JP6709279B2 - 予防および治療用の薬剤 - Google Patents

予防および治療用の薬剤 Download PDF

Info

Publication number
JP6709279B2
JP6709279B2 JP2018512484A JP2018512484A JP6709279B2 JP 6709279 B2 JP6709279 B2 JP 6709279B2 JP 2018512484 A JP2018512484 A JP 2018512484A JP 2018512484 A JP2018512484 A JP 2018512484A JP 6709279 B2 JP6709279 B2 JP 6709279B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
substrate binding
dnazyme
prophylactic
binding domain
dpp
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2018512484A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2018521114A5 (ja
JP2018521114A (ja
Inventor
ダニール ポタツェック，
ダニール ポタツェック，
ホルガ— ガルン，
ホルガ― ガルン，
ハーラルト レンツ，
ハーラルト レンツ，
Original Assignee
ゼカルナ ファーマスーティカルズ ゲーエムベーハー ウント ツェーオー． カーゲー
ゼカルナ ファーマスーティカルズ ゲーエムベーハー ウント ツェーオー． カーゲー
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ゼカルナ ファーマスーティカルズ ゲーエムベーハー ウント ツェーオー． カーゲー, ゼカルナ ファーマスーティカルズ ゲーエムベーハー ウント ツェーオー． カーゲー filed Critical ゼカルナ ファーマスーティカルズ ゲーエムベーハー ウント ツェーオー． カーゲー
Publication of JP2018521114A publication Critical patent/JP2018521114A/ja
Publication of JP2018521114A5 publication Critical patent/JP2018521114A5/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP6709279B2 publication Critical patent/JP6709279B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/711—Natural deoxyribonucleic acids, i.e. containing only 2'-deoxyriboses attached to adenine, guanine, cytosine or thymine and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
    • C12N2310/127—DNAzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/10—Applications; Uses in screening processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/31—Combination therapy

