である抗ガングリオシド抗体が存在する場合には、「担体−ガングリオシド−抗ガングリオシド抗体−抗ガングリオシド抗体と特異的に結合することができる物質−標識物質」の結合が形成される。（例えば「マイクロタイタープレートのウェル−ＧＭ１−抗ＧＭ１抗体−抗ヒトＩｇＧ抗体−標識酵素」） By this operation, when an anti-ganglioside antibody, which is a substance to be measured, is present in the sample, binding of "carrier-ganglioside-anti-ganglioside antibody-substance capable of specifically binding to anti-ganglioside antibody-labeling substance" Is formed. (For example, "well of microtiter plate-GM1-anti-GM1 antibody-anti-human IgG antibody-labeling enzyme")
（５）次に、担体のガングリオシドを固定化した部位を洗浄液で洗浄することにより、未反応の成分（この場合、未結合の「標識物質を結合した、抗ガングリオシド抗体と特異的に結合することができる物質」）を除去する。（例えば、マイクロタイタープレートのウェルに洗浄液を添加し、そして除去することにより、担体に結合していない「抗ヒトＩｇＧ抗体−標識酵素」を除去する。） (5) Next, by washing the site on which the ganglioside of the carrier is immobilized with a washing solution, an unreacted component (in this case, specifically binding to an unbound “labeled substance-bound anti-ganglioside antibody” is used. "Substances that can be produced") are removed. (For example, by adding and removing the wash solution to the wells of the microtiter plate, the "anti-human IgG antibody-labeling enzyme" that is not bound to the carrier is removed.)
（６）そして、「担体−ガングリオシド−抗ガングリオシド抗体−抗ガングリオシド抗体と特異的に結合することができる物質−標識物質」の結合により担体に結合した標識物質を検出することにより、試料に含まれていた抗ガングリオシド抗体の測定を行う。 (6) Then, by detecting the labeling substance bound to the carrier by the binding of "carrier-ganglioside-anti-ganglioside antibody-substance capable of specifically binding to the anti-ganglioside antibody-labeling substance", it is contained in the sample. Measure the anti-ganglioside antibody that had been used.
この測定においては、担体と標識物質が、試料に含まれていた抗ガングリオシド抗体を介して、「担体−ガングリオシド−抗ガングリオシド抗体−抗ガングリオシド抗体と特異的に結合することができる物質−標識物質」と結合するので、担体に結合した標識物質の量を測定することにより、試料に含まれていた抗ガングリオシド抗体の有無、又は量を測定することができるものである。 In this measurement, the carrier and the labeling substance are "substances capable of specifically binding to the carrier-ganglioside-antiganglioside antibody-antiganglioside antibody-labeling substance" via the anti-ganglioside antibody contained in the sample. By measuring the amount of the labeling substance bound to the carrier, the presence or absence or amount of the anti-ganglioside antibody contained in the sample can be measured.
なお、前記（４）において用いる「標識物質を結合した、抗ガングリオシド抗体と特異的に結合することができる物質」として、「標識物質を結合した、クラス別のヒト免疫グロブリンに対する抗体」を使用することにより、試料中の抗ガングリオシド抗体を免疫グロブリンのクラス別に測定することが可能となる。
このクラス別のヒト免疫グロブリンに対する抗体としては、例えば、抗ヒトＩｇＧ抗体、抗ヒトＩｇＡ抗体、抗ヒトＩｇＭ抗体、抗ヒトＩｇＤ抗体、又は抗ヒトＩｇＥ抗体等を挙げることができる。
As the "substance that can specifically bind to the anti-ganglioside antibody to which the labeling substance is bound" used in (4) above, "antibody to human immunoglobulin according to class to which the labeling substance is bound" is used. This makes it possible to measure the anti-ganglioside antibody in the sample by immunoglobulin class.
Examples of the antibody against human immunoglobulin according to this class include anti-human IgG antibody, anti-human IgA antibody, anti-human IgM antibody, anti-human IgD antibody, anti-human IgE antibody and the like.
また、これらの「標識物質を結合した、クラス別のヒト免疫グロブリンに対する抗体」を、それぞれ適当な割合で混合して使用することにより、免疫グロブリンのクラスに依存しない抗ガングリオシド抗体の測定を行うことができる。 In addition, anti-ganglioside antibodies that do not depend on the immunoglobulin class can be measured by using these "antibodies to human immunoglobulin by class to which a labeling substance is bound" in an appropriate ratio. Can be done.
更に、前記（４）において用いる「標識物質を結合した、抗ガングリオシド抗体と特異的に結合することができる物質」として、「標識物質を結合した、サブクラス別のヒト免疫グロブリンに対する抗体」を使用することにより、試料中の抗ガングリオシド抗体を免疫グロブリンのサブクラス別に測定することが可能となる。
このサブクラス別のヒト免疫グロブリンに対する抗体としては、例えば、抗ヒトカッパー（κ）抗体、抗ヒトラムダ（λ）抗体、抗ヒトＩｇＧ１抗体、抗ヒトＩｇＧ２抗体、抗ヒトＩｇＧ３抗体、又は抗ヒトＩｇＧ４抗体等を挙げることができる。
Further, as the "substance capable of specifically binding to the anti-ganglioside antibody to which the labeling substance is bound" used in (4) above, "antibody to human immunoglobulin according to subclass to which the labeling substance is bound" is used. This makes it possible to measure the anti-ganglioside antibody in the sample by immunoglobulin subclass.
Examples of the antibody against human immunoglobulin according to this subclass include anti-human copper (κ) antibody, anti-human lambda (λ) antibody, anti-human IgG1 antibody, anti-human IgG2 antibody, anti-human IgG3 antibody, anti-human IgG4 antibody and the like. Can be mentioned.
また、これらの「標識物質を結合した、サブクラス別のヒト免疫グロブリンに対する抗体」を、それぞれ適当な割合で混合して使用することにより、免疫グロブリンのサブクラスに依存しない抗ガングリオシド抗体の測定を行うことができる。 In addition, anti-ganglioside antibodies that do not depend on the subclass of immunoglobulin can be measured by using these "antibodies to human immunoglobulin by subclass to which a labeling substance is bound" in an appropriate ratio. Can be done.
なお、「担体−ガングリオシド−抗ガングリオシド抗体−抗ガングリオシド抗体と特異的に結合することができる物質−標識物質」の結合により担体に結合した標識物質の検出であるが、酵素免疫測定法等の標識物質として酵素を用いて測定を行う方法及び試薬キットにおいては、標識酵素にその至適条件下で基質を反応させ、その反応生成物の量を反応生成物の吸光度を測るなどの光学的方法等により測定を行う。 It should be noted that the detection of the labeling substance bound to the carrier by the binding of "carrier-ganglioside-anti-ganglioside antibody-substance capable of specifically binding to the anti-ganglioside antibody-labeling substance" is a labeling such as an enzyme immunoassay method. In the method of measuring using an enzyme as a substance and the reagent kit, an optical method such as reacting a labeling enzyme with a substrate under the optimum conditions and measuring the amount of the reaction product and the absorbance of the reaction product, etc. The measurement is performed by.
蛍光免疫測定法等の標識物質として蛍光物質を用いて測定を行う方法及び試薬キットにおいては、標識蛍光物質による蛍光強度を測定することにより測定を行う。 In the method of measuring using a fluorescent substance as a labeling substance such as a fluorescence immunoassay method and the reagent kit, the measurement is performed by measuring the fluorescence intensity of the labeled fluorescent substance.
放射免疫測定法等の標識物質として放射性物質を用いて測定を行う方法及び試薬キットにおいては、標識放射性物質による放射線量を測定することにより測定を行う。 In the method of measuring using a radioactive substance as a labeling substance such as the radioimmunoassay method and the reagent kit, the measurement is performed by measuring the radiation dose of the labeled radioactive substance.
発光免疫測定法等の標識物質として発光反応に係わる物質を用いて測定を行う方法及び試薬キットにおいては、標識物質が係わる発光反応系における発光量を測定することにより測定を行う。 In a method and a reagent kit for measuring using a substance related to a luminescence reaction as a labeling substance such as a luminescence immunoassay, the measurement is performed by measuring the amount of luminescence in the luminescence reaction system related to the labeling substance.
なお、前記の標識物質であるが、標識物質として酵素を用いる酵素免疫測定法等により測定を行う場合には、パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸脱水素酵素、又はα−アミラーゼ等の酵素を用いることができる。 Although it is the above-mentioned labeling substance, when the measurement is carried out by an enzyme immunoassay method using an enzyme as the labeling substance, peroxidase (POD), alkaline phosphatase (ALP), β-galactosidase, urease, catalase, glucose Enzymes such as oxidase, lactic acid dehydrogenase, or α-amylase can be used.
また、標識物質として蛍光物質を用いる蛍光免疫測定法等により測定を行う場合には、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、置換ローダミンイソチオシアネート、又はジクロロトリアジンイソチオシアネート等の蛍光物質を用いることができる。 In addition, when the measurement is carried out by a fluorescence immunoassay method using a fluorescent substance as a labeling substance, a fluorescent substance such as fluorescein isothiocyanate, tetramethylrhodamine isothiocyanate, substituted rhodamine isothiocyanate, or dichlorotriazine isothiocyanate may be used. can.
そして、標識物質として放射性物質を用いる放射免疫測定法等により測定を行う場合には、トリチウム、ヨウ素１２５、又はヨウ素１３１等の放射性物質を用いることができる。 Then, when the measurement is carried out by a radioimmunoassay method or the like using a radioactive substance as a labeling substance, a radioactive substance such as tritium, iodine 125, or iodine 131 can be used.
また、測定を発光免疫測定法により行う場合には、アクリジニウムエステル、アルカリ性ホスファターゼ、パーオキシダーゼ、又はグルコースオキシダーゼ等を標識物質として用い、アクリジニウムエステル系、ジオキセタン化合物系、ルミノール−過酸化水素−ＰＯＤ系、又はＮＡＤＨ−ＦＭＮＨ２−ルシフェラーゼ系等により担体に結合した標識物質の検出を行うことができる。 When the measurement is carried out by the luminescence immunoassay method, acridinium ester, alkaline phosphatase, peroxidase, glucose oxidase, etc. are used as labeling substances, and acridinium ester type, dioxetane compound type, luminol-hydrogen peroxide, etc. are used. The labeling substance bound to the carrier can be detected by a −POD system, a NADH-FMNH2-luciferase system, or the like.
〔例２〕
（１）まず、以下のものを用意する。
担体：測定を行おうとする抗ガングリオシド抗体と特異的に結合することができるガングリオシドを固定化した担体（例えば、抗ＧＭ１抗体の測定においては、ＧＭ１をウェルに固定化したマイクロタイタープレート）
試料希釈液：緩衝剤を含有する水溶液
洗浄液：緩衝剤及び塩類を含む水溶液であって、イオン強度が１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であるもの
[Example 2]
(1) First, prepare the following items.
