JP6688774B2 - 抗菌性向上物質のスクリーニング方法 - Google Patents

Description

本発明は抗菌性物質と併用した場合にその抗菌性を向上させる物質をスクリーニングするための方法に関する。

近年、生活環境における様々な物質表面の殺菌及び防汚のために抗菌性物質を配合した洗浄剤が種々開発されている。例えば、ベンジルアルコール、ベンジルオキシエタノール等の芳香族アルコール、ベンズアルデヒド等の芳香族アルデヒド、アルキレングリコールアルキルエーテル等は抗菌性を有することから、抗菌性洗浄剤の溶剤として広く使用されている。

しかしながら、抗菌性物質を単独で用いた場合には十分な抗菌性が得られず、他の抗菌性助剤等を併用してその抗菌力を補う場合が多い。例えば、特許文献１には第４級アンモニウム塩と抗菌性有機溶剤を組み合わせた抗菌剤、特許文献２には高浸透圧を付与する溶質と多価アルコール系抗菌物質を併用することが開示されている。

特開２０１２−３６１７９号公報 特開２００９−１６１５１８号公報

本発明は、抗菌性物質と併用した場合に、その抗菌性を向上させる物質を効率良く選択することが可能な方法を提供することに関する。

本発明者らは、化学物質が微生物に接触した際の、微生物の表層における物理的、熱力学的な変化を検討したところ、抗菌性物質（ベンジルアルコール）と併用するとその抗菌力を向上させる物質である塩化ベンザルコニウムが、微生物最外層のリポ多糖（ＬＰＳ）を脱水和することにより、当該層の粘弾性を上昇させることを発見した。そして、更に検討した結果、その粘弾性の上昇は、リポ多糖が脱水和されてエントロピーが変化したことに起因することを見出し、特定の多糖類に対する脱水和能を指標とすることにより、抗菌性物質の抗菌性を向上させる物質をスクリーニングできることを明らかにした。

すなわち、本発明は、抗菌性物質と併用した場合に当該抗菌性物質の抗菌性を向上させる物質をスクリーニングする方法であって、リポ多糖、グルカン、ペプチドグリカン及びムコ多糖から選ばれる１種以上の多糖類に対する脱水和能を評価する工程を含む、前記スクリーニング方法に係るものである。

本発明の方法によれば、抗菌性物質と併用した場合に、当該抗菌性物質の抗菌力を向上し得る物質を、客観的且つ迅速に評価又は選択することができる。

抗菌性向上力とΔＳ（エントロピー変化）の相関を示すグラフ

本発明のスクリーニング方法は、特定の多糖類に対する脱水和能を評価することにより、抗菌性物質の抗菌性を向上させる物質をスクリーニングするものである。

本発明において、多糖類は、リポ多糖、グルカン、ペプチドグリカン及びムコ多糖から選ばれる１種以上である。斯かる多糖類としては、微生物表層に存在する多糖類であるのが好ましいが、それと同様の物理化学的性質を有する限り必ずしもそれに限定されるものではない。
ここで、リポ多糖（リポポリサッカライド）は、リピドＡと呼ばれる脂質に多分子の糖からなる糖鎖が結合した糖脂質であり、具体的には、リン酸基が結合したグルコサミン２分子がグリコシド結合したものに複合結合した脂肪酸鎖と５〜８炭糖が結合した構造体を指す。
ペプチドグリカンは、ペプチドと糖からなる高分子であり、好適にはＮ−アセチルグルコサミンとＮ−アセチルムラミン酸の交互の繰り返しを単位としてそれらがオリゴペプチドによって架橋された構造体を指す。
グルカンとしては、βグルカンが好ましく、β−１，３−グルカンがより好ましい。β−１，３−グルカンとしては、β−１，３−グルカンの他に、Ｄ−グルコースがβ−１，３結合で重合したものを主鎖とし、その６位にβ−１，６結合で１個のＤ−グルコースが導入された構造を有するβ−１，３−１，６−グルカン等が包含される。β−１，３−グルカンとしては、例えばカードラン、ザイモサン等が挙げられ、β−１，３−１，６−グルカンとしては、例えばラミナリンが挙げられる。
ムコ多糖としては、ポリ-β１−４−Ｎ−アセチルグルコサミン（キチン）及びポリ-β１，４-グルコサミン（キトサン）が好ましい。
斯かる多糖類は、これらの１種、又は２種以上を混合して用いることができる。

