CN112358943A - 用于基于大小回收稀有细胞的以柱为基础的装置和方法，及其用途 - Google Patents

用于基于大小回收稀有细胞的以柱为基础的装置和方法，及其用途 Download PDF

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Abstract

公开了一种用于回收目的细胞的以柱为基础的装置和方法。所述装置包括柱，所述柱包括：(i)界定内腔室的内壁，所述内腔室具有入口开口和出口开口，(ii)邻近出口开口安置的穿孔塞，(iii)具有通道并且安置在腔室内并且邻近穿孔塞的套筒插入物，和(iv)容纳在套筒插入物内并且被夹在两个密封装置中间的过滤装置。具体来说，可以使用所公开的装置回收肿瘤来源的内皮细胞簇(TECC)，其特征在于具有多个核，表达内皮标志物(PECAM1、VWF和CDH5)以及不表达白细胞、巨核细胞和血小板标志物。还涵盖了通过使用要求保护的装置检测从血液样品分离的TECC的存在而用于癌症的诊断和预后的方法、试剂和试剂盒。

Description

用于基于大小回收稀有细胞的以柱为基础的装置和方法，及 其用途
本申请为一项发明专利申请的分案申请，其母案的申请日为2016年1月21 日、申请号为201680014812.9、发明名称为“用于基于大小回收稀有细胞的以柱为基础的装置和方法，及其用途”。
相关申请的引用
本申请要求2015年1月21日提交的新加坡临时申请第10201500471Q和10201500472R号的优先权，其内容以引用方式全部并入本文中以用于所有目的。
技术领域
本发明涉及一种用于回收目的细胞、尤其是稀有细胞的装置和方法。本发明还涉及使用所公开的装置和方法回收的细胞，和所述细胞作为生物标志物用于癌症诊断和预后的用途。
背景技术
对于疾病状态例如癌症的精确诊断来说，稀有细胞例如患病细胞的检测和回收正变得越来越重要。癌症是全球范围内第二大死因，2012年造成820万人死亡。如果被早期检测到和治疗的话，癌症死亡率可以显著降低。然而，用于可靠地早期检测癌症的方法主要包括使用内窥镜检查或放射性扫描，这是高成本的并且对患者造成特定健康风险。
当前可获得的用于分离和检测细胞的大多数装置只聚焦于捕获细胞(例如使用过滤筛)，但没有回收被捕获到的细胞。这导致被捕获到的细胞的随后分析仅限于筛上表征，例如使用免疫组织化学染色。使用此类装置，对于目的单细胞的更复杂分析(例如DNA突变分析或基因表达分析)是不可行的。当前可获得的用于分离稀有细胞的装置和方法存在缺陷，即需要额外步骤(使用繁琐技术，例如激光解剖显微镜)来分离粘附在滤器上的细胞。实际上，使用可获得的微过滤装置分离的稀有细胞容易粘附到滤器或装置的其他组件上，这对回收效率造成负面影响或甚至阻碍任何细胞被回收以用于下游分析。
因此，需要提供一种用于有效捕获和回收细胞、尤其是稀有细胞的装置和方法，其克服或至少改善以上所述的一个或多个缺点。需要以稀有细胞不粘附到装置的组件和滤器上的方式优化使用方法、材料和/或装置配置来优化回收分离稀有细胞的效率，使得稀有细胞可以被容易且有效地回收以用于下游程序。
需要提供用于癌症早期检测的侵入性更小的筛选测试方法。
发明内容
在第一方面，提供一种用于从样品捕获和回收细胞的设备，其包括至少一个柱，所述柱包括：
(i)界定内腔室的内壁，所述内腔室在柱的第一端具有用于接收样品的入口开口，并且在柱的第二端具有出口开口；
(ii)在内腔室内部邻近柱的第二端配置的穿孔塞；
(iii)在第一端具有开口并且在第二端具有开口的套筒插入物，所述套筒插入物包括在第二端逐渐变细的通道并且安置在内腔室内，其第二端邻近穿孔塞；和
(iv)容纳在套筒插入物内的过滤部件，所述过滤部件包括夹在两个密封装置中间的筛。
在第二方面，提供一种用于从样品捕获和回收细胞的方法，其包括以下步骤：
(a)将样品引入本文所述的设备的入口开口以允许样品流过设备的套筒插入物和过滤部件；和
(b)收集在设备的过滤部件中的筛的表面上保留的残余物。
在第三方面，提供一种具有以下特征的分离细胞群体：
(i)是来源于肿瘤并且分离自血液的内皮细胞；
(ii)每个细胞都具有至少两个明显区别的核；
(iii)每个细胞都具有大于约10μm的主轴；
(iv)表达内皮细胞基因或蛋白质；
(v)不表达白细胞特异性基因或蛋白质；和
(vi)不表达巨核细胞或血小板特异性基因或蛋白质。
在第四方面，提供一种在受试者的样品中检测本文所述的分离细胞群体的方法，所述方法包括：
(a)使用本文所述的设备或本文所述的方法从样品捕获和回收细胞。
在一个实施方案中，第四方面的方法另外包括以下步骤：
(b)将来自步骤(a)的细胞与偶合到可检测标记上的至少一个抗体接触以允许所述抗体结合到在所述细胞上表达的一个或多个目标生物标志物；
(c)从所述样品中去除未结合的抗体；和
(d)检测和分析结合到所述抗体的所述可检测标记以检测所述分离细胞群体。
在另一个实施方案中，第四方面的方法另外包括以下步骤：
(b)裂解来自步骤(a)的细胞；
(c)将来自步骤(b)的裂解细胞样品与来自第一引物对的反向引物以及反转录酶接触以实现RNA反转录成cDNA，所述来自第一引物对的反向引物被导向目标RNA区域；
(d)随后使来自步骤(c)的样品与以下物质接触：
(i)来自第一引物对的正向引物，所述来自第一引物对的正向引物被导向目标cDNA区域，
(ii)来自第二引物对的反向引物和正向引物，所述来自第二引物对的反向引物和正向引物被导向目标DNA区域，和
(iii)DNA聚合酶，
以在预扩增步骤中同时扩增目标cDNA区域和目标DNA区域；和
(e)分析扩增的目标cDNA区域和/或扩增的目标DNA区域。
在一个实施方案中，第四方面的方法另外包括：使来自步骤(d)的样品经历半巢式PCR，所述半巢式PCR使用步骤(c)中的反向引物或步骤(d)(i)中的正向引物，和在扩增的目标cDNA区域内部结合的巢式引物。
在另外一个实施方案中，第四方面的方法另外包括：使来自步骤(d)的样品经历巢式PCR，所述巢式PCR使用在扩增的目标DNA区域内部结合的巢式引物对。
在第五方面，提供一种用于在受试者的样品中检测第三方面的分离细胞群体的方法，所述方法包括：
(a)将来自所述样品的细胞与偶合到可检测标记上的至少一个抗体接触以允许所述抗体结合到在所述细胞上表达的一个或多个目标生物标志物；
(b)从所述样品中去除未结合的抗体；和
(c)检测和分析结合到所述抗体的所述可检测标记以检测所述分离细胞群体。
在第六方面，提供一种用于在受试者的样品中检测第三方面的分离细胞群体的方法，所述方法包括：
(a)裂解所述样品中存在的细胞；
(b)将来自步骤(a)的裂解细胞样品与来自第一引物对的反向引物以及反转录酶接触，以实现RNA反转录成cDNA，所述来自第一引物对的反向引物被导向目标RNA区域；
(c)随后将来自步骤(b)的样品与以下物质接触：
(i)来自所述第一引物对的正向引物，所述来自第一引物对的正向引物被导向目标cDNA区域，
(ii)来自第二引物对的反向引物和正向引物，所述来自第二引物对的反向引物和正向引物被导向目标DNA区域，和
(iii)DNA聚合酶，
以在预扩增步骤中同时扩增目标cDNA区域和目标DNA区域；和
(d)分析扩增的目标cDNA区域和/或扩增的目标DNA区域。
在一个实施方案中，第六方面的方法另外包括：使来自步骤(c)的样品经历半巢式PCR，所述半巢式PCR使用步骤(b)中的反向引物或步骤(c)(i)中的正向引物，和在扩增的目标cDNA区域内部结合的巢式引物。
在另外一个实施方案中，第六方面的方法另外包括：使来自步骤(c)的样品经历巢式PCR，所述巢式PCR使用在扩增的目标DNA区域内部结合的巢式引物对。
在第七方面，提供一种诊断受试者的癌症的方法，其包括分析来自受试者的样品中是否存在本文所述的分离细胞群体，其中存在所述分离细胞群体指示受试者具有癌症。
在第八方面，提供一种用于监测和/或预测癌症患者对于治疗的应答的方法，所述方法包括分析从治疗后患者获得的样品以测定本文所述的分离细胞群体的数目，其中与从治疗前患者获得的基线样品中的所述分离细胞群体的数目相比，所述分离细胞群体的数目的减少指示患者对治疗处于阳性应答。
在第九方面，提供一种用于预测癌症患者对于治疗的应答的方法，所述方法包括分析从治疗前癌症患者获得的样品以测定本文所述的分离细胞群体的数目，其中与在治疗前从已经对治疗有阳性应答的患者或一组患者获得的样品中的所述分离细胞群体的数目相比，所述分离细胞群体的数目相等或更高指示所述癌症患者将对治疗阳性应答，且其中与在治疗前从已经对治疗有阳性应答的患者或一组患者获得的样品中的所述分离细胞群体的数目相比，所述分离细胞群体的数目更低指示所述癌症患者将对治疗阴性应答。
在第十方面，提供一种用于分析受试者的肿瘤的血管特征的方法，所述方法包括分析来自所述受试者的样品以测定本文所述的分离细胞群体的数目，其中与基线样品相比，所述分离细胞群体的数目增加指示肿瘤相比基线样品具有更大的血管，且其中与基线样品相比，所述分离细胞群体的数目减少指示肿瘤相比基线样品具有更小的血管。
在第十一方面，提供一种用于第二、第四、第七、第八、第九或第十方面的方法中的试剂盒，所述试剂盒包括：
(a)本文所述的设备。
在一个实施方案中，第十一方面的试剂盒另外包括以下一种或多种：
(b)一种或多种细胞裂解缓冲液；
(c)选自由以下组成的组的引物：
i.第四方面的方法的步骤(c)的反向引物，
ii.第四方面的方法的步骤(d)(i)的正向引物，
iii.第四方面的方法的步骤(d)(ii)的引物对，和
iv.第四方面的方法的巢式引物和巢式引物对；
(d)一种或多种试剂，选自由以下组成的组：
i.用于第四方面的方法的步骤(c)中的反转录的反转录酶和一种或多种合适的反应缓冲液，
ii.用于第四方面的方法的步骤(d)中的扩增或用于第四方面的方法的半巢式或巢式PCR的DNA聚合酶和一种或多种合适的反应缓冲液，以及
iii.一种或多种经标记或未经标记的脱氧核糖核苷酸，选自由dATP、 dCTP、dGTP和dTTP或dUTP组成的组；以及
(e)能够特异性结合到选自由PAI-1、波形蛋白(Vimentin)、FOXC1、角蛋白-8、角蛋白-18、角蛋白-19、Ep-CAM、CD45、VWF、PECAM-1、CD146、CD41、CD34、PSMA、CD105、CD309、CD144、CD202B和血管生成素 (Angiopoietin)2组成的组的蛋白质的抗体，其中所述抗体偶合到可检测标记上；和任选地，用于检测所述可检测标记的部件。
在第十二方面，提供一种用于第五、第六、第七、第八、第九或第十方面的方法中的试剂盒，所述试剂盒包括以下一种或多种：
(a)一种或多种细胞裂解缓冲液；
(b)选自由以下组成的组的引物：
i.第五方面的方法的步骤(b)的反向引物，
ii.第五方面的方法的步骤(c)(i)的正向引物，
iii.第五方面的方法的步骤(c)(ii)的引物对，和
iv.第五方面的方法的巢式引物和巢式引物对；
(c)一种或多种试剂，选自由以下组成的组：
i.用于第五方面的方法的步骤(b)中的反转录的反转录酶和一种或多种合适的反应缓冲液，
ii.用于第五方面的方法的步骤(c)中的扩增或用于第五方面的方法的半巢式或巢式PCR的DNA聚合酶和一种或多种合适的反应缓冲液，以及
iii.一种或多种经标记或未经标记的脱氧核糖核苷酸，选自由dATP、 dCTP、dGTP和dTTP或dUTP组成的组；以及
(d)能够特异性结合到选自由PAI-1、波形蛋白、FOXC1、角蛋白-8、角蛋白 -18、角蛋白-19、Ep-CAM、CD45、VWF、PECAM-1、CD146、CD41、CD34、 PSMA、CD105、CD309、CD144、CD202B和血管生成素2组成的组的蛋白质的抗体，其中所述抗体偶合到本文所述的可检测标记上；和任选地，用于检测所述可检测标记的部件。
在另一实施方案中，第十一或第十二方面的试剂盒另外包括关于执行本文所述的方法的说明书。
附图说明
当结合非限制性实施例和附图考虑时，本发明将参考具体实施方式得到更好地理解，其中：
图1显示用于捕获和回收稀有细胞的本文所述的装置的实施例。(A)显示插入套筒，其在上端具有入口且在下端具有出口。插入套筒用作细胞捕获筛的外壳，将细胞捕获筛固定在柱的出口附近。样品从插入套筒的入口流入，并通过插入套筒的出口流出。(B)显示样品所流过的通道在插入套筒的下端逐渐变细。 (C)说明插入套筒(或在本文中互换使用的“套筒插入物”)和细胞捕获筛在装置的柱中的装配。细胞捕获筛(被夹在用作密封部件的两个O形环中间)首先放在插入套筒出口附近的狭槽中，然后使用杆形的插入工具(未展示)将整个装配件插入到柱中。(D)显示当在本文所述的方法中使用所述装置时，在一个示例性配置中，两个细胞捕获和回收装置连接到蠕动泵。血液样品通过所述装置过滤。(E)显示使用具有各种孔径的细胞捕获筛排除污染性白血球(WBC)和红血球(RBC)。1ml全血通过所述装置过滤。污染性WBC和RBC被回收和计数(黑色柱)，或者在使蠕动泵的流动短时间反转(“反冲”)以去除粘附在筛上的细胞之后被回收和计数(白色柱)。排除倍数计算如下：WBC或RBC的排除倍数＝ (全血中的WBC或RBC)/(微滤液中的WBC或RBC)。(E)中的线表示从针对每个测试条件使用三种不同装置的测试获得的平均值。误差线表示标准偏差。(F) 显示SW620的大小分布(浅灰色线)(n＝50)。Coumans,F等人,2013分别报道了从结直肠癌、前列腺癌和乳腺癌患者分离的WBC和循环肿瘤细胞(CTC)的中值大小。(G)显示使用掺有各种细胞系的全血的装置的回收效率。标记20到 50个细胞/ml并将其掺入1ml或3ml全血中。每个血液样品通过所述装置，并回收靶细胞，将靶细胞放置在96孔板中并计数。回收效率计算如下：％回收效率＝(回收的细胞)×100/(掺入加的细胞)。每个点都对应于独立实验。
图2显示使用本文所述的细胞捕获和回收装置的与捕获效率相比的回收效率，其中细胞捕获筛具有不同的孔径(8μm、9μm、10μm)。(A)显示使用HCT 116细胞的结果。对于每个独立实验，将30到50个HCT 116细胞掺入到1ml 全血中，将回收的细胞放置在96孔板中并计数。检查装置上保留的细胞的数目。捕获细胞的数目＝回收细胞的数目+装置上保留的细胞的数目。结果显示 HCT 116细胞可以>98％的效率回收。捕获效率＝(捕获细胞的数目)×100％/掺入细胞的数目。回收效率＝(回收细胞的数目)×100％/捕获细胞的数目。(B) 显示使用RKO细胞的结果。RKO细胞的捕获效率低于HCT 116细胞。然而，对于所用的细胞捕获筛的所有孔径，捕获的RKO细胞的回收效率都是100％。 (C)显示硅微筛的亮场合成图像(左上图)、扫描电子显微照片(右上图)和利用硅和氮化硅作为不同过滤材料的微筛的照片(下图)。(D)显示用HepG2细胞测试的使用不同过滤材料的细胞捕获和回收效率，这表明两种不同的过滤材料硅和氮化硅提供类似的细胞捕获和回收效率。
