JP6665414B2 - Method of storing Fc binding protein - Google Patents
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Description
本発明は、Ｆｃ結合性タンパク質を水溶液中で長期間保存可能な方法に関する。特に本発明はヒトＦｃγＲＩＩＩａ由来のＦｃ結合性タンパク質を水溶液中で長期間保存可能な方法に関する。 The present invention relates to a method for storing an Fc-binding protein in an aqueous solution for a long period of time. In particular, the present invention relates to a method capable of storing an Fc-binding protein derived from human FcγRIIIa in an aqueous solution for a long period of time.
Ｆｃレセプターは、免疫グロブリン分子のＦｃ領域に結合する一群の分子である。Ｆｃレセプターはその結合する免疫グロブリンの種類によって分類されており、ＩｇＧのＦｃ領域に結合するＦｃγレセプター、ＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεレセプター、ＩｇＡのＦｃ領域に結合するＦｃαレセプター等がある（非特許文献１）。また、各レセプターは、その構造の違いによりさらに細かく分類され、Ｆｃγレセプターの場合、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩｂの存在が報告されている（非特許文献１）。 Fc receptors are a group of molecules that bind to the Fc region of an immunoglobulin molecule. Fc receptors are classified according to the type of immunoglobulin to which they bind, and include Fcγ receptors that bind to the Fc region of IgG, Fcε receptors that bind to the Fc region of IgE, and Fcα receptors that bind to the Fc region of IgA (non- Patent Document 1). Further, each receptor is further classified finely according to the difference in its structure. In the case of Fcγ receptor, the presence of FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa, and FcγRIIIb has been reported (Non-patent Document 1).
Ｆｃγレセプターの中でも、ＦｃγＲＩＩＩａはナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）やマクロファージなどの細胞表面に存在しており、ヒト免疫機構の中でも重要なＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）活性に関与している重要なレセプターである。このＦｃγＲＩＩＩａとヒトＩｇＧとの親和性は結合の強さを示す結合定数（ＫＡ）が１０７Ｍ−１以下であることが報告されている（非特許文献２）。ヒトＦｃγＲＩＩＩａのアミノ酸配列（配列番号１）はＵｎｉＰｒｏｔ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：Ｐ０８６３７）などの公的データベースに公表されている。また、ヒトＦｃγＲＩＩＩａの構造上の機能ドメイン、細胞膜を貫通するためのシグナルペプチド配列、細胞膜貫通領域の位置についても同様に公表されている。図１にヒトＦｃγＲＩＩＩａの構造略図を示す。なお、図１中の番号はアミノ酸番号を示しており、その番号は配列番号１に記載のアミノ酸番号に対応する。すなわち、配列番号１中の１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から１６番目のアラニン（Ａｌａ）までがシグナル配列（Ｓ）、１７番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までが細胞外領域（ＥＣ）、２０９番目のバリン（Ｖａｌ）から２２９番目のバリン（Ｖａｌ）までが細胞膜貫通領域（ＴＭ）および２３０番目のリジン（Ｌｙｓ）から２５４番目のリジン（Ｌｙｓ）までが細胞内領域（Ｃ）とされている。なおＦｃγＲＩＩＩａはＩｇＧ１からＩｇＧ４まであるヒトＩｇＧサブクラスのうち、特にＩｇＧ１とＩｇＧ３に対し強く結合する一方、ＩｇＧ２とＩｇＧ４に対する結合は弱いことが知られている。 Among the Fcγ receptors, FcγRIIIa is present on cell surfaces such as natural killer cells (NK cells) and macrophages, and is an important receptor involved in ADCC (antibody-dependent cytotoxicity) activity which is important in the human immune system. It is. It has been reported that the affinity between FcγRIIIa and human IgG has a binding constant (KA) indicating the strength of binding of 10 7 M −1 or less (Non-Patent Document 2). The amino acid sequence of human FcγRIIIa (SEQ ID NO: 1) has been published in public databases such as UniProt (Accession number: P08637). Similarly, the functional domain on the structure of human FcγRIIIa, the signal peptide sequence for penetrating the cell membrane, and the location of the cell membrane transmembrane region have been published. FIG. 1 shows a schematic diagram of the structure of human FcγRIIIa. The numbers in FIG. 1 indicate amino acid numbers, and the numbers correspond to the amino acid numbers described in SEQ ID NO: 1. That is, the signal sequence (S) is from the 1st methionine (Met) to the 16th alanine (Ala) in SEQ ID NO: 1, and the extracellular region is from the 17th glycine (Gly) to the 208th glutamine (Gln). (EC), the 209th valine (Val) to the 229th valine (Val) have a transmembrane region (TM) and the 230th lysine (Lys) to the 254th lysine (Lys) have an intracellular region (C). ). It is known that FcγRIIIa strongly binds to IgG1 and IgG3 among human IgG subclasses from IgG1 to IgG4, but weakly binds to IgG2 and IgG4.
遺伝子組換え技術を利用したＦｃレセプター（Ｆｃ結合性タンパク質）の発現に関しては、これまで、大腸菌（特許文献１）、動物細胞（非特許文献３）、バチルス属細菌（特許文献２）、酵母（特許文献３）、麹菌（特許文献４）を宿主とした発現が報告されている。中でも大腸菌を宿主として用いた系では、高密度培養によるＦｃレセプター（Ｆｃ結合性タンパク質）の製造法（特許文献５）、疎水クロマトグラフィー（特許文献６）や陽イオン交換クロマトグラフィーを用いたＦｃレセプター（Ｆｃ結合性タンパク質）の精製法も報告されている。さらにはＦｃレセプター構造遺伝子の改変によりＦｃレセプター（Ｆｃ結合性タンパク質）の安定化や生産性が向上する（特許文献７）など、Ｆｃレセプターの産業利用への関心が高まっている。 Regarding the expression of Fc receptor (Fc binding protein) using gene recombination technology, Escherichia coli (Patent Document 1), animal cells (Non-patent Document 3), Bacillus bacteria (Patent Document 2), yeast ( Patent Literature 3) and expression using Aspergillus oryzae (Patent Literature 4) as hosts have been reported. In particular, in a system using Escherichia coli as a host, a method for producing an Fc receptor (Fc-binding protein) by high-density culture (Patent Document 5), an Fc receptor using hydrophobic chromatography (Patent Document 6) or cation exchange chromatography A method for purifying (Fc-binding protein) has also been reported. Furthermore, the Fc receptor (Fc binding protein) is stabilized and the productivity is improved by modifying the Fc receptor structural gene (Patent Document 7), and interest in industrial use of the Fc receptor is increasing.