上記多糖類に対する脱水和能とは、当該多糖類における糖鎖の水和構造を不安定化させる能力を意味する。
ここで、多糖類の糖鎖の水和には、糖の水酸基と水分子の水素結合による水素結合性水和と、周囲の水分子同士の水素結合による疎水性水和があるが、本発明においては、それらの何れの水和構造を不安定化するものであってもよい。
「不安定化」とは、水素結合を不安定化することを意味し、水分子の分極率を変化させること等が挙げられるが、好適には、水分子の分極率を変化させることである。水分子の分極率を変化させることとは、具体的には、双極子-双極子相互作用、イオン-双極子相互作用を生じさせることが挙げられる。

後記試験例に示すとおり、抗菌性物質の抗菌性を向上する物質を微生物に作用させると、微生物表層の多糖層が脱水和され微生物表面の粘弾性が上昇する（試験例２）。また、微生物表層の多糖層の水和構造が破壊され、その規則性が崩壊すると、エントロピーが増大する（試験例３）。そして、微生物に脱水和能を有する物質を作用させ、これに抗菌性物質を添加した場合、多糖層との反応におけるエントロピー変化（ΔＳ）と、脱水和能を有する物質が溶剤の抗菌性を向上させ得る濃度の逆数の対数値には、正の相関が認められ、ΔＳが大きいほど、より低濃度で抗菌性を向上することが判明した（試験例４）。
したがって、特定の多糖類との反応によって生じるエントロピーの変化量を測定することによって、多糖類に対する脱水和能が評価でき、抗菌性物質の抗菌性を向上させ得る物質をスクリーニングすることができる。

本発明において、エントロピー変化量（ΔＳ）の算出方法は、例えば、等温滴定カロリメトリー（ＩＴＣ）による相互作用熱量解析が挙げられる。

本発明において、抗菌性物質としては、細菌や真菌等の微生物に対して抗菌作用を有する物質であれば特に制限はないが、好ましくは、トリクロサンやイソプロピルメチルフェノール（ＩＰＭＰ）などの殺菌剤、アンピシリン、クローラムフェニコールなどの抗生剤、パラベン類（パラオキシ安息香酸エステル及びこれらの塩：例えば、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン及びこれらの塩等）、安息香酸などの防腐剤、芳香族アルコール、芳香族アルデヒド、並びに下記式（１）又は（２）で表わされる抗菌性溶剤が挙げられる。

〔式中、Ｒは、炭素数５〜１０のアルキル基若しくはアルケニル基、又はベンジル基を示し、Ａは、炭素数１〜１０のアルキレン基を示し、ｎは０〜５の数を示し、ｎ個のＡは同一でも異なってもよい。〕

ここで、芳香族アルコールとしては、好ましくはベンジルアルコール、ベンジルオキシエタノール、フェノキシエタノール、１-フェノキシ-２-プロパノール、フェネチルアルコール、ベンジルグリコール等が挙げられ、このうちベンジルアルコール、ベンジルオキシエタノール、フェノキシエタノール、フェネチルアルコールがより好ましい。

芳香族アルデヒドとしては、好ましくはベンズアルデヒド、フェニルアセトアルデヒド、４−メチルベンズアルデヒド、２−フェニルプロピオンアルデヒド等が挙げられ、このうちベンズアルデヒド、フェニルアセトアルデヒドがより好ましい。