图3显示使用本文所述的微过滤装置回收肿瘤来源的内皮细胞簇(TECC)。 (A)显示本文所述的微过滤装置的示例性安装，其中各自包围硅微筛(插图，比例尺＝10μm)的4个微过滤装置连接到用于流量控制的蠕动泵。(B)显示用于各种下游应用的微过滤程序，所述下游应用包括成像、计数、单细胞分离和分析、细胞培养以及合并的核酸提取。数字指示每个步骤的过程时间(以分钟计)。(B) 中所示的详细程序如下：将全血样品(例如2ml)通过筛过滤8分钟，洗涤20 分钟，并在筛上染色34分钟，总计62分钟。实施例3描述筛上免疫荧光的详细程序。(C)显示硅微筛的使用允许被捕获的细胞的有效回收。来自全血的 SW620细胞的捕获效率，其指示可以被回收以用于下游分析(黑色柱)、因为粘附到微筛上而丢失(白色柱)、或者在分离程序期间丢失(灰色柱)的在微筛上的被捕获到的细胞的百分比。显示4个独立实验的结果。(D)显示针对下游单细胞显微操作的回收效率和纯度的最佳化。散点图表示使用各种流动速率和微筛孔径的实验。黑色虚线长方形指示>90％回收效率和>5×103WBC排除的目标区域，用于被回收细胞的最佳下游处理。数据点是每个条件下的3个独立实验的平均值±s.e.m.。
图4显示使用本文所述的装置捕获和回收的细胞的可视化。(A)显示从结直肠癌患者的血液回收的细胞可以通过使用标准微分干涉相差(DIC)的倒置荧光显微镜容易地可视化。观察到大型多核细胞簇或微栓。(B)显示从临床样品回收的细胞簇可以被容易地显微操作并分析其基因表达和基因组DNA含量。在这个实施例中，通过针对CD45和DAPI的免疫荧光染色鉴别细胞簇，随后对所述细胞簇进行显微操作以分析基因表达和基因组DNA含量。
图5提供本文所述的scrmPCR方法的概念验证。将单一DLD-1和RKO细胞(结直肠癌细胞系)在5μl 2x反应缓冲液(CellDirect试剂盒)中显微操作。然后如本文所述进行scrmPCR，得到(a)中所示的结果。扩增属于TP53、KRAS 和BRAF基因的基因组区域。对PCR产物进行桑格测序(Sanger sequencing)，并检测到先前在两种细胞系中已被表征的已知热点突变，如(b)中所示。同时扩增来自相同细胞的若干转录物，且所述转录物显示在两种细胞系中都具有可变基因表达。通过熔解曲线峰值温度和通过单峰的存在证明基因表达特异性，如(c) 中所示。
图6显示TECC表达上皮细胞-间充质转型(EMT)标志物，但不反映原发肿瘤突变或染色体异常，从而指示TECC和CTC是不同的实体。(a)显示用于单细胞或单TECC的本文所述的示例性scrmPCR工作流。(b)显示来自4名具有已知原发性肿瘤突变的结直肠癌患者的9个TECC的图像，所述TECC在单个管中被显微操作以用于下游scrmPCR。(c)显示(b)中所示的TECC和对照单细胞针对指定上皮和间充质标志物和PTPRC(CD45)的基因表达热图。颜色代表从没有(黑色)到最大(浅灰色)的基因表达。NTC–无模板对照。(d)显示来源于 (b)和(c)中所示的相同单一TECC的热点基因序列的色谱图。匹配的原发性肿瘤和正常结肠组织(上图)用于比较基因突变。应注意，在TECC中没有发现此类突变，表明TECC不是来源于肿瘤上皮，因为此类TECC不同于先前描述的恶性CTC簇。(e)TECC阵列比较性基因组杂交(aCGH)显示具有已知染色体异常的代表性结直肠癌患者的3个TECC的图像。(f)显示利用匹配的正常组织和肿瘤组织对(e)中所示的TECC的aCGH分析。(g)显示对于指定组织和TECC 的染色体7和8的分析。线条指示使用Affymetrix ChAS软件计算的平滑数据。
图7显示TECC表达EMT标志物，但具有正常的染色体结构。(A)显示两个TECC的关于CD45、波形蛋白(VIM)、泛细胞角蛋白(pan-Keratin)(CK) 和DAPI的代表性4色免疫荧光，指示异源间充质和上皮标志物表达(箭头的点指示可见染色)。(B)显示用于评估全基因组扩增(WGA)对于使用单细胞的aCGH 实验的影响的对照实验。(C-E)各自显示对于指定患者的单TECC的aCGH，类似于(B)中所示的正常组织DNA。如(c-e)中所示，在TECC中，无法发现染色体异常，表明TECC不是来源于肿瘤上皮。因此，TECC不同于之前所述的恶性 CTC簇。
图8显示TECC的表征。(A)显示对照单细胞和14个TECC(N＝4名患者) 中的scrmPCR基因表达指示存在内皮细胞标志物，但不存在上皮细胞标志物，或白血球(白细胞)、红血球(红系细胞)、血小板/巨核细胞或破骨细胞的标志物。(B)显示免疫荧光研究的结果，证实TECC的内皮谱系。用指定抗体和各染色的内参来染色代表性TECC。中间的插图，CD41&CD42B+血小板聚集体。右边的插图，CD45+白血球。(C)表格指示对于指定免疫荧光呈现阳性或阴性的 TECC计数(N＝68名患者)。(D)用于将TECC归类为正常内皮细胞(NEC) 和肿瘤内皮细胞(TEC)的实验程序。(E)在NEC和TEC之间差异性地表达的基因。通过NOISe计算的差异性表达的PNOI概率。Log2FC，log2(倍数变化)。(F) 堆积到100％的柱状图，指示TECC被归类为TEC(红色柱)和NEC(蓝色柱)。左边的柱指示观察到的概率；右边的柱指示通过1000个随机签名获得的平均概率。**P＝0.003，效应值r＝0.46，精确二项式检验。这个实验指示TECC实际上是手术前和手术后的肿瘤来源(G)的纵向样品收集策略。(H)梯形图显示手术前 0-24小时和手术后24-72小时的CD31+CD45–TECC计数。直线连接来自同一名患者的数据。***P＝0.0006，效应值r＝0.54。这个实验支持TECC来源于肿瘤的假设，因为它们在肿瘤切除后很快消失。
图9显示TECC和CTC簇的谱系图(Aceto等人)。(a)显示具有上皮和间充质谱系特征的选定乳腺癌细胞系以及原代内皮细胞被用作上皮、间充质干细胞和内皮谱系的阳性对照。使用Cima I等人所述的方法对谱系绘图。(b)显示Aceto 等人报道的CTC簇的谱系推理，其显示存在上皮来源的细胞簇。(c)显示在这个研究中分析的单TECC的谱系推理指示TECC是内皮细胞且因此和CTC簇不同。
图10显示使用scrmPCR扩增和分析PSMA基因。针对正常内皮细胞和肿瘤内皮细胞的指定样品以及针对指定健康供体(D)或CRC患者(P)的血液微滤液显示PSMA(FOLH1)基因表达。F，女性；M，男性。
图11显示在TECC中表达的肿瘤内皮标志物。在正常组织、肿瘤组织和 TECC中表达额外的肿瘤内皮标志物，从RNA-Seq数据检测。PLXDC1，含从蛋白(plexin)结构域1(肿瘤内皮标志物3/7)；MMP2，基质金属蛋白酶2；NID1，巢蛋白1(nidogen 1)；MMP11，基质金属蛋白酶11；CLEC14A，C型凝集素结构域家族14成员A；POSTN，骨膜蛋白(periostin)；VWF，血管性血友病因子 (von Willebrand factor)；ECSCR，内皮细胞表面表达的趋化作用和细胞凋亡调节物。
图12显示在结直肠癌(CRC)患者中检测到TECC，但在健康个体中检测不到。(A)显示健康对照(中值＝0，N＝45)和CRC患者(中值＝4.5，N＝80) 的TECC计数。***P＝7.31×10-15，效应值r＝0.65。(B)在结直肠癌的治疗序列期间TECC计数的趋势。在以下离散时间点独立地收集血液样品：1)无治疗，2) 新辅助治疗后，3)手术后，4)辅助治疗后，和5)姑息治疗。箱体指示四分位距 (IQR)，横跨箱体的线指示中值，虚线指示中值的样条插值。箭头指示治疗事件。N＝80个CRC病例，***P＝0.0002，效应值r＝0.41，ND，未检测到。(C) 显示TECC计数与患者和肿瘤特征(n＝80个CRC病例)之间的相关性。利用 Bonferroni校正的双尾Wilcoxon-Mann-Whitney U检验，**P＝0.0072，效应值r ＝0.34，
Figure BDA0002733032440000111
(D)比较未治疗CRC患者与健康对照(总计N＝89)的ROC曲线。灰色区域代表自举95％CI。AUC(95％CI)＝0.930 (0.880–0.980)，效应值r＝0.716。(E)比较未治疗早期CRC患者(≤IIA)与健康对照的ROC曲线。AUC(95％CI)＝0.922(0.846–0.999)，效应值r＝0.706，(总计N＝61)。(F)验证集。比较未治疗CRC患者与健康对照(总计N＝100)的 ROC曲线。AUC(95％CI)＝0.923(0.837-1)，效应值r＝0.706。在(D)到(F)中，100％堆积柱形图指示健康对照和CRC病例的TECC阳性(深灰色)样品和TECC 阴性(浅灰色)样品的百分比。
图13显示TECC计数与炎症标志物或其它变数无关。(a-c)分别显示TECC 数目与指定肿瘤特征、患者特征和血液测试值之间的相关性。相关性被显示为点图并使用肯德尔τ系数(Kendall’sτcoefficient)和其衍生P值测量。二分变数的比较被显示为箱线图，且使用来自双尾精确Wilcoxon-Mann-Whitney U检验的P值定量差异。
图14显示用于产生图9所示的数据的谱系推理工作流。(a)是谱系推理工作流的流程图。(b)显示使用BioGPS(Wu等人)验证对于代表性谱系具有最高特异性指数的选定基因的特异性。(c)显示通常用在CTC研究中以用于指示上皮细胞的标志物的基因表达水平。注意内皮谱系中的KRT18表达和造血细胞中的 EPCAM表达。
图15显示谱系推理算法验证。(A)显示热图，其比较针对每个样品(行)和谱系(列)富集的基因的数目相对于随机富集。样品是来自选定谱系的已公开 RNA-Seq数据。每个有色箱体都代表从0(黑色)到1(浅灰色)的对应费舍尔精确检验(Fisher’s exact test)的标准化比值比。(B)与(A)中相同，除了使用全组织或复合细胞混合物，例如PBMC、皮肤和脑数据集。
具体实施方式
本公开提供一种用于捕获和回收细胞、尤其是稀有细胞的设备，其允许对所捕获细胞的简单的下游操作和分析。因此，在第一方面，提供一种用于从样品捕获和回收细胞的设备，其包括至少一个柱，所述柱包括：
(i)界定内腔室的内壁，所述内腔室在所述柱的第一端具有用于接收样品的入口开口，并且在所述柱的第二端具有出口开口；
(ii)在所述内腔室内部邻近所述柱的第二端安置的穿孔塞；
(iii)在第一端具有开口并且在第二端具有开口的套筒插入物，所述套筒插入物包括在第二端逐渐变细的通道并且被安置在所述内腔室内，其第二端邻近所述穿孔塞；和
(iv)容纳在所述套筒插入物内的过滤部件，所述过滤部件包括夹在两个密封部件中间的筛。
术语“设备”和“装置”在本公开中可互换地使用。
本文所述的术语“捕获”意思是捕捉或俘获一个或多个目的细胞。本文所用的术语“回收”意思是收回或收集所捕获的一个或多个细胞。举例来说，回收可以包括通过使用移液管分离细胞而从捕获筛收回或收集细胞。
本文所用的术语“分离”意思是从样品分出一个或多个目的细胞，使得分出的细胞大体上或实质上游离于样品中存在的其他组分。
本文所用的术语“微过滤”是指物理过滤方法，其中样品通过特定孔径过滤部件以从样品中分离悬浮颗粒(例如细胞、微生物等)。用于微过滤的典型孔径以微米计(即微米或μm)。
本文所用的术语“样品”是指生物样品，或包括至少一些生物材料例如细胞的样品。本公开的生物样品可以是被怀疑含有TECC的任何样品，包括固体组织样品，例如骨髓，和液体样品，例如全血、血清、血浆、脑脊髓液、中央脊髓液、淋巴液、囊液、痰、粪便、胸腔积液、黏液、胸膜液、腹水、羊水、腹膜液、唾液、支气管冲洗液和尿。在一些实施方案中，生物样品是血液样品。如所属领域技术人员将了解到的，生物样品可以包括血液的任何级分或组分，不限于T细胞、单核细胞、中性粒细胞、红细胞、血小板和微泡，例如外泌体 (exosome)和外泌体样囊泡。
本公开的生物样品可以从任何生物体获得，包括哺乳动物，例如人、灵长动物(例如猴、黑猩猩、猩猩和大猩猩)、猫、狗、兔、农场动物(例如牛、马、山羊、绵羊、猪)和啮齿动物(例如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠)。
应注意本文所用的术语“生物体”、“个体”、“受试者”或“患者”是作为同义词且互换地使用。
生物体可以是健康生物体或罹患疾病病况。疾病病况可以包括任何疾病。在一些实施方案中，疾病是癌症、糖尿病、代谢综合征或自身免疫性疾病。在一些实施方案中，健康或患病的生物体是人生物体。在一些实施方案中，健康或患病的生物体是疾病病况例如癌症的动物模型。普通技术人员了解，各种疾病病况的动物模型在所属领域中是众所周知的。
患病生物体可以未经过治疗或可以接受过治疗，例如化疗、放疗和手术。治疗可以早于样品收集，或在样品收集时进行。
本公开的样品可以各自含有可通过所属领域中众所周知的方法(例如 FACS、免疫组织化学)区分的多个细胞群体和细胞亚群。举例来说，血液样品可以含有无核细胞例如红细胞或血小板的群体，和有核细胞例如白细胞(WBC)、循环肿瘤细胞(CTC)的群体。WBC可以含有细胞亚群，例如嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞等。本公开的样品可以是非富集样品，即所述样品没有针对任何有核细胞或无核细胞的特定群体或亚群进行富集。举例来说，非富集血液样品没有针对TECC、WBC、B细胞、T细胞、 NK细胞、单核细胞等进行富集。
本文所用的术语“稀有细胞”是指在细胞群体中的丰度小于1:1,000，例如小于1:5,000、1:10,000、1:30,000、1:50,000、1:100,000、1:300,000、 1:500,000,1:1,000,000、1:5,000,000、1:10,000,000、1:30,000,000、1:50,000,000、 1:100,000,000、1:300,000,000、1:500,000,000或1:1,000,000,000的细胞。在一些实施方案中，稀有细胞在细胞群体中具有1:1,000,000到1:10,000,000,000的丰度。在一些实施例中，细胞群体是有核细胞群体或无核细胞群体。在一些实施方案中，稀有细胞是TECC。
本文所用的术语“邻近”意思是靠近、接近、邻接或毗连。举例来说，本文所述的装置的套筒插入物可以接近或邻接装置的柱中的穿孔塞。在套筒插入物和穿孔塞之间可以存在或不存在间隙，并且套筒插入物可以或可以不附着到穿孔塞上。
在一个实施方案中，设备包括一个柱。在一些其它实施方案中，设备包括两个或更多个柱。两个或更多个柱可以按任何配置排列，包括但不限于串联或并联或其任何组合。柱可以是任何形状(例如圆柱形、圆锥形或立方体)的完全空心或部分空心的结构。在一个实施例中，柱是圆柱形。在一个实施例中，柱包括注射器。
柱的第一端可适于连接到上游装置或设备，而柱的第二端可适于连接到下游装置或设备。在一个实施方案中，柱的第一端包括允许容易回收所捕获细胞的开口。在一个实施例中，简单移液可用于从开口中回收细胞。有利地，在一些实施例中，所捕获细胞的反冲洗对于回收不是必要的。省略反冲洗步骤的优点包括但不限于捕获和回收程序中所需的步骤的数目减少，以及杂质对被捕获和回收的细胞的污染减少。在一个实施方案中，柱的第二端适于连接到一个或多个泵，所述泵用于控制通过柱的样品的流动速率。任何适用于该目的的泵都可以使用，例如蠕动泵。
