JP6630374B2 - τリン酸化を阻害する方法 - Google Patents

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関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年３月１５日出願の出願番号第６１／７８９，１８０号、及び２０１２年７月１３日出願の出願番号第６１／６７１，４４５号の優先権を主張する。これらの開示は、本明細書中参考として援用される。
本発明は、過剰リン酸化τタンパク質の形成を阻害することによる中枢神経系（ＣＮＳ）の治療方法、及び神経原線維タングル（ＮＦＴ）の病的形成を導く可能性があるτタンパク質過剰リン酸化を阻害する薬物の製造における、企図する化合物の使用を企図する。本方法及び使用は、１種又は複数の、α−７ニコチン性アセチルコリン受容体（α７ｎＡｃｈＲ）、インシュリン受容体、及びＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体の機能の向上ももたらす。
微小管結合タンパク質τ（ＭＡＰＴ）は、主に軸索で、及びそれより量は減るものの星状細胞及びオリゴデンドロサイトで発生し、神経細胞微小管を安定させる。安定化することで、神経細胞微小管は、細胞プロセスの発展、細胞極性の確立、及び細胞内輸送におけるそれらの役割を果たす。７５８のアミノ酸残基をコードすることができる翻訳領域を持つ単一遺伝子がτタンパク質をコードする。τは、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベースに、Ｐ１０６３６という指定番号で登録されている。少なくとも９つの選択的スプライシングアイソフォームが、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベースで認知されている。
Ｇｏｅｄｅｒｔ及び共同実験者による初期の研究により、３５２〜４４１のアミノ酸残基を含有する６つのアイソフォームが同定された［Ｍａｎｄｅｌｋｏｗ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ８：４２５−４２７ （１９９８）；Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ， １１７（２４）：５７２１−５７２９ （２００４）も参照］。本明細書中述べられるアミノ酸残基配列及びリン酸化位置の番号付けは、Ｇｏｅｄｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｎ ３：５１９−５２６ （１９８９）において「ｈｔａｕ４０」と称されるヒトτアイソフォームに沿って行われる。この４４１の残基からなるτアイソフォームは、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔデータベースにおいてＴａｕ−４又はτ−Ｆとも称されており、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベースでは、このアイソフォームはＰ１０６３６−８という指定番号が与えられている。ＴＡＵ−４（Ｐ１０６３６−８、ｈｔａｕ４０）のアミノ酸残基配列を、配列番号２に示す。
τは、多数のリン酸化酵素酵素の基質である［Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ， １１７（２４）：５７２１−５７２９ （２００４）］。Ｓ−Ｐ又はＴ−Ｐモチーフのセリン及びトレオニン残基でのプロリン指向性タンパク質キナーゼ（ＰＤＰＫ１：ＣＤＫ１、ＣＤＫ５、ＧＳＫ３、ＭＡＰＫ）によるリン酸化、及びＫ−Ｘ−Ｇ−Ｓモチーフのセリン残基でのＭＡＰ／微小管親和性制御キナーゼ（ＭＡＲＫ１又はＭＡＲＫ２）によるリン酸化が、頻繁に見られる。
そのグループの酵素である、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）は、主要τキナーゼである可能性がある［Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ， ８８：３４９−３５８ （２００４）］。ＧＳＫ３βは、プロリンに富む領域にある非活性化部位（unprimed site）（Ｔｈｒ−１８１、Ｓｅｒ−１８４、Ｓｅｒ−２６２、Ｓｅｒ−３５６、及びＳｅｒ−４００）、又はＧＳＫ３βが反応する部位に対して４アミノ酸残基分Ｃ末端寄りに位置する部位でセリン又はトレオニンが別のタンパク質キナーゼ（例えば、Ａキナーゼ）により先行リン酸化されている非活性化部位（unprimed site）（Ｓｅｒ−１９５、Ｓｅｒ−１９８、Ｓｅｒ−１９９、Ｓｅｒ−２０２、Ｔｈｒ−２０５、Ｔｈｒ−２３１、Ｓｅｒ−２３５、Ｓｅｒ−２６２、Ｓｅｒ−３５６、及びＳｅｒ−４０４）をリン酸化することができる［Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ， ８８：３４９−３５８ （２００４）；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ， ４３６：２８−３４（１９９８）］。
タンパク質が正常リン酸化された（normophosphorylated）形というのが、微小管の会合を刺激し安定化する微小管（microtublule）結合タンパク質である。この正常リン酸化された（normophosphorylated）形は、典型的には、タンパク質１モルあたり２〜３モルのリン酸基を有する［Ｋｉｃｋｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ， ＵＳＡ， １０７（５０）：２１８３０−２１８３５ （２０１０）］。
多重リン酸化（過剰リン酸化）τタンパク質、すなわち、正常リン酸化（normophosphorylated）数よりも多いリン酸基を有するτタンパク質は、神経原線維タングルの形成をもたらす可能性があり、神経原線維タングルは、タウオパシーと総称される複数の病態を伴う。例えば、アルツハイマー病患者でのτリン酸化レベルは、リン酸基の個数が、正常リン酸化（normophosphorylated）分子に存在する数の３〜４倍多い［Ｋｉｃｋｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ， ＵＳＡ， １０７（５０）：２１８３０−２１８３５ （２０１０）］。
神経炎症がタウオパシーに共通する特徴であることを示唆する証拠は増えている。すなわち、活性化ミクログリアが、アルツハイマー病（ＡＤ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、進行性核上麻痺、及び大脳皮質基底核変性症をはじめとする様々なヒトタウオパシーの死後脳組織で見つかっている［Ｇｅｂｉｃｋｅ−Ｈａｅｒｔｅｒ， Ｍｉｃｒｏｓｃ Ｒｅｓ Ｔｅｃｈ， ５４：４７−５８ （２００１）； Ｇｅｒｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｖ Ｄｉｓｏｒｄ， ２１：８９−９３ （１２００６）； Ｉｓｈｉｚａｗａ ｅｔ ａｌ．， ＪＮｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ， ６０：６４７−６５７ （２００１）］。
トール様受容体４（ＴＬＲ４）リガンドであるリポ多糖類（ＬＰＳ）の投与を介した全身性炎症の誘導は、ＡＤの三重遺伝子導入マウスモデルでＭＡＰＴ（τ）過剰リン酸化を顕著に誘導する［Ｋｉｔａｚａｗａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ， ２５：８８４３−８８５３ （２００５）］。免疫抑制剤ＦＫ５０６（タクロリムス）は、ミクログリア活性化を減弱し、ＦＴＤのＰ３０１Ｓ遺伝子導入マウスモデルの寿命を延ばした［Ｙｏｓｈｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｎ ５３：３３７−３５１ （２００７）］。更に、星状細胞から放出される炎症性サイトカイン（インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、及び一酸化窒素など）が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＭＡＰＴ病理及び神経原線維タングル（ＮＦＴ）の形成を加速する可能性があることを示唆する研究の数が増加している［Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ， ２３：１６０５−１６１１ （２００３）；Ｑｕｉｎｔａｎｉｌｌａ ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ， ２９５：２４５−２５７ （２００４）； Ｓａｅｚ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎ Ｖｉｖｏ， １８：２７５−２８０ （２００４）］。
トール様受容体（ＴＬＲ）は、膜貫通受容体のグループであり、それらの細胞質部分は類似性が高く、インターロイキン−１（ＩＬ−１）受容体に対して高い類似性を有する。この細胞質部分は、現在、Ｔｏｌｌ／ＩＬ−１受容体（ＴＩＲ）ドメインと称される。細胞外部分は、構造的に関連しない。ＴＬＲは、病原体構成要素を認識する。［Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １６：３−９ （２００４）。］
ＴＬＲ４は、ほとんどのグラム陰性細菌で見られるリポ多糖類（ＬＰＳ）ならびに他の分子を認識する上で、病原体認識に基本的な役割を果たす。この受容体は、自然免疫の活性化にも役割を果たす。ＴＬＲ４経路の活性化は、感染の指標となり得る。
ＴＬＲ４は、典型的には、アダプター分子、ＭＤ２、ＣＤ１４と会合し、またＬＰＳと会合している場合にはリポ多糖類結合分子（ＬＰＢ）と会合する。シグナル伝達は、全てのＴＬＲに共通する、ミエロイド系分化因子８８（ＭｙＤ８８）依存経路と称されるものにおける一連の細胞質分子を通じて起こり、ＭｙＤ８８非依存経路は、ＴＬＲ３及びＴＬＲ４に共有される。ＴＬＲ３は、二本鎖ＲＮＡを認識し、ＴＬＲ４の活性化とは異なる条件下で活性化する。
ＭｙＤ８８非依存経路を介してＬＰＳにより誘導されるシグナル伝達は、転写因子ＩＲＦ−３の活性化を導き、これによりＩＦＮ−βを誘導する。続いてＩＦＮ−βは、Ｓｔａｔ１を活性化し、複数のＩＦＮ誘導遺伝子の誘導を導く。ＬＰＳにより誘導されたＮＦ−κＢ及びＪＮＫの活性化は、ＭｙＤ８８の存在とは無関係であるらしい。［Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １６：３−９ （２００４）。］
ＴＬＲ４は、免疫系の細胞（Ｂ細胞、Ｔ細胞、及びマクロファージなど）、ならびにＣＮＳの細胞に存在する。ＴＬＲ４は、自然免疫応答の重要なメディエーターであり、脳損傷により誘導される神経炎症に明らかに寄与する。ＴＬＲ４が媒介する神経炎症は、典型的には、上記のＴＬＲ４／アダプタータンパク質ＭｙＤ８８シグナル伝達経路を通じて進行する。
Ｍａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ， Ｍａｙ １４ （２０１２）は、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）のラットモデルにおいて、脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）前処置に神経保護機構の可能性があることを報告した。ＴＢＩはＴＬＲ４の顕著な発現上昇を誘導し、その発現ピークは外傷から２４時間後に出現することがわかった。
ＰＡＣＡＰでの前処置は、顕著に、運動及び認知の機能障害を改善し、神経細胞アポトーシスを減弱し、脳浮腫を減少させた。この前処置は、損傷した皮質周囲の脳組織及び海馬において、ＴＬＲ４の発現上昇ならびにその下流のシグナル伝達分子である、ＭｙＤ８８、ｐ−ＩκＢ、及びＮＦ−κＢの発現上昇を阻害し、下流の炎症作用物質、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）及び腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）のレベルの増加を抑制した。このように、ＰＡＣＡＰ処置は、恐らくはミクログリア及び神経細胞においてＴＬＲ４／ＭｙＤ８８／ＮＦ−κＢシグナル伝達経路を介した二次炎症反応を阻害し、それにより神経細胞死を減少させるとともにＴＢＩを受けた結果を改善することにより、このＴＢＩのラットモデルにおいて、神経保護効果を発揮した。
外傷性脳損傷（ＴＢＩ）は、近年の軍事衝突を「代表する」損傷であり、精神症状及び長期の認知能力障害を伴う。多重脳震盪を起こした運動選手で報告される、慢性外傷性脳障害（ＣＴＥ）、過剰リン酸化τタンパク質に関連した神経変性疾患（タウオパシー）は、爆風を受けた軍人におけるＴＢＩと臨床的特徴が共通する。ＣＴＥは、ボクサー認知症として既知の、ボクサーで見られる病理とも共通する。［Ｇａｎｄｙ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉ． Ｔｒａｎｓｌ． Ｍｅｄ． ４：１３４１−１３４３ （Ｍａｙ １２， ２０１２）。］
Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉ． Ｔｒａｎｓｌ． Ｍｅｄ． ４：１３４ｒａ６０ （２０１２）は、爆風を受けた及び／又は震盪性損傷のある米国退役軍人から採取した一連の死後脳において、ＴＢＩとＣＴＥの関連性を研究した。この著者らは、若いアマチュアアメリカンフットボール選手及びプロレスラーの脳で観測されるものと同様なＣＴＥ神経病理が退役軍人の脳にあることの証拠を報告した。研究者らは、戦争の爆風損傷を伴う典型的な爆風状態を模倣する爆風頭部外傷のマウスモデルを開発し、爆風を受けたマウスも、ＣＴＥ神経病理（τタンパク質過剰リン酸化、有髄軸索障害、微小血管障害、慢性神経炎症、及び神経変性など）を示すことを見いだした。
このマウス神経病理は、軸索伝導の緩徐、活動依存性長期シナプス可塑性の低下、ならびに空間学習及び記憶の障害を含む機能欠陥を伴い、この機能欠陥は爆風を１回受けた後１ヶ月間続くことが報告された。次いで、研究者らは、マウスで爆風に誘導される学習及び記憶の欠陥が、爆風を受ける最中にその頭を固定することで減少したことを示した。
爆風を受けた及び／又は震盪性損傷のある退役軍人ならびに震盪性損傷を繰り返した若年成人運動選手での神経病理学的知見は、この著者らが先に行ったＣＴＥの症例研究と一致し［ＭｃＫｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ ６８：７０９−７３５ （２００９）；ＭｃＫｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ ６９：９１８−９２９ （２０１０）］、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、及び他の加齢性神経変性疾患に伴う神経病理と容易に区別されることが報告された。
アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）は、カイロミクロン及び中間密度リポタンパク質（ＩＤＬ）で見られるアポリポタンク質の１つのクラスであり、肝細胞及び周辺細胞（peripheral cell）にある特異的受容体と結合する。ＡｐｏＥは、リポタンパク質輸送とは直接関係ない複数の生物学的プロセスにおけるその役割が研究されてきており、アルツハイマー病、免疫調節、及び認知などで、その機能が更に研究されている。
ＡｐｏＥは、２９９アミノ酸長を有し、リポタンパク質、脂溶性ビタミン、及びコレステロールを、リンパ系へ、それから更に血液中へ輸送する。ＡｐｏＥは、主に肝臓で合成されるが、脳など他の組織でも見つかっている。神経系では、非神経細胞種、特に注目すべきは、アストログリア及びミクログリアが、ＡｐｏＥの主な生産体であり、一方神経細胞はＡｐｏＥ受容体の発現が優先する。
哺乳類のＡｐｏＥ受容体は、現在７種類が同定されており、これらは、進化的に保存された低密度リポタンパク質受容体遺伝子ファミリーに属する。ＡｐｏＥは、多型遺伝子で、３つの主要アイソフォーム、ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３、ＡｐｏＥ４が存在し、これらは３つの対立遺伝子から翻訳される。そのうち、ＡｐｏＥ−ε３は「正常」対立遺伝子であり、ＡｐｏＥ−ε２及びＡｐｏＥ−ε４は、機能障害性対立遺伝子である。
ＡｐｏＥ４は、粥状動脈硬化及びアルツハイマー病、認知機能の損傷、ならびに神経突起伸長の減少に結びつけられてきた。ＡｐｏＥ４バリアントは、様々な民族において遅発型孤発性アルツハイマー病（ＡＤ）の既知の遺伝的危険因子の中で最も危険性の高いものである。コーカサス人種及び日本人で２つのＥ４対立遺伝子を保有する人は、年齢７５歳になるまでにＡＤを発症する危険性が、Ｅ４対立遺伝子を保有しない人に比べて１０〜３０倍高い。
ＡＤ患者の４０〜６５％が４つの対立遺伝子のうち少なくとも１つのコピーを有するものの、ＡｐｏＥ４は、この疾患の決定要因ではない。ＡＤ患者の少なくとも３分の１は、ＡｐｏＥ４陰性であり、ＡｐｏＥ４ホモ接合体の中には、疾患をまったく発症しない場合もある。しかしながら、２つのＥ４対立遺伝子を持つ人は、ＡＤを発症する危険性が２０倍まで上がる。
また、マウスの神経細胞でのＡｐｏＥ４過剰発現は、τ過剰リン酸化及び運動障害の発現をもたらし、筋消耗、体重減少、及び早期死亡を伴った。［Ｔｅｓｓｅｕｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ， １５６（３）：９５１−９６４ （２０００）。］一方、神経細胞に外部からＡｐｏＥアイソフォーム（Ｅ２又はＥ４）を供給して処置すると、神経細胞のいくつかの下流シグナル伝達カスケードに影響を及ぼす：神経細胞初代培養物における、Ｔｈｒ１７１及びＳｅｒ２０２／Ｔｈｒ２０５エピトープでのτキナーゼリン酸化の減少及びτリン酸化の阻害である。ＡｐｏＥは、τキナーゼ及びホスホτエピトープのレベルを変更することができるので、ＡＤ脳で見られるτの神経病理学的変化に影響を及ぼす可能性がある。［Ｈｏｅ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ， １：８ （２００６）。］
Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ及び共同研究者らは、τタンパク質の自己凝集によるβシート原繊維の形成を研究して、特定のヘキサペプチドが、βシート原繊維の「立体的ジッパー」と干渉して、βシート原繊維の形成を阻害し得ることを見いだした。しかしながら、この阻害ペプチドは、大きすぎるため、脳に深く浸透することもできないし、τ原繊維が形成される脳細胞に進入するようにも見えない。Ｓａｗａｙａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ４４７：４５３−４５７ （２００７）； Ｌａｎｄａｕ ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ９（６）：ｅ１００１０８０ （２０１１）；及びＳｉｅｖｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１０１５４ （２０１１）を参照。従って、脳及び他のＣＮＳ構造体、ならびにそれら構造体の細胞に進入する、τ含有ＮＦＴ形成の阻害剤を見つけることができれば、有益であるだろう。
アルツハイマー病（ＡＤ）は、医療的に満たされていない要求が非常に多く、現在、世界中で３５００万人の患者がいるが、利用可能な疾患修飾治療は存在しない。ＡＤに現在用いられている２つのクラスの薬物、コリンエステラーゼ阻害剤及びメマンチンは、これらの患者で一時的に認知機能を向上させるにすぎない。
ＡＤ病理の原因物質は、アミロイドβ（Ａβ）、Ａβ42であると一般的に受け止められている。Ａβは、３９〜４２の残基からなる、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のタンパク質分解産物であり、アミロイド前駆体タンパク質は、膜内在性タンパク質であって、多くの組織で発現し神経細胞のシナプスに濃縮されている。
Ａβレベルが上昇している遺伝子組換え動物は、ＡＤのモデルとすることができ、死後ＡＤ脳でのＡβレベルは、認知障害及び神経病理の度合いと相関する［Ｔａｎｚｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ １２０：５４５−５５５ （２００５）］。この相関性は、Ａβ豊富なプラークとよりも溶解性Ａβとの方が高く、このことが溶解性ＡβをＡＤ病原性に結びつけている［Ｎａｓｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ａｍ Ｍｅｄ Ａｓｓｏｃ， ２８３：１５７１−１５７７ （２０００）。］
溶解性Ａβの病原としての決定的な役割は、一昔前に実証されたとおり、α−７ニコチン性アセチルコリン受容体（α７ｎＡＣｈＲ）を介した毒性のシグナル伝達であると思われる。Ａβは、この受容体と高い親和性で結合し［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７５：５６２６−５６３２ （２０００）； Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ ７５：１１５５−１１６１ （２０００）］、ＥＲＫ２を活性化し、ＥＲＫ２がτタンパク質をリン酸化する［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８：１５４７−３１５５３ （２００３）］。ＥＲＫ２は、先に記載した分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ１（ＭＡＰＫ１）としても知られる。
持続性の異常なτタンパク質過剰リン酸化は、ＡＤ脳の突出した神経病理学的特徴である神経原線維タングル（ＮＦＴ）をもたらし、これら病変の大きさは、ＡＤ症候の重篤度と相関する［Ｄｅｌａｃｏｕｒｔｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ５２：１５８−１１６５ （１９９９）；Ｄｅｌａｃｏｕｒｔｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ４３：９３−２０４ （１９９８）。］ＮＦＴは、最初は細胞内ゴーストであるが、神経細胞の死後、細胞外ゴーストタングルになる［Ｍａｎｄｅｌｋｏｗ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ８：４２５−４２７ （１９９８）］。
Ａβペプチドは、複数のｉｎ ｖｉｔｒｏ実験系において、τリン酸化を誘導することがわかっており［Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ Ｄｉｓ １：２９−３５１ （１９９９）］、Ａβに誘導されるτリン酸化は、α７ｎＡＣｈＲに依存することが実証されている。なぜなら、組織をα７ｎＡＣｈＲアンタゴニスト又はＡβ12-28（Ａβ42−α７ｎＡＣｈＲ相互作用を阻害する）で前処理すると、、Ａβ42に誘導されるτリン酸化が減少するからである［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８：５４７−３１５５３ （２００３）］。
リン酸化は、部位によっては、微小管結合性質を制御するようである（例えば、Ｓｅｒ２６２及びＳｅｒ３５６）［Ｍａｎｄｅｌｋｏｗ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ８：４２５−４２７ （１９９８）］。一方、２０２Ｓｅｒ、２３１Ｔｈｒ、及び１８１Ｔｈｒの１つ又は複数でのリン酸化が、τ含有ＮＦＴで見つかっている［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８：３１５４７−３１５５３ （２００３）； Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ６７：５２２−５３０ （２０１０）］。
神経原線維の病理を媒介する上でのα７ｎＡＣｈＲの決定的役割は、少なくとも２つの知見により更に支持される：１）α７ｎＡＣｈＲを過剰発現するＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞とともにＡβ42を用いて遅延性インキュベーションするとＮＦＴを促進する、及び２）α７ｎＡＣｈＲレベルを低下させるアンチセンス−α７ｎＡＣｈＲオリゴヌクレオチドは、Ａβ42が誘導する神経原線維の病変を消失させる［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８：３１５４７−３１５５３ （２００３）］。これらのデータは、ＡＤ脳においてＡβ42がα７ｎＡＣｈＲを慢性的に摂動することが、神経原線維のリン酸化τ含有病変を導くことを示唆する。
本明細書中以下で詳細に説明するとおり、本発明は、シグナル伝達の骨格であるフィラミンＡ（ＦＬＮＡ）を利用するシグナル伝達経路の１つ又は複数を阻害することにより、Ａβ42が誘導するτタンパク質過剰リン酸化を阻害する方法を提供する。１つの経路では、Ａβとα７ｎＡＣｈＲが相互作用することで、ＦＬＮＡの補充がもたらされる。別の経路では、Ａβ42又はその同族リガンド（例えば、ＬＰＳ）によりＴＬＲ４が活性化され、ＴＬＲ４受容体にＦＬＮＡが補充されることにより、ＴＬＲ４が媒介するシグナル伝達が活性化される。Ａβ42は、α７ｎＡＣｈＲ又はＴＬＲ４へのＦＬＮＡ補充を誘導し、ならびにτリン酸化は、細胞２５０，０００個を酸素添加クレブス（Kreb's）・リンゲル液２５０μｌ中、１ｎＭのＡβ42とともにインキュベートすることで、観測される。このＡβ42が媒介する効果は、１００ｎＭでプラトーになることがわかった。
以下に開示する治療アプローチは、ＦＬＮＡに高親和性で結合する化合物を用いて、ＦＬＮＡが媒介するτタンパク質過剰リン酸化を阻害することを標的とする。この結合は、ＦＬＮＡの立体構造を変更させ、ＦＬＮＡが他のシグナル伝達分子（α７ｎＡＣｈＲなど）と相互作用することを防ぎ、それによりτタンパク質過剰リン酸化を阻害すると思われる。