Carrier: A carrier on which a ganglioside capable of specifically binding to the anti-ganglioside antibody to be measured is immobilized (for example, in the measurement of an anti-GM1 antibody, a microtiter plate in which GM1 is immobilized in a well).
Sample diluent: Aqueous solution containing a buffer Washing solution: An aqueous solution containing a buffer and salts having an ionic strength of 150 mmol / L or less.
（２）試料（ヒト血清）と試料希釈液との混合物を、担体のガングリオシドを固定化した部位に一定量添加し、一定時間接触させる。
これにより、試料中に測定対象物質である抗ガングリオシド抗体が存在する場合には、抗原抗体反応により、「担体−ガングリオシド−抗ガングリオシド抗体」の結合を形成させる。（例えば、「マイクロタイタープレートのウェル−ＧＭ１−抗ＧＭ１抗体」）
(2) A mixture of the sample (human serum) and the sample diluent is added in a fixed amount to the site where the ganglioside of the carrier is immobilized, and is contacted for a certain period of time.
As a result, when an anti-ganglioside antibody, which is a substance to be measured, is present in the sample, a “carrier-ganglioside-anti-ganglioside antibody” bond is formed by an antigen-antibody reaction. (For example, "well of microtiter plate-GM1-anti-GM1 antibody")
（３）この試料の添加、接触の後、担体のガングリオシドを固定化した部位を洗浄液で洗浄することにより、未反応の成分（この場合、未結合の試料成分）を除去する。（例えば、マイクロタイタープレートのウェルに洗浄液を添加し、そして除去することにより、担体に固定化したガングリオシドに結合していない成分を除去する。） (3) After the addition and contact of this sample, the unreacted component (in this case, the unbound sample component) is removed by washing the site on which the ganglioside of the carrier is immobilized with a washing solution. (For example, by adding and removing the cleaning solution to the wells of the microtiter plate, the components not bound to the ganglioside immobilized on the carrier are removed.)
（４）この洗浄の後に、前記の抗ガングリオシド抗体と特異的に結合することができる物質にビオチンを結合させたものの一定量を、担体のガングリオシドを固定化した部位に添加して、一定時間接触させる。 (4) After this washing, a certain amount of a substance in which biotin is bound to a substance capable of specifically binding to the anti-ganglioside antibody is added to the site where the ganglioside of the carrier is immobilized, and the contact is carried out for a certain period of time. Let me.
なお、抗ガングリオシド抗体と特異的に結合することができる物質としては、例えば、この抗ガングリオシド抗体に対する抗体、又はこの抗ガングリオシド抗体と結合することができるガングリオシド抗原等を挙げることができる。 Examples of the substance capable of specifically binding to the anti-ganglioside antibody include an antibody against the anti-ganglioside antibody, a ganglioside antigen capable of binding to the anti-ganglioside antibody, and the like.
より具体的には、この抗ガングリオシド抗体に対する抗体としては、例えば、抗ヒトＩｇＧ抗体、抗ヒトＩｇＡ抗体、抗ヒトＩｇＭ抗体、抗ヒトＩｇＤ抗体、及び抗ヒトＩｇＥ抗体より選ばれる１種又は２種以上の抗体等を挙げることができる。 More specifically, as the antibody against this anti-ganglioside antibody, for example, one or two selected from anti-human IgG antibody, anti-human IgA antibody, anti-human IgM antibody, anti-human IgD antibody, and anti-human IgE antibody. The above antibodies and the like can be mentioned.
また、この抗ガングリオシド抗体と結合することができる抗原としては、例えば、この抗ガングリオシド抗体と結合することができるガングリオシド抗原等を挙げることができる。（例えば、抗ガングリオシド抗体が抗ＧＭ１抗体である場合には、ＧＭ１を挙げることができる。） In addition, examples of the antigen capable of binding to this anti-ganglioside antibody include a ganglioside antigen capable of binding to this anti-ganglioside antibody. (For example, when the anti-ganglioside antibody is an anti-GM1 antibody, GM1 can be mentioned.)
この操作により、試料中に測定対象物質である抗ガングリオシド抗体が存在する場合には、「担体−ガングリオシド−抗ガングリオシド抗体−抗ガングリオシド抗体と特異的に結合することができる物質−ビオチン」の結合が形成される。（例えば「マイクロタイタープレートのウェル−ＧＭ１−抗ＧＭ１抗体−抗ヒトＩｇＧ抗体−ビオチン」） By this operation, when an anti-ganglioside antibody, which is a substance to be measured, is present in the sample, the binding of "carrier-ganglioside-anti-ganglioside antibody-substance capable of specifically binding to anti-ganglioside antibody-biotin" is formed. It is formed. (For example, "well of microtiter plate-GM1-anti-GM1 antibody-anti-human IgG antibody-biotin")
（５）次に、担体のガングリオシドを固定化した部位を洗浄液で洗浄することにより、未反応の成分（この場合、未結合の「ビオチンを結合した、抗ガングリオシド抗体と特異的に結合することができる物質」）を除去する。（例えば、マイクロタイタープレートのウェルに洗浄液を添加し、そして除去することにより、担体に結合していない「抗ヒトＩｇＧ抗体−ビオチン」を除去する。） (5) Next, by washing the site on which the ganglioside of the carrier is immobilized with a washing solution, an unreacted component (in this case, a biotin-bound anti-ganglioside antibody can be specifically bound to the unreacted component). Remove "possible substances"). (For example, the "anti-human IgG antibody-biotin" that is not bound to the carrier is removed by adding and removing the washing solution to the wells of the microtiter plate.)
（６）この洗浄の後に、アビジン（又はストレプトアビジン）に酵素等の標識物質を結合させたものの一定量を、担体のガングリオシドを固定化した部位に添加して、一定時間接触させる。 (6) After this washing, a certain amount of avidin (or streptavidin) bound to a labeling substance such as an enzyme is added to the site where the ganglioside of the carrier is immobilized, and the mixture is contacted for a certain period of time.
この操作により、「担体−ガングリオシド−抗ガングリオシド抗体−抗ガングリオシド抗体と特異的に結合することができる物質−ビオチン−アビジン（又はストレプトアビジン）−標識物質」の結合が形成される。（例えば「マイクロタイタープレートのウェル−ＧＭ１−抗ＧＭ１抗体−抗ヒトＩｇＧ抗体−ビオチン−アビジン（又はストレプトアビジン）−標識酵素」） By this operation, a bond of "carrier-ganglioside-anti-ganglioside antibody-substance capable of specifically binding to anti-ganglioside antibody-biotin-avidin (or streptavidin) -labeled substance" is formed. (For example, "well of microtiter plate-GM1-anti-GM1 antibody-anti-human IgG antibody-biotin-avidin (or streptavidin) -labeling enzyme")
（５）次に、担体のガングリオシドを固定化した部位を洗浄液で洗浄することにより、未反応の成分（この場合、未結合の「アビジン（又はストレプトアビジン）に酵素等の標識物質を結合させたもの」）を除去する。（例えば、マイクロタイタープレートのウェルに洗浄液を添加し、そして除去することにより、担体に結合していない「アビジン（又はストレプトアビジン）−標識酵素」を除去する。） (5) Next, by washing the site on which the ganglioside of the carrier was immobilized with a washing solution, a labeling substance such as an enzyme was bound to an unreacted component (in this case, unbound "avidin (or streptavidin)). Things ") are removed. (For example, by adding and removing the wash solution to the wells of the microtiter plate, the "avidin (or streptavidin) -labeling enzyme" that is not bound to the carrier is removed.)
（６）そして、「担体−ガングリオシド−抗ガングリオシド抗体−抗ガングリオシド抗体と特異的に結合することができる物質−ビオチン−アビジン（又はストレプトアビジン）−標識物質」の結合により担体に結合した標識物質を検出することにより、試料に含まれていた抗ガングリオシド抗体の測定を行う。 (6) Then, a labeling substance bound to the carrier by the binding of "carrier-ganglioside-anti-ganglioside antibody-substance capable of specifically binding to anti-ganglioside antibody-biotin-avidin (or streptavidin) -labeling substance" By detecting, the anti-ganglioside antibody contained in the sample is measured.
この測定においては、担体と標識物質が、試料に含まれていた抗ガングリオシド抗体を介して、「担体−ガングリオシド−抗ガングリオシド抗体−抗ガングリオシド抗体と特異的に結合することができる物質−ビオチン−アビジン（又はストレプトアビジン）−標識物質」と結合するので、担体に結合した標識物質の量を測定することにより、試料に含まれていた抗ガングリオシド抗体の有無、又は量を測定することができるものである。 In this measurement, the carrier and the labeling substance can specifically bind to "carrier-ganglioside-anti-ganglioside antibody-anti-ganglioside antibody-biotinate-avidin" via the anti-ganglioside antibody contained in the sample. (Or streptavidin) -labeled substance ", so by measuring the amount of labeled substance bound to the carrier, the presence or absence or amount of anti-ganglioside antibody contained in the sample can be measured. be.
なお、その他については、例１と同様である。 Others are the same as in Example 1.
［８］測定試薬
本発明の試料中の抗ガングリオシド抗体の測定試薬は、試料中の抗ガングリオシド抗体を、担体に固定化したガングリオシドと抗原抗体反応させることにより測定する測定試薬において、未反応の成分を除去するための洗浄液として、イオン強度が１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下である洗浄液を含むことを特徴とするものである。
[8] Measuring reagent
The anti-ganglioside antibody measuring reagent in the sample of the present invention is for removing unreacted components in the measuring reagent measured by reacting the anti-ganglioside antibody in the sample with the ganglioside immobilized on the carrier. The cleaning solution is characterized by containing a cleaning solution having an ion intensity of 150 mmol / L or less.
本発明においては、以上のことにより、試料中の抗ガングリオシド抗体の測定試薬の感度を向上させることができるものである。 In the present invention, the sensitivity of the measurement reagent for the anti-ganglioside antibody in the sample can be improved by the above.
なお、洗浄液及びその使用方法等の詳細については、前記の通りである。 The details of the cleaning liquid and its usage are as described above.
［９］洗浄液
本発明の洗浄液は、試料中の抗ガングリオシド抗体を、担体に固定化したガングリオシドと抗原抗体反応させることにより測定する際に未反応の成分を除去するための洗浄液であって、イオン強度が１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることを特徴とするものである。
[9] Cleaning liquid
The cleaning solution of the present invention is a cleaning solution for removing unreacted components when measuring by reacting an anti-ganglioside antibody in a sample with a ganglioside immobilized on a carrier with an antigen-antibody reaction, and has an ionic strength of 150 mmol /. It is characterized by being L or less.
本発明においては、以上のことにより、試料中の抗ガングリオシド抗体の測定の感度を向上させることができるものである。 In the present invention, the sensitivity of the measurement of the anti-ganglioside antibody in the sample can be improved by the above.
