JP6702326B2 - 環境応答性色素集積ナノ粒子および細胞内環境分析方法 - Google Patents

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Description

本発明は、環境応答性色素集積ナノ粒子、これを用いた細胞内環境分析方法に関する。
医学的診断の１つとして、病理診断が行われている。病理診断では、免疫染色と呼ばれる、標本の分子情報の発現を確認するための分子標的染色を施し、遺伝子やタンパクの発現異常といった機能異常を診断する免疫観察が行われている。かかる病理診断の一つとして、細胞自体をみて、異常細胞等を検出することにより、病変の有無や病変部の病理学的診断や臨床診断を求める細胞診・細胞診断が行われている。
細胞内には、核の他に、細胞質基質内には、リボソーム、小胞体、ゴルジ体、ミトコンドリア、リソソームなどの細胞小器官が存在している。細胞内ではこれら小器官に応じて、局所に特有の環境が存在していると考えられる。このような細胞内環境を把握できれば、細胞自体の病変の感知や、さらに細胞診断への応用・精度向上にも高く期待できる。
しかしながら、このような細胞内環境について評価しうる手段が全く提案されていない。
なお、特許文献1（特許第4444363号公報）には、蛍光色素分子や吸光色素を含有する積層構造シリカナノ粒子および該シリカナノ粒子を用いた標識試薬について開示されている。特許文献１では、積層構造により、機能性分子のシリカ粒子への取り込み効率を向上させて、シリカナノ粒子から機能性分子が脱離すること抑制することが開示されている。
また、特許文献２（特表2010-508295号公報）には新規なpH応答性蛍光色素が開示されている。かかる、特許文献２にはpH応答性蛍光色素を担体分子であるポリマー微小粒子に共有結合させたものが開示されている。
なお、特許文献１は、極微量標的物質の高感度定量分析に関するものであり、特許文献２は食作用の検出を目的とするものである。
特許第4444363号公報 特表2010-508295号公報
特許文献1を参考にpH応答性色素含有シリカナノ粒子を、特許文献2を参考にpH応答性色素結合ポリスチレン粒子を合成し、培養細胞内部のpH測定を試みたところ、いずれの粒子を用いた場合も蛍光が観測される領域は、ミクロンサイズであり、粒子サイズにくらべ大きいものであった。また、蛍光強度が弱いため、ナノサイズの領域（1粒子レベルの大きさ）の観測はできず、ことに細胞内の環境を分析できなかった。
このような状況のもと、本発明者らはナノサイズの領域（1粒子レベルの大きさ）の観測可能な新規環境応答性色素集積ナノ粒子を開発した。
本発明の構成は以下の通りである。
［１］熱硬化性樹脂粒子の表面または内部に環境応答性色素を集積してなる平均粒径30〜800ｎｍのナノ粒子であり、
前記環境応答性色素の集積量が200〜10,000,000分子／粒子であることを特徴とする環境応答性色素集積ナノ粒子。
［２］前記環境応答性色素が、ｐＨまたはＣaイオンに対し蛍光強度依存性を有するものであることを特徴とする［１］に記載の環境応答性色素集積ナノ粒子。
［３］前記熱硬化性樹脂がメラミン樹脂である、［１］または［２］に記載の環境応答性色素集積ナノ粒子。
［４］表面が、さらにポリエチレングリコールで修飾されてなることを特徴とする［１］〜［３］のいずれかに記載の環境応答性色素集積ナノ粒子。
［５］［１］〜［４］のいずれかに記載の環境応答性色素集積ナノ粒子を含む、細胞内環境分析用試薬。
［６］［１］〜［４］のいずれかに記載の環境応答性色素集積ナノ粒子を細胞内に取り込ませ細胞内を評価する、細胞内環境分析方法。
本発明によれば、ｐＨなどの細胞内環境を、個々の細胞について把握できる。このため、細胞自体の病変の感知や、さらに細胞診断への応用・精度向上にも高く期待できる。