本発明は、τタンパク質の過剰リン酸化［セリン−２０２（２０２Ｓｅｒ及びＳ202とも称する）、トレオニン−２３１（２３１Ｔｈｒ及びＴ231とも称する）及びトレオニン−１８１（１８１Ｔｈｒ及びＴ181とも称する）の１つ又は複数でのリン酸化を、その他任意の部位で起こる可能性のあるリン酸化と合わせて］阻害する方法を目論んでおり、本方法は、その阻害が必要であると認められる（診断された）中枢神経系細胞に、フィラミンＡ（ＦＬＮＡ）と又は例えば実施例１に記載されるとおりの配列番号１のフィラミンＡのペンタペプチドと結合する化合物又はその薬学的に許容可能な塩であって、その化合物又は塩が１０μＭ濃度で存在し、同濃度で対照阻害剤として未標識のナロキソンを用いた場合に、ＦＩＴＣ標識化ナロキソン結合を少なくとも約６０％阻害し、好ましくは約７０％阻害する、化合物又はその塩を有効量で投与する工程を含む。化合物は、好ましくは本明細書中以下に記載されるとおりの系列Ａ、Ｂ、Ｃ−１、Ｃ−２、Ｄ、もしくはＥの化合物であり、かつ好ましくは図３５〜図４０の６つのファルマコフォアのうち少なくとも４つを有する。投与は、μオピオイド受容体（ＭＯＲ）結合有効量の別個のＭＯＲアゴニスト又はアンタゴニスト分子が存在しない状態で行われる。
企図する化合物の、単一の立体異性体もしくは立体異性体混合物、又はその薬学的に許容可能な塩の使用も企図する。企図する投与は、ｉｎ ｖｉｖｏでもｉｎ ｖｉｔｒｏでも行うことができ、ｉｎ ｖｉｖｏで投与される場合、典型的には数日間又は数ヶ月間という期間にわたり繰り返される。
本発明の別の態様は、ＴＬＲ４媒介性免疫応答（ＣＮＳの細胞の炎症など）を阻害する方法を企図する。企図する方法は、その阻害が必要であると認められる（診断された）ＴＬＲ４含有細胞に、フィラミンＡ（ＦＬＮＡ）と又は実施例１に記載されるとおりの配列番号１のフィラミンＡのペンタペプチドと結合する化合物又はその薬学的に許容可能な塩であって、その化合物又は塩が１０μＭ濃度で存在し、同濃度で対照阻害剤として未標識のナロキソンを用いた場合に、ＦＩＴＣ標識化ナロキソン結合を少なくとも約６０％阻害し、好ましくは約７０％阻害する、化合物又はその塩を有効量で投与する工程を含む。企図する化合物は、好ましくは本明細書中以下に記載されるとおりの系列Ａ、Ｂ、Ｃ−１、Ｃ−２、Ｄ、もしくはＥの化合物であり、かつ好ましくは図３５〜図４０の６つのファルマコフォアのうち少なくとも４つを有する。投与は、好ましくは、μオピオイド受容体（ＭＯＲ）結合有効量の別個のＭＯＲアゴニスト又はアンタゴニスト分子が存在しない状態で行われる。
企図する化合物の、単一の立体異性体もしくは立体異性体混合物、又はその薬学的に許容可能な塩の使用も企図する。企図する投与は、ｉｎ ｖｉｖｏでもｉｎ ｖｉｔｒｏでも行うことができ、ｉｎ ｖｉｖｏで宿主動物（ヒトなど）の細胞に投与される場合、典型的には数日間又は数ヶ月間という期間にわたり繰り返される。
上記方法の１つの態様において、足場タンパク質フィラミンＡ（ＦＬＮＡ）を介したＡβとα７ｎＡＣｈＲの相互作用を通じて、Ｓ202、Ｔ231、及びＴ181の１つ又は複数でτ過剰リン酸化が生じる。企図する方法の別の態様において、そのようなτ過剰リン酸化は、ＴＬＲ４媒介性免疫応答を介して生じ、その機構は現在のところ不明であるが、これにもＦＮＬＡの仲介が関与する。
上記経路、Ａβ−α７ｎＡＣｈＲ及びＴＬＲ４は、それぞれ、同時に作動し得るとともに、互いに独立していると、現在のところ考えられている。Ｓ202、Ｔ231、及びＴ181の１つ又は複数でＡβ−α７ｎＡＣｈＲ媒介性及び／又はＴＬＲ４媒介性τリン酸化の一方又は両方を示すＣＮＳ状態の例として、外傷性脳損傷（例えば、脳振盪）などの脳損傷、慢性外傷性脳障害により誘導される免疫応答（炎症など）を示しているＣＮＳ細胞を有する個人及び他の動物、アルツハイマー病（ＡＤ）症候、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、進行性核上麻痺、ボクサー認知症、及び大脳皮質基底核変性症、ならびにグラム陽性及びグラム陰性細菌の一方又は両方に感染している個人及び他の動物が挙げられる。
企図する化合物による配列番号１のペンタペプチドへの結合阻害は、実施例１に説明されるとおりに測定される。企図する化合物は、その企図する化合物の使用濃度において、ＦＬＮＡの他の部分のどことも実質的に結合しない。ＦＬＮＡの他の部分のどことも実質的に結合しないことは、本明細書中の図４８Ａ［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ３（２）：ｅ１５５４ （２００８）の図３］に示されるものなどの滴定アッセイを用いて測定することができる。滴定アッセイは、その図において、２つの結合部位領域が存在することを、プロットに示される２つの屈曲点で示すが、単一の結合部位が存在することは、そのようなプロットに単一の屈曲点が存在することで示される（図４８Ｄ）。ＦＬＮＡの他の部分のどことも実質的に結合しないことは、本明細書中以下に示すサイトカイン放出アッセイなどの機能データからも推測することができ、サイトカイン放出アッセイは、企図する化合物が、ＦＬＮＡの第二の部位に結合しないことを示す。その理由は、ＦＬＮＡにある２つの結合部位に結合する化合物（ナロキソン及びナルトレキソンなど）とは異なり、この化合物が広範囲の濃度にわたって有効だからである。
本発明の好適な実施形態において、本発明は、Ｓ202、Ｔ231、及びＴ181の１つ又は複数でのτタンパク質リン酸化を阻害する方法を目論んでおり、本方法は、必要が認められる（診断された）中枢神経系細胞（脳細胞など）に、１種又は複数の系列Ａ、系列Ｂ、系列Ｃ−１及び系列Ｃ−２、系列Ｄ、及び系列Ｅの化合物、立体異性体、又はその薬学的に許容可能な塩を有効量で投与する工程を含む。ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで、必要が認められる（診断された）細胞（脳細胞など）とは、外傷性脳損傷などの脳損傷、慢性外傷性脳障害により誘導される免疫応答（炎症など）を示している哺乳類対象の組織又は器官の細胞、アルツハイマー病（ＡＤ）症候、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、進行性核上麻痺、ボクサー認知症、及び大脳皮質基底核変性症の、ならびにグラム陽性及びグラム陰性細菌の一方又は両方に感染している対象の細胞である。
投与は、好ましくは、ＭＯＲ結合有効量の別個のＭＯＲアゴニスト又はアンタゴニスト分子が存在しない状態で行われ、数日間又は数ヶ月間の期間にわたって複数回行われることが多い。
同じく企図するのは、治療の必要が認められる中枢神経系細胞においてτタンパク質リン酸化を阻害する薬物を製造するための、化合物又はその薬学的に許容可能な塩の使用である。そのような化合物又はその塩は、配列番号１のフィラミンＡのペンタペプチドと結合し、その化合物又は塩が１０μＭ濃度で存在し、同濃度で対照阻害剤として未標識のナロキソンを用いた場合に、ＦＩＴＣ標識化ナロキソン結合を少なくとも約６０％阻害し、好ましくは約７０％阻害する。この使用は、足場タンパク質フィラミンＡ（ＦＬＮＡ）を介したＡβとα７ｎＡＣｈＲの相互作用を通じたτ過剰リン酸化（リン酸化）、ならびにＴＬＲ４媒介性免疫応答を介して生じるそのようなτ過剰リン酸化を阻害する薬物の製造を企図する。上記のとおり、ＴＬＲ４媒介性免疫応答を介して生じるそのようなτ過剰リン酸化も、ＦＮＬＡの仲介が関与していると思われる。
各系列の化合物の一般構造を、以下に示し、続いて各文字及びＲ基についてより具体的に説明する。
Figure 0006630374
上記式のそれら化合物の個々の光学異性体及び光学異性体混合物も考慮に入っており、それら化合物の薬学的に許容可能な塩も考慮に入っている。
上記の企図する化合物又はその薬学的に許容可能な塩は、典型的には、薬学的組成物に有効量で溶解した又は分散した状態で投与される。この薬学的組成物は、固形も液状も可能である。
本発明は、以下の方法も企図する。
ａ）α７ｎＡＣｈＲ−ＦＬＮＡ会合（複合体形成）を阻害する方法；
ｂ）Ａβが誘導する、細胞外シグナル制御キナーゼ２［ＥＲＫ２；分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ１（ＭＡＰＫ１）としても既知］のα７ｎＡＣｈＲ媒介性シグナル伝達を阻害する方法；
ｃ）Ａβ42が誘導するＴＬＲ４とＦＬＮＡの会合を阻害する方法；
ｄ）Ａβ42が誘導するα７ｎＡＣｈＲ機能（例えば、α７ｎＡＣｈＲ刺激後のカルシウム流入）障害を阻害する方法；
ｅ）Ａβ42が誘導するＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体（ＮＭＤＡＲ）機能（例えば、ＮＭＤＡＲをコアゴニストであるＮＭＤＡ及びグリシンで刺激した後のカルシウム流入）障害を修復する方法；
ｆ）サブユニットＩＲβのリン酸化及びＩＲＳ−１シグナル伝達分子との会合の一方又は両方で測定されるとおりの、Ａβ42が誘導するインシュリン受容体（ＩＲ）機能障害を修復する方法；
ｇ）Ａβ42が誘導するＫ+誘発性細胞カルシウム流入障害を阻害する方法；
ｈ）Ａβ42存在下でのτ含有ＮＦＴ形成及びＡβ42凝集（老人斑）を減少させる方法；ならびに
ｉ）Ａβ42が誘導する炎症性サイトカイン産生を阻害する方法。これらの方法は、それぞれが、中枢神経系の細胞（脳細胞など）に、配列番号１のＦＬＮＡペンタペプチドと結合する上記化合物を有効量で投与することで行われる。投与は、ＭＯＲ結合有効量の別個のＭＯＲアゴニスト又はアンタゴニスト分子が存在しない状態で行われる。
本発明の更に他の態様は、変形性関節症（コラーゲン分解酵素及び／又は手術又は他の原因により誘導されるものなど）を有する哺乳類において、軟骨修復を促進する方法を企図する。この方法は、そのような修復の必要が認められる（診断された）哺乳類の多能性間葉系幹細胞に、フィラミンＡ（ＦＬＮＡ）と又は例えば実施例１に記載されるとおりの配列番号１のフィラミンＡのペンタペプチドと結合する化合物又はその薬学的に許容可能な塩であって、その化合物又は塩が１０μＭ濃度で存在し、同濃度で対照阻害剤として未標識のナロキソンを用いた場合に、ＦＩＴＣ標識化ナロキソン結合を少なくとも約６０％阻害し、好ましくは約７０％阻害する化合物又はその塩を有効量で投与する工程を含む。化合物は、好ましくは本明細書中以下に記載されるとおりの系列Ａ、Ｂ、Ｃ−１、Ｃ−２、Ｄ、もしくはＥの化合物であり、かつ好ましくは図３５〜図４０の６つのファルマコフォアのうち少なくとも４つを有する。投与は、μオピオイド受容体（ＭＯＲ）結合有効量の別個のＭＯＲアゴニスト又はアンタゴニスト分子が存在しない状態で行われる。
企図する立体異性化合物の、単一の立体異性体もしくは立体異性体混合物、又はその薬学的に許容可能な塩の使用も企図する。企図する投与は、ｉｎ ｖｉｖｏでもｉｎ ｖｉｔｒｏでも行うことができ、ｉｎ ｖｉｖｏで投与される場合、典型的には繰り返される。
本発明は、複数の有益性及び利点を有する。
有益性の１つは、企図する方法が、α７ｎＡＣｈＲを通じたＡβシグナル伝達を阻害するものであり、受容体そのものを標的とするより優れていると思われることである。α７ｎＡＣｈＲに直接影響を及ぼすことなく、Ａβが誘導するα７ｎＡＣｈＲシグナル伝達を不可能にすることにより、受容体アゴニスト又はアンタゴニストの慢性使用に伴う潜行性の問題である受容体の感受性又は細胞表面レベルの変更が回避される。
本発明の利点は、このアプローチが、基礎の結合は保存しつつも、Ａβによるフィラミン補充の頑強な増加に選択的に影響を及ぼすらしいことであり、このことは、本方法で用いられる化合物が、生理的α７ｎＡＣｈＲシグナル伝達を保持しつつも、Ａβによる病的シグナル伝達を減少させることを示唆している。
本発明の別の有益性は、企図する化合物の投与が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏのτタンパク質リン酸化を阻害することである。
本発明の別の利点は、企図する化合物がｉｎ ｖｉｖｏで投与される場合、その投与は、企図する化合物が投与される対象哺乳類の脳でＮＦＴの形成を阻害することである。
本発明の更に別の有益性は、企図する化合物を投与することで、その化合物と配列番号１のＦＬＮＡペンタペプチドの結合により、新規に見いだされたＦＬＮＡ相互作用の１つ又は複数が妨害され、上記に列挙される１つ又は複数の方法の有益性を提供することができることである。
本発明の更に別の利点は、本発明を利用することで、頭部を損傷した個人又は他の動物でのτリン酸化及びその結果のＴＬＲ４媒介性炎症の影響を小さくできることである。
更に他の有益性及び利点は、以下の開示から当業者に明らかとなるだろう。
本開示の一部をなす図面において、
ＡＤ遺伝子導入マウス及びＡＤ患者の前頭皮質におけるα７ｎＡＣｈＲ−ＦＬＮＡ会合の増大を示す。６ヶ月齢のＡＤ遺伝子導入／野生型マウス（ｎ＝４）及び４組の一致するＡＤ／対象者ヒト対由来の前頭皮質のシナプトソームを、それらのα７ｎＡＣｈＲ−ＦＬＮＡ複合体含有量のベースラインについて分析した。溶解させた前頭皮質のシナプトソーム中のα７ｎＡＣｈＲ−ＦＬＮＡ複合体を、抗ＦＬＮＡで免疫沈降させ、抗ＦＬＮＡ免疫沈降物中のα７ｎＡＣｈＲレベルを、抗α７ｎＡＣｈＲ抗体を用いるウエスタンブロット法で測定した。次いで、ブロットを剥離させ、添加対照として抗ＦＬＮＡを用いて再探索した。比重走査測定を用いて定量した。 ２枚のパネル、図２Ａ及び図２Ｂにて、高親和性ＦＬＮＡ結合化合物により、α７ｎＡＣｈＲ−ＦＬＮＡ会合が減少することを示す。２ヶ月齢のラット（ｎ＝４）由来の前頭皮質のシナプトソームを、Ａβ42と同時（Ｓｉｍ）に又はそれより１０分前（１０’ｐｒ）にのいずれかで、０．１ｎＭ濃度又は１ｎＭ濃度の化合物［Ａ００３３、Ａ００４０、Ａ００５３、Ａ００６８、Ｂ００５５、Ｃ０１０５Ｍ、Ｃ０１１４Ｍ、Ｃ０１３７Ｍ、及びＣ０１３８Ｍ］で処理し、それらのα７ｎＡＣｈＲ−ＦＬＮＡ複合体含有量を分析した。溶解させたシナプトソーム中のα７ｎＡＣｈＲ−ＦＬＮＡ複合体を、固定化抗ＦＬＮＡで免疫沈降させ、抗ＦＬＮＡ免疫沈降物中のα７ｎＡＣｈＲ及びＦＬＮＡレベルを、ウエスタンブロット法で求め（図２Ａ）、濃度測定法により定量した（図２Ｂ）。ｎ＝３。データは、平均±ＳＥＭである。**ｐ＜０．０５、*ｐ＜０．０１は、Ａβ42単独に対して。「Ｃ系列」化合物の多くに付随する文字記号「Ｍ」は、表示を見やすくするため、図２、残りの図、及び本明細書中以下の図面及び化合物の説明の大部分において、省略してある。この図及びその他の図に用いられている化合物の構造式は、本明細書中以下で提供する。 ２枚のパネル、図２Ａ及び図２Ｂにて、高親和性ＦＬＮＡ結合化合物により、α７ｎＡＣｈＲ−ＦＬＮＡ会合が減少することを示す。２ヶ月齢のラット（ｎ＝４）由来の前頭皮質のシナプトソームを、Ａβ42と同時（Ｓｉｍ）に又はそれより１０分前（１０’ｐｒ）にのいずれかで、０．１ｎＭ濃度又は１ｎＭ濃度の化合物［Ａ００３３、Ａ００４０、Ａ００５３、Ａ００６８、Ｂ００５５、Ｃ０１０５Ｍ、Ｃ０１１４Ｍ、Ｃ０１３７Ｍ、及びＣ０１３８Ｍ］で処理し、それらのα７ｎＡＣｈＲ−ＦＬＮＡ複合体含有量を分析した。溶解させたシナプトソーム中のα７ｎＡＣｈＲ−ＦＬＮＡ複合体を、固定化抗ＦＬＮＡで免疫沈降させ、抗ＦＬＮＡ免疫沈降物中のα７ｎＡＣｈＲ及びＦＬＮＡレベルを、ウエスタンブロット法で求め（図２Ａ）、濃度測定法により定量した（図２Ｂ）。ｎ＝３。データは、平均±ＳＥＭである。**ｐ＜０．０５、*ｐ＜０．０１は、Ａβ42単独に対して。「Ｃ系列」化合物の多くに付随する文字記号「Ｍ」は、表示を見やすくするため、図２、残りの図、及び本明細書中以下の図面及び化合物の説明の大部分において、省略してある。この図及びその他の図に用いられている化合物の構造式は、本明細書中以下で提供する。 ２枚のパネル、図３Ａ及び図３Ｂにて、ＦＬＮＡ結合化合物により、Ａβが誘導するα７ｎＡＣｈＲ媒介性ＥＲＫ２シグナル伝達が減少することを示す。図２で用いたのと同じ処理済シナプトソームで、ＥＲＫ２の免疫沈降物中のリン酸化（活性化）ＥＲＫ２のレベルを測定した。Ａβ42は、細胞外シグナル制御キナーゼ２［ＥＲＫ２；分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ１（ＭＡＰＫ１）としても既知］を強力に活性化したが、試験した化合物は全て、１０分の前処理で、この活性化を減少させた。化合物Ｃ０１０５は、同時投与でもｐＥＲＫ２を減少させた。４種の化合物について、免疫沈降物をウエスタンブロット法により測定し（図３Ａ）、濃度測定定量により分析した（図３Ｂ）。ｎ＝３。データは、平均±ＳＥＭである。**ｐ＜０．０５、*ｐ＜０．０１は、Ａβ42単独に対して。 ２枚のパネル、図３Ａ及び図３Ｂにて、ＦＬＮＡ結合化合物により、Ａβが誘導するα７ｎＡＣｈＲ媒介性ＥＲＫ２シグナル伝達が減少することを示す。図２で用いたのと同じ処理済シナプトソームで、ＥＲＫ２の免疫沈降物中のリン酸化（活性化）ＥＲＫ２のレベルを測定した。Ａβ42は、細胞外シグナル制御キナーゼ２［ＥＲＫ２；分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ１（ＭＡＰＫ１）としても既知］を強力に活性化したが、試験した化合物は全て、１０分の前処理で、この活性化を減少させた。化合物Ｃ０１０５は、同時投与でもｐＥＲＫ２を減少させた。４種の化合物について、免疫沈降物をウエスタンブロット法により測定し（図３Ａ）、濃度測定定量により分析した（図３Ｂ）。ｎ＝３。データは、平均±ＳＥＭである。**ｐ＜０．０５、*ｐ＜０．０１は、Ａβ42単独に対して。 ４枚のパネル、図４Ａ〜図４Ｄにて、ＦＬＮＡ結合化合物により、τリン酸化が３つのリン酸化部位全てで減少することを示す。図２及び図３で用いたのと同じ処理済シナプトソームで、抗τ抗体を用いた免疫沈降物中のＳ202、Ｔ231、及びＴ181でのτタンパク質リン酸化のレベルを測定した。用いた抗τ抗体は、τタンパク質のリン酸化状態を識別しない。免疫沈降物中のτの３種のホスホエピトープを、特異的抗体を用いて検出した。Ａβ42は３つの部位全てでτリン酸化を強力に促進するが、化合物は全て、１０分の前処理で、このリン酸化を減少させた。化合物Ｃ０１０５は、同時投与でもτリン酸化を減少させた。免疫沈降物を、ウエスタンブロット法により測定し（図４Ａ〜図４Ｃ）、濃度測定法により定量した（図４Ｄ）。データは、平均±ＳＥＭである。**ｐ＜０．０５、*ｐ＜０．０１は、Ａβ42単独に対して。 ４枚のパネル、図４Ａ〜図４Ｄにて、ＦＬＮＡ結合化合物により、τリン酸化が３つのリン酸化部位全てで減少することを示す。図２及び図３で用いたのと同じ処理済シナプトソームで、抗τ抗体を用いた免疫沈降物中のＳ202、Ｔ231、及びＴ181でのτタンパク質リン酸化のレベルを測定した。用いた抗τ抗体は、τタンパク質のリン酸化状態を識別しない。免疫沈降物中のτの３種のホスホエピトープを、特異的抗体を用いて検出した。Ａβ42は３つの部位全てでτリン酸化を強力に促進するが、化合物は全て、１０分の前処理で、このリン酸化を減少させた。化合物Ｃ０１０５は、同時投与でもτリン酸化を減少させた。免疫沈降物を、ウエスタンブロット法により測定し（図４Ａ〜図４Ｃ）、濃度測定法により定量した（図４Ｄ）。データは、平均±ＳＥＭである。**ｐ＜０．０５、*ｐ＜０．０１は、Ａβ42単独に対して。 ４枚のパネル、図４Ａ〜図４Ｄにて、ＦＬＮＡ結合化合物により、τリン酸化が３つのリン酸化部位全てで減少することを示す。図２及び図３で用いたのと同じ処理済シナプトソームで、抗τ抗体を用いた免疫沈降物中のＳ202、Ｔ231、及びＴ181でのτタンパク質リン酸化のレベルを測定した。用いた抗τ抗体は、τタンパク質のリン酸化状態を識別しない。免疫沈降物中のτの３種のホスホエピトープを、特異的抗体を用いて検出した。Ａβ42は３つの部位全てでτリン酸化を強力に促進するが、化合物は全て、１０分の前処理で、このリン酸化を減少させた。化合物Ｃ０１０５は、同時投与でもτリン酸化を減少させた。免疫沈降物を、ウエスタンブロット法により測定し（図４Ａ〜図４Ｃ）、濃度測定法により定量した（図４Ｄ）。データは、平均±ＳＥＭである。**ｐ＜０．０５、*ｐ＜０．０１は、Ａβ42単独に対して。 ４枚のパネル、図４Ａ〜図４Ｄにて、ＦＬＮＡ結合化合物により、τリン酸化が３つのリン酸化部位全てで減少することを示す。図２及び図３で用いたのと同じ処理済シナプトソームで、抗τ抗体を用いた免疫沈降物中のＳ202、Ｔ231、及びＴ181でのτタンパク質リン酸化のレベルを測定した。用いた抗τ抗体は、τタンパク質のリン酸化状態を識別しない。免疫沈降物中のτの３種のホスホエピトープを、特異的抗体を用いて検出した。Ａβ42は３つの部位全てでτリン酸化を強力に促進するが、化合物は全て、１０分の前処理で、このリン酸化を減少させた。化合物Ｃ０１０５は、同時投与でもτリン酸化を減少させた。免疫沈降物を、ウエスタンブロット法により測定し（図４Ａ〜図４Ｃ）、濃度測定法により定量した（図４Ｄ）。データは、平均±ＳＥＭである。**ｐ＜０．０５、*ｐ＜０．０１は、Ａβ42単独に対して。 ３枚のパネルにて、化合物Ｃ０１０５及び化合物Ｃ０１１４により、Ａβ42が誘導するＦＬＮＡとα７ｎＡＣｈＲ及びＴＬＲ４の会合の増加が減少することを示す。０．１ｎＭ濃度又は１ｎＭ濃度の化合物をＡβ42と同時に用いて処理した器官型ＦＣＸ切片培養物からシナプトソームを調製し、それらのα７ｎＡＣｈＲ−ＦＬＮＡ複合体含有量について分析した。溶解させたシナプトソーム中の、α７ｎＡＣｈＲ、ＴＬＲ４、ＩＲ、及びＭＯＲとの、ＦＬＮＡ会合の程度を、固定化抗ＦＬＮＡを用いて免疫沈降させ、各受容体に特異的な抗体を用いてウエスタンブロット法により検出する（図５Ａ）ことにより査定した。ブロットを、濃度測定定量により分析した（図５Ｂ）。Ａβ42は、α７ｎＡＣｈＲ及びＴＬＲ４とＦＬＮＡとの会合を大きく増加させたが、ＩＲ及びＭＯＲとＦＬＮＡとの会合レベルは、変化しなかった。Ｃ０１０５及びＣ０１１４は、これらのＡβ42が誘導する増加を低下させた。阻害パーセントを、図５Ｃに示す。ｎ＝３。データは、平均±ＳＥＭである。**ｐ＜０．０５、*ｐ＜０．０１は、Ａβ42単独に対して；＃ｐ＜０．０１は、ビヒクルに対して。 ３枚のパネルにて、化合物Ｃ０１０５及び化合物Ｃ０１１４により、Ａβ42が誘導するＦＬＮＡとα７ｎＡＣｈＲ及びＴＬＲ４の会合の増加が減少することを示す。０．１ｎＭ濃度又は１ｎＭ濃度の化合物をＡβ42と同時に用いて処理した器官型ＦＣＸ切片培養物からシナプトソームを調製し、それらのα７ｎＡＣｈＲ−ＦＬＮＡ複合体含有量について分析した。溶解させたシナプトソーム中の、α７ｎＡＣｈＲ、ＴＬＲ４、ＩＲ、及びＭＯＲとの、ＦＬＮＡ会合の程度を、固定化抗ＦＬＮＡを用いて免疫沈降させ、各受容体に特異的な抗体を用いてウエスタンブロット法により検出する（図５Ａ）ことにより査定した。ブロットを、濃度測定定量により分析した（図５Ｂ）。Ａβ42は、α７ｎＡＣｈＲ及びＴＬＲ４とＦＬＮＡとの会合を大きく増加させたが、ＩＲ及びＭＯＲとＦＬＮＡとの会合レベルは、変化しなかった。Ｃ０１０５及びＣ０１１４は、これらのＡβ42が誘導する増加を低下させた。阻害パーセントを、図５Ｃに示す。ｎ＝３。データは、平均±ＳＥＭである。**ｐ＜０．０５、*ｐ＜０．０１は、Ａβ42単独に対して；＃ｐ＜０．０１は、ビヒクルに対して。 ３枚のパネルにて、化合物Ｃ０１０５及び化合物Ｃ０１１４により、Ａβ42が誘導するＦＬＮＡとα７ｎＡＣｈＲ及びＴＬＲ４の会合の増加が減少することを示す。０．１ｎＭ濃度又は１ｎＭ濃度の化合物をＡβ42と同時に用いて処理した器官型ＦＣＸ切片培養物からシナプトソームを調製し、それらのα７ｎＡＣｈＲ−ＦＬＮＡ複合体含有量について分析した。溶解させたシナプトソーム中の、α７ｎＡＣｈＲ、ＴＬＲ４、ＩＲ、及びＭＯＲとの、ＦＬＮＡ会合の程度を、固定化抗ＦＬＮＡを用いて免疫沈降させ、各受容体に特異的な抗体を用いてウエスタンブロット法により検出する（図５Ａ）ことにより査定した。ブロットを、濃度測定定量により分析した（図５Ｂ）。Ａβ42は、α７ｎＡＣｈＲ及びＴＬＲ４とＦＬＮＡとの会合を大きく増加させたが、ＩＲ及びＭＯＲとＦＬＮＡとの会合レベルは、変化しなかった。Ｃ０１０５及びＣ０１１４は、これらのＡβ42が誘導する増加を低下させた。阻害パーセントを、図５Ｃに示す。ｎ＝３。データは、平均±ＳＥＭである。**ｐ＜０．０５、*ｐ＜０．０１は、Ａβ42単独に対して；＃ｐ＜０．０１は、ビヒクルに対して。 ３枚のパネルにて、シナプトソームを、化合物Ｃ０１０５（０．１ｎＭ、１ｎＭ、及び１０ｎＭ）及び化合物Ｃ０１１４（１ｎＭ及び１０ｎＭ）と接触させると、τリン酸化が３つのリン酸化部位全てで減少したことを示す。図５で用いたのと同じ処理済シナプトソームで、抗τ抗体を用いた免疫沈降物中のＳ202、Ｔ231、及びＴ181でリン酸化されたτタンパク質のレベルを測定した。用いた抗τ抗体は、τタンパク質のリン酸化状態を識別しない。免疫沈降物中のτの３種のホスホエピトープを、特異的抗体を用いて検出した。Ａβ42は３つの部位全てでτリン酸化を強力に促進するが、化合物は両方とも、このリン酸化を有意に減少させた。ウエスタンブロット（図６Ａ）を、濃度測定定量により分析した（図６Ｂ）。阻害パーセントを、図６Ｃに示す。ｎ＝３。データは、平均±ＳＥＭである。**ｐ＜０．０５、*ｐ＜０．０１は、Ａβ42単独に対して；＃ｐ＜０．００１、＃＃ｐ＜０．００７、＃＃＃ｐ＜０．００３は、Ａβ42を含まないビヒクル群に対して。 ３枚のパネルにて、シナプトソームを、化合物Ｃ０１０５（０．１ｎＭ、１ｎＭ、及び１０ｎＭ）及び化合物Ｃ０１１４（１ｎＭ及び１０ｎＭ）と接触させると、τリン酸化が３つのリン酸化部位全てで減少したことを示す。図５で用いたのと同じ処理済シナプトソームで、抗τ抗体を用いた免疫沈降物中のＳ202、Ｔ231、及びＴ181でリン酸化されたτタンパク質のレベルを測定した。用いた抗τ抗体は、τタンパク質のリン酸化状態を識別しない。免疫沈降物中のτの３種のホスホエピトープを、特異的抗体を用いて検出した。Ａβ42は３つの部位全てでτリン酸化を強力に促進するが、化合物は両方とも、このリン酸化を有意に減少させた。ウエスタンブロット（図６Ａ）を、濃度測定定量により分析した（図６Ｂ）。阻害パーセントを、図６Ｃに示す。ｎ＝３。データは、平均±ＳＥＭである。**ｐ＜０．０５、*ｐ＜０．０１は、Ａβ42単独に対して；＃ｐ＜０．００１、＃＃ｐ＜０．００７、＃＃＃ｐ＜０．００３は、Ａβ42を含まないビヒクル群に対して。 ３枚のパネルにて、シナプトソームを、化合物Ｃ０１０５（０．１ｎＭ、１ｎＭ、及び１０ｎＭ）及び化合物Ｃ０１１４（１ｎＭ及び１０ｎＭ）と接触させると、τリン酸化が３つのリン酸化部位全てで減少したことを示す。図５で用いたのと同じ処理済シナプトソームで、抗τ抗体を用いた免疫沈降物中のＳ202、Ｔ231、及びＴ181でリン酸化されたτタンパク質のレベルを測定した。用いた抗τ抗体は、τタンパク質のリン酸化状態を識別しない。免疫沈降物中のτの３種のホスホエピトープを、特異的抗体を用いて検出した。Ａβ42は３つの部位全てでτリン酸化を強力に促進するが、化合物は両方とも、このリン酸化を有意に減少させた。ウエスタンブロット（図６Ａ）を、濃度測定定量により分析した（図６Ｂ）。阻害パーセントを、図６Ｃに示す。ｎ＝３。データは、平均±ＳＥＭである。**ｐ＜０．０５、*ｐ＜０．０１は、Ａβ42単独に対して；＃ｐ＜０．００１、＃＃ｐ＜０．００７、＃＃＃ｐ＜０．００３は、Ａβ42を含まないビヒクル群に対して。 化合物Ｃ０１０５及び化合物Ｃ０１１４のそれぞれにより、Ａβ42が誘導するα７ｎＡＣｈＲ機能障害が回復することを示す。処理済ＦＣＸ培養物由来の同じシナプトソームで、Ａβ42は、ＰＮＵ２８２９８７（α７ｎＡＣｈＲの全アゴニスト）による刺激後のカルシウム流入を有意に障害するが、化合物Ｃ０１０５及び化合物Ｃ０１１４は、それぞれ、この障害を防ぐ。ｎ＝３。データは、平均±ＳＥＭである。*ｐ＜０．０１は、ビヒクルに対して；＃ｐ＜０．０１は、Ａβ42単独に対して。 化合物Ｃ０１０５及び化合物Ｃ０１１４のそれぞれにより、Ａβ42が誘導するＮＭＤＡＲ機能障害が回復することを示す。Ａβ42は、ＮＭＤＡ及びグリシン（ＮＭＤＡＲのコアゴニスト）による刺激後のカルシウム流入を有意に障害するが、化合物Ｃ０１０５及び化合物Ｃ０１１４は、それぞれ、この障害を防ぐ。ｎ＝３。データは、平均±ＳＥＭである。*ｐ＜０．０１は、ビヒクルに対して；＃＃ｐ＜０．０５、＃ｐ＜０．０１は、Ａβ42単独に対して。 ２枚のパネルにて、化合物Ｃ０１０５及び化合物Ｃ０１１４のそれぞれにより、ＮＭＤＡＲ付随シグナル伝達分子のレベルが回復することを示す。グリシン及びＮＭＤＡで同時刺激した後、ＮＲ−１（ＮＭＤＡＲの必須サブユニット）で免疫共沈する６種の異なるシグナル伝達分子のレベルを測定することで、ＮＭＤＡＲのシグナル伝達機能を査定した（図９Ａ）。Ａβ42は、６種のシグナル伝達構成要素全てでＮＲ−１との会合レベルを抑制し、図８に示したＮＭＤＡＲ機能障害を裏付けた（図９Ｂ）。ｎ＝３。データは、平均±ＳＥＭである。**ｐ＜０．０５、*ｐ＜０．０１は、Ａβ42単独に対して；＃ｐ＜０．０１は、ビヒクルに対して。 ２枚のパネルにて、化合物Ｃ０１０５及び化合物Ｃ０１１４のそれぞれにより、ＮＭＤＡＲ付随シグナル伝達分子のレベルが回復することを示す。グリシン及びＮＭＤＡで同時刺激した後、ＮＲ−１（ＮＭＤＡＲの必須サブユニット）で免疫共沈する６種の異なるシグナル伝達分子のレベルを測定することで、ＮＭＤＡＲのシグナル伝達機能を査定した（図９Ａ）。Ａβ42は、６種のシグナル伝達構成要素全てでＮＲ−１との会合レベルを抑制し、図８に示したＮＭＤＡＲ機能障害を裏付けた（図９Ｂ）。ｎ＝３。データは、平均±ＳＥＭである。**ｐ＜０．０５、*ｐ＜０．０１は、Ａβ42単独に対して；＃ｐ＜０．０１は、ビヒクルに対して。 ２枚のパネル、Ｃ０１０５及びＣ０１１４にて、化合物Ｃ０１０５及び化合物Ｃ０１１４のそれぞれにより、Ａβ42が誘導するＩＲ機能障害が回復することを示す。Ａβ42は、ウエスタンブロット（図１０Ａ）及び濃度測定法（図１０Ｂ）に示されるとおり、ＩＲβのリン酸化及びＩＲβとシグナル伝達分子ＩＲＳ−１との会合により測定されるとおり、ＩＲのシグナル伝達を障害した。*ｐ＜０．０１は、Ａβ42単独に対して；＃ｐ＜０．０１は、ビヒクルに対して。 ２枚のパネル、Ｃ０１０５及びＣ０１１４にて、化合物Ｃ０１０５及び化合物Ｃ０１１４のそれぞれにより、Ａβ42が誘導するＩＲ機能障害が回復することを示す。Ａβ42は、ウエスタンブロット（図１０Ａ）及び濃度測定法（図１０Ｂ）に示されるとおり、ＩＲβのリン酸化及びＩＲβとシグナル伝達分子ＩＲＳ−１との会合により測定されるとおり、ＩＲのシグナル伝達を障害した。*ｐ＜０．０１は、Ａβ42単独に対して；＃ｐ＜０．０１は、ビヒクルに対して。 化合物Ｃ０１０５及び化合物Ｃ０１１４のそれぞれにより、Ｋ+誘発性カルシウム流入の減少で示されるとおりの細胞死が減少する可能性があることを示す。Ａβ42は、Ｋ+誘発性Ｃａ+2流入を減少させ、細胞死又は非機能化を示した。細胞を化合物Ｃ０１０５及び化合物Ｃ０１１４いずれかと接触させると、このＡβ42が誘導する障害を防ぐ。ｎ＝３。データは、平均±ＳＥＭである。**ｐ＜０．０５、*ｐ＜０．０１は、ビヒクルに対して；＃ｐ＜０．０１は、Ａβ42単独に対して。 ２組の３枚のパネルにて、脳前頭皮質切片培養物に化合物Ｃ０１０５を投与すると、Ａβ42が誘導するＮＦＴが予防されることを示す。Ａβ42とともにインキュベートすると、リン酸化τ（ｐＴａｕ）免疫反応性により可視化されるとおり、ＮＦＴが産生された（図１２Ａ）。Ａβ42と化合物Ｃ０１０５で同時インキュベートすると、この神経病理が予防された（図１２Ｂ）。ビヒクル処理した切片を図１２Ｃに示す。下段のパネルは拡大したものである。 ２組の３枚のパネルにて、脳前頭皮質切片培養物に化合物Ｃ０１０５を投与すると、Ａβ42凝集物の免疫染色が劇的に減少することを示す。Ａβ42とともにインキュベートすると、Ａβ42免疫反応性により可視化されるとおり、アミロイド沈着物が産生された（図１３Ａ）が、Ａβ42と化合物Ｃ０１０５で同時インキュベートすると、この神経病理が予防された（図１３Ｂ）。ビヒクル処理した切片を図１３Ｃに示す。下段のパネルは拡大したものである。 ３部構成にて、化合物Ｃ０１０５をマウスに全身投与すると、Ａβ42が誘導するＦＬＮＡとα７ｎＡＣｈＲ及びトール様受容体４（ＴＬＲ４）との会合両方が減少したことを示す。すなわち、Ａβ42又はビヒクルの脳室内（ＩＣＶ）輸液を継続的に受け、加えて化合物Ｃ０１０５又はビヒクルを１日２回注射されたマウスの前頭前皮質及び海馬から調製したシナプトソームを、それらのＦＬＮＡ−α７ｎＡＣｈＲ／ＴＬＲ４相互作用について分析した。溶解させたシナプトソーム中で、固定化抗ＦＬＮＡで免疫沈降させ、各受容体に特異的な抗体を用いてウエスタンブロットで検出する（図１４Ａ）ことにより、ＦＬＮＡとα７ｎＡＣｈＲ又はＴＬＲ４との会合の度合いを査定した。ブロットの外側左にある数値は、ブロット内の分子量の位置である。ブロットを、濃度測定定量により分析した（図１４Ｂ）。Ａβ42は、α７ｎＡＣｈＲ及びＴＬＲ４とＦＬＮＡとの会合を大きく増加させたが、化合物Ｃ０１０５は、これらのＡβ42が誘導する増加を減少させた。図１４Ｃに、阻害パーセントを示す。ｎ＝３。データは、平均±ＳＥＭである。*ｐ＜０．０１は、偽、ビヒクルに対して；＃ｐ＜０．０１は、Ａβ42、ビヒクルに対して。 ３部構成にて、化合物Ｃ０１０５をマウスに全身投与すると、Ａβ42が誘導するＦＬＮＡとα７ｎＡＣｈＲ及びトール様受容体４（ＴＬＲ４）との会合両方が減少したことを示す。すなわち、Ａβ42又はビヒクルの脳室内（ＩＣＶ）輸液を継続的に受け、加えて化合物Ｃ０１０５又はビヒクルを１日２回注射されたマウスの前頭前皮質及び海馬から調製したシナプトソームを、それらのＦＬＮＡ−α７ｎＡＣｈＲ／ＴＬＲ４相互作用について分析した。溶解させたシナプトソーム中で、固定化抗ＦＬＮＡで免疫沈降させ、各受容体に特異的な抗体を用いてウエスタンブロットで検出する（図１４Ａ）ことにより、ＦＬＮＡとα７ｎＡＣｈＲ又はＴＬＲ４との会合の度合いを査定した。ブロットの外側左にある数値は、ブロット内の分子量の位置である。ブロットを、濃度測定定量により分析した（図１４Ｂ）。Ａβ42は、α７ｎＡＣｈＲ及びＴＬＲ４とＦＬＮＡとの会合を大きく増加させたが、化合物Ｃ０１０５は、これらのＡβ42が誘導する増加を減少させた。図１４Ｃに、阻害パーセントを示す。ｎ＝３。データは、平均±ＳＥＭである。*ｐ＜０．０１は、偽、ビヒクルに対して；＃ｐ＜０．０１は、Ａβ42、ビヒクルに対して。 ３部構成にて、化合物Ｃ０１０５をマウスに全身投与すると、Ａβ42が誘導するＦＬＮＡとα７ｎＡＣｈＲ及びトール様受容体４（ＴＬＲ４）との会合両方が減少したことを示す。すなわち、Ａβ42又はビヒクルの脳室内（ＩＣＶ）輸液を継続的に受け、加えて化合物Ｃ０１０５又はビヒクルを１日２回注射されたマウスの前頭前皮質及び海馬から調製したシナプトソームを、それらのＦＬＮＡ−α７ｎＡＣｈＲ／ＴＬＲ４相互作用について分析した。溶解させたシナプトソーム中で、固定化抗ＦＬＮＡで免疫沈降させ、各受容体に特異的な抗体を用いてウエスタンブロットで検出する（図１４Ａ）ことにより、ＦＬＮＡとα７ｎＡＣｈＲ又はＴＬＲ４との会合の度合いを査定した。ブロットの外側左にある数値は、ブロット内の分子量の位置である。ブロットを、濃度測定定量により分析した（図１４Ｂ）。Ａβ42は、α７ｎＡＣｈＲ及びＴＬＲ４とＦＬＮＡとの会合を大きく増加させたが、化合物Ｃ０１０５は、これらのＡβ42が誘導する増加を減少させた。図１４Ｃに、阻害パーセントを示す。ｎ＝３。データは、平均±ＳＥＭである。*ｐ＜０．０１は、偽、ビヒクルに対して；＃ｐ＜０．０１は、Ａβ42、ビヒクルに対して。 ３部構成にて、化合物Ｃ０１０５をマウスに投与すると、３つのリン酸化部位全てでτリン酸化が減少することを示す。図１４で用いたのと同じ処理済シナプトソームで、抗τ抗体を用いた免疫沈降物中のＳ202、Ｔ231、及びＴ181でリン酸化されたτタンパク質のレベルを測定した。用いた抗τ抗体は、τタンパク質のリン酸化状態を識別しない。免疫沈降物中のτの３種のホスホエピトープを、特異的抗体を用いて検出した。Ａβ42は３つの部位全てでτリン酸化を強力に促進するが、化合物は両方とも、このリン酸化を有意に減少させた。ウエスタンブロット（図１５Ａ）を、濃度測定定量により分析した（図１５Ｂ）。図１５Ａのブロットの外側左にある数値は、ブロット内の分子量の位置である。阻害パーセントを、図１５Ｃに示す。データは、平均±ＳＥＭである。*ｐ＜０．０１は、偽、ビヒクルに対して；＃ｐ＜０．０１は、Ａβ42、ビヒクルに対して。 ３部構成にて、化合物Ｃ０１０５をマウスに投与すると、３つのリン酸化部位全てでτリン酸化が減少することを示す。図１４で用いたのと同じ処理済シナプトソームで、抗τ抗体を用いた免疫沈降物中のＳ202、Ｔ231、及びＴ181でリン酸化されたτタンパク質のレベルを測定した。用いた抗τ抗体は、τタンパク質のリン酸化状態を識別しない。免疫沈降物中のτの３種のホスホエピトープを、特異的抗体を用いて検出した。Ａβ42は３つの部位全てでτリン酸化を強力に促進するが、化合物は両方とも、このリン酸化を有意に減少させた。ウエスタンブロット（図１５Ａ）を、濃度測定定量により分析した（図１５Ｂ）。図１５Ａのブロットの外側左にある数値は、ブロット内の分子量の位置である。阻害パーセントを、図１５Ｃに示す。データは、平均±ＳＥＭである。*ｐ＜０．０１は、偽、ビヒクルに対して；＃ｐ＜０．０１は、Ａβ42、ビヒクルに対して。 ３部構成にて、化合物Ｃ０１０５をマウスに投与すると、３つのリン酸化部位全てでτリン酸化が減少することを示す。図１４で用いたのと同じ処理済シナプトソームで、抗τ抗体を用いた免疫沈降物中のＳ202、Ｔ231、及びＴ181でリン酸化されたτタンパク質のレベルを測定した。用いた抗τ抗体は、τタンパク質のリン酸化状態を識別しない。免疫沈降物中のτの３種のホスホエピトープを、特異的抗体を用いて検出した。Ａβ42は３つの部位全てでτリン酸化を強力に促進するが、化合物は両方とも、このリン酸化を有意に減少させた。ウエスタンブロット（図１５Ａ）を、濃度測定定量により分析した（図１５Ｂ）。図１５Ａのブロットの外側左にある数値は、ブロット内の分子量の位置である。阻害パーセントを、図１５Ｃに示す。データは、平均±ＳＥＭである。*ｐ＜０．０１は、偽、ビヒクルに対して；＃ｐ＜０．０１は、Ａβ42、ビヒクルに対して。 ３部構成にて、化合物Ｃ０１０５をマウスに投与すると、Ａβ42−α７ｎＡＣｈＲ複合体が減少することを示す。マウスを１日２回化合物Ｃ０１０５で処置すると、前頭前皮質及び海馬の両方で、Ａβ42−α７ｎＡＣｈＲ複合体のレベルが大きく低下した；ｎ＝７又はｎ＝８。ウエスタンブロット（図１６Ａ）を、濃度測定定量により分析した（図１６Ｂ）。図１６Ａのブロットの外側左にある数値は、ブロット内の分子量の位置である。図１６Ｃに、阻害パーセントを示す。データは、平均±ＳＥＭである。*ｐ＜０．０１は、偽、ビヒクルに対して；＃ｐ＜０．０１は、Ａβ42、ビヒクルに対して。 ３部構成にて、化合物Ｃ０１０５をマウスに投与すると、Ａβ42−α７ｎＡＣｈＲ複合体が減少することを示す。マウスを１日２回化合物Ｃ０１０５で処置すると、前頭前皮質及び海馬の両方で、Ａβ42−α７ｎＡＣｈＲ複合体のレベルが大きく低下した；ｎ＝７又はｎ＝８。ウエスタンブロット（図１６Ａ）を、濃度測定定量により分析した（図１６Ｂ）。図１６Ａのブロットの外側左にある数値は、ブロット内の分子量の位置である。図１６Ｃに、阻害パーセントを示す。データは、平均±ＳＥＭである。*ｐ＜０．０１は、偽、ビヒクルに対して；＃ｐ＜０．０１は、Ａβ42、ビヒクルに対して。 ３部構成にて、化合物Ｃ０１０５をマウスに投与すると、Ａβ42−α７ｎＡＣｈＲ複合体が減少することを示す。マウスを１日２回化合物Ｃ０１０５で処置すると、前頭前皮質及び海馬の両方で、Ａβ42−α７ｎＡＣｈＲ複合体のレベルが大きく低下した；ｎ＝７又はｎ＝８。ウエスタンブロット（図１６Ａ）を、濃度測定定量により分析した（図１６Ｂ）。図１６Ａのブロットの外側左にある数値は、ブロット内の分子量の位置である。図１６Ｃに、阻害パーセントを示す。データは、平均±ＳＥＭである。*ｐ＜０．０１は、偽、ビヒクルに対して；＃ｐ＜０．０１は、Ａβ42、ビヒクルに対して。 化合物Ｃ０１０５での処置により、Ａβ42が誘導するα７ｎＡＣｈＲ機能不全が減少することを示す。マウスを１日２回化合物Ｃ０１０５で処置すると、全α７ｎＡＣｈＲアゴニストであるＰＮＵ２８２９８７を用いた刺激に続くカルシウム流入におけるＡβ42が誘導する障害が正常化した。ｎ＝７又はｎ＝８。データは、平均±ＳＥＭである。*ｐ＜０．０１は、偽、ビヒクルに対して；＃ｐ＜０．０１は、Ａβ42、ビヒクルに対して；＋ｐ＜０．０１は、ビヒクル処理及び化合物Ｃ０１０５処理した偽群に対して。 マウスを化合物Ｃ０１０５で処置すると、Ａβ42が誘導するＮＭＤＡＲ機能不全が減少することを示す。Ａβ42は、ＮＭＤＡ及びグリシン（ＮＭＤＡＲのコアゴニスト）を用いた刺激後のカルシウム流入を有意に障害するが、化合物Ｃ０１０５は、この障害を防ぐ。ｎ＝７又はｎ＝８。データは、平均±ＳＥＭである。*ｐ＜０．０１は、偽、ビヒクルに対して；＃ｐ＜０．０１は、Ａβ42、ビヒクルに対して；＋ｐ＜０．０１は、ビヒクル処理及び化合物Ｃ０１０５処理した偽群に対して。 マウスを化合物Ｃ０１０５で処置すると、Ｋ+誘発性Ｃａ+2流入で測定されるとおりの細胞死が減少することを示す。Ａβ42は、Ｋ+誘発性Ｃａ+2流入を減少させ、細胞死亡又は非機能化を示した。化合物Ｃ０１０５は、このＡβ42が誘導する障害を減少させる。ｎ＝７又はｎ＝８。データは、平均±ＳＥＭである。*ｐ＜０．０１は、偽、ビヒクルに対して；＃ｐ＜０．０１は、Ａβ42、ビヒクルに対して；＋＋ｐ＜０．０５は、ビヒクル処理及び化合物Ｃ０１０５処理した偽群に対して。 ２枚のパネルにて、マウスを化合物Ｃ０１０５で処置すると、Ａβ42が誘導するＮＭＤＡＲのシグナル伝達障害が正常化することを示す。ＮＭＤＡＲのシグナル伝達機能も、グリシン及びＮＭＤＡで同時刺激した後、ＮＲ−１（ＮＭＤＡＲの必須サブユニット）で免疫共沈する６種の異なるシグナル伝達分子（ＰＬＣγ、ｎＮＯＳ、ｐＹ402ＰｙＫ２、ＰＳＤ−９５、ＰＫＣγ、ｐＹ416Ｓｒｃ、及びＮＲ１）のレベルを測定することで査定した（図２０Ａ）。ブロットの外側左にある数値は上記のとおりである。Ａβ42は、６種のシグナル伝達構成要素全てでＮＲ−１との会合レベルを抑制し、図１８に示したＮＭＤＡＲ機能障害を裏付けた（図２０Ｂ）。ｎ＝７又はｎ＝８。データは、平均±ＳＥＭである。＋ｐ＜０．０１は、対照ビヒクル群の基本レベルに対して；*ｐ＜０．０１は、偽、ビヒクル群のＮＭＤＡ／グリシン刺激したレベルに対して；＃ｐ＜０．０１は、ＩＣＶのＡβ42、ビヒクルのＮＭＤＡ／グリシン刺激したレベルに対して。 ２枚のパネルにて、マウスを化合物Ｃ０１０５で処置すると、Ａβ42が誘導するＮＭＤＡＲのシグナル伝達障害が正常化することを示す。ＮＭＤＡＲのシグナル伝達機能も、グリシン及びＮＭＤＡで同時刺激した後、ＮＲ−１（ＮＭＤＡＲの必須サブユニット）で免疫共沈する６種の異なるシグナル伝達分子（ＰＬＣγ、ｎＮＯＳ、ｐＹ402ＰｙＫ２、ＰＳＤ−９５、ＰＫＣγ、ｐＹ416Ｓｒｃ、及びＮＲ１）のレベルを測定することで査定した（図２０Ａ）。ブロットの外側左にある数値は上記のとおりである。Ａβ42は、６種のシグナル伝達構成要素全てでＮＲ−１との会合レベルを抑制し、図１８に示したＮＭＤＡＲ機能障害を裏付けた（図２０Ｂ）。ｎ＝７又はｎ＝８。データは、平均±ＳＥＭである。＋ｐ＜０．０１は、対照ビヒクル群の基本レベルに対して；*ｐ＜０．０１は、偽、ビヒクル群のＮＭＤＡ／グリシン刺激したレベルに対して；＃ｐ＜０．０１は、ＩＣＶのＡβ42、ビヒクルのＮＭＤＡ／グリシン刺激したレベルに対して。 ２枚のパネルにて、マウスを化合物Ｃ０１０５で処置すると、Ａβ42が誘導するインシュリン受容体のシグナル伝達障害が正常化することを示す。Ａβ42は、ＩＲβのリン酸化及びＩＲβとシグナル伝達分子ＩＲＳ−１との会合により測定されるとおり、ＩＲのシグナル伝達を障害した。固定化抗ＩＲβを用いて行った免疫沈降を図２１Ａに示す。図中、ブロットの外側左にある数値は上記のとおりである。図２１Ｂに示す結果は、抗体を除去し、ニトロセルロース膜に移動させ、縦軸に示す種に対する抗体を用いてウエスタンブロットを行い、続いて濃度測定で定量して得られたものである。化合物Ｃ０１０５は、これらの障害を正常化した。ｎ＝７又はｎ＝８。データは、平均±ＳＥＭである。*ｐ＜０．０１は、偽、ビヒクル群のインシュリン刺激したレベルに対して；＃ｐ＜０．０１は、ＩＣＶのＡβ42、ビヒクル群のインシュリン刺激したレベルに対して。 ２枚のパネルにて、マウスを化合物Ｃ０１０５で処置すると、Ａβ42が誘導するインシュリン受容体のシグナル伝達障害が正常化することを示す。Ａβ42は、ＩＲβのリン酸化及びＩＲβとシグナル伝達分子ＩＲＳ−１との会合により測定されるとおり、ＩＲのシグナル伝達を障害した。固定化抗ＩＲβを用いて行った免疫沈降を図２１Ａに示す。図中、ブロットの外側左にある数値は上記のとおりである。図２１Ｂに示す結果は、抗体を除去し、ニトロセルロース膜に移動させ、縦軸に示す種に対する抗体を用いてウエスタンブロットを行い、続いて濃度測定で定量して得られたものである。化合物Ｃ０１０５は、これらの障害を正常化した。ｎ＝７又はｎ＝８。データは、平均±ＳＥＭである。*ｐ＜０．０１は、偽、ビヒクル群のインシュリン刺激したレベルに対して；＃ｐ＜０．０１は、ＩＣＶのＡβ42、ビヒクル群のインシュリン刺激したレベルに対して。 マウスを化合物Ｃ０１０５で処置すると、Ａβ42が誘導するサイトカイン産生がほぼ消失することを示す。Ａβ42は、ＦＩＴＣを用いた蛍光ＥＬＩＳＡアッセイで測定されるサイトカインＩＬ−６、ＴＮＦα、及びＩＬ−１βのレベルを上昇させた。化合物Ｃ０１０５は、これら３種のサイトカインの産生をほとんど消失させた。ｎ＝７又はｎ＝８。データは、平均±ＳＥＭである。*ｐ＜０．０１は、偽、ビヒクル群の各サイトカインレベルに対して；＃ｐ＜０．０１は、ＩＣＶのＡβ42、ビヒクル群の各サイトカインレベルに対して。 顕微鏡写真を含む２枚のパネルにて、マウスを化合物Ｃ０１０５で処置すると、ＮＦＴ免疫染色が劇的に減少することを示す。抗ホスホτ抗体で免疫染色した切片の代表的なもの（図２３Ａ）は、化合物Ｃ０１０５処置により、Ａβ42のＩＣＶ輸液を受けたマウスの前頭前皮質（ＦＣＸ）及び海馬（ＨＰ）の両方でＮＦＴ免疫染色が大きく減少したことを、はっきりと示す。全ての動物での光強度の定量（図２３Ｂ）から、化合物Ｃ０１０５により、両方の領域で、Ａβ42が誘導するＮＦＴ免疫反応性が有意に減少することが示される。＃ｐ＜０．０１は、Ａβ42対Ａβ42＋Ｃ０１０５、*ｐ＜０．０１は、偽に対して。 顕微鏡写真を含む２枚のパネルにて、マウスを化合物Ｃ０１０５で処置すると、ＮＦＴ免疫染色が劇的に減少することを示す。抗ホスホτ抗体で免疫染色した切片の代表的なもの（図２３Ａ）は、化合物Ｃ０１０５処置により、Ａβ42のＩＣＶ輸液を受けたマウスの前頭前皮質（ＦＣＸ）及び海馬（ＨＰ）の両方でＮＦＴ免疫染色が大きく減少したことを、はっきりと示す。全ての動物での光強度の定量（図２３Ｂ）から、化合物Ｃ０１０５により、両方の領域で、Ａβ42が誘導するＮＦＴ免疫反応性が有意に減少することが示される。＃ｐ＜０．０１は、Ａβ42対Ａβ42＋Ｃ０１０５、*ｐ＜０．０１は、偽に対して。 顕微鏡写真を含む２枚のパネルにて、マウスを化合物Ｃ０１０５で処置すると、Ａβ42凝集物の免疫染色が劇的に減少することを示す。Ａβ42凝集物について免疫染色した切片の代表的なもの（図２４Ａ）は、化合物Ｃ０１０５処置により、Ａβ42のＩＣＶ輸液を受けたマウスの前頭前皮質（ＦＣＸ）及び海馬（ＨＰ）の両方でＡβ42凝集物の免疫染色が大きく減少したことを、はっきりと示す。全ての動物での光強度の定量（図２４Ｂ）から、化合物Ｃ０１０５により、両方の領域で、Ａβ42が誘導するＮＦＴ免疫反応性が有意に減少することが示される。＃ｐ＜０．０１Ａβ42対Ａβ42＋Ｃ０１０５、*ｐ＜０．０１は、偽に対して。 顕微鏡写真を含む２枚のパネルにて、マウスを化合物Ｃ０１０５で処置すると、Ａβ42凝集物の免疫染色が劇的に減少することを示す。Ａβ42凝集物について免疫染色した切片の代表的なもの（図２４Ａ）は、化合物Ｃ０１０５処置により、Ａβ42のＩＣＶ輸液を受けたマウスの前頭前皮質（ＦＣＸ）及び海馬（ＨＰ）の両方でＡβ42凝集物の免疫染色が大きく減少したことを、はっきりと示す。全ての動物での光強度の定量（図２４Ｂ）から、化合物Ｃ０１０５により、両方の領域で、Ａβ42が誘導するＮＦＴ免疫反応性が有意に減少することが示される。＃ｐ＜０．０１Ａβ42対Ａβ42＋Ｃ０１０５、*ｐ＜０．０１は、偽に対して。 ５枚のパネルにて、化合物Ｃ０１０５が、ヒト死後ＡＤ脳組織及び対照脳組織において、Ａβ42が誘導するＦＬＮＡとα７ｎＡＣｈＲ及びＴＬＲ４との会合両方を減少させたことを示す。ＡＤ及び同年齢の対照の脳切片を、０．１ｎＭ濃度又は１ｎＭ濃度の化合物Ｃ０１０５で処理し、対照脳切片は同時にＡβ42でも処理した。溶解させたシナプトソーム中で、固定化抗ＦＬＮＡで免疫沈降させ、各受容体に特異的な抗体を用いてウエスタンブロットで検出する（図２５Ａ）ことにより、ＦＬＮＡとα７ｎＡＣｈＲ又はＴＬＲ４との会合の度合いを査定した。ブロットの外側左にある数値は、上記のとおりである。ブロットを、濃度測定定量により分析した（図２５Ｂ及び図２５Ｄ）。ＡＤ組織及びＡβ42処理した対照組織は、α７ｎＡＣｈＲ及びＴＬＲ４とＦＬＮＡとの会合の著しい増加を示したが、化合物Ｃ０１０５はそれらの会合を減少させた。図２５Ｃ及び図２５Ｅに、阻害パーセントを示す。ｎ＝１１。データは、平均±ＳＥＭである。*ｐ＜０．０１は、ビヒクル処理した対照に対して、＃ｐ＜０．０１は、Ａβ42処理した対照又はビヒクル処理したＡＤに対して。 ５枚のパネルにて、化合物Ｃ０１０５が、ヒト死後ＡＤ脳組織及び対照脳組織において、Ａβ42が誘導するＦＬＮＡとα７ｎＡＣｈＲ及びＴＬＲ４との会合両方を減少させたことを示す。ＡＤ及び同年齢の対照の脳切片を、０．１ｎＭ濃度又は１ｎＭ濃度の化合物Ｃ０１０５で処理し、対照脳切片は同時にＡβ42でも処理した。溶解させたシナプトソーム中で、固定化抗ＦＬＮＡで免疫沈降させ、各受容体に特異的な抗体を用いてウエスタンブロットで検出する（図２５Ａ）ことにより、ＦＬＮＡとα７ｎＡＣｈＲ又はＴＬＲ４との会合の度合いを査定した。ブロットの外側左にある数値は、上記のとおりである。ブロットを、濃度測定定量により分析した（図２５Ｂ及び図２５Ｄ）。ＡＤ組織及びＡβ42処理した対照組織は、α７ｎＡＣｈＲ及びＴＬＲ４とＦＬＮＡとの会合の著しい増加を示したが、化合物Ｃ０１０５はそれらの会合を減少させた。図２５Ｃ及び図２５Ｅに、阻害パーセントを示す。ｎ＝１１。データは、平均±ＳＥＭである。*ｐ＜０．０１は、ビヒクル処理した対照に対して、＃ｐ＜０．０１は、Ａβ42処理した対照又はビヒクル処理したＡＤに対して。 ５枚のパネルにて、化合物Ｃ０１０５が、ヒト死後ＡＤ脳組織及び対照脳組織において、Ａβ42が誘導するＦＬＮＡとα７ｎＡＣｈＲ及びＴＬＲ４との会合両方を減少させたことを示す。ＡＤ及び同年齢の対照の脳切片を、０．１ｎＭ濃度又は１ｎＭ濃度の化合物Ｃ０１０５で処理し、対照脳切片は同時にＡβ42でも処理した。溶解させたシナプトソーム中で、固定化抗ＦＬＮＡで免疫沈降させ、各受容体に特異的な抗体を用いてウエスタンブロットで検出する（図２５Ａ）ことにより、ＦＬＮＡとα７ｎＡＣｈＲ又はＴＬＲ４との会合の度合いを査定した。ブロットの外側左にある数値は、上記のとおりである。ブロットを、濃度測定定量により分析した（図２５Ｂ及び図２５Ｄ）。ＡＤ組織及びＡβ42処理した対照組織は、α７ｎＡＣｈＲ及びＴＬＲ４とＦＬＮＡとの会合の著しい増加を示したが、化合物Ｃ０１０５はそれらの会合を減少させた。図２５Ｃ及び図２５Ｅに、阻害パーセントを示す。ｎ＝１１。データは、平均±ＳＥＭである。*ｐ＜０．０１は、ビヒクル処理した対照に対して、＃ｐ＜０．０１は、Ａβ42処理した対照又はビヒクル処理したＡＤに対して。 ５枚のパネルにて、化合物Ｃ０１０５が、ヒト死後ＡＤ脳組織及び対照脳組織において、Ａβ42が誘導するＦＬＮＡとα７ｎＡＣｈＲ及びＴＬＲ４との会合両方を減少させたことを示す。ＡＤ及び同年齢の対照の脳切片を、０．１ｎＭ濃度又は１ｎＭ濃度の化合物Ｃ０１０５で処理し、対照脳切片は同時にＡβ42でも処理した。溶解させたシナプトソーム中で、固定化抗ＦＬＮＡで免疫沈降させ、各受容体に特異的な抗体を用いてウエスタンブロットで検出する（図２５Ａ）ことにより、ＦＬＮＡとα７ｎＡＣｈＲ又はＴＬＲ４との会合の度合いを査定した。ブロットの外側左にある数値は、上記のとおりである。ブロットを、濃度測定定量により分析した（図２５Ｂ及び図２５Ｄ）。ＡＤ組織及びＡβ42処理した対照組織は、α７ｎＡＣｈＲ及びＴＬＲ４とＦＬＮＡとの会合の著しい増加を示したが、化合物Ｃ０１０５はそれらの会合を減少させた。図２５Ｃ及び図２５Ｅに、阻害パーセントを示す。