なお、洗浄液及びその使用方法等の詳細については、前記の通りである。 The details of the cleaning liquid and its usage are as described above.
［１０］試料中の抗ガングリオシド抗体の測定の感度の向上方法
本発明の試料中の抗ガングリオシド抗体の測定の感度の向上方法は、試料中の抗ガングリオシド抗体を、担体に固定化したガングリオシドと抗原抗体反応させることにより測定する方法において、未反応の成分を除去するための洗浄液として、イオン強度が１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下である洗浄液を使用することを特徴とするものである。
[10] Method for improving the sensitivity of measurement of anti-ganglioside antibody in a sample The method of improving the sensitivity of measurement of anti-ganglioside antibody in a sample of the present invention is a method of improving the sensitivity of measurement of an anti-ganglioside antibody in a sample. The method for measuring by reacting with an antibody is characterized in that a cleaning solution having an ion intensity of 150 mmol / L or less is used as a cleaning solution for removing unreacted components.
本発明においては、以上のことにより、試料中の抗ガングリオシド抗体の測定の感度を向上させることができるものである。 In the present invention, the sensitivity of the measurement of the anti-ganglioside antibody in the sample can be improved by the above.
なお、洗浄液及びその使用方法等の詳細については、前記の通りである。 The details of the cleaning liquid and its usage are as described above.
以下、実施例により本発明をより具体的に詳述するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited to these Examples.
〔実施例１〕（異なるイオン強度での抗ガングリオシド抗体の測定−１）
塩化ナトリウム濃度を変えることによりイオン強度を変え、標識免疫測定法により試料中の抗ＧＭ１抗体（抗ガングリオシド抗体）の測定を行った。
[Example 1] (Measurement of anti-ganglioside antibody at different ionic strength-1)
The ionic strength was changed by changing the sodium chloride concentration, and the anti-GM1 antibody (anti-ganglioside antibody) in the sample was measured by a labeled immunoassay.
１．試薬の調製
（１）試料希釈液の調製
１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液〔ｐＨ７．６〕を調製した。ここに、塩化ナトリウムを６５ｍＭの濃度となるように添加し、調製を行った。
1. 1. Preparation of Reagents (1) Preparation of Sample Diluted Solution A 10 mM HEPES buffer solution [pH 7.6] containing 1% (w / v) bovine serum albumin (BSA) was prepared. Sodium chloride was added to a concentration of 65 mM to prepare the mixture.
（２）ＧＭ１抗原固定化担体の調製
ガングリオシドＧＭ１（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ Ｌｉｍｉｔｅｄ社）を１ウェル当たり２５０ｎｇずつポリスチレンプレート〔ＰｏｌｙＳｏｒｐ〕（ヌンク社）のウェルに分注し、一定時間放置して、前記ガングリオシドＧＭ１を前記ポリスチレンプレートの各ウェルに固定化した。
次に、このガングリオシドＧＭ１が固定化されたウェル内に１．５％ＢＳＡ溶液（ｐＨ７．７）を１ウェル当たり２００μＬずつ分注し、一定時間放置してブロッキング処理を行い、ＧＭ１抗原固定化担体を調製した。
(2) Preparation of GM1 Antigen Immobilization Carrier Ganglioside GM1 (Carbosynth Limited) was dispensed into wells of polystyrene plates [PolySorp] (Nunk) at a rate of 250 ng per well, and left to stand for a certain period of time to disperse the ganglioside GM1. Immobilized in each well of the polystyrene plate.
Next, 200 μL of a 1.5% BSA solution (pH 7.7) was dispensed into each well in which the ganglioside GM1 was immobilized, and left for a certain period of time for blocking treatment to perform a blocking treatment on the GM1 antigen-immobilized carrier. Was prepared.
（３）洗浄液の調製
０．０５％ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）を含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５)を調製した。ここに、塩化ナトリウムをそれぞれ５０ｍＭ、１００ｍＭ又は１３７ｍＭの濃度になるように添加し、塩化ナトリウム濃度の異なる３種類の洗浄液の調製を行った。
この場合、各々の洗浄液のイオン強度は、それぞれ６８ｍｍｏｌ／Ｌ、１１８ｍｍｏｌ／Ｌ及び１５５ｍｍｏｌ／Ｌとなる。
(3) Preparation of washing solution A 20 mM Tris-hydrochloric acid buffer solution (pH 7.5) containing 0.05% Tween 20 was prepared. To this, sodium chloride was added so as to have concentrations of 50 mM, 100 mM or 137 mM, respectively, and three types of cleaning solutions having different sodium chloride concentrations were prepared.
In this case, the ionic strengths of each cleaning solution are 68 mmol / L, 118 mmol / L and 155 mmol / L, respectively.
（４）酵素標識抗体
ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体〔Ｐ０２１４〕（ダコ社）を、酵素標識抗体として用いた。
(4) Enzyme-labeled antibody A peroxidase-labeled rabbit anti-human IgG polyclonal antibody [P0214] (Daco) was used as an enzyme-labeled antibody.
（５）発色液
０．０２％ペルオキシダーゼ基質液〔３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン〕（同仁化学研究所）を含有する５ｍＭ過酸化水素水溶液を発色液として用いた。
(5) Color-developing liquid A 5 mM hydrogen peroxide aqueous solution containing a 0.02% peroxidase substrate solution [3,3', 5,5'-tetramethylbenzidine] (Dojin Chemical Laboratory) was used as the color-developing liquid.
２．試料
抗ＧＭ１抗体陽性血清：
抗ＧＭ１抗体を含むことが確認されている１０種類の血清を、抗ＧＭ１抗体陽性血清として用意した。
2. Sample Anti-GM1 antibody positive serum:
Ten kinds of sera confirmed to contain anti-GM1 antibody were prepared as anti-GM1 antibody positive sera.
３．試料中の抗ガングリオシド抗体の測定
（１）試料である前記２の１０種類の抗ＧＭ１抗体陽性血清を本実施例の１の（１）の試料希釈液により、それぞれ１００倍に希釈して混合液を調製した。
3. 3. Measurement of anti-ganglioside antibody in sample (1) The 10 types of anti-GM1 antibody-positive sera of the above 2 samples are diluted 100-fold with the sample diluent of 1 (1) of this example and mixed. Was prepared.
（２）前記（１）で調製した混合液の各々を、本実施例の１の（２）のＧＭ１抗原固定化担体の各ウェルに１００μＬずつ分注し、これを４℃にて一晩静置した。
これにより、担体に固定化されているＧＭ１抗原と試料に含まれていた抗ＧＭ１抗体を接触させ、反応させた。
(2) 100 μL of each of the mixed solutions prepared in (1) above was dispensed into each well of the GM1 antigen-immobilized carrier of 1 (2) of this example, and this was allowed to stand overnight at 4 ° C. Placed.
As a result, the GM1 antigen immobilized on the carrier and the anti-GM1 antibody contained in the sample were brought into contact with each other and reacted.
（３）次に、前記のウェルより、前記の混合液を吸引して除去した。
そして、このウェルを、本実施例の１の（３）の３種類の洗浄液毎に分けて洗浄した。
(3) Next, the mixed solution was sucked and removed from the well.
Then, this well was washed separately for each of the three types of cleaning solutions of 1 (3) of this example.
（４）本実施例の１の（４）の酵素標識抗体を、１％ＢＳＡを含むトリス塩酸緩衝液で２，０００倍希釈した。次にこれを、前記の洗浄操作を行ったウェルに１００μＬずつ分注して、室温で２時間反応させた。 (4) The enzyme-labeled antibody of 1 (4) of this example was diluted 2,000 times with Tris-hydrochloric acid buffer containing 1% BSA. Next, 100 μL of this was dispensed into the wells subjected to the above-mentioned washing operation, and the mixture was reacted at room temperature for 2 hours.
（５）その後、前記のウェルより、未結合の酵素標識抗体を吸引して除去した。そして、このウェルを、本実施例の１の（３）の３種類の洗浄液毎に分けて洗浄した。 (5) Then, the unbound enzyme-labeled antibody was aspirated and removed from the well. Then, this well was washed separately for each of the three types of cleaning solutions of 1 (3) of this example.
（６）次に、本実施例の１の（５）の発色液の１００μＬを、前記のウェルに分注し、室温で２０分間反応させた。
これにより、担体に固定化された標識酵素（ペルオキシダーゼ）と、発色液を反応させて、色素を生成させた。
(6) Next, 100 μL of the color-developing solution of 1 (5) of this example was dispensed into the wells and reacted at room temperature for 20 minutes.
As a result, the labeling enzyme (peroxidase) immobilized on the carrier was reacted with the color-developing liquid to generate a dye.
（７）前記の発色液の添加２０分後に、０．３５Ｍ硫酸の１００μＬを、前記のウェルに分注して、前記の反応を停止させた。 (7) Twenty minutes after the addition of the color-developing liquid, 100 μL of 0.35 M sulfuric acid was dispensed into the wells to stop the reaction.
（８）マイクロプレートリーダー〔サンライズ〕（テカン社）にて、前記のウェル中の液の吸光度（主波長：４５０ｎｍ、副波長：５５０ｎｍ）を測定して、吸光度差の測定値を得た。 (8) The absorbance (main wavelength: 450 nm, sub-wavelength: 550 nm) of the liquid in the well was measured with a microplate reader [Sunrise] (Tecan) to obtain a measured value of the absorbance difference.
４．測定結果
以上の測定の結果を表１に示した。
4. Measurement results Table 1 shows the above measurement results.
この表より、洗浄液のイオン強度が１５５ｍｍｏｌ／Ｌの場合に比べて、１１８ｍｍｏｌ／Ｌの場合の方が得られた吸光度差の測定値は高く、更に６８ｍｍｏｌ／Ｌの場合の方が得られた吸光度差の測定値がより高いことが分かる。 From this table, the measured value of the absorbance difference obtained when the ionic strength of the washing liquid was 155 mmol / L was higher when it was 118 mmol / L, and the absorbance obtained when it was 68 mmol / L. It can be seen that the measured difference is higher.
このことより、イオン強度が１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下である洗浄液を使用することにより、試料中の抗ガングリオシド抗体の測定の感度を向上させることができることが確かめられた。 From this, it was confirmed that the sensitivity of measurement of the anti-ganglioside antibody in the sample can be improved by using a washing solution having an ionic strength of 150 mmol / L or less.
〔実施例２〕（異なるイオン強度での抗ガングリオシド抗体の測定−２）
塩化ナトリウム濃度を変えることによりイオン強度を変え、標識免疫測定法により試料中の抗ＧＱ１ｂ抗体（抗ガングリオシド抗体）の測定を行った。
[Example 2] (Measurement of anti-ganglioside antibody at different ionic strength-2)
The ionic strength was changed by changing the sodium chloride concentration, and the anti-GQ1b antibody (anti-ganglioside antibody) in the sample was measured by a labeled immunoassay.