一方でＦｃレセプターは精製後に溶液状態で保存すると凝集しやすいことが問題となっており、産業利用において重大な欠点となっていた。すなわち、精製したＦｃレセプターを使用するまでの間放置しておくと、凝集し析出する問題があった。さらに凝集したＦｃレセプターをそのまま放置しておくと変性し再溶解できなくなる問題もあった。 On the other hand, when the Fc receptor is stored in a solution state after purification, there is a problem that the Fc receptor is easily aggregated, which has been a serious drawback in industrial use. That is, if the purified Fc receptor is allowed to stand until it is used, there is a problem that the Fc receptor aggregates and precipitates. Furthermore, if the aggregated Fc receptor is left as it is, it is denatured and cannot be redissolved.
タンパク質の保存方法としては、特定の抗体を安定に保存する緩衝液（特許文献８）や保存方法（特許文献９）が知られている。しかしながら前述した方法は、タンパク質としての性質の異なるＦｃ結合性タンパク質には適用できなかった。そのためＦｃレセプターを安定に保存できる方法の開発が求められていた。 As a method for storing a protein, a buffer solution for stably storing a specific antibody (Patent Document 8) and a storing method (Patent Document 9) are known. However, the method described above could not be applied to Fc-binding proteins having different protein properties. Therefore, development of a method that can stably store the Fc receptor has been demanded.
本発明の目的は、Ｆｃレセプター（Ｆｃ結合性タンパク質）を凝集させずに長期間安定的に保存可能な溶液、およびＦｃレセプターを凝集させずに長期間安定的に保存する方法を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a solution that can be stably stored for a long time without aggregating Fc receptor (Fc binding protein), and a method for stably storing the Fc receptor for a long time without aggregating the Fc receptor. is there.
前記課題を解決するために鋭意検討した結果、水溶液中のＦｃレセプター（Ｆｃ結合性タンパク質）を安定に保存できるｐＨを見出し、本発明の完成に至った。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found a pH at which an Fc receptor (Fc binding protein) in an aqueous solution can be stably stored, and have completed the present invention.
すなわち本発明は、以下の態様を包含する：
（Ａ）Ｆｃ結合性タンパク質を含む水溶液であって、前記水溶液のｐＨが７．０から９．０である、前記水溶液。
That is, the present invention includes the following embodiments:
(A) An aqueous solution containing an Fc-binding protein, wherein the pH of the aqueous solution is 7.0 to 9.0.
（Ｂ）さらに０．５ｍｏｌ／Ｌ以上の塩化ナトリウムを含む、（Ａ）に記載の水溶液。 (B) The aqueous solution according to (A), further containing 0.5 mol / L or more of sodium chloride.
（Ｃ）Ｆｃ結合性タンパク質が、
配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含むタンパク質、または
配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含み、かつ前記アミノ酸残基のうちの一つ以上が他のアミノ酸残基に置換、挿入または欠失したタンパク質である、
（Ａ）または（Ｂ）に記載の水溶液。
(C) The Fc binding protein is
A protein comprising amino acid residues from at least the 17th glycine to the 192nd glutamine in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, or at least the 17th glycine to the 192nd glutamine of the amino acid sequence of the SEQ ID NO: 1 Up to and including one or more of the amino acid residues is a protein substituted with another amino acid residue, inserted or deleted,
The aqueous solution according to (A) or (B).
（Ｄ）Ｆｃ結合性タンパク質をｐＨ７．０から９．０の水溶液中で保存する、Ｆｃ結合性タンパク質の保存方法。 (D) A method for storing an Fc-binding protein, wherein the Fc-binding protein is stored in an aqueous solution having a pH of 7.0 to 9.0.
（Ｅ）Ｆｃ結合性タンパク質を、０．５ｍｏｌ／Ｌ以上の塩化ナトリウムを含むｐＨ７．０から９．０の水溶液中で保存する、Ｆｃ結合性タンパク質の保存方法。 (E) A method for storing an Fc-binding protein, wherein the Fc-binding protein is stored in an aqueous solution containing 0.5 mol / L or more of sodium chloride at a pH of 7.0 to 9.0.
（Ｆ）Ｆｃ結合性タンパク質が、
配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含むタンパク質、または
配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含み、かつ前記アミノ酸残基のうちの一つ以上が他のアミノ酸残基に置換、挿入または欠失したタンパク質である、
（Ｄ）または（Ｅ）に記載の保存方法。
(F) the Fc binding protein is
A protein comprising amino acid residues from at least the 17th glycine to the 192nd glutamine in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, or at least the 17th glycine to the 192nd glutamine of the amino acid sequence of the SEQ ID NO: 1 Up to and including one or more of the amino acid residues is a protein substituted with another amino acid residue, inserted or deleted,
The storage method according to (D) or (E).
以下、本発明を詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
本発明においてＦｃ結合性タンパク質とは、ヒトＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域（具体的には天然型ヒトＦｃγＲＩＩＩａの場合、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでの領域）（図１）を構成するタンパク質があげられる。なお必ずしもヒトＦｃγＲＩＩＩａ細胞外領域の全領域でなくてもよく、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ細胞外領域を構成するタンパク質（ポリペプチド）のうち、少なくとも抗体（免疫グロブリン）のＦｃ領域に結合する本来の機能を発現し得る領域のポリペプチドを含んでいればよい。本明細書におけるヒトＦｃ結合性タンパク質の一例として、
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含むタンパク質や、
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含み、かつ前記アミノ酸残基のうちの一つ以上が他のアミノ酸残基に置換、挿入または欠失したタンパク質、
があげられる。
In the present invention, the Fc-binding protein is an extracellular region of human FcγRIIIa (specifically, in the case of natural human FcγRIIIa, a region from glycine at
(I) a protein comprising amino acid residues from at least the 17th glycine to the 192nd glutamine in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1,
(Ii) including at least the amino acid residues from glycine at
Is raised.