ｎ＝１１。データは、平均±ＳＥＭである。*ｐ＜０．０１は、ビヒクル処理した対照に対して、＃ｐ＜０．０１は、Ａβ42処理した対照又はビヒクル処理したＡＤに対して。 ５枚のパネルにて、化合物Ｃ０１０５が、ヒト死後ＡＤ脳組織及び対照脳組織において、Ａβ42が誘導するＦＬＮＡとα７ｎＡＣｈＲ及びＴＬＲ４との会合両方を減少させたことを示す。ＡＤ及び同年齢の対照の脳切片を、０．１ｎＭ濃度又は１ｎＭ濃度の化合物Ｃ０１０５で処理し、対照脳切片は同時にＡβ42でも処理した。溶解させたシナプトソーム中で、固定化抗ＦＬＮＡで免疫沈降させ、各受容体に特異的な抗体を用いてウエスタンブロットで検出する（図２５Ａ）ことにより、ＦＬＮＡとα７ｎＡＣｈＲ又はＴＬＲ４との会合の度合いを査定した。ブロットの外側左にある数値は、上記のとおりである。ブロットを、濃度測定定量により分析した（図２５Ｂ及び図２５Ｄ）。ＡＤ組織及びＡβ42処理した対照組織は、α７ｎＡＣｈＲ及びＴＬＲ４とＦＬＮＡとの会合の著しい増加を示したが、化合物Ｃ０１０５はそれらの会合を減少させた。図２５Ｃ及び図２５Ｅに、阻害パーセントを示す。ｎ＝１１。データは、平均±ＳＥＭである。*ｐ＜０．０１は、ビヒクル処理した対照に対して、＃ｐ＜０．０１は、Ａβ42処理した対照又はビヒクル処理したＡＤに対して。 ２枚のパネルにて、ＡＤ及びＡβ42処理した対照において、化合物Ｃ０１０５により、Ａβ42−α７ｎＡＣｈＲ複合体が減少することを示す。図２５で用いたのと同じ処理済のＡＤ脳切片及び対照脳切片由来の溶解させたシナプトソームで、抗Ａβ42を用いて免疫沈降させ、免疫沈降物のウエスタンブロット（図２６Ａ）を、抗α７ｎＡＣｈＲを用いて探索し、濃度測定定量により分析した（図２６Ｂ）。Ａβ42−α７ｎＡＣｈＲ複合体は、Ａβ42処理した対照組織及びＡＤ組織の両方で増加していたが、化合物Ｃ０１０５（０．１ｎＭ及び１ｎＭ）は、この相互作用を減少させた。ｎ＝１１。データは、平均±ＳＥＭである。*ｐ＜０．０１は、ビヒクル処理した対照に対して、＃ｐ＜０．０１は、Ａβ42処理した対照又はビヒクル処理したＡＤに対して。 ２枚のパネルにて、ＡＤ及びＡβ42処理した対照において、化合物Ｃ０１０５により、Ａβ42−α７ｎＡＣｈＲ複合体が減少することを示す。図２５で用いたのと同じ処理済のＡＤ脳切片及び対照脳切片由来の溶解させたシナプトソームで、抗Ａβ42を用いて免疫沈降させ、免疫沈降物のウエスタンブロット（図２６Ａ）を、抗α７ｎＡＣｈＲを用いて探索し、濃度測定定量により分析した（図２６Ｂ）。Ａβ42−α７ｎＡＣｈＲ複合体は、Ａβ42処理した対照組織及びＡＤ組織の両方で増加していたが、化合物Ｃ０１０５（０．１ｎＭ及び１ｎＭ）は、この相互作用を減少させた。ｎ＝１１。データは、平均±ＳＥＭである。*ｐ＜０．０１は、ビヒクル処理した対照に対して、＃ｐ＜０．０１は、Ａβ42処理した対照又はビヒクル処理したＡＤに対して。 ２枚のパネルにて、化合物Ｃ０１０５により、Ａβ42−α７ｎＡＣｈＲ相互作用の親和性が低下することを示す。死後対照組織では、化合物Ｃ０１０５を用いたインキュベーションは、認知障害のない対照の死後前頭皮質由来のビオチン化シナプス膜において、Ａβ42のα７ｎＡＣｈＲに対する結合親和性を１００フェムトモル濃度から１６ナノモル濃度へと１０００倍に低下させる（図２７Ａ）。新鮮なＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞では、化合物Ｃ０１０５は、この結合親和性を、７７０フェムトモル濃度から１ナノモル濃度へと１０，０００倍に低下させる（図２７Ｂ）。データは、平均±ＳＥＭである。死後対照組織はｎ＝１１；ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞はｎ＝６。 ２枚のパネルにて、化合物Ｃ０１０５により、Ａβ42−α７ｎＡＣｈＲ相互作用の親和性が低下することを示す。死後対照組織では、化合物Ｃ０１０５を用いたインキュベーションは、認知障害のない対照の死後前頭皮質由来のビオチン化シナプス膜において、Ａβ42のα７ｎＡＣｈＲに対する結合親和性を１００フェムトモル濃度から１６ナノモル濃度へと１０００倍に低下させる（図２７Ａ）。新鮮なＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞では、化合物Ｃ０１０５は、この結合親和性を、７７０フェムトモル濃度から１ナノモル濃度へと１０，０００倍に低下させる（図２７Ｂ）。データは、平均±ＳＥＭである。死後対照組織はｎ＝１１；ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞はｎ＝６。 化合物Ｃ０１０５によりα７ｎＡＣｈＲ機能不全が減少することを示す棒グラフである。ＡＤ脳切片及びＡβ42処理した対照脳切片は、α７ｎＡＣｈＲ全アゴニストであるＰＮＵ２８２９８７での刺激後のカルシウム流入が有意に障害されていた。化合物Ｃ０１０５処理は、この障害を正常化した。データは、平均±ＳＥＭである。ｎ＝１１。*ｐ＜０．０１は、ビヒクル処理した対照に対して、＃ｐ＜０．０１は、ビヒクル−処理したＡＤ群に対して、＋ｐ＜０．０１は、ビヒクル処理した対照群及び化合物Ｃ０１０５処理した対照群に対して。 化合物Ｃ０１０５によりＮＭＤＡＲ機能不全が減少することを示す棒グラフである。ＡＤ脳切片及びＡβ42処理した対照脳切片は、ＮＭＤＡ及びグリシン（ＮＭＤＡＲのコアゴニスト）での刺激後のＣａ+2流入が有意に障害されていた。化合物Ｃ０１０５処理は、この障害を正常化した。データは、平均±ＳＥＭである。ｎ＝１１。*ｐ＜０．０１は、対照の基本レベルに対して、＃ｐ＜０．０１は、ビヒクル処理したＡＤ群に対して、＋ｐ＜０．０１は、ビヒクル処理した対照群及び化合物Ｃ０１０５処理した対照群と比較して。 １ｎＭの化合物Ｃ０１０５が、Ｋ+誘発性Ｃａ+2流入を部分的に正常化することを示す棒グラフである。Ｋ+誘発性Ｃａ+2流入は、ＡＤ脳切片及びＡβ42処理した脳切片で劇的に減少し、細胞の非機能化又は細胞死を示す。化合物Ｃ０１０５を用いたインキュベーションは、この脱分極が誘導するＣａ+2流入を有意に上昇させ、機能しなくなった細胞をいくらか救出する。データは、平均±ＳＥＭである。ｎ＝１１。*ｐ＜０．０１は、ビヒクル処理した対照群に対して；＃ｐ＜０．０１は、ビヒクル処理したＡＤ群に対して；＋ｐ＜０．０１は、ビヒクル処理した対照群及び化合物Ｃ０１０５処理した対照群に対して。 ２枚のパネルにて、化合物Ｃ０１０５により、ＮＭＤＡＲシグナル伝達障害が正常化することを示す。ＡＤ脳切片又はＡβ42処理した対照脳切片でのＮＭＤＡＲ機能不全は、複数のシグナル伝達分子とＮＲ−１（ＮＭＤＡＲの必須サブユニット）との連結が減少することによっても裏付けられる。化合物Ｃ０１０５（１ｎＭ）は、これらの減少を緩和する。ウエスタンブロット（図３１Ａ）（図中、ブロットの外側左にある数値は上記のとおりである）を濃度測定定量により分析した（図３１Ｂ）。データは、平均±ＳＥＭである。ｎ＝１１。*ｐ＜０．０１は、ビヒクル処理した対照群でのＮＭＤＡ／グリシン刺激したレベルに対して；＃ｐ＜０．０１は、ビヒクル処理したＡＤ群でのＮＭＤＡ／グリシン刺激したレベルに対して。 ２枚のパネルにて、化合物Ｃ０１０５により、ＮＭＤＡＲシグナル伝達障害が正常化することを示す。ＡＤ脳切片又はＡβ42処理した対照脳切片でのＮＭＤＡＲ機能不全は、複数のシグナル伝達分子とＮＲ−１（ＮＭＤＡＲの必須サブユニット）との連結が減少することによっても裏付けられる。化合物Ｃ０１０５（１ｎＭ）は、これらの減少を緩和する。ウエスタンブロット（図３１Ａ）（図中、ブロットの外側左にある数値は上記のとおりである）を濃度測定定量により分析した（図３１Ｂ）。データは、平均±ＳＥＭである。ｎ＝１１。*ｐ＜０．０１は、ビヒクル処理した対照群でのＮＭＤＡ／グリシン刺激したレベルに対して；＃ｐ＜０．０１は、ビヒクル処理したＡＤ群でのＮＭＤＡ／グリシン刺激したレベルに対して。 ２枚のパネルにて、化合物Ｃ０１０５により、ＩＲシグナル伝達障害が正常化することを示す。ＩＲシグナル伝達は、ＩＰβのリン酸化及びＩＰβとシグナル伝達分子ＩＲＳ−１との会合により測定されるとおり、ＡＤ脳切片及びＡβ42処理した対照脳切片で障害されている。化合物Ｃ０１０５（１ｎＭ）を用いたインキュベーションは、これらの障害を正常化する。ウエスタンブロット（図３２Ａ）（図中、ブロットの外側左にある数値は上記のとおりである）を濃度測定定量により分析した（図３２Ｂ）。データは、平均±ＳＥＭである。ｎ＝１１。*ｐ＜０．０１は、対照ビヒクル群のインシュリン刺激したレベルと比較して；＃ｐ＜０．０１は、ＡＤビヒクル群のインシュリン刺激したレベルに対して。 ２枚のパネルにて、化合物Ｃ０１０５により、ＩＲシグナル伝達障害が正常化することを示す。ＩＲシグナル伝達は、ＩＰβのリン酸化及びＩＰβとシグナル伝達分子ＩＲＳ−１との会合により測定されるとおり、ＡＤ脳切片及びＡβ42処理した対照脳切片で障害されている。化合物Ｃ０１０５（１ｎＭ）を用いたインキュベーションは、これらの障害を正常化する。ウエスタンブロット（図３２Ａ）（図中、ブロットの外側左にある数値は上記のとおりである）を濃度測定定量により分析した（図３２Ｂ）。データは、平均±ＳＥＭである。ｎ＝１１。*ｐ＜０．０１は、対照ビヒクル群のインシュリン刺激したレベルと比較して；＃ｐ＜０．０１は、ＡＤビヒクル群のインシュリン刺激したレベルに対して。 ２枚のパネルにて、ＶＡＫＧＬ（配列番号１）ペンタペプチド（１０μＭ）により、ＦＬＮＡ−α７ｎＡＣｈＲ又はＴＬＲ４会合のＣ０１０５による予防が遮断されることを示す。ＦＬＮＡタンパク質のデコイとして作用することにより、ＦＬＮＡにおける化合物Ｃ０１０５のペンタペプチド結合部位は、死後前頭皮質のシナプトソームにおいて、Ａβ42誘導ＦＬＮＡ−α７ｎＡＣｈＲ／ＴＬＲ４会合の化合物Ｃ０１０５による減少を遮断する。ウエスタンブロット（図３３Ａ）（図中、ブロットの外側左にある数値は上記のとおりである）を濃度測定定量により分析した（図３３Ｂ）。データは、平均±ＳＥＭである。ｎ＝３。*ｐ＜０．０１は、各基本レベルに対して；＃ｐ＜０．０１は、Ａβ42接触組織に対して。 ２枚のパネルにて、ＶＡＫＧＬ（配列番号１）ペンタペプチド（１０μＭ）により、ＦＬＮＡ−α７ｎＡＣｈＲ又はＴＬＲ４会合のＣ０１０５による予防が遮断されることを示す。ＦＬＮＡタンパク質のデコイとして作用することにより、ＦＬＮＡにおける化合物Ｃ０１０５のペンタペプチド結合部位は、死後前頭皮質のシナプトソームにおいて、Ａβ42誘導ＦＬＮＡ−α７ｎＡＣｈＲ／ＴＬＲ４会合の化合物Ｃ０１０５による減少を遮断する。ウエスタンブロット（図３３Ａ）（図中、ブロットの外側左にある数値は上記のとおりである）を濃度測定定量により分析した（図３３Ｂ）。データは、平均±ＳＥＭである。ｎ＝３。*ｐ＜０．０１は、各基本レベルに対して；＃ｐ＜０．０１は、Ａβ42接触組織に対して。 ＶＡＫＧＬ（配列番号１）ペンタペプチド（１０μＭ）により、τリン酸化の化合物Ｃ０１０５による予防が遮断される。再び死後前頭皮質のシナプトソームを用いて、ＶＡＫＧＬペンタペプチドは、神経原線維タングルに見られる３つのリン酸化部位全てにおけるτリン酸化のＣ０１０５による減少を遮断する。ウエスタンブロット（図３４Ａ）（図中、ブロットの外側左にある数値は上記のとおりである）を濃度測定定量により分析した（図３４Ｂ）。データは、平均±ＳＥＭである。ｎ＝３。*ｐ＜０．０１は、各基本レベルに対して；＃ｐ＜０．０１は、Ａβ42接触組織に対して。 ＶＡＫＧＬ（配列番号１）ペンタペプチド（１０μＭ）により、τリン酸化の化合物Ｃ０１０５による予防が遮断される。再び死後前頭皮質のシナプトソームを用いて、ＶＡＫＧＬペンタペプチドは、神経原線維タングルに見られる３つのリン酸化部位全てにおけるτリン酸化のＣ０１０５による減少を遮断する。ウエスタンブロット（図３４Ａ）（図中、ブロットの外側左にある数値は上記のとおりである）を濃度測定定量により分析した（図３４Ｂ）。データは、平均±ＳＥＭである。ｎ＝３。*ｐ＜０．０１は、各基本レベルに対して；＃ｐ＜０．０１は、Ａβ42接触組織に対して。 配列番号１のＦＬＮＡの五量体ペプチドに結合する化合物について、ファルマコフォア１を模式的に表したものであり、化学的特色（水素結合受容体（ＨＢＡ）、芳香族性／疎水性（ＡＲＯ／ＨＹＤ）中心など）の相対配置、及びそれらの間の分子内距離（オングストローム単位）を示す。 配列番号１のＦＬＮＡの五量体ペプチドに結合する化合物について、ファルマコフォア２を模式的に表したものであり、化学的特色（水素結合受容体（ＨＢＡ）、芳香族性／疎水性（ＡＲＯ／ＨＹＤ）中心など）の相対配置、及びそれらの間の分子内距離（オングストローム単位）を示す。 配列番号１のＦＬＮＡの五量体ペプチドに結合する化合物について、ファルマコフォア３を模式的に表したものであり、化学的特色（水素結合受容体（ＨＢＡ）、芳香族性／疎水性（ＡＲＯ／ＨＹＤ）中心など）の相対配置、及びそれらの間の分子内距離（オングストローム単位）を示す。 配列番号１のＦＬＮＡの五量体ペプチドに結合する化合物について、ファルマコフォア４を模式的に表したものであり、化学的特色（水素結合受容体（ＨＢＡ）、芳香族性／疎水性（ＡＲＯ／ＨＹＤ）中心など）の相対配置、及びそれらの間の分子内距離（オングストローム単位）を示す。 配列番号１のＦＬＮＡの五量体ペプチドに結合する化合物について、ファルマコフォア５を模式的に表したものであり、化学的特色（水素結合受容体（ＨＢＡ）、芳香族性／疎水性（ＡＲＯ／ＨＹＤ）中心など）の相対配置、及びそれらの間の分子内距離（オングストローム単位）を示す。 配列番号１のＦＬＮＡの五量体ペプチドに結合する化合物について、ファルマコフォア６を模式的に表したものであり、化学的特色（水素結合受容体（ＨＢＡ）、芳香族性／疎水性（ＡＲＯ／ＨＹＤ）中心など）の相対配置、及びそれらの間の分子内距離（オングストローム単位）を示す。 ２枚のパネル、図４１及び図４１Ｂにて、図２と同じようにアッセイした、α７ｎＡＣｈＲ−ＦＬＮＡ会合を減少させるさらなる高親和性ＦＬＮＡ結合化合物を示す。２ヶ月齢のラット由来の前頭皮質のシナプトソームを、Ａβ42（０．１μＭ）と同時（Ｓｉｍ）に又はそれより１０分前（１０’ｐｒ）にのいずれかで、１ｎＭ濃度又は１０ｎＭ濃度の化合物Ａ、Ｂ、又はＣで処理し、化合物Ｃ０１３４及びＣ０１０５は対照として用いた。そして、固定化抗ＦＬＮＡで免疫沈降させた。溶解させたシナプトソーム中の複合体、ならびに抗ＦＬＮＡ免疫沈降物中のα７ｎＡＣｈＲ、ＴＬＲ４、及びＦＬＮＡのレベルを、ウエスタンブロット法で求めた（図４１Ａ）。ブロットの外側左にある数値は、上記のとおりである。ブロットに存在する量を、濃度測定法により定量した（図４１Ｂ）。α７ｎＡＣｈＲ／ＦＬＮＡ比は、ダネット検定で検定したところ、全ての化合物についてｐ＜０．０１でＡβ42単独の場合に対し統計上有意差があった。ＴＬＲ４／ＦＬＮＡ比は、ほとんどの化合物及び条件について*ｐ＜０．０１又は**ｐ＜０．０５でＡβ42単独の場合に対し統計上有意差があった。この図及び他の図に用いられている化合物の構造式は、本明細書中以下で提供する。 ２枚のパネル、図４１及び図４１Ｂにて、図２と同じようにアッセイした、α７ｎＡＣｈＲ−ＦＬＮＡ会合を減少させるさらなる高親和性ＦＬＮＡ結合化合物を示す。２ヶ月齢のラット由来の前頭皮質のシナプトソームを、Ａβ42（０．１μＭ）と同時（Ｓｉｍ）に又はそれより１０分前（１０’ｐｒ）にのいずれかで、１ｎＭ濃度又は１０ｎＭ濃度の化合物Ａ、Ｂ、又はＣで処理し、化合物Ｃ０１３４及びＣ０１０５は対照として用いた。そして、固定化抗ＦＬＮＡで免疫沈降させた。溶解させたシナプトソーム中の複合体、ならびに抗ＦＬＮＡ免疫沈降物中のα７ｎＡＣｈＲ、ＴＬＲ４、及びＦＬＮＡのレベルを、ウエスタンブロット法で求めた（図４１Ａ）。ブロットの外側左にある数値は、上記のとおりである。ブロットに存在する量を、濃度測定法により定量した（図４１Ｂ）。α７ｎＡＣｈＲ／ＦＬＮＡ比は、ダネット検定で検定したところ、全ての化合物についてｐ＜０．０１でＡβ42単独の場合に対し統計上有意差があった。ＴＬＲ４／ＦＬＮＡ比は、ほとんどの化合物及び条件について*ｐ＜０．０１又は**ｐ＜０．０５でＡβ42単独の場合に対し統計上有意差があった。この図及び他の図に用いられている化合物の構造式は、本明細書中以下で提供する。 ２枚のパネル、図４２Ａ及び図４２Ｂにてもまた、図４１の化合物及び濃度を用いると、それらＦＬＮＡ結合化合物により、３つのリン酸化部位全てでτリン酸化が減少することを、免疫沈降及びウエスタンブロット法を用いて示す。すなわち、図４１で用いたのと同じ処理済シナプトソームで、抗τ抗体を用いた免疫沈降物中のＳ202、Ｔ231、及びＴ181でリン酸化されたτタンパク質のレベルを測定した。用いた抗τ抗体は、τタンパク質のリン酸化状態（Ｔａｕ）を識別しない。免疫沈降物中のτの３種のホスホエピトープを、特異的抗体を用いて検出した。Ａβ42は３つの部位全てでτリン酸化を強力に促進する（図４２Ａ）。ブロットの濃度測定分析（図４２Ｂ）は、５種の化合物全てが、１０ｎＭ濃度で同時投与した場合、又は両方の濃度で１０分前処理した場合のいずれかで、このリン酸化を、Ａβ42単独の場合に比べて、ダネット検定を用いて*ｐ＜０．０１の有意差で減少させたことを示した。化合物Ａは、１ｎＭでの同時投与の場合も、**ｐ＜０．０５又は*ｐ＜０．０１の有意差で、τリン酸化を減少させ、一方、化合物Ｃは同時投与した場合に、２つのリン酸化位置で、統計上有意差のある結果をもたらさなかった。 ２枚のパネル、図４２Ａ及び図４２Ｂにてもまた、図４１の化合物及び濃度を用いると、それらＦＬＮＡ結合化合物により、３つのリン酸化部位全てでτリン酸化が減少することを、免疫沈降及びウエスタンブロット法を用いて示す。すなわち、図４１で用いたのと同じ処理済シナプトソームで、抗τ抗体を用いた免疫沈降物中のＳ202、Ｔ231、及びＴ181でリン酸化されたτタンパク質のレベルを測定した。用いた抗τ抗体は、τタンパク質のリン酸化状態（Ｔａｕ）を識別しない。免疫沈降物中のτの３種のホスホエピトープを、特異的抗体を用いて検出した。Ａβ42は３つの部位全てでτリン酸化を強力に促進する（図４２Ａ）。ブロットの濃度測定分析（図４２Ｂ）は、５種の化合物全てが、１０ｎＭ濃度で同時投与した場合、又は両方の濃度で１０分前処理した場合のいずれかで、このリン酸化を、Ａβ42単独の場合に比べて、ダネット検定を用いて*ｐ＜０．０１の有意差で減少させたことを示した。化合物Ａは、１ｎＭでの同時投与の場合も、**ｐ＜０．０５又は*ｐ＜０．０１の有意差で、τリン酸化を減少させ、一方、化合物Ｃは同時投与した場合に、２つのリン酸化位置で、統計上有意差のある結果をもたらさなかった。 ２枚のパネル、図４３Ａ及び図４３Ｂにて、図２と同じようにアッセイした、α７ｎＡＣｈＲ−ＦＬＮＡ会合を減少させるさらなる高親和性ＦＬＮＡ結合化合物を示す。２ヶ月齢のラット由来の前頭皮質のシナプトソームを、Ａβ42（０．１μＭ）と同時（Ｓｉｍ）に又はそれより１０分前（１０’ｐｒ）にのいずれかで、１ｎＭ濃度又は１０ｎＭ濃度の化合物Ｃ００８７及び化合物Ｃ０１０８で処理し、化合物Ｃ０１０５は対照として用いた。そして、固定化抗ＦＬＮＡで免疫沈降させた。溶解させたシナプトソーム中の複合体、ならびに抗ＦＬＮＡ免疫沈降物中のα７ｎＡＣｈＲ、ＴＬＲ４、及びＦＬＮＡのレベルを、ウエスタンブロット法で求めた（図４３Ａ）。ブロットの外側左にある数値は、上記のとおりである。ブロットに存在する量を、濃度測定法により定量した（図４３Ｂ）。α７ｎＡＣｈＲ／ＦＬＮＡ及びＴＬＲ４／ＦＬＮＡ比は、ダネット検定を用いて示されるとおり、化合物について**ｐ＜０．０５、*ｐ＜０．０１でＡβ42単独の場合に対し統計上有意差があった。この図及び他の図に用いられている化合物の構造式は、本明細書中以下で提供する。 ２枚のパネル、図４３Ａ及び図４３Ｂにて、図２と同じようにアッセイした、α７ｎＡＣｈＲ−ＦＬＮＡ会合を減少させるさらなる高親和性ＦＬＮＡ結合化合物を示す。２ヶ月齢のラット由来の前頭皮質のシナプトソームを、Ａβ42（０．１μＭ）と同時（Ｓｉｍ）に又はそれより１０分前（１０’ｐｒ）にのいずれかで、１ｎＭ濃度又は１０ｎＭ濃度の化合物Ｃ００８７及び化合物Ｃ０１０８で処理し、化合物Ｃ０１０５は対照として用いた。そして、固定化抗ＦＬＮＡで免疫沈降させた。溶解させたシナプトソーム中の複合体、ならびに抗ＦＬＮＡ免疫沈降物中のα７ｎＡＣｈＲ、ＴＬＲ４、及びＦＬＮＡのレベルを、ウエスタンブロット法で求めた（図４３Ａ）。ブロットの外側左にある数値は、上記のとおりである。ブロットに存在する量を、濃度測定法により定量した（図４３Ｂ）。α７ｎＡＣｈＲ／ＦＬＮＡ及びＴＬＲ４／ＦＬＮＡ比は、ダネット検定を用いて示されるとおり、化合物について**ｐ＜０．０５、*ｐ＜０．０１でＡβ42単独の場合に対し統計上有意差があった。この図及び他の図に用いられている化合物の構造式は、本明細書中以下で提供する。 ２枚のパネル、図４４Ａ及び図４４Ｂにてもまた、図４３の化合物及び濃度を用いると、それらＦＬＮＡ結合化合物により、３つのリン酸化部位全てでτリン酸化が減少することを、免疫沈降及びウエスタンブロット法を用いて示す。すなわち、図４３で用いたのと同じ処理済シナプトソームで、抗τ抗体を用いた免疫沈降物中のＳ202、Ｔ231、及びＴ181でリン酸化されたτタンパク質のレベルを測定した。用いた抗τ抗体は、τタンパク質のリン酸化状態（Ｔａｕ）を識別しない。免疫沈降物中のτの３種のホスホエピトープを、特異的抗体を用いて検出した。Ａβ42は３つの部位全てでτリン酸化を強力に促進する。ブロットの濃度測定分析（図４４Ｂ）は、両方の化合物が、両方の濃度で、同時投与又は１０分前処理のいずれでも、このリン酸化を、Ａβ42単独の場合に比べて、ダネット検定を用いて**ｐ＜０．０５、*ｐ＜０．０１の有意差で減少させたことを示した。 ２枚のパネル、図４４Ａ及び図４４Ｂにてもまた、図４３の化合物及び濃度を用いると、それらＦＬＮＡ結合化合物により、３つのリン酸化部位全てでτリン酸化が減少することを、免疫沈降及びウエスタンブロット法を用いて示す。すなわち、図４３で用いたのと同じ処理済シナプトソームで、抗τ抗体を用いた免疫沈降物中のＳ202、Ｔ231、及びＴ181でリン酸化されたτタンパク質のレベルを測定した。用いた抗τ抗体は、τタンパク質のリン酸化状態（Ｔａｕ）を識別しない。免疫沈降物中のτの３種のホスホエピトープを、特異的抗体を用いて検出した。Ａβ42は３つの部位全てでτリン酸化を強力に促進する。ブロットの濃度測定分析（図４４Ｂ）は、両方の化合物が、両方の濃度で、同時投与又は１０分前処理のいずれでも、このリン酸化を、Ａβ42単独の場合に比べて、ダネット検定を用いて**ｐ＜０．０５、*ｐ＜０．０１の有意差で減少させたことを示した。 ２枚のパネル、図４５Ａ及び図４５Ｂにて、図２と同じようにアッセイした、α７ｎＡＣｈＲ−ＦＬＮＡ会合を減少させるさらなる高親和性ＦＬＮＡ結合化合物を示す。２ヶ月齢のラット由来の前頭皮質のシナプトソームを、Ａβ42（０．１μＭ）と同時（Ｓｉｍ）に又はそれより１０分前（１０’ｐｒ）にのいずれかで、１ｎＭ濃度又は１０ｎＭ濃度の化合物Ｃ０１２４で処理し、化合物Ｃ０１０５は対照として用いた。そして、固定化抗ＦＬＮＡで免疫沈降させた。溶解させたシナプトソーム中の複合体、ならびに抗ＦＬＮＡ免疫沈降物中のα７ｎＡＣｈＲ、ＴＬＲ４、及びＦＬＮＡのレベルを、ウエスタンブロット法で求めた（図４５Ａ）。ブロットの外側左にある数値は、上記のとおりである。ブロットに存在する量を、濃度測定法により定量した（図４５Ｂ）。α７ｎＡＣｈＲ／ＦＬＮＡ及びＴＬＲ４／ＦＬＮＡ比は、ダネット検定を用いて示されるとおり、化合物について**ｐ＜０．０５、*ｐ＜０．０１でＡβ42単独の場合に対し統計上有意差があった。この図及び他の図に用いられている化合物の構造式は、本明細書中以下で提供する。 ２枚のパネル、図４５Ａ及び図４５Ｂにて、図２と同じようにアッセイした、α７ｎＡＣｈＲ−ＦＬＮＡ会合を減少させるさらなる高親和性ＦＬＮＡ結合化合物を示す。２ヶ月齢のラット由来の前頭皮質のシナプトソームを、Ａβ42（０．１μＭ）と同時（Ｓｉｍ）に又はそれより１０分前（１０’ｐｒ）にのいずれかで、１ｎＭ濃度又は１０ｎＭ濃度の化合物Ｃ０１２４で処理し、化合物Ｃ０１０５は対照として用いた。そして、固定化抗ＦＬＮＡで免疫沈降させた。溶解させたシナプトソーム中の複合体、ならびに抗ＦＬＮＡ免疫沈降物中のα７ｎＡＣｈＲ、ＴＬＲ４、及びＦＬＮＡのレベルを、ウエスタンブロット法で求めた（図４５Ａ）。ブロットの外側左にある数値は、上記のとおりである。ブロットに存在する量を、濃度測定法により定量した（図４５Ｂ）。α７ｎＡＣｈＲ／ＦＬＮＡ及びＴＬＲ４／ＦＬＮＡ比は、ダネット検定を用いて示されるとおり、化合物について**ｐ＜０．０５、*ｐ＜０．０１でＡβ42単独の場合に対し統計上有意差があった。この図及び他の図に用いられている化合物の構造式は、本明細書中以下で提供する。 ２枚のパネル、図４６Ａ及び図４６Ｂにてもまた、図４５の化合物及び濃度を用いると、それらＦＬＮＡ結合化合物により、３つのリン酸化部位全てでτリン酸化が減少することを、免疫沈降及びウエスタンブロット法を用いて示す。すなわち、図４５で用いたのと同じ処理済シナプトソームで、抗τ抗体を用いた免疫沈降物中のＳ202、Ｔ231、及びＴ181でリン酸化されたτタンパク質のレベルを測定した。用いた抗τ抗体は、τタンパク質のリン酸化状態（Ｔａｕ）を識別しない。免疫沈降物中のτの３種のホスホエピトープを、特異的抗体を用いて検出した。Ａβ42は３つの部位全てでτリン酸化を強力に促進する。ブロットの濃度測定分析（図４６Ｂ）は、化合物Ｃ０１０５及び化合物Ｃ０１２４の両方が、両方の濃度で、同時投与又は１０分前処理のいずれでも、このリン酸化を、Ａβ42単独の場合に比べて、ダネット検定を用いて*ｐ＜０．０１の有意差で減少させたことを示した。 ２枚のパネル、図４６Ａ及び図４６Ｂにてもまた、図４５の化合物及び濃度を用いると、それらＦＬＮＡ結合化合物により、３つのリン酸化部位全てでτリン酸化が減少することを、免疫沈降及びウエスタンブロット法を用いて示す。すなわち、図４５で用いたのと同じ処理済シナプトソームで、抗τ抗体を用いた免疫沈降物中のＳ202、Ｔ231、及びＴ181でリン酸化されたτタンパク質のレベルを測定した。用いた抗τ抗体は、τタンパク質のリン酸化状態（Ｔａｕ）を識別しない。免疫沈降物中のτの３種のホスホエピトープを、特異的抗体を用いて検出した。Ａβ42は３つの部位全てでτリン酸化を強力に促進する。ブロットの濃度測定分析（図４６Ｂ）は、化合物Ｃ０１０５及び化合物Ｃ０１２４の両方が、両方の濃度で、同時投与又は１０分前処理のいずれでも、このリン酸化を、Ａβ42単独の場合に比べて、ダネット検定を用いて*ｐ＜０．