１．試薬の調製
（１）試料希釈液の調製
１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液〔ｐＨ７．６〕を調製した。ここに、塩化ナトリウムを６５ｍＭの濃度となるように添加し、調製を行った。
1. 1. Preparation of Reagents (1) Preparation of Sample Diluted Solution A 10 mM HEPES buffer solution [pH 7.6] containing 1% (w / v) bovine serum albumin (BSA) was prepared. Sodium chloride was added to a concentration of 65 mM to prepare the mixture.
（２）ＧＱ１ｂ抗原固定化担体の調製
ガングリオシドＧＱ１ｂ（Ｈｙｔｅｓｔ社）を１ウェル当たり２５０ｎｇずつポリスチレンプレート〔ＰｏｌｙＳｏｒｐ〕（ヌンク社）のウェルに分注し、一定時間放置して、前記ガングリオシドＧＱ１ｂを前記ポリスチレンプレートの各ウェルに固定化した。
(2) Preparation of GQ1b Antigen Immobilization Carrier Ganglioside GQ1b (Hytest) was dispensed into wells of a polystyrene plate [PolySorp] (Nunk) at a rate of 250 ng per well, left for a certain period of time, and the ganglioside GQ1b was subjected to the polystyrene. Immobilized in each well of the plate.
次に、このガングリオシドＧＱ１ｂが固定化されたウェル内に１．５％ＢＳＡ溶液（ｐＨ７．７）を１ウェル当たり２００μＬずつ分注し、一定時間放置してブロッキング処理を行い、ＧＱ１ｂ抗原固定化担体を調製した。 Next, 200 μL of a 1.5% BSA solution (pH 7.7) was dispensed into each well in which the ganglioside GQ1b was immobilized, and left for a certain period of time for blocking treatment to perform a blocking treatment on the GQ1b antigen-immobilized carrier. Was prepared.
（３）洗浄液の調製
０．０５％ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）を含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５)を調製した。ここに、塩化ナトリウムをそれぞれ５０ｍＭ、１００ｍＭ又は１３７ｍＭの濃度になるように添加し、塩化ナトリウム濃度の異なる３種類の洗浄液の調製を行った。
この場合、各々の洗浄液のイオン強度は、それぞれ６８ｍｍｏｌ／Ｌ、１１８ｍｍｏｌ／Ｌ及び１５５ｍｍｏｌ／Ｌとなる。
(3) Preparation of washing solution A 20 mM Tris-hydrochloric acid buffer solution (pH 7.5) containing 0.05% Tween 20 was prepared. To this, sodium chloride was added so as to have concentrations of 50 mM, 100 mM or 137 mM, respectively, and three types of cleaning solutions having different sodium chloride concentrations were prepared.
In this case, the ionic strengths of each cleaning solution are 68 mmol / L, 118 mmol / L and 155 mmol / L, respectively.
（４）酵素標識抗体
ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体〔Ｐ０２１４〕（ダコ社）を、酵素標識抗体として用いた。
(4) Enzyme-labeled antibody A peroxidase-labeled rabbit anti-human IgG polyclonal antibody [P0214] (Daco) was used as an enzyme-labeled antibody.
（５）発色液
０．０２％ペルオキシダーゼ基質液〔３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン〕（同仁化学研究所）を含有する５ｍＭ過酸化水素水溶液を発色液として用いた。
(5) Color-developing liquid A 5 mM hydrogen peroxide aqueous solution containing a 0.02% peroxidase substrate solution [3,3', 5,5'-tetramethylbenzidine] (Dojin Chemical Laboratory) was used as the color-developing liquid.
２．試料
抗ＧＱ１ｂ抗体陽性血清：
抗ＧＱ１ｂ抗体を含むことが確認されている１０種類の血清を、抗ＧＱ１ｂ抗体陽性血清として用意した。
2. Sample Anti-GQ1b antibody-positive serum:
Ten types of sera confirmed to contain anti-GQ1b antibody were prepared as anti-GQ1b antibody-positive sera.
３．試料中の抗ガングリオシド抗体の測定
（１）試料である前記２の１０種類の抗ＧＱ１ｂ抗体陽性血清を本実施例の１の（１）の試料希釈液により、それぞれ１００倍に希釈して混合液を調製した。
3. 3. Measurement of anti-ganglioside antibody in sample (1) The 10 types of anti-GQ1b antibody-positive sera of the above 2 samples are diluted 100-fold with the sample diluent of 1 (1) of this example and mixed. Was prepared.
（２）前記（１）で調製した混合液の各々を、本実施例の１の（２）のＧＱ１ｂ抗原固定化担体の各ウェルに１００μＬずつ分注し、これを４℃にて一晩静置した。
これにより、担体に固定化されているＧＱ１ｂ抗原と試料に含まれていた抗ＧＱ１ｂ抗体を接触させ、反応させた。
(2) 100 μL of each of the mixed solutions prepared in (1) above was dispensed into each well of the GQ1b antigen-immobilized carrier of 1 (2) of this example, and this was allowed to stand overnight at 4 ° C. Placed.
As a result, the GQ1b antigen immobilized on the carrier and the anti-GQ1b antibody contained in the sample were brought into contact with each other and reacted.
（３）次に、前記のウェルより、前記の混合液を吸引して除去した。
そして、このウェルを、本実施例の１の（３）の３種類の洗浄液毎に分けて洗浄した。
(3) Next, the mixed solution was sucked and removed from the well.
Then, this well was washed separately for each of the three types of cleaning solutions of 1 (3) of this example.
（４）本実施例の１の（４）の酵素標識抗体を、１％ＢＳＡを含むトリス塩酸緩衝液で７，０００倍希釈した。次にこれを、前記の洗浄操作を行ったウェルに１００μＬずつ分注して、室温で２時間反応させた。 (4) The enzyme-labeled antibody of 1 (4) of this example was diluted 7,000 times with Tris-hydrochloric acid buffer containing 1% BSA. Next, 100 μL of this was dispensed into the wells subjected to the above-mentioned washing operation, and the mixture was reacted at room temperature for 2 hours.
（５）その後、前記のウェルより、未結合の酵素標識抗体を吸引して除去した。そして、このウェルを、本実施例の１の（３）の３種類の洗浄液毎に分けて洗浄した。 (5) Then, the unbound enzyme-labeled antibody was aspirated and removed from the well. Then, this well was washed separately for each of the three types of cleaning solutions of 1 (3) of this example.
（６）次に、本実施例の１の（５）の発色液の１００μＬを、前記のウェルに分注し、室温で２０分間反応させた。
これにより、担体に固定化された標識酵素（ペルオキシダーゼ）と、発色液を反応させて、色素を生成させた。
(6) Next, 100 μL of the color-developing solution of 1 (5) of this example was dispensed into the wells and reacted at room temperature for 20 minutes.
As a result, the labeling enzyme (peroxidase) immobilized on the carrier was reacted with the color-developing liquid to generate a dye.
（７）前記の発色液の添加２０分後に、０．３５Ｍ硫酸の１００μＬを、前記のウェルに分注して、前記の反応を停止させた。 (7) Twenty minutes after the addition of the color-developing liquid, 100 μL of 0.35 M sulfuric acid was dispensed into the wells to stop the reaction.
（８）マイクロプレートリーダー〔サンライズ〕（テカン社）にて、前記のウェル中の液の吸光度（主波長：４５０ｎｍ、副波長：５５０ｎｍ）を測定して、吸光度差の測定値を得た。 (8) The absorbance (main wavelength: 450 nm, sub-wavelength: 550 nm) of the liquid in the well was measured with a microplate reader [Sunrise] (Tecan) to obtain a measured value of the absorbance difference.
４．測定結果
以上の測定の結果を表２に示した。
4. Measurement results Table 2 shows the above measurement results.
この表より、洗浄液のイオン強度が１５５ｍｍｏｌ／Ｌの場合に比べて、１１８ｍｍｏｌ／Ｌの場合の方が得られた吸光度差の測定値は高く、更に６８ｍｍｏｌ／Ｌの場合の方が得られた吸光度差の測定値がより高いことが分かる。 From this table, the measured value of the absorbance difference obtained when the ionic strength of the washing liquid was 155 mmol / L was higher when it was 118 mmol / L, and the absorbance obtained when it was 68 mmol / L. It can be seen that the measured difference is higher.
このことより、イオン強度が１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下である洗浄液を使用することにより、試料中の抗ガングリオシド抗体の測定の感度を向上させることができることが確かめられた。 From this, it was confirmed that the sensitivity of measurement of the anti-ganglioside antibody in the sample can be improved by using a washing solution having an ionic strength of 150 mmol / L or less.
〔実施例３〕（異なるイオン強度での抗ガングリオシド抗体の測定−３）
塩化カリウム濃度を変えることによりイオン強度を変え、標識免疫測定法により試料中の抗ＧＭ１抗体（抗ガングリオシド抗体）の測定を行った。
[Example 3] (Measurement of anti-ganglioside antibody at different ionic strength-3)
The ionic strength was changed by changing the potassium chloride concentration, and the anti-GM1 antibody (anti-ganglioside antibody) in the sample was measured by a labeled immunoassay.
１．試薬の調製
（１）試料希釈液の調製
１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液〔ｐＨ７．６〕を調製した。ここに、塩化ナトリウムを６５ｍＭの濃度となるように添加し、調製を行った。
1. 1. Preparation of Reagents (1) Preparation of Sample Diluted Solution A 10 mM HEPES buffer solution [pH 7.6] containing 1% (w / v) bovine serum albumin (BSA) was prepared. Sodium chloride was added to a concentration of 65 mM to prepare the mixture.
（２）ＧＭ１抗原固定化担体の調製
ガングリオシドＧＭ１（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ Ｌｉｍｉｔｅｄ社）を１ウェル当たり２５０ｎｇずつポリスチレンプレート〔ＰｏｌｙＳｏｒｐ〕（ヌンク社）のウェルに分注し、一定時間放置して、前記ガングリオシドＧＭ１を前記ポリスチレンプレートの各ウェルに固定化した。
(2) Preparation of GM1 Antigen Immobilization Carrier Ganglioside GM1 (Carbosynth Limited) was dispensed into wells of polystyrene plates [PolySorp] (Nunk) at a rate of 250 ng per well, and left to stand for a certain period of time to disperse the ganglioside GM1. Immobilized in each well of the polystyrene plate.
次に、このガングリオシドＧＭ１が固定化されたウェル内に１．５％ＢＳＡ溶液（ｐＨ７．７）を１ウェル当たり２００μＬずつ分注し、一定時間放置してブロッキング処理を行い、ＧＭ１抗原固定化担体を調製した。 Next, 200 μL of a 1.5% BSA solution (pH 7.7) was dispensed into each well in which the ganglioside GM1 was immobilized, and left for a certain period of time for blocking treatment to perform a blocking treatment on the GM1 antigen-immobilized carrier. Was prepared.