前記（ｉｉ）の具体例としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において以下の（１）から（４０）のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が生じている、Ｆｃ結合性タンパク質（特願２０１４−１６６８８３号）があげられる。
（１）配列番号１の１８番目のメチオニンがアルギニンに置換
（２）配列番号１の２７番目のバリンがグルタミン酸に置換
（３）配列番号１の２９番目のフェニルアラニンがロイシンまたはセリンに置換
（４）配列番号１の３０番目のロイシンがグルタミンに置換
（５）配列番号１の３５番目のチロシンがアスパラギン酸、グリシン、リジン、ロイシン、アスパラギン、プロリン、セリン、スレオニン、ヒスチジンのいずれかに置換
（６）配列番号１の４６番目のリジンがイソロイシンまたはスレオニンに置換
（７）配列番号１の４８番目のグルタミンがヒスチジンまたはロイシンに置換
（８）配列番号１の５０番目のアラニンがヒスチジンに置換
（９）配列番号１の５１番目のチロシンがアスパラギン酸またはヒスチジンに置換
（１０）配列番号１の５４番目のグルタミン酸がアスパラギン酸またはグリシンに置換
（１１）配列番号１の５６番目のアスパラギンがスレオニンに置換
（１２）配列番号１の５９番目のグルタミンがアルギニンに置換
（１３）配列番号１の６１番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（１４）配列番号１の６４番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換
（１５）配列番号１の６５番目のセリンがアルギニンに置換
（１６）配列番号１の７１番目のアラニンがアスパラギン酸に置換
（１７）配列番号１の７５番目のフェニルアラニンがロイシン、セリン、チロシンのいずれかに置換
（１８）配列番号１の７７番目のアスパラギン酸がアスパラギンに置換
（１９）配列番号１の７８番目のアラニンがセリンに置換
（２０）配列番号１の８２番目のアスパラギン酸がグルタミン酸またはバリンに置換
（２１）配列番号１の９０番目のグルタミンがアルギニンに置換
（２２）配列番号１の９２番目のアスパラギンがセリンに置換
（２３）配列番号１の９３番目のロイシンがアルギニンまたはメチオニンに置換
（２４）配列番号１の９５番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（２５）配列番号１の１１０番目のロイシンがグルタミンに置換
（２６）配列番号１の１１５番目のアルギニンがグルタミンに置換
（２７）配列番号１の１１６番目のトリプトファンがロイシンに置換
（２８）配列番号１の１１８番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（２９）配列番号１の１１９番目のリジンがグルタミン酸に置換
（３０）配列番号１の１２０番目のグルタミン酸がバリンに置換
（３１）配列番号１の１２１番目のグルタミン酸がアスパラギン酸またはグリシンに置換
（３２）配列番号１の１５１番目のフェニルアラニンがセリンまたはチロシンに置換
（３３）配列番号１の１５５番目のセリンがスレオニンに置換
（３４）配列番号１の１６３番目のスレオニンがセリンに置換
（３５）配列番号１の１６７番目のセリンがグリシンに置換
（３６）配列番号１の１６９番目のセリンがグリシンに置換
（３７）配列番号１の１７１番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（３８）配列番号１の１８０番目のアスパラギンがリジン、セリン、イソロイシンのいずれかに置換
（３９）配列番号１の１８５番目のスレオニンがセリンに置換
（４０）配列番号１の１９２番目のグルタミンがリジンに置換
また前記（ｉｉ）の別の具体例としては、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において以下の（４１）から（１１１）のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が生じている、Ｆｃ結合性タンパク質があげられ、さらに具体的な例として配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基を含むＦｃ結合性タンパク質があげられる（特願２０１５−０４７４６２号）。
（４１）配列番号２の４５番目のフェニルアラニンがイソロイシンまたはロイシンに置換
（４２）配列番号２の５５番目のグルタミン酸がグリシンに置換
（４３）配列番号２の６４番目のグルタミンがアルギニンに置換
（４４）配列番号２の６７番目のチロシンがセリンに置換
（４５）配列番号２の７７番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（４６）配列番号２の９３番目のアスパラギン酸がグリシンに置換
（４７）配列番号２の９８番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換
（４８）配列番号２の１０６番目のグルタミンがアルギニンに置換
（４９）配列番号２の１２８番目のグルタミンがロイシンに置換
（５０）配列番号２の１３３番目のバリンがグルタミン酸に置換
（５１）配列番号２の１３５番目のリジンがアスパラギンまたはグルタミン酸に置換
（５２）配列番号２の１５６番目のスレオニンがイソロイシンに置換
（５３）配列番号２の１５８番目のロイシンがグルタミンに置換
（５４）配列番号２の１８７番目のフェニルアラニンがセリンに置換
（５５）配列番号２の１９１番目のロイシンがアルギニンに置換
（５６）配列番号２の１９６番目のアスパラギンがセリンに置換
（５７）配列番号２の２０４番目のイソロイシンがバリンに置換
（５８）配列番号２の３４番目のメチオニンがイソロイシン、リジン、スレオニンのいずれかに置換
（５９）配列番号２の３７番目のグルタミン酸がグリシンまたはリジンに置換
（６０）配列番号２の３９番目のロイシンがメチオニンまたはアルギニンに置換
（６１）配列番号２の４９番目のグルタミンがプロリンに置換
（６２）配列番号２の６２番目のリジンがイソロイシンまたはグルタミン酸に置換
（６３）配列番号２の６４番目のグルタミンがトリプトファンに置換
（６４）配列番号２の６７番目のチロシンがヒスチジンまたはアスパラギンに置換
（６５）配列番号２の７０番目のグルタミン酸がグリシンまたはアスパラギン酸に置換
（６６）配列番号２の７２番目のアスパラギンがセリンまたはイソロイシンに置換
（６７）配列番号２の７７番目のフェニルアラニンがロイシンに置換
（６８）配列番号２の８０番目のグルタミン酸がグリシンに置換
（６９）配列番号２の８１番目のセリンがアルギニンに置換
（７０）配列番号２の８３番目のイソロイシンがロイシンに置換
（７１）配列番号２の８４番目のセリンがプロリンに置換
（７２）配列番号２の８５番目のセリンがアスパラギンに置換
（７３）配列番号２の８７番目のアラニンがスレオニンに置換
（７４）配列番号２の９０番目のチロシンがフェニルアラニンに置換
（７５）配列番号２の９１番目のフェニルアラニンがアルギニンに置換
（７６）配列番号２の９３番目のアスパラギン酸がバリンまたはグルタミン酸に置換
（７７）配列番号２の９４番目のアラニンがグルタミン酸に置換
（７８）配列番号２の９７番目のバリンがメチオニンとグルタミン酸に置換
（７９）配列番号２の９８番目のアスパラギン酸がアラニンに置換
（８０）配列番号２の１０２番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換
（８１）配列番号２の１０６番目のグルタミンがロイシンに置換
（８２）配列番号２の１０９番目のロイシンがグルタミンに置換
（８３）配列番号２の１１７番目のグルタミンがロイシンに置換
（８４）配列番号２の１１９番目のグルタミン酸がバリンに置換
（８５）配列番号２の１２１番目のヒスチジンがアルギニンに置換
（８６）配列番号２の１３０番目のプロリンがロイシンに置換
（８７）配列番号２の１３５番目のリジンがチロシンに置換
（８８）配列番号２の１３６番目のグルタミン酸がバリンに置換
（８９）配列番号２の１４１番目のヒスチジンがグルタミンに置換
（９０）配列番号２の１４６番目のセリンがスレオニンに置換
（９１）配列番号２の１５４番目のリジンがアルギニンに置換
（９２）配列番号２の１５９番目のグルタミンがヒスチジンに置換
（９３）配列番号２の１６３番目のグリシンがバリンに置換
（９４）配列番号２の１６５番目のリジンがメチオニンに置換
（９５）配列番号２の１６７番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（９６）配列番号２の１６９番目のヒスチジンがチロシンに置換
（９７）配列番号２の１７４番目のチロシンがフェニルアラニンに置換
（９８）配列番号２の１７７番目のリジンがアルギニンに置換
（９９）配列番号２の１８５番目のセリンがグリシンに置換
（１００）配列番号２の１９４番目のセリンがアルギニンに置換
（１０１）配列番号２の１９６番目のアスパラギンがリジンに置換
（１０２）配列番号２の２０１番目のスレオニンがアラニンに置換
（１０３）配列番号２の２０３番目のアスパラギンがイソロイシンまたはリジンに置換
（１０４）配列番号２の２０７番目のスレオニンがアラニンに置換
（１０５）配列番号２の９４番目のアラニンがセリンに置換
（１０６）配列番号２の９８番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換
（１０７）配列番号２の１１７番目のグルタミンがアルギニンに置換
（１０８）配列番号２の１５６番目のスレオニンがイソロイシンに置換
（１０９）配列番号２の１７４番目のチロシンがヒスチジンに置換
（１１０）配列番号２の１８１番目のリジンがグルタミン酸に置換
（１１１）配列番号２の２０３番目のアスパラギンがアスパラギン酸またはチロシンに置換
また前記（ｉｉ）のさらに別の具体例としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において以下の（１１２）から（１１５）に示す天然に生じるアミノ酸置換のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が生じている、Ｆｃ結合性タンパク質があげられる。
（１１２）配列番号１の６６番目のロイシンがヒスチジンまたはアルギニンに置換
（１１３）配列番号１の１４７番目のグリシンがアスパラギン酸に置換
（１１４）配列番号１の１５８番目のチロシンがヒスチジンに置換
（１１５）配列番号１の１７６番目のバリンがフェニルアラニンに置換