０１の有意差で減少させたことを示した。 ３枚のパネル図４７Ａ〜図４７Ｃにて、ヒト死後海馬細胞切片において、ＬＰＳが、２種の濃度（１０μｇ／ｍｌ及び１０μｇ／ｍｌ）それぞれで、３つのリン酸化部位全てでτリン酸化を誘導すること、及びそのリン酸化が１ｎＭ濃度の化合物Ｃ０１０５により阻害されることを、免疫沈降及びウエスタンブロット法を用いて示す。抗τ抗体を用いた免疫沈降物中のＳ202、Ｔ231、及びＴ181でリン酸化されたτタンパク質のレベルを測定した。用いた抗τ抗体は、τタンパク質のリン酸化状態（Ｔａｕ）を識別しない。免疫沈降物中のτの３種のホスホエピトープを、特異的抗体を用いてウエスタンブロット（ＷＢ）により検出した。Ａβ42は対照として用いられたもので、Ａβ42も３つの部位全てでτリン酸化を強力に促進する。ブロットの濃度測定分析（図４７Ｂ及び図４７Ｃ）は、化合物Ｃ０１０５が、Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ多重比較法を用いて以下の有意差で、このリン酸化を減少させたことを、定量的に示す：*ｐ＜０．０１、**ｐ＜０．０５は、ビヒクルとともにインキュベートした群と比較して、及び＃ｐ＜０．０１は、ＬＰＳ又はＡｂ42処理した群それぞれと比較して。図４７Ｃのグラフは、図４７Ｂに示されるものと同じ順序(in the same order)である。 ３枚のパネル図４７Ａ〜図４７Ｃにて、ヒト死後海馬細胞切片において、ＬＰＳが、２種の濃度（１０μｇ／ｍｌ及び１０μｇ／ｍｌ）それぞれで、３つのリン酸化部位全てでτリン酸化を誘導すること、及びそのリン酸化が１ｎＭ濃度の化合物Ｃ０１０５により阻害されることを、免疫沈降及びウエスタンブロット法を用いて示す。抗τ抗体を用いた免疫沈降物中のＳ202、Ｔ231、及びＴ181でリン酸化されたτタンパク質のレベルを測定した。用いた抗τ抗体は、τタンパク質のリン酸化状態（Ｔａｕ）を識別しない。免疫沈降物中のτの３種のホスホエピトープを、特異的抗体を用いてウエスタンブロット（ＷＢ）により検出した。Ａβ42は対照として用いられたもので、Ａβ42も３つの部位全てでτリン酸化を強力に促進する。ブロットの濃度測定分析（図４７Ｂ及び図４７Ｃ）は、化合物Ｃ０１０５が、Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ多重比較法を用いて以下の有意差で、このリン酸化を減少させたことを、定量的に示す：*ｐ＜０．０１、**ｐ＜０．０５は、ビヒクルとともにインキュベートした群と比較して、及び＃ｐ＜０．０１は、ＬＰＳ又はＡｂ42処理した群それぞれと比較して。図４７Ｃのグラフは、図４７Ｂに示されるものと同じ順序(in the same order)である。 ３枚のパネル図４７Ａ〜図４７Ｃにて、ヒト死後海馬細胞切片において、ＬＰＳが、２種の濃度（１０μｇ／ｍｌ及び１０μｇ／ｍｌ）それぞれで、３つのリン酸化部位全てでτリン酸化を誘導すること、及びそのリン酸化が１ｎＭ濃度の化合物Ｃ０１０５により阻害されることを、免疫沈降及びウエスタンブロット法を用いて示す。抗τ抗体を用いた免疫沈降物中のＳ202、Ｔ231、及びＴ181でリン酸化されたτタンパク質のレベルを測定した。用いた抗τ抗体は、τタンパク質のリン酸化状態（Ｔａｕ）を識別しない。免疫沈降物中のτの３種のホスホエピトープを、特異的抗体を用いてウエスタンブロット（ＷＢ）により検出した。Ａβ42は対照として用いられたもので、Ａβ42も３つの部位全てでτリン酸化を強力に促進する。ブロットの濃度測定分析（図４７Ｂ及び図４７Ｃ）は、化合物Ｃ０１０５が、Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ多重比較法を用いて以下の有意差で、このリン酸化を減少させたことを、定量的に示す：*ｐ＜０．０１、**ｐ＜０．０５は、ビヒクルとともにインキュベートした群と比較して、及び＃ｐ＜０．０１は、ＬＰＳ又はＡｂ42処理した群それぞれと比較して。図４７Ｃのグラフは、図４７Ｂに示されるものと同じ順序(in the same order)である。 ４部構成、図４８Ａ、４８Ｂ、４８Ｃ、及び４８Ｄによる、ナルトレキソン（ＮＴＸ）又は例示化合物Ｃ０１０５の存在下での、フィラミンＡ（ＦＬＮＡ）又は配列番号１のフィラミンＡ（ＦＬＮＡ）五量体に対する放射標識化ナロキソン［3Ｈ］ＮＬＸの結合を示す競合曲線を示すグラフであり、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ３（２）：ｅ１５５４ （２００８）で報告されたとおりのものである。図４８Ａは、示される量でのナルトレキソン（ＮＴＸ）の存在下における、Ａ７細胞の膜でのＦＬＮＡに対する［3Ｈ］ＮＬＸの結合を示し、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ３（２）：ｅ１５５４ （２００８）の図３から引用したものである；図４８Ｂは、示される量での化合物Ｃ０１０５の存在下における、Ａ７細胞の膜でのＦＬＮＡに対する［3Ｈ］ＮＬＸの結合を示し；図４８Ｃは、示される量での化合物Ｃ０１０５の存在下における、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞の膜でのＦＬＮＡに対する［3Ｈ］ＮＬＸの結合を示し；及び図４８Ｄは、示される量での化合物Ｃ０１０５の存在下における、配列番号１のＦＬＮＡ五量体に対する［3Ｈ］ＮＬＸの結合を示す。 ４部構成、図４８Ａ、４８Ｂ、４８Ｃ、及び４８Ｄによる、ナルトレキソン（ＮＴＸ）又は例示化合物Ｃ０１０５の存在下での、フィラミンＡ（ＦＬＮＡ）又は配列番号１のフィラミンＡ（ＦＬＮＡ）五量体に対する放射標識化ナロキソン［3Ｈ］ＮＬＸの結合を示す競合曲線を示すグラフであり、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ３（２）：ｅ１５５４ （２００８）で報告されたとおりのものである。図４８Ａは、示される量でのナルトレキソン（ＮＴＸ）の存在下における、Ａ７細胞の膜でのＦＬＮＡに対する［3Ｈ］ＮＬＸの結合を示し、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ３（２）：ｅ１５５４ （２００８）の図３から引用したものである；図４８Ｂは、示される量での化合物Ｃ０１０５の存在下における、Ａ７細胞の膜でのＦＬＮＡに対する［3Ｈ］ＮＬＸの結合を示し；図４８Ｃは、示される量での化合物Ｃ０１０５の存在下における、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞の膜でのＦＬＮＡに対する［3Ｈ］ＮＬＸの結合を示し；及び図４８Ｄは、示される量での化合物Ｃ０１０５の存在下における、配列番号１のＦＬＮＡ五量体に対する［3Ｈ］ＮＬＸの結合を示す。 ４部構成、図４８Ａ、４８Ｂ、４８Ｃ、及び４８Ｄによる、ナルトレキソン（ＮＴＸ）又は例示化合物Ｃ０１０５の存在下での、フィラミンＡ（ＦＬＮＡ）又は配列番号１のフィラミンＡ（ＦＬＮＡ）五量体に対する放射標識化ナロキソン［3Ｈ］ＮＬＸの結合を示す競合曲線を示すグラフであり、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ３（２）：ｅ１５５４ （２００８）で報告されたとおりのものである。図４８Ａは、示される量でのナルトレキソン（ＮＴＸ）の存在下における、Ａ７細胞の膜でのＦＬＮＡに対する［3Ｈ］ＮＬＸの結合を示し、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ３（２）：ｅ１５５４ （２００８）の図３から引用したものである；図４８Ｂは、示される量での化合物Ｃ０１０５の存在下における、Ａ７細胞の膜でのＦＬＮＡに対する［3Ｈ］ＮＬＸの結合を示し；図４８Ｃは、示される量での化合物Ｃ０１０５の存在下における、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞の膜でのＦＬＮＡに対する［3Ｈ］ＮＬＸの結合を示し；及び図４８Ｄは、示される量での化合物Ｃ０１０５の存在下における、配列番号１のＦＬＮＡ五量体に対する［3Ｈ］ＮＬＸの結合を示す。 ４部構成、図４８Ａ、４８Ｂ、４８Ｃ、及び４８Ｄによる、ナルトレキソン（ＮＴＸ）又は例示化合物Ｃ０１０５の存在下での、フィラミンＡ（ＦＬＮＡ）又は配列番号１のフィラミンＡ（ＦＬＮＡ）五量体に対する放射標識化ナロキソン［3Ｈ］ＮＬＸの結合を示す競合曲線を示すグラフであり、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ３（２）：ｅ１５５４ （２００８）で報告されたとおりのものである。図４８Ａは、示される量でのナルトレキソン（ＮＴＸ）の存在下における、Ａ７細胞の膜でのＦＬＮＡに対する［3Ｈ］ＮＬＸの結合を示し、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ３（２）：ｅ１５５４ （２００８）の図３から引用したものである；図４８Ｂは、示される量での化合物Ｃ０１０５の存在下における、Ａ７細胞の膜でのＦＬＮＡに対する［3Ｈ］ＮＬＸの結合を示し；図４８Ｃは、示される量での化合物Ｃ０１０５の存在下における、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞の膜でのＦＬＮＡに対する［3Ｈ］ＮＬＸの結合を示し；及び図４８Ｄは、示される量での化合物Ｃ０１０５の存在下における、配列番号１のＦＬＮＡ五量体に対する［3Ｈ］ＮＬＸの結合を示す。
略号及び短略形
以下の略号及び短略形を、本明細書中で使用する。
「Ａβ」は、アミロイドβを意味する
「Ａβ42」は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）タンパク質の４２の残基からなるタンパク質分解産物を意味する
「α７ｎＡｃｈＲ」は、α−７ニコチン性アセチルコリン受容体を意味する
「ＤＡＭＧＯ」は、［Ｄ−Ａｌａ２，Ｎ−ＭｅＰｈｅ４，Ｇｌｙ−ｏｌ］−エンケファリンを意味する
「ＥＲＫ２」は、細胞外シグナル制御キナーゼ２を意味する
「ＦＣＸ」は、前頭皮質又は前頭前皮質を意味する
「ＦＬＮＡ」は、フィラミンＡを意味する
「ＦＩＴＣ」は、フルオレセインイソチオシアネートを意味する
「Ｇｓ」は、Ｇタンパク質刺激型サブタイプを意味し、アデニリルシクラーゼを刺激する
「ＨＰ」は、海馬を意味する
「ＩＨＣ」は、免疫組織化学を意味する
「ＩＲ」は、インシュリン受容体を意味する
「ＭＯＲ」は、μオピオイド受容体を意味する
「ＮＬＸ」は、ナロキソンを意味する
「ＮＴＸ」は、ナルトレキソンを意味する
「ＮＦＴ」は、神経原線維タングルを意味する
「ＮＭＤＡ」は、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸を意味する
「ＮＭＤＡＲ」は、ＮＭＤＡ受容体を意味する
「ｐＥＲＫ２」は、リン酸化型ＥＲＫ２を意味する
「ｐＴａｕ」は、高リン酸化型τタンパク質を意味する
「ＴＬＲ４」は、トール様受容体４を意味する
定義
本発明の文脈及び添付の請求項において、以下の用語は以下の意味を有する：
「ａ」及び「ａｎ」という冠詞は、本明細書中、その冠詞の文法上の目的語が１つ又は１つより多い（すなわち少なくとも１つである）ことを示すとして用いられる。例として、「ａｎ要素」は、１つの要素又は１つより多い要素を意味する。
本明細書中使用される場合、「ヒドロカルビル」という用語は、非芳香族基についての略語であり、この用語は、炭素及び水素のみを有する、直鎖及び分岐鎖の脂肪族ならびに脂環式の基又はラジカルを含む。脂環式基は環状の脂肪族基であるため、そのような置換基は、本明細書中以下、脂肪族基に組み込まれると見なされる。つまり、アルキル基、アルケニル基、及びアルキニル基を考慮に入れており、一方、芳香族炭化水素（フェニル基及びナフチル基など）は、厳密に言えばそれらもヒドロカルビル基ではあるが、本明細書中では、以下に説明するとおり、アリール基、アリール置換基、アリール部分、又はアリールラジカルと示す。アラルキル置換基（ベンジルなど）は、Ｘ基（ベンジルならＸはＣＨ2である）に結合した芳香環であるため、芳香族基と見なされる。テトラリン（テトラヒドロナフタレン）などの、脂肪族環及び芳香環部分の両方を有する置換基で、脂肪族部分を介して直接、Ｗ基を含む示されている環に連結しているものは、非芳香族ヒドロカルビル基と見なす。一方で、同様な基でも芳香族部分を介して直接結合するものは、置換芳香族基と見なす。具体的な脂肪族ヒドロカルビル置換基が意図されている場合、そのような基は記述される；すなわち、Ｃ1−Ｃ4アルキル、メチル、又はドデセニルである。ヒドロカルビル基の例として、１〜約１２個の炭素原子、好ましくは１〜約８個の炭素原子、より好ましくは１〜６個の炭素原子からなる鎖が挙げられる。
特に好適なヒドロカルビル基は、アルキル基である。結果として、本明細書中列挙される置換基のいずれであっても「ヒドロカルビル」という記述語を「アルキル」で置き換えることで、置換基を、より一般化された、しかしより好適な置換基として、記述することができる。
アルキルラジカルの例として、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソアミル（ｉｓｏ−ａｍｙｌ）、ヘキシル、オクチル、デシル、ドデシルなどが挙げられる。環状アルキルラジカル（シクロプロピル（ｃｙｃｌｏ ｐｒｏｐｙｌ）、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、及びシクロヘプチルなど）も考慮に入っており、それらの対応するアルケニルラジカル及びアルキニルラジカルも同様である。適切な直鎖及び分岐鎖のアルケニルラジカルの例として、エテニル（ビニル）、２−プロペニル、３−プロペニル、１，４−ペンタジエニル、１，４−ブタジエニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、デセニルなどが挙げられる。直鎖及び分岐鎖のアルキニルラジカルの例として、エチニル、２−プロピニル、３−プロピニル、デシニル、１−ブチニル、２−ブチニル、３−ブチニルなどが挙げられる。
「ヒドロカルビル」という言葉を用いる場合、通常の化学接尾語式命名に従うが、ただし、常に語尾の「イル」を外して適切な接尾語を付け足す常套手段に従うとは限らない。なぜなら、そうして得られる名前が１つ以上の置換基に対して類似する可能性があるからである。従って、ヒドロカルビルエーテルは、化学命名法の通常規則に従った場合に、「ヒドロカルボキシ」ではなくて「ヒドロカルビルオキシ」基とした方がより好ましいかもしれないのであれば、「ヒドロカルビルオキシ」基と称される。例示のヒドロカルビルオキシ基として、メトキシ、エトキシ、及びシクロヘキセニルオキシ基が挙げられる。一方、−Ｃ（Ｏ）−官能基を含有するヒドロカルビル基は、ヒドロカルボイル（アシル）基と称され、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−を含有するヒドロカルビル基は、まったく曖昧なところがないため、ヒドロカルボイルオキシ基である。ヒドロカルボイル基及びヒドロカルボイルオキシ基の例として、アシル基及びアシルオキシ基、例えば、それぞれ、アセチル及びアセトキシ、アクリロイル及びアクリロイルオキシが挙げられる。
中心スピロ環系と、芳香環又はヘテロ芳香環系である環Ａとの間のカルボキシルが関係する連結基として、複数の種類のエステル結合及びアミド結合が挙げられる。そのような結合の例として、スルホンアミド、スルホン酸エステル、及びチオスルホン酸エステルが挙げられるが、これらはそれぞれ、ＳＯ2含有基［Ｓ（＝Ｏ）2基と示されることもある］とアミン、酸素、又は硫黄原子との間で形成され得る。アミド結合、エステル結合、及びチオエステル結合は、それぞれ、Ｃ（Ｏ）［（Ｃ＝Ｏ）と示されることもある］基を含有する芳香環又はヘテロ芳香環と、窒素、酸素、又は硫黄原子との間で形成され得る。同様に、グアニジノ連結部は、ＮＨＣ（ＮＨ）［ＮＨＣ（＝ＮＨ）］基を含有する芳香環又はヘテロ芳香環と、窒素との間で形成され得る。ウレタン、炭酸エステル、又はチオ炭酸エステルは、それぞれ、ＯＣ（Ｏ）［すなわちＯＣ（＝Ｏ）］基を含有する芳香環又はヘテロ芳香環と、窒素、酸素、又は硫黄との間で形成され得る。尿素連結部、ウレタン連結部、又はイソチオ尿素連結部［ＮＨＣ（Ｏ）Ｓ］｛すなわち［ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｓ］｝を有する化合物は、それぞれ、ＮＨＣ（Ｏ）基を含有する芳香環又はヘテロ芳香環と、窒素、酸素、又は硫黄との間で形成され得る。チオ尿素連結部も考慮に入っている。
「カルボキシル」置換基とは、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ基である。Ｃ1−Ｃ6ヒドロカルビルカルボキシラートは、カルボキシル基のＣ1−Ｃ6ヒドロカルビルエステルである。カルボキサミドは−Ｃ（Ｏ）ＮＲ3Ｒ4置換基であり、式中、Ｒ基は、どこかで定義されており、ここではさらなる説明での簡単のため３及び４と番号が付けられているが、必ずしも以下の化学式においてそのように番号が付くわけではない。同様に、スルホンアミドは−Ｓ（Ｏ）2ＮＲ3Ｒ4置換基であり、式中、Ｒ基は、本明細書中以下で定義されている。Ｒ3基及びＲ4基が、カルボキサミドの示されている窒素と一緒になって五員〜七員の環を形成し、形成された環は随意に１〜２個の追加のヘテロ原子を含有し、含有されるヘテロ原子は独立して窒素、酸素、又は硫黄である場合の例として、モルホリニル基、ピペラジニル基、オキサチアゾリル基、１，２，３−トリアゾリル基、１，２，４−トリアゾリル基、ピラゾリル基、１，２，４−オキサジアジニル基、及びアゼピニル基が挙げられる。
当業者には当然のことながら、２個以上の炭素原子を持つアルケニル又はアルキニルなどの置換基は、「ヒドロカルビル」という用語に包含することを意図しているが、Ｃ1アルケニル又はアルキニルなどの存在し得ない置換基は、意図していない。
「アリール」という用語は、単独でも組み合わせでも、本明細書中以下で記述されるとおりのフェニル、ナフチル、又は他のラジカルを意味し、アリールは、随意に、ヒドロカルビル、ヒドロカルビルオキシ、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、ニトロなどから選択される置換基を１つ又は複数有する（フェニル、ｐ−トルイル、４−メトキシフェニル、４−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）フェニル、４−フルオロフェニル、４−クロロフェニル、４−ヒドロキシフェニルなど）。「アリールヒドロカルビル」という用語は、単独でも組み合わせでも、上記で定義されるとおりのヒドロカルビルラジカルであって、ラジカル中、１個の水素原子が上記で定義されるとおりのアリールラジカルで置換されているものを意味する（ベンジル、２−フェニルエチルなど）。「アリールヒドロカルビルオキシカルボニル」という用語は、単独でも組み合わせでも、式−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−アリールヒドロカルビルのラジカルを意味し、式中、「アリールヒドロカルビル」という用語は上記で与えられる意味を有する。アリールヒドロカルビルオキシカルボニルラジカルの例としてベンジルオキシカルボニルがある。「アリールオキシ」という用語は、式アリール−Ｏ−のラジカルを意味し、式中、アリールという用語は上記で与えられる意味を有する。組み合わせで用いられる「芳香環」という用語（置換芳香環スルホンアミド、置換芳香環スルフィンアミド、又は置換芳香環スルフェンアミドなど）は、上記で定義されるとおりのアリール又はヘテロアリールを意味する。
本明細書中使用される場合、「結合する」という用語は、分子同士が互いに接着することを示し、例えば、リガンドとその受容体との相互作用、又は配列番号１のポリペプチドと本明細書中開示される化合物などの小分子との相互作用、又は抗体とその抗原との相互作用が挙げられるが、それらに限定されない。
本明細書中使用される場合、「ＦＬＮＡ結合化合物」という用語は、足場タンパク質フィラミンＡと、より好ましくはＦＬＮＡ配列の残基−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−（配列番号１）を含むポリペプチドと結合する化合物を示し、この配列は、ウェブ・アドレス：ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ ｅｎｔｒｙ Ｐ２１３３３， ＦＬＮＡ−ＨＵＭＡＮ， Ｆｉｌａｍｉｎ−Ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅに提示される配列に記載されるとおりのＦＬＮＡタンパク質配列の中の２５６１番−２５６５番のアミノ酸残基に相当する。ＦＬＮＡ結合化合物は、好ましくは２４番目の繰返し領域での、フィラミンＡとの相互作用を介して、μオピオイド受容体のアゴニスト刺激により引き起こされるＭＯＲ−Ｇｓ結合を阻害することができる。
本明細書中使用される場合、「オピオイド受容体」という用語は、オピオイドと相互作用するＣＮＳ中に位置するＧタンパク質結合型受容体を示す。より詳細には、μオピオイド受容体は、モルヒネにより活性化されて、当業者に既知の、痛覚消失、鎮静、悪心、及び他にも多くの副作用を引き起こす。
本明細書中使用される場合、「オピオイドアゴニスト」という用語は、オピオイド受容体と結合すると、受容体を刺激し、Ｇタンパク質結合を誘導し、生理反応の引き金を引くことができる物質を示す。より詳細には、オピオイドアゴニストは、ＭＯＲと相互作用して痛覚消失をもたらすモルヒネ様物質である。
本明細書中使用される場合、「オピオイドアンタゴニスト」という用語は、オピオイド受容体と結合すると、オピオイドアゴニストと受容体の結合に干渉することでオピオイドアゴニストの機能を阻害する物質を示す。
本明細書中使用される場合、「超低用量」又は「超少量」という用語は、化合物がその量でオピオイドアゴニストと併用投与された場合にオピオイドアゴニストの鎮痛効力を向上するのに十分な量であることを示す。より詳細には、超低用量のオピオイドアンタゴニストは、オピオイドアゴニストの約１０００分の１〜約１０，０００，０００分の１、好ましくは約１０，０００分の１〜約１，０００，０００分の１の量で、オピオイドアゴニストと混合される。
本明細書中使用される場合、「ＦＬＮＡ結合有効量」又は、もっと簡単に「有効量」は、企図する化合物の量が、配列番号１のＦＬＮＡペンタペプチドに結合し、かつ本明細書中記載される機能（τタンパク質リン酸化の阻害など）を発揮するのに十分であることを示す。企図する化合物の有効量は、実施例１のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを用いると特に簡単に決定できる。その定義を用いると、有効量の企図する化合物は、企図する化合物が１０μＭ濃度で存在し、企図する化合物と同濃度及び同条件で未標識ナロキソンを対照阻害剤として使用した場合に得られる値の少なくとも約６０パーセント、より好ましくは７０％から、上限は対照としてナロキソンを用いて得られる値の約２倍（２００％）までで、ＦＩＴＣ標識化ナロキソン結合を阻害する。
本明細書中使用される場合、「ファルマコフォア」という用語は、何かしらの薬理活性を暗示するものではない。ファルマコフォアは、分子にある、受容体と相互作用し、かつ化合物の活性の一因となっている関連基と定義することができる。［Ｒ． Ｂ． Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ， Ｔｈｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｃｔｉｏｎ， ２nd ｅｄ．， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ， （２００４）， ｐ．１７。］この用語は、分子が受容体と相互作用するための好適な前提条件を構成する、分子の化学的特徴及びその三次元空間配置を示すものであると定義することも可能であり、本明細書中ではそのように定義するものとする（米国特許第６，０３４，０６６号を参照）。ファルマコフォアは、適切にプログラムされたコンピューターを用いて、特定受容体（ここでは、配列番号１のペンタペプチド）と同様に結合する化合物の群で共有される芳香族性／疎水性及び水素結合アクセプター官能基及びそれらの距離を求めることで、計算される。そのようなコンピュータープログラムは、メーカー（Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ， Ｓｃｈｒoｄｉｎｇｅｒ， ＬＬＣ， Ｐｏｒｔｌａｎｄ， ＯＲ， ｆｒｏｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ， Ｉｎｃ．， Ｍｏｎｔｒｅａｌ， ＱＣ， Ｃａｎａｄａなど）の市販品もあるし，ＺＩＮＣＰｈａｒｍｅｒと呼ばれるオープンアクセスプログラムもある。
発明の詳細な説明
本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏならびにｉｎ ｖｉｖｏで、Ｓ202、Ｔ231、及びＴ181の１つ又は複数でのτタンパク質の過剰リン酸化（リン酸化）を阻害する方法を企図する。そのような方法は、その阻害が必要であると認められる中枢神経系細胞（脳細胞など）に、配列番号１のＦＬＮＡペンタペプチドと結合する化合物であって、その化合物が１０μＭ濃度で存在し、同濃度で対照阻害剤として未標識のナロキソンを用いた場合に、ＦＩＴＣ標識化ナロキソン結合を少なくとも約６０％阻害し、好ましくは約７０％阻害する化合物を有効量で投与する工程を含む。この化合物はまた、好ましくは図３５〜図４０の６つのファルマコフォアのうち少なくとも４つを有する。より好適な化合物は、６つのファルマコフォアのうち少なくとも５つを有し、特に好適な化合物は６つのファルマコフォア全てを有する。
Ｓ202、Ｔ231、及びＴ181の１つ又は複数でのτタンパク質のリン酸化は、典型的には、このタンパク質の１つ又は複数のさらなる残基でのリン酸化に加えて起こる。そのようなリン酸化の存在は、本明細書中示されるとおり、これら３つのアミノ酸残基のうち１つでリン酸化されたτタンパク質と特異的に免疫反応する抗体（通常はモノクローナル抗体）の免疫反応により明らかにすることができる。