式（１）で示されるヒドロキシ化合物、式（２）で示されるアルデヒド化合物において、Ａで示される炭素数１〜１０のアルキレン基としては、炭素数２又は３のアルキレン基が好ましい。

Ｒで示される炭素数５〜１０のアルキル基又はアルケニル基としては、直鎖又は分岐鎖の何れでも良いが、炭素数５〜８のアルキル基が好ましく、例えばｎ−ブチル基、ｎ−ヘキシル基、２−エチルヘキシル基等が挙げられる。

ｎは０〜３の数であるが、１〜３が好ましく、１又は２が更に好ましい。
尚、ｎ個のＡは同一でも異なってもよい。

抗菌性溶剤の好適な具体例としては、例えばベンジルアルコール、エチレングリコールモノ−ｎ−ブチルエーテル、エチレングリコールモノヘキシルエーテル、２−（２−エチルヘキシルオキシ）エタノール、ジエチレングリコールモノ−ｎ−ブチルエ−テル、ジエチレングリコールモノヘキシルエーテル、２−［２−（２−エチルヘキシルオキシ）エトキシ］エタノール、２−ベンジルオキシエタノール、２−フェノキシエタノール、ベンズアルデヒド、フェニルアセトアルデヒド、４−メチルベンズアルデヒド、２−フェニルプロピオンアルデヒド、ヘキサナール、２-エチルブチルアルデヒド、ジエチレングリコールモノヘキシルエーテル、ペンタノール、１-フェノキシ-２-プロパノール等が挙げられる。

本発明のスクリーニング方法の具体的態様として、例えば、以下の（Ａ）〜（Ｃ）の工程が挙げられる。
（Ａ）ＩＴＣ装置を用いて、リポ多糖、グルカン、ペプチドグリカン及びムコ多糖から選ばれる１種以上の多糖類の溶液に、被験物質含有溶液を接触させる工程
（Ｂ）前記多糖類溶液に生じたエントロピー変化量（ΔＳ）を測定する工程
（Ｃ）ΔＳ＞０となる被験物質を、抗菌性物質と併用した場合にその抗菌性を向上させる物質として選択する工程

ここで、ＩＴＣ装置としては、滴下液のサンプルセルとリファレンスセル、滴定シリンジ、コンピュータ制御された電動ビュレット、断熱ジャケット（インナーシールド）、電力供給装置及び検出器を備えた装置、例えば、ＭｉｃｒｏＣａｌ社製のＶＰ−ＩＴＣ等が使用できる。
ＶＰ−ＩＴＣを用いる場合、多糖類溶液はセル側のサンプルとし、被験物質含有溶液を、シリンジ側のサンプルとするのが好ましい。

多糖類溶液及び被験物質含有溶液は、多糖類又は被験物質を、適当な緩衝液、例えばＰＢＳを用いて、０．１〜１０質量％に調製したものが使用される。

多糖類溶液と被験物質含有溶液との接触は、温度２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃、セル側の攪拌速度５００〜１５００ｒｐｍ、１回の滴下量５〜１５μＬ、滴下間隔３００〜５００秒、全滴下量を１５０〜３００μＬで行うことができる。例えば、測定温度３０℃、セル側の攪拌速度１０００ｒｐｍ、１回の滴下量１０μＬ、滴下間隔３００秒、全滴下量２００μＬの条件が挙げられる。

