JP6693966B2 - サイズに基づいて希少細胞を回収するためのカラムベースのデバイスおよび方法ならびにその使用 - Google Patents
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Description
本出願は、いずれも2015年1月21日に出願されたシンガポール特許仮出願第10201500471Q号および第10201500472R号の優先権の恩典を主張し、これらの内容は、あらゆる目的のために参照により全体として本明細書に組み入れられる。
本発明は、対象細胞(特に希少細胞)を回収するためのデバイスおよび方法に関する。本発明はまた、開示されるデバイスおよび方法を使用して回収された細胞ならびにがんの診断および予後診断のためのバイオマーカーとしてのそれらの細胞の使用に関する。
がんなどの疾患状態の正確な診断のために、希少細胞(たとえば疾患細胞)の検出および回収がますます重要になっている。がんは世界で第二位の死因であり、2012年には820万人の死を占めている。がん死亡率は、早期に検出され、治療されるならば、有意に下げることができる。しかし、がんの信頼しうる早期検出方法は、主として、内視鏡検査または放射性スキャンの使用を伴い、それらは高額であり、一定の健康リスクを患者に課す。
(i)内部チャンバを画定する内壁であって、カラムの第一端にある、試料を受けるための入口開口部と、カラムの第二端にある出口開口部とを内部チャンバが有する、内壁;
(ii)内部チャンバ内でカラムの第二端に隣接して配置された、有孔プラグ;
(iii)第一端における開口部および第二端における開口部を有するスリーブインサートであって、第二端で細くなり、その第二端が有孔プラグに隣接する状態で内部チャンバ内に配置されたチャネルを含む、スリーブインサート;ならびに
(iv)スリーブインサート内に収容された濾過手段であって、2つの封止手段の間に挟まれたシーブを含む、濾過手段;
を含む、装置が提供される。
(a)本明細書に記載される装置の入口開口部に試料を導入して、試料が装置のスリーブインサートおよび濾過手段を通って流れることを可能にする工程;および
(b)装置の濾過手段内のシーブの表面に保持された残留物を捕集する工程;
を含む、試料から細胞を捕捉および回収する方法が提供される。
(i)腫瘍に由来しかつ血液から単離された内皮細胞であること;
(ii)各細胞が少なくとも2つの明らかに別個の核を有すること;
(iii)各細胞が約10μmよりも大きい長軸を有すること;
(iv)内皮細胞遺伝子またはタンパク質の発現;
(v)白血球特異的遺伝子またはタンパク質の非発現;および
(vi)巨核球または血小板特異的遺伝子またはタンパク質の非発現;
を有する、単離された細胞集団が提供される。
(a)本明細書に記載される装置または本明細書に記載される方法を使用して試料から細胞を捕捉および回収する工程;
を含む、対象の試料中の本明細書に記載される単離された細胞集団を検出する方法が提供される。
(b)工程(a)からの細胞を、検出可能な標識に結合した少なくとも1つの抗体と接触させて、細胞上に発現した1つまたは複数の標的バイオマーカーへの抗体の結合を可能にする工程;
(c)結合していない抗体を試料から除去する工程;ならびに
(d)単離された細胞集団を検出するために、抗体に結合した検出可能な標識を検出および分析する工程;
を含む。
(b)工程(a)からの細胞を溶解させる工程;
(c)工程(b)からの溶解させた細胞試料を、標的RNA領域に対する、第一のプライマー対のリバースプライマーおよび逆転写酵素と接触させて、RNAのcDNAへの逆転写を生じさせる工程;
(d)その後、工程(c)からの試料を、
(i)標的cDNA領域に対する、第一のプライマー対のフォワードプライマー、
(ii)標的DNA領域に対する、第二のプライマー対のリバースプライマーおよびフォワードプライマー、および
(iii)DNAポリメラーゼ
と接触させて、前増幅工程において標的cDNA領域および標的DNA領域を同時に増幅させる工程;および
(e)増幅された標的cDNA領域および/または増幅された標的DNA領域を分析する工程;
を含む。
(a)試料からの細胞を、検出可能な標識に結合した少なくとも1つの抗体と接触させて、細胞上に発現した1つまたは複数の標的バイオマーカーへの抗体の結合を可能にする工程;
(b)結合していない抗体を試料から除去する工程;ならびに
(c)単離された細胞集団を検出するために、抗体に結合した検出可能な標識を検出および分析する工程;
を含む、対象の試料中の第3の局面の単離された細胞集団を検出する方法が提供される。
(a)試料中に存在する細胞を溶解させる工程;
(b)工程(a)からの溶解させた細胞試料を、標的RNA領域に対する、第一のプライマー対のリバースプライマーおよび逆転写酵素と接触させて、RNAのcDNAへの逆転写を生じさせる工程;
(c)その後、工程(b)からの試料を、
(i)標的cDNA領域に対する、第一のプライマー対のフォワードプライマー、
(ii)標的DNA領域に対する、第二のプライマー対のリバースプライマーおよびフォワードプライマー、および
(iii)DNAポリメラーゼ
と接触させて、前増幅工程において標的cDNA領域および標的DNA領域を同時に増幅させる工程;および
(d)増幅された標的cDNA領域および/または増幅された標的DNA領域を分析する工程;
を含む、対象の試料中の第3の局面の単離された細胞集団を検出する方法が提供される。
(a)本明細書に記載される装置
を含む、第2、第4、第7、第8、第9または第10の局面の方法に使用するためのキットが提供される。
(b)1つまたは複数の細胞溶解バッファ;
(c)i. 第4の局面の方法の工程(c)のリバースプライマー、
ii. 第4の局面の方法の工程(d)(i)のフォワードプライマー、
iii. 第4の局面の方法の工程(d)(ii)のプライマー対、および
iv. 第4の局面の方法のネステッドプライマーおよびネステッドプライマー対
からなる群より選択されるプライマー;
(d)i. 逆転写酵素、および第4の局面の方法の工程(c)における逆転写に適した1つまたは複数の反応バッファ、
ii. DNAポリメラーゼ、および第4の局面の方法の工程(d)における増幅または第4の局面の方法のセミネステッドPCRもしくはネステッドPCRに適した1つまたは複数の反応バッファ、および
iii. dATP、dCTP、dGTP、およびdTTPまたはdUTPからなる群より選択される1つまたは複数の標識されたまたは標識されていないデオキシリボヌクレオチド
からなる群より選択される1つまたは複数の試薬;ならびに
(e)PAI-1、ビメンチン、FOXC1、ケラチン8、ケラチン18、ケラチン19、Ep-CAM、CD45、VWF、PECAM-1、CD146、CD41、CD34、PSMA、CD105、CD309、CD144、CD202B、およびアンジオポエチン2からなる群より選択されるタンパク質に特異的に結合することができる、検出可能な標識に結合されている抗体;ならびに任意で、検出可能な標識を検出するための手段;
のうちの1つまたは複数を含む。
(a)1つまたは複数の細胞溶解バッファ;
(b)i. 第5の局面の方法の工程(b)のリバースプライマー、
ii. 第5の局面の方法の工程(c)(i)のフォワードプライマー、
iii. 第5の局面の方法の工程(c)(ii)のプライマー対、および
iv. 第5の局面の方法のネステッドプライマーおよびネステッドプライマー対
からなる群より選択されるプライマー;
(c)i. 逆転写酵素、および第5の局面の方法の工程(b)における逆転写に適した1つまたは複数の反応バッファ、
ii. DNAポリメラーゼ、および第5の局面の方法の工程(c)における増幅または第5の局面の方法のセミネステッドPCRもしくはネステッドPCRに適した1つまたは複数の反応バッファ、および
iii. dATP、dCTP、dGTP、およびdTTPまたはdUTPからなる群より選択される1つまたは複数の標識されたまたは標識されていないデオキシリボヌクレオチド
からなる群より選択される1つまたは複数の試薬;ならびに
(d)PAI-1、ビメンチン、FOXC1、ケラチン8、ケラチン18、ケラチン19、Ep-CAM、CD45、VWF、PECAM-1、CD146、CD41、CD34、PSMA、CD105、CD309、CD144、CD202B、およびアンジオポエチン2からなる群より選択されるタンパク質に特異的に結合することができる、本明細書に記載される検出可能な標識に結合されている抗体;ならびに任意で、検出可能な標識を検出するための手段;