投与は、好ましくは、ＭＯＲ結合有効量の別個の外部から提供されるＭＯＲアゴニスト又はアンタゴニスト分子が存在しない状態で行われる。すなわち、外部から供給されるＭＯＲ結合化合物として、モルヒネ自身、コデイン、オキシコドンなどのようなＭＯＲ結合化合物は、企図する化合物を細胞に投与するときに、存在しない。外部から供給されるＭＯＲ結合化合物としてエンドルフィン又はエンケファリンなどの存在も、容易に制御することができないため、対象外とはならない。企図するＦＬＮＡペンタペプチド結合化合物のいくつかはＭＯＲにも結合し、それらの使用も、対象外とはならない。しかしながら、本明細書中以下に説明するとおり、仮にＭＯＲに結合するとしてもその結合が弱く、ＭＯＲアゴニストではない化合物を使用することが好ましい。そのような化合物は、同じ濃度及びアッセイ条件下で、ＤＡＭＧＯがもたらすＭＯＲ刺激の約８０％未満しかＭＯＲ刺激を示さない。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでのτタンパク質の過剰リン酸化（リン酸化）の阻害は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、培養ＣＮＳ細胞の溶解液又は他の細胞調製物において、ｉｎ ｖｉｖｏアッセイではＣＮＳ細胞（神経系上皮細胞用に鼻腔を擦過して得られる嗅神経細胞又は生検標本由来のものなど）の溶解液でアッセイすることができる。
同じく企図するのは、ＴＬＲ４含有細胞（リンパ球又はＣＮＳ細胞など）の炎症などのＴＬＲ４媒介性免疫応答を阻害する方法であり、この方法は、その阻害の必要があると認められるＴＬＲ４含有細胞に、配列番号１のフィラミンＡ（ＦＬＮＡ）のペンタペプチドと結合する化合物又はその薬学的に許容可能な塩であって、その化合物又は塩が１０μＭ濃度で存在し、同濃度で対照阻害剤として未標識のナロキソンを用いた場合に、ＦＩＴＣ標識化ナロキソン結合を少なくとも約６０％阻害し、より好ましくは約７０％阻害し、かつ図３５〜図４０の６つのファルマコフォアのうち少なくとも４つを有する化合物又はその塩を有効量で投与する工程を含む。投与は、好ましくは、μオピオイド受容体（ＭＯＲ）結合有効量の別個のＭＯＲアゴニスト又はアンタゴニスト分子が存在しない状態で行われる。投与される化合物は、好ましくは、本明細書中以下に記載されるとおり、ＭＯＲに結合するとしても弱いか又はＭＯＲに結合せず、例えば、その化合物は、同じ濃度で、ＤＡＭＧＯがもたらすＭＯＲ刺激の約８０％未満しかＭＯＲ刺激を示さない。
企図する化合物の単一の立体異性体又は立体異性体の混合物、あるいは薬学的に許容可能な塩の使用も、考慮に入っている。企図する投与は、ｉｎ ｖｉｖｏでもｉｎ ｖｉｔｒｏでも行うことが可能であり、ヒトなどの宿主動物の細胞にｉｎ ｖｉｖｏで投与される場合、典型的には、数日間又は数ヶ月間の期間にわたり複数回繰り返される。
投与される化合物は、図３５〜図４０の６つのファルマコフォアのうち少なくとも４つを有するが、より好ましくは、そのような企図する化合物は、図３５〜図４０の６つのファルマコフォアのうち少なくとも５つを有する。特に好ましくは、投与される化合物は、図３５〜図４０の６つのファルマコフォアのそれぞれを有する。
ＣＮＳ細胞のＴＬＲ４媒介性免疫応答炎症は、τタンパク質の過剰リン酸化及び関連するタウオパシー（ＮＦＴから生じるものなど）をもたらす。結果として、ＴＬＲ４媒介性炎症の存在をアッセイするやり方の１つは、過剰リン酸化τについて上記で記載したとおり、非炎症性状態で存在する量と比べて増加した量のリン酸化τが存在するかどうかをアッセイすることである。
ＴＬＲ４媒介性炎症は、バックグラウンド量よりも多いＴＬＲ４活性化タンパク質マーカーによっても認めることができ、ＴＬＲ４活性化タンパク質マーカーとしては、例えば、サイトカインＩＬ−１β、ＩＬ−６、及びＴＮＦα（これらは、典型的には、一緒に増加する）及び／又は別々に刺激されたＮＦ−κＢ及びＪＮＫタンパク質がある。既に指摘されたとおり、ＮＦ−κＢ及びＪＮＫの発現と比較してＩＬ−１β、ＩＬ−６、及びＴＮＦαの発現が向上することは、異なるＴＬＲ４媒介性経路により進行するためと思われる。しかしながら、同じ免疫刺激により、両方の炎症マーカーが同時に存在し得る。
すなわち、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、及びＴＮＦαのうち１つ、２つ、又は３つが、非炎症性状態で存在する量よりも増加した量で存在することは、ＴＬＲ４媒介性炎症の存在を示す。同様に、転写因子ＮＦ−κＢ及び分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼｃ−ＪｕｎＮ末端キナーゼ（ＪＮＫ）が、非炎症性状態で存在する量よりも存在量を増加させることは、独立して、ＴＬＲ４媒介性炎症の存在を暗示する。
これらのタンパク質又はポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｖｏアッセイ用には、リンパ球（Ｂ細胞、Ｔ細胞、及びマクロファージなど）又はＣＮＳ細胞（神経系上皮細胞用に鼻腔を擦過することで得ることができる嗅神経細胞など）などの培養細胞の溶解液でアッセイすることができる。タンパク質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究用には、本明細書中以下に記載されるものなどのリンパ球又はＣＮＳ細胞を用いて、細胞培養液中で、及びｉｎ ｖｉｖｏアッセイ用には、血液又はその構成血漿もしくは血清又はリンパ球などの体液中で、アッセイすることができる。
企図する化合物又はその薬学的に許容可能な塩の投与は、τ過剰リン酸化がそれ以上増加しなくなるまで、及び／又は１種又は複数のＴＬＲ４活性化タンパク質マーカーの量がバックグラウンドレベルになるまで、続けられる。過剰リン酸化τ又はＴＬＲ４タンパク質マーカーの１種のレベルが、バックグラウンド（ＴＬＲ４媒介性免疫応答がない）状態に対して上昇していることは、添付の図面に示されるとおり、少なくとも９０％信頼水準（ｐ＜０．１）で、好ましくは９５％信頼水準（ｐ＜０．０５）で、その差が統計的有意であることにより判定される。
投与される化合物又はその薬学的に許容可能な塩が、投与されるときには、薬学的組成物として薬学的に許容可能な希釈剤に溶解又は分散して存在することも好ましい。特に好ましくは、投与は経口である。
企図する化合物の薬学的に許容可能な塩の使用も考慮に入っており、単一の立体異性体又は立体異性体混合物、あるいはそれらの薬学的に許容可能な塩の使用も同様である。企図する投与は、ｉｎ ｖｉｖｏでもｉｎ ｖｉｔｒｏでも行うことができる。
本発明の好適な実施形態において、本発明は、１）τタンパク質のリン酸化、及び／又は２）リンパ球及び／又はＣＮＳ細胞のＴＬＲ４媒介性免疫応答（例えば、炎症）を阻害する方法を目論んでおり、本方法は、その阻害が必要と認められる中枢神経系の細胞（脳細胞など）に、系列Ａ、系列Ｂ、系列Ｃ−１、系列Ｃ−２、系列Ｄ、及び系列Ｅのうち１種又は複数の化合物、その企図する化合物いずれかの単一の鏡像異性体、鏡像異性体混合物、又は薬学的に許容可能な塩を有効量で投与することを含む。投与は、好ましくは、ＭＯＲ結合有効量の別個のＭＯＲアゴニスト又はアンタゴニスト分子が存在しない状態で行われる。ＣＮＳ細胞の例として、脳損傷（外傷性脳損傷など）、慢性外傷性脳障害により誘導される炎症を起こしている宿主動物の細胞、ならびにアルツハイマー病（ＡＤ）症候、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、進行性核上麻痺、ボクサー認知症、及び大脳皮質基底核変性症、ならびにグラム陽性菌及び／又はグラム陰性菌に感染している宿主動物（ヒトなど）の細胞などがある。
各系列の化合物の一般構造を以下に示す。これらの系列それぞれの化合物についての詳細な説明を、以下に続く「企図する化合物」のセクションで記載する。
Figure 0006630374
上記の方法によれば、企図する化合物又はその薬学的に許容可能な塩を有効量で、薬学的に許容可能な希釈剤に溶解又は希釈させた状態で含有する組成物を、ｉｎ ｖｉｖｏなら生きている動物で、又はｉｎ ｖｉｔｒｏなら細胞調製物で、投与の必要が認められるＣＮＳ細胞（特に脳）に投与する。動物（実験ラットもしくはマウスなど）又は必要が認められるヒトにｉｎ ｖｉｖｏで投与されると、その投与により、企図する化合物が投与された対象動物のＣＮＳ（脳など）でのリン酸化τ含有ＮＦＴ形成が阻害される。企図する化合物又はその薬学的に許容可能な塩を薬学的に許容可能な希釈剤に溶解又は希釈させた状態で含有する組成物を、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＮＳ細胞（脳細胞調製物など）と混合することによっても、本明細書中以下で説明するとおり、ＮＦＴの形成が阻害される。
企図する化合物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、足場ＦＬＮＡタンパク質に、特に、ＦＬＮＡタンパク質の配列Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ（配列番号１）という５残基からなる部分に結合する。このｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは、本明細書中以下の実施例１で説明するが、以下でも簡単に説明する。企図する化合物は、ＦＬＮＡの１カ所にのみ結合し、その部位が配列番号１ペンタペプチド部位である。
トリチウム標識化ナロキソン、すなわち［3Ｈ］ＮＬＸの、ＦＬＮＡ発現Ａ７細胞（ＳＶ４０大型Ｔ抗原を持つＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット胎児由来の視神経星状細胞を不死化することで作り出された星状細胞細胞株）由来の膜への結合に対するナルトレキソン阻害についての結合研究から、ＦＬＮＡに２つの親和性部位が存在することがわかった；３．９４ピコモル濃度というＩＣ50−Ｈの高親和性部位（Ｈ）及び８３４ピコモル濃度というＩＣ50−Ｌの低親和性部位（Ｌ）である。［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ３（２）：ｅ１５５４ （２００８）； Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ４（１）：ｅ４２８２ （２００９）。］高親和性部位は、その後、配列番号１のＦＬＮＡペンタペプチドと同定されたが（米国特許出願公開第２００９／０１９１５７９号、及びその前身である２００７年１１月２日出願の出願番号第６０／９８５，０８６号）、一方、低親和性部位は未だに同定されていない。
ナロキソン（ＮＬＸ）、ナルトレキソン（ＮＴＸ）、メサドン、フェンタニル、ナロルフィン、ナルブフィン、及びブプレノルフィンなどの化合物は、配列番号１の高親和性ＦＬＮＡペンタペプチド（ＶＡＫＧＬ）によく結合する。しかしながら、市販品のラベルに記載されている用量で使用される場合、これらの化合物は、ＦＬＮＡの低親和性部位にも結合し、また典型的にはＭＯＲにも結合する。これらの化合物のいくつかは、ＭＯＲアンタゴニストであり（ナロキソン、ナルトレキソン、ナルブフィンなど）、一方他の化合物（メサドン、ブプレノルフィン、及びフェンタニルなど）は、ＭＯＲの完全アゴニスト又は部分アゴニストである。低親和性ＦＬＮＡ部位への結合は、本明細書中説明し、利用し、例示する活性を配列番号１のＦＬＮＡペンタペプチドが発揮するというその発揮活性を損なう。結論として、ＦＬＮＡタンパク質の低親和性部位にも結合する化合物（ナロキソン、ナルトレキソン、メサドン、フェンタニル、ナロルフィン、ナルブフィン、ブプレノルフィン、及び類似化合物など）は、本明細書中で使用することを企図すない。
本発明で使用することを企図する化合物は、本明細書中以下の実施例１で定義される条件下、被覆されたストレプトアビジンプレートに結合したビオチン結合配列番号１（Ｂｎ−ＶＡＫＧＬ）への、フルオレセインイソチオシアネート標識化ナロキソン（ＦＩＴＣ−ＮＬＸ）の結合を、その企図する化合物が１０μＭ濃度で存在し、その化合物と同濃度で対照阻害剤としてナロキソンを用いた場合に得られる値の少なくとも約６０％、好ましくは約８０％から、上限は対照としてナロキソンを用いて得られる値の約２倍までの度合いで、阻害する。
ナルトレキソン（ＮＴＸ）も、対照阻害剤として使用できる。ＮＬＸではなくＮＴＸを用いて得られる平均阻害値は、絶対値で、ＮＬＸで得られる値よりも１〜２％低い傾向にある。つまり、例えば、ある具体的なＮＬＸ濃度での平均阻害値が４０％の場合、ＮＴＸで得られる値は約３８又は３９％になると予想することができる。企図する化合物についての結合阻害値は、予想されるＮＬＸ／ＮＴＸ値の差を考慮に入れて測定される。
他の結合研究において、Ｓｕｎｄｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．の米国特許第７，５６０，８８２号及び第８，１５３，７９５号は、Ｃ−１及びＣ−２系列の化合物と同様な化合物が、セロトニン再取り込み、ノルアドレナリン再取り込みの阻害に有用であり、バトラコトキシン（ＢＴＸ）受容体及び／又はカンナビノイド受容体（ＣＢ２）に対して高い親和性を有することを教示する。図４５に示す結果は、Ｓｕｎｄｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．の米国特許第７，５６０，８８２号が提供する定義の範囲内にある系列Ｄの化合物も、τ過剰リン酸化を阻害し、企図する方法に有用であることを示す。
本発明の系列Ａ、系列Ｃ−１、及び系列Ｃ−２グループの代表的な化合物を、Ｒｉｃｅｒｃａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＬＬＣ ｏｆ Ｔａｉｐｅｉ（Ｔａｉｗａｎ）において、発表されている技法を用いて競合的結合アッセイで試験することにより、６５を超える受容体、チャンネル、及び輸送体のいずれかに対して、化合物が結合を競合的に阻害することができるのかどうか明らかにした。試験には、ノルアドレナリンが結合するアドレナリン受容体、セロトニン受容体、ＢＴＸが結合するムスカリン受容体、及びカンナビノイド受容体が含まれる。研究した化合物はそれぞれ、これらのアッセイそれぞれにおいて、有意な阻害を示さなかった。
ファルマコフォアの決定
本発明の１つの態様は、ＦＬＮＡに存在する配列番号１のペンタペプチドに結合する化合物を用いて、τタンパク質のリン酸化を阻害するものである。この態様において、配列番号１のペンタペプチドに有効に結合する化合物の構造は、大きく変化するが、そのように結合するそれら化合物が共有するファルマコフォアのグループをコンピューター計算することで統合することができる。
本発明の方法で有用な企図する化合物は、図３５〜図４０の６つのファルマコフォアのうち少なくとも４つを有する。好適に実施される場合、企図する化合物は、これらの図の６つのファルマコフォアのうち５つを有し、より好ましくは、企図する化合物は、６つのファルマコフォア全てを有する。配列番号１のＦＬＮＡペンタペプチド（ＶＡＫＧＬ）によく結合するＮＬＸ、ＮＴＸ、メサドン、フェンタニル、ナロルフィン、ナルブフィン、及びブプレノルフィンの他に、本明細書中以下に説明する４種の構造系列の化合物が特に好ましい。
アンサンブルファルマコフォアモデルは、トレーニングセットに含まれる化合物の三次元立体構造を用いて、汎用コンピューターをプログラミングして組み立てた。実施例１で得られた０．１μＭでのデータを出発点に用いると、実施例１の各表にある化合物の一覧のうち１５３種の化合物は、ＦＬＮＡペンタペプチドへの結合活性が平均値の４５．５４％より小さい。「結合が弱い」化合物又は「弱い結合剤」は、実施例１で行われたとおりのアッセイにおいて結合阻害が平均値の４５．５４％に等しいかそれより小さい化合物として定義される。そうした化合物での結果は、実施例１の各表に示される。トレーニングセットは、ＦＬＮＡペンタペプチドに結合することが既知の１０種の化合物、上記の結合が弱い１５３種の化合物、及びＺＩＮＣデータベース（ｚｉｎｃ．ｄｏｃｋｉｎｇ．ｏｒｇ．）から無作為に選択された約１０００種の化合物で構成される。
ファルマコフォアの選択は、以下の工程を含む：１）全ての化合物について、最初に、コンピューターで発生させた三次元立体構造を用意した。２）既知の活性化合物の大部分に存在する４点ファルマコフォアの組を派生させた。３）既知の不活性化合物及び無作為に選択した化合物を参照化合物として用いて、参照化合物の大部分に存在しない４点ファルマコフォアだけを、ＦＬＮＡ結合活性と関連するものとして同定した。４）上記で求められたものから最終的に６つの４点ファルマコフォアを、１０種の活性化合物を最もよく表すものとして同定した。
試験しなかった化合物で６つのファルマコフォアのうち４つを有するものは、ＦＬＮＡペンタペプチドに対して活性な結合剤である可能性は約２０％である。６つのファルマコフォアのうち５つを有する化合物は、ＦＬＮＡペンタペプチドに対して活性な結合剤である可能性は約３２％であり、６つのファルマコフォアのうち６つを有する場合は約６０％である。
Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ（Ｍｏｎｔｒｅａｌ、Ｑｕｅｂｅｃ、Ｃａｎａｄａ）製のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ（ＭＯＥ）ソフトウェアを用いて、汎用コンピューターをプログラムして三次元立体構造を発生させ、活性化合物から４点ファルマコフォアを派生させ、これらのファルマコフォアを既知の不活性化合物及び無作為に選択した化合物に対して試験した。本明細書中使用されるとおりのファルマコフォアモデル計算は、Ｐｅｎｚｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．， ２００２， ４５（９）：１７３７−１７４０ （２００２）； Ｓｉｅｗ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ， ２１（１０）：２８９８−２９０５ （２０１１年５月１５日）； Ｌｅｏｎｇ， Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ． Ｔｏｘｉｃｏｌ．， ２０（２）：２１７−２２６ （２００７）；及びＬｉｎ， ｃｈｅｍｃｏｍｐ．ｃｏｍ／ｊｏｕｒｎａｌ／ｐｈ４．ｈｔｍ．に記載及び説明されるとおりに行われる。
いくつかの実施形態において、ＦＬＮＡ結合化合物は、ＭＯＲアゴニストでもあることが好ましい。他の実施形態において、ＦＬＮＡ結合化合物は、ＭＯＲアゴニストではないことが好ましい。ある化合物の有する結合性が、実施例２の表で用いられる２種の濃度のいずれかにおいて、［Ｄ−Ａｌａ２，Ｎ−ＭｅＰｈｅ４，Ｇｌｙ−ｏｌ］−エンケファリン（ＤＡＭＧＯ）の結合性の約８０％未満であるかぎり、その化合物は、本明細書中、ＭＯＲアゴニストではないと定義される。
トレーニングセットに含まれる１０種の既知のＦＬＮＡペンタペプチド結合化合物を、本明細書中それらに使用されるアルファベット数字表記と合わせて示す。
Figure 0006630374
ファルマコフォアを求めるためのトレーニングセットに用いられる上記の１０種の化合物のうち、９種は６つのファルマコフォア全てを有していた。ナロキソンは、６つのうち５つを有していた。本明細書中以下の実施例１で各表に示されるアッセイされた４つの群（系列Ａ、系列Ｂ、系列Ｃ−１、及び系列Ｃ−２）の化合物の構造のいくつかを更に調べたところ、更に２０種の化合物が６つのファルマコフォアのうち５つを有しており、更に別の２０種は６つのうち４つを有していた。
具体的に企図するＦＬＮＡ結合化合物
企図する方法で使用することを企図する化合物は、配列番号１のＦＬＮＡペンタペプチドに結合し、図３５〜図４０の６つのファルマコフォアのうち少なくとも４つを有する。そのような化合物は、上記のとおり様々な構造を有することが可能である。そのような構造多様性にも関わらず、企図する化合物は、標識化ナロキソン（ＦＩＴＣ−ＮＬＸ）の、被覆ストレプトアビジンプレートに結合したビオチン化ＶＡＫＧＬペンタペプチド（Ｂｎ−ＶＡＫＧＬ；配列番号１）への結合を、本明細書中以下の実施例１に定義される条件下で、同濃度でナロキソンを阻害剤として用いた場合に得られる値の少なくとも約８０％の度合いで阻害し、同濃度でナロキソンについての値の約２倍となり得る。
４種の例示構造を有する化合物が、配列番号１のペンタペプチドによく結合することが見いだされた。これらの化合物を、本明細書中、系列Ａ、系列Ｂ、系列Ｃ−１、系列Ｃ−２、系列Ｄ、及び系列Ｅと称する。化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃ、及び系列Ｄによるτリン酸化の阻害を、本明細書中例示するが、これらの化合物は、これらの構造系列を代表するものである。系列Ｅの化合物は、系列Ｃ−１及びＣ−２の化合物と重複し、従って、それらも本発明に含まれる。各系列の化合物の一般構造を、以下に示し、続いてより具体的に説明する。
Figure 0006630374
上記式のそれぞれの化合物の薬学的に許容可能な塩も、考慮に入っている。非対称（キラル）炭素を有する化合物、又はそのような化合物の塩は、立体異性体の形で存在し得る、すなわち２種の鏡像異性体が存在する。本発明は、個別の各鏡像異性体及びそれらの混合物の両方に関連する；すなわち、鏡像異性体型（ｄ型及びｌ型、又はＲ型及びＳ型）の両方及びそれらの混合物に関連する。更に、２つ以上のキラル中心が存在する場合、ジアステレオマーと呼ばれる立体異性体が形成され得るが、ジアステレオマーも考慮に入っている。
以下の定義からわかるとおり、企図する化合物は、１つ又は複数の重水素化炭素を有することができ、その場合重水素は、その通常の化学表記であるＤで指定される。重水素化化合物は、代謝経路及び生合成経路を解明するために生きている生命体での薬物相互作用の機構を研究するのに有用となり得る。重水素化は、企図する化合物のｉｎ ｖｉｖｏでの半減期も延長することができる。なぜなら、炭素重水素（Ｃ−Ｄ）結合は、炭素水素（Ｃ−Ｈ）結合よりも強く、そのため結合切断により大きなエネルギーを投入する必要があるからである。Ｂｌａｋｅ ｅｔ ａｌ．， １９７５ Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ． ６４（３）：３６７−３９１；及びＮｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２００３ Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ． Ｄｉｓｐｏｓ． ３１（１２）：１４８１−１４９８、ならびにそのなかの引用文献を参照。企図する重水素化化合物は、周知の反応を用いて調製される。
より詳細には、系列Ａの化合物は、以下の式Ａの構造に一致する：
Figure 0006630374
式中
Ｒ1及びＲ2は、同じであるか異なっていて、それぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ1−Ｃ12ヒドロカルビル、Ｃ1−Ｃ6アシル、Ｃ1−Ｃ6ヒドロカルビルオキシ、ＣＦ3、及びＮＲ3Ｒ4であり、
ＮＲ3Ｒ4中、Ｒ3及びＲ4は、同じであるか異なっていて、Ｈ、Ｃ1−Ｃ4ヒドロカルビル、Ｃ1−Ｃ4アシル、Ｃ1−Ｃ4ヒドロカルビルスルホニルであるか、又はＲ3とＲ4は、示されている窒素と一緒になって五員〜七員環を形成し、形成された環は随意に１又は２個の追加のヘテロ原子を含有し、追加のヘテロ原子はそれぞれ独立して窒素、酸素、又は硫黄であり；
Ａ及びＢは、同じであるか異なっていて、ＣＨ2、ＣＤＨ、又はＣＤ2であり（式中、Ｄは重水素であり）；
Ｘは、ＯＨ又はＮＲ5Ｒ6であり
ＮＲ5Ｒ6中、Ｒ5及びＲ6は、同じであるか異なっていて、Ｈ、Ｃ1−Ｃ4ヒドロカルビル、Ｃ1−Ｃ4アシル、Ｃ1−Ｃ4ヒドロカルビルスルホニルであるか、又はＲ5とＲ6は、示されている窒素と一緒になって五員〜七員環を形成し、形成された環は随意に１又は２個の追加のヘテロ原子を含有し、追加のヘテロ原子はそれぞれ独立して窒素、酸素、又は硫黄であり；
ＮＲ7Ｒ8中、Ｒ7及びＲ8は、同じであるか異なっていて、Ｈ、Ｃ1−Ｃ6ヒドロカルビル、Ｃ1−Ｃ6アシル、Ｃ1−Ｃ6ヒドロカルビルスルホニルであるか、又はＲ7とＲ8は、示されている窒素と一緒になって環構造Ｗを形成し；
Ｗは、示されている窒素を含めて５〜１４個の原子を、好ましくは上限１２個の原子を環構造中に有する。Ｗは、随意に以下を有することができる：
ａ）１又は２個のさらなるヘテロ原子、さらなるヘテロ原子はそれぞれ独立して、酸素、窒素、又は硫黄である、及びｂ）１つ又は複数の環原子に結合した１つ又は複数の置換基、この場合１つ又は複数の置換基は、合計で上限８個まで、好ましくは上限６個まで原子を有し、原子は、炭素、窒素、酸素、及び硫黄、ならびにそれらの混合物から成る群より選択される。
点線（−−−−）は、随意の二重結合を表す。
企図する化合物に関して、ＷがＮ−モルホリニル又はジメチル−Ｎ−モルホリニルであり、かつ随意の二重結合が存在しない場合、好ましくは、Ｒ1はメチルではなく、かつＲ2はイソプロピルではない。
式Ａの化合物で好適なものは、以下の式Ｉの化合物である（式中、Ａ、Ｂ、Ｘ、Ｗ、ならびにＲ1及びＲ2は、上記で定義されるとおりである）。
Figure 0006630374
１つの好適な実施形態において、企図する化合物は、式Ｉａの構造に一致する。
Figure 0006630374
この場合、Ｒ1及びＲ2は、同じであるか異なっていて、それぞれ独立してＨ、又はＣ1−Ｃ6ヒドロカルビルであり；Ａ及びＢは、同じであるか異なっていて、ＣＨ2、ＣＤＨ、又はＣＤ2であり；Ｗは、環構造体で、示されている窒素を含む５〜１４個の原子を環構造中に有し、随意に以下を有することができ：ａ）１、２、又は３個のさらなるヘテロ原子、さらなるヘテロ原子はそれぞれ独立して、酸素、窒素、又は硫黄である、及びｂ）１つ又は複数の環原子に結合した１つ又は複数の置換基、この場合１つ又は複数の置換基は、合計で上限１４個まで、好ましくは上限１２個まで、より好ましくは上限８個まで原子を有し、原子は、炭素、窒素、酸素、及び硫黄、ならびにそれらの混合物から成る群より選択される。点線（−−−−）は、１、２、又は３本の随意の二重結合を表す。好ましくは、ＷがＮ−モルホリニル又はジメチル−Ｎ−モルホリニルであり、かつ随意の二重結合が存在しない場合、Ｒ1はメチルではなく、かつＲ2はイソプロピルではない。