具体的な手順としては、例えば、ＰＢＳを用いて０．１質量％に調製した多糖類溶液をセルに、ＰＢＳを用いて１質量％に調製した被験物質含有溶液をシリンジ側に準備し、任意の一定温度に保たれたサンプルセル中にシリンジから１０μＬずつ３００秒間隔で計２０回滴下し、リファレンスセルとの温度差をゼロに制御するためにサンプルセルに供給される単位時間当たりのフィードバック電力（熱量）に対し、セルにＰＢＳを用いて同様の操作で得られる単位時間当たりのフィードバック電力（熱量）を引いて得られた熱量を算出する方法を採用することができる。
ここで、１滴下あたりの最大熱量の絶対値が１ｃａｌ／ｍｏｌ（４．１８Ｊ／ｍｏｌ）以下の場合を検出限界とする。
エントロピー変化（ΔＳ）の算出は、例えばＭｉｃｒｏＣａｌ，ＬＬＣ，ＩＴＣというソフトを用いて行うことができる。具体的には、例えば、ＩＴＣとサンプルセル中におけるリガンドとシリンジ中の標的分子の反応は１：１ではないことを考慮し、測定値を逐次反応モデルであるＳｅｑｕｅｎｔｉａｌ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅｓによってフィッティングしてそれぞれの反応のエンタルピー変化（ΔＨ）と結合定数（ＫＡ）を算出し、例えば一つ目の反応の値を用いることで、ΔＳ＝ΔＨ／Ｔ＋ＲｌｎＫＡという式に代入することでΔＳを算出する方法が挙げられる。ここで、Ｔは絶対温度、Ｒは気体定数を示す。１滴下あたりの最大熱量の絶対値が１ｃａｌ／ｍｏｌ（４．１８Ｊ／ｍｏｌ）以下、すなわち検出限界以下の場合には、ΔＳはｎｏｔ ｄｅｔｅｃｔｅｄ（ｎ．ｄ．）とする。

ΔＳが０以上となる被験物質は、系における規則性を崩壊することを意味しており、これは糖鎖の周りに規則性を持って並んだ水和構造を破壊すること、すなわち多糖類を脱水和することを示す。多糖類の脱水和は多糖構造の変化を引き起こすことから、抗菌性物質の抗菌性を向上させる物質となり得るが、好ましくは１０以上、より好ましくは２０以上である。

斯くして、ΔＳが０以上である物質を選択することにより、抗菌性物質の抗菌性を向上させる物質として選択することができる。
ΔＳが０以上となる物質としては、例えば、硫酸アンモニウム、硫酸カリウム、塩化ベンザルコニウム、ベンジルトリメチルアンモニウム塩、アミンオキサイド、アルキルグルコシト、メタノール、クエン酸２アンモニウム、クエン酸３アンモニウム、ラウリルトリメチルアンモニウム塩、ヨウ化カリウム、キシリトール、エリスリトール、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化リチウム、塩化セシウム、塩化アンモニウム、硝酸カリウム、酢酸カリウム、リジン、アルギニン等が挙げられ、これら自体に抗菌性があるか否かは問われない。

上述した実施形態に関し、本発明においては以下の態様が開示される。
＜１＞抗菌性物質と併用した場合に当該抗菌性物質の抗菌性を向上させる物質をスクリーニングする方法であって、リポ多糖、グルカン、ペプチドグリカン及びムコ多糖から選ばれる１種以上の多糖類に対する脱水和能を評価する工程を含む、前記スクリーニング方法。
＜２＞脱水和能が多糖類との反応におけるエントロピー変化量（ΔＳ）を測定することによって評価される、＜１＞のスクリーニング方法。
＜３＞多糖類が微生物表層由来の多糖である、＜１＞又は＜２＞のスクリーニング方法。＜４＞グルカンがβ−１，３−グルカンであり、ムコ多糖がポリ-β１−４−Ｎ−アセチルグルコサミンである、＜１＞〜＜３＞のいずれかのスクリーニング方法。
＜５＞β−１，３−グルカンがβ−１，３−１，６−グルカンである＜４＞のスクリーニング方法。
＜６＞β−１，３−グルカンがカードラン又はラミナリンである＜４＞のスクリーニング方法。
＜７＞抗菌性物質がトリクロサン及びイソプロピルメチルフェノールから選ばれる殺菌剤、アンピシリン、及びクローラムフェニコールから選ばれる抗生剤、パラベン類及び安息香酸から選ばれる防腐剤、芳香族アルコール、芳香族アルデヒド、並びに下記式（１）又は（２）：