のうちの1つまたは複数を含む、第5、第6、第7、第8、第9または第10の局面の方法に使用するためのキットが提供される。
[本発明1001]
少なくとも1つのカラムを含む、試料から細胞を捕捉および回収するための装置であって、該カラムが、
(i)内部チャンバを画定する内壁であって、該カラムの第一端にある、該試料を受けるための入口開口部と、該カラムの第二端にある出口開口部とを該内部チャンバが有する、内壁;
(ii)該内部チャンバ内で該カラムの第二端に隣接して配置された、有孔プラグ;
(iii)第一端における開口部および第二端における開口部を有するスリーブインサートであって、該第二端で細くなり、該第二端が該有孔プラグに隣接する状態で該内部チャンバ内に配置されたチャネルを含む、スリーブインサート;ならびに
(iv)該スリーブインサート内に収容された濾過手段であって、2つの封止手段の間に挟まれたシーブを含む、濾過手段;
を含む、前記装置。
[本発明1002]
1つのカラムを含む、本発明1001の装置。
[本発明1003]
2つ以上のカラムを含む、本発明1001の装置。
[本発明1004]
前記カラムの第二端が、該カラムを通過する前記試料の流量を制御するための1つまたは複数のポンプへの接続のために適合されている、前記本発明のいずれかの装置。
[本発明1005]
前記ポンプが、少なくとも約0.05mL/min、少なくとも約0.10mL/min、少なくとも約0.15mL/min、少なくとも約0.20mL/min、少なくとも約0.25mL/min、少なくとも約0.30mL/min、少なくとも約0.40mL/min、および少なくとも約0.50mL/minからなる群より選択される流量で前記試料を通過させるように適合されている、本発明1004の装置。
[本発明1006]
前記シーブが非細胞接着性材料を含む、前記本発明のいずれかの装置。
[本発明1007]
前記非細胞接着性材料が、ケイ素、二酸化ケイ素、窒化ケイ素、エポキシ系ネガ型フォトレジスト、およびセラミクスからなる群より選択される、本発明1006の装置。
[本発明1008]
前記エポキシ系ネガ型フォトレジストがSU-8を含む、本発明1007の装置。
[本発明1009]
前記シーブが、少なくとも約6μm、少なくとも約7μm、少なくとも約8μm、少なくとも約9μm、少なくとも約10μm、少なくとも約12μm、少なくとも約14μm、少なくとも約16μm、少なくとも約18μm、および少なくとも約20μmからなる群より選択される直径を有する複数の細孔を含む、前記本発明のいずれかの装置。
[本発明1010]
以下の工程を含む、試料から細胞を捕捉および回収する方法:
(a)本発明1001〜1009のいずれかの装置の入口開口部に該試料を導入して、該試料が該装置のスリーブインサートおよび濾過手段を通って流れることを可能にする工程;ならびに
(b)該装置の濾過手段内のシーブの表面に保持された残留物を捕集する工程。
[本発明1011]
前記試料が生物学的流体を含む、本発明1010の方法。
[本発明1012]
前記生物学的流体が、全血、血清、血漿、脳脊髄液、リンパ液、嚢胞液、痰、便、胸水、粘液、腹水、および尿からなる群より選択される、本発明1011の方法。
[本発明1013]
前記試料が単一の細胞を含む、本発明1010〜1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
前記試料が複数の細胞を含む、本発明1010〜1012のいずれかの方法。
[本発明1015]
前記単一の細胞が、被験がん細胞、被験腫瘍由来細胞、胚または胎児に由来する被験細胞、および病原生物に由来する細胞からなる群より選択される、本発明1013の方法。
[本発明1016]
前記複数の細胞のうちの少なくともいくつかが、被験がん細胞、被験腫瘍由来細胞、胚または胎児に由来する被験細胞、および病原生物に由来する細胞からなる群より選択される、本発明1014の方法。
[本発明1017]
前記複数の細胞のうちの2つ以上が細胞クラスターを形成している、本発明1014または1016の方法。
[本発明1018]
前記単一の細胞または前記複数の細胞のうちの少なくともいくつかが多核細胞である、本発明1013〜1017のいずれかの方法。
[本発明1019]
前記試料が血液試料であり、該試料から捕捉および回収された細胞が少なくとも2つの明らかに別個の核を含む、本発明1010〜1018のいずれかの方法。
[本発明1020]
前記細胞の長軸が少なくとも10μmである、本発明1019の方法。
[本発明1021]
前記細胞が、PECAM1、VWF、およびCDH5からなる群より選択される遺伝子を発現する、本発明1019または1020の方法。
[本発明1022]
前記細胞が、PTPRC、ITGA2B、およびGP1BAからなる群より選択される遺伝子を発現しない、本発明1019〜1021のいずれかの方法。
[本発明1023]
工程(b)における残留物を捕集する工程が、ピペットを使用して残留物を回収する工程を含む、本発明1010〜1022のいずれかの方法。
[本発明1024]
以下の特徴:
(i)腫瘍に由来しかつ血液から単離された内皮細胞であること;
(ii)各細胞が少なくとも2つの明らかに別個の核を有すること;
(iii)各細胞が約10μmよりも大きい長軸を有すること;
(iv)内皮細胞遺伝子またはタンパク質の発現;
(v)白血球に特異的な遺伝子またはタンパク質の非発現;および
(vi)巨核球または血小板に特異的な遺伝子またはタンパク質の非発現;
を有する、単離された細胞集団。
[本発明1025]
前記内皮細胞遺伝子が、PECAM1、VWF、およびCDH5からなる群より選択される、本発明1024の単離された細胞集団。
[本発明1026]
白血球および巨核球または血小板に特異的な前記遺伝子が、PTPRC、ITGA2B、およびGP1BAからなる群より選択される、本発明1024または1025の単離された細胞集団。
[本発明1027]
以下の工程を含む、対象の試料中の本発明1024〜1026のいずれかの単離された細胞集団を検出する方法:
(a)本発明1001〜1009のいずれかの装置または本発明1010〜1023のいずれかの方法を使用して該試料から細胞を捕捉および回収する工程。
[本発明1028]
(b)工程(a)からの細胞を、検出可能な標識に結合した少なくとも1つの抗体と接触させて、該細胞上に発現した1つまたは複数の標的バイオマーカーへの該抗体の結合を可能にする工程;
(c)結合していない抗体を該試料から除去する工程;ならびに
(d)前記単離された細胞集団を検出するために、該抗体に結合した該検出可能な標識を検出および分析する工程;
をさらに含む、本発明1027の方法。
[本発明1029]
以下の工程を含む、対象の試料中の本発明1024〜1026のいずれかの単離された細胞集団を検出する方法:
(a)該試料からの細胞を、検出可能な標識に結合した少なくとも1つの抗体と接触させて、該細胞上に発現した1つまたは複数の標的バイオマーカーへの該抗体の結合を可能にする工程;
(b)結合していない抗体を該試料から除去する工程;ならびに
(c)該単離された細胞集団を検出するために、該抗体に結合した該検出可能な標識を検出および分析する工程。
[本発明1030]
前記抗体が、PAI-1、ビメンチン、FOXC1、ケラチン8、ケラチン18、ケラチン19、Ep-CAM、CD45、VWF、PECAM-1、CD146、CD41、CD34、PSMA、CD105、CD309、CD144、CD202B、およびアンジオポエチン2からなる群より選択される標的バイオマーカーに特異的に結合することができる、本発明1028または1029の方法。
[本発明1031]
前記検出可能な標識が、蛍光基、放射性同位体、安定同位体、酵素基、化学発光基、およびビオチニル基からなる群より選択される、本発明1028〜1030のいずれかの方法。
[本発明1032]
(b)工程(a)からの細胞を溶解させる工程;
(c)工程(b)からの溶解させた細胞試料を、標的RNA領域に対する、第一のプライマー対のリバースプライマーおよび逆転写酵素と接触させて、該RNAのcDNAへの逆転写を生じさせる工程;
(d)その後、工程(c)からの該試料を、
(i)標的cDNA領域に対する、該第一のプライマー対のフォワードプライマー、
(ii)標的DNA領域に対する、第二のプライマー対のリバースプライマーおよびフォワードプライマー、ならびに
(iii)DNAポリメラーゼ
と接触させて、前増幅工程において該標的cDNA領域および該標的DNA領域を同時に増幅させる工程;ならびに