（３）洗浄液の調製
０．０５％ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）を含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５)調製した。ここに、塩化カリウムをそれぞれ５０ｍＭ、１００ｍＭ又は１３７ｍＭの濃度になるように添加し、塩化カリウム濃度の異なる３種類の洗浄液の調製を行った。
この場合、各々の洗浄液のイオン強度は、それぞれ６８ｍｍｏｌ／Ｌ、１１８ｍｍｏｌ／Ｌ及び１５５ｍｍｏｌ／Ｌとなる。
(3) Preparation of washing solution A 20 mM Tris-hydrochloric acid buffer solution (pH 7.5) containing 0.05% Tween 20 was prepared. To this, potassium chloride was added so as to have concentrations of 50 mM, 100 mM or 137 mM, respectively, and three types of washing solutions having different potassium chloride concentrations were prepared.
In this case, the ionic strengths of each cleaning solution are 68 mmol / L, 118 mmol / L and 155 mmol / L, respectively.
（４）酵素標識抗体
ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体〔Ｐ０２１４〕（ダコ社）を、酵素標識抗体として用いた。
(4) Enzyme-labeled antibody A peroxidase-labeled rabbit anti-human IgG polyclonal antibody [P0214] (Daco) was used as an enzyme-labeled antibody.
（５）発色液
０．０２％ペルオキシダーゼ基質液〔３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン〕（同仁化学研究所）を含有する５ｍＭ過酸化水素水溶液を発色液として用いた。
(5) Color-developing liquid A 5 mM hydrogen peroxide aqueous solution containing a 0.02% peroxidase substrate solution [3,3', 5,5'-tetramethylbenzidine] (Dojin Chemical Laboratory) was used as the color-developing liquid.
２．試料
抗ＧＭ１抗体陽性血清：
抗ＧＭ１抗体を含むことが確認されている１０種類の血清を、抗ＧＭ１抗体陽性血清として用意した。
2. Sample Anti-GM1 antibody positive serum:
Ten kinds of sera confirmed to contain anti-GM1 antibody were prepared as anti-GM1 antibody positive sera.
３．試料中の抗ガングリオシド抗体の測定
（１）試料である前記２の１０種類の抗ＧＭ１抗体陽性血清を本実施例の１の（１）の試料希釈液により、それぞれ１００倍に希釈して混合液を調製した。
3. 3. Measurement of anti-ganglioside antibody in sample (1) The 10 types of anti-GM1 antibody-positive sera of the above 2 samples are diluted 100-fold with the sample diluent of 1 (1) of this example and mixed. Was prepared.
（２）前記（１）で調製した混合液の各々を、本実施例の１の（２）のＧＭ１抗原固定化担体の各ウェルに１００μＬずつ分注し、これを４℃にて一晩静置した。
これにより、担体に固定化されているＧＭ１抗原と試料に含まれていた抗ＧＭ１抗体を接触させ、反応させた。
(2) 100 μL of each of the mixed solutions prepared in (1) above was dispensed into each well of the GM1 antigen-immobilized carrier of 1 (2) of this example, and this was allowed to stand overnight at 4 ° C. Placed.
As a result, the GM1 antigen immobilized on the carrier and the anti-GM1 antibody contained in the sample were brought into contact with each other and reacted.
（３）次に、前記のウェルより、前記の混合液を吸引して除去した。
そして、このウェルを、本実施例の１の（３）の３種類の洗浄液毎に分けて洗浄した。
(3) Next, the mixed solution was sucked and removed from the well.
Then, this well was washed separately for each of the three types of cleaning solutions of 1 (3) of this example.
（４）本実施例の１の（４）の酵素標識抗体を、１％ＢＳＡを含むトリス塩酸緩衝液で２，０００倍希釈した。次にこれを、前記の洗浄操作を行ったウェルに１００μＬずつ分注して、室温で２時間反応させた。 (4) The enzyme-labeled antibody of 1 (4) of this example was diluted 2,000 times with Tris-hydrochloric acid buffer containing 1% BSA. Next, 100 μL of this was dispensed into the wells subjected to the above-mentioned washing operation, and the mixture was reacted at room temperature for 2 hours.
（５）その後、前記のウェルより、未結合の酵素標識抗体を吸引して除去した。そして、このウェルを、本実施例の１の（３）の３種類の洗浄液毎に分けて洗浄した。 (5) Then, the unbound enzyme-labeled antibody was aspirated and removed from the well. Then, this well was washed separately for each of the three types of cleaning solutions of 1 (3) of this example.
（６）次に、本実施例の１の（５）の発色液の１００μＬを、前記のウェルに分注し、室温で２０分間反応させた。
これにより、担体に固定化された標識酵素（ペルオキシダーゼ）と、発色液を反応させて、色素を生成させた。
(6) Next, 100 μL of the color-developing solution of 1 (5) of this example was dispensed into the wells and reacted at room temperature for 20 minutes.
As a result, the labeling enzyme (peroxidase) immobilized on the carrier was reacted with the color-developing liquid to generate a dye.
（７）前記の発色液の添加２０分後に、０．３５Ｍ硫酸の１００μＬを、前記のウェルに分注して、前記の反応を停止させた。 (7) Twenty minutes after the addition of the color-developing liquid, 100 μL of 0.35 M sulfuric acid was dispensed into the wells to stop the reaction.
（８）マイクロプレートリーダー〔サンライズ〕（テカン社）にて、前記のウェル中の液の吸光度（主波長：４５０ｎｍ、副波長：５５０ｎｍ）を測定して、吸光度差の測定値を得た。 (8) The absorbance (main wavelength: 450 nm, sub-wavelength: 550 nm) of the liquid in the well was measured with a microplate reader [Sunrise] (Tecan) to obtain a measured value of the absorbance difference.
４．測定結果
以上の測定の結果を表３に示した。
4. Measurement results Table 3 shows the above measurement results.
この表より、洗浄液のイオン強度が１５５ｍｍｏｌ／Ｌの場合に比べて、１１８ｍｍｏｌ／Ｌの場合の方が得られた吸光度差の測定値は高く、更に６８ｍｍｏｌ／Ｌの場合の方が得られた吸光度差の測定値がより高いことが分かる。 From this table, the measured value of the absorbance difference obtained when the ionic strength of the washing liquid was 155 mmol / L was higher when it was 118 mmol / L, and the absorbance obtained when it was 68 mmol / L. It can be seen that the measured difference is higher.
このことより、イオン強度が１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下である洗浄液を使用することにより、試料中の抗ガングリオシド抗体の測定の感度を向上させることができることが確かめられた。 From this, it was confirmed that the sensitivity of measurement of the anti-ganglioside antibody in the sample can be improved by using a washing solution having an ionic strength of 150 mmol / L or less.
〔実施例４〕（異なるイオン強度での抗ガングリオシド抗体の測定−４）
塩化カリウム濃度を変えることによりイオン強度を変え、標識免疫測定法により試料中の抗ＧＱ１ｂ抗体（抗ガングリオシド抗体）の測定を行った。
[Example 4] (Measurement of anti-ganglioside antibody at different ionic strength-4)
The ionic strength was changed by changing the potassium chloride concentration, and the anti-GQ1b antibody (anti-ganglioside antibody) in the sample was measured by a labeled immunoassay.
１．試薬の調製
（１）試料希釈液の調製
１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液〔ｐＨ７．６〕を調製した。ここに、塩化ナトリウムを６５ｍＭの濃度となるように添加し、調製を行った。
1. 1. Preparation of Reagents (1) Preparation of Sample Diluted Solution A 10 mM HEPES buffer solution [pH 7.6] containing 1% (w / v) bovine serum albumin (BSA) was prepared. Sodium chloride was added to a concentration of 65 mM to prepare the mixture.
（２）ＧＱ１ｂ抗原固定化担体の調製
ガングリオシドＧＱ１ｂ（Ｈｙｔｅｓｔ社）を１ウェル当たり２５０ｎｇずつポリスチレンプレート〔ＰｏｌｙＳｏｒｐ〕（ヌンク社）のウェルに分注し、一定時間放置して、前記ガングリオシドＧＱ１ｂを前記ポリスチレンプレートの各ウェルに固定化した。
(2) Preparation of GQ1b Antigen Immobilization Carrier Ganglioside GQ1b (Hytest) was dispensed into wells of a polystyrene plate [PolySorp] (Nunk) at a rate of 250 ng per well, left for a certain period of time, and the ganglioside GQ1b was subjected to the polystyrene. Immobilized in each well of the plate.
次に、このガングリオシドＧＱ１ｂが固定化されたウェル内に１．５％ＢＳＡ溶液（ｐＨ７．７）を１ウェル当たり２００μＬずつ分注し、一定時間放置してブロッキング処理を行い、ＧＱ１ｂ抗原固定化担体を調製した。 Next, 200 μL of a 1.5% BSA solution (pH 7.7) was dispensed into each well in which the ganglioside GQ1b was immobilized, and left for a certain period of time for blocking treatment to perform a blocking treatment on the GQ1b antigen-immobilized carrier. Was prepared.
（３）洗浄液の調製
０．０５％ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）を含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５)を調製した。ここに、塩化カリウムをそれぞれ５０ｍＭ、１００ｍＭ又は１３７ｍＭの濃度になるように添加し、塩化カリウム濃度の異なる３種類の洗浄液の調製を行った。
この場合、各々の洗浄液のイオン強度は、それぞれ６８ｍｍｏｌ／Ｌ、１１８ｍｍｏｌ／Ｌ及び１５５ｍｍｏｌ／Ｌとなる。
(3) Preparation of washing solution A 20 mM Tris-hydrochloric acid buffer solution (pH 7.5) containing 0.05% Tween 20 was prepared. To this, potassium chloride was added so as to have concentrations of 50 mM, 100 mM or 137 mM, respectively, and three types of washing solutions having different potassium chloride concentrations were prepared.
In this case, the ionic strengths of each cleaning solution are 68 mmol / L, 118 mmol / L and 155 mmol / L, respectively.
（４）酵素標識抗体
ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体〔Ｐ０２１４〕（ダコ社）を、酵素標識抗体として用いた。
(4) Enzyme-labeled antibody A peroxidase-labeled rabbit anti-human IgG polyclonal antibody [P0214] (Daco) was used as an enzyme-labeled antibody.
（５）発色液
０．０２％ペルオキシダーゼ基質液〔３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン〕（同仁化学研究所）を含有する５ｍＭ過酸化水素水溶液を発色液として用いた。
(5) Color-developing liquid A 5 mM hydrogen peroxide aqueous solution containing a 0.02% peroxidase substrate solution [3,3', 5,5'-tetramethylbenzidine] (Dojin Chemical Laboratory) was used as the color-developing liquid.
