JP6712072B2

JP6712072B2 - 活性酸素による細胞培養基板の表面改質および滅菌処理

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Publication number: JP6712072B2
Application number: JP2015038344A
Authority: JP
Inventors: 暁岩森; 渓大家; 和輝細谷; 裕之松本; 潔吉野; 岩崎　達行; 達行岩崎; 亮小佐々
Original assignee: iwasakidenki; Tokai University Educational Systems
Current assignee: iwasakidenki; Tokai University Educational Systems
Priority date: 2015-02-27
Filing date: 2015-02-27
Publication date: 2020-06-17
Anticipated expiration: 2035-02-27
Also published as: JP2016158524A

Description

本発明は、活性酸素による細胞培養基板の表面改質および滅菌処理方法に関する。

現在、生物研究や医学、薬学の分野では、新薬や新たな治療法の開発、生体機構の把握をするために、生物の最小単位である細胞をポリスチレン（ＰＳ）製の細胞培養基板上で培養して試験を行うことが一般的である。接着細胞の培養には、細胞培養基板への細胞の接着が必要であることから、細胞培養基板の接着面に適度な粗さと親水性の付与のための表面改質が必要不可欠である。また、細胞培養に利用するためには、細胞培養基板への雑菌の混入（コンタミネーション）を防ぐための滅菌処理を行わなければならない。

従来、細胞培養基板を有する細胞培養皿等の細胞培養器具の作製には、細胞培養基板の表面をプラズマ処理することで、細胞の培養に必要な適度な粗さと親水性を付与するという方法が採用されている。しかし、プラズマ処理を用いた方法では、プラズマを用いるための大規模な装置が必要であり、プラズマ処理により培養基板の材料であるプラスチックが大きく損傷するという問題が生じていた。また、プラズマ処理された培養基板は、細胞の接着が促進される反面、細胞の増殖を抑制する傾向があることも知られている。

特許文献１には、このような問題を解決するために、ポリマー基材にプラズマ照射した後に、少なくとも１以上の洗浄工程を含む方法により、プラズマ処理したポリマー基材の細胞の接着性を高める方法が示されている。

特表２０１１−５２１０９１号公報

しかしながら、依然としてプラズマ照射による細胞培養基板の作製には、大規模な装置及び高いコストが必要であるという問題点を有する。また、プラズマ照射では、細胞培養基板の表面改質と滅菌処理を同時に行うことができず、表面改質された細胞培養基板の滅菌を、γ線の照射やエチレンオキシドガスへの曝露等の方法で行う必要がある。

一方、本発明者らは、紫外光により酸素を励起させることにより発生した活性酸素をポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）に曝露することにより、ＰＥＴの表面特性を変化させることを見出している（ＫｅｉＯｙａ，ＲｙｏｔａＷａｔａｎａｂｅ，ＳｈｕｎｓｕｋｅＳａｓａｋｉ，ＨａｊｉｍｅＨｉｒａｇａ，ＹａｓｕｔａｋａＯｈｎｉｓｈｉ，ａｎｄＳａｔｏｒｕＩｗａｍｏｒｉ“ＳｕｒｆａｃｅＣｈａｒａｃｔｅｒｔｉｓｔｉｃｏｆＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅＴｅｒｅｐｈｔｈａｌａｔｅ（ＰＥＴ）ＦｉｌｍＥｘｐｏｓｅｄｔｏＡｃｔｉｖｅＯｘｙｇｅｎＳｐｅｃｉｅｓＧｅｎｅｒａｔｅｄｖｉａＵｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ（ＵＶ）ＬｉｇｈｔＩｒｒａｄｉａｔｉｏｎｉｎＨｉｇｈａｎｄＬｏｗＨｕｍｉｄｉｔｙＣｏｎｄｉｔｉｏｎｓ”Ｊ．Ｐｈｏｔｏｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，Ｖｏｌ．２７，Ｎｏ．３（２０１４）４０９−４１４）。

