JP6706417B2 - Method for producing aptamer - Google Patents
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Description
本発明は、アプタマーの製造方法及びそれにより製造されたアプタマーに関する。 The present invention relates to a method for producing an aptamer and an aptamer produced thereby.
任意の分子と特異的に結合する核酸分子であるアプタマーが知られている。アプタマーは、所望の標的分子と特異的に結合するので、アプタマーを利用して該標的分子の検出や定量を行うことが提案されている。これまでに、インスリン、ルシフェラーゼ、チログロブリン、Ｃ反応性タンパク質、血管内皮細胞増殖因子（特許文献１）等に特異的に結合するアプタマーが報告されている。 Aptamers, which are nucleic acid molecules that specifically bind to any molecule, are known. Since an aptamer specifically binds to a desired target molecule, it has been proposed to utilize the aptamer to detect or quantify the target molecule. So far, aptamers that specifically bind to insulin, luciferase, thyroglobulin, C-reactive protein, vascular endothelial cell growth factor (Patent Document 1), etc. have been reported.
所望の標的分子と特異的に結合するこれらのアプタマーは、基本的にSELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment)と呼ばれる方法により作出されている (非特許文献１)。この方法では、標的分子を担体に固定化し、これに膨大な種類のランダムな塩基配列を有する核酸から成る核酸ライブラリを添加し、標的分子に結合する核酸を回収し、これをPCRにより増幅して再び標的分子を固定化した担体に添加する。この工程を１０回程度繰り返すことにより、標的分子に対して結合力の高いアプタマーを濃縮し、その塩基配列を決定して、標的分子を認識するアプタマーを取得する。なお、上記核酸ライブラリーは、核酸の自動化学合成装置により、ランダムにヌクレオチドを結合していくことにより容易に調製可能である。このように、ランダムな塩基配列を有する核酸ライブラリーを用いた、偶然を積極的に利用する方法により、任意の標的物質と特異的に結合するアプタマーを作出できる。 These aptamers that specifically bind to a desired target molecule are basically produced by a method called SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment) (Non-Patent Document 1). In this method, a target molecule is immobilized on a carrier, a nucleic acid library consisting of nucleic acids having an enormous variety of random base sequences is added to it, nucleic acids that bind to the target molecule are recovered, and this is amplified by PCR. The target molecule is again added to the immobilized carrier. By repeating this step about 10 times, the aptamer having a high binding force with respect to the target molecule is concentrated, its base sequence is determined, and the aptamer recognizing the target molecule is obtained. The nucleic acid library can be easily prepared by randomly binding nucleotides with an automatic chemical synthesizer for nucleic acids. As described above, an aptamer that specifically binds to an arbitrary target substance can be produced by a method that positively utilizes a chance by using a nucleic acid library having a random base sequence.
SELEXは、任意の標的物質と特異的に結合するアプタマーを作出できる優れた方法ではあるが、アプタマーを作出するためにかなり手間のかかる作業を必要とする。また、偶然を利用する方法であるので、かなりの時間に亘りSELEXを適用しても、満足できる親和性で標的物質と特異的に結合するアプタマーが得られない場合もある。 SELEX is an excellent method for producing an aptamer that specifically binds to any target substance, but it requires a considerable amount of work to produce an aptamer. Further, since it is a method that uses chance, even if SELEX is applied for a considerable time, an aptamer that specifically binds to a target substance with a satisfactory affinity may not be obtained in some cases.
本発明の目的は、SELEXを用いることなく、標的物質と特異的に結合するアプタマーを製造する方法を提供することである。 An object of the present invention is to provide a method for producing an aptamer that specifically binds to a target substance without using SELEX.
G-quadruplex構造がゲノミックＤＮＡ中に存在して四重らせん構造をとることが知られており、G-quadruplex構造を含むプロモーターも知られている。本願発明者らは、プロモーター中にG-quadruplex構造が含まれる場合、該プロモーターが制御する構造遺伝子の遺伝子産物又は該遺伝子産物が包含されるカスケードの下流の遺伝子産物が、該G-quadruplex構造に結合してフィードバック阻害がかかるのではないか考えた。そして、プロモーター中に含まれるG-quadruplex構造含有領域と同じ塩基配列を有する一本鎖核酸は、そのままで、該プロモーターが結合する物質と特異的に結合するアプタマーとして利用可能であるという新知見を得て本発明を完成した。 It is known that a G-quadruplex structure exists in genomic DNA to form a quadruplex structure, and a promoter containing the G-quadruplex structure is also known. The present inventors have found that when a G-quadruplex structure is contained in the promoter, the gene product of the structural gene controlled by the promoter or the gene product downstream of the cascade in which the gene product is included has the G-quadruplex structure. I thought that they might be combined to cause feedback inhibition. Then, a single-stranded nucleic acid having the same nucleotide sequence as the G-quadruplex structure-containing region contained in the promoter, as it is, is a new finding that it can be used as an aptamer that specifically binds to a substance to which the promoter binds. obtained and completed the present onset Akira is.
すなわち、本発明は、塩基配列が、標的タンパク質（インシュリンを除く）をコードする遺伝子配列若しくはその制御配列中に存在するG-quadruplex構造を含む領域と同一の塩基配列から成り、前記標的タンパク質若しくは前記遺伝子配列の関連遺伝子産物と結合するアプタマー（ただし、塩基配列が配列番号４、６、１５又は１８で表されるものを除く）又は該アプタマーの塩基配列と９５％以上の配列同一性を有し、かつ、G-quadruplex構造を含み、前記アプタマーが結合する前記標的タンパク質又は前記関連遺伝子産物に結合するアプタマーを化学合成することを含む、アプタマーの製造方法を提供する。ここで、「制御配列」は、プロモーターやエンハンサー、サイレンサー、インスレーター等、標的タンパク質をコードする遺伝子の発現を制御する遺伝子配列を意味する。また、「標的タンパク質をコードする遺伝子配列」は、cDNA配列のみならず、ゲノミックDNAの場合にはイントロンをも包含する遺伝子配列を意味する。また、「転写産物」には、mRNAのみならず、スプライシング前のmRNA前駆体も包含される。また、周知の通り、ＤＮＡ中のチミンとＲＮＡ中のウラシルは、共にアデニンと特異的に対合するものであるから、本発明において、ＤＮＡ中のチミンとＲＮＡ中のウラシルは「同一の塩基」と解する。従って、本発明において、あるＤＮＡ配列と、このＤＮＡ配列中のチミンがウラシルに置き換わったＲＮＡ配列は、「同一の塩基配列を有する」と解する。
That is, the present invention, the base sequence consists of the same base sequence as the region containing the G-quadruplex structure present in the gene sequence encoding the target protein (excluding insulin) or its control sequence, wherein the target protein or An aptamer that binds to a related gene product of a gene sequence (provided that the base sequence is not represented by SEQ ID NO: 4, 6, 15 or 18) or has 95% or more sequence identity with the base sequence of the aptamer And a method for producing an aptamer, which comprises chemically synthesizing an aptamer that includes a G-quadruplex structure and that binds to the target protein or the related gene product to which the aptamer binds. Here, the “regulatory sequence” means a gene sequence that controls the expression of a gene encoding a target protein such as a promoter, an enhancer, a silencer, and an insulator. Further, the “gene sequence encoding the target protein” means not only the cDNA sequence but also the intron in the case of genomic DNA. The “transcript” includes not only mRNA but also mRNA precursor before splicing. Further, as is well known, both thymine in DNA and uracil in RNA specifically pair with adenine, so in the present invention, thymine in DNA and uracil in RNA are “same base”. I understand. Therefore, in the present invention, a certain DNA sequence and an RNA sequence in which thymine in this DNA sequence is replaced with uracil are understood to have "the same base sequence".
本発明によれば、プロモーター中に存在するG-quadruplex構造を含む領域と同一の塩基配列を有し、該プロモーターが制御する構造遺伝子の遺伝子産物若しくは該遺伝子産物の関連遺伝子産物と結合するアプタマー又は該アプタマーの塩基配列と９５％以上の配列同一性を有し、かつ、G-quadruplex構造を含み、前記アプタマーが結合する遺伝子産物に結合するアプタマーを化学合成することを含む、アプタマーの製造方法が提供される。 According to the present invention, an aptamer that has the same nucleotide sequence as a region containing a G-quadruplex structure present in a promoter and that binds to a gene product of a structural gene controlled by the promoter or a related gene product of the gene product, or have nucleotide sequence and 95% or more sequence identity of the aptamer, and, G-quadruplex comprises structure involves chemically synthesized aptamers that bind to the gene product the aptamer binds, the method of manufacturing the aptamer Will be provided.
本発明により、手間のかかる操作が必要なSELEXを用いることなく所望の標的物質と結合するアプタマーを製造する方法が初めて提供された。本発明の方法によれば、SELEXを用いることなく、所望の標的タンパク質をコードする遺伝子のプロモーター中のG-quadruplex構造含有領域の塩基配列と同じ塩基配列を持つ核酸を市販の核酸合成機により化学合成することで標的物質と結合するアプタマーを製造することができるので、所望の標的タンパク質と結合するアプタマーを、従来法に比べて遙かに容易に製造することができる。 The present invention provides for the first time a method for producing an aptamer that binds to a desired target substance without using SELEX, which requires a troublesome operation. According to the method of the present invention, a nucleic acid having the same base sequence as the base sequence of the G-quadruplex structure-containing region in the promoter of a gene encoding a desired target protein is chemically synthesized by a commercially available nucleic acid synthesizer without using SELEX. Since it is possible to produce an aptamer that binds to a target substance by synthesizing, an aptamer that binds to a desired target protein can be produced much more easily than conventional methods.
G-quadruplex（Gカルテット、G4、グアニン四重鎖等とも呼ばれる）構造は、核酸中のグアニン塩基が４つ接近して水素結合により四量体を形成している面が２〜３面重なった構造であり、四重らせん構造をとることで知られている。G-quadruplex構造は、ヒトテロメアやプロモーター中に存在することが知られている。 In the G-quadruplex (also called G quartet, G4, guanine quadruplex) structure, four guanine bases in the nucleic acid come close to each other to form a tetramer by hydrogen bonding. It is a structure and is known to have a quadruple helix structure. The G-quadruplex structure is known to exist in human telomeres and promoters.