样品通过柱的流动速率可以由包括但不限于以下的因素决定：所用样品的类型、可获得样品的量、欲捕获和回收的靶细胞的大小、欲捕获和回收的细胞的数目、样品中欲捕获和回收的细胞的百分比等。在一些实施例中，流动速率可以是以下任一种：至少约0.01mL/min、至少约0.02mL/min、至少约0.03 mL/min、至少约0.04mL/min、至少约0.05mL/min、至少约0.06mL/min、至少约0.07mL/min、至少约0.08mL/min、至少约0.09mL/min、至少约0.10mL/min、至少约0.15mL/min、至少约0.20mL/min、至少约0.25mL/min、至少约0.30mL/min、至少约0.35mL/min、至少约0.40mL/min、至少约0.45mL/min、至少约0.50mL/min、至少约0.60mL/min、至少约0.70mL/min、至少约0.80mL/min、至少约0.90mL/min、至少约1.0mL/min、至少约1.1mL/min、至少约1.2mL/min、至少约1.3mL/min、至少约1.4mL/min、至少约1.5mL/min、至少约1.6mL/min、至少约1.7mL/min、至少约1.8mL/min、至少约1.9mL/min、至少约2.0mL/min、至少约3.0mL/min、至少约4.0mL/min、至少约5.0mL/min、至少约6.0mL/min、至少约7.0mL/min、至少约8.0mL/min、至少约9.0mL/min、至少约10.0mL/min、至少约15.0mL/min、至少约20.0mL/min、至少约25.0mL/min、至少约30.0 mL/min、至少约35.0mL/min、至少约40.0mL/min、至少约45.0mL/min或至少约50.0mL/min。在一个实施例中，流动速率介于0.05mL/min与50.0mL/min 之间。
穿孔塞用作插入套筒的支撑部件，同时提供用于让滤液通过的通道。术语“穿孔的”或“穿孔”是指一个孔或多个孔穿过塞。塞可以用穿孔装置被穿孔，并且穿孔塞可以由任何材料制成。在一个实施例中，穿孔塞是穿孔橡胶塞。
套筒插入物(或本文中互换使用的插入套筒)可以用作过滤部件的外壳，同时还用作密封部件以防止未被过滤的样品流过通道而不是流过过滤部件。套筒插入物包括用于将样品引导到过滤部件中心的在第二端逐渐变细的通道。在一个实施例中，所述过滤部件包括筛。
使用本文所述的装置捕获的细胞可以容易地回收而无需额外步骤例如激光切除和光镊(optical tweezer)将捕获的细胞从细胞捕获筛分离。因此，和样品直接接触的装置的一个或多个表面包括非细胞粘附性材料。
在一个实施方案中，筛包括非细胞粘附性材料。在另一实施方案中，非细胞粘附性材料选自由硅、二氧化硅、氮化硅、基于环氧基的负型光刻胶和陶瓷组成的组。基于环氧基的负型光刻胶的实例是SU-8。
本文所述的装置的筛包括多个孔，不被关注且因此不想捕获的细胞(或样品的其它组分)可允许通过这些孔。孔的大小或直径可以由包括但不限于以下的因素决定：待捕获和回收的细胞的大小、待消除的细胞的大小、所用样品的量、所用样品的粘度等。同一个筛中的多个孔可以具有相同直径，或者可以具有不同直径。在一些实施例中，孔径可以是以下任一个：至少约5μm、至少约 6μm、至少约7μm、至少约8μm、至少约9μm、至少约10μm、至少约11μm、至少约12μm、至少约13μm、至少约14μm、至少约15μm、至少约16μm、至少约17μm、至少约18μm、至少约19μm、至少约20μm、至少约25μm、至少约30μm、至少约35μm、至少约40μm、至少约45μm、至少约50μm、至少约60μm、至少约70μm、至少约80μm、至少约90μm、至少约100μm或至少约200μm。举例来说，为了捕获和回收肿瘤来源的内皮细胞簇(TECC)，孔径可以是约6μm、约7μm、约8μm、约9μm或约10μm。在一个实施例中，孔径是9μm。在另一个实施例中，孔径是10μm。
在第二方面，提供一种用于从样品捕获和回收细胞的方法，其包括以下步骤：
(a)将样品引入本文所述的设备的入口开口以允许所述样品流过所述设备的套筒插入物和过滤部件；和
(b)收集在所述设备的所述过滤部件中的筛的表面上保留的残余物。
所述方法可以应用于本文所述的生物样品，其可以包括来自受试者的异质细胞类型。生物样品可以选自由分离自受试者的组织、细胞(例如干细胞、疑似癌细胞)、体液和其分离物等组成的组。
在一个实施方案中，样品包括生物流体。在一些实施方案中，生物流体包括以下任一种：全血、血清、血浆、脑脊髓液、淋巴液、囊液、痰、粪便、胸腔积液、黏液、腹水和尿。
样品可以包括许多细胞。在一个实施方案中，样品包括单细胞。在另一个实施方案中，样品包括多个细胞。在另外一个实施方案中，样品包括多个细胞，其中多个细胞中的两个或更多个细胞形成细胞簇或多核细胞。在一个实施方案中，多核细胞包括单个TECC。在一个实施方案中，单细胞选自由疑似癌细胞、疑似肿瘤来源细胞、疑似来源于胚胎或胎儿的细胞、和来自病原生物体的细胞组成的组。
在另一个实施方案中，多个细胞中的至少一些选自由以下组成的组：疑似癌细胞、疑似肿瘤来源细胞、疑似来源于胚胎或胎儿的细胞、和来自病原生物体的细胞。
使用本文所述的方法捕获和回收的细胞可以包括不同数目的明显区别的核。举例来说，明显区别的核的数目可以是以下任一个：从约2到约100个、从约5到约90个、从约10到约80个、从约20到约70个、从约30到约60个、从约40到约50个明显的核，或至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少7个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少55个、至少60个、至少65 个、至少70个、至少75个、至少80个、至少85个、至少90个、至少95个、或至少100个区分的核。
在一个实施方案中，样品是血液样品，且从其捕获和回收的细胞包括至少两个明显区别的核。
捕获和回收的细胞的主轴长度可以是以下任一个：至少约5μm、至少约6 μm、至少约7μm、至少约8μm、至少约9μm、至少约10μm、至少约11μm、至少约12μm、至少约13μm、至少约14μm、至少约15μm、至少约16μm、至少约17μm、至少约18μm、至少约19μm、至少约20μm、至少约25μm、至少约30μm、至少约35μm、至少约40μm、至少约45μm、至少约50μm、至少约60μm、至少约70μm、至少约80μm、至少约90μm、至少约100μm或至少200μm。
使用本文所述的方法捕获和回收的细胞可以通过许多基因和/或蛋白质的表达或不表达来表征。在一个实施方案中，捕获和回收的细胞表达以下基因中的一种或多种：PECAM1、VWF和CDH5。在此实施方案的一个实施例中，细胞表达以下基因组合中的任一种：PECAM1和VWF；PECAM1和CDH5；VWF和 CDH5；或PECAM1、VWF和CDH5。在另一个实施方案中，捕获和回收的细胞不表达以下基因中的一种或多种：PTPRC、ITGA2B和GP1BA。在此实施方案的一个实施例中，细胞不表达以下基因组合中的任一种：PTPRC和ITGA2B； PTPRC和GP1BA；ITGA2B和GP1BA；或PTPRC、ITGA2B和GP1BA。
所属领域技术人员将了解，基因PECAM1编码蛋白质CD31，基因VWF编码蛋白质VWF，基因CDH5编码蛋白质CD144，基因PTPRC编码蛋白质CD45，基因ITGA2B编码蛋白质CD41，且基因GP1BA编码蛋白质CD42B。因此，在一个实施方案中，捕获和回收的细胞表达以下蛋白质中的一种或多种：CD31、 VWF和CD144。在此实施方案的一个实施例中，细胞表达以下蛋白质组合中的任一种：CD31和VWF；CD31和CD144；VWF和CD144；或CD31、VWF和 CD144。在另一个实施方案中，捕获和回收的细胞不表达以下基因蛋白质中的一种或多种：CD45、CD41和CD42B。在此实施方案的一个实施例中，细胞不表达以下蛋白质组合中的任一种：CD45和CD41；CD45和CD42B；CD41和 CD42B；或CD45、CD41和CD42B。
本文所述的细胞捕获和回收方法可以允许捕获样品中任何百分比的靶细胞。有利地，可以捕获和/或回收样品中高百分比的靶细胞。使用本文所述的方法捕获和回收的样品中存在的细胞的百分比可以是以下任一个：至少约10、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约75％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约95.5％、至少约96％、至少约96.5％、至少约97％、至少约97.5％、至少约98％、至少约98.5％、至少约99％、至少约99.5％或100％。
在设备的过滤部件的筛的表面上保留的残余物可以使用各种物理和/或化学方法收集。在一个实施方案中，收集在设备的过滤部件中的筛的表面上保留的残余物包括标准移液。
使用本发明的细胞捕获和回收装置和方法允许发明人鉴别分离细胞群体。因此，在第三方面，提供一种具有以下特征的分离细胞群体：
(i)是来源于肿瘤并且分离自血液的内皮细胞；
(ii)每个细胞都具有至少两个明显区别的核；
(iii)每个细胞都具有大于约10μm的主轴；
(iv)表达内皮细胞基因或蛋白质；
(v)不表达白细胞特异性基因或蛋白质；和
(vi)不表达巨核细胞或血小板特异性基因或蛋白质。
术语“内皮细胞”是指作为血管和淋巴管内表面的内衬的简单鳞状细胞薄层。和血液直接接触的内皮细胞被称为血管内皮细胞，而和淋巴直接接触的内皮细胞则被称为淋巴内皮细胞。
术语“白细胞”是指白血球(WBC)，其是免疫系统中参与保护身体对抗传染病和外来入侵者两者的细胞。术语“巨核细胞”是指大的骨髓细胞，其具有负责生产凝血细胞(血小板)的分叶核，凝血细胞是正常血液凝结所必需的。术语“血小板”是指(连同凝血因子一起)功能在于通过凝集和凝结血管损伤来停止出血的血液组分。血小板不具有细胞核，是来源于骨髓巨核细胞的细胞质的片段，然后进入循环。
在一个实施方案中，由本文所述的分离细胞群体表达的内皮细胞基因包括但不限于PECAM1、VWF和CDH5。在一个实施方案中，由本文所述的分离细胞群体表达的内皮细胞蛋白质包括但不限于CD31、VWF和CD144。
在一个实施方案中，不由本文所述的分离细胞群体表达的白细胞特异性、巨核细胞性、或血小板特异性的基因包括但不限于PTPRC、ITGA2B和GP1BA。在一个实施方案中，不由本文所述的分离细胞群体表达的白细胞特异性、巨核细胞性、或血小板特异性的蛋白质包括但不限于CD45、CD41和CD42B。
在一些实施例中，以下基因表达的组合可用于定义内皮细胞：PECAM1阳性和PTPRC阴性，VWF阳性和ITGA2B阴性，VWF阳性和GP1BA阴性，CDH5 阳性和PTPRC阴性。在一些其它实施例中，以下蛋白质表达的组合可用于定义内皮细胞：CD31阳性和CD45阴性，VWF阳性和CD41阴性，VWF阳性和CD42B 阴性，CD144阳性和CD45阴性。
本文所述的细胞捕获和回收装置和方法可用于捕获和回收本文所述的分离细胞群体。因此，在第四方面，提供一种在受试者的样品中检测本文所述的分离细胞群体的方法，所述方法包括：
(a)使用本文所述的设备或本文所述的方法从样品捕获和回收细胞。
使用本文所述的装置和方法捕获的分离细胞群体可接受下游操纵和/或分析，例如用于检测特定基因和/或蛋白质的表达。因此，在一个实施方案中，第四方面的方法另外包括：
(b)将来自步骤(a)的细胞与偶合到可检测标记上的至少一个抗体接触以允许所述抗体结合到在所述细胞上表达的一个或多个目标生物标志物；
(c)从所述样品中去除未结合的抗体；和
(d)检测和分析结合到所述抗体的所述可检测标记以检测所述分离细胞群体。
本文所述的分离细胞群体也可使用其它细胞分离方法获得。因此，在第五方面，提供一种用于在受试者的样品中检测第三方面的分离细胞群体的方法，所述方法包括：
(a)将来自所述样品的细胞与偶合到可检测标记上的至少一个抗体接触以允许所述抗体结合到在所述细胞上表达的一个或多个目标生物标志物；
(b)从所述样品中去除未结合的抗体；和
(c)检测和分析结合到所述抗体的所述可检测标记以检测所述分离细胞群体。
在一个实施方案中，在第五方面的方法的步骤(a)之前，使用第二方面的方法或所属领域中已知的任何细胞捕获和回收方法分离细胞。
术语“抗体”意思是能够和抗原上的特异性表位结合的免疫球蛋白分子。抗体可以由多克隆混合物构成，或者在本质上可以是单克隆。此外，抗体可以是来自天然来源或重组来源的完全免疫球蛋白。本文所述的方法中使用的抗体可以多种形式存在，包括例如作为全抗体，或作为抗体片段，或抗体的其它免疫活性片段，例如互补决定区。类似地，抗体可以作为具有功能抗原结合域(也就是重链可变域和轻链可变域)的抗体片段存在。抗体片段也可以采取选自由以下组成但不限于以下的组的形式存在：Fv、Fab、F(ab)2、scFv(单链Fv)、dAb (单结构域抗体)、双特异性抗体、双链抗体(diabody)和三链抗体(triabody)。示例性抗体如实施例3中所述。
在一个实施方案中，本文所述的方法中使用的抗体能够特异性结合生物标志物。术语“生物标志物”是指生物分子或生物分子片段，其变化和/或检测可以与TECC的特定身体状况或状态相关。术语“标志物”和“生物标志物”在本公开中互换地使用。此类生物标志物包括但不限于生物分子，包括核苷酸、核酸、核苷、氨基酸、糖、脂肪酸、类固醇、代谢物、肽、多肽、蛋白质、碳水化合物、脂质、激素、抗体、用作生物大分子和其组合(例如糖蛋白、核糖核蛋白、脂蛋白)的替代物的目的区域。该术语还涵盖生物分子的部分或片段，例如蛋白质或多肽的肽片段。在一个实施方案中，生物标志物是癌症生物标志物。在一个实施方案中，抗体能够特异性结合以下目标生物标志物中的任一种：PAI-1、波形蛋白、FOXC1、角蛋白-8、角蛋白-18、角蛋白-19、Ep-CAM、CD45、VWF、 PECAM-1、CD146、CD41、CD34、PSMA、CD105、CD309、CD144、CD202B 和血管生成素2。
在一个实施方案中，抗体通过所属领域中已知的方法(例如直接抗体缀合和间接抗体缀合)偶合到可检测标记。术语“直接抗体缀合”是指一级抗体缀合到可检测标记。术语“间接抗体缀合”是指其中一级抗体不缀合到可检测标记的两步法。使用针对一级抗体的二级抗体，其中二级抗体缀合到可检测标记。可检测标记可以是以下任一种：荧光基团、放射性同位素、稳定同位素、酶基团、化学发光基团或生物素基基团。示例性的荧光标记抗体如实施例3中所述。
所属领域中已知用于在免疫分析中检测抗体与其抗原的结合的许多其它方法，且所述方法处于本公开的范围内。
其它方法如scrmPCR也可用于检测和分析本文所述的分离细胞群体。因此，第四方面的方法的一个实施方案另外包括：