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

本発明は、ピコルナウイルス、特にライノウイルスによって引き起こされるウイルス感染症の予防および治療用の薬剤に関する。
ピコルナウイルス
ピコルナウイルスは、ヒトおよび様々なその他の哺乳類において感染および疾患を引き起こす特殊なＲＮＡウイルス群である。ピコルナウイルスのウイルスゲノムは、プラス極性の一本鎖ＲＮＡを含む。３’末端および５’末端にある２つの非コード領域間に、翻訳中に個々のウイルスタンパク質に切断されるウイルス前駆体ポリタンパク質のための唯一のオープンリーディングフレームが位置する。３’末端には、プラス鎖ウイルスに典型的なポリＡ尾部が位置する。５’末端には、開始コドンに先立ち、ＲＮＡが、多数の相補的塩基対によって複雑な二次構造を有する領域が位置する。機能的には、この断片は、リボソーム上で翻訳を開始するためのＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ：配列内リボソーム進入部位）に相応する。
ピコルナウイルス科に数えられるのは、以下のものである。
・ コクサッキーウイルス
・ エコーウイルス
・ エンテロウイルス
・ ポリオウイルス
・ ライノウイルス
これらのウイルスによる感染は、一連の臨床的に関係した疾患、例えば、無菌性髄膜炎、ヘルパンギーナ（ザホルスキー病とも呼ばれる）、手足口病、出血性結膜炎、気道疾患（例えば、夏風邪、咽頭炎、肺炎）および内臓疾患（例えば、心膜炎、心筋炎、胸膜痛）を引き起こす。
診断
問題になる可能性のある病原体の多様性ゆえ、ヒトまたは哺乳類の生体試料での確かな診断は、依然として、細胞培養でのウイルス増殖に続くタイピング（中和試験）または分子的方法（核酸増幅技術、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）によるウイルスゲノムの検出を用いた直接的な病原体検出によって行われる。生体試料、例えば、血液、大便、髄液、または咽頭洗浄水中でのこの直接検出は、非常に手間がかかり費用がかさむ。
治療
ウイルス感染症の特異的薬剤治療も、目下のところ不可能である。治療は、もっぱら対症的に行い、冒された臓器系に向けられている。
予防
ウイルス感染症を防ぐための一連の予防衛生措置がある。感染および疾患に対する最も重要な防御は予防接種である。ポリオウイルスに対してはそのようなワクチンが提供されているのに対して、ピコルナウイルス科の群のライノウイルスおよびその他のウイルスに関しては、有効なワクチンが全くまたはほとんど提供されていない。
ライノウイルス
ライノウイルスの群に数えられるのは、ゲノムの相同性に基づき、３つの群Ａ、ＢおよびＣに分類されるおよそ１５７の異なる型である。ＡおよびＢ群のライノウイルスは、たいていの場合、細胞のＩＣＡＭ−１受容体に、またはＬＤＬ受容体に結合する。
ウイルスタンパク質は、ポリタンパク質として製造された後、プロテアーゼにより切断される。ビリオン中に存在する構造タンパク質は、ＲＮＡの５’領域にコードされ、非構造タンパク質は３’領域にコードされる。５’末端には、非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）があり、Ｐ１領域、Ｐ２領域、およびＰ３領域がそれに続き、それぞれカプシドタンパク質（ＶＰ１からＶＰ４）、プロテアーゼ、およびＲＮＡポリメラーゼをコードする。それに、さらなる非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）およびポリＡ尾部が続く。カプシドタンパク質（ＶＰ１からＶＰ４）は、ゲノムを包むことに利用され、さらには宿主細胞に付着するための受容体としても利用される。ＶＰ１〜３は、表面タンパク質として、宿主生物の抗体によって認識される。
ライノウイルスは、世界中に広まっており、ヒトに限定されている。ライノウイルスは、その増殖に、３℃から３３℃の温度を好むものの、特に、感染が粘膜領域のみならず気道および肺領域にも及ぶ場合には、さらにより高温でも増殖する。
Ｒｈｉｎｉｔｉｓ ａｃｕｔａ（鼻風邪）は、ライノウイルスによって引き起こされる最も頻繁なヒト感染症であり、鼻風邪、喘息、または気道感受性の亢進をもたらす。すべての急性喘息発作またはＣＯＰＤ（慢性閉塞性肺疾患）増悪の４０パーセントまでは、上気道のウイルス感染症が関与している。ウイルスは、気道の上皮層を損ない、炎症を引き起こし、気道細胞の神経感受性を高める。それは、喘息患者の場合、重度の影響をもたらすが、健常者にも打撃を与える。それゆえ、「風邪」を引いた後に、長引く咳を患う者もいる。
ライノウイルスによる感染が、健常者の場合は通常、大事には至らずにすぐに良くなる風邪を引き起こすのに対して、これらの感染は、喘息患者、およびすでに気道細胞の感受性を示す人においては、非常に著しくなり、生命を脅かす呼吸困難、狭心症、および息切れを引き起こすことがある。
イギリスの科学者が、最近、ライノウイルスによる感染が、ヒトの肺上皮細胞において、サイトカイン、特にインターロイキン（ＩＬ−２５）の形成の増加を引き起こすことを示した。それが、アレルギー反応の場合と同様にシグナルカスケードを引き起こし、最終的には異常に激しい炎症反応を引き起こす。
これに関して、ライノウイルスによる感染が、小児では、気道細胞を感作させ、成人では喘息の発症率を高めることも知られている。
予防
ライノウイルスによる感染前の予防がほとんど不可能であるのと同様に原因療法もほぼ不可能であるため、ヒトの免疫系により対処することが任されているということが、主流を占める科学的意見である。ただし、まさに新生児、自然免疫抑制または薬剤に起因する免疫抑制を伴う患者の免疫系は、極端に弱まっているため、ピコルナウイルス、特にライノウイルスによる感染に先立つ予防が望ましい。
治療
原因療法がないということは、必然的に、ヒトにとっては病期の我慢を意味する。ヒトに提供されるのは、鼻風邪および頭痛といった付随症状の対症療法用薬剤のみである。知られている対症措置は、身体的休養、吸入、精油の塗擦、および健康な食事である。さらに、鼻粘膜の腫れを鎮めるか、または鼻粘膜を手当てするべき有効成分を含む各種の経鼻剤形が加わる。当業者には、気道を短期間解放する有効成分のトラマゾリンおよびキシロメタゾリンを含む点鼻スプレーが公知である。有効成分オキシメタゾリンを含む点鼻スプレーは、ライノウイルスの受容体であるＩＣＡＭ−１の発現を阻止することによる直接的な抗ウイルス作用を有する。ただし、これらの点鼻スプレーは、鼻風邪症状に対してしか作用せず、喘息またはＣＯＰＤ（慢性閉塞性肺疾患）といった重度のウイルス感染症では作用しない。さらに、喉のヒリヒリに対するトローチ、および粘性の高い粘液の喀出を楽にするか、または咳を緩和するべき有効成分を含む発泡性錠剤、シロップまたは滴薬が使用され、時として、患者には短期間、鎮痛剤および解熱薬も勧められる。しばしば、ウイルス感染症に続いて細菌重複感染症も起こり、それゆえ肺炎にも至る。その場合、これらは様々な抗生物質を用いて治療するが、抵抗性が存在する場合の影響は一般的に知られている。喘息またはＣＯＰＤを治療する際には、しかも経口投与から全身投与への切り替えが必要であり、ただし、グルココルチコイドを使用せざるを得ず、病院での治療は費用がかさみ手間がかかる。
予防接種
ライノウイルスに対する特異的な予防接種はこれまでのところ存在しない。１９６０年代に様々なワクチンが生成されたが、それらのワクチンは、その季節またはその地域の特定ライノウイルスに対する特異的ワクチン防御しか生み出せなかった。
もっとも、ライノウイルス感染症も、体内において、特定感染型に対する唯一の免疫性しか引き起こさない。ＲＮＡウイルス一般の特徴的性質は、そのより著しい突然変異率、およびそれに起因する柔軟性である。したがって、例えば、ライノウイルスのカプシドタンパク質は、タンパク質レベルで非常に可変性があり、それは、包括的な免疫性の形成を非常に困難にし、１つを超えるライノウイルス型に対して有効なワクチンの製造もこれまでのところ不可能にした。目下のところ、長期的に有効な特異的な医薬品またはワクチンは存在しない。従来技術において、カプシドタンパク質ＶＰ１と相互作用する、カプシド遮断薬である有効成分プレコナリルが確かに言及されているが、市販製剤は入手できないか、または承認されていない。