〔式中、Ｒは、炭素数５〜１０のアルキル基若しくはアルケニル基、又はベンジル基を示し、Ａは、炭素数１〜１０のアルキレン基を示し、ｎは０〜５の数を示し、ｎ個のＡは同一でも異なってもよい。〕

で表わされる抗菌性溶剤から選ばれる１種以上である＜１＞〜＜５＞の何れかのスクリーニング方法。
＜８＞抗菌性物質がベンジルアルコール、フェノキシエタノール、ベンジルグリコール、フェニルエチルアルコール、ペンタノール及びメチルパラベンから選ばれる１種以上である＜６＞のスクリーニング方法。

試験例１ ２物質併用による抗菌性の向上
全ての試験液はＰＢＳで調製し、ｐＨが７．４になるよう塩酸もしくは水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを調整した。表１に示す抗菌性物質と添加剤を単独又は組み合わせた試験液２ｍＬにＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（Ｅ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９）の菌液（Ｏ．Ｄ．６００ｎｍ＝０．８）を２０μＬ添加してテストチューブミキサーにて攪拌した。尚、菌液の調製は下記の手順で行った。ＬＢ寒天培地（Ｌｕｒｉａ-Ｂｅｒｔａｎｉ ＡＧＡＲ ＞＞ＤＡＩＧＯ＜＜ 和光純薬工業製）を用いて３７℃で一夜培養し、培地上のＥ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９の菌体を一白金耳掻き取り、ＬＢ液体培地（Ｌｕｒｉａ-ＢｅｒｔａｎｉＢＲＯＴＨ ＞＞ＤＡＩＧＯ＜＜ 和光純薬工業製）に懸濁して３７℃で１日間振盪培養した。これを遠心分離（７０００ｇ×５ｍｉｎ．）して上清を除去した後、等量の生理食塩水で懸濁した。その後もう一度遠心分離し（７０００ｇ×５ｍｉｎ．）、生理食塩水で菌液を調製した。試験液と菌液の混合液を所定の時間往復振とう（１７０回／ｍｉｎ 振幅２５ｍｍ）させながら接触させた後、１００μＬを分取して９００μＬのＬＰ希釈液に懸濁することで試験液を不活化した。これをさらにＬＰ希釈液（ＬＰ希釈液「ダイゴ」（日本製薬（株）製）精製水１Ｌ当たり ポリペプトン １ｇ、レシチン ０．７ｇ、ポリソルベート８０ ２０ｇ、ｐＨ７．０〜７．４）製）にて希釈した後、前述の寒天培地に塗布して静置培養し、得られたコロニー数から生残菌数を求め、初発菌数の対数値と生残菌数の対数値の差をＬｏｇ減少菌数として算出し、これを抗菌活性値とした。初発菌数の測定には、試験液の代わりにＰＢＳで同様の操作を行った際に得られた生残菌数を用いた。なお、接触試験はガラス試験管内で行った。また、培養条件は３７℃で１日間とした。

ベンジルアルコール（ＢＡ）を単独で接触した場合にはＬｏｇ減少菌数（抗菌活性値）がほぼ０であったが、同条件（濃度、接触時間）であっても塩化ベンゼトニウム、塩化ベンジルトリブチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム（Ｃ８）、硫酸アンモニウム、塩化ベンジルトリメチルアンモニウムを添加すると抗菌性が向上した。尚、ＢＡと組み合わせて用いた各種剤に関しても、単独で接触した場合には抗菌活性値がほぼ０である条件（濃度、接触時間）で用いた場合であっても抗菌性が向上した。