(b)溶解来自步骤(a)的细胞；
(c)使来自步骤(b)的溶解细胞样品与来自第一引物对的反向引物以及反转录酶接触，以实现RNA反转录成cDNA，所述来自第一引物对的反向引物被导向目标RNA区域；
(d)随后使来自步骤(c)的样品与以下物质接触：
(i)来自第一引物对的正向引物，所述来自第一引物对的正向引物被导向目标cDNA区域，
(ii)来自第二引物对的反向引物和正向引物，所述来自第二引物对的反向引物和正向引物被导向目标DNA区域，和
(iii)DNA聚合酶，
以在预扩增步骤中同时扩增目标cDNA区域和目标DNA区域；和
(e)分析扩增的目标cDNA区域和/或扩增的目标DNA区域。
在第六方面，提供一种用于在受试者的样品中检测第三方面的分离细胞群体的方法，所述方法包括：
(a)溶解样品中存在的细胞；
(b)使来自步骤(a)的溶解细胞样品与来自第一引物对的反向引物以及反转录酶接触以实现RNA反转录成cDNA，所述来自第一引物对的反向引物被导向目标RNA区域；
(c)随后使来自步骤(b)的样品与以下物质接触：
(i)来自第一引物对的正向引物，所述来自第一引物对的正向引物被导向目标cDNA区域，
(ii)来自第二引物对的反向引物和正向引物，所述来自第二引物对的反向引物和正向引物被导向目标DNA区域，和
(iii)DNA聚合酶，
以在预扩增步骤中同时扩增目标cDNA区域和目标DNA区域；和
(d)分析扩增的目标cDNA区域和/或扩增的目标DNA区域。
在一个实施方案中，在第六方面的方法的步骤(a)之前，使用第二方面的方法或所属领域中已知的任何细胞捕获和回收方法分离细胞。
有利地，在第四方面的步骤(d)或第六方面的步骤(c)中的目标cDNA区域和目标DNA区域的同时扩增(参见实施例3中描述的scrmPCR)可以形成预扩增步骤，其在分析之前增加用作模板的cDNA和/或DNA的量，所述模板用于目标cDNA和/或目标DNA区域的进一步扩增。目标DNA区域可以是目标基因组 DNA区域。
术语“引物”是指寡核苷酸，当和DNA或RNA链配对时，所述寡核苷酸能够在合适聚合剂的存在下引发引物延伸产物的合成。为了获得最大扩增效率，引物优选地是单链的，但是也可以是双链的。引物必须足够长，以在聚合剂的存在下引发延伸产物的合成。引物长度取决于许多因素，包括应用、待使用的温度、模板反应条件、其它试剂和引物来源。举例来说，取决于靶序列的复杂度，寡核苷酸引物典型地含有15到35个或更多核苷酸，虽然其也可含有更少核苷酸。引物可以是大的多核苷酸，例如从约200个核苷酸到几千碱基或更多。引物可以被选择成和模板上的序列“基本上互补”，所述引物被设计成与所述模板杂交并用作起始合成的位点。举例来说，并非引物中的所有碱基都需要反映引物将要杂交的模板分子的序列—引物只需要含有能够使引物与模板杂交的足够的互补碱基。引物可以包括额外碱基，例如以5'端的限制酶识别序列的形式，以帮助被扩增DNA的克隆。引物还可以在一个或多个位置包括错配碱基，所述错配碱基是和模板中的碱基不互补，而是被设计成在碱基延伸或扩增时将变化引入到DNA中的碱基。
术语“扩增”涉及额外的核酸拷贝的生产。扩增可以使用聚合酶链式反应 (PCR)技术或所属领域中众所周知的其它核酸扩增技术进行。
“引物对”可用于扩增(和鉴别)核酸，例如通过聚合酶链式反应(PCR)。“引物对”可以包括“正向引物”和“反向引物”。在PCR反应中，双链DNA的两条链都被扩增。“正向引物”可以结合到DNA的一条链上并允许从5’到3’方向合成引物延伸产物。“反向引物”可以结合到DNA的互补链上并允许从互补DNA链的 5’到3’方向合成引物延伸产物。在反转录反应中，“反向引物”可以结合到RNA 链上并允许在反转录酶的存在下在cDNA链的5’到3’方向上合成互补DNA (cDNA)链。“反向引物”随后可以和“正向引物”一起用于扩增被合成的cDNA 链。PCR引物对可以源于已知序列，例如，通过使用用于该目的的计算机程序，例如Primer(Version 0.5,1991,怀特黑德生物医学研究所(Whitehead Institute for BiomedicalResearch),Cambridge MA)和本文公开的实施例中使用的那些(例如PrimerBLAST)。用作引物的寡核苷酸是使用所属领域中已知的用于该目的的软件选择的。举例来说，OLIGO 4.06软件可用于筛选各自多达30-100个核苷酸的PCR引物对，且可用于分析来自多达32千碱基的输入多核苷酸序列的多达 5,000个核苷酸的寡核苷酸和更大的多核苷酸。
用于PCR扩增反应、限制酶消化和随后的片段解析和核酸测序中的方法和试剂对于所属领域技术人员是众所周知的。在每种情况下，合适的方案和试剂将在很大程度上取决于个别环境。可以从各种来源，例如Sambrook等人,《分子克隆：实验室手册(MolecularCloning:A Laboratory Manual)》,Cold Spring Harbor,New York,1989,和Ausubel等人,《分子生物学的当前方案(Current Protocols in Molecular Biology)》,GreenePubl.Assoc.and Wiley-Intersciences, 1992获得指导。所属领域技术人员将容易理解，这些程序的各种参数可以在不影响获得期望产物的能力的情况下进行变化。举例来说，在PCR扩增情况下，盐浓度可以变化。类似地，用作模板的DNA的量也可以取决于可用DNA的量或有效扩增所需的模板最佳量而变化。
技术人员将能够理解“反转录酶”是一种可用于基于RNA模板合成cDNA的酶。技术人员还将理解“DNA聚合酶”是一种可基于DNA模板合成DNA分子的酶。
通过“接触”，引物可以和样品产生物理缔合。这允许例如引物对与样品中存在的DNA退火，随后通过PCR扩增DNA。这也允许引物与样品中存在的RNA 链退火，以允许使用所属领域技术人员已知的反转录酶合成cDNA。
术语“分析”是指通过所属领域中已知的各种技术研究或检查扩增的目标 cDNA区域和/或扩增的目标DNA区域。可以针对基因表达或可能存在的突变研究扩增的cDNA区域和/或扩增的目标DNA区域研究。
发明人已经发现，DNA和RNA两者的特异性扩增可以通过至少使用针对 RNA的半巢式方法和针对DNA分子的全巢式方法来实现。本文所用的术语“半巢式PCR”是指一种改良的PCR技术，其中使用一个“巢式引物”减少因为非预期结合位点的扩增而引起的非特异性结合。“全巢式方法”是指一种在模板DNA的两侧使用两个巢式引物的改良PCR技术。“巢式引物”的使用允许特异性识别使用第一组引物扩增的PCR产物，从而消除由不想要的产物(例如引物二聚体、发夹和替代性的引物靶序列)所造成的污染。发明人还发现，DNA和RNA分子的扩增受预扩增步骤中的退火温度有差别地影响。因此需要设定权衡以便扩增两种分子。
因此，第四方面的方法的一个实施方案另外包括以下步骤：使来自步骤(d) 的样品经历半巢式PCR，所述半巢式PCR使用步骤(c)中的反向引物或步骤(d)(i) 中的正向引物，和在扩增的目标cDNA区域内部结合的巢式引物。第四方面的方法的另一个实施方案另外包括以下步骤：使来自步骤(d)的样品经历巢式PCR，所述巢式PCR使用在扩增的目标DNA区域内部结合的巢式引物对。
类似地，第六方面的方法的一个实施方案另外包括以下步骤：使来自步骤(c) 的样品经历半巢式PCR，所述半巢式PCR使用步骤(b)中的反向引物或步骤(c)(i) 中的正向引物，和在扩增的目标cDNA区域内部结合的巢式引物。第六方面的方法的另一个实施方案另外包括以下步骤：使来自步骤(c)的样品经历巢式PCR，所述巢式PCR使用在扩增的目标DNA区域内部结合的巢式引物对。
在一个实施方案中，第四方面的方法的步骤(c)和(d)或第六方面的方法的步骤(b)和(c)在相同的反应混合物中进行。
在一个实施方案中，第四方面的步骤(e)或第六方面的步骤(d)中的分析包括分析扩增的目标cDNA的基因表达(例如在基因表达分析中)。基因表达分析可以使用所属领域中已知的任何技术，例如定量PCR、数字PCR、微阵列等来进行。
在一个实施方案中，第四方面的步骤(e)或第六方面的步骤(d)中的分析包括分析扩增的目标cDNA的突变(例如在突变分析中)。突变分析可以使用所属领域中已知的任何技术，例如桑格测序法、马克萨姆-吉尔伯特测序法 (Maxam-Gilbert sequencing)、焦磷酸测序法、鸟枪测序法、高通量DNA测序法、等位基因特异性PCR(ASPCR)或高分辨率熔解温度PCR(HRM)来进行。
根据第四方面或第六方面的方法可以对于一个或多个目标RNA区域、和/ 或一个或多个目标cDNA区域、和/或一个或多个目标DNA区域同时进行。因此，对于目标RNA区域各自具有相同或不同特异性的一种或多种反向引物可用在第四方面的步骤(c)或第六方面的步骤(b)中，对于目标cDNA区域各自具有相同或不同特异性的一种或多种正向引物可用在第四方面的步骤(d)(i)或第六方面的步骤(c)(i)中，对于目标DNA区域各自具有相同或不同特异性的一种或多种引物对可用在第四方面的步骤(d)(ii)或第六方面的步骤(c)(ii)中，结合到目标cDNA 区域的一种或多种巢式引物和结合到目标DNA区域的一种或多种巢式引物对可以使用。
第一引物对可以包括跨越外显子-外显子边界的引物，或者被对应DNA区域上的至少一个内含子分隔的引物。第二引物对可以包括结合到目标DNA区域的内含子区域的引物。
术语“外显子”是指基因组DNA的一部分，其成为被转化到成熟信使mRNA 的基因组DNA的一部分。术语“内含子”或“内含子区域”是指通过RNA剪接移除且因此不在最终成熟mRNA中存在的基因组DNA的那部分。
在一个实施方案中，使用的第一引物对可以是表1列举的引物对中的任一个或多个。
表1.用于预扩增步骤的引物对
Figure BDA0002733032440000241
Figure BDA0002733032440000251
参考文献：
(1)来源于Hesse等人(2001)J.Cell Sci.114,2569
说明：
EMT：上皮细胞-间充质转化标志物
L：谱系标志物
TEC：肿瘤内皮细胞标志物
S：干细胞标志物
Ep：上皮标志物
He：造血细胞标志物
En：内皮细胞标志物
Me：巨核细胞/血小板标志物
在一个实施方案中，使用的第二引物对可以是表2列举的引物对中的任一个或多个。
表2.用于扩增步骤的引物对
Figure BDA0002733032440000252
Figure BDA0002733032440000261
参考文献：
(1)来源于Hesse等人(2001)J.Cell Sci.114,2569
第四方面的方法的步骤(d)中的预扩增可以包括一个或多个循环步骤。每个循环步骤可以包括在预定温度下的持续预定时间的一个或多个扩增周期(即变性、退火和延长)。应了解，循环步骤的数目、变性、退火和延长周期的数目、执行这些周期的温度、和每个温度所应用的持续时间将取决于多种因素，例如扩增反应中使用的试剂、目标cDNA或DNA区域、所用的引物、待扩增的样品等。在一个实施方案中，扩增不包括最终延长步骤。
举例来说，步骤(d)可以包括约1到约60个循环步骤、约1到约50个循环步骤、约1到约40个循环步骤、约1到约30个循环步骤、约1到约25个循环步骤、约1到约20个循环步骤、约1到约15个循环步骤、约1到约10个循环步骤、约1到约5个循环步骤、约1到约4个循环步骤、约1到约3个循环步骤、约1个循环步骤、约2个循环步骤或约3个循环步骤。
每个循环步骤可以包括约1到约50个、约1到约40个、约1到约30个、约1到约25个、约1到约20个、约1到约18个、约1到约15个、约1到约 10个、约1到约6个、约2个、约4个、约6个、约8个、约10个、约15个、约20个、约25个、约30个、约40个或约50个变性、退火和延长周期。
在一些实施例中，周期中的退火和/或延长温度为约40℃到约80℃、约40℃到约75℃、约40℃到约70℃、约40℃到约65℃、约40℃到约60℃、约40℃到约55℃、约40℃到约50℃、约40℃、约45℃、约50℃、约55℃、约60℃、约65℃、约70℃、约75℃或约80℃。
用于连续循环步骤的退火和/或延长温度可降低约1℃到约10℃、约1℃到约9℃、约1℃到约8℃、约1℃到约7℃、约1℃到约6℃、约1℃到约5℃、约1℃到约4℃、约1℃到约3℃、或约1℃到约2℃。
在一些实施例中，退火和/或延长可进行约10秒到约10分钟、约10秒到约 8分钟、约10秒到约6分钟、约10秒到约4分钟、约10秒到约2分钟、约10 秒到约1分钟、约1分钟、约2分钟、约4分钟、约6分钟、约8分钟、或约 10分钟。
在一些实施例中，变性可以在约75℃到约120℃、约75℃到约115℃、约 75℃到约110℃、约75℃到约105℃、约75℃到约100℃、约75℃到约95℃、约75℃到约90℃、约75℃到约85℃、约75℃到约80℃、约75℃、约80℃、约85℃、约90℃、约95℃、约100℃、约105℃、约110℃、约115℃、或约 120℃的温度下进行。
变性可进行约1秒到约10分钟、约1秒到约5分钟、约1秒到约4分钟、约1秒到约3分钟、约1秒到约2分钟、约1秒到约1分钟、约1秒、约10秒、约20秒、约30秒、约40秒、约50秒、约1分钟、约2分钟、约3分钟、约4 分钟、约5分钟、或约10分钟。
在一个实施例中，方法的步骤(d)包括：
在60℃下持续4分钟随后在95℃下持续1分钟的6个周期，
在55℃下持续4分钟随后在95℃下持续1分钟的6个周期，和
在50℃下持续4分钟随后在95℃下持续1分钟的6个周期。
在一些实施例中，来自步骤(b)的溶解细胞样品包括不含细胞的RNA或不含细胞的DNA。
有利地，根据第四方面或第六方面的方法可用于在仅可获得有限量的样品的情况下(例如在稀有细胞样品中)分析RNA和DNA。
在一些实施例中，RNA或DNA可以少量存在，例如约1pg到约10ng、约 5pg到约10ng、约5pg到约5ng、约5pg到约1ng、约5pg到约500pg、约 5pg到约250pg、约5pg到约125pg、约5pg到约100pg、或约5pg到约50pg。
本文所述的方法可用于诊断，尤其用于癌症诊断。因此，在第七方面，提供一种诊断受试者的癌症的方法，其包括分析来自受试者的样品中是否存在本文所述的分离细胞群体，其中存在所述分离细胞群体表明所述受试者具有癌症。癌症患者中TECC的检测的一个实施例在实施例3中显示。
在一些实施例中，如果所述分离细胞群体被检测到在所用各检测方法的背景噪声以上(例如是背景的2倍、3倍、5倍或10倍，例如是背景的2倍或3 倍)，那么所述分离细胞群体被视为“存在”。
受试者可以是哺乳动物，例如人。