本願発明者らは、プロモーター中に含まれるG-quadruplex構造を含む領域（「G-quadruplex構造含有領域」と呼ぶ）と同一の塩基配列を有する一本鎖ポリヌクレオチドが、そのままでアプタマーとして機能し、該アプタマーは、そのプロモーターが制御する構造遺伝子の遺伝子産物又は該遺伝子産物の関連遺伝子産物と結合することを見出した。本発明は、この新知見を基礎とする。ここで、ある「遺伝子産物の関連遺伝子産物」は、例えば、その遺伝子産物が包含されるカスケードの上流又は下流の遺伝子産物や、その遺伝子産物と協働して機能するタンパク質等である。ある遺伝子産物の関連遺伝子産物は、例えば、文献における共起性解析により調べることができる。この共起性解析は、例えば、国立情報学研究所、国立遺伝学研究所等が公開しているJabionのウェブサイトで行うことができる。このウェブサイトで提供されている方法によれば、共起性スコアもわかるので、ある遺伝子産物と共起性の強い遺伝子産物が、関連性の高い遺伝子産物であると考えることができる。例えば、下記実施例において具体的に試験した血管内皮増殖因子(VEGF)と共起性の高いタンパク質は、KDR、FLT1、HIF1Aの順で共起性が高く、血小板由来成長因子(PDGF)では、PDGFB、 PDGFRAの順、網膜芽細胞腫関連タンパク質(RB-1)では、E2F1、 CDKN2A、TP53の順で共起性が高い。これらの遺伝子のプロモーター中のG-quadruplex形成配列を後述する方法で探し、その配列を合成して結合能を確認することができる。 The present inventors have found that a single-stranded polynucleotide having the same nucleotide sequence as a region containing a G-quadruplex structure contained in a promoter (referred to as “G-quadruplex structure-containing region”) functions as an aptamer as it is. , The aptamer was found to bind to the gene product of a structural gene controlled by its promoter or a related gene product of the gene product. The present invention is based on this new finding. Here, a certain “gene product-related gene product” is, for example, a gene product upstream or downstream of a cascade in which the gene product is included, a protein that functions in cooperation with the gene product, or the like. The related gene product of a given gene product can be examined, for example, by co-occurrence analysis in the literature. This co-occurrence analysis can be performed, for example, on the Jabion website published by the National Institute of Informatics, the National Institute of Genetics and the like. According to the method provided on this website, the co-occurrence score is also known, so that a gene product having a strong co-occurrence with a certain gene product can be considered to be a gene product having a high degree of association. For example, a highly co-occurring protein with vascular endothelial growth factor (VEGF) specifically tested in the following examples, KDR, FLT1, and HIF1A have high co-occurrence in this order, and in platelet-derived growth factor (PDGF), PDGFB followed by PDGFRA, followed by E2F1, CDKN2A, and TP53 in order of retinoblastoma-related protein (RB-1). The G-quadruplex forming sequences in the promoters of these genes can be searched for by the method described below, and the sequences can be synthesized to confirm the binding ability.
本発明の方法は、例えば次のように実施することができる。先ず、G-quadruplex構造を含むプロモーターを選出する。ヒトゲノムは既に解読されており、各種構造遺伝子のプロモーター配列も公知である。これらの各種プロモーターのうち、G-quadruplex構造を含むものが本発明の方法において利用可能である。G-quadruplex構造を含むことが公知であるプロモーターは、本発明の方法において利用可能である。G-quadruplex構造を含むことが公知であるプロモーターの例としては、c-Kit遺伝子のプロモーターであるc-Kit87up、c-Myb遺伝子プロモーター、Rb遺伝子プロモーター、c-myc遺伝子プロモーターであるc-myc-23456、BCL-2遺伝子プロモーター、HIF1α遺伝子プロモーター、PDGFRβ遺伝子プロモーター、KRAS遺伝子プロモーター、TERT遺伝子プロモーター、MYB遺伝子プロモーター等を挙げることができる。また、後述の実施例では、プロモーターとして、血管内皮増殖因子(VEGF)プロモーター、血小板由来成長因子(PDGF-A)プロモーター及び網膜芽細胞腫関連タンパク質(RB-1)プロモーター中を選出したが、これらのプロモーター中にG-quadruplex構造が含まれることも公知である。 The method of the present invention can be implemented, for example, as follows. First, a promoter containing the G-quadruplex structure is selected. The human genome has already been decoded, and promoter sequences of various structural genes are also known. Among these various promoters, those containing a G-quadruplex structure can be used in the method of the present invention. Promoters known to contain the G-quadruplex structure can be used in the methods of the invention. Examples of promoters known to include G-quadruplex structure include c-Kit gene promoter c-Kit87up, c-Myb gene promoter, Rb gene promoter, c-myc gene promoter c-myc- 23456, BCL-2 gene promoter, HIF1α gene promoter, PDGFRβ gene promoter, KRAS gene promoter, TERT gene promoter, MYB gene promoter and the like. In the examples described below, as promoters, vascular endothelial growth factor (VEGF) promoter, platelet-derived growth factor (PDGF-A) promoter and retinoblastoma-related protein (RB-1) promoter were selected. It is also known that the G-quadruplex structure is contained in the promoter of.
G-quadruplex構造を含むことが知られていないプロモーターが、G-quadruplex構造を含むか否かは、次のようにして調べることができる。プロモーター配列がG-quadruplex構造を含むためには、グアニンの２連続配列が４箇所以上含まれることが必要である。この要件を満足するプロモーター配列がG-quadruplex構造を含むか否かは、コンピューターソフトによる解析（例えば、http://bioinformatics.ramapo.edu/QGRS/analyze.phpで公開されているRAMAPO COLLEGEのMapper（Nucleic Acids Research 2006 July; 34 (Web Server issue):W676-W682）や、実際にG-quadruplex構造含有領域を化学合成し、それが例えば特許文献３に記載されている公知のG-quadruplex構造検出試薬と反応させて結合するか否かを調べることにより容易に調べることができる。 Whether or not a promoter not known to contain the G-quadruplex structure contains the G-quadruplex structure can be examined as follows. In order for the promoter sequence to include the G-quadruplex structure, it is necessary that two or more guanine continuous sequences be contained at four or more positions. Whether or not a promoter sequence satisfying this requirement contains a G-quadruplex structure is analyzed by computer software (for example, RAMAPO COLLEGE Mapper published at http://bioinformatics.ramapo.edu/QGRS/analyze.php). (Nucleic Acids Research 2006 July; 34 (Web Server issue): W676-W682) or actually chemically synthesizing a G-quadruplex structure-containing region, which is a known G-quadruplex structure described in Patent Document 3, for example. It can be easily examined by reacting with a detection reagent to examine whether or not it binds.
本願発明者らはまた、本発明の方法が、ヘパリン結合性ドメインを持つタンパク質に結合するアプタマーの創製にも有用であることを見出した。下記実施例では、このようなヘパリン結合性ドメインを持つタンパク質である肝細胞増殖因子(HGF(hepatocyte growth factor))、ヘパリン結合性EGF(HBEGF(Heparin-binding EGF-like growth factor))及び血小板由来成長因子、アネキシンII(Annexin II)又はアポリポタンパク質Ｅ４(ApoE4)について実験を行い、これらのいずれに対しても本願発明の方法により、これらのそれぞれに結合するアプタマーの創製に成功している。 The present inventors have also found that the method of the present invention is useful for creating an aptamer that binds to a protein having a heparin-binding domain. In the following Examples, hepatocyte growth factor (HGF) which is a protein having such a heparin-binding domain, heparin-binding EGF (HBEGF (Heparin-binding EGF-like growth factor)) and platelet-derived Experiments were carried out on growth factors, Annexin II or Apolipoprotein E4 (ApoE4), and the method of the present invention succeeded in creating an aptamer that binds to each of them.
次に、選出したプロモーターのG-quadruplex構造含有領域と同一の塩基配列を有するアプタマーを化学合成する。なお、G-quadruplex構造はプロモーター中に存在するが、G-quadruplex構造含有領域はプロモーター以外の部分に跨がるものであってもよい。アプタマーのサイズは特に限定されないが、通常、15merないし100mer程度、好ましくは30merないし70mer程度である（merはヌクレオチド数を示す）。また、アプタマーは、DNAでもRNAでもよいが、化学的に安定なDNAが好ましい。なお、ＤＮＡやＲＮＡの化学合成は、市販の自動合成装置を用いて容易に行うことができる。また、所定の塩基配列を持つＤＮＡやＲＮＡの化学合成を請け負っている業者も種々存在するので、これらの業者に依頼することもできる。なお、in vitro transcriptionによるＲＮＡ合成や、ＰＣＲ等の核酸増幅法によるＤＮＡ合成等、無細胞系で核酸を合成することも本発明における「化学合成」に包含される。なお、本明細書及び特許請求の範囲において、「塩基配列を有する」という語は、塩基がそのように並んでいることを意味し、例えば、「配列番号１で示される塩基配列を有するアプタマー」とは、塩基配列が配列番号１の通りに並んでいる34merのアプタマーを意味する。 Next, an aptamer having the same nucleotide sequence as the G-quadruplex structure-containing region of the selected promoter is chemically synthesized. The G-quadruplex structure exists in the promoter, but the G-quadruplex structure-containing region may extend over a portion other than the promoter. The size of the aptamer is not particularly limited, but is usually about 15mer to 100mer, preferably about 30mer to 70mer (mer indicates the number of nucleotides). The aptamer may be DNA or RNA, but chemically stable DNA is preferable. The chemical synthesis of DNA or RNA can be easily performed using a commercially available automatic synthesizer. In addition, since there are various contractors who undertake chemical synthesis of DNA or RNA having a predetermined nucleotide sequence, it is possible to request these contractors. In addition, synthesizing a nucleic acid in a cell-free system such as RNA synthesis by in vitro transcription and DNA synthesis by a nucleic acid amplification method such as PCR is also included in the "chemical synthesis" in the present invention. In the present specification and claims, the term “having a base sequence” means that the bases are arranged in such a manner, and for example, “aptamer having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1”. Means a 34-mer aptamer in which the nucleotide sequences are arranged as shown in SEQ ID NO: 1.