試験例２ 抗菌性向上作用機構の解明
試験例１においてＢＡと組み合わせることで抗菌性が向上した物質の作用機構を解明するために、基板にＥ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を固定化し、抗菌性を向上させたＣ８塩化ベンザルコニウムを作用させた際の菌の粘弾性変化をＱＣＭ−Ｄ（Ｑｕａｒｔｚ Ｃｒｙｓｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂａｌａｎｃｅ ｗｉｔｈ Ｄｉｓｓｉｐａｔｉｏｎ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）を用いて解析した。尚、菌の固定は抗原抗体反応を用いた。金基板にカルボキシル基末端の自己組織化単分子膜を作成し、スクシンイミドエステル法によりストレプトアビジンを結合させた。さらにビオチン標識した抗Ｅ．ｃｏｌｉ抗体を反応させ、そこに菌を作用させることで金基板に菌を固定化した。

ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で調製したＣ８塩化ベンザルコニウムを添加すると、速やかに菌に蓄積した。また蓄積に伴ってまず物性が硬くなり、その後緩やかに軟らかくなった。またＢＡと組み合わせて作用させた場合にもＣ８塩化ベンザルコニウムによる一時的な物性の硬化が起こり、その後速やかに軟らかくなったことから、抗菌性を向上させる機構としてＣ８塩化ベンザルコニウムによる菌の硬化が重要であることが分かった。

試験例３ 菌表層のＬＰＳの脱水和
試験例２において菌の一時的な硬化が脱水和によるものだと考え、大腸菌をはじめとするグラム陰性細菌の最外層に存在するＬＰＳとの反応による熱量変化を測定した。ＰＢＳで１％となるよう調製したリポポリサッカライド（ＬＰＳ Ｅ． ｃｏｌｉ５５：Ｂ５由来 ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製）溶液をセル側のサンプルとした。一方ＰＢＳで１％となるよう調製した塩化ベンゼトニウム、Ｃ８塩化ベンザルコニウム、塩化ベンジルトリブチルアンモニウム、硫酸アンモニウムの溶液をシリンジ側のサンプルとし、セル側に滴下することによる熱量変化を調べた。エントロピー変化（ΔＳ）の算出には、ＭｉｃｒｏＣａｌ， ＬＬＣ， ＩＴＣというソフトを用いた。具体的な手順としては、測定値を逐次反応モデルであるＳｅｑｕｅｎｔｉａｌ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅｓによってフィッティングしてエンタルピー変化（ΔＨ）と結合定数（ＫＡ）を算出し、ΔＳ＝ΔＨ／Ｔ＋ＲｌｎＫＡという式に代入することでΔＳを算出した。測定器は、ＭｉｃｒｏＣａｌ社製のＶＰ−ＩＴＣを使用し、測定温度３０℃、セル側の攪拌速度１０００ｒｐｍ、１回の滴下量１０μＬ、滴下間隔３００秒、全滴下量は２００μＬとした。
その結果、Ｃ８塩化ベンザルコニウムに加え、試験例１において抗菌性向上効果を示した塩化ベンゼトニウム、ベンジルトリブチルアンモニウム塩、硫酸アンモニウム、ベンジルトリメチルアンモニウムはＬＰＳと反応させた際、脱水和を示唆する正のエントロピー変化が確認された。

試験例４ 抗菌性向上力とΔＳの相関
全ての試験液はＰＢＳで調製し、ｐＨが７．４になるよう塩酸もしくは水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを調整した。表４に示す添加剤を含む試験液２ｍＬに前述した方法と同じ方法で調製したＥ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９の菌液（Ｏ．Ｄ．６００ｎｍ＝０．８）を２０μＬ添加してテストチューブミキサーにて攪拌した。所定の時間往復振とう（１７０回／ｍｉｎ 振幅２５ｍｍ）させながら接触させた後、１００μＬを分取して９００μＬのＬＰ希釈液に懸濁することで試験液を不活化した。これをさらにＬＰ希釈液にて希釈した後、前述の寒天培地に塗布して静置培養し、得られたコロニー数から生残菌数を求め、初発菌数の対数値と生残菌数の対数値の差をＬｏｇ減少菌数として算出し、これを抗菌活性値とした。初発菌数の測定には、試験液の代わりにＰＢＳで同様の操作を行った際に得られた生残菌数を用いた。なお、接触試験はガラス試験管内で行った。また、培養条件は３７℃で１日間とした。種々の濃度で上記の抗菌性試験を実施し、１％のＢＡを５分間接触させた際の抗菌活性値が０から２まで上昇するために必要な濃度を測定した。