本発明者らは、鋭意検討の結果、上記活性酸素によるＰＥＴ表面特性の変化が、細胞培養基板の表面改質に有効であり、また他の材料から成る細胞培養基板の表面改質にも適用できることを見出した。
さらに、活性酸素により前記細胞培養基板が滅菌されることから、表面改質と滅菌処理とを同時に行うことが可能であることも見出した。

本発明は、以上のような実情に鑑みてなされたものであり、低コストプロセスである紫外光励起活性酸素曝露技術を用いることで、非常に簡便に、細胞培養基板の表面改質と滅菌処理を同時に行う方法を提供するものである。また、本発明によれば、生物研究や医学、薬学の分野で利用される滅菌容器を提供することができる。

本発明の一態様によれば、活性酸素により有機高分子材料から成る細胞培養基板の表面改質と滅菌処理を同時に行う方法が提供される。

ＵＶ光を照射することによって活性酸素を生成することができる真空対応活性酸素生成装置を示す図である。試料の算術平均粗さを示す図である。試料の表面構造の原子の組成比を示す図である。培養後のＭＣ３Ｔ３−Ｅ１の位相差顕微鏡での観察結果を示す図である。培養後のＭＣ３Ｔ３−Ｅ１の培養基板への接着面積の平均値を示す図である。培養後のＭＣ３Ｔ３−Ｅ１の培養基板への接着面積の分布を示す図である。

以下に、活性酸素による細胞培養基板の表面改質および滅菌処理方法について詳細に説明する。なお、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。

（１）細胞培養基板
本発明の細胞培養基板は、表面改質処理により細胞の接着が可能となる限りいかなる金属材料、無機材料、有機高分子材料等のいかなる材料から成っても良いが、成形性および前記細胞培養基板の表面改質のされやすさに鑑みて、有機高分子材料が好ましい。中でも、ポリスチレン、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、及びポリプロピレン（ＰＰ）であることがより好ましく、特にポリスチレンは、化学的安定性及び成形時の寸法安定性に優れており、また透明性が非常に高いことから位相差顕微鏡での細胞観察がしやすいために好ましい。

本発明の有機高分子材料から成る細胞培養基板は、シャーレ、試験管、遠沈管、培養皿、培養ビン、又は培養フラスコ等の培養器具の少なくとも一部又は全部を構成し、対象とする細胞が接着し、増殖可能な構成であれば、いかなる構成で用いられても良い。

（２）活性酸素
本発明における活性酸素とは、原子状酸素（Ｏ（^３Ｐ））、励起一重項酸素（^１Ｏ_２、Ｏ（^１Ｄ））やオゾン（Ｏ_３）のみならず、ヒドロキシルラジカル（ＯＨ^＊）、過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）、及びヒドロペルオキシルラジカル（ＨＯ_２）を含む広義の活性酸素を意味する。これら活性酸素の表面改質処理のための細胞培養基板への曝露方法は、別途生成した活性酸素を気流等により導入することで細胞培養基板に曝露しても良いし、紫外線ランプを有する装置内に細胞培養基板を設置し、酸素雰囲気下で紫外線を酸素に照射することにより生成した活性酸素を細胞培養基板に曝露しても良い。

前記紫外線ランプの照射による酸素からの活性酸素の生成は、下式（１）〜（６）に示すように、１８５ｎｍ及び２５４ｎｍの波長（ｈν）の光により進行する。そのため、本発明に用いる紫外線ランプは、いかなる紫外線ランプを用いても良いが、２６０ｎｍ以下の波長の光を照射するランプであることが好ましく、低圧水銀ランプのように少なくとも１８５ｎｍ及び２５４ｎｍの波長の光、又はキセノンエキシマランプのように２００ｎｍ以下で直接活性酸素種を生成できる波長（例えば主発光波長１７２ｎｍ）を照射できなければならない。また、活性酸素の生成と該活性酸素の細胞培養基板への曝露を同一装置内で行う場合、前記装置内の酸素濃度（体積比）は、活性酸素が生成する濃度であればいかなる濃度でも構わないが、好ましくは通常の空気と同程度の２０％程度から１００％までの濃度である。この場合、本発明を大規模で行う場合は安全面の観点から酸素濃度は２０％程度が好ましく、実験室レベルで行う場合は効率の観点から１００％の濃度が好ましい。