ＤＮＡザイム（ＤＮＡｚｙｍｅ）
ＤＮＡザイムは、触媒活性のある一本鎖ＤＮＡ分子である。
公知のＤＮＡザイムファミリーは、ＲＮＡ分子の標的配列を特異的に認識し、相補的に結合し、触媒活性により切断する「１０−２３」ＤＮＡザイムであり、切断されたＲＮＡ分子の活性は消失するか、または低下する。これは、ＲＮＡ分子の発現の増加に起因する、人または動物の疾患を治療するための、治療上大いに期待のもてるアプローチである。しかしながら、前提条件は、結合のための標的構造または標的配列が、十分に同定されている上にアクセス可能であり、ＤＮＡザイムが優れた結合特性同様に触媒活性も発揮できることである。
１０−２３−ＤＮＡザイムは、１５ヌクレオチドの触媒ドメインを有し、それに２つの基質結合ドメイン（ＩおよびＩＩ）が隣接する。ＲＮＡ基質への結合は、ワトソン・クリック則に基づく塩基対により、基質結合ドメインＩおよびＩＩを介して起こる。
従来技術
人体内または動物体内において疾患誘導性のＲＮＡ分子を結合および遮断するために、アンチセンス戦略を利用することは公知である。従来技術では、高特異的なＲＮＡ標的構造を認識、結合および切断する「１０−２３」ＤＮＡザイムが公知である。その結果、標的構造が、不活性化、阻害、または遮断されるため、ＲＮＡ分子は、その疾患誘導性機能を生物体内でもはや実現できなくなる。選択されたＤＮＡザイムが、例えば、ウイルス複製を阻害するための薬剤として医療上の使用に向けて記載されている。しかしながら、それらのＤＮＡザイムは、ある型の特定ＲＮＡウイルスの保存領域に対して非常に特異的であるため、複数のウイルス型または著しく変化するウイルス型の一群をカバーすることはできない。それらのＤＮＡザイムは、ピコルナウイルスが示すような複数のウイルス型または著しく変化するウイルス型に対する幅広い適用性を有さない。
ＤＥ１０３２２６６２Ａ１（特許文献１）も同様に、「１０−２３」ＤＮＡザイムを変化させたＤＮＡザイムを開示する。それらのＤＮＡザイムは、血清型ＨＲＶ１４のライノウイルスの標的配列ＩＲＥＳを認識して結合する。
欠点は、その標的配列が、あまり保存されておらず、高い突然変異率の影響下にあることである。それゆえ、ＤＮＡザイムの有効性は、血清型ＨＲＶ１４のライノウイルスのみに限定されており、ライノウイルスの全血清型またはピコルナウイルスの全血清型に対して一般的には有効でない。
ＵＳ２０１１００９１５０１（特許文献２）には、改善されたライノウイルスベクターおよびそれらの配列、ならびにそれらを免疫原、例えば、インフルエンザウイルス免疫原用の輸送媒体として治療において使用する方法が記載される。開示されるベクターは、血清型ＨＲＶ１４のライノウイルスのヌクレオチド配列と共に開示されている。しかしながら、そのベクターは、ライノウイルスｍＲＮＡを結合するためのアンチセンス分子としては使用されない。
ＵＳ２０１３０３０９２３８（特許文献３）には、ライノウイルス関連炎症反応および喘息を、Ｍｉｄｌｉｎｅ−１反応経路のアンチセンス阻害により、軽減させる可能性が開示される。その明細書では、触媒的なアンチセンスのコンストラクト（ｃａｔａｌｙｔｉｃ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）について確かに言及されるが、特定またはできる限り多数の血清型のライノウイルスに対する具体的なＤＮＡザイムについては言及されない。
従来技術から見出された出版物のいずれも、ピコルナウイルス、特にライノウイルスによって引き起こされる多数のウイルス感染症に対して使用可能である特異的ＤＮＡザイムを開示しない。
独国特許出願公開第１０３２２６６２号明細書 米国特許出願公開第２０１１／００９１５０１号明細書 米国特許出願公開第２０１３／０３０９２３８号明細書
本発明の課題は、従来技術の欠点を排除すること、およびピコルナウイルス、特にライノウイルスによって引き起こされるウイルス感染症の予防および治療用の、多数の血清型に対して有効である薬剤を提供することである。
この課題は、本発明によると、請求項１および従属請求項の特徴部分に記載される、配列番号２〜６２による少なくとも１つのＤＮＡザイム、およびその本発明による使用によって解決される。
１．本発明によるＤＮＡザイムが結合する標的配列
驚くべきことに、バイオインフォマティクスを用いて評価した、ピコルナウイルスの使用可能な全ゲノム配列のアライメントにおいて、ウイルスゲノムの５’−ＵＴＲ領域の非常に高い相同性または配列同一性が確認された。この領域は、非常に保存されており、ウイルス内においてわずかな突然変異率を示す。
ライノウイルスの使用可能な全ゲノム配列のより詳細な評価（Mclntyreら、J Gen Virol、2012年に基づく）も同じく、その５’−ＵＴＲ領域において非常に高い相同性または配列同一性を示す。
それゆえ、この相同性５’−ＵＴＲ領域の配列番号１は、できる限り多数のピコルナウイルス、およびライノウイルスのできる限り多数の血清型のｍＲＮＡに対して相補的かつ特異的であるＤＮＡザイムを提供するために、良好な起点となる。
本発明によるＤＮＡザイムは、ウイルスゲノムの５’−ＵＴＲ領域に由来するそのｍＲＮＡに対して向けられている。本発明によるＤＮＡザイムの少なくとも１つによる、そのｍＲＮＡの切断が、多数のピコルナウイルスの複製およびライノウイルスの多数の血清型の複製を阻害し、それゆえ、疾患の発現に抵抗する。
本発明によるＤＮＡザイムは、まさにその標的配列に対して特異的に向けられている。それゆえ、本発明によるＤＮＡザイムは、ピコルナウイルス、特にライノウイルスによって引き起こされるウイルス感染症の予防および治療用の有効な薬剤である。本発明によるＤＮＡザイムは、多数の血清型に対して有効である。
特に、ｄｐｐ−Ｘ１、ｄｐｐ−Ｘ２およびｄｐｐ−ｊ−９の群から選択される本発明によるＤＮＡザイム（配列番号２〜６２）は、
− ウイルスゲノムの５’−ＵＴＲ領域にある標的配列への結合
− ５’−ＵＴＲ領域にある標的配列に対する高い酵素的切断活性
− ライノウイルスの様々な血清型およびその他のピコルナウイルスにおける、ウイルスＲＮＡの著しい不活性化
に関して、予想外に好都合の特性を有する。
本発明によるＤＮＡザイムの切断を、ピコルナウイルス、特にライノウイルスの使用可能な全ゲノム配列を用いて、Mclntyreら、J Gen Virol、2012年に基づいて算出する。
９７．４％の相同性、それゆえ全ＨＲＶ−Ａ株での切断が見出される。１００％の相同性、それゆえ全ＨＲＶ−Ｂ株での切断が見出される。９８．０８％の相同性、それゆえ全ＨＲＶ−Ｃ株での切断が見出される。
２．ＤＮＡザイム
本発明によるＤＮＡザイムの構成
ｄｐｐ−Ｘ１、ｄｐｐ−Ｘ２およびｄｐｐ−ｊ−９の群から選択される本発明によるＤＮＡザイム（配列番号２〜６２）は、それぞれ、２つの基質結合ドメインＩおよびＩＩが隣接する、配列ＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡを含む１５個のデオキシリボ核酸からなる中央触媒ドメインを含む。両方の基質結合ドメインＩおよびＩＩは、脱エステル化により標的配列を切断する際のＤＮＡザイムの触媒活性にとって重要である。基質結合ドメインは、ウイルスゲノムの５’−ＵＴＲ領域にある特異的標的配列を認識し、ワトソン・クリック塩基対を介して非常に特異的に結合する。
本発明によるＤＮＡザイムは、ピコルナウイルス、特にライノウイルスのゲノムの保存されたＲＮＡ領域を認識し、これらの領域に相補的に結合し、これらの領域を切断する。その結果、ピコルナウイルス、特にライノウイルスのＲＮＡが、不活性化、阻害、または遮断されるため、その複製、それゆえ、生物体内で疾患誘導作用をもはや発揮できなくなる。本発明によるＤＮＡザイムは、ピコルナウイルス、特にライノウイルスのウイルス複製を阻害することを目的とした医療上の使用のための有効な薬剤である。予防および治療用の医療上の使用は、ヒトおよび／または哺乳類で行う。