本発明はＦｃ結合性タンパク質を含む水溶液を保存する際、当該水溶液のｐＨを７．０から９．０の範囲とすることを特徴としている。好ましくは、前記ｐＨの範囲で緩衝能を有する緩衝液成分を含むとよく、一例として、リン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＴＥＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＤＩＰＳＯ緩衝液、ＴＡＳＰＯ緩衝液、ＰＯＰＳＯ緩衝液、ＥＰＰＳ緩衝液、Ｔｒｉｃｉｎｅ緩衝液、Ｂｉｃｉｎｅ緩衝液、ＴＡＰＳ緩衝液があげられる。なお、Ｆｃ結合性タンパク質を含む水溶液に０．５ｍｏｌ／Ｌ以上の塩化ナトリウムをさらに含ませると、保存中に発生するＦｃ結合性タンパク質の凝集をさらに抑えることができるため、より好ましい。本発明のＦｃ結合性タンパク質を含む水溶液の調製法に特に限定はなく、例えば、透析による方法や、限外ろ過による方法や、硫安などの塩またはアセトン、エタノール等の水と任意の容量比で混和する有機溶媒を加えて沈殿物として回収する方法を用いて、Ｆｃ結合性タンパク質水溶液（またはＦｃ結合性タンパク質そのもの）を調製した後、ｐＨが７．０から９．０の緩衝液に再溶解させればよい。中でも処理の簡便性から、透析や限外ろ過による方法が工業的には好ましく用いられる。塩化ナトリウムの添加は、前述した方法で得られたｐＨが７．０から９．０の水溶液に、必要量の塩化ナトリウムを添加すればよい。
As a specific example of the above (ii), the amino acid sequence containing the 17th to 192nd amino acid residues in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and the following (1) And Fc-binding protein (Japanese Patent Application No. 2014-166883) in which at least one amino acid substitution of (40) has occurred.
(1) Substitution of methionine at position 18 of SEQ ID NO: 1 with arginine (2) Substitution of valine at position 27 of SEQ ID NO: 1 with glutamic acid (3) Substitution of phenylalanine at position 29 of SEQ ID NO: 1 with leucine or serine (4) Leucine at
(41) Substitution of phenylalanine at position 45 of SEQ ID NO: 2 with isoleucine or leucine (42) Substitution of glutamic acid at position 55 of SEQ ID NO: 2 with glycine (43) Substitution of glutamine at position 64 of SEQ ID NO: 2 with arginine (44) Tyrosine at position 67 in SEQ ID NO: 2 is substituted with serine (45) Phenylalanine at position 77 in SEQ ID NO: 2 is substituted with tyrosine (46) Aspartic acid at position 93 in SEQ ID NO: 2 is substituted with glycine (47) The aspartic acid at position 98 is replaced with glutamic acid (48) The glutamine at position 106 in SEQ ID NO: 2 is replaced with arginine (49) The glutamine at position 128 in SEQ ID NO: 2 is replaced with leucine (50) The valine at position 133 in SEQ ID NO: 2 Is replaced with glutamic acid. (51) The lysine at position 135 in SEQ ID NO: 2 is asparagine or Substitution with glutamic acid (52) Threonine at position 156 of SEQ ID NO: 2 is substituted with isoleucine (53) Leucine at position 158 of SEQ ID NO: 2 is substituted with glutamine (54) Phenylalanine at position 187 of SEQ ID NO: 2 is substituted with serine (55 ) Leucine at position 191 of SEQ ID NO: 2 is substituted with arginine (56) Asparagine at position 196 of SEQ ID NO: 2 is substituted with serine (57) Isoleucine at position 204 of SEQ ID NO: 2 is substituted with valine (58) Substitution of methionine at position 34 with any of isoleucine, lysine, or threonine (59) Substitution of glutamic acid at position 37 of SEQ ID NO: 2 with glycine or lysine (60) Substitution of leucine at position 39 of SEQ ID NO: 2 with methionine or arginine ( 61) substitution of glutamine at position 49 of SEQ ID NO: 2 with proline ( 2) The lysine at position 62 of SEQ ID NO: 2 is substituted with isoleucine or glutamic acid (63) The glutamine at position 64 of SEQ ID NO: 2 is substituted with tryptophan (64) The tyrosine at position 67 of SEQ ID NO: 2 is substituted with histidine or asparagine (65 ) Glutamic acid at position 70 of SEQ ID NO: 2 is substituted with glycine or aspartic acid (66) Asparagine at position 72 of SEQ ID NO: 2 is substituted with serine or isoleucine (67) Phenylalanine at position 77 of SEQ ID NO: 2 is substituted with leucine (68) ) The glutamic acid at position 80 in SEQ ID NO: 2 is substituted with glycine (69) The serine at position 81 in SEQ ID NO: 2 is substituted with arginine (70) The isoleucine at position 83 in SEQ ID NO: 2 is substituted with leucine (71) Serine at position 84 replaced with proline (72) 85 of SEQ ID NO: 2 Serine is substituted with asparagine (73) alanine at position 87 of SEQ ID NO: 2 is substituted with threonine (74) tyrosine at position 90 of SEQ ID NO: 2 is substituted with phenylalanine (75) phenylalanine at position 91 of SEQ ID NO: 2 is arginine (76) Aspartic acid at position 93 in SEQ ID NO: 2 is substituted with valine or glutamic acid (77) Alanine at position 94 in SEQ ID NO: 2 is substituted with glutamic acid (78) Valine at position 97 of SEQ ID NO: 2 is substituted with methionine and glutamic acid (79) Substitution of aspartic acid at position 98 of SEQ ID NO: 2 with alanine (80) Substitution of glutamic acid at position 102 of SEQ ID NO: 2 with aspartic acid (81) Substitution of glutamine at position 106 of SEQ ID NO: 2 with leucine ( 82) Leucine at position 109 in SEQ ID NO: 2 is substituted with glutamine (83) Glutamine at position 117 of SEQ ID NO: 2 is replaced with leucine (84) Glutamic acid at position 119 of SEQ ID NO: 2 is replaced with valine (85) Histidine at position 121 of SEQ ID NO: 2 is replaced