(e)増幅された該標的cDNA領域および/または増幅された該標的DNA領域を分析する工程;
をさらに含む、本発明1027の方法。
[本発明1033]
以下の工程を含む、対象の試料中の本発明1024〜1026のいずれかの単離された細胞集団を検出する方法:
(a)該試料中に存在する細胞を溶解させる工程;
(b)工程(a)からの溶解させた細胞試料を、標的RNA領域に対する、第一のプライマー対のリバースプライマーおよび逆転写酵素と接触させて、該RNAのcDNAへの逆転写を生じさせる工程;
(c)その後、工程(b)からの該試料を、
(i)標的cDNA領域に対する、該第一のプライマー対のフォワードプライマー、
(ii)標的DNA領域に対する、第二のプライマー対のリバースプライマーおよびフォワードプライマー、ならびに
(iii)DNAポリメラーゼ
と接触させて、前増幅工程において該標的cDNA領域および該標的DNA領域を同時に増幅させる工程;ならびに
(d)増幅された該標的cDNA領域および/または増幅された該標的DNA領域を分析する工程。
[本発明1034]
工程(c)におけるリバースプライマーまたは工程(d)(i)におけるフォワードプライマー、および増幅された前記標的cDNA領域内に結合するネステッドプライマーを使用して、工程(d)からの試料をセミネステッドPCRに供する工程をさらに含む、本発明1032の方法。
[本発明1035]
工程(b)におけるリバースプライマーまたは工程(c)(i)におけるフォワードプライマー、および増幅された前記標的cDNA領域内に結合するネステッドプライマーを使用して、工程(c)からの試料をセミネステッドPCRに供する工程をさらに含む、本発明1033の方法。
[本発明1036]
増幅された前記標的DNA領域内に結合するネステッドプライマー対を使用して、工程(d)からの試料をネステッドPCRに供する工程をさらに含む、本発明1032の方法。
[本発明1037]
増幅された前記標的DNA領域内に結合するネステッドプライマー対を使用して、工程(c)からの試料をネステッドPCRに供する工程をさらに含む、本発明1033の方法。
[本発明1038]
工程(c)および(d)が同じ反応混合物中で実施される、本発明1036の方法。
[本発明1039]
工程(b)および(c)が同じ反応混合物中で実施される、本発明1037の方法。
[本発明1040]
工程(e)における分析が、増幅された前記標的cDNAを遺伝子発現に関して分析することを含む、本発明1032、1034、1036および1038のいずれかの方法。
[本発明1041]
工程(d)における分析が、増幅された前記標的cDNAを遺伝子発現に関して分析することを含む、本発明1033、1035、1037および1039のいずれかの方法。
[本発明1042]
工程(e)における分析が、増幅された前記標的cDNAを突然変異に関して分析することを含む、本発明1032、1034、1036、1038および1040のいずれかの方法。
[本発明1043]
工程(d)における分析が、増幅された前記標的cDNAを突然変異に関して分析することを含む、本発明1033、1035、1037、1039および1041のいずれかの方法。
[本発明1044]
前記第一または第二のプライマー対が、(i)SEQ ID NO: 1とSEQ ID NO: 2;(ii)SEQ ID NO: 3とSEQ ID NO: 4;(iii)SEQ ID NO: 5とSEQ ID NO: 6;(iv)SEQ ID NO: 7とSEQ ID NO: 8;(v)SEQ ID NO: 9とSEQ ID NO: 10;(vi)SEQ ID NO: 11とSEQ ID NO: 12;(vii)SEQ ID NO: 13とSEQ ID NO: 14;(viii)SEQ ID NO: 15とSEQ ID NO: 16;(ix)SEQ ID NO: 17とSEQ ID NO: 18;(x)SEQ ID NO: 19とSEQ ID NO: 20;(xi)SEQ ID NO: 21とSEQ ID NO: 22;(xii)SEQ ID NO: 23とSEQ ID NO: 24;(xiii)SEQ ID NO: 25とSEQ ID NO: 26;(xiv)SEQ ID NO: 27とSEQ ID NO: 28;(xv)SEQ ID NO: 29とSEQ ID NO: 30;(xvi)SEQ ID NO: 31とSEQ ID NO: 32;(xvii)SEQ ID NO: 33とSEQ ID NO: 34;(xviii)SEQ ID NO: 52と53;および(xix)SEQ ID NO: 54と55からなる群より選択される、本発明1032〜1043のいずれかの方法。
[本発明1045]
セミネステッドPCRまたはネステッドPCRのための前記プライマー対が、(i)SEQ ID NO: 35とSEQ ID NO: 2;(ii)SEQ ID NO: 3とSEQ ID NO: 36;(iii)SEQ ID NO: 5とSEQ ID NO: 37;(iv)SEQ ID NO: 38とSEQ ID NO: 8;(v)SEQ ID NO: 39とSEQ ID NO: 10;(vi)SEQ ID NO: 40とSEQ ID NO: 12;(vii)SEQ ID NO: 41とSEQ ID NO: 14;(viii)SEQ ID NO: 42とSEQ ID NO: 16;(ix)SEQ ID NO: 17とSEQ ID NO: 43;(x)SEQ ID NO: 44とSEQ ID NO: 20;(xi)SEQ ID NO: 45とSEQ ID NO: 22;(xii)SEQ ID NO: 46とSEQ ID NO: 24;(xiii)SEQ ID NO: 25とSEQ ID NO: 47;(xiv)SEQ ID NO: 27とSEQ ID NO: 48;(xv)SEQ ID NO: 49とSEQ ID NO: 30;(xvi)SEQ ID NO: 31とSEQ ID NO: 50;(xvii)SEQ ID NO: 51とSEQ ID NO: 34;(xviii)SEQ ID NO: 56とSEQ ID NO: 57;および(xix)SEQ ID NO: 58とSEQ ID NO: 55からなる群より選択される、本発明1032〜1044のいずれかの方法。
[本発明1046]
対象におけるがんを診断する方法であって、該対象からの試料を本発明1024〜1026のいずれかの単離された細胞集団の存在に関して分析する工程を含み、該単離された細胞集団の存在によって該対象ががんを有することが示される、前記方法。
[本発明1047]
前記がんが、がん腫、肉腫、リンパ腫、胚細胞腫瘍、芽腫、結腸がん、直腸がん、乳がん、前立腺がん、腎細胞がん、移行上皮細胞がん、肺がん、胆管がん、脳腫瘍、非小細胞肺がん、膵臓がん、胃がん、膀胱がん、食道がん、中皮腫、メラノーマ、甲状腺がん、頭頸部がん、骨肉腫、肝細胞がん、原発不明がん、卵巣がん、子宮内膜がん、グリア芽腫、神経芽細胞腫、ホジキンリンパ腫、および非ホジキンリンパ腫からなる群より選択される、本発明1046の方法。
[本発明1048]
前記がんが、浸潤がんおよび/または転移がんである、本発明1046または1047の方法。
[本発明1049]
前記がんが、ステージIがん、ステージIIがん、ステージIIIがん、またはステージIVがんである、本発明1046または1047の方法。
[本発明1050]
前記がんが早期がんである、本発明1046または1047の方法。
[本発明1051]
がん患者の治療に対する応答性をモニタリングおよび/または予測する方法であって、治療後に該患者から得た試料を、本発明1024〜1026のいずれかの単離された細胞集団の数の決定に関して分析する工程を含み、該単離された細胞集団の数が、治療前に該患者から得たベースライン試料中の単離された細胞集団の数と比べて減少していることによって、該患者が該治療に対して陽性に応答していることが示される、前記方法。
[本発明1052]
がん患者の治療に対する応答性を予測する方法であって、治療前に該がん患者から得た試料を、本発明1024〜1026のいずれかの単離された細胞集団の数の決定に関して分析する工程を含み、該単離された細胞集団の数が、該治療に対して陽性に応答した患者または患者群から治療前に得た試料中の単離された細胞集団の数と比べて等しいまたは多いことによって、該がん患者が該治療に対して陽性に応答することが示され、該単離された細胞集団の数が、該治療に対して陽性に応答した患者または患者群から治療前に得た試料中の単離された細胞集団の数と比べて少ないことによって、該がん患者が該治療に対して陰性に応答することが示される、前記方法。