特に、ｄｐｐ−Ｘ１、ｄｐｐ−Ｘ２およびｄｐｐ−ｊ−９の群から選択される本発明によるＤＮＡザイム（配列番号２〜６２）は、
− ウイルスゲノムの５’−ＵＴＲ領域にある標的配列への結合
− ５’−ＵＴＲ領域にある標的配列に対する高い酵素的切断活性
− ライノウイルスの様々な血清型およびその他のピコルナウイルスにおける、ウイルスＲＮＡの著しい不活性化
に関して、予想外に好都合の特性を有する。
基質結合ドメインＩおよびＩＩの長さおよび配列が、ＤＮＡザイムの切断特性および触媒活性にとって決定的である。基質結合ドメインＩおよびＩＩは、長さが同じであるか、または長さが異なるかのいずれか一方である。ｄｐｐ−Ｘ１、ｄｐｐ−Ｘ２およびｄｐｐ−ｊ−９の群から選択される本発明によるＤＮＡザイム（配列番号２〜６２）を対象に、標的配列でのその切断特性に関する基質結合ドメインＩおよびＩＩの様々な長さおよび配列を示すために、多数の実験シリーズを行った。これらの切断実験の結果は、例示的実施形態に示す。
一つの実施態様では、基質結合ドメインＩおよびＩＩが、ウイルスゲノムの５’−ＵＴＲ領域にある特定標的配列に対して完全に相補的である。しかしながら、ウイルスゲノムの５’−ＵＴＲ領域においてＲＮＡを切断するためには、本発明によるＤＮＡザイムの基質結合ドメインＩおよびＩＩが、必ずしも完全に相補的でなくてもよい。Ｉｎ ｖｉｔｒｏでの検討は、８０％、８５％、９０％、または９５％の相同性を有する基質結合ドメインＩまたはＩＩを含む本発明によるＤＮＡザイムも、ウイルスゲノムの５’−ＵＴＲ領域にある標的配列に結合し、その標的配列を切断できるということを示す。
修飾
さらに、驚くべきことに、ｄｐｐ−Ｘ１、ｄｐｐ−Ｘ２およびｄｐｐ−ｊ−９の群から選択される本発明によるＤＮＡザイム（配列番号２〜６２）が、修飾により、核酸分解攻撃に対して安定化されるということが見出された。このことは、特に、医療薬剤としての適用には重要である。
修飾は、安定化されたＤＮＡザイムが、触媒活性の著しい低下を示さないか、またはしかもそれぞれのＲＮＡ基質に対して触媒活性の改善さえも示すことをもたらす。
修飾ヌクレオチドは、特に化学修飾を含む。化学修飾と当業者が理解するのは、修飾ヌクレオチドが、単一または複数の原子または原子団の除去、付加、または置換により、天然ヌクレオチドと比べて変化していることである。化学修飾は、例えば、リボース（例えば、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、いわゆる「ロックド核酸（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）」（ＬＮＡ）−リボヌクレオチドおよび逆向きチミジン）、ホスホ（ジ）エステル結合（例えば、ホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｔｈｉｏａｔｅ）、ホスホロアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）、メチルホスホネート、およびペプチドヌクレオチド）、および／または塩基（例えば、７−デアザグアノシン、５−メチルシトシン、およびイノシン）を含む。
特に好ましい一実施形態では、本発明によるＤＮＡザイムが、基質結合ドメインＩおよび／またはＩＩの少なくとも１つのヌクレオチドにおいて、特に、ホスホロチオエート、逆向きチミジン、２’−Ｏ−メチルリボース、またはＬＮＡリボヌクレオチドによって修飾可能である。さらなる好ましいＤＮＡザイムでは、触媒ドメインの１つのヌクレオチドまたは複数のヌクレオチドが、特に、ホスホロチオエート、逆向きチミジン、２’−Ｏ−メチルリボース、またはＬＮＡリボヌクレオチドによって修飾されている。
好ましい一実施態様は、本発明によるＤＮＡザイムの末端における３’−３’反転の導入である。３’−３’反転という用語は、末端ヌクレオチドの３’−炭素と隣接ヌクレオチドの３’−炭素との間のリン酸共有結合を意味する。この型の結合は、連続するヌクレオチドの３’−炭素と５’−炭素との間の通常のリン酸結合と対照的である。それに応じて、３’末端のヌクレオチドが、触媒ドメインの３’末端に隣接する基質結合ドメインと反転していることが好ましい。反転に加えて、ＤＮＡザイムは、修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチド化合物を含有してもよい。修飾ヌクレオチドは、例えば、Ｎ３’−Ｐ５’−ホスホロアミデート化合物、２’−Ｏ−メチル置換、およびペプチド核酸化合物を内包する。あらゆる修飾の製造は、この分野の当業者には周知であり、当業者はその方法に関する手引きを従来技術に見つける。
一実施形態では、修飾が、触媒ドメイン中に局在する。さらなる一実施形態では、修飾が、基質結合ドメインＩおよび／またはＩＩ中に局在する。さらなる一実施形態では、修飾が、触媒ドメイン中および基質結合ドメインＩおよび／またはＩＩ中に局在する。
薬としての使用
ｄｐｐ−Ｘ１、ｄｐｐ−Ｘ２およびｄｐｐ−ｊ−９の群から選択される、修飾を伴うかまたは伴わない、本発明によるＤＮＡザイム（配列番号２〜６２）の少なくとも１つが、ピコルナウイルス、特にライノウイルスによって引き起こされるウイルス感染症を予防および治療するための医療薬剤の成分である。
本発明による薬剤は、別法として、薬理学的に許容される担体、助剤、および／または溶媒を含む。
本発明による薬剤は、滴薬、口腔用スプレー、点鼻スプレー、丸薬、錠剤、フィルムコーティング錠、多層錠、座薬（Zaepfchen）、ジェル、軟膏、シロップ、吸入粉末剤、顆粒、座薬（Suppositorium）、乳剤、分散剤、マイクロカプセル、カプセル、粉末剤、または注射液の形態で製造および投与される。それは、放出制御型および／または持続放出型の多層錠のような剤形、ならびに特殊剤形としてのマイクロカプセル化も含む。
本発明による薬剤は、皮膚科学および薬学において皮膚へ輸送するために公知であるような小胞へのカプセル化、例えば、皮膚を介する、または皮膚の細胞もしくは毛髪の細胞への浸透用のアニオン性リポソーム若しくはカチオン性リポソーム、ニオソーム、ナノ粒子、または多層膜（ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒｅ）小胞を含む。
本発明による薬剤は、中でも、吸入、または静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、粘膜皮膚、経口、直腸、経皮（transdermale）、局部、口腔内、皮内（intradermale）、胃内、皮内（intrakutane）、鼻腔内、頬内、経皮（perkutane）、または舌下投与に適切である。
薬学的に許容される担体としては、例えば、ラクトース、デンプン、ソルビトール、スクロース、セルロース、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、タルク、マンニトール、エチルアルコール等を使用する。粉末剤同様に錠剤も、５から９５％まで、そのような担体からなり得る。
さらに、本発明による薬剤には、崩壊剤、色素、味覚物質、および／または結合剤を添加してもよい。
液体剤形は、溶液剤、懸濁液剤、スプレー、および乳剤、例えば、非経口注射用の水ベースまたは水・プロピレングリコールベースの注射液を含む。
カプセルは、例えば、メチルセルロース、ポリビニルアルコール、または変性させたゼラチンまたはデンプンから製造する。
崩壊剤としては、デンプン、カルボキシメチルデンプンナトリウム、天然ゴムおよび合成ゴム、例えば、ローカストビーンガム、カラヤ、グアル、トラガント、および寒天、ならびにセルロース誘導体、例えば、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、微結晶セルロース、ならびにアルギン酸塩、アルミナ、およびベントナイトを使用する。これらの成分は、２から３０重量％の量で使用する。