２．試料
抗ＧＱ１ｂ抗体陽性血清：
抗ＧＱ１ｂ抗体を含むことが確認されている１０種類の血清を、抗ＧＱ１ｂ抗体陽性血清として用意した。
2. Sample Anti-GQ1b antibody-positive serum:
Ten types of sera confirmed to contain anti-GQ1b antibody were prepared as anti-GQ1b antibody-positive sera.
３．試料中の抗ガングリオシド抗体の測定
（１）試料である前記２の１０種類の抗ＧＱ１ｂ抗体陽性血清を本実施例の１の（１）の試料希釈液により、それぞれ１００倍に希釈して混合液を調製した。
3. 3. Measurement of anti-ganglioside antibody in sample (1) The 10 types of anti-GQ1b antibody-positive sera of the above 2 samples are diluted 100-fold with the sample diluent of 1 (1) of this example and mixed. Was prepared.
（２）前記（１）で調製した混合液の各々を、本実施例の１の（２）のＧＱ１ｂ抗原固定化担体の各ウェルに１００μＬずつ分注し、これを４℃にて一晩静置した。
これにより、担体に固定化されているＧＱ１ｂ抗原と試料に含まれていた抗ＧＱ１ｂ抗体を接触させ、反応させた。
(2) 100 μL of each of the mixed solutions prepared in (1) above was dispensed into each well of the GQ1b antigen-immobilized carrier of 1 (2) of this example, and this was allowed to stand overnight at 4 ° C. Placed.
As a result, the GQ1b antigen immobilized on the carrier and the anti-GQ1b antibody contained in the sample were brought into contact with each other and reacted.
（３）次に、前記のウェルより、前記の混合液を吸引して除去した。
そして、このウェルを、本実施例の１の（３）の３種類の洗浄液毎に分けて洗浄した。
(3) Next, the mixed solution was sucked and removed from the well.
Then, this well was washed separately for each of the three types of cleaning solutions of 1 (3) of this example.
（４）本実施例の１の（４）の酵素標識抗体を、１％ＢＳＡを含むトリス塩酸緩衝液で７，０００倍希釈した。次にこれを、前記の洗浄操作を行ったウェルに１００μＬずつ分注して、室温で２時間反応させた。 (4) The enzyme-labeled antibody of 1 (4) of this example was diluted 7,000 times with Tris-hydrochloric acid buffer containing 1% BSA. Next, 100 μL of this was dispensed into the wells subjected to the above-mentioned washing operation, and the mixture was reacted at room temperature for 2 hours.
（５）その後、前記のウェルより、未結合の酵素標識抗体を吸引して除去した。そして、このウェルを、本実施例の１の（３）の３種類の洗浄液毎に分けて洗浄した。 (5) Then, the unbound enzyme-labeled antibody was aspirated and removed from the well. Then, this well was washed separately for each of the three types of cleaning solutions of 1 (3) of this example.
（６）次に、本実施例の１の（５）の発色液の１００μＬを、前記のウェルに分注し、室温で２０分間反応させた。
これにより、担体に固定化された標識酵素（ペルオキシダーゼ）と、発色液を反応させて、色素を生成させた。
(6) Next, 100 μL of the color-developing solution of 1 (5) of this example was dispensed into the wells and reacted at room temperature for 20 minutes.
As a result, the labeling enzyme (peroxidase) immobilized on the carrier was reacted with the color-developing liquid to generate a dye.
（７）前記の発色液の添加２０分後に、０．３５Ｍ硫酸の１００μＬを、前記のウェルに分注して、前記の反応を停止させた。 (7) Twenty minutes after the addition of the color-developing liquid, 100 μL of 0.35 M sulfuric acid was dispensed into the wells to stop the reaction.
（８）マイクロプレートリーダー〔サンライズ〕（テカン社）にて、前記のウェル中の液の吸光度（主波長：４５０ｎｍ、副波長：５５０ｎｍ）を測定して、吸光度差の測定値を得た。 (8) The absorbance (main wavelength: 450 nm, sub-wavelength: 550 nm) of the liquid in the well was measured with a microplate reader [Sunrise] (Tecan) to obtain a measured value of the absorbance difference.
４．測定結果
以上の測定の結果を表４に示した。
4. Measurement results Table 4 shows the above measurement results.
この表より、洗浄液のイオン強度が１５５ｍｍｏｌ／Ｌの場合に比べて、１１８ｍｍｏｌ／Ｌの場合の方が得られた吸光度差の測定値は高く、更に６８ｍｍｏｌ／Ｌの場合の方が得られた吸光度差の測定値がより高いことが分かる。 From this table, the measured value of the absorbance difference obtained when the ionic strength of the washing liquid was 155 mmol / L was higher when it was 118 mmol / L, and the absorbance obtained when it was 68 mmol / L. It can be seen that the measured difference is higher.
このことより、イオン強度が１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下である洗浄液を使用することにより、試料中の抗ガングリオシド抗体の測定の感度を向上させることができることが確かめられた。 From this, it was confirmed that the sensitivity of measurement of the anti-ganglioside antibody in the sample can be improved by using a washing solution having an ionic strength of 150 mmol / L or less.
〔実施例５〕（異なるイオン強度での抗ガングリオシド抗体の測定−５）
緩衝剤濃度を変えることによりイオン強度を変え、標識免疫測定法により試料中の抗ＧＭ１抗体（抗ガングリオシド抗体）の測定を行った。
[Example 5] (Measurement of anti-ganglioside antibody at different ionic strength-5)
The ionic strength was changed by changing the buffer concentration, and the anti-GM1 antibody (anti-ganglioside antibody) in the sample was measured by the labeled immunoassay.
１．試薬の調製
（１）試料希釈液の調製
１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液〔ｐＨ７．６〕を調製した。ここに、塩化ナトリウムを６５ｍＭの濃度となるように添加し、調製を行った。
1. 1. Preparation of Reagents (1) Preparation of Sample Diluted Solution A 10 mM HEPES buffer solution [pH 7.6] containing 1% (w / v) bovine serum albumin (BSA) was prepared. Sodium chloride was added to a concentration of 65 mM to prepare the mixture.
（２）ＧＭ１抗原固定化担体の調製
ガングリオシドＧＭ１（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ Ｌｉｍｉｔｅｄ社）を１ウェル当たり２５０ｎｇずつポリスチレンプレート〔ＰｏｌｙＳｏｒｐ〕（ヌンク社）のウェルに分注し、一定時間放置して、前記ガングリオシドＧＭ１を前記ポリスチレンプレートの各ウェルに固定化した。
(2) Preparation of GM1 Antigen Immobilization Carrier Ganglioside GM1 (Carbosynth Limited) was dispensed into wells of polystyrene plates [PolySorp] (Nunk) at a rate of 250 ng per well, and left to stand for a certain period of time to disperse the ganglioside GM1. Immobilized in each well of the polystyrene plate.
次に、このガングリオシドＧＭ１が固定化されたウェル内に１．５％ＢＳＡ溶液（ｐＨ７．７）を１ウェル当たり２００μＬずつ分注し、一定時間放置してブロッキング処理を行い、ＧＭ１抗原固定化担体を調製した。 Next, 200 μL of a 1.5% BSA solution (pH 7.7) was dispensed into each well in which the ganglioside GM1 was immobilized, and left for a certain period of time for blocking treatment to perform a blocking treatment on the GM1 antigen-immobilized carrier. Was prepared.
（３）洗浄液の調製
０．０５％ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）を含む５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５)、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５)、及び２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５)をそれぞれ調製した。これらに、塩化ナトリウムをそれぞれ１３７ｍＭの濃度になるように添加し、緩衝剤濃度の異なる３種類の洗浄液の調製を行った。
この場合、各々の洗浄液のイオン強度は、それぞれ１４１ｍｍｏｌ／Ｌ、１４６ｍｍｏｌ／Ｌ及び１５５ｍｍｏｌ／Ｌとなる。
(3) Preparation of washing solution 5 mM Tris-hydrochloric acid buffer (pH 7.5) containing 0.05% Tween 20 (Tween 20), 10 mM Tris-hydrochloric acid buffer (pH 7.5), and 20 mM Tris-hydrochloric acid buffer (pH 7.5). Were prepared respectively. Sodium chloride was added to these so as to have a concentration of 137 mM, respectively, to prepare three types of cleaning solutions having different buffer concentration.
In this case, the ionic strength of each cleaning solution is 141 mmol / L, 146 mmol / L and 155 mmol / L, respectively.
（４）酵素標識抗体
ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体〔Ｐ０２１４〕（ダコ社）を、酵素標識抗体として用いた。
(4) Enzyme-labeled antibody A peroxidase-labeled rabbit anti-human IgG polyclonal antibody [P0214] (Daco) was used as an enzyme-labeled antibody.
（５）発色液
０．０２％ペルオキシダーゼ基質液〔３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン〕（同仁化学研究所）を含有する５ｍＭ過酸化水素水溶液を発色液として用いた。
(5) Color-developing liquid A 5 mM hydrogen peroxide aqueous solution containing a 0.02% peroxidase substrate solution [3,3', 5,5'-tetramethylbenzidine] (Dojin Chemical Laboratory) was used as the color-developing liquid.
２．試料
抗ＧＭ１抗体陽性血清：
抗ＧＭ１抗体を含むことが確認されている５種類の血清を、抗ＧＭ１抗体陽性血清として用意した。
2. Sample Anti-GM1 antibody positive serum:
Five types of sera confirmed to contain anti-GM1 antibody were prepared as anti-GM1 antibody positive sera.
３．試料中の抗ガングリオシド抗体の測定
（１）試料である前記２の５種類の抗ＧＭ１抗体陽性血清を本実施例の１の（１）の試料希釈液により、それぞれ１００倍に希釈して混合液を調製した。
3. 3. Measurement of anti-ganglioside antibody in sample (1) The five types of anti-GM1 antibody-positive sera of the above 2 samples are diluted 100-fold with the sample diluent of 1 (1) of this example and mixed. Was prepared.
（２）前記（１）で調製した混合液の各々を、本実施例の１の（２）のＧＭ１抗原固定化担体の各ウェルに１００μＬずつ分注し、これを４℃にて一晩静置した。
これにより、担体に固定化されているＧＭ１抗原と試料に含まれていた抗ＧＭ１抗体を接触させ、反応させた。
(2) 100 μL of each of the mixed solutions prepared in (1) above was dispensed into each well of the GM1 antigen-immobilized carrier of 1 (2) of this example, and this was allowed to stand overnight at 4 ° C. Placed.
As a result, the GM1 antigen immobilized on the carrier and the anti-GM1 antibody contained in the sample were brought into contact with each other and reacted.
（３）次に、前記のウェルより、前記の混合液を吸引して除去した。
そして、このウェルを、本実施例の１の（３）の３種類の洗浄液毎に分けて洗浄した。
(3) Next, the mixed solution was sucked and removed from the well.