式Ｉ又は式Ｉａいずれかの化合物の実施形態のいくつかが好適に実施される場合、Ｗは更に、１つ又は複数の環原子に結合した１つ又は複数の置換基を含み、この場合１つ又は複数の置換基は、合計で上限８個まで原子を有し、原子は、炭素、窒素、酸素、及び硫黄、ならびにそれらの混合物から成る群より選択される。これらの原子に結合した水素原子は数えない。
１つの好適な実施形態において、式Ｉ及び式Ｉａの化合物は、式ＩＩの構造を有するが、一方別の好適な実施形態では、式Ｉ及び式Ｉａの化合物は、式ＩＩＩの構造を有する。
Figure 0006630374
式ＩＩ及び式ＩＩＩの化合物両方において、Ａ、Ｂ、Ｗ、及びＸは、上記の式Ｉ及び式Ｉａの化合物について先に定義したとおりである。式ＩＩの化合物の場合、Ｒ1及びＲ2は、式Ｉａの化合物についてＲ1及びＲ2が定義されるとおりに定義されるが、式ＩＩＩの化合物の場合、Ｒ1及びＲ2は、式Ｉの化合物についてＲ1及びＲ2が定義されるとおりに定義される。
より好ましくは、式ＩＩの化合物のＲ1基及びＲ2基は、３〜５個の炭素原子を有する。式ＩＩＩの化合物のうちいくつかについては、Ｒ1はＨであり、Ｒ2はハロゲン、Ｃ1−Ｃ6ヒドロカルビル、Ｃ1−Ｃ6アシル、Ｃ1−Ｃ6ヒドロカルビルオキシ、又はＮＲ3Ｒ4であり、一方他のものについては、２つのＲ基両方ともＨではなくて、上記で定義されるとおりに選択される。
式ＩＩ又は式ＩＩＩいずれかである化合物において、Ｗは、１又は２個のさらなるヘテロ原子を随意に有することができ、さらなるヘテロ原子はそれぞれ独立して酸素、窒素、又は硫黄であり、より好ましくは、そのようなヘテロ原子を少なくとも１個、常に有する。Ｗが更に、１個又は複数の環原子に結合した１つ又は複数の置換基を含むことも好適であり、この場合１つ又は複数の置換基は、合計で上限８個まで原子を有し、原子は、炭素、窒素、酸素、及び硫黄、ならびにそれらの混合物から成る群より選択され、これらの原子に結合した水素原子は数えない。
式ＩＩ及び式ＩＩＩの化合物で特に好適なものは、式ＩＩａ及び式ＩＩＩａの構造を有し、式中その他の基Ａ、Ｂ、Ｗ、Ｒ1及びＲ2は、上記で定義されるとおりである。
Figure 0006630374
系列Ｂの化合物は、概して以下の式Ｉに一致する：
Figure 0006630374
式中
ｎ＝０又は１であり；
ｍ＝０又は１であり；
ｍ＋ｎ＝０、１、又は２であり；
Figure 0006630374
Ｗは、芳香環であり、環中に０、１、又は２個のヘテロ原子を有し、ヘテロ原子は、その環において、窒素、酸素、又は硫黄、あるいはそれらの混合物が可能であり；
Ｒ1は、Ｈ、Ｃ1−Ｃ6ヒドロカルビル、Ｃ1−Ｃ6ヒドロカルビルオキシ、ハロゲン、シアノ、Ｃ1−Ｃ6ヒドロカルビルオキシヒドロカルボキシレン、トリフルオロメチル、及びヒドロキシルからなる群より選択され；
Ｒ2は、Ｈ、Ｃ1−Ｃ6ヒドロカルビル、Ｃ1−Ｃ6ヒドロカルビルオキシ、Ｃ1−Ｃ6ヒドロカルビルオキシヒドロカルボキシレン、及びハロゲンからなる群より選択され；
Ｒ3は、存在しないか、又はＣ1−Ｃ6ヒドロカルビルであり；
Ｒ4は、Ｃ1−Ｃ6ヒドロカルビルであり；
Ｘ-＝アニオンであるか、又はＲ3が存在しない場合は存在せず；
点線は、示されている炭素原子間の随意の二重結合を示し；かつ
波線は、随意の二重結合が存在する場合に、示されているフェニル置換基がＺ配置にあることもＥ配置にあることも可能であることを示す。
アニオンの例としては、一価でも多価でも可能である。企図するアニオンは、薬学的に許容可能なものであり、リン酸イオン、リン酸水素イオン、リン酸二水素イオン、硫酸イオン、重硫酸イオン、塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオン、酢酸イオン、ギ酸イオン、ベンゼンンスルホン酸イオン、メタンスルホン酸イオン、トルエンスルホン酸イオンなどが挙げられ、周知である。これら、及び他のアニオンは、Ｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．， １９７７ Ｊ． Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ． ６８（１）：１−１９に記載されている。
ｍ＋ｎ＝１又は２であり、かつ随意の二重結合は存在せず、むしろ飽和の単結合であることが好ましい。
好適に実施される場合、Ｗは六員環であるが、しかし五員環も考慮に入っている。すなわち、企図する芳香環は、０、１、又は２個のヘテロ原子を有することができ、ヘテロ原子は、窒素、酸素、又は硫黄、あるいはそれらの混合物であって、そのような芳香環として、フェニル、ピリジル、フラニル、イミダジル、オキサゾリルなどが挙げられる。いくつかの好適な実施形態において、Ｗは環窒素原子を含まない（０個有する）。他の実施形態において、好適な化合物は、環ヘテロ原子を含まず、環炭素原子のみを有するＷ基を有する。
Ｗは、好ましくは、１個又は複数の環原子に結合した１つ又は複数の置換基（Ｒ1及びＲ2）を有し、この場合１つ又は複数の置換基は、合計で上限１２個まで原子を有し、原子は、炭素、窒素、酸素、及び硫黄、ならびにそれらの混合物から成る群より選択され、ただし水素原子は数えない。環Ｗにあって好適な置換基は、Ｗ環に結合した酸素原子を有する。そのような化合物は、好ましくは、Ｃ1−Ｃ6ヒドロカルビルオキシ基（メトキシ基など）である。
Ｚ含有基は、ケト基が可能であるが、還元されてヒドロキシル基になることも可能である。どちらの基も好適である。
いくつかの実施形態において、Ｒ3及びＲ4の両方が、Ｃ1−Ｃ6ヒドロカルビル基であり、その両方がメチルである。他の実施形態において、一方はエチル基であり、他方はメチルであるか、存在しない。Ｒ3が存在しない場合、系列Ｂの化合物は、第三級アミンである。
１つの好適な実施形態において、式Ｉの系列Ｂの化合物は、式ＩＩの構造を有する、
Figure 0006630374
式中
ｎ＝０又は１であり；
ｍ＝０又は１であり；
ｍ＋ｎ＝０、１、又は２であり；
Figure 0006630374
Ｘ-＝アニオンであり；
Ｒ1は、Ｈ、Ｃ1−Ｃ6ヒドロカルビル、Ｃ1−Ｃ6ヒドロカルビルオキシ、ハロゲン、シアノ、Ｃ1−Ｃ6ヒドロカルビルオキシヒドロカルボキシレン、トリフルオロメチル、及びヒドロキシルからなる群より選択され；
Ｒ2は、Ｈ、Ｃ1−Ｃ6ヒドロカルビル、Ｃ1−Ｃ6ヒドロカルビルオキシ、Ｃ1−Ｃ6ヒドロカルビルオキシヒドロカルボキシレン、及びハロゲンからなる群より選択され；
点線は、示されている炭素原子間の随意の二重結合を示し；かつ
波線は、随意の二重結合が存在する場合に、示されているフェニル置換基がＺ配置にあることもＥ配置にあることも可能であることを示す。
いくつかの好適な実施形態において、Ｒ2＝Ｈである。いくつかのそのような実施形態において、Ｒ1は、示されているフェニル環に結合した酸素原子を含み、その酸素は好ましくはＣ1−Ｃ6ヒドロカルビルオキシ基の一部である。多くの化合物について、以下のとおりであることが好ましい：
Figure 0006630374
更に別の好適な実施形態において、企図する系列Ｂの化合物は、以下の式ＩＩＩに一致する構造を有する：
Figure 0006630374
式中、
ｎ＝０又は１であり；
ｍ＝０又は１であり；
ｍ＋ｎ＝０、１、又は２であり；
Ｘ-＝アニオンであり；
Ｒ1は、Ｈ、Ｃ1−Ｃ6ヒドロカルビル、Ｃ1−Ｃ6ヒドロカルビルオキシ、ハロゲン、シアノ、Ｃ1−Ｃ6ヒドロカルビルオキシヒドロカルボキシレン、トリフルオロメチル、及びヒドロキシルからなる群より選択され；かつ
Ｒ2は、Ｈ、Ｃ1−Ｃ6ヒドロカルビル、Ｃ1−Ｃ6ヒドロカルビルオキシ、Ｃ1−Ｃ6ヒドロカルビルオキシヒドロカルボキシレン、及びハロゲンからなる群より選択される。
他の系列Ｂの化合物の実施形態についてそうであったとおり、Ｒ2は、場合によりＨであり、Ｒ1及びＲ2の一方又は両方は、Ｃ1−Ｃ6ヒドロカルビルオキシ基（メトキシなど）である。式Ｉ、式ＩＩ、及び式ＩＩＩ、ならびに本明細書中開示される残りの系列Ｂの式全ての化合物の薬学的に許容可能な塩も考慮に入っている。
系列Ｃ−１の化合物は、概して、以下の式Ａに一致する。
Figure 0006630374
式系列Ｃ−１式Ａ中、Ｇ及びＷは、ＮＲ20、ＮＲ7、ＣＨ2、Ｓ、及びＯからなる群より選択され、式中、Ｒ7は、Ｈ、Ｃ1−Ｃ12ヒドロカルビル、又はＣ1−Ｃ12ヒドロカルボイル（アシル）であり、かつＲ20は、本明細書中以下で定義されるとおりのＸ−環Ａ−Ｒ1基であり、Ｇ及びＷは、好ましくはＮＲ20及びＮＲ7である。１つの好適な実施形態において、Ｇ及びＷの１つだけがＮＲ7であり、かつＧ及びＷの１つは、ＮＲ7又はＮＲ20でなければならない；
Ｘ及びＹは、同じであるか異なっていて、ＳＯ2、Ｃ（Ｏ）、ＣＨ2、ＣＤ2（式中、Ｄは重水素である）、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（ＮＨ）、ＮＨＣ（Ｓ）、又はＮＨＣ（Ｏ）であり；
Ｑは、ＣＨＲ9又はＣ（Ｏ）であり；Ｚは、ＣＨＲ10又はＣ（Ｏ）であり；
ｄ、ｅ、ｆ、及びｋは、それぞれ、０又は１いずれかであり、かつ合計（ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｋ）＝２である。いくつかの実施形態において、ｄが０の場合、ｅは０であり、及びｆが０の場合、ｇは０である。他の実施形態において、ｆが０の場合、ｄは０であり、又はｇが０の場合、ｅは０である。
ｍ、ｎ、及びｐは、それぞれ、０又は１であり、かつ全ての実施形態において、ｍ＋ｎ＋ｐの合計は、２又は３である。ｍ及びｎは、それぞれ、好ましくは１であり、かつｐは、ｍ＋ｎ＋ｐの合計が好ましくは２であるように、好ましくは０である。
環Ａ及び環Ｂは、同じであるか異なっていて、芳香環系又はヘテロ芳香環系である。基Ｒ1及び基Ｒ2は、同じであるか異なっていて、それぞれが、水素であることも可能であるし、水素以外の上限３個までの置換基を表すことも可能であり（すなわち、Ｒ1a、Ｒ1b、及びＲ1c、ならびにＲ2a、Ｒ2b、及びＲ2c）、上限３個までの置換基自身は、同じであっても異なっていてもよい。これら６つの基Ｒ1a-c及びＲ2a-cは、それぞれ個別に、Ｈ、Ｃ1−Ｃ6ヒドロカルビル、Ｃ1−Ｃ6ヒドロカルビルオキシ、Ｃ1−Ｃ6ヒドロカルビルオキシカルボニル、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、Ｃ1−Ｃ7ヒドロカルボイル（アシル）、ヒドロキシ置換、トリフルオロメチル（−ＣＦ3）置換、もしくはハロゲン置換のＣ1−Ｃ7ヒドロカルボイル、Ｃ1−Ｃ6ヒドロカルビルスルホニル、Ｃ1−Ｃ6ヒドロカルビルオキシスルホニル、ハロゲン、ニトロ、フェニル、シアノ、カルボキシル、Ｃ1−Ｃ7ヒドロカルビルカルボキシラート［Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｃ1−Ｃ7ヒドロカルビル］、カルボキサミド［Ｃ（Ｏ）ＮＲ3Ｒ4］もしくはスルホンアミド［Ｓ（Ｏ）2ＮＲ3Ｒ4］（式中、アミド窒素は、いずれの基に含まれていても式ＮＲ3Ｒ4を有し、式中、Ｒ3及びＲ4は、同じであるか異なっていて、Ｈ、Ｃ1−Ｃ4ヒドロカルビルであるか、又はＲ3とＲ4は、示されている窒素と一緒になって五員〜七員環を形成し、形成された環は随意に１又は２個の追加のヘテロ原子を含有し、追加のヘテロ原子はそれぞれ独立して窒素、酸素、又は硫黄である）、
ＭＡｒ（既に記載したとおり、式中、Ｍは、−ＣＨ2−、−Ｏ−、又は−Ｎ＝Ｎ−であり、かつＡｒは単環のアリール基である）、及びＮＲ5Ｒ6（式中、Ｒ5及びＲ6は、同じであるか異なっていて、かつＨ、Ｃ1−Ｃ4ヒドロカルビル、Ｃ1−Ｃ4アシル、Ｃ1−Ｃ4ヒドロカルビルスルホニルであるか、又はＲ5とＲ6は示されている窒素と一緒になって五員〜七員環を形成し、形成された環は随意に１又は２個の追加のヘテロ原子を含有し、追加のヘテロ原子はそれぞれ独立して窒素、酸素、又は硫黄である）からなる群より選択され；
Ｒ8、Ｒ9、及びＲ10は、それぞれＨであるか、又はＲ8、Ｒ9、及びＲ10のうち２つがＨであり、１つがＣ1−Ｃ8ヒドロカルビル基であって、このＣ1−Ｃ8ヒドロカルビル基は、無置換であるか、又は上限３個までの原子で置換され、原子は、同じであるか異なっていて、酸素又は窒素原子であり；
Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、及びＲ14は、全てＨであるか、あるいはＲ11とＲ12の対又はＲ13とＲ14の対のうち一方が示されている環と一緒になって飽和又は不飽和の六員環を形成し、他方の対がそれぞれＨであるか、あるいは他方の対は、本明細書中（このサブ段落において）記述されるとおりＨ及びＤである。
上記の好適な実施形態においてはまた、Ｘ及びＹが両方ともＳＯ2であり、ＷがＯであり、かつｐがゼロの場合、Ｒ1及びＲ2が両方ともメトキシであることはない。
別の好適な実施形態において、
ｉ）Ｇ及びＷのうち１つだけがＮＲ20であり、
ｉｉ）Ｇ及びＷのうち１つは必ずＮＲ20であり、
ｉｉｉ）（ａ）ｍ＋ｎ＋ｐの合計が２であり、かつ（ｂ）Ｇ及びＷのうち１つが、対応するＺ又はＱに結合したＮＲ20であり、そのＺ又はＱがＣ（Ｏ）である場合、Ｇ及びＷの他方はＮＲ7（式中、Ｒ7はＨ又は脂肪族Ｃ1ヒドロカルビル（すなわち、メチル）である）以外であり；及び
ｉｖ）Ｘ及びＹが両方ともＳＯ2であり、ＷがＯであり、ＱがＣＨ2であり、ｐが０であり、かつｄ及びｆが両方とも１である場合、Ｒ1及びＲ2は、（ａ）両方ともＨ、メトキシ、又はＣ1−Ｃ3−ヒドロカルビルである、（ｂ）Ｈ、ハロゲン、及びＣ1−Ｃ3−ヒドロカルビルである、（ｃ）Ｈ及びＣ1−Ｃ3−ヒドロカルビルである、（ｄ）ハロゲン及びＣ1−Ｃ3−ヒドロカルビルである、及び（ｅ）Ｈ及びハロゲンである、のどれでもない。
上記の好適な実施形態において、Ｘ及びＹが両方ともＳＯ2であり、ＷがＯであり、かつｐが０の場合、Ｒ1及びＲ2はまた、好ましくは、両方ともがメトキシであることはない。
系列Ｃ−１の式Ａ及び本明細書中開示される残りの系列Ｃ−１の式全ての化合物の薬学的に許容可能な塩も考慮に入っている。
１つの好適な系列Ｃ−１の実施形態において、ｅ及びｇは両方とも０であり、そうすると系列Ｃ−１の式Ａの化合物は、以下の系列Ｃ−１の式Ｂの化合物になる。
Figure 0006630374
式Ｂ中、式に使用される文字Ｇ、Ｊ、Ｅ、Ｆ、Ｋ、Ｗ、Ｑ、Ｚ、ｄ、ｅ、ｆ、ｋ、ｎ、ｍ、ｐ、Ｘ、Ｙ、環Ａ及び環Ｂ、ならびに全てのＲ基は、系列Ｃ−１の式Ａの化合物について既に定義したとおりである。好ましくは、Ｘ及びＹが両方ともＳＯ2であり、ＷがＯであり、かつｐが０の場合、Ｒ1及びＲ2は、両方ともがメトキシであることはない。
系列Ｃ−１の化合物の以下のサブ一般式全てにおいて、式に使用される文字Ｇ、Ｊ、Ｅ、Ｆ、Ｋ、Ｗ、Ｑ、Ｚ、ｄ、ｅ、ｆ、ｋ、ｎ、ｍ、ｐ、Ｘ、Ｙ、環Ａ及び環Ｂ、ならびに全てのＲ基は、特に他の定義がないかぎり、系列Ｃ−１の式Ａの化合物について既に定義したとおりである。更に、既に記述した内容は、示されている構造式がそのような内容を不可能にするものでないかぎり、同様に当てはまる。
より好ましくは、系列Ｃ−１の式Ｂの化合物は、以下の系列Ｃ−１の式Ｉの構造に一致する。
Figure 0006630374
系列Ｃ−１の式Ｉ中、Ｘ及びＹは、同じであるか異なっていて、ＳＯ2、Ｃ（Ｏ）、ＣＨ2、ＣＤ2、ＮＨＣ（ＮＨ）、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｓ）、又はＮＨＣ（Ｏ）であり；
Ｗは、ＮＲ7、ＣＨ2、Ｓ、又はＯ（式中、Ｒ7は、Ｈ、Ｃ1−Ｃ12ヒドロカルビル、又はＣ1−Ｃ12ヒドロカルボイル（アシル）である）であり、好ましくはＮＲ7であり；
Ｑは、ＣＨＲ9又はＣ（Ｏ）であり；
Ｚは、ＣＨＲ10又はＣ（Ｏ）であり；
Ｊ及びＦは、同じであるか異なっていて、ＣＨ又はＣＤ（式中、Ｄは重水素である）であり；
ｍ、ｎ、及びｐはそれぞれ、０又は１であり、かつｍ＋ｎ＋ｐの合計は、２又は３、好ましくは２であり；かつ
環Ａ及び環Ｂは、同じであるか異なっていて、１つの環又は縮合した２つの環を含む芳香環系又はヘテロ芳香環系である。基Ｒ1及び基Ｒ2は、同じであるか異なっていて、それぞれが、水素であることも可能であるし、水素以外の上限３個までの置換基を表すことも可能であり（すなわち、Ｒ1a、Ｒ1b、及びＲ1c、ならびにＲ2a、Ｒ2b、及びＲ2c）、上限３個までの置換基自身は、同じであっても異なっていてもよい。これら６つの基Ｒ1a-c及びＲ2a-cは、それぞれ個別に、Ｈ、Ｃ1−Ｃ6ヒドロカルビル、Ｃ1−Ｃ6ヒドロカルビルオキシ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、Ｃ1−Ｃ7ヒドロカルボイル（アシル）、ヒドロキシ置換、トリフルオロメチル−（−ＣＦ3）置換、もしくはハロゲン置換のＣ1−Ｃ7ヒドロカルボイル、Ｃ1−Ｃ6ヒドロカルビルスルホニル、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、又はＢｒ、好ましくはＣｌ）、ニトロ、フェニル、シアノ、カルボキシル、Ｃ1−Ｃ7ヒドロカルビルカルボキシラート［Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｃ1−Ｃ7ヒドロカルビル］、カルボキサミド［Ｃ（Ｏ）ＮＲ3Ｒ4］もしくはスルホンアミド［ＳＯ2ＮＲ3Ｒ4］（式中、アミド窒素は、いずれの基（カルボキサミド又はスルホンアミド）に含まれていても式ＮＲ3Ｒ4を有し、式中、Ｒ3及びＲ4は、同じであるか異なっていて、Ｈ、Ｃ1−Ｃ4ヒドロカルビルであるか、又はＲ3とＲ4は、示されている窒素と一緒になって五員〜七員環を形成し、形成された環は随意に１又は２個の追加のヘテロ原子を含有し、追加のヘテロ原子はそれぞれ独立して窒素、酸素、又は硫黄である）、ＭＡｒ（式中、Ｍは、−ＣＨ2−、−Ｏ−、又は−Ｎ＝Ｎ−であり、かつＡｒは単環のアリール基である）、及びＮＲ5Ｒ6（式中、Ｒ5及びＲ6は、同じであるか異なっていて、Ｈ、Ｃ1−Ｃ4ヒドロカルビル、Ｃ1−Ｃ4アシル、Ｃ1−Ｃ4ヒドロカルビルスルホニルであるか、又はＲ5とＲ6は示されている窒素と一緒になって五員〜七員環を形成し、形成された環は随意に１又は２個の追加のヘテロ原子を含有し、追加のヘテロ原子はそれぞれ独立して窒素、酸素、又は硫黄である）からなる群より選択され；
Ｒ8、Ｒ9、及びＲ10は、それぞれＨであるか、又はＲ8、Ｒ9、及びＲ10のうち２つがＨであり、１つがＣ1−Ｃ8ヒドロカルビル基であって、このＣ1−Ｃ8ヒドロカルビル基は、無置換であるか、又は上限３個までの原子で置換され、原子は、同じであるか異なっていて、酸素又は窒素原子であり；かつ
Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、及びＲ14は、全てＨであるか、又はＲ11及びＲ13はＨでありかつＲ12及びＲ14はＨ又はＤであるか、又はＲ11とＲ12の対又はＲ13とＲ14の対のうち一方が、示されている環と一緒になって飽和又は不飽和の六員環を形成し、他方の対がそれぞれＨであるか、あるいは他方の対は、本明細書中（このサブ段落において）記述されるとおりＨ及びＤである。
Ｘ及びＹが両方ともＳＯ2であり、ＷがＯであり、かつｐが０の場合、Ｒ1及びＲ2は、好ましくは、両方ともがメトキシであることはない。
他の好適な実施形態において、ＸとＹは同じものである。Ｘ及びＹは、好ましくは、両方ともＣ（Ｏ）又は両方ともＳＯ2であり、より好ましくは両方ともＳＯ2である。これら及び他の実施形態において、Ｗは、好ましくはＯである。ｐが０であることも好ましい。
環Ａ又は環Ｂの芳香環系又はヘテロ芳香環系として企図する環系は、１つの環又は縮合した２つの環を含むことが可能であり、好ましくは単独の芳香環を含む。芳香環系又はヘテロ芳香環系の例は、フェニル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、トリアジニル（１，３，５−トリアジニル、１，２，４−トリアジニル、及び１，２，３−トリアジニル）、フラニル、チエニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、ナフチル、ベンゾフラニル、イソベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、イソベンゾチオフェニル、ベンゾオキサゾリル、ベンズイソキサゾール、キノリル、イソキノリル、キナゾリル、シンノリニル、キノキサリニル、ナフチリジニル、ベンゾピリミジニル、及びそれらの混合物からなる群より選択される。環Ａの芳香環系又はヘテロ芳香環系と環Ｂの芳香環系又はヘテロ芳香環系が異なる場合、上記文の混合物が生じる。
置換基ＭＡｒの単環のアリール基の例は、フェニル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、トリアジニル（１，３，５−トリアジニル、１，２，４−トリアジニル、及び１，２，３−トリアジニル）、フラニル、チエニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、及びイソチアゾリルからなる群より選択される。
フェニルは、環Ａ及び環Ｂの芳香環系又はヘテロ芳香環系に好適である。フェニル、ピリジニル、及びフラニルは、ＭＡｒ置換基の単環のアリール基、Ａｒに好適であり、フェニルが特に好適である。
置換基Ｒ基に関していくつかのそれぞれ独立した別々な優先性が存在する。すなわち、環Ａ及び環Ｂが両方とも水素以外の単独置換基を有するためには、Ｒ1及びＲ2は、好ましくは水素以外の同じ単独置換基である。単独置換基であるＲ1及びＲ2は、好ましくはそれぞれの含まれる環系において同じ相対位置に配置される。
こうして、Ｘ及びＹは、環Ａ又は環Ｂの環系から中心スピロ環の示されている窒素原子への、スルホンアミド連結部、カルボキサミド連結部、尿素連結部、チオ尿素連結部、グアニジノ連結部、又はメチレン連結部を形成することができる。スピロ６，６−環系又はスピロ５，６−環系である中心環を、１つの窒素及び１つの酸素と、又は２つの窒素原子と合わせて有する化合物を企図する。中心スピロ環の例を以下に示すが、式中、波線は、他の実体との共有結合が存在することを示すために用いられており、かつＲ7は上記で定義され、Ｒ8はＨである。
Figure 0006630374
式Ａの例示化合物のうち、式中、ｄ及びｅがそれぞれ０であり、かつＲ11、Ｒ12、及びＲ13がそれぞれＨであるものは、非対称スピロ環構造を有し、そのうちのいくつかを以下に示す。式中、波線は、他の実体との共有結合が存在することを示し、かつＲ7は上記で定義され、Ｒ8はＨである。
Figure 0006630374
好適に実施される場合、中心環がスピロ５，６−環系であり、その環系の六員環が無置換かつスピロ結合が六員環の窒素に対して４位にあるようにするためには、ｐは０であり、ｅ及びｇは両方とも０であり、かつＲ11、Ｒ12、及びＲ13は全てＨである。これとは別に、ＷがＯであることが好ましい。式中、ＸとＹが同じである化合物が好ましい。これとは別に、Ｘ及びＹが両方ともＳＯ2（スルホニル）であることも好ましい。
系列Ｃ−１式Ａの化合物で上記のそれぞれ別個の優先性を具体化した特に好適なものは、系列Ｃ−１式ＩＩの化合物である：
Figure 0006630374
式中
環Ａ及び環Ｂ、Ｚ、Ｑ、ｍ、ｎ、ｐ、Ｒ1、Ｒ2、及びＲ8は、示されるとおりの式において、式Ａの化合物に対してなされた定義が不可能でないかぎり、系列Ｃ−１の化合物について上記で記載されるとおりであり；かつＪ及びＦは、同じであるか異なっていて、ＣＨ2、ＣＨＤ、又はＣＤ2（式中、Ｄは重水素である）である。
環Ａ及び環Ｂは、それぞれ、フェニル、フラニル、又はピリジルであり、かつＲ1及びＲ2は、それぞれ、単独の置換基であることがより好ましい。置換基Ｒ基に関していくつかの独立した別個の優先性が存在する。すなわち、Ｒ1及びＲ2は、好ましくは同じである。Ｒ1及びＲ2はまた好ましくは、それぞれの含まれる環において同じ相対位置に配置される。つまり、Ｒ1が４−シアノならば、Ｒ2も４−シアノである。スピロで示される上の環が環原子を５個有するように、ｍ＋ｎ＋ｐの合計＝２であることも好ましい。
好適なＲ1置換基及びＲ2置換基は、約７．２〜７．４のｐＨ値において、それら自身は化合物に正電荷も負電荷も与えない。
他の実施形態において、系列Ｃ−１式Ａの化合物で特に好適なものは、系列Ｃ−１式ＩＩＩの化合物である：
Figure 0006630374
式中
環Ａ及び環Ｂ、Ｚ、Ｑ、ｍ、ｎ、ｐ、Ｒ1、Ｒ2、及びＲ8は、示されるとおりの式において、先になされた定義が不可能でないかぎり、系列Ｃ−１の化合物について既に記載されたとおりであり；Ｊ及びＦは、同じであるか異なっていて、ＣＨ2、ＣＨＤ、又はＣＤ2（式中、Ｄは重水素である）であり；かつＸ及びＹは、両方ともＣＯであるか、又はＸとＹは異なっていて、ＳＯ2、Ｃ（Ｏ）、ＣＨ2、ＣＤ2（式中、Ｄは重水素である）、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（ＮＨ）、ＮＨＣ（Ｓ）、又はＮＨＣ（Ｏ）である。既出の優先性は、上記の構造式で不可能でないかぎり、同じく当てはまる。
より好ましくは、環Ａ及び環Ｂは、それぞれ、フェニル、フラニル、又はピリジルである。Ｒ1及びＲ2は、同じであって、トリフルオロメチル、Ｃ1−Ｃ6アシル、Ｃ1−Ｃ4アルキルスルホニル、ハロゲン、ニトロ、シアノ、カルボキシル、Ｃ1−Ｃ4アルキルカルボキシラート、カルボキサミドからなる群より選択され、この群において、アミド窒素は式ＮＲ3Ｒ4を有し、式中、Ｒ3及びＲ4は、同じであるか異なっていて、Ｈ、Ｃ1−Ｃ4アルキル、及びＮＲ5Ｒ6であり、式中、Ｒ5及びＲ6は、同じであるか異なっていて、Ｈ、Ｃ1−Ｃ4アルキル、Ｃ1−Ｃ4アシル、Ｃ1−Ｃ4アルキルスルホニルである。
Ｒ1及びＲ2は、それぞれ、単独の置換基であることが、更により好ましい。置換基Ｒ基に関していくつかの独立した別個の優先性が存在する。Ｒ1及びＲ2は、好ましくは同じである。Ｒ1及びＲ2はまた好ましくは、それぞれの含まれる環において同じ相対位置に配置される。すなわち、Ｒ1が４−シアノならば、Ｒ2も４−シアノである。スピロで示される上の環が環原子を５個有するように、ｐ＝０かつｍ＋ｎ＋ｐの合計＝２であることも好ましい。
更に他の実施形態において、系列Ｃ−１式Ａの化合物で特に好適なものは、系列Ｃ−１式ＩＶの化合物である：
Figure 0006630374
式中