可通过本文所述的方法诊断的主要癌症类型包括但不限于癌、肉瘤、淋巴瘤、生殖细胞瘤和母细胞瘤。可通过本文所述的方法诊断的特定癌症类型包括但不限于结肠癌、直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、移行细胞癌、肺癌、胆管癌、结肠癌、脑癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌、食道癌、间皮瘤、黑素瘤、甲状腺癌、头颈癌、骨肉瘤和胶质母细胞瘤。所属领域技术人员将了解，术语“结直肠癌”可用于指结肠癌和直肠癌。具体来说，当结直肠癌起源于结肠时，其被视为结肠癌，而当结直肠癌起源于直肠时，其则被视为直肠癌。
在一个实施方案中，癌症是侵入性和/或转移性癌症。在另一个实施方案中，癌症是I期癌症、II期癌症、III期癌症或IV期癌症。在另外一个实施方案中，癌症是早期癌症，例如术前期癌症。早期癌症的一个实例是原发性肿瘤。本文所述的方法尤其可用于检测早期癌症，因为所述方法能够捕获和回收以极低数目存在的细胞，例如早期癌症中的细胞，用于分析。
本文所述的方法可用于监测和/或预测癌症患者对于治疗的应答。因此，在第八方面，提供一种用于监测和/或预测癌症患者对于治疗的应答的方法，所述方法包括分析从治疗后患者获得的样品以测定本文所述的分离细胞群体的数目，其中与从治疗前患者获得的基线样品中的分离细胞群体的数目相比，所述分离细胞群体的数目的减少指示患者对治疗处于阳性应答。类似地，在第九方面，提供一种用于预测癌症患者对于治疗的应答的方法，所述方法包括分析从治疗前癌症患者获得的样品以测定本文所述的分离细胞群体的数目，其中与在治疗前从已经对治疗有阳性应答的患者或一组患者获得的样品中的所述分离细胞群体的数目相比，所述分离细胞群体的数目相等或更高指示所述癌症患者将对治疗阳性应答，且其中与在治疗前从已经对治疗有阳性应答的患者或一组患者获得的样品中的所述分离细胞群体的数目相比，所述分离细胞群体的数目更低指示所述癌症患者将对治疗阴性应答。
如果所述分离细胞群体没有被检测到在所用检测方法的背景噪声以上(例如是背景信号的<1.5倍或<2.0倍，例如是背景的<1.5倍或<2.0倍)，那么所述分离细胞群体被视为“不存在”。术语“减少”、“降低”或“更低”是指相对于基线样品或对照或与基线样品或对照相比，所述分离细胞群体的数目的减少。基线或对照可以是从治疗前的同一名受试者获得的样品，或者是从正常的健康受试者或一组正常的健康受试者获得的样品，或者是从在初步研究中已经对治疗有应答的患者或一组患者获得的样品。在一些实施例中，基线或对照样品中的所述分离细胞群体的数目是从1到5、1到10、1到15、1到20、1到25、1到30、 1到30、1到40或1到50/ml血液。在一些实施例中，与基线或对照样品中的所述分离细胞群体的数目相比，所述分离细胞群体的减少或更低数目是减少至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。术语“增加”或“更高”是指相对于基线样品或对照或与基线样品或对照相比，所述分离细胞群体的数目的增加。基线或对照可以是从治疗前的同一名受试者获得的样品，或者是从正常的健康受试者获得的样品，或者是从在初步研究中已经对治疗有应答的患者获得的样品。在一些实施例中，所述分离细胞群体的增加或更高数目是基线或对照样品中的所述分离细胞群体的数目的至少约1.05倍、至少约1.1倍、至少约1.2倍、至少约1.3 倍、至少约1.4倍、至少约1.5倍、至少约1.6倍、至少约1.7倍、至少约1.8倍、至少约1.9倍或至少约2.0倍。
在一些实施例中，如果所述分离细胞群体的数目小于100/ml、小于90/ml、小于80/ml、小于70/ml、小于60/ml、小于50/ml、小于40/ml、小于30/ml、小于20/ml、小于15/ml、小于10/ml、小于9/ml、小于8/ml、小于7/ml、小于6/ml、小于5/ml、小于4/ml、小于3/ml、小于2/ml或小于1/ml血液，那么癌症患者对于治疗的应答将是阴性的。
在一些其它实施例中，如果所述分离细胞群体的数目超过1/ml、超过2/ml、超过3/ml、超过4/ml、超过5/ml、超过6/ml、超过7/ml、超过8/ml、超过9/ml、超过10/ml、超过15/ml、超过20/ml、超过30/ml、超过40/ml、超过50/ml、超过60/ml、超过70/ml、超过80/ml、超过90/ml或超过100/ml血液，那么癌症患者对于治疗的应答将是阳性的。
所属领域技术人员将了解，许多方法都可用于测定生物标志物的存在、不存在或表达的增加或降低，包括基于显微镜的方法，包括荧光扫描显微镜(参见例如Marrinucci D等人,2012,Phys.Biol.9016003)、质谱法(例如MS/MS、 LC-MS/MS、多反应监测(MRM)或SRM)和生产监测(PIM))，还包括基于抗体的方法，例如免疫荧光、免疫组织化学、免疫分析例如蛋白质印迹法、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫沉淀、放射免疫分析、斑点印迹、荧光激活细胞分选(FACS)和质谱流式细胞技术。免疫分析技术和方案对于所属领域技术人员通常是已知的(Price和Newman,《免疫分析的原理和实践(Principles and Practice ofImmunoassay)》,第2版,Grove's Dictionaries,1997；和Gosling,《免疫分析：一种实用方法(Immunoassays:A Practical Approach)》,Oxford University Press,2000)。可使用多种免疫分析技术，包括竞争性和非竞争性免疫分析(Self 等人,Curr.Opin.Biotechnol 7:60-65(1996),也参见John R.Crowther,The ELISA Guidebook,第1版,Humana Press2000,ISBN 0896037282以及《放射性免疫分析和相关技术的介绍(An Introduction toRadioimmunoassay and Related Techniques)》,由Chard T编辑,Elsevier Science1995,ISBN 0444821 198)。
所属领域技术人员将进一步了解，生物标志物的存在、不存在或表达的增加或降低可使用所属领域中已知的任何种类的标志物特异性结合试剂来检测，所述标志物特异性结合试剂包括例如抗体、适体、融合蛋白(例如包括蛋白受体或蛋白配体组分(例如CD31、VWF、CD144、CD 45、CD41或CD42B结合受体或配体)的融合蛋白)或生物标志物特异性小分子结合剂。
本文所述的分离细胞群体主要是内皮性质的。因为内皮细胞作为所有血管内部的内衬，所以本文所述的方法也可用于分析肿瘤的血管特征。因此，在第十方面，提供一种用于分析受试者的肿瘤的血管特征的方法，所述方法包括分析来自受试者的样品以测定本文所述的分离细胞群体的数目，其中与基线样品相比，所述分离细胞群体的数目增加表明肿瘤相比基线样品具有更大的血管，且其中与基线样品相比，所述分离细胞群体的数目减少表明肿瘤相比基线样品具有更小的血管。
在一些实施例中，基线样品或对照样品是从在初步研究中显示具有小血管的患者获得。在一些实施例中，基线或对照样品中的所述分离细胞群体的数目是从1到5、1到10、1到15、1到20、1到25、1到30、1到30、1到40或1 到50/ml血液。在一些实施例中，所述分离细胞群体的增加的数目是基线或对照样品中的所述分离细胞群体的数目的至少约1.05倍、至少约1.1倍、至少约1.2 倍、至少约1.3倍、至少约1.4倍、至少约1.5倍、至少约1.6倍、至少约1.7倍、至少约1.8倍、至少约1.9倍或至少约2.0倍。在一些实施例中，与基线或对照样品中的所述分离细胞群体的数目的所述分离细胞群体的数目相比，所述分离细胞群体的减少数目是减少至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少 50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。
在一些实施例中，如果所述分离细胞群体的数目超过1/ml、超过2/ml、超过3/ml、超过4/ml、超过5/ml、超过6/ml、超过7/ml、超过8/ml、超过9/ml、超过10/ml、超过15/ml、超过20/ml、超过30/ml、超过40/ml、超过50/ml、超过60/ml、超过70/ml、超过80/ml、超过90/ml或超过100/ml血液，那么患者被归类为在肿瘤中具有大血管。
在一些其它实施例中，如果所述分离细胞群体的数目小于100/ml、小于 90/ml、小于80/ml、小于70/ml、小于60/ml、小于50/ml、小于40/ml、小于30/ml、小于20/ml、小于15/ml、小于10/ml、小于9/ml、小于8/ml、小于7/ml、小于 6/ml、小于5/ml、小于4/ml、小于3/ml、小于2/ml或小于1/ml血液，那么患者被归类为在肿瘤中具有小血管。
在一些实施例中，如果患者在肿瘤中具有更大的血管，那么癌症患者对于治疗的应答将是阳性的。在一些其它实施例中，如果患者在肿瘤中具有更小的血管，那么癌症患者对于治疗的应答将是阴性的。
还设想可以开发商业试剂盒用于快速捕获、回收和/或检测所述分离细胞群体，用于诊断、监测和/或预测对于治疗的应答，和/或用于分析本文所述的肿瘤的血管特征。因此，在第十一方面，提供一种用于本文所述的方法(例如第二、第四、第七、第八、第九或第十方面的方法)中的试剂盒，其中所述试剂盒包括(a)本文所述的设备。
第十一方面的试剂盒可以另外包括以下一种或多种：
(b)用于裂解从样品获得的细胞的一种或多种细胞裂解缓冲液；
(c)选自由以下组成的组的引物：
i.第四方面的方法的步骤(c)的反向引物；
ii.第四方面的方法的步骤(d)(i)的正向引物，
iii.第四方面的方法的步骤(d)(ii)的引物对，和
iv.第四方面的方法的巢式引物和巢式引物对；
(d)一种或多种试剂，选自由以下组成的组：
i.用于第四方面的方法的步骤(c)中的反转录的反转录酶和一种或多种合适的反应缓冲液，
ii.用于第四方面的方法的步骤(d)中的扩增或用于第四方面的方法的半巢式或巢式PCR的DNA聚合酶和一种或多种合适的反应缓冲液，以及
iii.一种或多种经标记或未经标记的脱氧核糖核苷酸，选自由dATP、 dCTP、dGTP和dTTP或dUTP组成的组；以及
(e)能够特异性结合到选自由PAI-1、波形蛋白、FOXC1、角蛋白-8、角蛋白 -18、角蛋白-19、Ep-CAM、CD45、VWF、PECAM-1、CD146、CD41、CD34、 PSMA、CD105、CD309、CD144、CD202B和血管生成素2组成的组的蛋白质的抗体，其中所述抗体偶合到本文所述的可检测标记上；和任选地，用于检测所述可检测标记的工具。
在第十二方面，提供一种用于本文所述的方法(例如第五、第六、第七、第八、第九或第十方面的方法)中的试剂盒，所述试剂盒包括：
(a)用于裂解从样品获得的细胞的一种或多种细胞裂解缓冲液；
(b)选自由以下组成的组的引物：
i.第五方面的方法的步骤(b)的反向引物，
ii.第五方面的方法的步骤(c)(i)的正向引物，
iii.第五方面的方法的步骤(c)(ii)的引物对，和
iv.第五方面的方法的巢式引物和巢式引物对；
(c)一种或多种试剂，选自由以下组成的组：
i.用于第五方面的方法的步骤(b)中的反转录的反转录酶和一种或多种合适的反应缓冲液，
ii.用于第五方面的方法的步骤(c)中的扩增或用于第五方面的方法的半巢式或巢式PCR的DNA聚合酶和一种或多种合适的反应缓冲液，以及
iii.一种或多种经标记或未经标记的脱氧核糖核苷酸，选自由dATP、 dCTP、dGTP和dTTP或dUTP组成的组；以及
(d)能够特异性结合到选自由PAI-1、波形蛋白、FOXC1、角蛋白-8、角蛋白 -18、角蛋白-19、Ep-CAM、CD45、VWF、PECAM-1、CD146、CD41、CD34、 PSMA、CD105、CD309、CD144、CD202B和血管生成素2组成的组的蛋白质的抗体，其中所述抗体偶合到本文所述的可检测标记上；和任选地，用于检测所述可检测标记的工具。
可以使用所属领域中常用的裂解缓冲液，例如碱性裂解缓冲液或含有蛋白酶K的细胞裂解缓冲液，或仅仅是含有洗涤剂、或将会破坏细胞并允许其核酸释放到溶液中的化合物和/或酶的缓冲液。
根据第十一或第十二方面的试剂盒还可包括用于定量实时PCR的探针或染料。示例性探针和染料包括但不限于SYBR绿染料、EvaGreen、dsGreen、TaqMan 探针、杂交探针等。
试剂盒还可包括关于设计一种或多种所述引物、和/或优化第四方面或第五方面的方法的步骤(c)和/或(d)的预扩增和/或扩增循环条件的说明书。
在一个实施方案中，引物和/或试剂被预混合成适合于根据第四方面或第五方面的方法的裂解、预扩增和扩增步骤的组合。在另一个实施方案中，引物被预混合成适合于分析基因表达谱或突变特征的组合。引物可以是被设计成用于扩增一种或多种目的靶基因的引物。
第十一或第十二方面的试剂盒的一个实施方案另外包括关于执行本文所述的方法的说明书。
在一个实施方案中，试剂盒包括一个或多个容器，所述容器包括用于执行上文所述的方法和/或用途的一种或多种反应缓冲液。在一些实施方案中，试剂盒包括用于商业PCR仪器(例如Life Technologies 7500FastDx或Cepheid
Figure BDA0002733032440000331
II)中的由软件驱动的分析方案，其可以设置在CD上。
如本文所用，除非上下文另外明确指示，否则单数形式“a(一)”和“所述”包括多个引用对象。举例来说，术语“一引物”包括多个引物，包括其混合物。
单词“基本上”并不排除“完全”，例如“基本上不含”Y的组合物可以完全不含 Y。必要时，单词“基本上”可以从本发明的定义中省略。
除非另外说明，否则术语“包括”和其语法变体目的在于表示“开放”或“包括性”的语言，因而其包括所叙述的要素，但也允许包括额外的未叙述的要素。
如本文所用，在制剂组分的浓度的上下文中的术语“约”典型地表示所述值的 +/-5％，更典型地所述值的+/-4％，更典型地所述值的+/-3％，更典型地所述值的+/-2％，甚至更典型地所述值的+/-1％，且甚至更典型地所述值的+/-0.5％。
在本公开全文中，某些实施方案可以范围格式公开。应了解，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，且不应当被解释为对于所公开范围之范畴的固定限制。因此，范围的描述应被视为已经具体地公开了所有可能的子范围以及该范围内的单独数值。举例来说，例如从1到6的范围的描述应被视为已经具体地公开了子范围，例如从1到3、从1到4、从1到5、从2到4、从2到6、从 3到6等，以及该范围内的单独数值，例如1、2、3、4、5和6。无论范围的宽度如何，这都适用。
某些实施方案也可以在本文中被广泛地和一般性地描述。属于通用公开范围内的更窄种类和亚一般性分组中的每一个也形成本公开的部分。这包括实施方案的一般描述，带有限制条件或负面限制从一般性中移除任何主题，无论删除的材料是否在本文中被具体地叙述。
实验部分
实施例1-用于从血液捕获和回收细胞的装置.