ＬＰＳとのΔＳと抗菌性を向上させるために必要な濃度の逆数の対数値に正の相関が得られ、ΔＳが大きいほどより低濃度で抗菌性を向上させることが示された（図１）。すなわち、ΔＳが大きい添加剤ほど抗菌性向上力が高いことが示された。

試験例５ 抗菌性向上力評価
全ての試験液はＰＢＳで調製し、ｐＨが７．４になるよう塩酸もしくは水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを調整した。表５に示す添加剤を含む試験液２ｍＬにＥ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９及び、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＮＢＲＣ１３２７５（Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＮＢＲＣ１３２７６（Ｓ． ａｕｒｅｕｓ）の菌液（いずれもＮＢＲＣ（独立行政法人製品評価技術基盤機構 生物遺伝資源部門）から購入）、Ｐｈｏｍａ ｓｐ． Ａ−ＢＴ（環境分離株）、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｐ． ＰＡ−４（環境分離株）の胞子液を２０μＬ添加してテストチューブミキサーにて攪拌した。尚、菌液の調製は前述の方法で行ったが、Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ及びＳ． ａｕｒｅｕｓの培養にはＳｏｙｂｅａｎ Ｃａｓｅｉｎ Ｄｉｇｅｓｔ（ＳＣＤ）寒天培地（和光純薬工業）及びＳＣＤ培地（和光純薬工業）を使用した。また胞子液の調製は、２５℃で１週間培養したＰｏｔａｔｏ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ Ａｇａｒ（ＰＤＡ Ｄｉｆｃｏ）平板上の供試菌株に対して０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を滴下し、軽く揺することで回収した。試験液と菌液又は胞子液を所定の時間往復振とう（１７０回／ｍｉｎ 振幅２５ｍｍ）させながら接触させた後、１００μＬを分取して９００μＬのＬＰ希釈液に懸濁することで試験液を不活化した。これをさらにＬＰ希釈液にて希釈した後、前述の寒天培地に塗布して静置培養し、得られたコロニー数から生残菌数を求め、初発菌数の対数値と生残菌数の対数値の差をＬｏｇ減少菌数として算出し、これを抗菌活性値とした。初発菌数の測定には、試験液の代わりにＰＢＳで同様の操作を行った際に得られた生残菌数を用いた。なお、接触試験はガラス試験管内で行った。また、培養条件はＰ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ及びＳ． ａｕｒｅｕｓは３０℃で１日間、Ｐｈｏｍａ ｓｐ．及びＣｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｐ．は２５℃でそれぞれ２日間、３日間とした。前述までに抗菌性向上力とΔＳの相関が確認された添加剤に関して、大腸菌以外の菌種、またＢＡ以外の抗菌性物質に対して抗菌性試験を実施し、抗菌性向上効果が認められるか測定した。
大腸菌以外の菌種やＢＡ以外の抗菌性物質に対してもΔＳが正となる添加剤は抗菌性向上効果を示すことが明らかとなり、本スクリーニング手法は種々の菌、種々の抗菌性物質に適用できることが示された。