（３）表面改質
本発明における表面改質とは、細胞培養基板表面の活性酸素による化学的結合状態の切断及び／又は親水性官能基の付与を指す。破壊された細胞培養基板表面は、その粗さが増大し、培養細胞の接着性が増す。また、親水性官能基が付与された細胞培養基板表面は、親水性が増大し、培養細胞の伸展性が増す。前記親水性官能基としては、水酸基、ホルミル基、カルボニル基、カルボキシル基、オキシラン基、スルホキシド基、スルホン基、スルホン酸基等の、基板表面を構成する有機高分子材料が酸化されたことにより生じる官能基を含む。

前記細胞培養基板表面の粗さは、活性酸素への曝露前後の細胞培養基板表面の状態を走査型プローブ顕微鏡、共焦点レーザー顕微鏡等で測定し、それらの表面形状を比較することで評価することができる。前記評価方法としては、算術平均粗さ、二乗平均粗さ、最大高さ粗さ、最大深さ粗さ、十点平均粗さ等を用いることができるが、これらに限られない。

前記細胞培養基板表面の親水性の評価は、Ｘ線光電子分光分析法及び純水を用いた接触角測定法によるぬれ性評価等により行うことができる。例えば、Ｘ線光電子分光分析法では、Ｃ１ｓスペクトルを測定することにより細胞培養基板表面の炭素原子の１ｓ軌道のエネルギーの化学シフトを測定し、炭素原子の化学状態を判断することにより細胞培養基板表面の親水性を評価することができる。同様に、Ｘ線光電子分光分析法において、Ｏ１ｓスペクトルを測定することにより細胞培養基板表面の酸素原子の１ｓ軌道のエネルギーの化学シフトを測定し、細胞培養基板表面の親水性を評価することもできる。さらに、各スペクトルの波形分離を行うことで、親水性に起因する官能基を同定、定量化することができる。また、ぬれ性評価では、純水と細胞培養基板表面のなす接触角を測定することで親水性の評価を行うことができ、前記接触角が小さいほど親水性が高い。

本発明の方法により表面処理された細胞培養基板における細胞の接着及び伸展の評価は、本発明の細胞培養基板、対照、及び市販の表面処理された細胞培養基板等を用いて実際に培養された細胞の観察及び比較により評価する。接着細胞が増殖するためには細胞培養基板へ細胞の接着が必要であるため、細胞培養基板と細胞の接着が十分か否かは、接着細胞の数を計測することにより判断することができる。細胞の伸展の評価は、前記接着細胞の形状から判断することができ、増殖した接着細胞が十分に伸展している場合は扁平な形状を示し、細胞が十分に進展していない場合は線形化することから判断できる。

（４）滅菌処理
本発明の有機高分子材料から成る細胞培養基板の滅菌処理は、活性酸素に曝露されることにより、前記表面改質と同時に行われる。したがって滅菌処理の条件は、前記表面改質と同じとなる。滅菌処理後の細胞培養基板は、無菌状態を保ったまま滅菌バッグに封入することができる。また、本発明の細胞培養基板の表面改質と滅菌処理を同時に行う方法では、滅菌バッグに封入した未滅菌の細胞培養基板の表面改質と滅菌処理を、活性酸素を用いて同時に行うことができる。この方法により、表面改質後のコンタミネーションを簡便な方法で防ぐことができる。一方、従来、表面改質に用いられているプラズマは高エネルギーであり、通常の滅菌バッグに用いられる材料が大きくダメージを受けてしまうことから、細胞培養基板を滅菌バッグに封入した状態で表面改質と滅菌処理を同時に行うことができない。したがって、プラズマを用いた従来法では、プラズマによる表面改質後に、細胞培養基板を滅菌バッグに封入し、続いて滅菌処理をするという多段階の処理が必要であった。これに対して、本発明の方法によれば、コンタミネーションを起こすことなく、低コストで表面改質及び滅菌処理がなされた細胞培養基板を、一度の処理で提供することが可能である。