次に製造したアプタマーが、当該プロモーターにより制御される構造遺伝子の遺伝子産物と結合することを確認する。これは、下記実施例に具体的に記載するゲルシフトアッセイやＳＰＲ測定により行うことができる。すなわち、ゲルシフトアッセイでは、アプタマーの末端に蛍光標識等の標識を結合し、遺伝子産物と混合後、ゲル電気泳動にかけ、標識を検出すると共に銀染色によりタンパク質を検出し、標識と銀染色とが共に陽性であれば、アプタマーと遺伝子産物とが結合していることが確認できる。ＳＰＲ測定では、ＳＰＲ測定用のチップ上に遺伝子産物を固定化し、遺伝子産物とアプタマーを接触させ、アプタマーが遺伝子産物に結合するか否かを市販のＳＰＲ測定装置で測定することによりアプタマーと遺伝子産物とが結合するか否かを確認することができる。 Next, it is confirmed that the produced aptamer binds to the gene product of the structural gene controlled by the promoter. This can be performed by the gel shift assay or SPR measurement specifically described in the examples below. That is, in the gel shift assay, a label such as a fluorescent label is bound to the end of the aptamer, mixed with the gene product, subjected to gel electrophoresis, the label is detected, and the protein is detected by silver staining. If positive, it can be confirmed that the aptamer and the gene product are bound. In SPR measurement, a gene product is immobilized on a chip for SPR measurement, the gene product is brought into contact with the aptamer, and whether the aptamer binds to the gene product is measured by a commercially available SPR measuring device to measure the aptamer and the gene product. It can be confirmed whether and are combined.
アプタマーが遺伝子産物と結合することが確認できた場合には、化学合成によりそのアプタマーを製造する。なお、一般に、標的物質と結合するアプタマーの塩基配列をわずかに変更しても該標的物質との結合性を維持できる場合が少なからず存在することが知られているので、遺伝子産物と結合することが確認されたアプタマーの塩基配列を、該遺伝子産物との結合性を維持したまま修飾してもよい。修飾後のアプタマーの塩基配列は、元の塩基配列と９５％以上の配列同一性を有するものである。この場合、修飾後のアプタマーもG-quadruplex構造を有している必要がある。G-quadruplex構造が遺伝子産物と結合すると考えられるので、G-quadruplex構造以外の部分を修飾することが好ましく、G-quadruplex構造以外の部分を修飾しても遺伝子産物との結合性は維持される可能性が高い。このような修飾アプタマーを化学合成により製造することもできる。なお、ここで、「配列同一性」は、配列を比較する２つの塩基配列の塩基ができるだけ多く一致するように２つの配列を整列させ（必要に応じてギャップを挿入する）、一致する塩基の数を全塩基数で除し、百分率で表した数値を意味する。両者の塩基数が異なる場合には、長い方の塩基数で除す。配列同一性を算出するソフトは周知であり、インターネット上でも無料公開されている。なお、上記の通り、本発明では、ＤＮＡ中のチミンとＲＮＡ中のウラシルは、「同一の塩基」と解するので、ＤＮＡ配列とＲＮＡ配列の配列同一性を比較する場合、チミンとウラシルは同一の塩基として計算する。 When it is confirmed that the aptamer binds to the gene product, the aptamer is produced by chemical synthesis. In addition, it is generally known that even if the base sequence of an aptamer that binds to a target substance is slightly changed, the binding property to the target substance can be maintained in some cases. The base sequence of the aptamer confirmed to have the gene may be modified while maintaining the binding property to the gene product. Nucleotide sequence of the aptamer after modification is a shall which have a original nucleotide sequence 95% or more sequence identity. In this case, the modified aptamer also needs to have a G-quadruplex structure. Since the G-quadruplex structure is considered to bind to the gene product, it is preferable to modify the part other than the G-quadruplex structure, and even if the part other than the G-quadruplex structure is modified, the binding property to the gene product is maintained. Probability is high. Such modified aptamers can also be produced by chemical synthesis. Here, "sequence identity" means that two sequences are aligned (a gap is inserted if necessary) so that the bases of the two base sequences for which the sequences are compared match each other as much as possible, and the sequence of the matched bases is It means the numerical value expressed as a percentage by dividing the number by the total number of bases. When the numbers of bases of both are different, the number of bases with the longer length is divided. Software for calculating sequence identity is well known and is freely available on the Internet. As described above, in the present invention, thymine in DNA and uracil in RNA are understood to be “identical bases”. Therefore, when comparing the sequence identities of a DNA sequence and an RNA sequence, thymine and uracil are the same. Calculated as the base.
G-quadruplex構造含有領域と同一の塩基配列を有するアプタマーを、公知のコンピューター内進化（in silico maturation）法に付して、その塩基配列を改変することにより、遺伝子産物との親和性をさらに高めることが可能である。コンピューター内進化法は、本願共同発明者により発明された方法で、非特許文献２、非特許文献３や特許文献２に記載されており、下記実施例１２にも具体的に記載されている。この方法を、遺伝子産物と結合することが確認されたアプタマーに適用する場合には、例えば、G-quadruplex構造の維持に不可欠ではない、例えば３〜５mer程度の複数の領域を、得られた各アプタマーの対応する各領域どうしの間でランダムに交換したり（シャフル)、遺伝的アルゴリズムによる交差を行う。そして、さらにシャフル又は交差後の上記各領域に、ランダムな一塩基置換を導入する。これらのシャフル又は交差及び一塩基置換の導入はコンピューターで行なう。そして、コンピューターにより作出された新たな塩基配列を有するアプタマーを化学合成して核酸ライブラリーとし、SELEXのサイクルに付す。１サイクル目終了後の第２の核酸ライブラリーを作製する際、結合能の順序の高かったアプタマーに由来する領域を有するアプタマーの量を最も多くし、以下、順序が下がるにつれてその比率を少なくする。以上のように、コンピューター内でのシャフル又は交差及び一塩基置換により人為的に変異を導入することにより、SELEXによる進化の効率を高めることができる。 An aptamer having the same nucleotide sequence as the G-quadruplex structure-containing region is subjected to a known in silico maturation method to modify its nucleotide sequence to further enhance the affinity with the gene product. It is possible. The in-computer evolution method is a method invented by the joint inventor of the present application and is described in Non-Patent Document 2, Non-Patent Document 3 and Patent Document 2, and is also specifically described in Example 12 below. When this method is applied to an aptamer confirmed to bind to a gene product, for example, a plurality of regions of about 3 to 5 mer, which are not essential for maintaining the G-quadruplex structure, are obtained. The corresponding regions of the aptamer are randomly exchanged (shuffled) or crossed by a genetic algorithm. Then, random single base substitution is introduced into each of the above regions after shuffle or crossover. The introduction of these shuffles or crossovers and single base substitutions is performed by a computer. Then, an aptamer having a new base sequence created by a computer is chemically synthesized to form a nucleic acid library, which is then subjected to the SELEX cycle. When the second nucleic acid library after the completion of the first cycle is prepared, the amount of aptamers having a region derived from the aptamer having the highest order of binding ability is maximized, and the ratio is reduced as the order decreases. .. As described above, the efficiency of evolution by SELEX can be increased by artificially introducing a mutation by shuffle or crossover and single base substitution in a computer.
このコンピューター内進化法は、コンピューターの支援を利用してSELEXを行うものであるが、元になるアプタマーが既に遺伝子産物との結合能を有するものであるので、全くのゼロから出発するSELEXとは難易度が異なり、高い確率で遺伝子産物との結合能をさらに高めることができる。なお、コンピューター内進化法は、遺伝子産物との結合能を実験で確かめながら行うものであるので、塩基配列が元の塩基配列とかなり異なるものとなっても遺伝子産物との結合能が確保されているので、配列同一性は、必ずしも９５％以上に限定されるものではない。もっとも、コンピューター内進化法は、上記の通り、G-quadruplex構造以外の部分に変異を導入するものであるので、G-quadruplex構造は維持されている。さらに、下記実施例１２に具体的に記載する通り、コンピューター内進化法において、各世代で得られたアプタマーのうち、目的の遺伝子産物との結合能が高いアプタマーの配列を調べることにより、目的の遺伝子産物との結合能を発揮する配列モチーフが明らかになる場合がある。例えば、下記実施例１２では、下記実施例４で得られたHGF結合性アプタマーを親配列として、コンピューター内進化法を行い、第２世代まで行った時点で、第１世代と第２世代のアプタマーのうち、HGFとの結合能が高いアプタマーの塩基配列を調べたところ、多くの配列がggtggagggg（配列番号５７）という配列モチーフを共通して持っていることがわかった。そこで、この配列モチーフの部分を固定して第３世代を行ったところ、HGFに対する結合特異性(Sp(HGF))が親配列の実に約２４０倍ものアプタマーを得ることができた。このように、コンピューター内進化法によれば、途中段階で、高い結合能を発揮する配列モチーフが判明する場合があり、この場合には、この配列モチーフを固定して、それ以降の世代を行うことにより、一層効率的に高い結合能を持つアプタマーを得ることが可能になる。 This in-computer evolution method uses computer support to perform SELEX, but since the original aptamer already has the ability to bind to the gene product, SELEX that starts from completely zero The degree of difficulty is different, and the ability to bind to the gene product can be further increased with a high probability. In addition, since the in-computer evolution method is performed while confirming the binding ability with a gene product in an experiment, the binding ability with a gene product is ensured even if the base sequence is considerably different from the original base sequence. because there, sequence identity are not necessarily limited to 95% or more. However, the in-computer evolution method, as described above, introduces a mutation into a portion other than the G-quadruplex structure, so that the G-quadruplex structure is maintained. Further, as specifically described in Example 12 below, in the in-computer evolution method, among the aptamers obtained in each generation, by examining the sequence of the aptamer having a high binding ability to the target gene product, Sequence motifs that exert the ability to bind to gene products may be revealed. For example, in Example 12 below, the HGF-binding aptamer obtained in Example 4 below was used as a parent sequence, an in-computer evolution method was performed, and when the second generation was performed, the aptamers of the first generation and the second generation were obtained. Among them, when the nucleotide sequence of an aptamer having high binding ability to HGF was examined, it was found that many sequences commonly had a sequence motif ggtggagggg (SEQ ID NO: 57). Therefore, when this sequence motif portion was fixed and the third generation was performed, an aptamer having a binding specificity for HGF (Sp (HGF) ) of about 240 times that of the parent sequence could be obtained. As described above, according to the in-computer evolution method, a sequence motif exhibiting high binding ability may be found in the middle stage. In this case, this sequence motif is fixed and the subsequent generation is performed. This makes it possible to more efficiently obtain an aptamer having a high binding ability.