[本発明1053]
対象における腫瘍の血管特性を分析する方法であって、該対象からの試料を、本発明1024〜1026のいずれかの単離された細胞集団の数の決定に関して分析する工程を含み、該単離された細胞集団の数がベースライン試料と比べて増加していることによって、該腫瘍が該ベースライン試料と比べて大きい血管を有することが示され、該単離された細胞集団の数がベースライン試料と比べて減少していることによって、該腫瘍が該ベースライン試料と比べて小さい血管を有することが示される、前記方法。
[本発明1054]
(a)本発明1001〜1009のいずれかの装置
を含む、本発明1010〜1023、1027、1028、1030〜1032、1034、1036、1038、1040、1042および1044〜1053のいずれかの方法に使用するためのキット。
[本発明1055]
(b)1つまたは複数の細胞溶解バッファ;
(c)i. 本発明1032、1034、1036、1038、1040、1042、1044および1045のいずれかの方法の工程(c)のリバースプライマー、
ii. 本発明1032、1034、1036、1038、1040、1042、1044および1045のいずれかの方法の工程(d)(i)のフォワードプライマー、
iii. 本発明1032、1034、1036、1038、1040、1042、1044および1045のいずれかの方法の工程(d)(ii)のプライマー対、
iv. 本発明1032、1034、1036、1038、1040、1042、1044および1045のいずれかの方法のネステッドプライマーおよびネステッドプライマー対
からなる群より選択されるプライマー;
(d)i. 逆転写酵素、および本発明1032、1034、1036、1038、1040、1042、1044および1045のいずれかの方法の工程(c)における逆転写に適した1つまたは複数の反応バッファ、
ii. DNAポリメラーゼ、および本発明1032、1034、1036、1038、1040、1042、1044および1045のいずれかの方法の工程(d)における増幅または本発明1034、1036、1038、1040、1042、1044および1045のいずれかの方法のセミネステッドPCRもしくはネステッドPCRに適した1つまたは複数の反応バッファ、ならびに
iii. dATP、dCTP、dGTP、およびdTTPまたはdUTPからなる群より選択される1つまたは複数の標識されたまたは標識されていないデオキシリボヌクレオチド
からなる群より選択される1つまたは複数の試薬;ならびに
(e)PAI-1、ビメンチン、FOXC1、ケラチン8、ケラチン18、ケラチン19、Ep-CAM、CD45、VWF、PECAM-1、CD146、CD41、CD34、PSMA、CD105、CD309、CD144、CD202B、およびアンジオポエチン2からなる群より選択されるタンパク質に特異的に結合することができる、検出可能な標識に結合されている抗体;ならびに任意で、該検出可能な標識を検出するための手段;
のうちの1つまたは複数をさらに含む、本発明1054のキット。
[本発明1056]
(a)1つまたは複数の細胞溶解バッファ;
(b)i. 本発明1033、1035、1037、1039、1041および1043〜1045のいずれかの方法の工程(b)のリバースプライマー、
ii. 本発明1033、1035、1037、1039、1041および1043〜1045のいずれかの方法の工程(c)(i)のフォワードプライマー、
iii. 本発明1033、1035、1037、1039、1041および1043〜1045のいずれかの方法の工程(c)(ii)のプライマー対、ならびに
iv. 本発明1033、1035、1037、1039、1041および1043〜1045のいずれかの方法のネステッドプライマーおよびネステッドプライマー対
からなる群より選択されるプライマー;
(c)i. 逆転写酵素、および本発明1033、1035、1037、1039、1041および1043〜1045のいずれかの方法の工程(b)における逆転写に適した1つまたは複数の反応バッファ、
ii. DNAポリメラーゼ、および本発明1033、1035、1037、1039、1041および1043〜1045のいずれかの方法の工程(d)における増幅または本発明1035、1037、1039、1041および1043〜1045のいずれかの方法のセミネステッドPCRもしくはネステッドPCRに適した1つまたは複数の反応バッファ、ならびに
iii. dATP、dCTP、dGTP、およびdTTPまたはdUTPからなる群より選択される1つまたは複数の標識されたまたは標識されていないデオキシリボヌクレオチド
からなる群より選択される1つまたは複数の試薬;ならびに
(d)PAI-1、ビメンチン、FOXC1、ケラチン8、ケラチン18、ケラチン19、Ep-CAM、CD45、VWF、PECAM-1、CD146、CD41、CD34、PSMA、CD105、CD309、CD144、CD202B、およびアンジオポエチン2からなる群より選択されるタンパク質に特異的に結合することができる、検出可能な標識に結合されている抗体;ならびに任意で、該検出可能な標識を検出するための手段;
のうちの1つまたは複数を含む、本発明1029〜1031および1033、1035、1037、1039、1041および1043〜1053のいずれかの方法に使用するためのキット。
[本発明1057]
前記プライマーおよび/または試薬が、本発明1032〜1045のいずれかの溶解、前増幅および増幅工程に適した組み合わせで予め混合されている、本発明1055または1056のキット。
[本発明1058]
前記プライマーが、遺伝子発現プロファイルまたは突然変異シグネチャの分析に適した組み合わせで予め混合されている、本発明1057のキット。
[本発明1059]
本発明1010〜1023および1027〜1053のいずれかの方法を実施するための取扱説明書をさらに含む、本発明1054〜1058のいずれかのキット。
[本発明1060]
本発明1010〜1023および1027〜1053のいずれかの方法を実施するための1つまたは複数の反応バッファを含む1つまたは複数の容器を含む、本発明1054〜1058のいずれかのキット。
本開示は、捕捉された細胞の容易な下流側操作および分析を可能にする、細胞、特に希少細胞を捕捉および回収するための装置を提供する。したがって、第1の局面においては、少なくとも1つのカラムを含む、試料から細胞を捕捉および回収するための装置であって、カラムが、
(i)内部チャンバを画定する内壁であって、カラムの第一端にある、試料を受けるための入口開口部と、カラムの第二端にある出口開口部とを内部チャンバが有する、内壁;
(ii)内部チャンバ内でカラムの第二端に隣接して配置された、有孔プラグ;
(iii)第一端における開口部および第二端における開口部を有するスリーブインサートであって、第二端で細くなり、その第二端が有孔プラグに隣接する状態で内部チャンバ内に配置されたチャネルを含む、スリーブインサート;ならびに
(iv)スリーブインサート内に収容された濾過手段であって、2つの封止手段の間に挟まれたシーブを含む、濾過手段;
を含む、装置が提供される。
(a)本明細書に記載される装置の入口開口部に試料を導入して、試料が装置のスリーブインサートおよび濾過手段を通って流れることを可能にする工程;および
(b)装置の濾過手段内のシーブの表面に保持された残留物を捕集する工程;
を含む、試料から細胞を捕捉および回収する方法が提供される。
(i)腫瘍に由来しかつ血液から単離された内皮細胞であること;
(ii)各細胞が少なくとも2つの明らかに別個の核を有すること;
(iii)各細胞が約10μmよりも大きい長軸を有すること;
(iv)内皮細胞遺伝子またはタンパク質の発現;
(v)白血球に特異的な遺伝子またはタンパク質の非発現;および
(vi)巨核球または血小板に特異的な遺伝子またはタンパク質の非発現;
を有する、単離された細胞集団が提供される。
(a)本明細書に記載される装置または本明細書に記載される方法を使用して試料から細胞を捕捉および回収する工程;
を含む、対象の試料中の本明細書に記載される単離された細胞集団を検出する方法が提供される。
(b)工程(a)からの細胞を、検出可能な標識に結合した少なくとも1つの抗体と接触させて、細胞上に発現した1つまたは複数の標的バイオマーカーへの抗体の結合を可能にする工程;