前記滅菌バッグは、活性酸素が透過できる限りいかなる滅菌バッグであっても良い。本発明の方法では、活性酸素の発生を高湿度条件下で行う場合もあるため、前記滅菌バッグは耐水性を有することが好ましい。また、前記滅菌バッグは透明、半透明、不透明のいずれであっても良く、少なくとも一面が紫外線を透過しない滅菌バッグが好ましい。このような滅菌バッグを用いる場合、細胞培養基板の表面改質と滅菌処理を紫外線照射下で行う際に、紫外線を透過しない面を紫外線ランプに向けることにより、紫外線による細胞培養基板の損傷を防ぐことができる。

前記滅菌処理の評価は、生物インジケータ（ＢＩ）、プロセスチャレンジデバイス（ＰＣＤ）等を用いて評価することもできるし、滅菌処理後の細胞培養基板に適当な培地を注入し、培養することで残存菌の有無の判断を行っても良い。

以下に、具体的な実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。下記の実施例は、本発明の最良な実施形態の一例であるものの、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。

［実施例１］高酸素濃度化におけるポリスチレン（ＰＳ）製細胞培養皿の表面改質及び滅菌処理
ＵＶ光を照射することによって活性酸素を生成することができる真空対応活性酸素生成装置（図１）を作製し、本実験で使用した。真空チャンバーに１８５ｎｍと２５４ｎｍの波長のＵＶ光を同時に発生できるＵＶランプ（出力１１０Ｗ）１灯を取り付け、ランプからの赤外放射に起因するチャンバー内の急激な温度上昇を防ぐために装置の周りに冷却水を循環させた。表面処理されていないＰＳ製細胞培養皿（Ｎｏ．３５１１４３，コーニング社製）を、一方の面が不織布から成り他方の面がフィルムから成る酸素及び活性酸素を透過し、微生物および紫外線を透過しない滅菌バッグ（タイベック，ジョンソン・エンド・ジョンソン社製）に封入し、チャンバー内に静置した。その後、真空ポンプによりチャンバー内の圧力が１０Ｐａとなるまで排気後、酸素を２ｋＰａ台まで流入させ、チャンバー内の酸素濃度をほぼ１００％とした。その後、湿度０％ＲH、照射開始温度２０℃の条件で紫外線を３０分間照射することで、ＰＳ製細胞培養皿を活性酸素に曝露し、表面改質および滅菌処理を行い、試料を得た。

表面処理されていないＰＳ製細胞培養皿（以下、「未処理の細胞培養皿」とも言う。）、前記３０分間活性酸素に曝露されたＰＳ製細胞培養皿（以下、「活性酸素処理された細胞培養皿」とも言う。）、及び表面処理された市販の細胞培養皿（Ｎｏ．３５３０４３，コーニング社製）（以下、「表面処理済みの細胞培養皿」とも言う。）の表面を走査型プローブ顕微鏡（ＳＰＭ−９６００，島津製作所製）により観察した。それぞれ３つの試料について、１試料につきの任意の５μｍ四方の中から無作為に１．５μｍ四方を５ヶ所について表面形状を測定し、画像化した。得られた画像を付属のソフトウェアを用いて、算術平均粗さを算出した（図２）。