with arginine (86) 130 of SEQ ID NO: 2 Proline is replaced by leucine (87) 135th lysine of SEQ ID NO: 2 is replaced by tyrosine (88) Glutamate at 136th of SEQ ID NO: 2 is replaced by valine (89) Histidine at 141st of SEQ ID NO: 2 is glutamine (90) Serine at position 146 of SEQ ID NO: 2 is substituted with threonine (91) Lysine at position 154 of SEQ ID NO: 2 is substituted with arginine (92) Glutamine at position 159 of SEQ ID NO: 2 is substituted with histidine (93) The 163rd glycine in SEQ ID NO: 2 is replaced with valine (94). Substitution with nin (95) Phenylalanine at position 167 of SEQ ID NO: 2 is substituted with tyrosine (96) Histidine at position 169 of SEQ ID NO: 2 is substituted with tyrosine (97) Tyrosine at position 174 of SEQ ID NO: 2 is substituted with phenylalanine (98 ) Lysine at position 177 of SEQ ID NO: 2 is substituted with arginine (99) Serine at position 185 of SEQ ID NO: 2 is substituted with glycine (100) Serine at position 194 of SEQ ID NO: 2 is substituted with arginine (101) SEQ ID NO: 2 Substitution of the 196th asparagine with lysine (102) Substitution of the 201st threonine of SEQ ID NO: 2 with alanine (103) Substitution of the 203th asparagine of SEQ ID NO: 2 with isoleucine or lysine (104) Substitution of threonine with alanine (105) Substitution with phosphorus (106) Substitution of 98th aspartic acid of SEQ ID NO: 2 with glutamic acid (107) Substitution of 117th glutamine of SEQ ID NO: 2 with arginine (108) Substitution of 156th threonine of SEQ ID NO: 2 with isoleucine ( 109) Tyrosine at position 174 of SEQ ID NO: 2 is substituted with histidine (110) Lysine at position 181 of SEQ ID NO: 2 is substituted with glutamic acid (111) Asparagine at position 203 of SEQ ID NO: 2 is substituted with aspartic acid or tyrosine As yet another specific example of ii), the amino acid sequence includes the 17th to 192nd amino acid residues in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and the following 17th to 192th amino acid residues are represented by the following ( At least one of the naturally occurring amino acid substitutions shown in 112) to (115); An Fc binding protein in which at least one amino acid substitution has occurred.
(112) The 66th leucine in SEQ ID NO: 1 is substituted with histidine or arginine. (113) The 147th glycine in SEQ ID NO: 1 is substituted with aspartic acid. (114) The 158th tyrosine of SEQ ID NO: 1 is substituted with histidine (115). ) Substitution of valine at position 176 of SEQ ID NO: 1 with phenylalanine The present invention is characterized in that, when an aqueous solution containing an Fc-binding protein is stored, the pH of the aqueous solution is in the range of 7.0 to 9.0. Preferably, it contains a buffer component having a buffering capacity in the above-mentioned pH range. For example, phosphate buffer, Tris-HCl buffer, borate buffer, glycine-sodium hydroxide buffer, MOPS buffer TES buffer, HEPES buffer, DIPSO buffer, TASPO buffer, POPSO buffer, EPPS buffer, Tricine buffer, Bicine buffer, and TAPS buffer. It is more preferable that the aqueous solution containing the Fc-binding protein further contain 0.5 mol / L or more of sodium chloride, because the aggregation of the Fc-binding protein generated during storage can be further suppressed. The method for preparing the aqueous solution containing the Fc-binding protein of the present invention is not particularly limited. For example, a method by dialysis, a method by ultrafiltration, or a salt such as ammonium sulfate or water such as acetone or ethanol at any volume ratio. After preparing an aqueous solution of Fc-binding protein (or Fc-binding protein itself) using a method of adding a miscible organic solvent and collecting the precipitate as a precipitate, the solution is redissolved in a buffer having a pH of 7.0 to 9.0. It should be done. Above all, dialysis and ultrafiltration are preferably used industrially from the viewpoint of simplicity of treatment. For the addition of sodium chloride, a necessary amount of sodium chloride may be added to the aqueous solution having a pH of 7.0 to 9.0 obtained by the above-described method.
本発明はＦｃ結合性タンパク質を含む水溶液を保存する際、当該水溶液のｐＨを７．０から９．０とすることを特徴としている。これにより、精製したＦｃ結合性タンパク質を、他の用途（例えばアフィニティークロマトグラフィー用リガンド）に用いるまでの間に、凝集により生じる、Ｆｃ結合性タンパク質のロスが防止され、Ｆｃ結合性タンパク質の利用効率を大幅に向上させることできる。 The present invention is characterized in that when storing an aqueous solution containing an Fc-binding protein, the pH of the aqueous solution is adjusted to 7.0 to 9.0. This prevents the loss of the Fc-binding protein caused by aggregation before using the purified Fc-binding protein for other uses (for example, ligands for affinity chromatography), and improves the utilization efficiency of the Fc-binding protein. Can be greatly improved.