上記の通り、本発明の方法によれば、所望の標的タンパク質の構造遺伝子のプロモーター配列を利用して、SELEXを行うことなく、所望の標的タンパク質に結合するアプタマーを容易に製造することができるという優れた効果が奏される。 As described above, according to the method of the present invention, it is possible to easily produce an aptamer that binds to a desired target protein by using the promoter sequence of the structural gene of the desired target protein without performing SELEX. Excellent effect is achieved.
アプタマーは、標的タンパク質と特異的に結合する性質を有しているので、その標的タンパク質の定量や検出に用いることができる（例えば特許文献２）。この場合にはアプタマーを標識して用いることができる。標識としては、蛍光標識、放射標識、酵素標識、化学発光標識等、周知の標識を挙げることができる。これらの標識を直接又はスペーサー配列を介してアプタマーの末端に結合しても、標的物質に対する結合親和性は維持されることは周知であり、下記実施例でも蛍光標識であるFITCを結合したアプタマーを用いている。これらの標識を付加したアプタマーは、遺伝子産物の測定（検出又は定量）に用いることができる。標識アプタマーを用いた標的物質の測定方法自体はこの分野において周知であり、例えば標識抗体を用いる免疫測定法と同様に行うことができる。 Since an aptamer has a property of specifically binding to a target protein, it can be used for quantification and detection of the target protein (for example, Patent Document 2). In this case, the aptamer can be labeled and used. Examples of the label include known labels such as fluorescent labels, radiolabels, enzyme labels, chemiluminescent labels and the like. It is well known that even if these labels are bound to the ends of the aptamer directly or via a spacer sequence, the binding affinity for the target substance is maintained, and in the examples below, the aptamer bound with FITC which is a fluorescent label is also used. I am using. The aptamer to which these labels are added can be used for measuring (detecting or quantifying) a gene product. A method for measuring a target substance using a labeled aptamer is well known in this field, and for example, it can be performed in the same manner as an immunoassay using a labeled antibody.
また、標的タンパク質が疾患に関する何らかの生理活性を有しており、その発現を促進することがその疾患の治療につながる場合には、本発明の方法により製造されたアプタマーは、核酸医薬として利用することができる。すなわち、生体に該アプタマーを投与すると、細胞内で生産された遺伝子産物の一部がアプタマーと結合し、プロモーターと結合できなくなるので、遺伝子産物による転写抑制が低減される。また、アプタマーが、遺伝子産物と結合してその活性を中和できる場合には、遺伝子産物の活性を阻害することも可能であり、遺伝子産物の阻害がその疾患の治療につながる場合にも核酸医薬として用いることができる。アプタマーを核酸医薬として用いる場合、例えば、耐ヌクレアーゼ性向上のために例えばポリエチレングリコール(PEG)鎖のような、他の構造を付加することができる。PEG鎖をアプタマーの末端に結合することにより、アプタマーの耐ヌクレアーゼ性を高めることは周知であり、既に実用化されている。PEG鎖のサイズは、特に限定されないが、通常、分子量１万〜３万程度、好ましくは分子量15000〜25000程度であり、また、PEG鎖の数は１本でも２本でもよいが２本が好ましい。このようなPEG鎖は、アプタマーの末端に周知のアミノリンカーを付加し、これを介して結合することができる。PEG鎖を２本結合する場合には、リジン化したアミノリンカー等の複数のアミノ基を持つアミノリンカーを用い、各アミノ基にPEG鎖を結合することができる。 When the target protein has some physiological activity related to a disease and promotion of its expression leads to the treatment of the disease, the aptamer produced by the method of the present invention should be used as a nucleic acid drug. You can That is, when the aptamer is administered to a living body, a part of the gene product produced in the cell binds to the aptamer and cannot bind to the promoter, and thus transcriptional repression by the gene product is reduced. In addition, when the aptamer can bind to the gene product and neutralize its activity, it is also possible to inhibit the activity of the gene product, and even when the inhibition of the gene product leads to the treatment of the disease, the nucleic acid drug Can be used as When the aptamer is used as a nucleic acid drug, for example, another structure such as a polyethylene glycol (PEG) chain can be added to improve nuclease resistance. It is well known that the nuclease resistance of an aptamer is improved by binding a PEG chain to the end of the aptamer, and it has already been put to practical use. The size of the PEG chain is not particularly limited, but usually has a molecular weight of about 10,000 to 30,000, preferably about 15,000 to 25,000, and the number of PEG chains may be one or two, but is preferably two. .. Such a PEG chain can be linked via a well-known amino linker added to the end of the aptamer. When two PEG chains are linked, an amino linker having a plurality of amino groups such as a lysinated amino linker can be used to link the PEG chains to each amino group.
さらに、標的タンパク質が疾患に関する何らかの生理活性を有しており、その発現を促進することがその疾患の治療につながる場合には、本発明の方法により製造されたアプタマーに対する結合性を指標とした新薬スクリーニングを行うことも可能である。新薬スクリーニングにより見出された物質を投与することにより、遺伝子産物によりプロモーターの阻害が低減されるので、該物質は、薬理効果を発揮する。 Furthermore, if the target protein has some physiological activity related to a disease and promotion of its expression leads to the treatment of that disease, a new drug using the binding property to the aptamer produced by the method of the present invention as an index It is also possible to perform screening. By administering the substance found by the new drug screening, the substance exerts a pharmacological effect because the inhibition of the promoter is reduced by the gene product.
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。なお、下記実施例において、実施例８〜１０は、それぞれ、参考例１〜３と読み替えるものとする。
Hereinafter, the present invention will be described more specifically based on Examples. However, the present invention is not limited to the following examples. In the following examples, Examples 8 to 10 shall be read as Reference Examples 1 to 3, respectively.
実施例１、比較例１
VEGFプロモーター領域中で形成されるGq構造のVEGFへの結合能の解析
Example 1, Comparative Example 1
Analysis of binding ability of Gq structure formed in VEGF promoter region to VEGF
実験方法
G-quadruplex構造を含むことが公知であるVEGFプロモーター（Sun, D., Guo, K., Rusche, J. J. & Hurley, L. H. Facilitation of a structural transition in the polypurine/polypyrimidine tract within the proximal promoter region of the human VEGF gene by the presence of potassium and G-quadruplex-interactive agents. Nucleic Acids Res. 33, 6070-6080 (2005))をプロモーターとして選出した。VEGFプロモーター領域（ゲノム上の位置：chr6:43,737,633-43,739,852）内で形成されるG-quadruplex（以下、「Gq」と略記することがある）構造形成配列(VEGF promoter Gq（配列番号１)、実施例１）及び、Gq形成に関与するG塩基をT塩基に置換しGqを形成しないように設計したオリゴＤＮＡ (VEGF promoter Gq-（配列番号２）、比較例１)のVEGFに対する結合能の評価を行った。各オリゴＤＮＡは、市販のＤＮＡ自動合成機により合成した。なお、すべての塩基番号はHuman Feb. 2009 (GRCh37/hg19) Assemblyに対応している。
experimental method
VEGF promoter known to include G-quadruplex structure (Sun, D., Guo, K., Rusche, JJ & Hurley, LH Facilitation of a structural transition in the polypurine/polypyrimidine tract within the proximal promoter region of the human VEGF gene by the presence of potassium and G-quadruplex-interactive agents. Nucleic Acids Res. 33, 6070-6080 (2005)) was selected as a promoter. A G-quadruplex (hereinafter sometimes abbreviated as "Gq") structure-forming sequence (VEGF promoter Gq (SEQ ID NO: 1)) formed within the VEGF promoter region (position on genome: chr6:43,737,633-43,739,852) Example 1) and evaluation of the binding ability of oligo DNA (VEGF promoter Gq- (SEQ ID NO: 2), Comparative Example 1) designed to substitute G bases involved in Gq formation with T bases and not to form Gq for VEGF I went. Each oligo DNA was synthesized by a commercially available automatic DNA synthesizer. All base numbers correspond to Human Feb. 2009 (GRCh37/hg19) Assembly.
評価はゲルシフトアッセイ及びSPR測定により行った。評価に用いたDNA配列を下記表１に示す。アプタマーは全てTBS バッファー(10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 5 mM KCl, pH 7.4)を用いて1μMに希釈し、フォールディングした後に使用した。 The evaluation was performed by gel shift assay and SPR measurement. The DNA sequences used for evaluation are shown in Table 1 below. All aptamers were diluted to 1 μM with TBS buffer (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 5 mM KCl, pH 7.4), and used after folding.
ゲルシフトアッセイ
VEGF165（GenBank Accession No.: NP_001165097)及び各アプタマー(5'-FITC修飾)を、それぞれ終濃度1.3μM又は500 nMとなるように混合し、30 分間室温で振とうした。その後、各サンプルを12%未変性ポリアクリルアミドゲルにアプライし、室温、20mA(定電流)で25 分間泳動を行った。泳動した後、Typhoon 8600（商品名、GE Healthcare社製）により各アプタマーのFITCの蛍光を検出した。また、銀染色によりVEGFを染色した。
Gel shift assay
VEGF 165 (GenBank Accession No.: NP — 001165097) and each aptamer (5′-FITC modified) were mixed at a final concentration of 1.3 μM or 500 nM and shaken at room temperature for 30 minutes. After that, each sample was applied to a 12% non-denaturing polyacrylamide gel and electrophoresed at room temperature and 20 mA (constant current) for 25 minutes. After the migration, FITC fluorescence of each aptamer was detected by Typhoon 8600 (trade name, manufactured by GE Healthcare). In addition, VEGF was stained by silver staining.
SPR測定
ランニングバッファーにはTBS バッファーを用いた。アミンカップリング法により4700 RU程度のVEGF165が固定化されたセンサーチップCM5（商品名、GE Healthcare社製）を用いて、7.8〜1000 nMに調製した各アプタマーを注入し、センサーチップ上のVEGF165と各アプタマーの結合をSPR測定により観察した。
SPR measurement TBS buffer was used as a running buffer. Using a sensor chip CM5 (trade name, manufactured by GE Healthcare) on which VEGF 165 of about 4700 RU was immobilized by the amine coupling method, each aptamer prepared at 7.8 to 1000 nM was injected, and VEGF on the sensor chip was injected. The binding between 165 and each aptamer was observed by SPR measurement.