算出結果より、前記活性酸素処理された細胞培養皿の表面の算術平均粗さは、未処理の細胞培養皿の表面及び表面処理済みの細胞培養皿の表面よりも粗さが増加していた。

続いて、未処理の細胞培養皿、前記活性酸素処理された細胞培養皿、及び表面処理済みの細胞培養皿の表面の構造原子の組成をＱｕａｎｔｕｍ２０００（ＵＬＶＡＣ−ＰＨＩ社製）を用いたＸ線光電子分光分析法により解析した。各試料の表面に超高真空下（＜１×１０^−３〜１０^−７Ｐａ）でＸ線を任意の直径５０μｍの円に照射し、Ｃ１ｓおよびＯ１ｓのＸ線光電子分光分析法スペクトルを得た。得られたスペクトルの積分面積を測定し組成比を求めた。表面構造の原子の組成比を図３に示す。

活性酸素に曝露されたＰＳ製細胞培養皿の表面構造の原子の組成比は、酸素原子が占める割合が７％、炭素原子が占める割合が９３％であった。一方、未処理の細胞培養皿の表面構造の原子の組成比は、酸素原子が占める割合が１％、炭素原子が占める割合が９９％であった。このことから、活性酸素の曝露によりＰＳ製細胞培養皿の表面構造が酸化され、親水性となっていることが分かる。また、表面処理済みの細胞培養皿の表面構造中の原子の組成比は、酸素原子の組成が１２％であった。

そこで、未処理の細胞培養皿、前記活性酸素処理された細胞培養皿、及び表面処理済みの細胞培養皿を用いて、マウス頭蓋冠由来骨芽細胞様細胞株のＭＣ３Ｔ３−Ｅ１を培養し、本発明の方法により表面処理及び滅菌処理が行われた細胞培養基板への細胞の接着性及び増殖性の評価を行った。

基本培地（α−ＭＥＭ）に１０％濃度になるようにウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加し、さらに抗生物質・抗真菌剤（１００ＩＵ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、及び０．２５μｇ／ｍＬのアンフォテリシンＢ）を添加した培養培地を用いて、未処理の細胞培養皿、前記活性酸素処理された細胞培養皿、又は表面処理済みの細胞培養皿でＭＣ３Ｔ３−Ｅ１を３７°Ｃ、５％ＣＯ_２の条件で２４時間培養した。培養後の細胞を、位相差顕微鏡（ＩＸ−７１，ＯＬＹＭＰＵＳ社製）を用いて細胞の接着性及び増殖性の様子を１００倍および２００倍の倍率で観察した（図４）。なお、図４中のスケールバーは２００μｍを表す。

活性酸素処理された細胞培養皿用いて培養した細胞（図４ａおよびその拡大図である図４ｂ）は、表面処理済みの細胞培養皿を用いて培養した細胞（図４ｃおよびその拡大図である図４ｄ）と同等に接着、伸展している。一方、未処理の細胞培養皿を用いて培養した細胞（図４ｅおよびその拡大図である図４ｆ）は線形化して細胞が伸展していない。

上記観察結果をもとに、各細胞培養皿を用いて培養した細胞の接着面積を比較した（図５）。ここでは、各細胞培養皿上の細胞の接着面積を任意の培養細胞４０個の接着面積の平均値として示している。この結果より、活性酸素処理された細胞培養皿を用いて培養した細胞の接着面積の平均値（３４１６±１３８８μｍ^２）は、表面処理済みの細胞培養皿を用いて培養した細胞の接着面積の平均値（３５９７±３１０５μｍ^２）とほぼ同じであることが分かった。したがって、活性酸素による細胞培養基板の表面改質は、表面処理された市販の細胞培養基板の表面改質と、同等の効果を得られると考えられた。
続いて、前記細胞の接着面積の分布を比較した（図６）。活性酸素処理された細胞培養皿を用いて培養した細胞の接着面積の分布（図６ａ）は、２，５０１〜４，０００μｍ^２付近に多くの細胞が分布していた。これに対して、表面処理済みの細胞培養皿を用いて培養した細胞の接着面積の分布（図６ｂ）は、１，００１〜４，５００μｍ^２付近に多くの細胞が分布していた。また、未処理の細胞培養皿を用いて培養した細胞の接着面積の分布（図６ｃ）は、５０１〜２，０００μｍ^２付近に多くの細胞が分布していた。