試験例６ カビ表層の多糖層の脱水和
試験例５においてカビに対してもＬＰＳを脱水和する添加剤が抗菌性向上効果を発揮したが、これはカビ表層に存在する多糖層が脱水和したことによるものだと考え、カビの表層を構成するβ-1,3-,1,6-グルカンのモデル物質としてラミナリンと添加剤との反応による熱量変化を測定した。ＰＢＳで１％となるよう調製したラミナリン溶液をセル側のサンプルとした。一方ＰＢＳで１％となるよう調製した硫酸アンモニウムの溶液をシリンジ側のサンプルとし、セル側に滴下することによる熱量変化を調べた。エントロピー変化（ΔＳ）の算出には、ＭｉｃｒｏＣａｌ， ＬＬＣ， ＩＴＣというソフトを用い、前述の方法で算出した。測定器は、ＭｉｃｒｏＣａｌ社製のＶＰ−ＩＴＣを使用し、測定温度３０℃、セル側の攪拌速度１０００ｒｐｍ、１回の滴下量１０μＬ、滴下間隔３００秒、全滴下量は２００μＬとした。
その結果、ＬＰＳと同様にラミナリンと硫酸アンモニウムを反応させた際にも、脱水和を示唆する正のエントロピー変化が確認された。

実施例１ ΔＳ＞０を指標とした抗菌性向上物質のスクリーニング
ＰＢＳで１％となるよう調製したリポポリサッカライド（ＬＰＳ Ｅ． ｃｏｌｉ５５：Ｂ５由来 ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製）溶液をセル側のサンプルとした。一方ＰＢＳで１％となるよう調製した表５に示す被検物質の溶液をシリンジ側のサンプルとし、セル側に滴下することによる熱量変化を調べた。測定器は、ＭｉｃｒｏＣａｌ社製のＶＰ−ＩＴＣを使用し、測定温度３０℃、セル側の攪拌速度１０００ｒｐｍ、１回の滴下量１０μＬ、滴下間隔３００秒、全滴下量は２００μＬとした。

アルキルグルコシド、Ｃ１２塩化ベンザルコニウム、オクチルジメチルアミンオキサイド、硫酸カリウム、メタノール、及び塩化ベンジルトリメチルアンモニウムは、何れもΔＳ＞０となった。

次に上記５物質の抗菌性向上力を評価した。全ての試験液はＰＢＳで調製し、ｐＨが７．４になるよう塩酸もしくは水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを調整した。表６に示す抗菌性物質及び添加剤を含む試験液２ｍＬにＥ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９の菌液（Ｏ．Ｄ．６００ｎｍ＝０．８）を２０μＬ添加してテストチューブミキサーにて攪拌した。所定の時間往復振とう（１７０回／ｍｉｎ 振幅２５ｍｍ）させながら接触させた後、１００μＬを分取して９００μＬのＬＰ希釈液に懸濁することで試験液を不活化した。これをさらにＬＰ希釈液にて希釈した後、前述の寒天培地に塗布して静置培養し、得られたコロニー数から生残菌数を求め、初発菌数の対数値と生残菌数の対数値の差をＬｏｇ減少菌数として算出し、これを抗菌活性値とした。なお、接触試験はガラス試験管内で行った。また、培養条件は３７℃で１日間とした。

ΔＳ＞０であった物質はＢＡの抗菌性を向上させた。
以上より、ΔＳ＞０を指標として抗菌性を向上させる物質をスクリーニングすることができた。

Claims (3)

1. リポポリサッカライドとの反応におけるエントロピー変化量（ΔＳ）が＞０となる物質を、微生物に対して抗菌作用を有する抗菌性物質と併用する当該抗菌性物質の抗菌性の向上方法であって、微生物がカビを含み、抗菌性物質がベンジルアルコール、フェノキシエタノール及びフェネチルアルコールから選ばれる１種以上の芳香族アルコールを含み、エントロピー変化量（ΔＳ）が＞０となる物質が、硫酸アンモニウム、硫酸カリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化リチウム、塩化セシウム及び塩化アンモニウムから選ばれる１種以上である、方法。
2. カビが、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ属又はＰｈｏｍａ属を含む、請求項１記載の抗菌性の向上方法。
3. 抗菌性物質がベンジルアルコールである、請求項１又は２記載の抗菌性の向上方法。