(c)結合していない抗体を試料から除去する工程;ならびに
(d)単離された細胞集団を検出するために、抗体に結合した検出可能な標識を検出および分析する工程;
を含む。
(a)試料からの細胞を、検出可能な標識に結合した少なくとも1つの抗体と接触させて、細胞上に発現した1つまたは複数の標的バイオマーカーへの抗体の結合を可能にする工程;
(b)結合していない抗体を試料から除去する工程;ならびに
(c)単離された細胞集団を検出するために、抗体に結合した検出可能な標識を検出および分析する工程;
を含む、対象の試料中の第3の局面の単離された細胞集団を検出する方法が提供される。
(b)工程(a)からの細胞を溶解させる工程;
(c)工程(b)からの溶解させた細胞試料を、標的RNA領域に対する、第一のプライマー対のリバースプライマーおよび逆転写酵素と接触させて、RNAのcDNAへの逆転写を生じさせる工程;
(d)その後、工程(c)からの試料を、
(i)標的cDNA領域に対する、第一のプライマー対のフォワードプライマー、
(ii)標的DNA領域に対する、第二のプライマー対のリバースプライマーおよびフォワードプライマー、および
(iii)DNAポリメラーゼ
と接触させて、前増幅工程において標的cDNA領域および標的DNA領域を同時に増幅させる工程;および
(e)増幅された標的cDNA領域および/または増幅された標的DNA領域を分析する工程;
を含む。
(a)試料中に存在する細胞を溶解させる工程;
(b)工程(a)からの溶解させた細胞試料を、標的RNA領域に対する、第一のプライマー対のリバースプライマーおよび逆転写酵素と接触させて、RNAのcDNAへの逆転写を生じさせる工程;
(c)その後、工程(b)からの試料を、
(i)標的cDNA領域に対する、第一のプライマー対のフォワードプライマー、
(ii)標的DNA領域に対する、第二のプライマー対のリバースプライマーおよびフォワードプライマー、および
(iii)DNAポリメラーゼ
と接触させて、前増幅工程において標的cDNA領域および標的DNA領域を同時に増幅させる工程;および
(d)増幅された標的cDNA領域および/または増幅された標的DNA領域を分析する工程;
を含む、対象の試料中の第3の局面の単離された細胞集団を検出する方法が提供される。
EMT:上皮間葉転換マーカー
L:細胞系マーカー
TEC:腫瘍内皮細胞マーカー
S:幹細胞マーカー
Ep:上皮マーカー
He:造血細胞マーカー
En:内皮細胞マーカー
Me:巨核球/血小板マーカー
60℃で4分間、次いで95℃で1分間の6サイクル、
55℃で4分間、次いで95℃で1分間の6サイクル、および
50℃で4分間、次いで95℃で1分間の6サイクル
を含む。
(b)試料から得た細胞を溶解させるための1つまたは複数の細胞溶解バッファ;
(c)i. 第4の局面の方法の工程(c)のリバースプライマー、
ii. 第4の局面の方法の工程(d)(i)のフォワードプライマー、
iii. 第4の局面の方法の工程(d)(ii)のプライマー対、および
iv. 第4の局面の方法のネステッドプライマーおよびネステッドプライマー対
からなる群より選択されるプライマー;
(d)i. 逆転写酵素、および第4の局面の方法の工程(c)における逆転写に適した1つまたは複数の反応バッファ、
ii. DNAポリメラーゼ、および第4の局面の方法の工程(d)における増幅または第4の局面の方法のセミネステッドもしくはネステッドPCRに適した1つまたは複数の反応バッファ、および
iii. dATP、dCTP、dGTP、およびdTTPまたはdUTPからなる群より選択される1つまたは複数の標識されたまたは標識されていないデオキシリボヌクレオチド
からなる群より選択される1つまたは複数の試薬;ならびに
(e)PAI-1、ビメンチン、FOXC1、ケラチン8、ケラチン18、ケラチン19、Ep-CAM、CD45、VWF、PECAM-1、CD146、CD41、CD34、PSMA、CD105、CD309、CD144、CD202B、およびアンジオポエチン2からなる群より選択されるタンパク質に特異的に結合することができる、本明細書に記載される検出可能な標識に結合されている抗体;ならびに任意で、検出可能な標識を検出するための手段;
のうちの1つまたは複数を含み得る。
(a)試料から得た細胞を溶解させるための1つまたは複数の細胞溶解バッファ;
(b)i. 第5の局面の方法の工程(b)のリバースプライマー、
ii. 第5の局面の方法の工程(c)(i)のフォワードプライマー、
iii. 第5の局面の方法の工程(c)(ii)のプライマー対、および
iv. 第5の局面の方法のネステッドプライマーおよびネステッドプライマー対
からなる群より選択されるプライマー;
(c)i. 逆転写酵素、および第5の局面の方法の工程(b)における逆転写に適した1つまたは複数の反応バッファ、
ii. DNAポリメラーゼ、および第5の局面の方法の工程(c)における増幅または第5の局面の方法のセミネステッドPCRもしくはネステッドPCRに適した1つまたは複数の反応バッファ、および
iii. dATP、dCTP、dGTP、およびdTTPまたはdUTPからなる群より選択される1つまたは複数の標識されたまたは標識されていないデオキシリボヌクレオチド
からなる群より選択される1つまたは複数の試薬;ならびに
(d)PAI-1、ビメンチン、FOXC1、ケラチン8、ケラチン18、ケラチン19、Ep-CAM、CD45、VWF、PECAM-1、CD146、CD41、CD34、PSMA、CD105、CD309、CD144、CD202B、およびアンジオポエチン2からなる群より選択されるタンパク質に特異的に結合することができる、本明細書に記載される検出可能な標識に結合されている抗体;ならびに任意で、検出可能な標識を検出するための手段;
を含む、本明細書に記載される方法(たとえば第5、第6、第7、第8、第9または第10の局面の方法)に使用するためのキットが提供される。
実施例1―血液から細胞を捕捉および回収するためのデバイス
図1Aは、上端に入口を有し、下端に出口を有するインサートスリーブを示す。インサートスリーブは、細胞捕捉シーブをデバイスのカラムの出口近くに確保する、細胞捕捉シーブのハウジングとして機能する。試料がインサートスリーブの入口から流入し、インサートスリーブの出口を通って流出する。図1Bは、試料が中を流れるチャネルがインサートスリーブの下端で細くなる様子を示す。図1Cは、カラム内のインサートスリーブと細胞捕捉シーブとのアセンブリを示す。まず、細胞捕捉シーブ(2つのOリングの間に挟まれている)がインサートスリーブの出口近くでスロットの中に配置され、次いで、ロッドの形態の挿入ツール(図示せず)を使用することによってインサートスリーブアセンブリ全体がカラムに挿入される。図1Dは、蠕動ポンプに接続されている2つの細胞捕捉および回収デバイスを示し、図3Aは、ケイ素マイクロシーブ(挿入図、スケールバー=10μm)をそれぞれが包囲する4つの精密濾過デバイスが流量制御のための蠕動ポンプに接続されている、精密濾過装置の別の例示的な構成を示す。血液試料をデバイスに通して濾過した。様々な孔径の細胞捕捉シーブを使用して、汚染性の白血球(WBC)および赤血球(RBC)の除去を試験した。結果が図1Eに示されている。全血1mlをデバイスに通して濾過した。汚染性のWBCおよびRBCを回収し、カウントした(黒い棒)または、短時間、蠕動ポンプの流れを逆転(「バックフラッシュ」)させて、シーブに貼り付いた細胞を取り除いたのち、回収し、カウントした(白い棒)。除去倍率は以下のように計算した。
WBCまたはRBCの除去倍率=(全血中のWBCまたはRBC)/(精密濾液中のWBCまたはRBC)。
%回収効率=(回収された細胞)×100/(スパイクされた細胞)。
。
患者試料および臨床データ
すべての対象は、参加する旨の書面によるインフォームドコンセントを提出していた。臨床試料は、シンガポール国立大学の施設内倫理委員会(IRB)、Fortis Surgical HospitalおよびSingapore Health Services(SingHealth)によって認められたプロトコルにしたがって2012年7月から2014年4月までの間に得られた。82名の大腸がん患者からの血液試料がFortis Surgical Hospital(FSH)およびシンガポール国立がんセンター(NCC)から継続的に提供された。45名の健常な対象からの血液試料がSingapore Consortium of Cohort Studies(SCCS)によって提供された。Institute of Bioengineering and Nanotechnologyにおいてすべての試料をEDTA Vacutainer管(Becton-Dickinson)に捕集し、6時間以内に処理した。精密濾過デバイスの技術的故障のため、2つの症例を分析から除外した。利用可能ならば、対応した腫瘍および転移試料を切除後ただち凍結し、使用するまで−80℃で貯蔵した。参加した対象の臨床病理データが補足表6に記載されており、TECCカウントの完了後に遡及的に収集されたものである。臨床データ収集は、TECCカウントの事前知識なしで実施した。同様に、大腸がん患者の臨床データは、FSH試料の診断および術前状態を除き、TECCカウント時には知られていなかった。腫瘍面積を幅×長さで計算した。