图1A显示插入套筒，其在上端具有入口且在下端具有出口。插入套筒用作细胞捕获筛的外壳，将细胞捕获筛固定在装置的柱的出口附近。样品从插入套筒的入口流入，并通过插入套筒的出口流出。图1B显示样品所流过的通道在插入套筒的下端逐渐变细。图1C说明插入套筒和细胞捕获筛在柱内的装配。细胞捕获筛(被夹在两个O形环中间)首先放在插入套筒出口附近的狭槽中，然后使用杆形的插入工具(未展示)将整个插入套筒装配件插入到柱中。图1D显示两个细胞捕获和回收装置连接到蠕动泵，而图3A显示微过滤设备的另一个示例性安装，所述微过滤设备具有4个微过滤装置，其各自包围硅微筛(插图，比例尺＝10μm)，连接到用于流量控制的蠕动泵。血液样品通过所述装置过滤。测试使用具有各种孔径的细胞捕获筛对污染性白血球(WBC)和红血球(RBC) 的排除。图1E显示结果。1ml全血通过所述装置过滤。污染性WBC和RBC 被回收和计数(黑色柱)，或者在使蠕动泵的流动短时间反向(“反冲”)以去除粘附在筛上的细胞之后被回收和计数(白色柱)。排除倍数计算如下：
WBC或RBC的排除倍数＝(全血中的WBC或RBC)/(微滤液中的WBC 或RBC)
图1E中的柱状图表示从针对每个测试条件使用三种不同装置的测试获得的平均值。误差线表示标准偏差。
通过掺入具有30个SW620细胞的1ml供体血来优化TECC富集和回收效率，SW620细胞是和CTC具有类似的中值大小的CRC细胞系(图1F)。使用 0.25ml/min的流动速率和9-10μm的孔径获得回收效率和细胞纯度之间的最佳权衡。
测试使用掺有各种细胞系的全血的装置的回收效率。图1G显示结果，其中每个点图对应于独立实验。标记20到50个细胞/ml并将其加入1ml或3ml全血中。每个血液样品通过所述装置，并回收靶细胞，将所述靶细胞放置在96孔板中并计数。回收效率计算如下：
％回收效率＝(回收的细胞)×100/(掺入的细胞)
使用两种不同的细胞系HCT116和RKO细胞系测试使用所述设备的与捕获效率相比的细胞回收效率。将30到50个细胞掺入到1ml全血中，将回收的细胞放置在96孔板中并计数。也对筛上保持未回收状态的细胞的数目计数。通过组合回收的细胞的数目与筛上保持未回收状态的细胞的数目来计算被捕获的细胞的数目。如图2A所示，使用孔径8μm、9μm和10μm的筛时，对于HCT 116 细胞的捕获效率大于90％，且回收效率大于98％。如图2B所示，使用孔径8μm、 9μm和10μm的筛时，对于RKO细胞的捕获效率分别是大约40％、68％和58％。然而，在使用所有三种不同的孔径时，被捕获的RKO细胞的回收效率都是100％。
用HepG2细胞测试使用图2C所示的不同过滤材料的细胞捕获和回收效率。图2D所示的结果表明两种不同的过滤材料硅和氮化硅提供类似的细胞捕获和回收效率。
实施例2-肿瘤来源的内皮细胞簇(TECC)的捕获和回收
患者样品和临床数据.所有受试者都提供了参与的知情同意书。临床样品在 2012年7月与2014年4月之间，根据通过新加坡国立大学的机构审查委员会(IRB)、富斯外科医院(Fortis Surgical Hospital)和新加坡健康服务集团 (SingHealth)批准的方案获得。由富斯外科医院(FSH)和新加坡国家癌症中心(NCC)提供来自82名结直肠癌患者的连续血液样品。由新加坡群组研究联合体(Singapore Consortium of Cohort Studies)(SCCS)提供来自45名健康受试者的血液样品。所有样品在生物工程与纳米技术研究所(Institute ofBioengineering and Nanotechnology)被收集到EDTA Vacutainer(真空抗凝)管(Becton-Dickinson)中并在6小时内处理。因为微过滤装置的技术故障，两例被排除在分析之外。无论在哪里可获得，匹配的肿瘤和转移样品在切除后立即冷冻，并在-80℃储存备用。关于参与受试者的临床病理数据在补充表6中进行描述并在完成TECC计数后被回顾地收集。在事先不知道TECC计数的情况下进行临床数据收集。类似地，在TECC计数时也不知道结直肠癌患者的临床数据，除了FSH样品的诊断和术前状态。肿瘤面积以宽度×长度计算。
细胞系和培养物.HCT 116、COLO 201、SW480、SW620、DLD-1和RKO 结直肠癌细胞系、BJ-5ta永生化人包皮成纤维细胞和HUVEC是来自ATCC。 HUVEC以第1代和第2代使用并在EGM-2培养基(Lonza)中培养。所有的其它细胞系都在补充有10％FBS的DMEM(LifeTechnologies)中培养。细胞在 37℃的潮湿恒温箱中在5％CO2的存在下维持。
装置制造和装配.根据描述(Lim等人)制造硅微筛。简言之，微筛由总直径
Figure BDA0002733032440000361
为7.3mm的硅盘和厚度为300μm的支撑环组成。中心捕获区具有
Figure BDA0002733032440000362
mm和60μm厚度，并含有通过深层反应离子刻蚀而获得的100,000个圆孔。为了将微筛嵌入无菌3-ml注射器中，设计了丙烯酸套筒插入物，其由
Figure BDA0002733032440000363
的进入通道组成，所述进入通道逐渐变细成对应于微筛细胞捕获区的
Figure BDA0002733032440000364
通道。套筒插入物容纳微筛和确保良好密封和减震的硅酮O形环(0.5mm厚)，如图1C所示。回收装置如下装配。首先，移除3ml注射器柱塞的橡胶塞并使用打孔刀产生5.5mm直径的孔。将穿孔橡胶塞放入3ml注射器内。接下来，将 O形环放入套筒插入物的狭槽中，随后再放入微筛和另一个O形环。最后将具有微筛和O形环的套筒插入物放入3ml注射器中，位于穿孔橡胶塞上方。这个配置允许通过大小从全血微过滤细胞，和随后以便捷设置中从微筛上表面回收被捕获的细胞。
微过滤.为了最佳化血液微过滤，将5μM经过CellTracker(Life Technologies)标记的细胞以每毫升全血10-50个细胞的比率添加到供体血液中。借助蠕动泵 (Ismatec)在各种流动速率下过滤血液。使用PBS、0.5％BSA和2mM EDTA 洗涤6次后，将细胞再悬浮于培养基中。随后使用Hoechst 33342(Life Technologies)对细胞核染色，并回收细胞以测定回收效率和污染性WBC的排除倍数。在一些实验中，也计数保留在微筛上的CellTracker阳性细胞。回收效率百分比计算如下：
％回收效率＝(回收的细胞)×100/(掺加的细胞)
排除倍数计算如下：
WBC或RBC的排除倍数＝(全血中的WBC或RBC)/(微滤液中的WBC 或RBC)
微滤液中的WBC计数在实验富集的情况下被定义为任何Hoechst 33342阳性、CellTracker阴性事件的数目，或者在临床样品分析的情况下通过任何CD45 阳性事件定义。立即处理所有临床样品以用于图3B中描述的使用最佳参数的指定下游应用，即成像、计数、单细胞分离和分析、细胞培养或汇集核酸提取。为了估计理想的目标WBC排除，向含有50个CellTracker阳性HCT 116细胞的 PBMC的连续稀释进行显微操作。五千倍的排除倍数允许纯HCT 116细胞的显微操作，而不含污染性白血球。基于对于现有无标记CTC分离装置(Cima等人) 的文献检索来选择理想的目标回收效率。对于每个装置和最佳化的微过滤条件，使用2ml全血进行临床样品的微过滤。
使用0.25ml min-1的流动速率和9-10μm的孔径获得回收效率和细胞纯度之间的最佳权衡。这产生>90％的SW620回收效率以及白血球的>5×103排除倍数 (图3D)，从而允许除细胞计数以外的多种下游应用。
实施例3-被捕获和回收的TECC的分析和表征
本实施例描述一种用于鉴别和分析定义明确的内皮细胞(来源于血管的细胞)群体的方法，所述内皮细胞可以从血液分离且可以用作以下用途的生物标志物：
1)在肿瘤的所有阶段、甚至在疾病的非常早期阶段诊断肿瘤
2)监测对于肿瘤治疗的应答
3)预测对于肿瘤治疗的应答
4)预测肿瘤的血管特征。
所述方法可以自己独自使用，或者可以和标准诊断/预后方法组合以增加诊断/预后测试的准确性。举例来说，这种方法可以和CEA测量(一种在血液中测量的结直肠癌的生物标志物)组合以有助于结直肠肿瘤的诊断。
筛上免疫荧光.在含有0.5％BSA、2mM EDTA和人FcR封闭试剂(Miltenyi Biotec)的PBS中洗涤5次后，使用以下荧光标记的抗体直接‘在筛上’将悬浮细胞染色30分钟：抗-CD45 1:200(克隆2D1；eBioscience)、抗-Ep-CAM 1:20(9C4， BioLegend)、抗-CD31 1:20(WM59，BioLegend)、抗-CD144 1:10(55-7H1， BD)、抗-CD41 1:20(HIP8，BioLegend)、抗-CD42B 1:20(HIP1，BioLegend)。对于细胞内抗原，使用Inside Stain试剂盒(MiltenyiBiotec)和人FcR封闭试剂以及以下抗体：抗-VWF 1:200(兔多克隆A0082，DAKO，使用LifeTechnologies APEX抗体标记试剂盒内部缀合至Alexa 488或Alexa 555上)、抗-波形蛋白(V9， Santa Cruz Biotechnology)、抗-广谱细胞角质蛋白(pan Cytokeratin)(C11，CellSignaling Technology)。使用Hoechst 33342(Life Technologies)对核染色。在一些实验中，使用钙黄绿素AM(Calcein AM)(Life Technologies)鉴别活细胞。在洗涤步骤后，回收细胞并在倒置荧光显微镜(IX81，奥林巴斯)下在悬浮液中可视化以用于成像、计数和/或显微操作。使用MetaMorph软件(Molecular Devices)以及CoolSNAP HQ2 CCD照相机(Photometrics)记录图像。
TECC定义和计数.使用本文所述的方法检测结直肠癌患者的血液中的肿瘤来源的内皮细胞群体。这些细胞形成来源于肿瘤血管系统(肿瘤血管)的多个细胞的簇(图8)，因此被鉴别为肿瘤来源的内皮细胞簇(TECC)。TECC定义如下：“从血液分离的具有>10μm的主轴、具有至少2个明显区别的核并表达 CD31、VWF或CD144蛋白但不表达CD45、CD41和CD42B的任何细胞或细胞簇”(图8B)。重要的是，属于巨核细胞谱系、具有大的分叶状单核或大的圆形单核的细胞群体被排除在外。这些细胞具有容易和TECC区别的特征性细胞形态，对CD41和CD42B染色呈阳性，且主要在经历治疗的结直肠癌患者中观察到，但是在一些健康志愿者和未治疗结直肠癌患者中也被观察到。单一内皮细胞也被排除在分析之外，因为其直径较小，从而允许其通过微筛。通过将从2 ml全血获得的微滤液加入到96孔板的孔中，通过应用这些纳入标准和排除标准来计数TECC。在短暂的离心步骤后，通过使用20倍物镜手动扫描目标孔三次来鉴别TECC并计数。通过检测到至少一个TECC来定义阳性样品。
如图13所示，TECC计数与炎症标志物或其它变数无关。这表明TECC与炎症事件或和肿瘤无关的其它变数没有直接关联。这因此支持TECC是肿瘤来源的。
测定TECC是否是肿瘤来源的
为了测试TECC是否来源于肿瘤，在手术肿瘤切除(n＝34)之前0-24h 和之后24-72h从17名结直肠癌患者收集成对样品。肿瘤移除引起内皮TECC 的急剧减少，从而支持肿瘤与TECC之间的直接关联(图8H和补充表5)。编码前列腺特异性膜抗原(PSMA)的基因叶酸水解酶(FOLH1)在各种癌症类型的肿瘤血管系统中被表达，但在正常血管系统和外周血中不存在。FOLH1的确在从新鲜结直肠癌组织分离的CD31+CD45-细胞中和从7/10结直肠癌患者的血液分离的TECC中被表达，但在从正常组织分离的内皮细胞中或在健康供体外周血单核细胞(PBMC)中不被表达(图9)。这个结果进一步支持内皮TECC 的肿瘤起源(图8)。另外，TECC的RNA-Seq数据揭示若干肿瘤内皮标志物的表达(图11)。通过对来源于具有低或高TECC计数的患者的肿瘤组织中的血管计数，进一步研究TECC数目是否可能和潜在的肿瘤血管系统的特征有关。虽然血管单元的中值数目没有不同，但是管腔的中值数目在具有高TECC计数的患者中明显更高。总体看来，显示结直肠癌患者中的TECC不是恶性实体，而是肿瘤来源的成熟内皮细胞的簇。
因为TECC和原发性肿瘤之间的上述关联，接着研究内皮TECC是否是结直肠癌的信息指示物。对从125名受试者(45名对照健康志愿者和80名结直肠癌患者的连续系列，包括来自上述患者的TECC计数)的总计141个临床样本得到的内皮TECC计数。在76.2％(61/80)的结直肠癌患者中但仅在2.2％(1/45) 的健康个体中观察到至少一个内皮TECC(图12A)。发现与经历针对结直肠癌的治疗干预的患者相比，未治疗患者呈现明显更高的内皮TECC计数(图12C)。然而，内皮TECC计数与临床参数例如肿瘤分期、分级或远端转移的存在(补充表6和7)或者与包括炎症标志物的其它变数没有关联。具体来说，时间序列分析中的内皮TECC数目指示手术切除事件对TECC分布具有最强的影响，从而证实图8H中的结果且进一步支持内皮TECC与原发性肿瘤的存在的关联(图 12B)。在86.5％的未治疗患者(45/52)中但仅在2.2％的健康对照(1/45)中存在内皮TECC指示TECC计数在辅助结直肠癌诊断方面可能是有用的。比较未治疗患者与健康对照的受试者工作特征(ROC)曲线的曲线下面积(AUC)是0.930(图12D)，且比较未治疗早期CRC患者与健康对照的ROC曲线的AUC 是0.923(图12F)。值得注意的是，具有低病理肿瘤分期(分期≤IIA)的结直肠癌患者在86.4％(19/22)的病例中对内皮TECC也呈阳性，AUC＝0.922(图 12E)。总体看来，这些结果进一步证实内皮TECC计数与原发性肿瘤的存在之间的关联。此外，内皮TECC在未治疗患者中但不在健康个体中的普遍存在指示，内皮TECC计数可以潜在用作结直肠癌的诊断辅助。
靶细胞的鉴别、显微操作和储存.使用连接到25ml注射器的口吸管手动地微量移液靶细胞。简言之，借助亮场图像、核染色和特定的荧光信号从总细胞回收中鉴别细胞。然后将目标单细胞或TECC微量移液到洗涤缓冲液的10-μl 液滴中，随后沉积在含有以下适当缓冲液的0.2-ml PCR管中：用于scrmPCR的 5μl的2×反应缓冲液(CellsDirect One-StepqRT-PCR Kit,Life Technologies)，用于全基因组扩增的2μl的PBS，或用于低输入RNA-Seq的2μl的SuperBlock 缓冲液(Thermo Scientific)。细胞立即储存在-80℃下备用。在一些情况下，将完全微滤液快速离心并储存在-80℃下直至进一步使用。
单细胞RNA和突变分析PCR(scrmPCR).
为了确认经历EMT的单细胞中DNA突变的存在，确立PCR方案以在单细胞规模下同时定量RNA转录物和检测DNA突变(单细胞RNA和突变分析PCR 或‘scrmPCR’)(图5，补充表1)。
使用Primer-BLAST(Ye等人)设计引物。对于每一RNA转录物，将引物设计成跨越外显子-外显子边界，或者由对应基因组DNA区域上的至少一个内含子分隔的引物。用于突变分析的引物被设计成结合靶基因的内含子区域(补充表1)。scrmPCR可用于在同一个细胞中同时检测和定量RNA转录物和序列 DNA热点。简言之，使用SuperScript III反转录酶(Invitrogen)和500nM目标反向引物混合物在50℃将单细胞RNA转录物反转录30分钟。然后通过将正向引物的匹配混合物加入到转录物特异性反向引物和靶向基因组区域的引物对中，使用Platinum Taq DNA聚合酶(Invitrogen)进行预扩增操作。预扩增循环通过在没有延长的情况下交替退火和变性步骤如下进行：60℃，4min和95℃， 1min的6个周期；55℃，4min和95℃，1min的6个周期；50℃，4min和 95℃，1min的6个周期。使用Axyprep PCR清除试剂盒(Axygen)进行引物清除。样品被1/20稀释并在-20℃储存直至进一步使用。对于RNA转录物定量，使用2μl预扩增反应物、根据靶转录物的半巢式引物对(补充表1)和SensiFASTSYBR Lo-ROX试剂盒(Bioline)，在ViiA7仪(Applied Biosystems)上遵照制造商的方案进行定量PCR。使用ACTB作为参考基因，将相对基因表达标准化。为了分析选定的DNA突变热点，通过使用2μl预扩增反应物、巢式PCR引物对(补充表1)和含有校对聚合酶的主混合物(KOD Hot Start Master Mix，EMD Millipore)，遵照制造商的说明书进行PCR。对于肿瘤和正常组织中的KRAS外显子2测序(图6d)，使用以下正向引物TTTGTATTAAAAGGTACTGGTGGAG和反向引物CCTTTATCTGTAT CAAAGAATGGTC进行PCR扩增。在琼脂糖凝胶上分离PCR产物，切除特定的条带并使用桑格方法测序。
图6a提供一种用于TECC的示例性scrmPCR工作流。使用scrmPCR方法根据所述工作流分析TECC样品。来源于4名患者的9个TECC的scrmPCR揭示存在包括SERPINE1、FOXC1和KRT8的上皮和间充质标志物，这和先前对于乳腺癌CTC所报道的上皮-间充质谱是一致的(图6b和6c)。通过panCK和波形蛋白免疫染色(图7a)证实了这些结果。接下来针对在对应原发性肿瘤中存在的突变对这些TECC测序。令人吃惊的是，测试的所有DNA序列热点都匹配野生型等位基因(图6d)。靶向高通量DNA测序被进一步应用于从16个单TECC (6名患者)和匹配肿瘤组织扩增的DNA中的8个通常突变的基因。再一次无法检测到肿瘤组织与相关TECC之间的匹配突变(补充表2和3)。使用从12 个TECC(4名患者)扩增的DNA，接着进行阵列比较基因组杂交(aCGH)。实际上，来自肺癌患者的CTC已经显示可再现地反映癌症组织拷贝数变化。在这里，与匹配的原发性肿瘤相比，TECC反而具有正常的细胞遗传学谱(图6e- g)。总的来说，来自10名患者的26个TECC的单细胞规模分析虽然显示上皮- 间充质标志物表达，但并不反映在匹配肿瘤组织中发现的DNA异常。这暗示与肿瘤上皮无关的一种TECC来源。
核酸提取.使用RNAqueous-Micro总RNA分离试剂盒(Ambion)，遵照制造商的说明书，对完全微滤液或分离细胞进行RNA提取。使用RNeasy迷你试剂盒(Qiagen)从组织分离总RNA。使用DNeasy迷你试剂盒(Qiagen)从组织分离DNA。
TECC靶向再测序和阵列比较基因组杂交(aCGH).使用GenomePlex单细胞全基因组扩增试剂盒(Sigma)并遵照制造商的说明书，对单TECC进行全基因组扩增。使用相同程序扩增组织DNA(50pg)样品。对于靶向再测序，设计靶向NRAS、CTNNB1、PIK3CA、EGFR、BRAF、PTEN、KRAS、AKT1和TP53 基因(～6.1kb)的外显子的一组定制基因。使用Ion AmpliSeq LibraryKits 2.0(Life Technologies)以及10ng输入DNA构建文库。在Ion Torrent PersonalGenome Machine(PGM)测序仪(Life Technologies)上进行靶向再测序操作。使用IonTorrent Variant Caller Plugin在高严谨性设定下收集变异体。通过利用制造商的说明书和试剂将250ng DNA杂交到CytoScan 750K阵列(Affymetrix)上来进行 aCGH。使用Chas软件2.1版(Affymetrix)分析和可视化数据。图6f显示aCGH 分析的结果。线条指示使用Affymetrix ChAS软件计算的已平滑数据。星号指示在肿瘤样品中检测到的大染色体异常。应注意在TECC中，无法发现染色体异常，表明TECC不是来源于肿瘤上皮。因此，TECC不同于之前所述的恶性CTC 簇。
TECC和组织cDNA合成和RNA-Seq.