以下、本発明の実施形態を説明するが、本発明はこれらに何ら限定的に解釈されるものではない。
《環境応答性色素集積ナノ粒子》
本発明に係る環境応答性色素集積ナノ粒子は、母体とする熱硬化性樹脂粒子の表面または内部に環境応答性色素を集積してなる。なお、「色素集積ナノ粒子」は、色素の分子が、化学結合、電気的な引力、物理的な包含、吸着、その他により、母体とする樹脂粒子に集積されたものである。
熱硬化性樹脂粒子
ナノ粒子を形成する熱硬化性樹脂としては、例えば、ポリスチレン、ポリアミド、ポリ乳酸、ポリアクリロニトリル、ポリグリシジルメタクリレート、ポリメラミン、ポリウレア、ポリベンゾグアナミン、ポリフラン、ポリキシレン、フェノール樹脂等が挙げられる。粒子を形成する熱硬化性樹脂は、環境応答性色素を安定的に内包できる樹脂であれば特に制限はないが、メラミン樹脂が好ましい。メラミン樹脂は色素を共有結合あるいは静電結合で集積できるので集積性に優れる。特に静電結合の場合は色素同士の反発が生じる事で色素の凝集を防ぎ量子収率を向上できる。
環境応答性色素集積ナノ粒子の平均粒径、すなわち、母体とする熱硬化性樹脂粒子の平均粒径は、30〜800ｎｍであり、好ましくは50〜500ｎｍの範囲にある。通常、体細胞の大きさは、数十μｍ〜数百μｍの範囲にあるため、前記範囲の平均粒径であれば、細胞内にナノ粒子をその環境を識別可能な量で取り込ませることが可能となる。また、粒径のばらつきを示す変動係数も特に限定されないが、通常は２０％以下であり、好ましくは５〜１５％である。なお、ナノ粒子の平均粒径が前記範囲よりも小さいと、色素の集積量が少なくなるため、発光が不十分となることがあり、また、前記範囲よりも大きいと、細胞や細胞小器官に比べて、粒子が大きすぎるため、微細な環境変化を判断できない場合がある。
なお、環境応答性色素集積ナノ粒子の粒径は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて電子顕微鏡写真を撮影し、環境応答性色素集積ナノ粒子の断面積を計測し、その計測値を相当する円の面積としたときの直径（面積円相当径）として測定することができる。環境応答性色素集積ナノ粒子の集団の粒子サイズの平均（平均粒径）および変動係数は、十分な数（たとえば１０００個）の環境応答性色素集積ナノ粒子について上記のようにして粒子サイズ（粒径）を測定した後、平均粒径はその算術平均として算出され、変動係数は式：１００×粒径の標準偏差／平均粒径、により算出される。
環境応答性色素
環境応答性色素とは、ｐＨ、金属イオン、ガス濃度、温度、圧力などまわりの環境の変化により、蛍光を発するかあるいは蛍光の強度が影響をうける色素である。環境応答性色素を含む１個のナノ粒子から蛍光が発光される。このうち本発明ではｐＨ、またはＣａイオンに対して応答性のある色素が細胞内の環境を判断する上で望ましい。
このような環境応答性色素としては、特表２００３−５０１５４０号公報、特表２０１０−５０８２９５号公報に記載のものを使用できる。
特表２０１０−５０８２９５号公報に記載の色素は、たとえば、以下の式Ａを有し、Ｒ1およびＲ2がヒドロキシでもなく、チオールでもなく、かつそれらのいずれの脱プロトン化形態でもないことを特徴とする、化合物である：
Figure 0006702326
式中、 Ｒ1−Ｒ6は、水素であるか、または電子吸引性基以外の置換基であり、かつ
Ｘはフルオロフォアであるか、あるいは
Ｒ1およびＲ3−Ｒ6は、水素であるか、または電子吸引性基以外の置換基であり、かつＸおよびＲ2は一緒になって、位置ＸとＲ2との間で式Ａのベンゼン環に縮合した５員もしくは６員の複素環式環を含む部分を形成する。