Then, this well was washed separately for each of the three types of cleaning solutions of 1 (3) of this example.
（４）本実施例の１の（４）の酵素標識抗体を、１％ＢＳＡを含むトリス塩酸緩衝液で２，０００倍希釈した。次にこれを、前記の洗浄操作を行ったウェルに１００μＬずつ分注して、室温で２時間反応させた。 (4) The enzyme-labeled antibody of 1 (4) of this example was diluted 2,000 times with Tris-hydrochloric acid buffer containing 1% BSA. Next, 100 μL of this was dispensed into the wells subjected to the above-mentioned washing operation, and the mixture was reacted at room temperature for 2 hours.
（５）その後、前記のウェルより、未結合の酵素標識抗体を吸引して除去した。そして、このウェルを、本実施例の１の（３）の３種類の洗浄液毎に分けて洗浄した。 (5) Then, the unbound enzyme-labeled antibody was aspirated and removed from the well. Then, this well was washed separately for each of the three types of cleaning solutions of 1 (3) of this example.
（６）次に、本実施例の１の（５）の発色液の１００μＬを、前記のウェルに分注し、室温で２０分間反応させた。
これにより、担体に固定化された標識酵素（ペルオキシダーゼ）と、発色液を反応させて、色素を生成させた。
(6) Next, 100 μL of the color-developing solution of 1 (5) of this example was dispensed into the wells and reacted at room temperature for 20 minutes.
As a result, the labeling enzyme (peroxidase) immobilized on the carrier was reacted with the color-developing liquid to generate a dye.
（７）前記の発色液の添加２０分後に、０．３５Ｍ硫酸の１００μＬを、前記のウェルに分注して、前記の反応を停止させた。 (7) Twenty minutes after the addition of the color-developing liquid, 100 μL of 0.35 M sulfuric acid was dispensed into the wells to stop the reaction.
（８）マイクロプレートリーダー〔サンライズ〕（テカン社）にて、前記のウェル中の液の吸光度（主波長：４５０ｎｍ、副波長：５５０ｎｍ）を測定して、吸光度差の測定値を得た。 (8) The absorbance (main wavelength: 450 nm, sub-wavelength: 550 nm) of the liquid in the well was measured with a microplate reader [Sunrise] (Tecan) to obtain a measured value of the absorbance difference.
４．測定結果
以上の測定の結果を表５に示した。
4. Measurement results Table 5 shows the above measurement results.
この表より、洗浄液のイオン強度が１５５ｍｍｏｌ／Ｌの場合に比べて、１４６ｍｍｏｌ／Ｌの場合の方が得られた吸光度差の測定値は高く、更に１４１ｍｍｏｌ／Ｌの場合の方が得られた吸光度差の測定値がより高いことが分かる。 From this table, the measured value of the absorbance difference obtained when the ionic strength of the washing liquid was 155 mmol / L was higher when it was 146 mmol / L, and further, the absorbance obtained when the ion intensity was 141 mmol / L was higher. It can be seen that the measured difference is higher.
このことより、イオン強度が１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下である洗浄液を使用することにより、試料中の抗ガングリオシド抗体の測定の感度を向上させることができることが確かめられた。 From this, it was confirmed that the sensitivity of measurement of the anti-ganglioside antibody in the sample can be improved by using a washing solution having an ionic strength of 150 mmol / L or less.
〔実施例６〕（異なるイオン強度での抗ガングリオシド抗体の測定−６）
緩衝剤濃度を変えることによりイオン強度を変え、標識免疫測定法により試料中の抗ＧＱ１ｂ抗体（抗ガングリオシド抗体）の測定を行った。
[Example 6] (Measurement of anti-ganglioside antibody at different ionic strength-6)
The ionic strength was changed by changing the buffer concentration, and the anti-GQ1b antibody (anti-ganglioside antibody) in the sample was measured by the labeled immunoassay.
１．試薬の調製
（１）試料希釈液の調製
１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液〔ｐＨ７．６〕を調製した。ここに、塩化ナトリウムを６５ｍＭの濃度となるように添加し、調製を行った。
1. 1. Preparation of Reagents (1) Preparation of Sample Diluted Solution A 10 mM HEPES buffer solution [pH 7.6] containing 1% (w / v) bovine serum albumin (BSA) was prepared. Sodium chloride was added to a concentration of 65 mM to prepare the mixture.
（２）ＧＱ１ｂ抗原固定化担体の調製
ガングリオシドＧＱ１ｂ（Ｈｙｔｅｓｔ社）を１ウェル当たり２５０ｎｇずつポリスチレンプレート〔ＰｏｌｙＳｏｒｐ〕（ヌンク社）のウェルに分注し、一定時間放置して、前記ガングリオシドＧＱ１ｂを前記ポリスチレンプレートの各ウェルに固定化した。
(2) Preparation of GQ1b Antigen Immobilization Carrier Ganglioside GQ1b (Hytest) was dispensed into wells of a polystyrene plate [PolySorp] (Nunk) at a rate of 250 ng per well, left for a certain period of time, and the ganglioside GQ1b was subjected to the polystyrene. Immobilized in each well of the plate.
次に、このガングリオシドＧＱ１ｂが固定化されたウェル内に１．５％ＢＳＡ溶液（ｐＨ７．７）を１ウェル当たり２００μＬずつ分注し、一定時間放置してブロッキング処理を行い、ＧＱ１ｂ抗原固定化担体を調製した。 Next, 200 μL of a 1.5% BSA solution (pH 7.7) was dispensed into each well in which the ganglioside GQ1b was immobilized, and left for a certain period of time for blocking treatment to perform a blocking treatment on the GQ1b antigen-immobilized carrier. Was prepared.
（３）洗浄液の調製
０．０５％ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）を含む５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５)、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５)、及び２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５)をそれぞれ調製した。これらに、塩化ナトリウムをそれぞれ１３７ｍＭの濃度になるように添加し、緩衝剤濃度の異なる３種類の洗浄液の調製を行った。
この場合、各々の洗浄液のイオン強度は、それぞれ１４１ｍｍｏｌ／Ｌ、１４６ｍｍｏｌ／Ｌ及び１５５ｍｍｏｌ／Ｌとなる。
(3) Preparation of washing solution 5 mM Tris-hydrochloric acid buffer (pH 7.5) containing 0.05% Tween 20 (Tween 20), 10 mM Tris-hydrochloric acid buffer (pH 7.5), and 20 mM Tris-hydrochloric acid buffer (pH 7.5). Were prepared respectively. Sodium chloride was added to these so as to have a concentration of 137 mM, respectively, to prepare three types of cleaning solutions having different buffer concentration.
In this case, the ionic strength of each cleaning solution is 141 mmol / L, 146 mmol / L and 155 mmol / L, respectively.
（４）酵素標識抗体
ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体〔Ｐ０２１４〕（ダコ社）を、酵素標識抗体として用いた。
(4) Enzyme-labeled antibody A peroxidase-labeled rabbit anti-human IgG polyclonal antibody [P0214] (Daco) was used as an enzyme-labeled antibody.
（５）発色液
０．０２％ペルオキシダーゼ基質液〔３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン〕（同仁化学研究所）を含有する５ｍＭ過酸化水素水溶液を発色液として用いた。
(5) Color-developing liquid A 5 mM hydrogen peroxide aqueous solution containing a 0.02% peroxidase substrate solution [3,3', 5,5'-tetramethylbenzidine] (Dojin Chemical Laboratory) was used as the color-developing liquid.
２．試料
抗ＧＱ１ｂ抗体陽性血清：
抗ＧＱ１ｂ抗体を含むことが確認されている５種類の血清を、抗ＧＱ１ｂ抗体陽性血清として用意した。
2. Sample Anti-GQ1b antibody-positive serum:
Five types of sera confirmed to contain anti-GQ1b antibody were prepared as anti-GQ1b antibody-positive sera.
３．試料中の抗ガングリオシド抗体の測定
（１）試料である前記２の５種類の抗ＧＱ１ｂ抗体陽性血清を本実施例の１の（１）の試料希釈液により、それぞれ１００倍に希釈して混合液を調製した。
3. 3. Measurement of anti-ganglioside antibody in sample (1) The five types of anti-GQ1b antibody-positive sera of the above 2 samples are diluted 100-fold with the sample diluent of 1 (1) of this example and mixed. Was prepared.
（２）前記（１）で調製した混合液の各々を、本実施例の１の（２）のＧＱ１ｂ抗原固定化担体の各ウェルに１００μＬずつ分注し、これを４℃にて一晩静置した。
これにより、担体に固定化されているＧＱ１ｂ抗原と試料に含まれていた抗ＧＱ１ｂ抗体を接触させ、反応させた。
(2) 100 μL of each of the mixed solutions prepared in (1) above was dispensed into each well of the GQ1b antigen-immobilized carrier of 1 (2) of this example, and this was allowed to stand overnight at 4 ° C. Placed.
As a result, the GQ1b antigen immobilized on the carrier and the anti-GQ1b antibody contained in the sample were brought into contact with each other and reacted.
（３）次に、前記のウェルより、前記の混合液を吸引して除去した。
そして、このウェルを、本実施例の１の（３）の３種類の洗浄液毎に分けて洗浄した。
(3) Next, the mixed solution was sucked and removed from the well.
Then, this well was washed separately for each of the three types of cleaning solutions of 1 (3) of this example.
（４）本実施例の１の（４）の酵素標識抗体を、１％ＢＳＡを含むトリス塩酸緩衝液で７，０００倍希釈した。次にこれを、前記の洗浄操作を行ったウェルに１００μＬずつ分注して、室温で２時間反応させた。 (4) The enzyme-labeled antibody of 1 (4) of this example was diluted 7,000 times with Tris-hydrochloric acid buffer containing 1% BSA. Next, 100 μL of this was dispensed into the wells subjected to the above-mentioned washing operation, and the mixture was reacted at room temperature for 2 hours.
（５）その後、前記のウェルより、未結合の酵素標識抗体を吸引して除去した。そして、このウェルを、本実施例の１の（３）の３種類の洗浄液毎に分けて洗浄した。 (5) Then, the unbound enzyme-labeled antibody was aspirated and removed from the well. Then, this well was washed separately for each of the three types of cleaning solutions of 1 (3) of this example.
（６）次に、本実施例の１の（５）の発色液の１００μＬを、前記のウェルに分注し、室温で２０分間反応させた。
これにより、担体に固定化された標識酵素（ペルオキシダーゼ）と、発色液を反応させて、色素を生成させた。
(6) Next, 100 μL of the color-developing solution of 1 (5) of this example was dispensed into the wells and reacted at room temperature for 20 minutes.
As a result, the labeling enzyme (peroxidase) immobilized on the carrier was reacted with the color-developing liquid to generate a dye.