通过高通量测序(RNA-Seq)对来自8名患者的18个单TECC以及匹配正常结肠和肿瘤组织进行RNA表达谱分析(图9c，补充表4)。使用分别具有25 个周期和18个周期的长距离PCR(LDPCR)，利用SMARTer Ultra Low RNA试剂盒(Clontech Laboratories)从单TECC和10pg组织RNA合成cDNA。对于每个样品，使用自适应聚焦声波(Adaptive FocusedAcoustics)系统(Covaris) 剪切cDNA。使用NEBNext DNA文库制备预混物试剂盒(NewEngland Biolabs) 构建文库。使用独特的索引对所有文库编上条码并汇集起来以用于在Illumina HiSeq 2000平台上进行RNA测序。使用Tophat(第2版)(Trapnell等人,2009) 将数据映射到人基因组第19版(hg19)。Cufflinks(第2.2版)(Trapnell,C.等人, 2010)用于定量作为FPKM(每百万定位读段的每千碱基转录物的片段)的基因表达。
进一步研发用于从转录谱推理细胞谱系的工作流(图14和15)。在包括42 种不同细胞类型的比较中(图9a至9c)，所有的TECC转录物组与内皮谱系的细胞类型是相关的(图9c)。基于scrmPCR测量的一系列内皮谱系标志物以及通用EMT标志物的存在在另外的14个TECC中得到证实(图8)。内皮细胞被视为特化上皮，且已知表达波形蛋白(通常用作间充质标志物)和各种角蛋白 (经典上皮标志物)。所有TECC(包括具有恶性细胞形态的那些)都无意外地对于内皮标志物例如CD31、VWF或CD144(图8B)被染色，但是对CD45或巨核细胞谱系标志物CD41和CD42B呈阴性。这表明在结直肠癌患者中，检测的所有TECC都是内皮起源。另外，没有检测到TECC内的单一肿瘤细胞。当前发现和El-Heliebi等人(其报道了在来自肾癌患者的循环非血液细胞(CNHC) 上的CD31表达)一致，但是和描述了恶性来源的CTC簇的最新报道不同(Aceto 等人)。从Aceto等人所述的CTC簇的RNA-Seq数据的谱系推理事实上指示上皮来源细胞的存在。本研究中表征的TECC因此代表结直肠癌患者中的截然不同的循环内皮细胞簇的群体。
RNA-Seq数据主成分分析.对完全RNA-Seq数据集进行主成分分析(图 9a-c)。通过选择前300个基因计算秩相关系数，所述基因通过在第1至第3主成分中的最大载荷被分类。根据这个清单，对每个TECC和组织计算斯皮尔曼秩相关系数(ρ)，并将得到的数据绘制成热图。通过平均连接聚类法(average linkage clustering)产生聚类树状图。
RNA-Seq数据谱系推理.用于谱系推理的工作流在图14呈现并用在要求时可用的R脚本实施。简言之，获得原代细胞atlas数据集(GSE49910)(Mabbott 等人)并选择来自298个不同实验的表达数据，对应于N＝42个不同细胞类型或‘谱系’(图15)。对于每个谱系l中的每个基因g来说，基于由Schug等人介绍的香农信息熵和Q统计学计算‘特异性指数’S，
Figure BDA0002733032440000431
其中p(l│g)是谱系l中的基因g的相对表达。通过使用BioGPS可视化具有高特异性指数的基因的表达数据来证实基因特异性(图14)。对于每个谱系，选择具有最高特异性指数的前80个基因(‘特异性基因’)(图14a)。之所以选择 80个基因是因为这在本文报道的分析中提供最佳分辨率。接下来，对于每个 RNA-Seq样品，计算对每个谱系具有特异性的基因的数目。同时，从Affymetrix HG-U133_Plus_2基因清单产生80个随机选择基因的1,000×清单(‘随机基因’)，并测定每个实验RNA-Seq图谱中偶然出现的基因的平均数目。最后，通过对每个实验样品中的每个测试谱系进行费舍尔精确检验来检查富集的特异性基因的数目是否等于随机富集的基因的数目。对每个检验的比值比进行均值中心化，测量并在包括所有经检验谱系的热图中可视化。最终结果用于基于标准化比值比的分布产生关于细胞谱系的假设。使用从各种细胞类型和组织产生的公开 RNA-Seq数据集验证算法(图15)。
内皮祖细胞(EPC)分析.如先前所述(Kalka等人,Colombo等人)进行集落形成EPC分析。简言之，通过CD144和钙黄绿素AM荧光染色，在2ml微滤液中对活内皮TECC计数。然后将来自第二装置的2ml血液的未染色微滤液放置在涂布有纤连蛋白(1μg/cm2)(Sigma-Aldrich)的96孔板上在EGM-2细胞培养基(Lonza)的存在下培养。在孵育前通过亮场显微镜确认TECC的存在。 HUVEC如下用作阳性对照：将10,000个HUVEC掺加到2ml供体血液中并使用两个装置通过微滤分离。在一个装置中，通过CD144和钙黄绿素AM染色定量回收的HUVEC。从另一个装置回收的HUVEC以指定数目(5、10、20、40、 80和160个细胞)接种到8个重复孔中。2天后，更换培养基，并通过每隔一天更换一半培养基使细胞生长总计30天。在亮场显微镜下每周监测集落的存在和活力。30天后，通过胰蛋白酶化分离细胞，使用CD144抗体、钙黄绿素AM 和Hoechst 33342染色，并在IX81(奥林巴斯)倒置荧光显微镜下定量。
微血管密度和管腔计数.如先前所述(Wild等人,Gupta等人)且使用ImageJ(Schneider等人)，使用被CD31染色的组织切片的免疫荧光图像进行微血管密度(MVD)计数。简言之，将新鲜组织埋入组织-Tek O.C.T化合物(Sakura) 中并在-80℃储存直至进一步使用。从所有可用的组织将5微米冷冻切片切到聚 L-赖氨酸载玻片上，在含有4％多聚甲醛的PBS中固定8分钟，在PBS中洗涤，并使用PE-抗-CD抗体(1:20，克隆WM59,BioLegend)染色。借助IX71显微镜系统(奥林巴斯)和MetaMorph软件(Molecular Devices)，用10倍目镜对每个组织切片的完整肿瘤区域成像。在成像前以及在MVD和管腔计数期间，隐藏患者ID以避免在数据采集和分析期间的主观偏见。
从新鲜组织分离内皮细胞.如先前所述(Van Beijnum等人)，在略微修改所述方案的情况下从正常结肠和肿瘤组织分离内皮细胞。简言之，将新鲜组织切碎并根据描述使用胶原酶、分散酶和DNAse在37℃消化60分钟。在Ficoll-Paque 密度离心步骤之后，使用MACS试剂和材料(Miltenyi Biotec)遵照制造商的说明书进行两步磁选。首先，在用抗CD45磁珠和人FcR封闭试剂标记细胞之后，通过在LD柱上的阴性筛选来排除CD45-表达细胞。接着收集CD45被排除的级分，并通过加入抗CD31磁珠和人FcR封闭试剂来进行第二标记。在使用MS柱的阳性筛选之后，将富含CD31+CD45-细胞的级分在-80℃储存直至进一步使用。
患有除结直肠癌以外的癌症的患者中TECC的检测
TECC不仅可以在结直肠癌患者的血液中被检测到，而且还可以在具有其它恶性肿瘤例如乳腺癌、前列腺癌、肾癌、移行细胞癌、肺癌和胆管癌的患者中被检测到(参见表3和4)。因此，针对TECC的标志物可用于检测任何类型的癌症，也可用于监测和预测治疗性治疗例如化疗或手术的结果。
表3.TECC计数和具有不同类型的转移性疾病的患者对治疗的应答有关。临床试验细节可以使用以下ID：NCT02435927在clinicaltrials.gov评估。
Figure BDA0002733032440000451
表4.手术前和手术后的移行细胞癌患者中的TECC计数
Figure BDA0002733032440000452
统计分析.在R环境(3.1.0版)中进行统计分析(R Core Team等人)。在多重比较的情况下，使用双尾Wilcoxon-Mann-Whitney U检验以及Bonferroni 校正测试不配对样品。对于每个测试，使用‘硬币’封装(Zeileis等人)计算具有位置参数(Hodges-Lehmann估计
Figure BDA0002733032440000453
)和其95％置信区间(CI)的精确P值。对于成对样品，使用双尾精确威尔考克森符号秩检验(two-tailed exact Wilcoxon signed-rank test)。使用‘pROC’封装(Robin等人)计算具有AUC和95％CI区间的ROC曲线。为了容易解释和比较效应值，如下推导每个统计检验的效应值 r：
Figure BDA0002733032440000454
其中Z是Wilcoxon-Mann-Whitney U检验或威尔考克森符号秩检验的Z值(Rosenthal等人)。如Rice&Harris(Rice等人)所述推导来自AUC 的r。如Cohen(Cohen等人)所介绍的，应用以下解释：r＝0.1，小效应；r＝0.3，中等效应；r＝0.5，大效应。箱线图显示为代表四分位距(IQR)的箱体，其中横跨箱体的线指示中值，须线指示1.5×IQR。为了推导病例对照研究所需的最小样本大小，首先假定TECC的存在与结直肠癌的存在之间没有关联(零假设)，并且对于0.95的目标功效，使用‘pwr’封装(Champely等人)的pwr.chisq.test函数估计最小样本大小n＝72。假定0.01显著性水平下的效应值w＝0.5，其中基于5名结直肠癌患者的初步试验、从具有阴性TECC计数的4名健康对照获得的信息、以及报道在健康个体中没有TECC但在各种癌症类型的病例中普遍存在TECC的文献综述(补充表1)，选择w＝0.5。使用肯德尔tau(τ)系数和其推导的P值检验相关性。对于RNA-Seq数据的谱系推理和主成分分析，分别使用费舍尔精确检验和斯皮尔曼相关系数(ρ)，如专门的方法段落中所描述。显著性水平被设定为0.05。一个星号(*),P<0.05；两个星号(**),P<0.01；三个星号(***),P<0.001；不显著(ns),P≥0.05。
TECC的分析的结果和结论
从结直肠癌患者分离的TECC不是癌细胞，而是代表截然不同的肿瘤来源的内皮细胞群体。TECC不反映匹配肿瘤的遗传变异，但是TECC表达上皮和间充质转录物，这和关于CTC表型分析的先前报道一致。单TECC的转录物组分析揭示其身份为内皮细胞，还有其它结果指示其肿瘤来源和成熟表型。在从手术前早期癌症患者取样的血液中发现内皮TECC的普遍存在但在健康供体中没有发现，表明内皮TECC计数是结直肠癌的潜在指示物。内皮TECC不应当和真正的CTC混淆，虽然他们的分析在诊断上可能有帮助，并且提供在治疗和疾病过程中潜在肿瘤血管系统的直接信息。
总而言之，来自结直肠癌患者的单TECC的分离、回收和分析第一次提供单TECC的转录物组谱以及关于TECC的肿瘤内皮来源的若干证据。检测到内皮TECC为多种细胞的结构。因此，TECC可能是从经历病理性血管生成(在结直肠肿瘤发展中被识别的一个早期事件)的混乱肿瘤血管系统上脱落。临床前模型可能揭示循环中的肿瘤内皮细胞脱落的基础机制，并且当前正在研究中。与通常在具有晚期疾病的患者中检测到的CTC对比，TECC是在早期和术前结直肠癌患者中流行的肿瘤来源的实体。内皮TECC计数因此代表用于早期结直肠癌检测的吸引人的方法。在这个研究中，没有像Aceto等人所报道的那样检测到CTC簇的存在。这可能是因为患者档案的差别。事实上，Aceto等人分析了来自末期乳腺癌患者的血液样品，而这个研究中的血液样品大部分来源于术前结直肠癌患者。其它研究将需要针对各种疾病中的循环内皮细胞簇的特异性。有趣的是，组织特异性分子特征已经在来自各种器官的内皮细胞中得到证明，表明基于特异性基因集的表达TECC可能被追溯到其来源器官。因为TECC的暗示恶性肿瘤的细胞形态、角蛋白表达以及混合上皮和间充质标志物图谱，所以内皮TECC不应当和经历EMT的真正的恶性CTC混淆。同时，内皮TECC 分析可能有助于早期结直肠癌检测并提供治疗和疾病过程中的潜在肿瘤血管系统的直接信息。
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补充表1-7
补充表1：包括描述为癌性实体的循环肿瘤细胞簇或CTM的所选出版物(1959-2014)
Figure BDA0002733032440000511
Figure BDA0002733032440000521
Figure BDA0002733032440000531
Figure BDA0002733032440000541
Figure BDA0002733032440000551
Figure BDA0002733032440000561
Figure BDA0002733032440000571
Figure BDA0002733032440000581
Figure BDA0002733032440000591
Figure BDA0002733032440000601
Figure BDA0002733032440000611
Figure BDA0002733032440000621
Figure BDA0002733032440000631
Figure BDA0002733032440000641
Figure BDA0002733032440000651
Figure BDA0002733032440000661
Figure BDA0002733032440000671
补充表4：RNA-seq数据，到hg19外显子的独特映射读数
Figure BDA0002733032440000681
说明：
P，患者
T，肿瘤组织
c，中央
d，深部
s，浅表
N，正常组织
Met，转移
TECC，肿瘤来源的内皮细胞簇
补充表5：术前和术后TECC计数。来自图8H的数据
Figure BDA0002733032440000691
前：术前0-24hr血液中的TECC计数
后：术后24-72hr血液中的TECC计数
补充表6：基线患者和健康供体特征
Figure BDA0002733032440000701
*不包括来自图3e的术后数据
补充表7：本研究中分析的每个基线样品的TECC计数和单TECC的数目
Figure BDA0002733032440000711
补充表7：本研究中分析的每个基线样品的TECC计数和单TECC的数目
Figure BDA0002733032440000721
补充表7：本研究中分析的每个基线样品的TECC计数和单TECC的数目
Figure BDA0002733032440000731
图例说明：
NUH，新加坡国立大学医院
IBN，新加坡生物工程和纳米技术研究所
FSH，新加坡富斯外科医院
NCC，新加坡国家癌症中心
CRC，结直肠癌
早期，分期≤IIA
*不包括来自图3f的术后样品
序列表
<110> 新加坡科技研究局
<120> 用于基于大小回收稀有细胞的以柱为基础的装置和方法，及其用途
<130> 9869SG3596
<160> 58
<170> PatentIn第3.5版
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SERPINE1预扩增正向引物
<400> 1
gccaagagcg ctgtcaa 17
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SERPINE1预扩增和扩增反向引物
<400> 2
cagcagaccc ttcaccaaa 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VIM预扩增和扩增正向引物
<400> 3
gatgtttcca agcctgacct 20
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VIM预扩增反向引物
<400> 4
cagtggactc ctgctttgc 19
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FOXC1预扩增和扩增正向引物
<400> 5
cacaccctca aagccgaact 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FOXC1预扩增反向引物
<400> 6
aaagtggagg tggctctgaa 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KRT8预扩增正向引物
<400> 7
aaggatgcca acgccaagtt 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KRT8预扩增和扩增反向引物
<400> 8
ccgctggtgg tcttcgtatg 20
<210> 9
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EPCAM预扩增正向引物
<400> 9
gcaggtcctc gcgttcg 17
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EPCAM预扩增和扩增反向引物
<400> 10
tctcccaagt tttgagccat tc 22
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PTPRC预扩增正向引物
<400> 11
gacatcatca cctagcagtt catg 24
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PTPRC预扩增和扩增反向引物
<400> 12
cagtggggga aggtgttgg 19
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VWF预扩增正向引物
<400> 13
acacaggggg accaaagag 19
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VWF预扩增和扩增反向引物
<400> 14
gagatgcccg ttcacacca 19
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PECAM1预扩增正向引物
<400> 15
tctcaacggt gacttgtgg 19
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PECAM1预扩增和扩增反向引物
<400> 16
gttcttccca ttttgcaccg t 21
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MCAM预扩增和扩增正向引物
<400> 17
ctcggtccca ggagtacc 18
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MCAM预扩增反向引物
<400> 18
tgtacaaacc actcgactcc a 21
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ITGA2B预扩增正向引物
<400> 19
cttctatgca ggccccaat 19
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ITGA2B预扩增和扩增反向引物
<400> 20
agcctacatt tcgggtctca tc 22
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD34预扩增正向引物
<400> 21
ccttctgggt tcatgagtct tgaca 25
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD34预扩增和扩增反向引物
<400> 22
tgtcgtttct gtgatgtttg ttgtg 25
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FOLH1预扩增正向引物
<400> 23
cggatattgt accacctttc agt 23
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FOLH1预扩增和扩增反向引物
<400> 24
agcagggtcg gagtagagaa 20
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ENG预扩增和扩增正向引物
<400> 25
gtgacggtga aggtggaact ga 22
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ENG预扩增反向引物
<400> 26
ttgaggtgtg tctgggagct 20
<210> 27
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KDR预扩增和扩增正向引物
<400> 27
gaaatgacac tggagcctac aag 23
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KDR预扩增反向引物
<400> 28
aatggacccg agacatggaa t 21
<210> 29
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CDH5预扩增正向引物
<400> 29
gttcacgcat cggttgttca at 22
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CDH5预扩增和扩增反向引物
<400> 30
gcctgcttct ctcggtccaa 20
<210> 31