なお、「フルオロフォア」とは、生来的に蛍光性であるか、またはプロトン化、生物学的化合物または金属イオンへの結合、もしくは酵素による代謝の際に蛍光の変化を示す組成物を指す。好ましいフルオロフォアとしては、キサンテン、インドール、ボラポリアザインダセン、フラン、およびベンゾフランなどが挙げられる。
式Ａで表される具体的な色素化合物としては特表２０１０−５０８２９５号公報に開示された通りである。これらの色素はＣａイオン応答性がある。
また、特表２００３−５０１５４０号公報に記載の色素は、たとえば下記式（Ｉ）で表される。
Figure 0006702326
[式中、Ｘ及びＹは、＞Ｃ（Ｃ1−Ｃ4アルキル）2、硫黄及び酸素から個別に選択され；Ｒ1及びＲ2は、Ｈ、ＣＨ2ＮＨ2、ＳＯ3 -、ホスフェート、ホスホネート、第四級アンモニウム、ＮＯ2、（ＣＨ2）qＣＯＯＨ、ＮＣＳ、ＣＨ2ＮＨ-ＣＯＲ7から個別に選択され、ここではＲ7は、Ｃ1−Ｃ20直鎖状もしくは分枝状アルキル及び-（ＣＨ2）q-ＣＯＯＨであり、ここではｑは、０乃至１０の整数であり；Ｒ3は、Ｈまたは-Ｌ-Ｐであり、ここではＬは、アルケニル、アルキニル、及びアリールから選択される、０、１、または２の不飽和基を任意に含むＣ1−Ｃ20直鎖状もしくは分枝状アルキルから選択され、Ｐは、反応性基、Ｈ、Ｃ1−Ｃ20直鎖状もしくは分枝状アルキル、ＳＯ3 -、ＮＨ2、第四級アンモニウム、ＣＨ2ＮＨ-ＣＯＲ8から選択され、ここではＲ8は、Ｃ1−Ｃ20直鎖状もしくは分枝状アルキル、-（ＣＨ2）m-ＣＯＯＨ、ＮＨＲ9であり、ここではＲ9は、Ｃ1−Ｃ20直鎖状もしくは分枝状アルキル、またはＣＯＯＨであり；ｎは０乃至３の整数であり；ｐ及びｑは個別に０、１、２、３、または４であって、ｐ及び／またはｒが１より大である場合には、各Ｒ1及び各Ｒ2は相違しても良く、ｍは１乃至１０の整数である]
式（Ｉ）で表される具体的な色素化合物としては特表２００３−５０１５４０号公報に開示された通りである。これらの色素はｐＨ応答性がある。
これらの環境応答性色素として、より具体的には、ライフテクノロジーズ社製 fluo-3、ＧＥ・ヘルスケア・ジャパン社製 CypHer5E NHS esterなどが挙げられる。
また、環境応答性色素は２種以上併用してもよく、公知の他の蛍光体色素（たとえば、特開2015-59806号公報、特開2015-93878号公報、特開2015-108572号公報などに開示された色素）と併用してもよい。
前記環境応答性色素の集積量は、200〜10,000,000分子／粒子であり、好ましくは1500〜2,000,000分子／粒子の範囲である。色素の集積量がこの範囲であれば、色素集積ナノ粒子から発せられる発光の強度が高く、周囲環境に応じて発した蛍光を検出器で充分感知できる。
なお、環境応答性色素を直接細胞内に注入することも可能であるが、この場合、細胞内に均一に色素が分散するので、細胞内の微小な環境を評価できない。また、熱可塑性樹脂では、色素を粒子内部に集積することが難しいためか、粒子内部の色素が漏れて、局所の環境を評価できないことがある。また、シリカなどの無機系粒子では、所定量の色素を集積させたナノ粒子を得ることは困難である。このように、これらの粒子では、必ずしも色素の集積を充分でないため、目的とする細胞内局所の環境を詳細に評価できない。
環境応答性色素集積ナノ粒子の製造方法
上述した本発明の環境応答性色素集積ナノ粒子は、蛍光標識として環境応答性機能が損なわれない限り、特に製造方法に限定はない。
たとえば、上記熱硬化性樹脂の原料となる樹脂原料を、環境応答性色素の存在下で重合させて、色素が集積された樹脂製ナノ粒子を製造することが可能である。
用いることができる樹脂原料は、上記熱硬化性樹脂に対応するモノマーであっても良く、あるいは、そのようなモノマーから得られるプレポリマーであっても良い。