結果及び考察
ゲルシフトアッセイの結果、VEGF165を混合したサンプルのレーンにおいてVEGFの位置にVEap121（配列番号３）の蛍光バンドのシフトが見られた。また、VEGF promoter GqにおいてもVEGFの位置にバンドのシフトが観察された。これにより、VEGF promoter領域のGq構造はVEGFに結合することが示された。VEGF promoter Gq配列のSPR測定を行った結果を図１に示す。
Results and Discussion gel shift assay results, the shift in fluorescence band VEap121 the position of VEGF in the lane of the sample mixed with VEGF 165 (SEQ ID NO: 3) was observed. Also, a band shift was observed at the VEGF position in the VEGF promoter Gq. This demonstrated that the Gq structure of the VEGF promoter region binds to VEGF. The results of SPR measurement of the VEGF promoter Gq sequence are shown in Fig. 1.
VEGF promoter Gq-を注入した場合にはSPRシグナルの上昇が見られなかったのに対し、VEap121又は VEGF promoter Gqを用いた場合、アプタマー濃度依存的なSPRシグナルの上昇が観察された。カーブフィッティングにより各アプタマーの解離定数を算出した結果、VEap121 : 510 nM, VEGF promoter Gq : 240 nMと算出された。 No increase in SPR signal was observed when VEGF promoter Gq- was injected, whereas an increase in aptamer concentration-dependent SPR signal was observed when VEap121 or VEGF promoter Gq was used. As a result of calculating the dissociation constant of each aptamer by curve fitting, VEap121:510 nM and VEGF promoter Gq:240 nM were calculated.
実施例２、比較例２
SPRによるPDGFプロモーター領域中で形成されるGq構造のPDGFへの結合能の解析
Example 2 and Comparative Example 2
Analysis of binding ability of Gq structure formed in PDGF promoter region by SPR to PDGF
実験方法
G-quadruplex構造を含むことが公知であるPDGF-Aプロモーター（Qin, Y., Rezler, E. M., Gokhale, V., Sun, D. & Hurley, L. H. Characterization of the G-quadruplexes in the duplex nuclease hypersensitive element of the PDGF-A promoter and modulation of PDGF-A promoter activity by TMPyP4. Nucleic Acids Res. 35, 7698-7713 (2007)) をプロモーターとして選出した。PDGF-Aプロモーター領域（ゲノム上の位置：chr7:556,612-562,845）内で形成されるGq構造形成配列(PDGF promoter Gq（配列番号４）、実施例２)及び、Gq形成に関与するG塩基をT塩基に置換しGqを形成しないように設計した配列(PDGF promoter Gq-（配列番号５）、比較例２)のPDGF-AAに対する結合能の評価をSPR測定により行った。これらの配列を表２に示す。なお、すべての塩基番号はHuman Feb. 2009 (GRCh37/hg19) Assemblyに対応している。
experimental method
PDGF-A promoter known to contain G-quadruplex structure (Qin, Y., Rezler, EM, Gokhale, V., Sun, D. & Hurley, LH Characterization of the G-quadruplexes in the duplex nuclease hypersensitive element of the PDGF-A promoter and modulation of PDGF-A promoter activity by TMPyP4. Nucleic Acids Res. 35, 7698-7713 (2007)) was selected as a promoter. The Gq structure forming sequence (PDGF promoter Gq (SEQ ID NO: 4), Example 2) formed in the PDGF-A promoter region (position on the genome: chr7:556,612-562,845) and the G bases involved in Gq formation are The binding ability of PDGF-AA (PDGF promoter Gq-(SEQ ID NO: 5), Comparative Example 2) designed so as not to form Gq by substitution with T base was evaluated by SPR measurement. These sequences are shown in Table 2. All base numbers correspond to Human Feb. 2009 (GRCh37/hg19) Assembly.
ランニングバッファーにはTBS バッファーを用いた。アミンカップリング法により9000 RU程度のPDGF-AAが固定化されたセンサーチップCM5を用いて、7.8〜1000 nMに調製した各アプタマーを注入し、センサーチップ上のPDGF-AA（GenBank Accession No.: P04085)と各アプタマーの結合をSPR測定により観察した。 TBS buffer was used as the running buffer. Using a sensor chip CM5 on which PDGF-AA of about 9000 RU was immobilized by the amine coupling method, each aptamer prepared at 7.8 to 1000 nM was injected, and PDGF-AA (GenBank Accession No.: The binding between P04085) and each aptamer was observed by SPR measurement.
結果及び考察
PDGF promoter Gq配列のSPR測定を行った結果を図２に示す。PDGF promoter Gq-を注入した場合にはSPRシグナルの上昇が見られなかったのに対し、PDGF promoter Gqを用いた場合、アプタマー濃度依存的なSPRシグナルの上昇が観察された。カーブフィッティングにより各アプタマーの解離定数を算出した結果、VEGF promoter Gq : 18nMと算出された。
Results and discussion
The results of SPR measurement of the PDGF promoter Gq sequence are shown in Fig. 2. No increase in SPR signal was observed when PDGF promoter Gq- was injected, whereas an increase in SPR signal dependent on aptamer concentration was observed when PDGF promoter Gq was used. As a result of calculating the dissociation constant of each aptamer by curve fitting, it was calculated as VEGF promoter Gq: 18 nM.
実施例３、比較例３
RB-1のプロモーター領域中に存在するGq構造のRB-1への結合能の解析
Example 3, Comparative Example 3
Analysis of the binding ability of Gq structure existing in the promoter region of RB-1 to RB-1
実験方法
G-quadruplex構造を含むことが公知であるRB-1プロモーター(Xu, Y. & Sugiyama, H. Formation of the G-quadruplex and i-motif structures in retinoblastoma susceptibility genes (Rb). Nucleic Acids Res. 34, 949-954 (2006))をプロモーターとして選出した。RB-1プロモーター領域（ゲノム上の位置：chr13:48877460-48878501）内で形成されるGq構造形成配列(RB-1_Gq promoter Gq（配列番号６）、実施例３)及び、Gq形成に関与するG塩基をT塩基に置換しGqを形成しないように設計した配列(RB-1_Gq_Mut（配列番号７）、比較例３)のRB-1に対する結合能をゲルシフトアッセイで調べた。なお、すべての塩基番号はHuman Feb. 2009 (GRCh37/hg19) Assemblyに対応している。RB-1(終濃度0nM or 470nM) （GenBank Accession No.: P06400)及び1000nM各DNA(5'-TAMRA修飾、下記表３に配列を示す)を混合し、30分間室温で振とうした。その後、各サンプルを12%未変性ポリアクリルアミドゲルにアプライし、室温、20 mA(定電流)で20分間泳動を行った。泳動した後、Typhoon 8600（商品名）により各DNAのTAMRAの蛍光を検出した。また、銀染色によりRB-1を染色した。
experimental method
RB-1 promoter known to include G-quadruplex structure (Xu, Y. & Sugiyama, H. Formation of the G-quadruplex and i-motif structures in retinoblastoma susceptibility genes (Rb). Nucleic Acids Res. 34, 949-954 (2006)) was selected as a promoter. Gq structure forming sequence (RB-1_Gq promoter Gq (SEQ ID NO: 6), Example 3) formed in the RB-1 promoter region (position on the genome: chr13:48877460-48878501) and G involved in Gq formation The binding ability to RB-1 of the sequence (RB-1_Gq_Mut (SEQ ID NO: 7), Comparative Example 3) designed so as not to form Gq by replacing the base with T base was examined by gel shift assay. All base numbers correspond to Human Feb. 2009 (GRCh37/hg19) Assembly. RB-1 (final concentration 0 nM or 470 nM) (GenBank Accession No.: P06400) and 1000 nM each DNA (5'-TAMRA modified, sequence shown in Table 3 below) were mixed and shaken for 30 minutes at room temperature. Then, each sample was applied to a 12% non-denaturing polyacrylamide gel, and electrophoresed at room temperature and 20 mA (constant current) for 20 minutes. After running, TAMRA fluorescence of each DNA was detected by Typhoon 8600 (trade name). Also, RB-1 was stained by silver staining.
結果及び考察
泳動後、Typhoon（商品名）により蛍光を検出した結果及び銀染色によりRB-1タンパク質を検出した結果を図３に示す。470 nM RB-1と1000 nM RB-1_Gqを混合したレーンにおいて、RB-1のバンドが観察される位置にTAMRAの蛍光が観察された。他のレーンではこのバンドは観察されなかった。このことから、RB-1プロモーター中で形成されるGq構造がRB-1タンパク質に結合することが示された。
Results and Discussion After the electrophoresis, the results of detecting fluorescence by Typhoon (trade name) and the results of detecting RB-1 protein by silver staining are shown in FIG. In the lane in which 470 nM RB-1 and 1000 nM RB-1_Gq were mixed, TAMRA fluorescence was observed at the position where the RB-1 band was observed. This band was not observed in the other lanes. This indicates that the Gq structure formed in the RB-1 promoter binds to the RB-1 protein.
実施例４〜７
ヘパリン結合性ドメインを有するタンパク質に対するアプタマーの創製
１．方法
(1)HGF、HBEGF、PDGFB、Annexin II遺伝子の各転写開始点近傍配列をUSCS Genome Browserを用いて取得した。HGFに対しては転写開始点±1kbpの配列を、HBEGF、PDGFB及びAnnexin IIに対しては転写開始点近傍に存在するCpGアイランドの配列を取得した。配列はプラスストランド及びマイナスストランドの両配列を取得した。
Examples 4-7
Creation of aptamer for protein having heparin-binding domain 1. Method
(1) HGF, HBEGF, PDGFB, and sequences near the transcription start points of Annexin II genes were obtained using USCS Genome Browser. The sequence of the transcription start point ±1 kbp was obtained for HGF, and the sequence of the CpG island existing near the transcription start point was obtained for HBEGF, PDGFB and Annexin II. Both positive strand and negative strand sequences were obtained.
(2)各配列の内、四重らせん構造を形成しうる配列を下記条件で抽出した。
HGF：2連続以上のGを4箇所以上含み、連続したGと連続したGの間の配列は7 mer以内であり、全長が40 mer以内の配列を抽出した。
PDGFB, HBEGF, Annexin II ：3連続以上のGを4箇所以上含み、連続したGと連続したGの間の配列は7 mer以内であり、全長が30 mer以内の配列を抽出した。上記条件に該当する配列が存在しない場合は、2連続以上のGを4箇所以上含み、連続したGと連続したGの間の配列は7 mer以内であり、全長が30 mer以内の配列を抽出した。
(2) Of each sequence, a sequence capable of forming a quadruplex structure was extracted under the following conditions.
HGF: G containing 2 or more consecutive Gs at 4 sites or more, the sequence between consecutive Gs was within 7 mer, and the sequence with a total length within 40 mer was extracted.