（７）前記の発色液の添加２０分後に、０．３５Ｍ硫酸の１００μＬを、前記のウェルに分注して、前記の反応を停止させた。 (7) Twenty minutes after the addition of the color-developing liquid, 100 μL of 0.35 M sulfuric acid was dispensed into the wells to stop the reaction.
（８）マイクロプレートリーダー〔サンライズ〕（テカン社）にて、前記のウェル中の液の吸光度（主波長：４５０ｎｍ、副波長：５５０ｎｍ）を測定して、吸光度差の測定値を得た。 (8) The absorbance (main wavelength: 450 nm, sub-wavelength: 550 nm) of the liquid in the well was measured with a microplate reader [Sunrise] (Tecan) to obtain a measured value of the absorbance difference.
４．測定結果
以上の測定の結果を表６に示した。
4. Measurement results Table 6 shows the above measurement results.
この表より、洗浄液のイオン強度が１５５ｍｍｏｌ／Ｌの場合に比べて、１４６ｍｍｏｌ／Ｌの場合の方が得られた吸光度差の測定値は高く、更に１４１ｍｍｏｌ／Ｌの場合の方が得られた吸光度差の測定値がより高いことが分かる。 From this table, the measured value of the absorbance difference obtained when the ionic strength of the washing liquid was 155 mmol / L was higher when it was 146 mmol / L, and further, the absorbance obtained when the ion intensity was 141 mmol / L was higher. It can be seen that the measured difference is higher.
このことより、イオン強度が１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下である洗浄液を使用することにより、試料中の抗ガングリオシド抗体の測定の感度を向上させることができることが確かめられた。 From this, it was confirmed that the sensitivity of measurement of the anti-ganglioside antibody in the sample can be improved by using a washing solution having an ionic strength of 150 mmol / L or less.
〔参考例１〕（異なるイオン強度での抗Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ａｓａｈｉｉ抗体の測定）
標識免疫測定法による試料中の抗Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ａｓａｈｉｉ抗体の測定を、塩化ナトリウム濃度を変えることにより行った。
なお、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ａｓａｈｉｉは、夏型過敏性肺炎の原因微生物となる真菌である。
[Reference Example 1] (Measurement of anti-Trichosporon asahi antibody at different ionic strengths)
The anti-Trichosporon asahi antibody in the sample by the labeled immunoassay was measured by changing the sodium chloride concentration.
Trichosporon asahii is a fungus that causes summer-type hypersensitivity pneumonitis.
１．試薬の調製
（１）試料希釈液
抗Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ａｓａｈｉｉ抗体の測定試薬（体外診断用医薬品）である「トリコ・アサヒＡｂチェック」（シノテスト社）の「試料希釈液」を試料希釈液として用いた。
1. 1. Preparation of Reagent (1) Sample Diluting Solution The "Sample Diluting Solution" of "Trico Asahi Ab Check" (Sinotest Co., Ltd.), which is a measurement reagent (in vitro diagnostic drug) for anti-Trichosporon asashii antibody, was used as the sample diluent.
（２）洗浄液の調製
０．０５％ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５)を調製した。ここに、塩化ナトリウムをそれぞれ５０ｍＭ、１００ｍＭ又は１３７ｍＭの濃度になるように添加し、塩化ナトリウム濃度の異なる３種類の洗浄液の調製を行った。
この場合、各々の洗浄液のイオン強度は、それぞれ７５ｍｍｏｌ／Ｌ、１２５ｍｍｏｌ／Ｌ及び１６２ｍｍｏｌ／Ｌとなる。
(2) Preparation of washing solution A 10 mM phosphate buffer solution (pH 7.5) containing 0.05% Tween 20 was prepared. To this, sodium chloride was added so as to have concentrations of 50 mM, 100 mM or 137 mM, respectively, and three types of cleaning solutions having different sodium chloride concentrations were prepared.
In this case, the ionic strengths of each cleaning solution are 75 mmol / L, 125 mmol / L, and 162 mmol / L, respectively.
（３）Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ａｓａｈｉｉ抗原固定化担体
前記の「トリコ・アサヒＡｂチェック」（シノテスト社）の「Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ａｓａｈｉｉ抗原固定マイクロプレート」をＴ．ａｓａｈｉｉ抗原結合担体として用いた。
(3) Trichosporon asahii antigen-immobilized carrier The "Trichosporon asahii antigen-immobilized microplate" of the above-mentioned "Trichosporon Abcheck" (Sinotest Co., Ltd.) was used in T.I. It was used as an asahii antigen-binding carrier.
（４）酵素標識抗体
前記の「トリコ・アサヒＡｂチェック」（シノテスト社）の「酵素標識抗体」を酵素標識抗体として用いた。
(4) Enzyme-labeled antibody The "enzyme-labeled antibody" of the above-mentioned "Toriko Asahi Ab Check" (Sinotest) was used as the enzyme-labeled antibody.
（５）発色液
前記の「トリコ・アサヒＡｂチェック」（シノテスト社）の「発色液」を発色液として用いた。
(5) Color-developing liquid The "color-developing liquid" of the above-mentioned "Toriko Asahi Ab Check" (Sinotest Co., Ltd.) was used as the color-developing liquid.
（６）反応停止液
前記の「トリコ・アサヒＡｂチェック」（シノテスト社）の「反応停止液」を反応停止液として用いた。
(6) Reaction stop solution The "reaction stop solution" of the above-mentioned "Toriko Asahi Ab Check" (Sinotest Co., Ltd.) was used as the reaction stop solution.
２．試料
抗Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ａｓａｈｉｉ抗体陽性血清：
抗Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ａｓａｈｉｉ抗体を含むことが確認されている６種類の血清を、抗Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ａｓａｈｉｉ抗体陽性血清として用意した。
2. Sample Anti-Trichosporon asahii antibody-positive serum:
Six types of sera confirmed to contain anti-Trichosporon asashii antibody were prepared as anti-Trichosporon asahii antibody-positive sera.
３．試料中の抗Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ａｓａｈｉｉ抗体の測定
（１）試料である前記２の６種類の抗Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ａｓａｈｉｉ抗体陽性血清を本実施例の１の（１）の試料希釈液により、それぞれ１００倍に希釈して混合液を調製した。
3. 3. Measurement of anti-Trichosporon asashii antibody in sample (1) The 6 types of anti-Trichosporon asashii antibody-positive sera of the above 2 samples are diluted 100-fold with the sample diluent of 1 (1) of this example. A mixture was prepared.
（２）前記（１）で調製した混合液の各々を、本実施例の１の（３）のＴ．ａｓａｈｉｉ抗原結合担体の各ウェルに１００μＬずつ分注し、これを３７℃にて１５時間反応させた。
これにより、担体に固定化されているＴｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ａｓａｈｉｉ抗原と試料に含まれていた抗Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ａｓａｈｉｉ抗体を接触させ、反応させた。
(2) Each of the mixed solutions prepared in (1) above was used in the T.I. 100 μL was dispensed into each well of the asahii antigen-binding carrier, and this was reacted at 37 ° C. for 15 hours.
As a result, the Trichosporon asashii antigen immobilized on the carrier and the anti-Trichosporon asashii antibody contained in the sample were brought into contact with each other and reacted.
（３）次に、前記のウェルより、前記の混合液を吸引して除去した。
そして、このウェルを、本実施例の１の（２）の３種類の洗浄液毎に分けて洗浄した。
(3) Next, the mixed solution was sucked and removed from the well.
Then, this well was washed separately for each of the three types of cleaning solutions of 1 (2) of this example.
（４）本実施例の１の（４）の酵素標識抗体を、前記の洗浄操作を行ったウェルに１００μＬずつ分注して、３７℃で２時間反応させた。 (4) The enzyme-labeled antibody of 1 (4) of this example was dispensed into the wells subjected to the above washing operation in an amount of 100 μL each and reacted at 37 ° C. for 2 hours.
（５）その後、前記のウェルより、未結合の酵素標識抗体を吸引して除去した。そして、このウェルを、本実施例の１の（２）の３種類の洗浄液毎に分けて洗浄した。 (5) Then, the unbound enzyme-labeled antibody was aspirated and removed from the well. Then, this well was washed separately for each of the three types of cleaning solutions of 1 (2) of this example.
（６）次に、本実施例の１の（５）の発色液の１５０μＬを、前記のウェルに分注し、３７℃で１時間反応させた。
これにより、担体に固定化された標識酵素（ペルオキシダーゼ）と、発色液を反応させて、色素を生成させた。
(6) Next, 150 μL of the color-developing solution of 1 (5) of this example was dispensed into the wells and reacted at 37 ° C. for 1 hour.
As a result, the labeling enzyme (peroxidase) immobilized on the carrier was reacted with the color-developing liquid to generate a dye.
（７）前記の発色液の添加１時間後に、本実施例の１の（６）の反応停止液を、前記のウェルに分注して、前記の反応を停止させた。 (7) One hour after the addition of the color-developing liquid, the reaction-terminating solution of 1 (6) of this example was dispensed into the wells to stop the reaction.
（８）マイクロプレートリーダー〔サンライズ〕（テカン社）にて、前記のウェル中の液の吸光度（主波長：４９０ｎｍ、副波長：６５５ｎｍ）を測定して、吸光度差の測定値を得た。 (8) The absorbance (main wavelength: 490 nm, sub-wavelength: 655 nm) of the liquid in the well was measured with a microplate reader [Sunrise] (Tecan) to obtain a measured value of the absorbance difference.
４．測定結果
以上の測定の結果を表７に示した。
4. Measurement results Table 7 shows the above measurement results.
この表より、洗浄液のイオン強度が１６２ｍｍｏｌ／Ｌの場合に比べて、１２５ｍｍｏｌ／Ｌや７５ｍｍｏｌ／Ｌの場合の方が得られた吸光度差の測定値がより低いことが分かる。 From this table, it can be seen that the measured values of the absorbance differences obtained when the ionic strength of the cleaning liquid is 162 mmol / L or 75 mmol / L are lower than those when the ionic strength is 162 mmol / L.
このことより、試料中の抗Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ａｓａｈｉｉ抗体の測定においては、抗ガングリオシド抗体の測定の場合とは異なり、イオン強度が１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下である洗浄液を使用しても、測定の感度を向上させることができないことが確かめられた。 From this, in the measurement of the anti-Trichosporon asashii antibody in the sample, unlike the case of the measurement of the anti-ganglioside antibody, the sensitivity of the measurement can be improved even if a washing solution having an ionic strength of 150 mmol / L or less is used. It was confirmed that it could not be done.
すなわち、試料中の抗ガングリオシド抗体の測定の場合においてこそ、イオン強度が１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下である洗浄液を使用することにより、測定の感度を向上させることができることが確かめられた。 That is, it was confirmed that the sensitivity of the measurement can be improved by using the washing solution having an ionic strength of 150 mmol / L or less only in the case of the measurement of the anti-ganglioside antibody in the sample.
Claims (4)
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