例えば、熱硬化性樹脂としてメラミン樹脂が用いられる場合、上記環境応答性色素とメラミン樹脂との混合液にギ酸を加えて重縮合反応させることにより、環境応答性色素が集積されたメラミン樹脂粒子を得ることができる。このときの反応は、例えば、水中で行うことができる。また、必要に応じて、適当な界面活性剤存在下で重合反応を行ってもよい。さらに、メラミン樹脂等の熱硬化性樹脂の重縮合反応を促進するとともに、当該樹脂または環境応答性色素に含まれるアミノ基のような官能基にプロトン（Ｈ+）を付与して荷電させ、静電的相互作用を起こしやすくすることを目的として、上記環境応答性色素とメラミン樹脂との混合液に対し、適当な酸などの重合反応促進剤をさらに添加しても良い。
界面活性剤としては、従来周知の種々の界面活性剤を使用でき、陰イオン、非イオン、陽イオン、両性界面活性剤が含まれる。なかでも第四級アンモニウム塩系である、テトラブチルアンモニウムクロリド、ブロミド又はヘキサフルオロホスフェート、テトラオクチルアンモニウムブロミド（ＴＯＡＢ）、またはトリブチルヘキサデシルホスホニウムブロミドが好ましい。特に、テトラオクチルアンモニウムブロミドが好ましい。
なお、液相法による反応は、液中の溶媒を含む化合物の状態により大きく変化する。単分散性の優れたナノサイズの粒子を製造する際には、特に注意を要する必要がある。例えば、逆ミセル反応法では、界面活性剤の濃度や種類により、反応場となる逆ミセルの大きさや状態が変わってくるため、ナノ粒子が形成される条件が限られてしまう。したがって、適切な界面活性剤と溶媒との組み合わせが必要となる。
重合反応の条件（温度、時間等）は、樹脂の種類、原料混合物の組成などを考慮しながら適切に設定することができる。メラミン樹脂等の熱硬化性樹脂の合成については、反応温度は通常６０〜２００℃、反応時間は通常２０〜１２０分間である。なお、反応温度は蛍光色素の性能が低下しない温度（耐熱温度範囲内）とすることが適切である。加熱は複数の段階に分けて行ってもよく、たとえば、相対的に低温で一定時間反応させた後、昇温して相対的に高温で一定時間反応させるようにしてもよい。
重合反応の終了後は、反応液から余剰の樹脂原料、環境応答性色素、界面活性剤等の不純物を除去し、生成し粒子を回収して精製すればよい。たとえば、反応液を遠心分離にかけ、不純物が含まれている上澄みを除去した後、超純水を加えて超音波照射して再度分散させて洗浄する。これらの操作は、上澄みに樹脂や色素に由来する吸光、蛍光が見られなくなるまで複数回繰り返し行うことが好ましい。
（平均粒径の調節）
乳化重合法により色素粒子の合成を行う場合、反応系では、界面活性剤により外側が水相で内側が油相のミセルが形成され、該ミセルの内側の油相に上記樹脂を構成するモノマーが包含された状態となり、このミセル内側で重合反応が行われることとなる。
例えば、この色素粒子の合成の際に、樹脂原料に対し、１０〜６０重量％の範囲で乳化作用を有する界面活性剤を加える事で、任意の粒子径を得る事ができ、例えば、３０ｎｍ〜３００ｎｍの粒子を作製できる。また、界面活性剤の割合を増やすと更に小さい粒子も作製可能で３０ｎｍ以下とすることができる。あるいは、界面活性剤の割合を減らすと更に大きい粒子も作製可能で３００ｎｍ以上の粒子も作製可能である。また、使用する界面活性剤の量が一定である場合、色素粒子の製造に使用する樹脂原料と蛍光体の反応系全体に対する各割合を変更することによっても、色素粒子の平均粒径の調節が可能である。
（表面修飾）
本発明では、得られた環境応答性色素集積ナノ粒子を、そのまま用いてもよいが、本発明の環境応答性色素集積ナノ粒子には、所要に応じて表面修飾を行うことができる。
ここで、本発明において行いうる表面修飾は、特に限定はされないが、他の分子と結合を形成可能な官能基の導入の形で行われることが好ましい。