結合剤としては、糖、穀物、コメ、またはジャガイモに由来するデンプン、天然ゴム、例えば、アカシアゴム、ゼラチン、トラガント、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸アンモニウムカルシウム、メチルセルロース、ワックス、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、および無機化合物、例えば、ケイ酸マグネシウムアルミニウムが、当業者には公知であり、それらを本発明による薬剤に添加してもよい。結合剤は、通常、１から３０重量％の量で添加する。
滑剤としては、ホウ酸、およびステアリン酸塩、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸カリウム、ステアリン酸、高融点ワックス同様に、水溶性滑剤、例えば、塩化ナトリウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、オレイン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、およびアミノ酸、例えば、ロイシンが公知であり、使用する。そのような滑剤は、通常、０．０５から１５重量％の量で使用する。
本発明による薬剤の用量法は、治療医が、臨床学的要因に応じて決定する。用量法は、様々な要因、例えば、身長、体重、体表面積、年齢、性別、または患者の全身健康状態に依存するが、特別に投与すべき薬剤、投与期間および投与方法、ならびに場合によっては並行して投与される別の医薬品にも依存することが当業者には公知である。
この医療薬剤は、ピコルナウイルス、特にライノウイルスによって引き起こされるウイルス感染症を予防および治療するために、特に、鼻炎、風邪、喘息、ＣＯＰＤを予防および治療するため、ならびに上気道のウイルス感染症を予防および治療するためにも適切である。
驚くべきことに、ｄｐｐ−Ｘ１、ｄｐｐ−Ｘ２およびｄｐｐ−ｊ−９の群から選択される本発明によるＤＮＡザイム（配列番号２〜６２）の少なくとも１つにより、喘息およびＣＯＰＤの形成および発現に対する一般的な予防も達成されることが認められた。
ｄｐｐ−Ｘ１、ｄｐｐ−Ｘ２およびｄｐｐ−ｊ−９の群から選択される、少なくとも１つの本発明によるＤＮＡザイム（配列番号２〜６２）と、少なくとも１つの有効成分、例えば、鎮痛剤および解熱薬との併用が可能である。
さらに、少なくとも１つの抗炎症剤、免疫調節剤、抗喘息薬、および／または気管支拡張剤との併用が可能である。
同じく、少なくとも１つの抗寄生虫性、抗細菌性、抗真菌性、および／または抗ウイルス性の有効成分との併用も可能である。
別法として、少なくとも１つの皮膚科学上または美容上の有効成分との併用が可能である。
この薬剤は、好ましくは、溶液剤および／または乳剤の形態で、患者の鼻内に適用する。そのためには、薬剤が、点鼻薬または点鼻スプレーとして形成されていてもよい。これらの経鼻薬は、鼻自体の治療も若しくは予防のために作用するか、または薬剤を血液循環へ取り込んで体内の別の部位でその作用を発揮するかのいずれかである。
それらの薬剤は、別法として、有効成分を安定化するため、または鼻内における生理的に許容されるある特定のｐＨ値を維持するための助剤を含有する。この目的では、当業者には、リン酸塩緩衝液、リン酸塩／クエン酸塩緩衝液、またはクエン酸塩緩衝液、および酢酸塩緩衝液が公知である。さらなる助剤は、口腔・咽頭消毒剤または保存剤であるかもしれない。
図のキャプションおよび参照符号リスト
図１は、現在の分類に応じて、ヒトライノウイルスの群に分類される様々な血清型を示す。 ５’−ＵＴＲ領域内にある標的配列（配列番号１）ＣＴＡＧＴＴＴＧＧＧＴＧＴＣＣＧＴＧＴＴＴＣを示す。この領域は、使用可能なピコルナウイルスおよびライノウイルスの全ウイルスゲノム内において、非常に高い配列相同性およびわずかな突然変異率を示す。６個のステムループ構造（サブドメイン１〜６）、およびサブドメイン５とサブドメイン６との間にあるポリピリミジントラクト（Ｐ）を含むヒトライノウイルス２ウイルスを例にして二次構造を示す。小さなボックス内に記されているのは、本発明によるＤＮＡザイムｄｐｐ−Ｘ１、ｄｐｐ−Ｘ２、ｄｐｐ−ｊ−９の切断領域である。 ＤＮＡザイムｄｐｐ−Ｘ１（配列番号２〜２２）の長さ変種の、切断アッセイにおける切断活性を示し、Ａ）が基質結合ドメインＩの変種、Ｂ）が基質結合ドメインＩＩの変種である。 ＤＮＡザイムｄｐｐ−Ｘ２（配列番号２３〜４３）の長さ変種の、切断アッセイにおける結果を示し、Ａ）が基質結合ドメインＩの変種であり、Ｂ）が基質結合ドメインＩＩの変種である。 ＤＮＡザイムｄｐｐ−ｊ−９（配列番号４４〜５９）の長さ変種の、切断アッセイにおける結果を示し、Ａ）が基質結合ドメインＩの変種であり、Ｂ）が基質結合ドメインＩＩの変種である。 Ａ）は本発明によるＤＮＡザイムの、ＨＲＶ血清型１ｂでの切断実験の結果を示し、Ｂ）は本発明によるＤＮＡザイムの、ＨＲＶ血清型１６での切断実験の結果を示す。 Ｃ）は本発明によるＤＮＡザイムの、ＨＲＶ血清型２９での切断実験の結果を示す。
例示的実施形態
１．ピコルナウイルスのウイルスゲノムの５’−ＵＴＲ領域において、できる限り最適な標的配列を同定するためのアライメント
バイオインフォマティクスを用いて評価した、ピコルナウイルスの使用可能な全ゲノム配列のアライメントは、ウイルスゲノムの５’−ＵＴＲ領域の非常に高い相同性または配列同一性を示す。
配列は、当業者には公知である出典、例えば、
エンテロウイルスＡ：http://www.picornaviridae.com/enterovirus/ev-a/ev-a.htmおよびhttp://www.picornaviridae.com/enterovirus/ev-a/ev-a_seqs.htm
エンテロウイルスＢ：http://www.picornaviridae.com/enterovirus/ev-b/ev-b.htm
エンテロウイルスＣ：http://www.picornaviridae.com/enterovirus/ev-c/ev-c.htm
エンテロウイルスＤ：http://www.picornaviridae.com/enterovirus/ev-d/ev-d.htm
エンテロウイルスＥ：http://www.picornaviridae.com/enterovirus/ev-e/ev-e.htm
エンテロウイルスＦ：http://www.picornaviridae.com/enterovirus/ev-f/ev-f.htm
エンテロウイルスＧ：http://www.picornaviridae.com/enterovirus/ev-g/ev-g.htm
エンテロウイルスＨ：http://www.picornaviridae.com/enterovirus/ev-h/ev-h.htm
エンテロウイルスＪ：http://www.picornaviridae.com/enterovirus/ev-j/ev-j.htm
に由来する。
この領域は、ピコルナウイルス内で非常に保存されており、わずかな突然変異率を示す。Mclntyreら、J Gen Virol、2012年に基づいて使用可能な、ライノウイルスの全ゲノム配列の詳細な評価も同じく、その５’−ＵＴＲ領域において非常に高い相同性または配列同一性を示す。
それゆえ、この相同性５’−ＵＴＲ領域は、できる限り多数のピコルナウイルス、およびライノウイルスのできる限り多数の血清型のその標的配列に結合し、その標的配列を特異的に切断するＤＮＡザイムを提供するために、良好な起点となる。
本発明によるＤＮＡザイムが結合するための標的配列として、相同性が最も高い５’−ＵＴＲ領域が決定される。
ＧＴ（Ｕ）切断ヌクレオチドは、太字で示し、下線が引いてある：