HCT116、COLO201、SW480、SW620、DLD-1およびRKO大腸がん細胞株、BJ-5ta不死化ヒト包皮繊維芽細胞およびHUVECはATCCから入手したものであった。HUVECを継代1および2で使用し、EGM-2培地(Lonza)中で培養した。他のすべての細胞株は、10%FBSで補足されたDMEM(Life Technologies)中で培養した。細胞を加湿インキュベータ中、5%CO2の存在下、37℃で維持した。
ケイ素マイクロシーブを記載(Lim et al.)のように作製した。簡単にいうと、マイクロシーブは、全直径(φ)7.3mmのケイ素ディスクおよび厚さ300μmの支持リングからなる。中央捕捉領域はφ5.3mmおよび厚さ60μmを有し、深掘り反応性イオンエッチングによって得られた100,000個の円形細孔を含む。マイクロシーブを無菌3mlシリンジに埋め込むために、マイクロシーブ細胞捕捉領域に相当する、φ8.58mmからφ5.54mmまで細くなる入口チャネルからなるアクリルスリーブインサートを設計した。スリーブインサートは、マイクロシーブと、図1Cに示すような、良好な封止およびクッションを保証するシリコーンOリング(厚さ0.5mm)とを収容した。回収デバイスを以下のようにアセンブルした。まず、3mlシリンジプランジャのゴムプラグを取り出し、パンチカッタを使用して直径5.5mmの穴を形成した。有孔ゴムプラグを3mlシリンジ中に配置した。次に、Oリングをスリーブインサートのスロットに配置したのち、マイクロシーブおよびもう1つのOリングを配置した。最後に、マイクロシーブおよびOリングを有するスリーブインサートを、3mlシリンジ中、有孔ゴムプラグよりも上に配置した。この配置が、従来の構成で、全血からサイズによる細胞の精密濾過およびその後の、マイクロシーブの上面からの捕捉された細胞の回収を可能にした。
血液精密濾過を最適化するために、5μM CellTracker(Life Technologies)標識細胞をドナー血液に全血1mlあたり10〜50個で加えた。蠕動ポンプ(Ismatec)により、様々な流量で血液を濾過した。PBS、0.5%BSAおよび2mM EDTAを使用する6回の洗浄ののち、細胞を培地中に再懸濁させた。その後、Hoechst 33342(Life Technologies)を使用して細胞核を染色し、細胞を回収して回収効率および汚染性WBCの除去倍率を決定した。いくつかの実験においては、マイクロシーブ上に残ったCellTracker陽性細胞もカウントした。%回収効率は以下のように計算した。
%回収効率=(回収された細胞)×100/(スパイクされた細胞)
除去倍率は以下のように計算した。
WBCまたはRBCの除去倍率=(全血中のWBCまたはRBC)/(精密濾液中のWBCまたはRBC)
この実施例は、血液から単離することができ、
1)疾患の非常に早期でさえ、すべてのステージの腫瘍を診断し、
2)腫瘍の治療に対する応答性をモニタリングし、
3)腫瘍の治療に対する応答性を予測し、
4)腫瘍の血管特徴を予測する
のためのバイオマーカーとして使用することができる明確な内皮細胞(血管に由来する細胞)集団を同定し、分析する方法を記載する。
懸濁細胞を、0.5%BSA、2mM EDTAおよびヒトFcRブロッキング試薬(Miltenyi Biotec)を含有するPBS中で5回の洗浄ののち、以下の蛍光標識抗体:抗CD45 1:200(クローン2D1;eBioscience)、抗Ep-CAM 1:20(9C4、BioLegend)、抗CD31 1:20(WM59、BioLegend)、抗CD144 1:10(55-7H1、BD)、抗CD41 1:20(HIP8、BioLegend)抗CD42B 1:20(HIP1、BioLegend)を使用して、直接「シーブ上」で30分間染色した。細胞内抗原の場合、Inside Stainキット(Miltenyi Biotec)およびヒトFcRブロッキング試薬を以下の抗体:抗VWF 1:200(ウサギポリクロナールA 0082、DAKO、Life Technologies APEX抗体標識キットを使用して院内でAlexa 488またはAlexaに555コンジュゲートしたもの)、抗ビメンチン(V9、Santa Cruz Biotechnology)、抗pan Cytokeratin(C11、Cell Signaling Technology)とともに使用した。Hoechst 33342(Life Technologies)を使用して核を染色した。いくつかの実験においては、Calcein AM(Life Technologies)を使用して生細胞を同定した。洗浄工程ののち、細胞を回収し、画像化、カウントおよび/または顕微操作のために、懸濁中、倒立蛍光顕微鏡(IX81、Olympus)下で可視化した。MetaMorphソフトウェア(Molecular Devices)をCoolSNAP HQ2 CCDカメラ(Photometrics)とともに使用して画像を記録した。
本明細書に記載された方法を使用して、大腸がん患者の血液中の腫瘍由来内皮細胞集団を検出した。これらの細胞は、腫瘍血管系(腫瘍の血管)に由来する複数の細胞のクラスターを形成し(図8)、したがって、腫瘍由来内皮細胞クラスター(TECC)と同定された。TECCは以下のように定義される:「>10μmの長軸を有し、少なくとも2つの明らかに別個の核を有し、CD31、VWFまたはCD144タンパク質を発現するが、CD45、CD41およびCD42Bを発現しない、血液から単離された任意の細胞または細胞クラスター」(図8B)。重要なことに、大きく分葉した単一の核または大きく丸い単一の核を有する巨核球細胞系に属する細胞集団は除外した。これらの細胞は、CD41およびCD42Bに関して陽性に染色される、TECCから容易に識別可能な特徴的な細胞形態を有し、治療を受けている大腸がん患者で主に認められたが、一部の健常ボランティアおよび治療未経験の大腸がん患者においても認められた。単一内皮細胞もまた、それがマイクロシーブを透過することを可能にするであろうその小さい直径のせいで、分析から除外した。これらの包含および除外基準を適用することにより、全血2mlから得た精密濾液を96ウェルプレートのウェルに加えることによってTECCをカウントした。短い遠心分離工程ののち、20×対物レンズを使用して標的ウェルを手作業で三回スキャンすることにより、TECCを同定し、カウントした。少なくとも1つのTECCの検出によって試料を陽性と決定した。
TECCが腫瘍由来であったかどうかを試験するために、17名の大腸がん患者から、外科的腫瘍切除の0〜24時間前と24〜72時間後との対で試料を捕集した(n=34)。腫瘍除去は内皮TECCの急激な減少を生じさせ、腫瘍とTECCとの間の直接的なリンクを裏付けた(図8Hおよび補足表5)。前立腺特異的膜抗原(PSMA)をコード化する遺伝子である葉酸ヒドロラーゼ(FOLH1)は、様々ながんタイプの腫瘍血管系中に特異的に発現するが、正常な血管系および末梢血中には存在しない。FOLH1は、事実、新鮮な大腸がん組織から単離されたCD31+CD45-細胞および大腸がん患者7/10名の血液から単離されたTECC中には発現していたが、正常な組織から単離された内皮細胞中または健常ドナー末梢血単核細胞(PBMC)中には発現していなかった(図9)。この結果は内皮TECCの腫瘍起源をさらに裏付けた(図8)。加えて、TECCのRNA-Seqデータがいくつかの腫瘍内皮マーカーの発現を明らかにした(図11)。さらに、低い、または高いTECCカウントを有する患者に由来する腫瘍細胞中の血管をカウントすることにより、TECC数が、基礎にある腫瘍血管系の特徴と相関するかどうかが問われた。血管単位の中央数は異ならなかったが、内腔の中央数は、高いTECCカウントの患者において有意に高かった。合わせて考えると、大腸がん患者中のTECCは、悪性の実体ではなく、腫瘍由来の成熟内皮細胞のクラスターであることが示された。