ここで、「他の分子と結合を形成可能な官能基」として、生化学の分野において一般的に用いられる官能基が挙げられ、そのような官能基の具体例として、水酸基、アミノ基、カルボキシル基、チオール基、マレイミド基、アルデヒド基などが挙げられる。なお、本明細書における以下の記載において、「他の分子と結合を形成可能な官能基」は、「反応性官能基」とも呼ばれる場合がある。
具体的には、ナノ粒子の表面をポリエチレングリコール鎖で覆うことにより、細胞への取り込み性に優れる環境応答性色素集積ナノ粒子が提供できる。
ポリエチレングリコール鎖で覆うことができるポリエチレングリコール類としては、ポリエチレングリコール鎖を有する化合物であれば特に限定されないが、具体例としては、ＨＳ−Ｃ2Ｈ4（ＯＣＨ2ＣＨ2）n−ＯＣＨ3、ＮＨ2−Ｃ2Ｈ4−（ＯＣＨ2ＣＨ2）n−ＯＣＨ3、Ｃ（＝Ｏ）Ｈ−Ｃ2Ｈ4−（ＯＣＨ2ＣＨ2）n−ＯＣＨ3、ＮＨ2−Ｃ2Ｈ4−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ−スクシンイミド、マレイミド−（ＣＨ2）2Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＣ3Ｈ6−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ−スクシンイミド、ＨＯ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−ＣＨ2ＣＨ2Ｃ（＝Ｏ）Ｈ、ＨＯ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−Ｃ3Ｈ6ＮＨ2、Ｈ2Ｎ（ＣＨ2）30（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n（ＣＨ2）5Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、ビオチン−（ＣＨ2）4Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＣ3Ｈ6（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ−スクシンイミド等のポリエチレングリコール類を挙げることができる。
ポリエチレングリコール鎖と環境応答性色素集積ナノ粒子との結合は、半導体ナノ粒子にポリエチレングリコール類を直接結合させてもよいが、シランカップリング剤などの有機物質を介して結合させてもよい。有機物質は、ポリエチレングリコール鎖がその末端にカルボキシ基を持つ場合、カルボキシ基に結合可能な官能基を有する化合物であり、この官能基としては、アミノ基、メルカプト基、ヒドロキシ基などが挙げられる。また、ポリエチレングリコール鎖がその末端にアミノ基を持つ場合、有機物質の官能基はカルボキシル基などである。好ましいカップリング剤は、例えば、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）のようなアミノトリアルコキシシランである。
〔環境応答性色素集積ナノ粒子の用途〕
本発明にかかる環境応答性色素集積ナノ粒子は細胞内環境分析用試薬として用いることができ、かかる環境応答性色素集積ナノ粒子を細胞内に取り込ませ細胞内を評価する細胞内環境分析方法に採用することができる。
細胞内環境としては、前記したように、ｐＨ、イオン濃度、ガス濃度、圧力などが挙げられ、調査対象の環境に応じて色素が選択される。
前記分析方法においては、培養細胞の培養液に、環境応答性色素集積ナノ粒子を添加し、培養することで、細胞内に、環境応答性色素集積ナノ粒子が取り込まれる。なお、細胞内へナノ粒子が取りこまれやすくするために、界面活性剤を添加してもよい。所定時間の培養後、蛍光顕微鏡で培養細胞を観察し、各粒子に由来する蛍光強度を観察する。各粒子の蛍光強度と予め作成しておいた検量線とから、細胞内で、環境の違いを評価できる。