以下、実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は前記例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited to the examples.
実施例１ Ｆｃ結合性タンパク質の調製
以降の実施例で用いるＦｃ結合性タンパク質を、以下の方法で調製した。
（１）配列番号３に記載の配列からなるＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号４）を含む発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲ９Ｔ８−Ｒ１を、特開２０１４−２２３０６４号公報で開示の方法にて作成し、当該発現ベクターを用いて大腸菌を形質転換した。なお配列番号３に記載の配列からなるＦｃ結合性タンパク質は、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基において以下の（Ｉ）から（ＩＶ）のアミノ酸置換が生じたＦｃ結合性タンパク質である（特願２０１５−０４７４６２号）。
（Ｉ）配列番号２の４５番目のフェニルアラニンがイソロイシンに置換
（ＩＩ）配列番号２の６４番目のグルタミンがアルギニンに置換
（ＩＩＩ）配列番号２の１３３番目のバリンがグルタミン酸に置換
（ＩＶ）配列番号２の１８７番目のフェニルアラニンがセリンに置換
（２）得られた組換え大腸菌を、特開２０１２−０３４５９１号公報および特開２０１３−０８５５３１号公報で開示の方法に基づき、培養することで、Ｆｃ結合性タンパク質を発現させた。
（３）組換え大腸菌の培養液より菌体を回収後、特開２０１３−２５２０９９号公報で開示の抽出液を用いて、菌体内に発現したＦｃ結合性タンパク質を抽出した。
（４）（３）で得られた菌体抽出液から遠心分離により上清を回収し、Ｆｃ結合性タンパク質抽出液を得た。
（５）（４）で得られたＦｃ結合性タンパク質抽出液を、あらかじめ平衡化緩衝液Ａ（１５０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムと０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０とを含んだ２０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ酸緩衝液（ｐＨ ７．５））で平衡化した、アフィニティークロマトグラフィー用ゲル（ＩｇＧ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、ＧＥヘルスケア社製）を充填したカラムに添加した。
（６）平衡化緩衝液Ａでゲルを十分洗浄した後、０．１ｍｏｌ／Ｌグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ ３．０）でＦｃ結合性タンパク質を溶出し、高純度に精製したヒトＦｃ結合性タンパク質を含む溶液を得た。
Example 1 Preparation of Fc binding protein Fc binding protein used in the following examples was prepared by the following method.
(1) An expression vector pTrcFcR9T8-R1 containing a polynucleotide (SEQ ID NO: 4) encoding an Fc-binding protein consisting of the sequence of SEQ ID NO: 3 was prepared by the method disclosed in JP-A-2014-223064. Escherichia coli was transformed with the expression vector. The Fc-binding protein having the sequence of SEQ ID NO: 3 contains the 33rd to 208th amino acid residues in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and the 33th to 208th amino acid residues. It is an Fc-binding protein having the following amino acid substitutions from (I) to (IV) (Japanese Patent Application No. 2015-047462).
(I) Substitution of phenylalanine at position 45 of SEQ ID NO: 2 with isoleucine (II) Substitution of glutamine at position 64 of SEQ ID NO: 2 with arginine (III) Substitution of valine at position 133 of SEQ ID NO: 2 with glutamic acid (IV) SEQ ID NO: The 187th phenylalanine in No. 2 was replaced with serine. (2) The obtained recombinant Escherichia coli was cultured based on the method disclosed in JP-A-2012-034591 and JP-A-2013-085531 to obtain Fc-binding. Sex protein was expressed.
(3) After recovering the cells from the culture solution of the recombinant Escherichia coli, the Fc-binding protein expressed in the cells was extracted using the extract disclosed in JP2013-252099A.
(4) The supernatant was recovered from the bacterial cell extract obtained in (3) by centrifugation to obtain an Fc-binding protein extract.
(5) Using the Fc-binding protein extract obtained in (4) in advance in equilibration buffer A (20 mmol / L Tris-HCl containing 150 mmol / L sodium chloride and 0.05% Tween 20) An affinity chromatography gel (IgG Sepharose 6 Fast Flow, manufactured by GE Healthcare) equilibrated with an acid buffer (pH 7.5) was added to the column.
(6) After sufficiently washing the gel with the equilibration buffer A, the Fc-binding protein was eluted with 0.1 mol / L glycine-HCl buffer (pH 3.0), and the human Fc-binding protein was purified to high purity. A solution containing the protein was obtained.
実施例２ ｐＨの違いによる水溶液中のＦｃ結合性タンパク質の安定性評価
Ｆｃ結合性タンパク質を含む水溶液の、ｐＨによる安定性の違いを確認した。
（１）実施例１で得られた精製Ｆｃ結合性タンパク質水溶液を以下の組成からなる緩衝液で透析した。
（検討した緩衝液）
２０ｍｍｏｌ／Ｌ クエン酸緩衝液（ｐＨ ３．０）
２０ｍｍｏｌ／Ｌ クエン酸緩衝液（ｐＨ ３．５）
２０ｍｍｏｌ／Ｌ 酢酸緩衝液（ｐＨ ４．０）
２０ｍｍｏｌ／Ｌ 酢酸緩衝液（ｐＨ ４．５）
２０ｍｍｏｌ／Ｌ 酢酸緩衝液（ｐＨ ５．０）
２０ｍｍｏｌ／Ｌ 酢酸緩衝液（ｐＨ ５．５）
２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ ６．０）
２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ ６．５）
２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）
２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．５）
２０ｍｍｏｌ／Ｌ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ８．０）
２０ｍｍｏｌ／Ｌ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ８．５）
２０ｍｍｏｌ／Ｌ ホウ酸緩衝液（ｐＨ ９．０）
２０ｍｍｏｌ／Ｌ ホウ酸緩衝液（ｐＨ ９．５）
２０ｍｍｏｌ／Ｌ ホウ酸緩衝液（ｐＨ １０．０）
（２）アヴァクタ社製Ｏｐｔｉｍ２タンパク質物性解析装置を用いて、温度上昇によるＦｃ結合性タンパク質の凝集開始温度Ｔａｇｇ（℃）の測定をすることで、タンパク質の安定性を評価した。
Example 2 Evaluation of Stability of Fc-Binding Protein in Aqueous Solution Due to Difference in pH A difference in stability of an aqueous solution containing an Fc-binding protein due to pH was confirmed.
(1) The purified Fc-binding protein aqueous solution obtained in Example 1 was dialyzed against a buffer having the following composition.