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TEK预扩增和扩增正向引物
<400> 31
cttatttctg tgaagggcga gtt 23
<210> 32
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TEK预扩增反向引物
<400> 32
ctcccttgtc cacagtcata gt 22
<210> 33
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ANGPT2预扩增正向引物
<400> 33
aacactccct ctcgacaaac aaatt 25
<210> 34
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ANGPT2预扩增和扩增反向引物
<400> 34
ctgtagttgg atgatgtgct tgtc 24
<210> 35
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SERPINE1扩增正向引物
<400> 35
agaacttcag gatgcagatg tct 23
<210> 36
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VIM扩增反向引物
<400> 36
tgtaccattc ttctgcctcc t 21
<210> 37
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FOXC1扩增反向引物
<400> 37
gagggatatt ctgttcgctg gt 22
<210> 38
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KRT8扩增正向引物
<400> 38
gctggagggc gaggaga 17
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EPCAM扩增正向引物
<400> 39
ccgcagctca ggaagaatgt 20
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PTPRC扩增正向引物
<400> 40
caacagtgga gaaaggacgc a 21
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VWF扩增正向引物
<400> 41
tgcctccaaa gggctgtatc 20
<210> 42
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PECAM1扩增正向引物
<400> 42
cagtcttcac tctcaggatg c 21
<210> 43
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MCAM扩增反向引物
<400> 43
cggccattct tgtaccagat ga 22
<210> 44
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ITGA2B扩增正向引物
<400> 44
ggcggcgtgt tcctgt 16
<210> 45
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD34扩增正向引物
<400> 45
ctaccccaga gttacctacc ca 22
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FOLH1扩增正向引物
<400> 46
ccagagggcg atctagtgta 20
<210> 47
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ENG扩增反向引物
<400> 47
agtattctcc agtggtccag atct 24
<210> 48
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KDR扩增反向引物
<400> 48
tgttggtcac taacagaagc a 21
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CDH5扩增正向引物
<400> 49
cacgcctctg tcatgtacca 20
<210> 50
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TEK扩增反向引物
<400> 50
gtagctggta ggaaggaagc t 21
<210> 51
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ANGPT2扩增正向引物
<400> 51
ggaccagacc agtgaaataa acaa 24
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KRT18预扩增正向引物
<400> 52
tgctcaccac acagtctgat 20
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KRT18预扩增反向引物
<400> 53
cactttgcca tccactagcc 20
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KRT19预扩增正向引物
<400> 54
cagccactac tacacgacca 20
<210> 55
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KRT19预扩增反向引物
<400> 55
cgttgatgtc ggcctcca 18
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KRT18扩增正向引物
<400> 56
tggaggaccg ctacgcccta 20
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KRT18扩增反向引物
<400> 57
ccaaggcatc accaagacta 20
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KRT19预扩增正向引物
<400> 58
tgcgggacaa gattcttggt 20

Claims (16)

1.一种用于从样品捕获和回收细胞的设备，其包括至少一个柱，所述柱包括：
(i)界定内腔室的内壁，所述内腔室在所述柱的第一端具有用于接收所述样品的入口开口，并且在所述柱的第二端具有出口开口；
(ii)在所述内腔室内部邻近所述柱的所述第二端安置的穿孔塞；
(iii)在第一端具有开口并且在第二端具有开口的套筒插入物，所述套筒插入物包括在所述第二端逐渐变细的通道并且安置在所述内腔室内，其第二端邻近所述穿孔塞；和
(iv)容纳在所述套筒插入物内的过滤部件，所述过滤部件包括夹在两个密封部件中间的筛。
2.根据权利要求1所述的设备，其包括一个柱，或者两个或更多个柱；
其中，任选地，所述柱的所述第二端适于连接到一个或多个泵，所述泵用于控制通过所述柱的所述样品的流动速率，
其中，任选地，所述泵适于在选自由以下组成的组的流动速率下传递所述样品：至少约0.05mL/min、至少约0.10mL/min、至少约0.15mL/min、至少约0.20mL/min、至少约0.25mL/min、至少约0.30mL/min、至少约0.40mL/min和至少约0.50mL/min；
其中，任选地，所述筛包括非细胞粘附性材料，
其中，任选地，所述非细胞粘附性材料选自由硅、二氧化硅、氮化硅、基于环氧基的负型光刻胶和陶瓷组成的组，
其中，任选地，所述基于环氧基的负型光刻胶包括SU-8，以及
其中，任选地，所述筛包括多个孔，所述孔的直径选自由以下组成的组：至少约6μm、至少约7μm、至少约8μm、至少约9μm、至少约10μm、至少约12μm、至少约14μm、至少约16μm、至少约18μm和至少约20μm。
3.一种用于从样品捕获和回收细胞的方法，其包括以下步骤：
(a)将所述样品引入根据权利要求1或2所述的设备的所述入口开口以允许所述样品流过所述设备的所述套筒插入物和过滤部件；和
(b)收集在所述设备的所述过滤部件中的所述筛的表面上保留的残余物。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述样品包括生物流体，任选地，所述生物流体选自由以下组成的组：全血、血清、血浆、脑脊髓液、淋巴液、囊液、痰、粪便、胸腔积液、黏液、腹水和尿，
其中，任选地，所述样品包括单细胞，
任选地，所述单细胞选自由疑似癌细胞、疑似肿瘤来源细胞、疑似来源于胚胎或胎儿的细胞、和来自病原生物体的细胞组成的组；或者
所述样品包括多个细胞，其中所述多个细胞中的至少一些任选地选自由以下组成的组：疑似癌细胞、疑似肿瘤来源细胞、疑似来源于胚胎或胎儿的细胞、和来自病原生物体的细胞；
其中，任选地，所述多个细胞中的两个或更多个形成细胞簇；
其中，任选地，所述单细胞或所述多个细胞中的至少一些是多核的；
其中，任选地，所述样品是血液样品，且从其捕获和回收的细胞包括至少两个明显区别的核，
其中，任选地，所述细胞的主轴是至少10μm；
其中，任选地，所述细胞表达选自由PECAM1、VWF和CDH5组成的组的基因；
其中，任选地，所述细胞不表达选自由PTPRC、ITGA2B和GP1BA组成的组的基因；以及
其中，任选地，收集步骤(b)中的所述残余物包括使用移液管回收所述残余物。
5.一种用于在受试者的样品中检测具有以下特征的分离细胞群体的方法，
(i)是来源于肿瘤并且分离自血液的内皮细胞；
(ii)每个细胞都具有至少两个明显区别的核；
(iii)每个细胞都具有大于约10μm的主轴；
(iv)表达内皮细胞基因或蛋白质；
(v)不表达白细胞特异性基因或蛋白质；和
(vi)不表达巨核细胞或血小板特异性基因或蛋白质；
所述方法包括：
(a)使用根据权利要求1或2所述的设备或根据权利要求3或4所述的方法从所述样品捕获和回收所述细胞。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述分离细胞群体的内皮细胞基因选自由PECAM1、VWF和CDH5组成的组；并且
其中，任选地，所述白细胞特异性基因和巨核细胞特异性基因或血小板特异性基因选自由PTPRC、ITGA2B和GP1BA组成的组。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其进一步包括以下步骤：
(b)使来自步骤(a)的细胞与偶合到可检测标记上的至少一个抗体接触以允许所述抗体结合到在所述细胞上表达的一个或多个目标生物标志物；
(c)从所述样品去除未结合的抗体；和
(d)检测和分析结合到所述抗体的所述可检测标记以检测所述分离细胞群体。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述抗体能够特异性结合到选自由以下组成的组的目标生物标志物：PAI-1、波形蛋白、FOXC1、角蛋白-8、角蛋白-18、角蛋白-19、Ep-CAM、CD45、VWF、PECAM-1、CD146、CD41、CD34、PSMA、CD105、CD309、CD144、CD202B和血管生成素2；以及
其中，任选地，所述可检测标记选自由荧光基团、放射性同位素、稳定同位素、酶基团、化学发光基团和生物素基基团组成的组。
9.根据权利要求5所述的方法，其进一步包括以下步骤：
(b)裂解来自步骤(a)的细胞；
(c)使来自步骤(b)的裂解细胞样品与来自第一引物对的反向引物以及反转录酶接触，以实现RNA反转录成cDNA，来自所述第一引物对的所述反向引物被导向目标RNA区域；
(d)随后使来自步骤(c)的样品与以下物质接触：
(i)来自所述第一引物对的正向引物，来自所述第一引物对的所述正向引物被导向目标cDNA区域，
(ii)来自第二引物对的反向引物和正向引物，来自所述第二引物对的所述反向引物和正向引物被导向目标DNA区域，和
(iii)DNA聚合酶，
以在预扩增步骤中同时扩增所述目标cDNA区域和所述目标DNA区域；和
(e)分析扩增的目标cDNA区域和/或扩增的目标DNA区域。
10.根据权利要求9所述的方法，其另外包括：使来自步骤(d)的样品经历半巢式PCR，所述半巢式PCR使用步骤(c)中的所述反向引物或步骤(d)(i)中的所述正向引物，和在扩增的目标cDNA区域内部结合的巢式引物，或
使来自步骤(d)的样品经历巢式PCR，所述巢式PCR使用在扩增的目标DNA区域内部结合的巢式引物对；
其中，任选地，步骤(c)和(d)在同一个反应混合物中进行；
其中，任选地，步骤(e)中的分析包括分析扩增的目标cDNA的基因表达；并且
其中，任选地，步骤(e)中的分析包括分析扩增的目标cDNA的突变。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其中所述第一引物对或所述第二引物对选自由以下组成的组：(i)SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2；(ii)SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；(iii)SEQID NO:5和SEQ ID NO:6；(iv)SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8；(v)SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；(vi)SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12；(vii)SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14；(viii)SEQID NO:15和SEQ ID NO:16；(ix)SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18；(x)SEQ ID NO:19和SEQ IDNO:20；(xi)SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22；(xii)SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24；(xiii)SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26；(xiv)SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28；(xv)SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30；(xvi)SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32；(xvii)SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34；(xviii)SEQ ID NO:52和53；和(xix)SEQ ID NO:54和55；
其中，任选地，用于半巢式或巢式PCR的所述引物对选自由以下组成的组：(i)SEQ IDNO:35和SEQ ID NO:2；(ii)SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:36；(iii)SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:37；(iv)SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:8；(v)SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:10；(vi)SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:12；(vii)SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:14；(viii)SEQ ID NO:42和SEQ IDNO:16；(ix)SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:43；(x)SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:20；(xi)SEQ IDNO:45和SEQ ID NO:22；(xii)SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:24；(xiii)SEQ ID NO:25和SEQID NO:47；(xiv)SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:48；(xv)SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:30；(xvi)SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:50；(xvii)SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:34；(xviii)SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57；和(xix)SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:55。
12.一种用于根据权利要求3至11中任一项所述的方法中的试剂盒，所述试剂盒包括：
(a)根据权利要求1或2所述的设备。
13.根据权利要求12所述的试剂盒，其另外包括以下一种或多种：
(b)一种或多种细胞裂解缓冲液；
(c)选自由以下组成的组的引物：
i.根据权利要求9至11中任一项所述的方法的步骤(c)的所述反向引物
ii.根据权利要求9至11中任一项所述的方法的步骤(d)(i)的所述正向引物
iii.根据权利要求9至11中任一项所述的方法的步骤(d)(ii)的所述引物对
iv.根据权利要求9至11中任一项所述的方法的巢式引物和巢式引物对
(d)一种或多种试剂，选自由以下组成的组：
i.用于根据权利要求9至11中任一项所述的方法的步骤(c)中的反转录的反转录酶和一种或多种合适的反应缓冲液
ii.用于根据权利要求9至11中任一项所述的方法的步骤(d)中的扩增的DNA聚合酶和一种或多种合适的反应缓冲液或用于根据权利要求10或11所述的方法的半巢式或巢式PCR的DNA聚合酶和一种或多种合适的反应缓冲液，以及
iii.一种或多种经标记或未经标记的脱氧核糖核苷酸，所述脱氧核糖核苷酸选自由dATP、dCTP、dGTP和dTTP或dUTP组成的组；以及
(e)能够特异性结合到选自由PAI-1、波形蛋白、FOXC1、角蛋白-8、角蛋白-18、角蛋白-19、Ep-CAM、CD45、VWF、PECAM-1、CD146、CD41、CD34、PSMA、CD105、CD309、CD144、CD202B和血管生成素2组成的组的蛋白质的抗体，其中所述抗体偶合到可检测标记上；
和任选地，用于检测所述可检测标记的工具。
14.一种用于根据权利要求8至11中任一项所述的方法中的试剂盒，所述试剂盒包括以下一种或多种：
(a)一种或多种细胞裂解缓冲液；
(b)选自由以下组成的组的引物：
i.根据权利要求11所述的方法的步骤(b)的所述反向引物
ii.根据权利要求11所述的方法的步骤(c)(i)的所述正向引物
iii.根据权利要求11所述的方法的步骤(c)(ii)的引物对，以及
iv.根据权利要求11所述的方法的巢式引物和巢式引物对；
(c)一种或多种试剂，选自由以下组成的组：
i.用于根据权利要求9所述的方法的步骤(b)中的反转录的反转录酶和一种或多种合适的反应缓冲液，
ii.用于根据权利要求9所述的方法的步骤(d)中的扩增的DNA聚合酶和一种或多种合适的反应缓冲液或用于根据权利要求11所述的方法的半巢式或巢式PCR的DNA聚合酶和一种或多种合适的反应缓冲液，以及
iii.一种或多种经标记或未经标记的脱氧核糖核苷酸，所述脱氧核糖核苷酸选自由dATP、dCTP、dGTP和dTTP或dUTP组成的组；以及
(d)能够特异性结合到选自由PAI-1、波形蛋白、FOXC1、角蛋白-8、角蛋白-18、角蛋白-19、Ep-CAM、CD45、VWF、PECAM-1、CD146、CD41、CD34、PSMA、CD105、CD309、CD144、CD202B和血管生成素2组成的组的蛋白质的抗体，其中所述抗体偶合到可检测标记上；
和任选地，用于检测所述可检测标记的工具。
15.根据权利要求13或14所述的试剂盒，其中所述引物和/或试剂被预混合成适合于根据权利要求9至11任一项中的裂解、预扩增和扩增步骤的组合；并且
其中，任选地，所述引物被预混合成适合于分析基因表达谱或突变特征的组合。
16.根据权利要求12至14中任一项所述的试剂盒，其另外包括关于执行根据权利要求3至11中任一项所述的方法的说明书；并且
其中，任选地，所述试剂盒包括一个或多个容器，所述容器包含用于执行根据权利要求3至11中任一项所述的方法的一种或多种反应缓冲液。
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