［実施例］
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
［実施例１］
Caイオン応答性色素を集積したメラミン樹脂ナノ粒子
Ｃａイオン応答性色素としてライフテクノロジーズ社製fluo-3 １ｍｇを水１ｍＬに加えて溶解した。その後、この溶液に乳化重合用乳化剤のエマルジョン（登録商標）４３０（ポリオキシエチレンオレイルエーテル、花王社製）の５％水溶液を２ｍＬ加えた。この溶液をホットスターラー上で撹拌しながら７０℃まで昇温させた後、この溶液にメラミン樹脂原料ニカラックＭＸ−０３５（日本カーバイド工業社製）を０．８ｇ加えた。
さらに、この溶液に界面活性剤としてドデシルベンゼンスルホン酸（関東化学社製）の１０％水溶液を２００μＬ加え、７０℃で５０分間加熱撹拌した。その後、９０℃に昇温して２０分間加熱撹拌した。得られた粒子分散液から、余剰の樹脂原料や色素等の不純物を除くため、純水による洗浄を行った。 洗浄は、遠心分離機（クボタ社製マイクロ冷却遠心機３７４０）にて２００００Ｇで１５分間、遠心分離し、上澄み除去後、超純水を加えて超音波照射して再分散した。遠心分離、上澄み除去および超純水への再分散による洗浄を５回繰り返した。得られた色素集積ナノ粒子の平均粒径は２００ｎｍであった。
得られた色素集積ナノ粒子に、エチレングリコール（Methyl-PEG12-NHS Ester東京化成）を０．１ｍｏｌ／Ｌとなるように添加し、１２時間反応させた。
［比較例１］
１４質量％のアンモニア水をさらにエタノールで５倍に希釈しアンモニア水含有溶媒１００ｍＬとし、その中に０．５体積％となる体積５００μＬのＴＥＯＳ（オルトケイ酸テトラエチル）を、前記ＴＥＯＳと同体積の実施例１で使用した環境応答性色素ライフテクノロジーズ社製fluo-3 １ｍｇを水１ｍＬに加えて溶解したもの）ＤＭＦ溶液を、それぞれ、添加して室温（２５℃）にて撹拌した。
撹拌１時間ほどでシリカコロイドの生成はほぼ完了し、さらに反応開始から５時間経過させて、fluo-3をシリカ粒子内に取り込ませた。
得られたシリカ粒子分散液に、さらに、ＴＥＯＳを追加投入し室温５時間反応させ、１層のシリカ層を有するシリカナノ粒子を得た。ＴＥＯＳの追加投入量は、最初に添加したＴＥＯＳの投入量の５０％分とした。
上記で得られたシリカナノ粒子分散液を、３０分間遠心分離（５０００×ｇ）し、粒子を沈降させた後、直ちに上清液を除去した。得られた沈殿物をエタノールに再分散させ、再度遠心分離（５０００×ｇ）を３０分行い、粒子を沈降させた。同様のエタノール洗浄操作をさらに１回繰り返し、未反応のＴＥＯＳ等を除去した。さらにエタノールの代わりに蒸留水を用いた以外は同様な洗浄操作を４回行い、遊離色素等を除去した。得られた色素集積シリカナノ粒子の平均粒径は２００ｎｍであった。調製した色素集積シリカナノ粒子も、実施例１と同様に表面をポリエチレングリコール修飾した。
［比較例２］
ポリスチレン粒子は市販品（メルク社製）を使用した。このポリスチレン粒子の平均粒子径は２００ｎｍであり、表面官能基はアミノ基である。
ポリスチレン粒子をメタノール１０ｍＬに分散させたところに、ライフテクノロジーズ社製fluo-3 １ｍｇをジクロロメタン1ｍＬに加えて溶解したもの添加し、３時間攪拌した。減圧下、ジクロロメタンを溜去した。遠心分離を３０分行い、粒子を沈降させた後、直ちに上清液を除去した。得られた沈殿物を水に再分散させ、再度遠心分離を行い、粒子を沈降させた。得られた色素集積シリカナノ粒子の平均粒径は２００ｎｍであった。
調製した色素集積ポリスチレンナノ粒子も、実施例１と同様に表面をポリエチレングリコール修飾した。
評価１