ｄｐｐ−Ｘ１、ｄｐｐ−Ｘ２およびｄｐｐ−ｊ−９の群から選択される本発明によるＤＮＡザイム（配列番号２〜６２）が、ヒトエンテロウイルス（Ａ〜Ｄ）の標的配列に、しかしさらにはブタエンテロウイルス（Ｇ）およびサルエンテロウイルス（Ｊ）にも特異的に結合し、その標的配列を切断することが見出された。
２．プラスミド構築
使用可能なすべてのピコルナウイルスのゲノムＲＮＡを、当業者に公知の方法によるか、または市販されているキット、例えば、ＱＩＡａｍｐ ＵｌｔｒａＳｅｎｓ Ｖｉｒｕｓ Ｋｉｔを用いてメーカの指示に基づいて単離し、ｃＤＮＡ合成用に使用する。ｃＤＮＡの合成は、当業者に公知の方法によるか、または市販されているキット、例えば、Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ＲＮａｓｅＯＵＴ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、ＣＡ、米国）を添加してメーカの指示に基づいて行う。模範的に、ここでは、ライノウイルス血清型ＨＲＶ−１ｂ、ＨＲＶ−１６およびＨＲＶ−２９のゲノムＲＮＡを用いて示す。
各ウイルスのｃＤＮＡを、特異的相同性５’−ＵＴＲ領域を増幅するために使用する。そのためには、当業者に公知の方法によるか、または市販されているキット、例えば、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）および配列特異的プライマーを用いて、ＰＣＲ反応を行う。得られたＰＣＲ生成物は、ゲル電気泳動（２％アガロースおよび１ｘＴＢＥ ＴＲＩＳ−ホウ酸−ＥＤＴＡ緩衝液）により分離し、公知の方法を用いるか、または市販されているキット、例えば、Ｑｉａｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ゲルから抽出して、−２０℃において保存する。精製したＰＣＲ生成物を、一般的な方法により、ＲＮＡ発現ベクター、例えば、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ ＩＩにサブクローニングする。ライゲーション生成物を、コンピテントセル、例えば、ＪＭ１０９ Ｈｉｇｈ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌに形質転換する。次いで、適切な培地、例えば、ＳＯＣ培地中で培養してから、形質転換させた細菌を寒天培地、例えば、アンピシリンを含む標準ＬＢ寒天培地にまき、適切な密度まで培養する。
陽性培養物を、プレートから、ミニプレップの、アンピシリンを含む標準ＬＢ培地に移して培養する。プラスミドＤＮＡを公知の方法を用いるか、または市販されているキット、例えば、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離する。クローニング効率の第１の検証は、ＥｃｏＲＩ（ＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ ＥｃｏＲＩ、Ｔｈｅｒｍａ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ゲル電気泳動（１．５％アガロースおよび１ｘＴＢＥ ＴＲＩＳ−ホウ酸−ＥＤＴＡ緩衝液）、標準プライマーＳＰ６を用いたシークエンシングにより行う。望みの配列を含有する細菌をマキシプレップ（標準ＬＢ培地、アンピシリン）中で培養する。プラスミドＤＮＡの単離は、公知の方法を用いるか、または市販されているキット、例えば、ＨｉＳｐｅｅｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて行う。精製したプラスミドを−２０℃において保存する。別法として、標準のＳＰ６プライマーを用いてコントロールシークエンシングを行う。
３．ＲＮＡ発現（合成）
プラスミドを、公知の方法を用いるか、または市販されているキットを用いて、制限酵素、例えば、ＳｐｅＩまたはＮｃｏＩを使用しながら直鎖化する。エタノール、ＥＤＴＡ、および酢酸アンモニウムを用いてサンプルを沈殿させ、ゲル電気泳動（０．８％アガロースおよび１ｘＴＢＥ ＴＲＩＳ−ホウ酸−ＥＤＴＡ緩衝液）でその直鎖化効率を検査する。
公知の方法を用いるか、または市販されているキット、例えば、Ａｍｂｉｏｎ ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ Ｔ７転写キット若しくはＡｍｂｉｏｎ ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ ＳＰ６転写キットを用いメーカの指示に基づいてＩｎ ｖｉｔｒｏ転写を行う。公知の方法を用いるか、または市販されているキット、例えば、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ＲＮＡを精製する。公知の方法を用いるか、または市販されているキット、例えば、ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００ｃ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＲＮＡサンプルの濃度を点検し、ゲル電気泳動（２．５％アガロース、１ｘＴＡＥ ＴＲＩＳ−酢酸−ＥＤＴＡ緩衝液）を用いて分析する。そのように得られたＲＮＡ分子は、その配列の点で、Ｔ７ポリメラーゼまたはＳＰ６ポリメラーゼの転写開始位置とインサートの５’（ゲノム）末端との間のベクター断片およびインサートの３’（ゲノム）末端とＳｐｅＩまたはＮｃｏＩ切断部位との間のベクター断片に囲まれるインサートに対応する。
すべての実験において、ピコルナウイルスの以下の型の５’−ＵＴＲ領域での、本発明によるＤＮＡザイム（配列番号２〜６２）の結合を確かめる：
Ａ１、Ａ２、Ａ７、Ａ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１１、Ａ１２、Ａ１３、Ａ１５、Ａ１６、Ａ１８、Ａ１９、Ａ２０、Ａ２１、Ａ２２、Ａ２３、Ａ２４、Ａ２５、Ａ２８、Ａ２９、Ａ３０、Ａ３１、Ａ３２、Ａ３３、Ａ３４、Ａ３６、Ａ３８、Ａ３９、Ａ４０、Ａ４１、Ａ４３、Ａ４５、Ａ４６、Ａ４７、Ａ４９、Ａ５０、Ａ５１、Ａ５３、Ａ５４、Ａ５５、Ａ５６、Ａ５７、Ａ５８、Ａ５９、Ａ６０、Ａ６１、Ａ６２、Ａ６３、Ａ６４、Ａ６５、Ａ６６、Ａ６７、Ａ６８、Ａ７１、Ａ７３、Ａ７４、Ａ７５、Ａ７６、Ａ７７、Ａ７８、Ａ８０、Ａ８１、Ａ８２、Ａ８８、Ａ８９、Ａ９０、Ａ９４、Ａ９６、Ａ１００、Ａ１０１、Ａ１０２、Ａ１０３、Ａ１０４、Ａ１０５、Ａ１０６、
Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ１４、Ｂ１７、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ３５、Ｂ３７、Ｂ４２、Ｂ４８、Ｂ５２、Ｂ６９、Ｂ７０、Ｂ７２、Ｂ７９、Ｂ８３、Ｂ８４、Ｂ８６、Ｂ９１、Ｂ９２、Ｂ９３、Ｂ９７、Ｂ９９、Ｂ１００、Ｂ１０１、Ｂ１０２、Ｂ１０３、Ｂ１０４、
Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１５、Ｃ１７、Ｃ２２、Ｃ２５、Ｃ２６、Ｃ２８、Ｃ３２、Ｃ３４、Ｃ３５、Ｃ３６、Ｃ３８、Ｃ３９、Ｃ４０、Ｃ４１、Ｃ４２、Ｃ４３、Ｃ４５、Ｃ４９、Ｃ５１。
４．本発明によるＤＮＡザイムの準備
本発明によるＤＮＡザイム（配列番号２〜６２）の製造は、当業者に公知の合成方法により行う。
５．本発明によるＤＮＡザイムを特徴づけるための、標的配列での切断アッセイ
切断アッセイは、配列番号２〜６２の本発明によるＤＮＡザイムが、ピコルナウイルス、特にライノウイルスのウイルスゲノムの５’−ＵＴＲ領域にある標的配列にどの程度結合および切断するかの定性・定量分析を内包する。
切断反応を、１μｌ反応バッファ、例えば５００ｍＭ ＴＲＩＳ、１μｌ １Ｍ ＮａＣｌ、１μｌ １０ｍＭ ＭｇＣｌ２）、および様々な量のＲＮＡとＤＮＡザイム（５０から２５０ｎｇの間または１０から３０ｐｍｏｌの間）、および二回蒸留水（総体積１０μｌまで）を用いて行う。定量実験では、コントロールとして、参照ＲＮＡ（例えば：ＧＡＴＡ３ ｍＲＮＡ）を反応混合液に添加する。反応混合液を３７℃において６０分間インキュベートしてから、氷上に置き、Ａｍｂｉｏｎ Ｇｅｌ ＬｏａｄｉｎｇバッファＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加して変性させることで、反応を停止する。
６５℃において１０分間インキュベーションした後、ゲル電気泳動（２．５％アガロース、１ｘＴＡＥ緩衝液）により反応混合液を分離し、例えば、Ｆｕｓｉｏｎ Ｆｘ７ Ｓｙｓｔｅｍ（ＰｅｑＬａｂ）によりグラフィック表示する。定量的に把握するために、続いて、ゲル画像をさらにバンド密度測定により、例えば、ＬａｂＩｍａｇｅ １Ｄ Ｌ３４０ Ｂｉｏ−Ｉｍａｇｉｎｇを用いて評価する。バックグラウンドを下げるために、「ｒｏｌｌｉｎｇ ｂａｌｌ ｍｏｄｅ」を使用する。
６．基質結合ドメインＩおよびＩＩの延長および短縮
発明者らは、自身の研究作業において、特異的基質結合ドメインＩおよびＩＩを含む特定ＤＮＡザイムのシリーズを製造し、ライノウイルスの様々な血清型およびその他のピコルナウイルスにおいて、ウイルスゲノムの５’−ＵＴＲ領域にある特定標的配列でのその有効性を分析した。有効性は、結合・切断アッセイにおいて示す。
特に、ｄｐｐ−Ｘ１、ｄｐｐ−Ｘ２およびｄｐｐ−ｊ−９の群から選択されるＤＮＡザイム（配列番号２〜６２）は、
− ウイルスゲノムの５’−ＵＴＲ領域にある標的配列への結合
− ５’−ＵＴＲ領域にある標的配列に対する高い酵素的切断活性
− ライノウイルスの様々な血清型およびその他のピコルナウイルスにおける、ウイルスＲＮＡの著しい不活性化
に関して、予想外に好都合の特性を有する。
ウイルスゲノムの５’−ＵＴＲ領域にある標的配列での本発明によるＤＮＡザイムの切断効率を、使用可能なピコルナウイルス、例えば、ライノウイルス型ＨＲＶ−１ｂ、ＨＲＶ−１６、ＨＲＶ−２９のＲＮＡを用いた切断アッセイにおいて示す。
触媒ドメインは、ＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡという配列を有する。同じく、本発明によるＤＮＡザイムの配列順序ＧＴが非常に重要であることも見出されたが、その理由は、ＧＣへの一置換による修飾が、ウイルスゲノムの５’−ＵＴＲ領域にある標的配列への結合をもはや示さなかったからである。ｄｐｐ−Ｘ１、ｄｐｐ−Ｘ２およびｄｐｐ−ｊ−９の群から選択される本発明によるＤＮＡザイム（配列番号２〜６２）に関して、触媒ドメインは不変のまま、基質結合ドメインＩまたはＩＩの長さを変化させてみた。
ａ）ＤＮＡザイムｄｐｐ−Ｘ１は、使用可能なピコルナウイルス、例えば、ライノウイルス型ＨＲＶ−１ｂ、ＨＲＶ−１６、およびＨＲＶ−２９に関して、９７．７６％という優れたＲＮＡ切断活性を示す。
基質結合ドメインＩＩの１０ヌクレオチドおよび触媒ドメインは不変のまま、基質結合ドメインＩの以下の長さ変種を扱った。切断特性は、切断アッセイにおいて試験する、図３Ａ：