25mlシリンジに取り付けられたマウスピペットを使用して標的細胞を手作業でマイクロピペット操作した。簡単にいうと、明視野像、核染色および特異的蛍光シグナルによって、全細胞回収から細胞を同定した。次いで、標的単一の細胞またはTECCを洗浄バッファの10μl小滴にマイクロピペット移送したのち、適切なバッファ:scrmPCRの場合には2×反応バッファ(CellsDirect One-Step qRT-PCRキット、Life Technologies)5μl、全ゲノム増幅の場合にはPBS2μlまたは低入力RNA-Seqの場合にはSuperBlockバッファ(Thermo Scientific)2μlを含む0.2mlのPCRチューブに入れた。使用するまで細胞をただちに−80℃で貯蔵した。いくつかの場合、完全な精密濾液をスピンダウンし、さらなる使用まで−80℃で貯蔵した。
EMTを受ける単一の細胞中のDNA突然変異の存在を確認するために、単一の細胞スケールでRNA転写産物の定量とDNA突然変異の検出とを同時に行うためのPCRプロトコルを確立した(単一の細胞RNAおよび突然変異分析PCRまたは「scrmPCR」)(図5、補足表1)。
およびリバースプライマー
を使用してPCR増幅を実施した。PCR産物をアガロースゲル上で分離し;特異的なバンドを切除し、サンガー法を使用してシークエンシングした。
RNAqueous-Micro全RNA単離キット(Ambion)を製造者の取扱説明書にしたがって使用して完全な精密濾液または単離細胞をRNA抽出に供した。RNeasyミニキット(Qiagen)を使用して組織から全RNAを単離した。DNeasyミニキット(Qiagen)を使用して組織からDNAを単離した。
GenomePlex単一の細胞全ゲノム増幅キット(Sigma)を使用し、製造者の取扱説明書にしたがって、単一TECCを全ゲノム増幅に供した。同じ手法を使用して組織DNA(50pg)試料を増幅した。ターゲットリシークエンシングの場合、NRAS、CTNNB1、PIK3CA、EGFR、BRAF、PTEN、KRAS、AKT1およびTP53遺伝子(約6.1kb)のためのエクソンをターゲットとするカスタム遺伝子パネルを設計した。Ion AmpliSeqライブラリキット2.0(Life Technologies)を入力DNA10ngとともに使用してライブラリを構築した。Ion Torrent Personal Genome Machine(PGM)シークエンサ(Life Technologies)上でターゲットリシークエンシングランを実施した。高ストリンジェンシー設定でIon Torrent Variant Caller Pluginを使用して変異コールを実施した。DNA250ngをCytoScan 750 Kアレイ(Affymetrix)に製造者の取扱説明書および試薬でハイブリダイズさせることにより、aCGHを実施した。Chasソフトウェアversion 2.1(Affymetrix)を使用してデータを分析し、可視化した。図6fはaCGH分析の結果を示す。線は、Affymetrix ChASソフトウェアを使用して計算された平滑化データを示す。星印は、腫瘍試料中で検出された大きな染色体異常を示す。TECC中に染色体異常を発見することはできず、TECCが腫瘍上皮に由来しないことを示したことに注目すること。そのようなものとして、TECCは、以前に記載されている悪性CTCクラスターとは異なる。
8名の患者からの18の単一TECCならびに対応する正常結腸組織および腫瘍組織をハイスループットシークエンシング(RNA-Seq)によってRNA発現プロファイリングに供した(図9c、補足表4)。SMARTer Ultra Low RNAキット(Clontech Laboratories)により、それぞれ25サイクルおよび18サイクルの長距離PCR(LDPCR)を使用して、単一TECCおよび組織RNA10pgからcDNAを合成した。試料ごとに、Adaptive Focused Acousticsシステム(Covaris)を使用してcDNAを剪断した。NEBNext DNA Library Prep Master Mixキット(New England Biolabs)を使用してライブラリを構築した。ユニークインデックスを使用してすべてのライブラリをバーコード化し、Illumina HiSeq 2000プラットフォームでのRNAシークエンシングランのためにプールした。Tophat(version 2)(Trapnell et al., 2009)を使用してデータをHuman Genome version 19(hg19)にマッピングした。Cufflinks(version 2.2)(Trapnell, C. et al., 2010)を使用して、遺伝子発現をFPKM(Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads)として定量化した。
完全なRNA-Seqデータセットに対する主成分分析(図9a〜c)を実施した。第一から第三までの主成分における最大負荷によって選別された上位300の遺伝子を選択することにより、順位相関係数を計算した。このリストから、各TECCおよび組織に関してスピアマン順位相関係数(ρ)を計算し、得られたデータをヒートマップとしてプロットした。平均連結クラスターリングによってデンドログラムを生成した。
細胞系推論のためのワークフローが図14に示され、要求に応じて利用可能なRスクリプト中で実施された。簡単にいうと、初代細胞アトラスデータセット(GSE49910)(Mabbott et al.)を取得し、298の異なる実験から、N=42の異なる細胞タイプまたは「細胞系」に対応する発現データを選択した(図15)。各細胞系l中の遺伝子gごとに、シャノン情報エントロピーおよびSchug et al.らによって導入されたQ統計量に基づいて「特異性指数」Sを計算した。
式中、p(l|g)は、細胞系lにおける遺伝子gの相対的発現である。BioGPSを使用して、特異性指数が高い遺伝子の発現データを可視化することによって、遺伝子特異性を確認した(図14)。細胞系ごとに、特異性指数が最も高い上位80個の遺伝子(特異的遺伝子)を選択した(図14a)。本明細書で報告される分析において最良の解を提供したため、80個の遺伝子を選択した。次に、各RNA-Seq試料について、各細胞系に特異的な遺伝子の数を計算した。同時に、Affymetrix HG-U133_Plus_2遺伝子リストから80個のランダムに選択された遺伝子のリスト×1,000を生成し(「ランダム遺伝子」)、各実験RNA-Seqプロファイル中に偶然に存在する遺伝子の平均数を決定した。最後に、各実験試料中の試験された細胞系ごとにフィッシャーの正確確率検定を実施することにより、富化された特異的遺伝子の数が、ランダムに富化された遺伝子の数に等しいかどうかを検査した。検定ごとのオッズ比を平均中心化し、スケーリングし、試験したすべての細胞系を含むヒートマップ中に可視化した。最終的な結果を使用して、正規化されたオッズ比の分布に基づいて、細胞系に関する仮説を立てた。様々な細胞タイプおよび組織から生成された公表されているRNA-Seqデータセットを使用してアルゴリズムをバリデートした(図15)。
以前に記載されているようにして(Kalka et al., Colombo et al.)、コロニー形成性EPCアッセイを実施した。簡単にいうと、2ml精密濾液中、生きた内皮TECCをCD144およびカルセインAM蛍光染色によってカウントした。次いで、第二のデバイスからの血液2mlからの染色されていない精密濾液を、フィブロネクチン(1μg/cm2)(Sigma-Aldrich)でコートされた96ウェルプレート上、EGM-2細胞培地(Lonza)の存在下で培養した。インキュベーションの前に明視野顕微鏡検査によってTECCの存在を確認した。以下のように、HUVECを陽性対照として使用した。10,000個のHUVECをドナー血液2ml中にスパイクし、2つのデバイスを使用する精密濾過によって単離した。1つのデバイス中、回収されたHUVECをCD144およびカルセインAM蛍光染色によって定量化した。他方のデバイスから回収されたHUVECを所定の数(5、10、20、40、80および160個)にて8個一組でウェル中に播種した。2日後、培地を交換し、一日おきに培地の半分を交換しながら合計30日間、細胞を増殖させた。コロニーの存在および生存度を明視野顕微鏡下で毎週モニタリングした。30日後、トリプシン処理によって細胞を剥がし、CD144抗体、カルセインAMおよびHoechst 33342を使用して染色し、IX81(Olympus)倒立蛍光顕微鏡下で定量化した。