(Buffer studied)
20 mmol / L citrate buffer (pH 3.0)
20 mmol / L citrate buffer (pH 3.5)
20 mmol / L acetate buffer (pH 4.0)
20 mmol / L acetate buffer (pH 4.5)
20 mmol / L acetate buffer (pH 5.0)
20 mmol / L acetate buffer (pH 5.5)
20 mmol / L phosphate buffer (pH 6.0)
20 mmol / L phosphate buffer (pH 6.5)
20 mmol / L phosphate buffer (pH 7.0)
20 mmol / L phosphate buffer (pH 7.5)
20 mmol / L Tris-HCl buffer (pH 8.0)
20 mmol / L Tris-HCl buffer (pH 8.5)
20 mmol / L borate buffer (pH 9.0)
20 mmol / L borate buffer (pH 9.5)
20 mmol / L borate buffer (pH 10.0)
(2) The stability of the protein was evaluated by measuring the aggregation initiation temperature Tagg (° C.) of the Fc-binding protein due to the temperature rise using an Optim2 protein physical property analyzer manufactured by Avacta.
凝集開始温度Ｔａｇｇ（℃）の測定結果を図２に示す。ｐＨが７．０から９．０で凝集開始温度が高くなっていることから、当該ｐＨ領域の水溶液でＦｃ結合性タンパク質の安定性が向上することがわかる。 FIG. 2 shows the measurement results of the aggregation start temperature Tagg (° C.). Since the aggregation initiation temperature is high when the pH is from 7.0 to 9.0, it can be seen that the stability of the Fc-binding protein is improved with an aqueous solution in the pH range.
実施例３ 塩の違いによる水溶液中のＦｃ結合性タンパク質の安定性評価
Ｆｃ結合性タンパク質を含む水溶液に添加する塩による、安定性の違いを確認した。
（１）実施例１で得られた精製Ｆｃ結合性タンパク質水溶液を以下の組成からなる緩衝液で透析した。なお塩の濃度は、各塩のイオン強度の効果を考慮し、適宜調整した。
（検討した緩衝液）
０．５ｍｏｌ／Ｌ 塩化ナトリウムを含んだ２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．５）
０．５ｍｏｌ／Ｌ 塩化カリウムを含んだ２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．５）
０．１６ｍｏｌ／Ｌ 塩化マグネシウムを含んだ２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．５）
０．１６ｍｏｌ／Ｌ 塩化カルシウムを含んだ２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．５）
０．１６ｍｏｌ／Ｌ 硫酸アンモニウムを含んだ２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．５）
０．１２ｍｏｌ／Ｌ 硫酸マグネシウムを含んだ２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．５）
０．１６ｍｏｌ／Ｌ 硫酸ナトリウムを含んだ２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．５）
０．００５ｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡを含んだ２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．５）
（２）アヴァクタ社製Ｏｐｔｉｍ２タンパク質物性解析装置を用いて、温度上昇によるＦｃ結合性タンパク質の凝集開始温度Ｔａｇｇ（℃）の測定をすることで、タンパク質の安定性を評価した。
Example 3 Evaluation of stability of Fc-binding protein in aqueous solution due to difference in salt Difference in stability due to salt added to the aqueous solution containing Fc-binding protein was confirmed.
(1) The purified Fc-binding protein aqueous solution obtained in Example 1 was dialyzed against a buffer having the following composition. The concentration of the salt was appropriately adjusted in consideration of the effect of the ionic strength of each salt.
(Buffer studied)
20 mmol / L phosphate buffer containing 0.5 mol / L sodium chloride (pH 7.5)
20 mmol / L phosphate buffer containing 0.5 mol / L potassium chloride (pH 7.5)
20 mmol / L phosphate buffer containing 0.16 mol / L magnesium chloride (pH 7.5)
20 mmol / L phosphate buffer containing 0.16 mol / L calcium chloride (pH 7.5)
20 mmol / L phosphate buffer containing 0.16 mol / L ammonium sulfate (pH 7.5)
20 mmol / L phosphate buffer containing 0.12 mol / L magnesium sulfate (pH 7.5)
20 mmol / L phosphate buffer containing 0.16 mol / L sodium sulfate (pH 7.5)
20 mmol / L phosphate buffer containing 0.005 mol / L EDTA (pH 7.5)
(2) The stability of the protein was evaluated by measuring the aggregation initiation temperature Tagg (° C.) of the Fc-binding protein due to the temperature rise using an Optim2 protein physical property analyzer manufactured by Avacta.
凝集開始温度Ｔａｇｇ（℃）の測定結果を図３に示す。添加する塩として塩化ナトリウムを用いることで、Ｆｃ結合性タンパク質の安定性が向上することがわかる。 FIG. 3 shows the measurement results of the aggregation start temperature Tagg (° C.). It can be seen that the use of sodium chloride as the salt to be added improves the stability of the Fc-binding protein.
実施例４ 塩濃度の違いによる水溶液中のＦｃ結合性タンパク質の安定性評価
Ｆｃ結合性タンパク質を含む水溶液に添加する塩化ナトリウムの濃度による、安定性の違いを確認した。
（１）実施例１で得られた精製Ｆｃ結合性タンパク質水溶液を以下の組成からなる緩衝液で透析した。
（検討した緩衝液）
０．１ｍｏｌ／Ｌ 塩化ナトリウムを含んだ２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．５）
０．２ｍｏｌ／Ｌ 塩化ナトリウムを含んだ２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．５）
０．３ｍｏｌ／Ｌ 塩化ナトリウムを含んだ２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．５）
０．４ｍｏｌ／Ｌ 塩化ナトリウムを含んだ２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．５）
０．５ｍｏｌ／Ｌ 塩化ナトリウムを含んだ２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．５）
０．６ｍｏｌ／Ｌ 塩化ナトリウムを含んだ２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．５）
０．７ｍｏｌ／Ｌ 塩化ナトリウムを含んだ２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．５）
０．８ｍｏｌ／Ｌ 塩化ナトリウムを含んだ２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．５）
０．９ｍｏｌ／Ｌ 塩化ナトリウムを含んだ２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．５）
１．０ｍｏｌ／Ｌ 塩化ナトリウムを含んだ２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．５）
（２）アヴァクタ社製Ｏｐｔｉｍ２タンパク質物性解析装置を用いて、温度上昇によるＦｃ結合性タンパク質の凝集開始温度Ｔａｇｇ（℃）の測定をすることで、タンパク質の安定性を評価した。
Example 4 Evaluation of Stability of Fc Binding Protein in Aqueous Solution Due to Difference in Salt Concentration Difference in stability due to the concentration of sodium chloride added to the aqueous solution containing Fc binding protein was confirmed.
(1) The purified Fc-binding protein aqueous solution obtained in Example 1 was dialyzed against a buffer having the following composition.