基質結合ドメインＩの１２ヌクレオチドは不変のまま、基質結合ドメインＩＩの以下の長さ変種を扱い、その切断特性を、切断アッセイにおいて試験した、図３Ｂ：

ｄｐｐ−Ｘ１の最小配列は、基質結合ドメインＩに関しては最低限８ヌクレオチドおよび基質結合ドメインＩＩに関しては最低限８ヌクレオチドである。特に、基質結合ドメインＩではＣＡＣＧＧＡＣＡであり、基質結合ドメインＩＩではＣＣＡＡＡＧＴＡである。
基質結合ドメインＩまたはＩＩの長さが、提示するヌクレオチドより長いことも可能である。一実施形態では、基質結合ドメインＩおよびＩＩの長さが同じである。さらなる一実施形態では、基質結合ドメインＩおよびＩＩの長さが異なる。
ｂ）ＤＮＡザイムｄｐｐ−Ｘ２は、使用可能なピコルナウイルス、例えば、ライノウイルス型ＨＲＶ−１ｂ、ＨＲＶ−１６、およびＨＲＶ−２９に関して、９７．７６％という優れたＲＮＡ切断活性を示す。
基質結合ドメインＩＩの１１ヌクレオチドは不変のまま、基質結合ドメインＩの以下の長さ変種を扱い、その切断特性を、切断アッセイにおいて試験した、図４Ａ：

基質結合ドメインＩの１０ヌクレオチドは不変のまま、基質結合ドメインＩＩの以下の長さ変種を扱い、その切断特性を、切断アッセイにおいて試験した、図４Ｂ：

ｄｐｐ−Ｘ２の最小配列は、基質結合ドメインＩに関しては最低限６ヌクレオチドおよび基質結合ドメインＩＩに関しては最低限７ヌクレオチドである。特に、基質結合ドメインＩではＣＡＣＧＧＡであり、基質結合ドメインＩＩではＡＣＣＣＡＡＡである。基質結合ドメインＩまたはＩＩの長さが、提示するヌクレオチドより長いことも可能である。一実施形態では、基質結合ドメインＩおよびＩＩの長さが同じある。さらなる一実施形態では、基質結合ドメインＩおよびＩＩの長さが異なる。
ｃ）ＤＮＡザイムｄｐｐ−ｊ−９は、使用可能なピコルナウイルス、例えば、ライノウイルス型ＨＲＶ−１ｂ、ＨＲＶ−１６、およびＨＲＶ−２９に関して、９７．７６％のＲＮＡ切断活性を示す。
基質結合ドメインＩＩの１２ヌクレオチドは不変のまま、基質結合ドメインＩの以下の長さ変種を扱い、その切断特性を、切断アッセイにおいて試験した、図５Ａ：

基質結合ドメインＩの６ヌクレオチドは不変のまま、基質結合ドメインＩＩの以下の長さ変種を扱い、その切断特性を、切断アッセイにおいて試験した、図５Ｂ：

ｄｐｐ−ｊ−９の最小配列は、基質結合ドメインＩに関しては最低限６ヌクレオチドおよび基質結合ドメインＩＩに関しては最低限１０ヌクレオチドである。
特に、基質結合ドメインＩではＧＡＡＡＣＡであり、基質結合ドメインＩＩではＧＧＡＣＡＣＣＣＡＡである。基質結合ドメインＩまたはＩＩの長さが、提示するヌクレオチドより長いことも可能である。一実施形態では、基質結合ドメインＩおよびＩＩの長さが同じである。さらなる一実施形態では、基質結合ドメインＩおよびＩＩの長さが異なる。

Claims (10)