以前に記載されているように(Wild et al., Gupta et al.)、ImageJ(Schneider et al.)を使用して、CD31染色組織切片の免疫蛍光画像を使用して微小血管密度(MVD)カウントを実施した。簡単にいうと、新鮮な組織をTissue-Tek O.C.T Compound(Sakura)に埋め込み、さらなる使用まで−80℃で貯蔵した。すべての利用可能な組織から、5マイクロメートルクリオスタット切片をポリ-L-リシンスライド上で切り出し、4%パラホルムアルデヒドを含有するPBS中で8分間固定し、PBS中で洗浄し、PE抗CD抗体(1:20、クローンWM59、BioLegend)を使用して染色した。組織切片ごとの全腫瘍面積をIX71顕微鏡システム(Olympus)およびMetaMorphソフトウェア(Molecular Devices)によって10×対物レンズで画像化した。画像化の前ならびにMVDおよび内腔カウントの間じゅう、データ取得および分析中の主観的偏りを回避するために患者IDを伏せておいた。
以前に記載されているように(Van Beijnum et al.)、ただしプロトコルに小さい変更を加えて、正常な結腸組織および腫瘍組織から内皮細胞を単離した。簡単にいうと、新鮮な組織を切り刻み、記載のようにコラゲナーゼ、ディスパーゼおよびDNAseを使用して37℃で60分間消化させた。Ficoll-Paque密度遠心分離工程ののち、MACS試薬および材料(Miltenyi Biotec)を製造者の取扱説明書にしたがって使用して二工程磁気選択を実施した。まず、抗CD45磁性ビーズおよびヒトFcRブロッキング試薬で細胞を標識したのち、CD45-発現細胞をLDカラム上で負の選択によって除去した。次に、CD45除去分画を捕集し、抗CD31磁性ビースおよびヒトFcRブロッキング試薬を加えることによって第二の標識を実施した。MSカラムを使用する正の選択ののち、CD31+CD45-細胞が富化された分画をさらなる使用まで−80℃で貯蔵した。
TECCは、大腸がん患者の血液中に検出することができるだけでなく、他の悪性腫瘍、たとえば乳がん、前立腺がん、腎臓がん、移行上皮細胞がん、肺がんおよび胆管がんの患者においても検出することができる(表3および4を参照)。したがって、TECCのバイオマーカーを、任意のタイプのがんの検出ならびに化学療法および手術などの治療の転帰のモニタリングおよび予測のために使用することができる。
R環境で統計分析を実施した(version 3.1.0)(R Core Team et al.)。複数の比較の場合、両側ウィルコクソン・マン・ホイットニーU検定をボンフェローニ補正とともに使用して対応のない標本を試験した。試験ごとに、「コイン」パッケージ(Zeileis et al.)を使用して、位置パラメータ(ホッジス・レーマン推定量
)での正確なP値およびその95%信頼区間(CI)を計算した。対応のある標本の場合、両側正確確率ウィルコクソン符号順位検定を使用した。「pROC」パッケージ(Robin et al.)を使用して、ROC曲線をAUCおよび95%CI区間とともに計算した。効果量の容易な解釈および比較のために、統計的検定ごとの効果量rを以下のように導出した。
式中、Zは、ウィルコクソン・マン・ホイットニーU検定またはウィルコクソン符号順位検定のZスコアである(Rosenthal, et al.)。AUCからのrは、Rice & Harris(Rice et al.)に記載されているように導出した。Cohen(Cohen et al.)によって導入されたように、以下の解釈を適用した:r=0.1、効果小;r=0.3、効果中;r=0.5、効果大。ボックスプロットが、四分位数範囲(IQR)を表すボックスとして示され、ボックスにかかる線は中央値を示し、ひげは1.5×IQRを示す。症例対照研究に必要な最小試料サイズを導出するために、まず、TECCの存在と大腸がんの存在との間に関係がないと仮定し(帰無仮説)、0.95のターゲットパワーの場合、「pwr」パッケージ(Champely et al.)のpwr.chisq.test関数を使用してn=72の最小試料サイズを推定した。0.01の有意水準でw=0.5の効果量を仮定した。w=0.5は、5名の大腸がん患者の予備試験、陰性TECCカウントを示す4名の健常対照者から導出された情報ならびに健常者におけるTECCの非存在および様々ながんタイプの症例における広範なTECCの存在を報告した文献(補足表1)のレビューに基づいて選択されたものである。ケンドールのタウ(τ)係数およびその導出P値を使用して相関を試験した。RNA-Seqデータの細胞系推論および主成分分析のために、そのための方法段落に記載されたようにして、フィッシャーの正確確率検定およびスピアマン順位相関係数(ρ)をそれぞれ使用した。有意水準は0.05に設定した。星印1つ(*)、P<0.05;星印2つ(**)、P<0.01;星印3つ(***)、P<0.001;非有意(ns)、P≧0.05。
大腸がん患者から単離されたTECCはがん性ではなく、腫瘍由来内皮細胞の別個の集団を表す。TECCは、対応する腫瘍の遺伝的変異を反映しないが、TECCは、CTC表現型に関する以前の報告と合致して、上皮および間葉転写産物を発現する。単一TECCのトランスクリプトーム分析は、内皮細胞としてのそれらの正体を明らかにし、さらなる結果が、それらの腫瘍起源および成熟表現型を示す。術前の早期がん患者から採取された血液中には内皮TECCの広範な存在が見られたが、健常ドナーにおいては見られず、大腸がんの潜在的指標としての内皮TECCカウントが示唆された。内皮TECCは真正CTCと混同されるべきではないが、その分析は診断的に有用であり、治療および疾患経過中に基礎となる腫瘍血管系に関する直接的な情報を提供する。
凡例:
P、患者
T、腫瘍組織
c、中心
d、深部
s、表在
N、正常組織
Met、転移
TECC、腫瘍由来内皮細胞クラスター
Claims (5)
- 以下の特徴:
(i)大腸がん患者に由来する腫瘍の血管に由来しかつ大腸がん患者の血液から単離された内皮細胞であること;
(ii)各細胞が少なくとも2つの明らかに別個の核を有すること;
(iii)各細胞が約10μmよりも大きい長軸を有すること;
(iv)内皮細胞遺伝子またはタンパク質の発現;
(v)白血球に特異的な遺伝子またはタンパク質の非発現;および
(vi)巨核球または血小板に特異的な遺伝子またはタンパク質の非発現;
を有する、単離された細胞集団。 - 前記内皮細胞遺伝子が、PECAM1、VWF、およびCDH5からなる群より選択される;ならびに白血球および巨核球もしくは血小板に特異的な前記遺伝子が、PTPRC、ITGA2B、およびGP1BAからなる群より選択される、請求項1に記載の単離された細胞集団。
- 対象における大腸がんを検出する方法であって、該対象からの試料を請求項1または2に記載の単離された細胞集団の存在に関して分析する工程を含み、該単離された細胞集団の存在によって該対象が大腸がんを有することが示される、前記方法。
- 大腸がん患者の治療に対する応答性をモニタリングおよび/または予測する方法であって、治療後に該患者から得た試料を、請求項1または2に記載の単離された細胞集団の数の決定に関して分析する工程を含み、該単離された細胞集団の数が、治療前に該患者から得たベースライン試料中の単離された細胞集団の数と比べて減少していることによって、該患者が該治療に対して陽性に応答していることが示される、前記方法。
- 大腸がん患者の治療に対する応答性を予測する方法であって、治療前に該大腸がん患者から得た試料を、請求項1または2に記載の単離された細胞集団の数の決定に関して分析する工程を含み、該単離された細胞集団の数が、該治療に対して陽性に応答した患者または患者群から治療前に得た試料中の単離された細胞集団の数と比べて等しいまたは多いことによって、該大腸がん患者が該治療に対して陽性に応答することが示され、該単離された細胞集団の数が、該治療に対して陽性に応答した患者または患者群から治療前に得た試料中の単離された細胞集団の数と比べて少ないことによって、該大腸がん患者が該治療に対して陰性に応答することが示される、前記方法。
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