このように、活性酸素処理された細胞培養皿を用いて培養した細胞の接着面積と表面処理済みの細胞培養皿を用いて培養した細胞の接着面積は、ほぼ同じであるのにもかかわらず、接着面積の分布に関しては、活性酸素処理された細胞培養皿を用いて培養した細胞の方が、明らかにばらつきが小さかった。

興味深いことに、任意の培養細胞４０個の接着面積の平均値は、表面処理済みの細胞培養皿を用いて培養した細胞の接着面積の平均値の方が、活性酸素処理された細胞培養皿を用いて培養した細胞の接着面積の平均値と比べてわずかに大きかったにもかかわらず、接着面積が２，５００μｍ^２以上の細胞の割合は、活性酸素処理された細胞培養皿を用いて培養した細胞では７７．５％であるのに対して、表面処理済みの細胞培養皿を用いて培養した細胞では５０．０％であった。

このことから、活性酸素による細胞培養基板の表面改質は、市販の細胞培養基板の表面改質とくらべて、細胞の接着性及び伸展性を高めることができ、細胞培養基板の表面改質方法としてより好ましいと考えられた。これは、市販の細胞培養基板の表面改質が細胞培養基板表面の酸化により親水性が増加する一方で表面粗さがあまり増加しないことに比べ、活性酸素による細胞培養基板の表面改質では、細胞培養基板表面の酸化による親水性の増加及び表面粗さの増加の両方が行われるためと考えられる。その結果、本発明の細胞培養基板は、表面の親水性の増加及び表面粗さの増加の相乗的な効果として、細胞の高い接着性及び伸展性という効果、並びに活性酸素を含む気体による均一的な処理による細胞接着面積のばらつきが小さいという効果を発揮すると考えられた。

また、培養の結果、コンタミネーションが発生していないことから、滅菌処理も十分に行われていた。したがって、本発明の方法により表面処理及び滅菌処理が行われた細胞培養基板は、表面処理された市販の細胞培養皿と同等の細胞の接着性及び増殖性を有する。

以上、本発明の方法により、活性酸素による有機高分子材料から成る細胞培養基板の表面改質と滅菌処理を同時に行うことを見出した。

Claims

活性酸素により有機高分子材料から成る細胞培養基板の表面改質と滅菌処理を同時に行う方法であって、
少なくとも一面が紫外線を透過しない通気性を有する滅菌バッグに前記細胞培養基板を封入し、
活性酸素生成装置で発生した前記活性酸素を前記滅菌バッグに導入し、
前記滅菌バッグ内で前記活性酸素を前記細胞培養基板に暴露する、方法であって
前記活性酸素生成装置が酸素存在下、紫外線の照射により前記活性酸素を発生すること、及び
前記紫外線が前記細胞培養基板に照射されないことを特徴とする、方法。
前記有機高分子材料が、ポリスチレンであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
前記細胞培養基板が封入された前記滅菌バッグが前記酸素存在下に静置されていることにより、前記活性酸素の発生と前記細胞培養基板への前記活性酸素の暴露を同一装置内で行うことを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
前記活性酸素生成装置が紫外線ランプであることを特徴とする、請求項１〜３の何れか一項に記載の方法。
前記紫外線が、少なくとも２６０ｎｍ以下の波長の光を照射することを特徴とする、請求項１〜４の何れか一項に記載の方法。
前記紫外線が、少なくとも１８５ｎｍ及び２５４ｎｍの波長の光を照射することを特徴とする、請求項５に記載の方法。
前記細胞培養基板が、シャーレ、遠沈管、培養ビン、又は培養フラスコの少なくとも一部であることを特徴とする、請求項１〜６の何れか一項に記載の方法。