  1. ピコルナウイルスが引き起こすウイルス感染症の予防および治療用の薬剤であって、
    配列番号２〜７、１５、１６、２３〜２９、３４〜３８、４４、および４９〜５１からなる群から選択される１０−２３型の少なくとも１つのＤＮＡザイムを有し、
    配列番号２〜７、１５、１６（ＤＰＰ−Ｘ１）の前記ＤＮＡザイムが、基質結合ドメインＩについて少なくとも８ヌクレオチド含みおよび基質結合ドメインＩＩについて少なくとも８ヌクレオチド含み、配列番号２３〜２９、３４〜３８（ｄｐｐ−Ｘ２）の前記ＤＮＡザイムが、基質結合ドメインＩについて少なくとも６ヌクレオチドおよび基質結合ドメインＩＩについて少なくとも７ヌクレオチド含み、ならびに／または、配列番号４４、４９〜５１（ｄｐｐ−ｊ−９）の前記ＤＮＡザイムは、基質結合ドメインＩについて少なくとも６ヌクレオチドおよび基質結合ドメインＩＩについて少なくとも１０ヌクレオチド含むことを特徴とする、予防および治療用の薬剤。
  2. 請求項１に記載の予防および治療用の薬剤において、
    標的配列が、ピコルナウイルスの５’−ＵＴＲ領域に位置することを特徴とする、予防および治療用の薬剤。
  3. 請求項１または２に記載の予防および治療用の薬剤において、
    標的配列が、配列番号１に基づく、ピコルナウイルスの５’−ＵＴＲ領域であることを特徴とする、予防および治療用の薬剤。
  4. 請求項１から３までのいずれか一項に記載の予防および治療用の薬剤において、
    前記基質結合ドメインＩおよびＩＩの長さが異なることを特徴とする、予防および治療用の薬剤。
  5. 請求項１から３までのいずれか一項に記載の予防および治療用の薬剤において、
    前記基質結合ドメインＩおよびＩＩの長さが同じであることを特徴とする、予防および治療用の薬剤。
  6. 請求項１から５までのいずれか一項に記載の予防および治療用の薬剤において、
    前記少なくとも１つのＤＮＡザイムが、少なくとも１つの抗炎症剤、免疫調節剤、抗喘息薬、鎮痛剤、解熱薬および／または気管支拡張剤と併用可能であることを特徴とする、予防および治療用の薬剤。
  7. 請求項１から６までのいずれか一項に記載の予防および治療用の薬剤において、
    前記少なくとも１つのＤＮＡザイムが、少なくとも１つの抗寄生虫性、抗細菌性、抗真菌性、および／または抗ウイルス性の有効成分と併用可能であることを特徴とする、予防および治療用の薬剤。
  8. 請求項１から７までのいずれか一項に記載の予防および治療用の薬剤において、
    鼻炎、風邪、喘息、ＣＯＰＤ、および上気道のウイルス感染症を予防するために適切であることを特徴とする、予防および治療用の薬剤。
  9. 請求項１から８までのいずれか一項に記載の予防および治療用の薬剤において、
    鼻炎、風邪、喘息、ＣＯＰＤ、および上気道のウイルス感染症を治療するために適切であることを特徴とする、予防および治療用の薬剤。
  10. 請求項１から９までのいずれか一項に記載の予防および治療用の薬剤において、
    薬学的に許容される組成物の一部として、吸入により、スプレーとして、滴薬として、経口で、または錠剤形態で投与されることを特徴とする、予防および治療用の薬剤。

JP2018512484A 2015-05-20 2016-05-13 予防および治療用の薬剤 Active JP6709279B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP15168512.0A EP3095866B1 (de) 2015-05-20 2015-05-20 Mittel zur prophylaxe und therapie von virusinfektionen
EP15168512.0 2015-05-20
PCT/EP2016/060872 WO2016184810A1 (de) 2015-05-20 2016-05-13 Mittel zur prophylaxe und therapie von virusinfektionen

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2018521114A JP2018521114A (ja) 2018-08-02
JP2018521114A5 JP2018521114A5 (ja) 2019-06-13
JP6709279B2 true JP6709279B2 (ja) 2020-06-10

Family

ID=53199819

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2018512484A Active JP6709279B2 (ja) 2015-05-20 2016-05-13 予防および治療用の薬剤

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20180171339A1 (ja)
EP (1) EP3095866B1 (ja)
JP (1) JP6709279B2 (ja)
DK (1) DK3095866T3 (ja)
ES (1) ES2729676T3 (ja)
HU (1) HUE045242T2 (ja)
PL (1) PL3095866T3 (ja)
PT (1) PT3095866T (ja)
WO (1) WO2016184810A1 (ja)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110607404B (zh) * 2019-10-30 2023-02-03 广西大学 猪肠病毒g型的实时荧光定量pcr检测引物及其试剂盒
US20240344064A1 (en) * 2021-08-04 2024-10-17 1E Therapeutics, Ltd. Guanine-rich deoxyribozymes, compositions and uses thereof

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10322662A1 (de) * 2002-11-06 2004-10-07 Grünenthal GmbH Wirksame und stabile DNA-Enzyme
CA2621964A1 (en) * 2005-09-08 2007-03-15 Avi Biopharma, Inc. Antisense antiviral compound and method for treating picornavirus infection
EP2257308A4 (en) 2008-03-27 2012-06-27 Sanofi Pasteur Biologics Co RECOMBINANT RHINOVIRUS VECTORS
EP2640469A4 (en) 2010-11-15 2015-01-14 Newcastle Innovation Ltd MODULATION OF THE SIGNAL TRANSDUCTION PATH

Also Published As

Publication number Publication date
EP3095866A1 (de) 2016-11-23
EP3095866B1 (de) 2019-05-08
DK3095866T3 (da) 2019-06-24
ES2729676T3 (es) 2019-11-05
PL3095866T3 (pl) 2019-09-30
WO2016184810A1 (de) 2016-11-24
HUE045242T2 (hu) 2019-12-30
US20180171339A1 (en) 2018-06-21
JP2018521114A (ja) 2018-08-02
PT3095866T (pt) 2019-06-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111557939B (zh) 法匹拉韦在制备用于治疗冠状病毒感染的药物中的应用
Wu et al. Developments towards antiviral therapies against enterovirus 71
Noton et al. Respiratory syncytial virus inhibitor AZ-27 differentially inhibits different polymerase activities at the promoter
Baldassarre et al. Potential use of noncoding RNAs and innovative therapeutic strategies to target the 5’UTR of SARS-CoV-2
Li et al. Honeysuckle-encoded microRNA2911 inhibits Enterovirus 71 replication via targeting VP1 gene
Kuo et al. Strategies to develop antivirals against enterovirus 71
Hsu et al. Identification of BPR3P0128 as an inhibitor of cap-snatching activities of influenza virus
US20240102015A1 (en) Antisense Oligonucleotides Targeting SARS-CoV-2
EP4015634A1 (en) Sirna and compositions for prophylactic and therapeutic treatment of virus diseases
US20210230591A1 (en) Methods of reducing virus molecule levels
JP6709279B2 (ja) 予防および治療用の薬剤
Lai et al. Inhibition of respiratory syncytial virus infections with morpholino oligomers in cell cultures and in mice
US20150152420A1 (en) Compounds and methods for altering rsv replication rate
Mohamud et al. Activation of cGAS-STING suppresses coxsackievirus replication via interferon-dependent signaling
TWI414301B (zh) 以微核醣核酸miＲ－１４１為標的治療小核醣核酸病毒感染
JP2021522178A (ja) 病態治療のためのＲＮＡエディターのｍＲＮＡ駆動型発現
TWI701030B (zh) Ev71感染的組合治療
JP2008541754A (ja) Ｈｃｖ特異的な低分子干渉ｒｎａおよびそれを含むｃ型肝炎の治療剤
Chang et al. Therapeutic and prophylactic potential of small interfering RNAs against severe acute respiratory syndrome: progress to date
US20160289678A1 (en) Use of microrna 146-a in the diagnosis, treatment and prevention of picornavirus infection and microrna 146-a antagonists
Liu et al. In vitro and in vivo protection against enterovirus 71 by an antisense phosphorothioate oligonucleotide
EP2683369B1 (en) Multiantivirus compound, composition and method for treatment of virus diseases
Yang et al. A novel minicircle vector based system for inhibting the replication and gene expression of Enterovirus 71 and Coxsackievirus A16
Baldassarre et al. Non-Coding RNAs and Innovative Therapeutic Strategies to Target the 5’UTR of SARS-CoV-2
Klaiber et al. Susceptibility of Enterovirus-D68 to RNAi-mediated antiviral knockdown

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20181116

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20190509

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20190509

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20200428

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20200522

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6709279

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250