PDGFB, HBEGF, Annexin II: 3 or more consecutive Gs were contained at 4 or more sites, the sequence between consecutive Gs was within 7 mer, and the sequence with a total length of within 30 mer was extracted. If there is no sequence corresponding to the above conditions, 2 or more consecutive Gs are contained at 4 or more positions, the sequence between consecutive Gs is within 7 mer, and the total length within 30 mer is extracted. did.
(3)上記(2)で抽出した配列を合成し、HGF, HBEGFに対してはSPRを用いて、PDGFB, Annexin IIに対してはゲルシフトアッセイにより解析した。 (3) The sequences extracted in (2) above were synthesized and analyzed by SPR for HGF and HBEGF and by gel shift assay for PDGFB and Annexin II.
(4) SPRは下記の方法で実施した。
HGF及びHBEGFをPBSバッファー (Na2HPO4 8.1 mM, KH2PO4 1.47 mM, NaCl 137 mM, KCl 2.68 mM, pH7.4)に溶解し、アミンカップリング法によりセンサーチップCM5上に固定化した。その後、合成したオリゴヌクレオチドをTBSK バッファー (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 100 mM KCl)中でフォールディングさせた(95℃5分の後25℃まで30分かけて冷却)。各オリゴヌクレオチドを種々の濃度に希釈し、センサーチップ上にインジェクションし、SPRシグナルの変化を観察した。添加時間120秒、解離時間120秒、流速30μl/minで行った。解離定数(Kd)は、Curve fitting解析によって算出した。
(4) SPR was carried out by the following method.
HGF and HBEGF were dissolved in PBS buffer (Na 2 HPO 4 8.1 mM, KH 2 PO 4 1.47 mM, NaCl 137 mM, KCl 2.68 mM, pH7.4) and immobilized on the sensor chip CM5 by the amine coupling method. .. Then, the synthesized oligonucleotide was folded in TBSK buffer (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 100 mM KCl) (95° C. for 5 minutes and then cooled to 25° C. for 30 minutes). Each oligonucleotide was diluted to various concentrations and injected on a sensor chip to observe changes in SPR signal. The addition time was 120 seconds, the dissociation time was 120 seconds, and the flow rate was 30 μl/min. The dissociation constant (Kd) was calculated by Curve fitting analysis.
(5) ゲルシフトアッセイは下記の方法で実施した。
5’末端をFITCで修飾した各オリゴヌクレオチドをTBSK バッファー (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 100 mM KCl, pH 7.4)中でフォールディングさせた。その後、250 ngのタンパク質と5 pmolのオリゴヌクレオチドを混合し、室温で30分間振とうした。その後、各サンプルを12%未変性ポリアクリルアミドゲルにアプライし、室温、20 mA(定電流)で泳動を行った。泳動した後、Typhoon 8600により各アプタマーの蛍光を検出した。
(5) The gel shift assay was performed by the following method.
Each oligonucleotide whose 5'end was modified with FITC was folded in TBSK buffer (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 100 mM KCl, pH 7.4). Then, 250 ng of protein and 5 pmol of the oligonucleotide were mixed and shaken at room temperature for 30 minutes. Then, each sample was applied to a 12% non-denaturing polyacrylamide gel, and electrophoresed at room temperature and 20 mA (constant current). After running, the fluorescence of each aptamer was detected by Typhoon 8600.
(6) HGF及びHBEGFプロモーター中に存在するDNA四重らせん構造を形成しうる配列については、CDスペクトル測定を行った。各オリゴヌクレオチドを、終濃度2 μMとなるようにTBSK バッファー (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 100 mM KCl pH 7.4)またはTBS バッファー(10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl pH 7.4)で調製し、フォールディング(95℃5分の後25℃まで30分かけて冷却)を行った。調製したサンプルを光路長10 mmの石英セルに入れ、J-820型円二色性分散計を用いてCDスペクトルを測定した。尚、感度は1000 mdeg、波長領域は220 nmから320 nm、データ取り込み間隔は1 nm、走査速度は500 nm/min、レスポンスは1 sec、バンド幅は5.0 nm、積算回数は10回の条件で測定を行った。 (6) The CD spectrum of the sequences capable of forming a DNA quadruplex structure present in the HGF and HBEGF promoters was measured. Prepare each oligonucleotide with TBSK buffer (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 100 mM KCl pH 7.4) or TBS buffer (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl pH 7.4) to a final concentration of 2 μM. Then, folding (95° C. for 5 minutes and then cooling to 25° C. for 30 minutes) was performed. The prepared sample was placed in a quartz cell having an optical path length of 10 mm, and a CD spectrum was measured using a J-820 type circular dichroism dispersometer. The sensitivity is 1000 mdeg, the wavelength range is 220 nm to 320 nm, the data acquisition interval is 1 nm, the scanning speed is 500 nm/min, the response is 1 sec, the bandwidth is 5.0 nm, and the number of integration is 10 times. The measurement was performed.
２．結果
(1)各プロモーター領域からDNA四重らせん構造を形成しうる配列を検索したところ、HGFプロモーターからは9配列、HBEGFプロモーターからは14配列、PDGFBプロモーターからは8配列、Annexin IIプロモーターからは7配列、抽出することができた(表４)。
2. result
(1) When searching for a sequence capable of forming a DNA quadruplex structure from each promoter region, 9 sequences from HGF promoter, 14 sequences from HBEGF promoter, 8 sequences from PDGFB promoter, 7 sequences from Annexin II promoter Could be extracted (Table 4).
(2)HGFに対して各オリゴヌクレオチドが結合するかSPRにより解析したところ、HGF-PQS1（配列番号８）、HGF-PQS7（配列番号９）、HGF-PQS8（配列番号１０）の3つの配列においてDNA濃度依存的なSPRシグナルの増加が観察された、これらがHGFのアプタマーであることが示された（図４）。HGF-PQS1、HGF-PQS7、HGF-PQS8のHGFに対する解離定数はそれぞれ73 nM、45 nM、110 nMであった。 (2) When each oligonucleotide binds to HGF and analyzed by SPR, three sequences of HGF-PQS1 (SEQ ID NO: 8), HGF-PQS7 (SEQ ID NO: 9), HGF-PQS8 (SEQ ID NO: 10) A DNA concentration-dependent increase in the SPR signal was observed in Fig. 4, and it was shown that these are HGF aptamers (Fig. 4). The dissociation constants of HGF-PQS1, HGF-PQS7, and HGF-PQS8 for HGF were 73 nM, 45 nM, and 110 nM, respectively.
(3)HBEGFに対して各オリゴヌクレオチドが結合するかSPRにより解析したところ、HBEGF-PQS8、HBEGF-PQS9の2つの配列においてDNA濃度依存的なSPRシグナルの増加が観察され、これらがHBEGFのアプタマーであることが示された（図５）。HBEGF-PQS8（配列番号１１）、HBEGF-PQS9（配列番号１２）のHBEGFに対する解離定数はそれぞれ110nM、9μMであった。 (3) When each oligonucleotide binds to HBEGF and analyzed by SPR, HBEGF-PQS8, HBEGF-PQS9 two sequences of DNA concentration-dependent increase in SPR signal was observed, these are the aptamers of HBEGF Was shown (FIG. 5). The dissociation constants of HBEGF-PQS8 (SEQ ID NO: 11) and HBEGF-PQS9 (SEQ ID NO: 12) for HBEGF were 110 nM and 9 μM, respectively.
(4)PDGF-BBに対して各オリゴヌクレオチドが結合するかゲルシフトアッセイにより解析したところ、8配列（表４中の上から順に配列番号１３〜２０）すべてのオリゴヌクレオチドがPDGF-BBに結合することが示され、これらがPDGF-BBに結合するアプタマーであることが示された（図６）。なお、図６中、+はPDGF-BB存在下、-はPDGF-BB非存在下のレーンを示している。 (4) When each oligonucleotide bound to PDGF-BB was analyzed by gel shift assay, all 8 sequences (SEQ ID NOs: 13 to 20 in Table 4) were bound to PDGF-BB. It was shown that these are aptamers that bind to PDGF-BB (FIG. 6). In FIG. 6, + indicates the presence of PDGF-BB and-indicates the lane in the absence of PDGF-BB.
(5)Annexin IIに対して各オリゴヌクレオチドが結合するかゲルシフトアッセイにより解析したところ、Annexin II-PQS6（配列番号２１）がAnnexin IIに結合することが示され、これがAnnexin IIに結合するアプタマーであることが示された（図７）。なお、図７中、+はAnnexin II存在下、-はAnnexin II非存在下のレーンを示している。 (5) Analysis of each oligonucleotide binding to Annexin II by gel shift assay showed that Annexin II-PQS6 (SEQ ID NO: 21) binds to Annexin II, which is an aptamer that binds to Annexin II. It was shown (Fig. 7). In addition, in FIG. 7, + indicates the lane in the presence of Annexin II, and-indicates the lane in the absence of Annexin II.
(6)HGF-PQS1からPQS9のCDスペクトル測定したところ、HGFに結合が観察されたHGF-PQS1及びHGF-PQS7のみ、カリウム存在下で260 nm付近に正のピーク、240 nm付近に負のピークを示した（図８）。これは、パラレル型のDNA四重らせん構造特有のCDスペクトルであることから、HGF-PQS1及びHGF-PQS7はパラレル型のDNA四重らせん構造を形成して、HGFに結合していることが示された。 (6) CD spectrum of HGF-PQS1 to PQS9 was measured, and only HGF-PQS1 and HGF-PQS7, which were observed to bind to HGF, were positive peak around 260 nm and negative peak around 240 nm in the presence of potassium. Is shown (FIG. 8). This is a CD spectrum specific to the parallel DNA quadruplex structure, indicating that HGF-PQS1 and HGF-PQS7 form a parallel DNA quadruplex structure and bind to HGF. Was done.
HBEGF-PQS1からPQS14のCDスペクトル測定したところ、HBEGFに結合が観察されたHBEGF-PQS8及びHBEGF-PQS9のみ、カリウム存在下で260 nm付近に正のピーク、240 nm付近に負のピークを示した（図９）。つまり、HBEGF-PQS8及びHBEGF-PQS9はパラレル型のDNA四重らせん構造を形成して、HBEGFに結合していることが示された。 When the CD spectrum of HBEGF-PQS1 to PQS14 was measured, binding to HBEGF was observed, only HBEGF-PQS8 and HBEGF-PQS9 showed a positive peak near 260 nm and a negative peak near 240 nm in the presence of potassium. (FIG. 9). That is, it was shown that HBEGF-PQS8 and HBEGF-PQS9 formed a parallel-type DNA quadruplex structure and bound to HBEGF.