(Buffer studied)
20 mmol / L phosphate buffer containing 0.1 mol / L sodium chloride (pH 7.5)
20 mmol / L phosphate buffer containing 0.2 mol / L sodium chloride (pH 7.5)
20 mmol / L phosphate buffer containing 0.3 mol / L sodium chloride (pH 7.5)
20 mmol / L phosphate buffer containing 0.4 mol / L sodium chloride (pH 7.5)
20 mmol / L phosphate buffer containing 0.5 mol / L sodium chloride (pH 7.5)
20 mmol / L phosphate buffer containing 0.6 mol / L sodium chloride (pH 7.5)
20 mmol / L phosphate buffer containing 0.7 mol / L sodium chloride (pH 7.5)
20 mmol / L phosphate buffer (pH 7.5) containing 0.8 mol / L sodium chloride
20 mmol / L phosphate buffer (pH 7.5) containing 0.9 mol / L sodium chloride
20 mmol / L phosphate buffer (pH 7.5) containing 1.0 mol / L sodium chloride
(2) The stability of the protein was evaluated by measuring the aggregation initiation temperature Tagg (° C.) of the Fc-binding protein due to the temperature rise using an Optim2 protein physical property analyzer manufactured by Avacta.
凝集開始温度Ｔａｇｇ（℃）の測定結果を図４に示す。塩化ナトリウム濃度を０．５ｍｏｌ／Ｌ以上添加することでＦｃ結合性タンパク質の安定性が向上することがわかる。 FIG. 4 shows the measurement results of the aggregation start temperature Tagg (° C.). It can be seen that the stability of the Fc-binding protein is improved by adding the sodium chloride concentration of 0.5 mol / L or more.
上記実施例２から４の結果をまとめると、Ｆｃ結合性タンパク質を含む水溶液のｐＨが７．０から９．０であり、かつ前記水溶液に０．５ｍｏｌ／Ｌ以上の塩化ナトリウムをさらに含ませると、Ｆｃ結合性タンパク質を最も安定的に保存できることがわかる。 Summarizing the results of Examples 2 to 4, the pH of the aqueous solution containing the Fc-binding protein is from 7.0 to 9.0, and the aqueous solution further contains 0.5 mol / L or more of sodium chloride. , Fc-binding protein can be stored most stably.
実施例５
本発明のＦｃ結合性タンパク質水溶液の保存安定性を確認した。
（１）０．８ｍｏｌ／Ｌ 塩化ナトリウムを含んだ２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．５）に実施例１で得られた精製Ｆｃ結合性タンパク質を添加することで、Ｆｃ結合性タンパク質水溶液を調製した。
（２）調製した水溶液を、−２０℃での凍結保存、または３から１０℃での冷蔵保存を行なった。
Example 5
The storage stability of the aqueous Fc-binding protein solution of the present invention was confirmed.
(1) By adding the purified Fc-binding protein obtained in Example 1 to a 20 mmol / L phosphate buffer (pH 7.5) containing 0.8 mol / L sodium chloride, an aqueous solution of the Fc-binding protein was prepared. Was prepared.
(2) The prepared aqueous solution was stored frozen at -20 ° C or refrigerated at 3 to 10 ° C.
結果を図５に示す。凍結保存、冷凍保存ともに６ヶ月以上保存しても、Ｆｃ結合性タンパク質の劣化はなく、沈殿物や凝集体も確認できなかった。このことから本発明により、Ｆｃ結合性タンパク質を水溶液中で長期間、安定に保存できることがわかる。 FIG. 5 shows the results. Even when stored for 6 months or longer in both frozen storage and frozen storage, no deterioration of the Fc-binding protein was observed, and no precipitates or aggregates were confirmed. This indicates that the present invention can stably store an Fc-binding protein in an aqueous solution for a long period of time.
Claims (2)
前記水溶液のｐＨが７．０から８．５であり、
前記水溶液が０．５ｍｏｌ／Ｌ以上１．０ｍｏｌ／Ｌ以下の塩化ナトリウムを含み、
前記Ｆｃ結合性タンパク質が、
（ｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、または
（ｉｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれか１以上のアミノ酸置換が生じているアミノ酸配列からなるタンパク質である、
前記水溶液：
（ａ）配列番号１の６６番目に該当するロイシンがヒスチジンまたはアルギニンに置換
（ｂ）配列番号１の１４７番目に該当するグリシンがアスパラギン酸に置換
（ｃ）配列番号１の１５８番目に該当するチロシンがヒスチジンに置換
（ｄ）配列番号１の１７６番目に該当するバリンがフェニルアラニンに置換。 An aqueous solution containing an Fc-binding protein,
The aqueous solution has a pH of 7.0 to 8.5,
The aqueous solution contains 0.5 mol / L or more and 1.0 mol / L or less sodium chloride,
The Fc binding protein is
(I) a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, or (ii) an amino acid having any one or more of the following amino acid substitutions (a) to (d) in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 A protein consisting of a sequence,
The aqueous solution:
(A) Leucine corresponding to position 66 of SEQ ID NO: 1 is substituted with histidine or arginine. (B) Glycine corresponding to position 147 of SEQ ID NO: 1 is substituted with aspartic acid. (C) Tyrosine corresponding to position 158 of SEQ ID NO: 1. Is substituted with histidine. (D) Valine corresponding to position 176 of SEQ ID NO: 1 is substituted with phenylalanine.
前記Ｆｃ結合性タンパク質が、
（ｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、または
（ｉｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれか１以上のアミノ酸置換が生じているアミノ酸配列からなるタンパク質である、方法：
（ａ）配列番号１の６６番目に該当するロイシンがヒスチジンまたはアルギニンに置換
（ｂ）配列番号１の１４７番目に該当するグリシンがアスパラギン酸に置換
（ｃ）配列番号１の１５８番目に該当するチロシンがヒスチジンに置換
（ｄ）配列番号１の１７６番目に該当するバリンがフェニルアラニンに置換。 A method for storing an Fc-binding protein, comprising storing the Fc-binding protein in an aqueous solution containing sodium chloride of 0.5 mol / L or more and 1.0 mol / L or less and having a pH of 7.0 to 8.5,
The Fc binding protein is
(I) a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, or (ii) an amino acid having any one or more of the following amino acid substitutions (a) to (d) in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 The method is a protein consisting of a sequence:
(A) Leucine corresponding to position 66 of SEQ ID NO: 1 is substituted with histidine or arginine. (B) Glycine corresponding to position 147 of SEQ ID NO: 1 is substituted with aspartic acid. (C) Tyrosine corresponding to position 158 of SEQ ID NO: 1. Is substituted with histidine. (D) Valine corresponding to position 176 of SEQ ID NO: 1 is substituted with phenylalanine.
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