実施例１および比較例１および２で調製した色素集積ナノ粒子について、Caイオンに対する蛍光強度依存性を評価した。
Ｃａイオンが存在しない条件での蛍光強度測定は、粒子を０．１ｎＭとなるようリン酸緩衝液（ｐＨ６．９）に分散させたものを用いて行った。Ｃａイオン存在下の蛍光強度測定は、粒子を０．１ｎＭとなるよう、１０ｍＭＣａイオンを含有するクエン酸緩衝液（ｐＨ６．９）に分散させたものを用いて行った。
蛍光強度の測定は、蛍光分光光度計Ｆ−７０００（商品名、日立ハイテクノロジーズ社製）を用いて、励起光波長を４８８ｎｍとし、波長５８０ｎｍの蛍光強度を測定した。
Figure 0006702326






本発明の粒子は、Ｃａイオンの有無に対し蛍光強度が変化し、かつ従来の粒子に比べ高い蛍光強度を有していることがわかる。
[実施例２]
ｐＨ応答性色素を集積したメラミン樹脂ナノ粒子
ｐＨ応答性色素としてＧＥ・ヘルスケア・ジャパン社製CypHer5E NHS ester を用いて、実施例１と同様にして色素存在下にメラミン樹脂の重合反応を行い、平均粒径は１００ｎｍのメラミン樹脂ナノ粒子を合成した。実施例１と同様にして表面にポリエチレングリコール修飾し、粒子４を合成した。
評価２
ｐＨ３、４、５、６および７の緩衝液それぞれに粒子４を分散させたものを、スライドガラスにのせ、蛍光顕微鏡観察を行った。ｐＨと蛍光強度の相関の検量線を作成した。
次に、培養細胞のＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地 シグマ社製）培養液に５０ｐＭ の粒子４分散液１００μＬおよび界面活性剤Tween20（東京化成工業（株）製）５０μＬを添加し、３７℃５時間培養した。蛍光顕微鏡を用いて、培養細胞を観察した。細胞内に粒子に由来する蛍光が点状に観察された。各粒子の蛍光強度から、別途作成した検量線をもとに粒子周囲のｐＨを求めることが可能であった。
Figure 0006702326




［実施例３］
Caイオン応答性色素を集積したメラミン樹脂ナノ粒子
Ｃａイオン応答性色素としてライフテクノロジーズ社製fluo-3 １ｍｇを水１ｍＬに加えて溶解した。その後、この溶液に乳化重合用乳化剤のエマルジョン（登録商標）４３０（ポリオキシエチレンオレイルエーテル、花王社製）の５％水溶液を２ｍＬ加えた。この溶液をホットスターラー上で撹拌しながら７０℃まで昇温させた後、この溶液にメラミン樹脂原料ニカラックＭＸ−０３５（日本カーバイド工業社製）を０．２ｇ加えた。
さらに、この溶液に界面活性剤としてドデシルベンゼンスルホン酸（関東化学社製）の１０％水溶液を２００μＬ加え、５０℃で５０分間加熱撹拌した。その後、９０℃に昇温して２０分間加熱撹拌した。得られた粒子分散液から、余剰の樹脂原料や色素等の不純物を除くため、純水による洗浄を行った。 洗浄は、遠心分離機（クボタ社製マイクロ冷却遠心機３７４０）にて１０００００Ｇで１５分間、遠心分離し、上澄み除去後、超純水を加えて超音波照射して再分散した。遠心分離、上澄み除去および超純水への再分散による洗浄を５回繰り返した。得られた色素集積ナノ粒子の平均粒径は３０ｎｍであった。
得られた色素集積ナノ粒子に、エチレングリコール（Methyl-PEG12-NHS Ester東京化成 ）を０．１ｍｏｌ／Ｌとなるように添加し、１２時間反応させた。
［実施例４］
Caイオン応答性色素を集積したメラミン樹脂ナノ粒子
Ｃａイオン応答性色素としてライフテクノロジーズ社製fluo-3 １ｍｇを水１ｍＬに加えて溶解した。その後、この溶液に乳化重合用乳化剤のエマルジョン（登録商標）４３０（ポリオキシエチレンオレイルエーテル、花王社製）の５％水溶液を２ｍＬ加えた。この溶液をホットスターラー上で撹拌しながら７０℃まで昇温させた後、この溶液にメラミン樹脂原料ニカラックＭＸ−０３５（日本カーバイド工業社製）を１．２ｇ加えた。