実施例８〜１０
１．方法
(1)VEGFA、PDGFA、PDGFB遺伝子から転写されるRNAの全長配列をUSCS Genome Browserを用いて取得した。
Examples 8-10
1. Method
(1) The full length sequences of RNA transcribed from VEGFA, PDGFA and PDGFB genes were obtained using USCS Genome Browser.
(2)各配列の内、RNA四重らせん構造を形成しうる配列を下記条件で抽出した。
2連続以上のGを4箇所以上含み、連続したGと連続したGの間の配列は14 mer以内であり、全長が40 mer以内の配列を抽出した。
(2) Of each sequence, a sequence capable of forming an RNA quadruplex structure was extracted under the following conditions.
Two or more consecutive G's were contained at 4 or more sites, the sequence between consecutive G's was within 14 mer, and the entire length was within 40 mer.
(3)PDGF-AA及びPDGF-BBは10 mM HEPES バッファー(pH7.0)に、VEGFAは10 mM 酢酸ナトリウムバッファー(pH6.0)に溶解し、アミンカップリング法によりセンサーチップCM5上に固定化した。その後、合成したオリゴヌクレオチドをPBS バッファー(Na2HPO4 8.1 mM, KH2PO4 1.47 mM, NaCl 137 mM, KCl 2.68 mM, pH7.4)中でフォールディングさせた(65℃5分の後25℃まで30分かけて冷却)。各オリゴヌクレオチドを種々の濃度に希釈し、センサーチップ上にインジェクションし、SPRシグナルの変化を観察した。添加時間120秒、解離時間120秒、流速30μl/minで行った。解離定数(Kd)は、Curve fitting解析によって算出した。 (3) PDGF-AA and PDGF-BB were dissolved in 10 mM HEPES buffer (pH 7.0), VEGFA was dissolved in 10 mM sodium acetate buffer (pH 6.0), and immobilized on the sensor chip CM5 by the amine coupling method. did. Then, the synthesized oligonucleotide was folded in PBS buffer (Na 2 HPO 4 8.1 mM, KH 2 PO 4 1.47 mM, NaCl 137 mM, KCl 2.68 mM, pH 7.4) (65° C. 5 minutes, then 25° C.). Until it cools down in 30 minutes). Each oligonucleotide was diluted to various concentrations and injected on a sensor chip to observe changes in SPR signal. The addition time was 120 seconds, the dissociation time was 120 seconds, and the flow rate was 30 μl/min. The dissociation constant (Kd) was calculated by Curve fitting analysis.
２．結果
(1)各遺伝子の転写されるRNA配列中から四重らせんRNA構造を形成しうる配列を探索したところ、VEGFA遺伝子からは159配列、PDGFA遺伝子からは247配列、PDGFB遺伝子からは194配列のRNAを抽出することができた。この内から下記の配列をそれぞれ選択し合成した(表５)。
2. result
(1) A search for sequences capable of forming a quadruplex RNA structure from the transcribed RNA sequence of each gene revealed that 159 sequences from the VEGFA gene, 247 sequences from the PDGFA gene, and 194 sequences from the PDGFB gene. Was able to be extracted. The following sequences were selected from these and synthesized (Table 5).
(2)VEGFAに対して各オリゴヌクレオチドが結合するかSPRにより解析したところ、すべての配列においてRNA濃度依存的なSPRシグナルの増加が観察され、これらがVEGFAに結合するRNAアプタマーであることが示された。VEGFA RNA1（配列番号２２）は約140 nM、VEGFA RNA2（配列番号２３）は約31 nM、 VEGFA RNA3（配列番号２４）は約300 nMの解離定数でそれぞれVEGFAに結合した。（図１０）。 (2) When each oligonucleotide binds to VEGFA or analyzed by SPR, RNA concentration-dependent increase in SPR signal was observed in all sequences, and these are RNA aptamers that bind to VEGFA. Was done. VEGFA RNA1 (SEQ ID NO: 22) bound to VEGFA with a dissociation constant of about 140 nM, VEGFA RNA2 (SEQ ID NO: 23) to about 31 nM, and VEGFA RNA3 (SEQ ID NO: 24) to about 300 nM. (FIG. 10).
(3)PDGF-AAに対して各オリゴヌクレオチドが結合するかSPRにより解析したところ、すべての配列においてRNA濃度依存的なSPRシグナルの増加が観察され、これらがPDGF-AAに結合するRNAアプタマーであることが示された。PDGFA RNA1（配列番号２５）は約29 nM、PDGFA RNA2（配列番号２６）は約30 nMの解離定数でそれぞれPDGFAに結合した。（図１１）。 (3) When each oligonucleotide binds to PDGF-AA was analyzed by SPR, an RNA concentration-dependent increase in SPR signal was observed in all sequences, and these are RNA aptamers that bind to PDGF-AA. It was shown to be. PDGFA RNA1 (SEQ ID NO:25) bound to PDGFA with a dissociation constant of about 29 nM and PDGFA RNA2 (SEQ ID NO:26) to about 30 nM, respectively. (FIG. 11).
(4)PDGF-BBに対して各オリゴヌクレオチドが結合するかSPRにより解析したところ、すべての配列においてRNA濃度依存的なSPRシグナルの増加が観察され、これらがPDGF-BBに結合するRNAアプタマーであることが示された。PDGFB RNA1（配列番号２７）は約42 nM、PDGFB RNA2（配列番号２８）は約30 nM、PDGFB RNA3（配列番号２９）は約59 nM、PDGFB RNA4（配列番号３０）は約35 nM、PDGFB RNA5（配列番号３１）は約34 nMの解離定数でそれぞれPDGFAに結合した（図１２）。 (4) When each oligonucleotide bound to PDGF-BB was analyzed by SPR, RNA concentration-dependent increase in SPR signal was observed in all sequences, and these were RNA aptamers that bound to PDGF-BB. It was shown to be. PDGFB RNA1 (SEQ ID NO: 27) is about 42 nM, PDGFB RNA2 (SEQ ID NO: 28) is about 30 nM, PDGFB RNA3 (SEQ ID NO: 29) is about 59 nM, PDGFB RNA4 (SEQ ID NO: 30) is about 35 nM, PDGFB RNA5 (SEQ ID NO: 31) each bound PDGFA with a dissociation constant of approximately 34 nM (FIG. 12).
実施例１１
1. 標的タンパク質遺伝子のプロモーター領域におけるG4形成予測配列の探索
ヘパリン結合ドメインを持つタンパク質であるApoE4をコードする遺伝子の転写開始点から±1 kbpの配列をGenome Browser (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway)を用いて抽出した。抽出した配列中からQGRS Mapper (http://bioinformatics.ramapo.edu/QGRS/index.php) を用いて以下の条件を満たす配列を探索した。
(i)全長30 mer 以内 (ii) 2連続以上のGを7 mer 以内の間隔で含んでいる
なお得られた配列をApoE4に対するアプタマー候補配列とした。
Example 11
1. Search for G4 formation predictive sequence in the promoter region of the target protein gene A sequence of ±1 kbp from the transcription start point of the gene encoding ApoE4, which is a protein having a heparin-binding domain, is Genome Browser (http://genome.ucsc. edu/cgi-bin/hgGateway). From the extracted sequences, we searched for sequences satisfying the following conditions using QGRS Mapper (http://bioinformatics.ramapo.edu/QGRS/index.php).
(i) Total length of 30 mer or less (ii) The obtained sequence containing two or more consecutive G's at intervals of 7 mer or less was used as an aptamer candidate sequence for ApoE4.
２. 表面プラズモン共鳴(SPR)測定によるアプタマー候補配列と標的タンパク質の結合評価
ApoE4を10 mM 酢酸 buffer (pH 4.0) を用いて希釈し、アミンカップリング法によりセンサーチップCM4上に約900 RU固定化した。その後、TBS buffer(10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 100 mM KCl, pH 7.4)中でフォールディングを行ったアプタマー候補配列(Table.)を種々の濃度に希釈し、センサーチップに添加した際のSPRシグナルの変化を測定した。測定後、カーブフィッティングにより解離定数(Kd)を算出した。
2. Evaluation of binding between aptamer candidate sequence and target protein by surface plasmon resonance (SPR) measurement
ApoE4 was diluted with 10 mM acetic acid buffer (pH 4.0), and about 900 RU was immobilized on the sensor chip CM4 by the amine coupling method. After that, the aptamer candidate sequences (Table.) folded in TBS buffer (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 100 mM KCl, pH 7.4) were diluted to various concentrations and added to the sensor chip. The change in SPR signal was measured. After the measurement, the dissociation constant (K d ) was calculated by curve fitting.
結果及び考察
1. ApoE4をコードする遺伝子のプロモーター領域から、G4構造を形成する可能性を持つ配列が8本得られた(ApoE4_1〜8と命名)。これらのうち、ApoE4_1（配列番号５６）においてDNA濃度依存的なSPRシグナルの上昇が観察された。これよりApoE4_1はApoE4に結合していると考えられる。カーブフィッティングにより解離定数を算出したところ、60 nMであった。
Results and discussion
1. From the promoter region of the gene encoding ApoE4, 8 sequences that could form G4 structure were obtained (named ApoE4_1-8). Among these, in ApoE4_1 (SEQ ID NO: 56), a DNA concentration-dependent increase in SPR signal was observed. From this, it is considered that ApoE4_1 is bound to ApoE4. When the dissociation constant was calculated by curve fitting, it was 60 nM.
実施例１２
獲得した3つのHGFアプタマーを、HGFap1, HGFap2, HGFap3、2つのHBEGFアプタマーをHBEGFap1, HBEGFap2と呼称する。またHGFアプタマーのin silico maturationにおいて、評価した配列のHGFに対する結合特異性(Sp(HGF))は、Sp(HGF)=[HGFを標的とした場合の結合定数Ka]／[HBEGFを標的とした場合の結合定数Ka] (Sp(HGF) =Ka(HGF) / Ka(HBEGF))と定義した。
Example 12
The obtained three HGF aptamers are called HGFap1, HGFap2, HGFap3, and the two HBEGF aptamers are called HBEGFap1 and HBEGFap2. Also, in in silico maturation of HGF aptamer, the binding specificity (Sp (HGF) ) of the evaluated sequence to HGF is Sp (HGF) = [binding constant K a when HGF is targeted]/[HBEGF is targeted to In this case, the binding constant K a ] (Sp (HGF) =K a (HGF) / K a (HBEGF) ) was defined.
第1世代配列の作製と特異性評価
まず第1世代親配列であるHGFap1, HGFap2, HGFap3についてSp(HGF)を求め、Sp(HGF)の値の比に基づいて各配列を複製し、合計20本の配列を作製した。続いて20本の配列の中でランダムに2本ずつ組を作り、任意の1点で交叉(crossover)させた。その後各20本の配列に10%の突然変異を位置、塩基の種類ともにランダムに導入し、第1世代配列とした(1R01〜1R20)。1R01〜1R20の塩基配列を、この順に配列番号５８〜７７に示す。
Generation of first generation sequence and evaluation of specificity First, Sp (HGF) was obtained for HGFap1, HGFap2, and HGFap3 that are first generation parent sequences, and each sequence was duplicated based on the ratio of Sp (HGF) values, and a total of 20 An array of books was created. Then, two pairs were randomly formed in the 20 sequences and crossed at any one point. After that, 10% mutations were randomly introduced into each of the 20 sequences with respect to both the position and the type of the bases to make the first generation sequences (1R01 to 1R20). The base sequences of 1R01 to 1R20 are shown in SEQ ID NOs: 58 to 77 in this order.
HGF及びHBEGFをPBS buffer (Na2HPO4 8.1 mM, KH2PO4 1.47 mM, NaCl 137 mM, KCl 2.68 mM, pH7.4)を用いて、アミンカップリング法によりセンサーチップCM5上に固定化した。タンパク質の希釈bufferとして、HGFには10 mM HEPES buffer (pH6.5)を、HBEGFには10 mM 酢酸buffer (pH5.0)を用いた。その後、TBS buffer (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 100 mM KCl)中でフォールディングを行った各第1世代配列を、TBS bufferを用いて種々の濃度(f.c. 1000 nM, 500 nM, 100 nM, 50 nM, 0 nM)に希釈し、HGFまたはHBEGFを固定化したセンサーチップに添加した際のSPRシグナルの変化を測定した。相互作用測定時のRunning bufferにはTBS bufferを使用し、添加時間120秒、解離時間200秒、流速30μL/minで測定を行った。測定後カーブフィッティングによってKa(HGF)及びKa(HBEGF)を求め、Sp(HGF)を算出した。 HGF and HBEGF were immobilized on the sensor chip CM5 by the amine coupling method using PBS buffer (Na 2 HPO 4 8.1 mM, KH 2 PO 4 1.47 mM, NaCl 137 mM, KCl 2.68 mM, pH 7.4). .. As a protein dilution buffer, 10 mM HEPES buffer (pH 6.5) was used for HGF and 10 mM acetic acid buffer (pH 5.0) was used for HBEGF. After that, each first-generation sequence folded in TBS buffer (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 100 mM KCl) was subjected to various concentrations (fc 1000 nM, 500 nM, 100 nM using TBS buffer). , 50 nM, 0 nM), and the change of SPR signal when HGF or HBEGF was added to the immobilized sensor chip was measured. TBS buffer was used as a running buffer at the time of interaction measurement, and the measurement was performed at an addition time of 120 seconds, a dissociation time of 200 seconds, and a flow rate of 30 μL/min. After the measurement, Ka (HGF) and Ka(HBEGF) were obtained by curve fitting, and Sp (HGF) was calculated.
第2世代配列の作製と特異性評価
第1世代配列から(i)親配列のSp(HGF) (最低値: 1.9)を下回る配列、(ii)Ka(HGF)が親配列のKa(HGF) (最低値: 9.1E+06)の1/10以下である配列を除外し、残りの配列を第2世代配列作製のための親配列とした。得られた第2世代親配列について、第1世代親配列と同様に複製、交叉、変異導入を行い第2世代配列を得た(2R01〜2R20)。2R01〜2R20の塩基配列を、この順に配列番号７８〜９７に示す。HGF及びHBEGFに対する結合の評価とSp(HGF)の算出は、第1世代配列と同様に行った。
Generation of second-generation sequence and specificity evaluation From the first-generation sequence (i) a sequence below Sp (HGF) (minimum value: 1.9) of the parent sequence, (ii) Ka (HGF) is the parent sequence Ka ( HGF) (minimum value: 9.1E+06), which was 1/10 or less of the sequence was excluded, and the remaining sequence was used as a parent sequence for preparing the second generation sequence. The obtained second generation parent sequence was duplicated, crossed over, and mutated in the same manner as the first generation parent sequence to obtain the second generation sequence (2R01 to 2R20). The base sequences of 2R01 to 2R20 are shown in SEQ ID NOs: 78 to 97 in this order. Evaluation of binding to HGF and HBEGF and calculation of Sp (HGF) were performed in the same manner as in the first generation sequence.
第3世代モチーフ固定配列の作製と特異性評価
第1世代配列及び第2世代配列を、高いSp(HGF)を持つ配列グループ、低いSp(HGF)を持つ配列グループ、HGF及びHBEGFに結合しなかった配列グループに分類し配列を比較したところ、高いSp(HGF)を持つ配列グループの多くの配列がGGTGGAGGGGという配列モチーフを共通して持っていた。そこで第1世代配列及び第2世代配列の中の、GGTGGAGGGG配列モチーフを有する配列で高いSp(HGF)を持つもの(1R01, 1R05, 1R08, 1R09, 2R07)を、第3世代モチーフ固定配列作製のための親配列とした。得られた第3世代モチーフ固定親配列について、第1世代親配列及び第2世代親配列と同様に複製、交叉、変異導入を行い、第3世代モチーフ固定配列を得た(3R01mfix〜3R20mfix)。3R01mfix〜3R20mfixの塩基配列を、この順に配列番号９８〜１１７に示す。HGF及びHBEGFに対する結合の評価とSp(HGF)の算出は、第1世代配列及び第2世代配列と同様に行った。
Generation of 3rd generation motif fixed sequence and evaluation of specificity The 1st generation sequence and 2nd generation sequence do not bind to the sequence group with high Sp (HGF) , the sequence group with low Sp (HGF) , HGF and HBEGF When the sequences were classified into different sequence groups and the sequences were compared, many sequences in the sequence group having high Sp (HGF) had a sequence motif GGTGGAGGGG in common. Therefore, among the first-generation sequence and the second-generation sequence, those having a high Sp (HGF) in the sequence having the GGTGGAGGGG sequence motif (1R01, 1R05, 1R08, 1R09, 2R07) were prepared as a third-generation motif fixed sequence. For the parent sequence. The obtained 3rd generation motif-fixed parent sequence was subjected to replication, crossover and mutation introduction in the same manner as the 1st generation parent sequence and the 2nd generation parent sequence to obtain a 3rd generation motif fixed sequence (3R01mfix to 3R20mfix). The nucleotide sequences of 3R01mfix to 3R20mfix are shown in SEQ ID NOs: 98 to 117 in this order. Evaluation of binding to HGF and HBEGF and calculation of Sp (HGF) were performed in the same manner as for the first generation sequence and the second generation sequence.
結果及び考察
第1世代配列において、親配列と比較して高いSp(HGF)の値を持つ配列が複数得られた(表６)。第2世代配列において、親配列のSp(HGF) (最低値: 1.9)のおよそ13倍のSp(HGF)を示す特異性の高い配列が得られた(表７、2R07)。さらに第3世代モチーフ固定配列においては、親配列のSp(HGF)のおよそ50倍のSp(HGF)を示す配列(3R02mfix)、また親配列のSp(HGF)のおよそ240倍のSp(HGF)を示す配列(3R14mfix)が得られた(表８)。これより、コンピューター内進化法によって本発明の方法で獲得されたHGFアプタマーの特異性を向上させることができた。
Results and Discussion In the 1st generation sequence, a plurality of sequences having a higher Sp (HGF) value compared to the parent sequence were obtained (Table 6). In the second generation sequence, a highly specific sequence was obtained, which shows Sp (HGF) approximately 13 times that of the parent sequence Sp (HGF) (minimum value: 1.9) (Table 7, 2R07). In a further third generation motif fixed sequence, the parent sequence Sp (HGF) approximately 50 times the Sp (HGF) sequences showing the (3R02mfix), also approximately 240 times the Sp of the parent sequence Sp (HGF) (HGF) A sequence (3R14mfix) having the following sequence was obtained (Table 8). From this, it was possible to improve the specificity of the HGF aptamer obtained by the method of the present invention by the in-computer evolution method.
Kd(HBEGF)：HBEGFに対する解離定数
Ka(HGF)：HGFに対する結合定数
Ka(HBEGF)：HBEGFに対する結合定数
Sp(HGF)：HGFに対する結合定数をHBEGFに対する結合定数で割った値（Ka(HGF) /Ka(HBEGF)）
K d(HBEGF) : Dissociation constant for HBEGF
Ka(HGF) : Coupling constant for HGF
Ka(HBEGF) : HBEGF binding constant
Sp (HGF) : Value obtained by dividing the binding constant for HGF by the binding constant for HBEGF (Ka (HGF) / Ka(HBEGF) ).
Kd(HBEGF)：HBEGFに対する解離定数
Ka(HGF)：HGFに対する結合定数
Ka(HBEGF)：HBEGFに対する結合定数
Sp(HGF)：HGFに対する結合定数をHBEGFに対する結合定数で割った値（Ka(HGF) /Ka(HBEGF)）
K d(HBEGF) : Dissociation constant for HBEGF
Ka(HGF) : Coupling constant for HGF
Ka(HBEGF) : HBEGF binding constant
Sp (HGF) : Value obtained by dividing the binding constant for HGF by the binding constant for HBEGF (Ka (HGF) / Ka(HBEGF) ).
Kd(HBEGF)：HBEGFに対する解離定数
Ka(HGF)：HGFに対する結合定数
Ka(HBEGF)：HBEGFに対する結合定数
Sp(HGF)：HGFに対する結合定数をHBEGFに対する結合定数で割った値（Ka(HGF) /Ka(HBEGF)）
K d(HBEGF) : Dissociation constant for HBEGF
Ka(HGF) : Coupling constant for HGF
Ka(HBEGF) : HBEGF binding constant
Sp (HGF) : Value obtained by dividing the binding constant for HGF by the binding constant for HBEGF (Ka (HGF) / Ka(HBEGF) ).
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