さらに、この溶液に界面活性剤としてドデシルベンゼンスルホン酸（関東化学社製）の１０％水溶液を２００μＬ加え、７０℃で５０分間加熱撹拌した。その後、９０℃に昇温して２０分間加熱撹拌した。得られた粒子分散液から、余剰の樹脂原料や色素等の不純物を除くため、純水による洗浄を行った。 洗浄は、遠心分離機（クボタ社製マイクロ冷却遠心機３７４０）にて２００００Ｇで１５分間、遠心分離し、上澄み除去後、超純水を加えて超音波照射して再分散した。遠心分離、上澄み除去および超純水への再分散による洗浄を５回繰り返した。得られた色素集積ナノ粒子の平均粒径は８００ｎｍであった。
得られた色素集積ナノ粒子に、エチレングリコール（Methyl-PEG12-NHS Ester東京化成 ）を０．１ｍｏｌ／Ｌとなるように添加し、１２時間反応させた。
［比較例３］
Caイオン応答性色素を集積したメラミン樹脂ナノ粒子
Ｃａイオン応答性色素としてライフテクノロジーズ社製fluo-3 １ｍｇを水１ｍＬに加えて溶解した。その後、この溶液に乳化重合用乳化剤のエマルジョン（登録商標）４３０（ポリオキシエチレンオレイルエーテル、花王社製）の５％水溶液を２ｍＬ加えた。この溶液をホットスターラー上で撹拌しながら７０℃まで昇温させた後、この溶液にメラミン樹脂原料ニカラックＭＸ−０３５（日本カーバイド工業社製）を０．１ｇ加えた。
さらに、この溶液に界面活性剤としてドデシルベンゼンスルホン酸（関東化学社製）の１０％水溶液を２００μＬ加え、５０℃で５０分間加熱撹拌した。その後、７０℃に昇温して２０分間加熱撹拌した。得られた粒子分散液から、余剰の樹脂原料や色素等の不純物を除くため、純水による洗浄を行った。 洗浄は、遠心分離機（クボタ社製マイクロ冷却遠心機３７４０）にて１０００００Ｇで６０分間、遠心分離し、上澄み除去後、超純水を加えて超音波照射して再分散した。遠心分離、上澄み除去および超純水への再分散による洗浄を５回繰り返した。得られた色素集積ナノ粒子の平均粒径は２０ｎｍであった。
得られた色素集積ナノ粒子に、エチレングリコール（Methyl-PEG12-NHS Ester東京化成 ）を０．１ｍｏｌ／Ｌとなるように添加し、１２時間反応させた。
実施例３，４および比較例３で調製した色素集積ナノ粒子について、上記評価１と同様に、Caイオンに対する蛍光強度依存性を評価した。
Figure 0006702326

Claims (7)

  1. 熱硬化性樹脂粒子の表面または内部に環境応答性色素を複数集積してなる平均粒径30〜800ｎｍのナノ粒子であり、
    前記環境応答性色素の集積量が200〜10,000,000分子／粒子であることを特徴とする環境応答性色素集積ナノ粒子。
  2. 前記環境応答性色素の集積量が15,000〜10,000,000分子／粒子であることを特徴とする請求項１に記載の環境応答性色素集積ナノ粒子。
  3. 前記環境応答性色素が、ｐＨまたはＣaイオンに対し蛍光強度依存性を有するものであることを特徴とする請求項１または２に記載の環境応答性色素集積ナノ粒子。
  4. 前記熱硬化性樹脂がメラミン樹脂である、請求項１〜３のいずれかに記載の環境応答性色素集積ナノ粒子。
  5. 表面が、さらにポリエチレングリコールで修飾されてなることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の環境応答性色素集積ナノ粒子。
  6. 請求項１〜５のいずれかに記載の環境応答性色素集積ナノ粒子を含む、細胞内環境分析用試薬。
  7. 請求項１〜５のいずれかに記載の環境応答性色素集積ナノ粒子を細胞内に取り込ませ細胞内を評価する、細胞内環境分析方法。
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