環Ａ及び環Ｂ、Ｚ、Ｑ、ｍ、ｎ、ｐ、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ7、及びＲ8は、示されるとおりの式において、系列Ｃ−１の化合物について先になされた定義が不可能でないかぎり、系列Ｃ−１の化合物について既に記載されたとおりであり；Ｊ及びＦは、同じであるか異なっていて、ＣＨ2、ＣＨＤ、又はＣＤ2（式中、Ｄは重水素である）であり；かつＸ及びＹは、同じであるか異なっていて、ＳＯ2、Ｃ（Ｏ）、ＣＨ2、ＣＤ2（式中、Ｄは重水素である）、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（ＮＨ）、ＮＨＣ（Ｓ）、又はＮＨＣ（Ｏ）である。既出の優先性は、上記の構造式で不可能でないかぎり、同じく当てはまる。
より好ましくは、環Ａ及び環Ｂは、それぞれ、フェニル、フラニル、又はピリジルである。Ｒ1及びＲ2は、同じであって、トリフルオロメチル、Ｃ1−Ｃ6アシル、Ｃ1−Ｃ4アルキルスルホニル、ハロゲン、ニトロ、シアノ、カルボキシル、Ｃ1−Ｃ4アルキルカルボキシラート、カルボキサミドからなる群より選択され、この群において、アミド窒素は式ＮＲ3Ｒ4を有し、式中、Ｒ3及びＲ4は、同じであるか異なっていて、Ｈ、Ｃ1−Ｃ4アルキル、及びＮＲ5Ｒ6であり、式中、Ｒ5及びＲ6は、同じであるか異なっていて、Ｈ、Ｃ1−Ｃ4アルキル、Ｃ1−Ｃ4アシル、Ｃ1−Ｃ4アルキルスルホニルである。
Ｒ1及びＲ2は、それぞれ、単独の置換基であることが更により好ましい。置換基Ｒ基に関していくつかの独立した別個の優先性が存在する。Ｒ1及びＲ2は、好ましくは同じである。Ｒ1及びＲ2はまた好ましくは、それぞれの含まれる環において同じ相対位置に配置される。すなわち、Ｒ1が４−シアノならば、Ｒ2も４−シアノである。スピロで示される上の環が環原子を５個有するように、ｍ＋ｎの合計＝１であることも好ましい。
なお、Ｅ、Ｊ、Ｆ、Ｇ、Ｋ、Ｑ、Ｗ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、ｄ、ｅ、ｆ、ｋ、ｎ、ｍ、ｐ、環Ａ、及び環Ｂ、ならびにＲ基の全てに関して既に述べられた優先性は、特定の式に対して適切であるとおりに、系列Ｃ−１式Ａ、Ｂ、及びＩ〜ＩＶの化合物に当てはまる。
系列Ｃ−２の化合物は、概して、以下の式Ａに一致する。
Figure 0006630374
系列Ｃ−２式Ａ中、
Ｑは、ＣＨＲ9又はＣ（Ｏ）であり、Ｚは、ＣＨＲ10又はＣ（Ｏ）であり、かつＱ及びＺのうち１つだけがＣ（Ｏ）であり；
ｍ及びｎ及びｐは、それぞれが０また１であり、かつｍ＋ｎ＋ｐの合計は、２又は３、好ましくは２であり；
Ｇ、Ｐ、及びＷは、それぞれが、ＮＲ20、ＮＲ2、ＮＲ7、Ｓ、及びＯからなる群より選択され、式中、Ｒ7及びＲ2は、同じであるか異なっていて、Ｈ、Ｃ（Ｈ）v（Ｄ）h（式中、ｖ及びｈは、それぞれが、０、１、２、又は３であり、かつｖ＋ｈ＝３）、Ｃ（Ｈ）q（Ｄ）r−脂肪族Ｃ1−Ｃ11ヒドロカルビル（式中、ｑ及びｒは、それぞれが、０、１、又は２であり、かつｑ＋ｒ＝０、１又は２であり、ｑ＋ｒ＝０の場合の脂肪族Ｃ1−Ｃ12ヒドロカルビルを含む）、脂肪族Ｃ1−Ｃ12ヒドロカルビルスルホニル、又は脂肪族Ｃ1−Ｃ12ヒドロカルボイル（アシル）であり、かつＲ20は、本明細書中以下で定義されるとおりのＸ−環Ａ−Ｒ1である。
好ましくは、１つの実施形態において、
ｉ）Ｇ、Ｐ、及びＷのうち１つだけがＮＲ20であり、
ｉｉ）Ｇ、Ｐ、及びＷのうち１つは必ずＮＲ20であり、
ｉｉｉ）Ｐは、ＮＲ20でなければＮＲ2であり、
ｉｖ）（ａ）ｍ＋ｎ＋ｐの合計が２であり、かつ（ｂ）Ｇ及びＷのうち１つが、対応するＺ又はＱに結合したＮＲ20、ＮＲ2、又はＮＲ7であり、そのＺ又はＱがＣ（Ｏ）である場合、Ｇ及びＷの他方はＮＲ2でもＮＲ7でもなく（式中、Ｒ2及びＲ7はＨ又は脂肪族Ｃ1ヒドロカルビルである）；及び
ｖ）（ａ）ｍ＋ｎ＋ｐの合計が２であり、かつ存在するＱ又はＺがＣＨ2であり、（ｂ）ＮＲ20でないＧ又はＷがＯであり、かつ（ｃ）Ｒ20が−Ｓ（Ｏ）2フェニル−Ｒ1（式中、Ｒ1は、Ｈ、Ｃ1−Ｃ3−ヒドロカルビル又はハロゲンである）である場合、ＰはＮＲ2であり、式中、Ｒ2は、−Ｓ（Ｏ）2Ｃ1−Ｃ3−ヒドロカルビル以外である。
ｄ、ｅ、ｆ、及びｋは、それぞれが、０又は１いずれかであり、（ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｋ）の合計＝２である。いくつかの実施形態において、ｄが０の場合、ｅは０であり、及びｆが０の場合、ｋは０である。他の実施形態において、ｋが０の場合、ｅは０であり、及びｄが０の場合、ｆは０である。
Ｊ及びＦは、同じであるか異なっていて、ＣＨ又はＣＤ（式中、Ｄは重水素である）である。
Ｅ及びＫは、同じであるか異なっていて、ＣＨ2、ＣＨＤ、又はＣＤ2（式中、Ｄは重水素である）である。
Ｘは、ＳＯ2、Ｃ（Ｏ）、ＣＨ2、ＣＤ2、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（ＮＨ）、ＮＨＣ（Ｓ）、又はＮＨＣ（Ｏ）であり、好ましくは、ＳＯ2、Ｃ（Ｏ）、又はＣＨ2である。いくつかの実施形態において、Ｘは、より好ましくは、ＣＨ2又はＳＯ2である。他の実施形態において、Ｘは、好ましくは、ＳＯ2、ＮＨＣ（ＮＨ）、ＮＨＣ（Ｓ）、又はＮＨＣ（Ｏ）である。
環Ａは、芳香環系又はヘテロ芳香環系であり、この環系は、好ましくは単環を含むが、縮合した２つの環を含むこともできる。Ｒ1は、Ｈであるか、又は上限３個までの置換基（Ｒ1a、Ｒ1b、及びＲ1c）を表し、上限３個までの置換基自身は、同じであっても異なっていてもよく、これら３つの基、Ｒ1a-cは、それぞれが個別に、Ｈ、Ｃ1−Ｃ6ヒドロカルビル、Ｃ1−Ｃ6ヒドロカルビルオキシ、Ｃ1−Ｃ6ヒドロカルビルオキシカルボニル、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、Ｃ1−Ｃ7ヒドロカルボイル、ヒドロキシ置換、トリフルオロメチル（−ＣＦ3）置換、又はハロゲン置換Ｃ1−Ｃ7ヒドロカルボイル、Ｃ1−Ｃ6ヒドロカルビルスルホニル、Ｃ1−Ｃ6ヒドロカルビルオキシスルホニル、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、又はＢｒ、好ましくはＣｌ）、ニトロ、フェニル、シアノ、カルボキシル、Ｃ1−Ｃ7ヒドロカルビルカルボキシラート［Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｃ1−Ｃ7ヒドロカルビル］、カルボキサミド［Ｃ（Ｏ）ＮＲ3Ｒ4］又はスルホンアミド［Ｓ（Ｏ）2ＮＲ3Ｒ4］（式中、アミド窒素は、いずれのアミド基に含まれていても式ＮＲ3Ｒ4を有し、式中、Ｒ3及びＲ4は、同じであるか異なっていて、Ｈ、Ｃ1−Ｃ4ヒドロカルビルであるか、又はＲ3とＲ4は、示されている窒素と一緒になって五員〜七員環を形成し、形成された環は随意に１又は２個の追加のヘテロ原子を含有し、追加のヘテロ原子はそれぞれ独立して窒素、酸素、又は硫黄である）、ＭＡｒ（式中、Ｍは、−ＣＨ2−、−Ｏ−、又は−Ｎ＝Ｎ−であり、かつＡｒは、単環のアリール基又はヘテロアリール基である）、及びＮＲ5Ｒ6（式中、Ｒ5及びＲ6は、同じであるか異なっていて、Ｈ、Ｃ1−Ｃ4ヒドロカルビル、Ｃ1−Ｃ4アシル、Ｃ1−Ｃ4ヒドロカルビルスルホニルであるか、又はＲ5とＲ6は、示されている窒素と一緒になって五員〜七員環を形成し、形成された環は随意に１又は２個の追加のヘテロ原子を含有し、追加のヘテロ原子はそれぞれ独立して窒素、酸素、又は硫黄であり）からなる群より選択される。
Ｒ8、Ｒ9、及びＲ10は、それぞれＨであることが好ましいが、又はＲ8、Ｒ9、及びＲ10のうち２つがＨであり、１つがＣ1−Ｃ8ヒドロカルビル基であって、このＣ1−Ｃ8ヒドロカルビル基は、無置換であるか、又は上限３個までの原子で置換され、原子は、同じであるか異なっていて、酸素又は窒素原子（適切であれば、水素を含む）である。
Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、及びＲ14は、全てＨであるか、又はＲ11及びＲ13はＨであり、かつＲ12及びＲ14はＨ又はＤであるか、又はＲ11とＲ12の対又はＲ13とＲ14の対のうち一方が、示されている環と一緒になって飽和又は不飽和の六員環を形成し、他方の対がそれぞれＨであるか、あるいは他方の対は、本明細書中（このサブ段落において）記載されるとおりＨ及びＤである。
上記の式Ａの化合物の別の好適な実施形態において、
ｉ）Ｇ、Ｐ、及びＷのうち１つだけがＮＲ20であり、
ｉｉ）Ｇ、Ｐ、及びＷのうち１つは必ずＮＲ20であり、及び
ｉｉｉ）Ｐは、ＮＲ20でなければＮＲ2である。
更に、ＱはＣＨＲ9又はＣ（Ｏ）であり；かつ
Ｚは、ＣＨＲ10又はＣ（Ｏ）であり、ただし、その他のＪ、Ｅ、Ｆ、Ｋ、Ｘ、Ｚ、ｄ、ｅ、ｆ、ｋ、ｎ、ｍ、ｐ、環Ａ、及びＲ基の全ては、構造式において不可能でないかぎり、上記のとおりに定義される。
系列Ｃ−２の式Ａ及び本明細書中開示される残りの式全ての化合物の薬学的に許容可能な塩も考慮に入っている。
好適な実施形態において、系列Ｃ−２式Ａの化合物は、式Ｂ又は式Ｃいずれかの構造に一致し、薬学的に許容可能な塩として存在することが可能であり、随意に、個々の鏡像異性体型の両方を含んで（すなわちラセミ体）、ジアステレオマーを含んで、及びそれらの混合物を含んで存在することができる。
Figure 0006630374
系列Ｃ−２式Ｂの構造に一致する系列Ｃ−２の化合物において、Ｇ及びＷは、ＮＲ20、ＮＲ7、Ｓ、及びＯからなる群より選択され、式中、Ｒ2及びＲ7は、同じであるか異なっていて、Ｃ（Ｈ）v（Ｄ）h（式中、Ｄは重水素であり、ｖ及びｈは、それぞれ、０、１、２、又は３であり、かつｖ＋ｈ＝３である）、Ｃ（Ｈ）q（Ｄ）r−脂肪族Ｃ1−Ｃ11ヒドロカルビル（式中、Ｄは重水素であり、ｑ及びｒは、それぞれ、０、１、又は２であり、かつｑ＋ｒ＝０、１、又は２である）、脂肪族Ｃ1−Ｃ12ヒドロカルビルスルホニル、又は脂肪族Ｃ1−Ｃ12ヒドロカルボイルであるか、又はＲ2及びＲ20は、同じであるか異なっていて、かつＲ20は、Ｘ−環Ａ−Ｒ1である。
好ましくは、１つの実施形態において、
ｉ）Ｇ及びＷのうち１つだけがＮＲ20であり、
ｉｉ）Ｇ及びＷのうち１つは必ずＮＲ20であり、
ｉｉｉ）（ａ）ｍ＋ｎ＋ｐの合計が２であり、かつ（ｂ）ＮＲ20であるＧ又はＷが、対応するＺ又はＱに結合していて、そのＺ又はＱがＣ（Ｏ）である場合、ＮＲ20ではないＧ又はＷは、ＮＲ2でもＮＲ7でもなく（式中、Ｒ2又はＲ7は、Ｈ又は脂肪族Ｃ1ヒドロカルビルである）；及び
ｉｖ）（ａ）ｍ＋ｎ＋ｐの合計が２であり、かつ存在するＱ又はＺがＣＨ2であり、（ｂ）ＮＲ20でないＧ又はＷがＯであり、かつ（ｃ）Ｒ20が−Ｓ（Ｏ）2フェニル−Ｒ1（式中、Ｒ1は、Ｈ、Ｃ1−Ｃ3−ヒドロカルビル又はハロゲンである）である場合、示されるＮＲ2のＲ2は、−Ｓ（Ｏ）2Ｃ1−Ｃ3−ヒドロカルビル以外である。
別の好適な実施形態において、：
ｉ）Ｇ及びＷのうち１つだけがＮＲ20であり、
ｉｉ）Ｇ及びＷのうち１つは必ずＮＲ20であり、
ｉｉｉ）ＮＲ20ではないＧ又はＷは、ＮＲ2又はＮＲ7であり（式中、Ｒ2又はＲ7は、Ｈ又は脂肪族Ｃ1ヒドロカルビルである）、
（ｉｖ）ｍ＋ｎ＋ｐの合計は２であり、及び
（ｖ）ＮＲ20であるＧ又はＷは、対応するＺ又はＱに結合していて、そのＺ又はＱはＣ（Ｏ）である。
更に別の好適な実施形態において：
ｉ）Ｇ及びＷのうち１つだけがＮＲ20であり、
ｉｉ）Ｇ及びＷのうち１つは必ずＮＲ20であり、
ｉｉｉ）ＮＲ20ではないＧ又はＷは、ＮＲ7であり（式中、Ｒ7は、Ｈ又は脂肪族Ｃ1ヒドロカルビルである）、
（ｉｖ）ｍ＋ｎ＋ｐの合計は２であり、
（ｖ）ＮＲ20であるＧ又はＷは、対応するＺ又はＱに結合していて、そのＺ又はＱはＣ（Ｏ）であり、
（ｖｉ）示されるＮＲ2のＲ2は、同じ又は異なるＲ20であり、及び
（ｖｉｉ）Ｒ20は、Ｘ−環Ａ−Ｒ1である。
式Ｃの化合物の場合、Ｇ及びＷは、ＮＲ2、ＮＲ7、Ｓ、及びＯからなる群より選択され、式中、Ｒ2及びＲ7は、同じであるか異なっていて、Ｈ、Ｃ（Ｈ）v（Ｄ）h（式中、Ｄは重水素であり、ｖ及びｈは、それぞれ、０、１、２、又は３であり、かつｖ＋ｈ＝３である）、Ｃ（Ｈ）q（Ｄ）r−脂肪族Ｃ1−Ｃ11ヒドロカルビル（式中、ｑ及びｒは、それぞれが、０、１、又は２であり、かつｑ＋ｒ＝０、１又は２である）、脂肪族Ｃ1−Ｃ12ヒドロカルビルスルホニル、又は脂肪族Ｃ1−Ｃ12ヒドロカルボイルである。
好ましくは、別の実施形態において：
ｉ）Ｇ及びＷのうち１つは必ずＮＲ2又はＮＲ7であり、及び
ｉｉ）（ａ）ｍ＋ｎ＋ｐの合計が２であり、かつ（ｂ）Ｇ及びＷのうち１つが、対応するＺ又はＱに結合したＮＲ2又はＮＲ7であり、そのＺ又はＱがＣ（Ｏ）である場合、Ｇ及びＷの他方はＮＲ2でもＮＲ7でもない（式中、Ｒ2又はＲ7は、Ｈ又は脂肪族Ｃ1ヒドロカルビルである）。
系列Ｃ−２の式Ｂ及び式Ｃ両方において、それらの構造式に続く段落で特に定義されていない記号Ｘ、Ｚ、Ｑ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｎ、ｍ、環Ａ、及びＲ基の全ては、示されるとおりの式において、先になされた定義が不可能でないかぎり、系列Ｃ−２式Ａの化合物について既に定義されたとおりである。既に記載された優先性も、示されるとおりの式において、先になされた優先性が不可能でないかぎり、同じく先に記載したとおりである。
１つの実施形態において、系列Ｃ−２の式Ａ及び式Ｂの化合物で好適なものは、式Ｉの構造を有する：
Figure 0006630374
式中、Ｊ及びＦは、同じであるか異なっていて、ＣＨ2、ＣＨＤ、又はＣＤ2（式中、Ｄは重水素である）であり；かつ、式中で定義されるＷ、Ｘ、Ｚ、Ｑ、ｎ、ｍ、ｐ、環Ａ、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ8、及びＲ基は、示されるとおりの式において、先になされた定義が不可能でないかぎり、系列Ｃ−２式Ａの化合物について既に記載されたとおりである。好ましくは、ｉ）（ａ）ｍ＋ｎ＋ｐの合計が２であり、かつ存在するＱ又はＺがＣＨ2であり、（ｂ）ＮＲ20ではないＧ又はＷが、Ｏであり、かつ（ｃ）Ｒ20が、−Ｓ（Ｏ）2フェニル−Ｒ1（式中、Ｒ1は、Ｈ、Ｃ1−Ｃ3−ヒドロカルビル、又はハロゲンである）である場合、示されているＮＲ2のＲ2は、−Ｓ（Ｏ）2Ｃ1−Ｃ3−ヒドロカルビル以外であり、かつｉｉ）（ａ）ｍ＋ｎ＋ｐの合計が２であり、かつ（ｂ）ＺがＣ（Ｏ）である場合、Ｗは、ＮＲ2でもＮＲ7でもない（式中、Ｒ2又はＲ7は、Ｈ又は脂肪族Ｃ1ヒドロカルビルである）。
Ｒ8がＨであり、ｎ及びｍのうち１つが０であり、残りのＺ又はＱがＣＨ2である別の好適な実施形態において、系列Ｃ−２の式Ａ、式Ｂ、及び式Ｉの化合物は、系列Ｃ−２式ＩＩの構造を有する：
Figure 0006630374
式中、Ｊ及びＦは、同じであるか異なっていて、ＣＨ2、ＣＨＤ、又はＣＤ2（式中、Ｄは重水素である）であり；かつ
式中で定義されるＸ、Ｗ、環Ａ、Ｒ1、Ｒ2、及びＲ基は、示されるとおりの式において、先になされた定義が不可能でないかぎり、系列Ｃ−２式Ａの化合物について既に記載されたとおりである。ＷがＯであり、かつＸ−環Ａ−Ｒ1が−Ｓ（Ｏ）2フェニル−Ｒ1（式中、Ｒ1は、Ｈ、Ｃ1−Ｃ3−ヒドロカルビル、又はハロゲンである）である場合、好ましくは、示されているＮＲ2のＲ2は、−Ｓ（Ｏ）2Ｃ1−Ｃ3−ヒドロカルビル以外である。
Ｒ8がＨである更に好適な実施形態において、系列Ｃ−２の式Ａ、式Ｂ、及び式Ｉの化合物は、系列Ｃ−２式ＩＩＩの構造を有する：
Figure 0006630374
式中、Ｊ及びＦは、同じであるか異なっていて、ＣＨ2、ＣＨＤ、又はＣＤ2（式中、Ｄは重水素である）であり；
ｍ及びｎは、それぞれ、１であり；かつ
式中で定義されるＷ、Ｘ、Ｚ、Ｑ、環Ａ、Ｒ1、Ｒ2、及びＲ基は、示されるとおりの式において、先になされた定義が不可能でないかぎり、系列Ｃ−２式Ａの化合物について既に記載されたとおりである。
１つの好適な実施形態において、ｉ）ＺはＣ（Ｏ）であり、ｉｉ）ＱはＣＨ2であり、ｉｉｉ）ＷはＮＨであり、かつＲ2はＨ又は直鎖、分岐鎖、もしくは環状のＣ1−Ｃ12脂肪族ヒドロカルビルであり、ｉｖ）Ｘは好ましくはＣＨ2、ＳＯ2、ＮＨＣ（ＮＨ）、ＮＨＣ（Ｓ）、又はＮＨＣ（Ｏ）であり、より好ましくはＣＨ2である。別の好適な実施形態において、ｉ）Ｚ及びＱの１つはＣ（Ｏ）であり、かつｉｉ）ＺがＣ（Ｏ）の場合、Ｗは、ＮＲ2でもＮＲ7でもなく（式中、Ｒ2及びＲ7は、Ｈ又は脂肪族Ｃ1ヒドロカルビルである）、かつｉｉｉ）Ｘは好ましくは、ＣＨ2、ＳＯ2、ＮＨＣ（ＮＨ）、ＮＨＣ（Ｓ）、又はＮＨＣ（Ｏ）である。
更に他の好適な実施形態において、ｉ）ＺはＣ（Ｏ）であり、ｉｉ）ＱはＣＨ2であり、ｉｉｉ）ＷはＮＨであり、（ｖｉ）Ｒ2は同じ又は異なるＲ20であり、及び（ｖｉｉ）Ｒ20は、Ｘ−環Ａ−Ｒ1である。この実施形態において、Ｘは、好ましくは、ＣＨ2、ＳＯ2、ＮＨＣ（ＮＨ）、ＮＨＣ（Ｓ）、又はＮＨＣ（Ｏ）であり、より好ましくはＣＨ2である。
企図する方法を行うために本発明で最も好適な化合物は、構造が、上記の式ＩＩＩに一致し、式中、ｉ）ＺはＣ（Ｏ）であり、ｉｉ）ＱはＣＨ2であり、ｉｉｉ）ＷはＮＨであり、かつＲ2はＨ又は直鎖、分岐鎖、もしくは環状の、Ｃ1−Ｃ12、好ましくはＣ1−Ｃ8、より好ましくはＣ1−Ｃ6の、脂肪族ヒドロカルビル基であり、ｉｖ）ＸはＣＨ2であり、かつ環Ａ−Ｒ1は、置換基Ｘ−環Ａ−Ｒ1がベンジル基となるように、無置換フェニルである。本発明で特に好適なＮ−（ベンジルアミド）−無置換−アミン化合物の例として、化合物Ｃ０１０５Ｍ、Ｃ０１１５Ｍ、及びＣ０１２４Ｍが挙げられ、それらの構造式を以下に示す。
Figure 0006630374
更に他の好適な実施形態において、系列Ｃ−２の式Ａ及び式Ｃの化合物は、系列Ｃ−２式ＩＶの構造を有する：
Figure 0006630374
式中、Ｊ及びＦは、同じであるか異なっていて、ＣＨ2、ＣＨＤ、又はＣＤ2（式中、Ｄは重水素である）であり；かつ
式中で定義されるＷ、Ｘ、Ｚ、Ｑ、環Ａ、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ8、及びＲ基は、示されるとおりの式において、先になされた定義が不可能でないかぎり、系列Ｃ−２式Ａの化合物について先に記載されたとおりである。
１つの好適な実施形態において、ｉ）ｐが０であり、ｍ＋ｎ＋ｐの合計が２であり、かつＺがＣ（Ｏ）である場合、Ｗは、ＮＲ2でもＮＲ7でもなく（式中、Ｒ2及びＲ7は、Ｈ又は脂肪族Ｃ1ヒドロカルビルである）、及びｉｉ）ｐが０であり、ｍ＋ｎ＋ｐの合計が２であり、ＷがＮＲ2又はＮＲ7であり、かつＱがＣ（Ｏ）である場合、示されているＮＲ2のＲ2は、Ｈでも脂肪族Ｃ1ヒドロカルビルでもない。
Ｒ8がＨであり、ｎ及びｍの１つが０であり、残っているＺ又はＱがＣＨ2である更に別の好適な実施形態において、式Ａ、式Ｃ、及び式ＩＶの化合物は、系列Ｃ−２式Ｖの構造を有する：
Figure 0006630374
式中、Ｊ及びＦは、同じであるか異なっていて、ＣＨ2、ＣＨＤ、又はＣＤ2（式中、Ｄは重水素である）であり；かつ、式中で定義されるＸ、Ｗ、環Ａ、Ｒ1、Ｒ2、及びＲ基は、示されるとおりの式において、先になされた定義が不可能でないかぎり、系列Ｃ−２の化合物について既に記載されたとおりである。
Ｒ8がＨである更に別の好適な実施形態において、式Ａ、式Ｃ、及び式Ｉの化合物は、系列Ｃ−２式ＶＩの構造を有する：
Figure 0006630374
式中、Ｊ及びＦは、同じであるか異なっていて、ＣＨ2、ＣＨＤ、又はＣＤ2（式中、Ｄは重水素である）であり；かつ
ｍ及びｎは、それぞれ１であり；式中で定義されるＷ、Ｘ、Ｚ、Ｑ、環Ａ、Ｒ1、Ｒ2、及びＲ基は、示されるとおりの式において、先になされた定義が不可能でないかぎり、系列Ｃ−２の化合物について既に記載されたとおりである。
好ましくは、ｉ）Ｚ及びＱの１つは、Ｃ（Ｏ）であり、ｉｉ）ＺがＣ（Ｏ）である場合、Ｗは、ＮＲ2でもＮＲ7でもなく（式中、Ｒ2又はＲ7は、Ｈ又は脂肪族Ｃ1ヒドロカルビルである）、及びｉｉｉ）ＷがＮＲ2又はＮＲ7であり、かつＱがＣ（Ｏ）である場合、示されているＮＲ2のＲ2は、Ｈでも脂肪族Ｃ1ヒドロカルビルでもない。上記式の化合物において、Ｘは、好ましくは、ＳＯ2、ＮＨＣ（ＮＨ）、ＮＨＣ（Ｓ）、又はＮＨＣ（Ｏ）である。
なお、Ｘ、Ｗ、Ｚ、Ｑ、ｄ、ｅ、ｆ、ｋ、ｎ、ｍ、環Ａ、及びＲ基の全てに当てはまるとして先に記載された優先性も、示されるとおりの式において、先になされた定義が不可能でないかぎり、系列Ｃ−２の式Ａ、式Ｂ、式Ｃ、及び式Ｉ〜ＶＩの化合物に当てはまる。
企図する化合物の１つが有する環Ａの芳香環（アリール）系として企図するものは、好ましくは、単独の芳香環を含むが、縮合した２つの環を含むこともできる。環Ａの芳香環系の例は、フェニル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、トリアジニル（１，３，５−トリアジニル、１，２，４−トリアジニル、及び１，２，３−トリアジニル）、フラニル、チエニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、ナフチル、ベンゾフラニル、イソベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、イソベンゾチオフェニル、ベンゾオキサゾリル、ベンズイソキサゾール、キノリル、イソキノリル、キナゾリル（quinazolyl）、シンノリニル、キノキサリニル、ナフチリジニル、及びベンゾピリミジニルからなる群より選択される。
環Ａ基又は環Ａの置換基ＭＡｒの中の単環のアリール又はヘテロアリール基の例は、フェニル基、ピリジル基、ピラジニル基、ピリミジニル基、ピリダジニル基、トリアジニル基（１，３，５−トリアジニル、１，２，４−トリアジニル、及び１，２，３−トリアジニル）、フラニル基、チエニル基、オキサゾリル基、イソオキサゾリル基、チアゾリル基、及びイソチアゾリル基からなる群より選択される。
フェニル、ピリジニル、及びフラニルが、環Ａの芳香環系又はヘテロ芳香環系として好適であるが、フェニルがより好適である。フェニル、ピリジニル、及びフラニルは、ＭＡｒ置換基の中の単環のアリール基又はヘテロアリール基Ａｒとしても好適であるが、フェニルが特に好適である。
Ｘ及びＹは、中心スピロ環の示されている窒素原子から環Ａ環系までをつなぐ、スルホンアミド（Ｎ−ＳＯ2−環Ａ）連結部、カルボキサミド［Ｎ−Ｃ（＝Ｏ）−環Ａ）連結部、尿素［カルボニルジイミノ；Ｎ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−環Ａ］連結部、チオ尿素［チオカルボニルジイミノ；Ｎ−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−環Ａ］連結部、グアニジノ［Ｎ−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ−環Ａ］連結部、又はアミノメチレン（Ｎ−ＣＨ2−環Ａ）連結部を形成することができる。
上記系列Ｃ−２の各式の化合物をより綿密に調べると、この式は、２つの環を有する置換スピロ化合物を定義するものであり、化合物は、２つの六員環、又は１つの六員環と１つの五員環を有することが可能である（「ｍ」及び「ｎ」の一方が１であり他方が０である場合にそうなる）ことがわかる。２つの環の１つ（式中、下側の環）は、六員環中に１つの窒素原子を有し、残りの環原子は炭素である。環原子を５個又は６個有することができる環（式中、上側の環）は、１個の環窒素原子と４個もしくは５個の炭素原子、又は２個の窒素原子、１個の窒素原子と１個の硫黄原子、もしくは１個の窒素原子と１個の酸素原子を、３個もしくは４個の環炭素と合わせて有することができる。中心スピロ環の例を、以下に示すが、式中、波線は、他の実体との共有結合が存在することを示し、及びＲ7は上記で定義され、及び明確にするため、Ｒ8はＨである。
Figure 0006630374
系列Ｃ−２式Ａの化合物で、式中、ｄ及びｅがそれぞれ０であり、かつＲ11、Ｒ12、及びＲ13がそれぞれＨであるものは非対称スピロ環構造を有し、そのような化合物の例として、いくつかを以下に示す。ただし、波線は、他の実体との共有結合が存在することを示し、及びＲ7は上記で定義され、及び明確にするため、Ｒ8はＨである。
Figure 0006630374
系列Ｃ−２の式Ａ、式Ｂ、及び式Ｃの化合物が好適に実施される場合、ｐは０であり、ｅ及びｇは、両方とも０であり、かつＲ11、Ｒ12、及びＲ13は全てＨであり、そうすると、中心環はスピロ５，６−環系になり、その環系の六員環が無置換で、かつその環系のスピロ結合が六員環の窒素に対して４−位にあるようになる。これとは別に、ＷがＯ、Ｓ、又はＮＲ7であることが好ましい。ＸがＳＯ2（スルホニル）であることも好ましい。
芳香族置換基、すなわち環Ａは、スピロ環の１つの窒素原子と、Ｘ基を介して結合しており、Ｘ基は、ＳＯ2、Ｃ（Ｏ）、ＣＨ2、ＣＤ2、ＯＣ（＝Ｏ）、ＮＨＣ（＝ＮＨ）、ＮＨＣ（＝Ｓ）、又はＮＨＣ（＝Ｏ）、好ましくはＳＯ2、Ｃ（Ｏ）、ＣＨ2、又はＣＤ2、特に好ましくはＣＨ2及びＳＯ2である。その結果、芳香族置換基は、スピロ環部分に、スルホンアミド連結部、アミド連結部、メチレン連結部、尿素連結部、チオ尿素連結部、又はグアニジノ連結部を介して結合している。アリールスルホンアミド架橋、アリールアミド架橋、及びフェニルメチレン架橋（ベンジル化合物）が好ましいが、アリールスルホンアミド及びフェニルメチレンが特に好ましい。
系列Ａ、系列Ｂ、系列Ｃ−１、系列Ｃ−２、系列Ｄ、及び系列Ｅの化合物の多く、ならびにナロキソン及びナルトレキソンなどの化合物は、配列番号１のペプチドに結合するだけではなく、ＭＯＲにも結合してその受容体を活性化又は刺激する。ナロキソン及びナルトレキソンのＭＯＲとの結合は、配列番号１のペンタペプチドにそれらが結合する場合の約２００分の１の弱い結合である。実施例２の表は、系列Ａ、系列Ｂ、系列Ｃ−１、及び系列Ｃ−２の例示化合物について、ＭＯＲ刺激活性に基づいた相対結合能力を示す。
いくつかの実施形態において、企図する方法に有用な化合物は、ＭＯＲによく結合してＭＯＲを活性化することが好ましい。そのような場合、その化合物は、表に示す濃度において、ＤＡＭＧＯの結合度合いの少なくとも約±２０％でＭＯＲに結合することが好ましく、そのような結合は、化合物がその受容体にとって完全アゴニストであることを示す。他の実施形態において、本発明に有用な化合物は、ＭＯＲにあまりよく結合しないことが好ましい。そのような実施形態の場合、その化合物は、同濃度においてＤＡＭＧＯがもたらすＭＯＲ刺激の約８０％未満しかＭＯＲ刺激を示さず、更に下限はゼロ結合／刺激まであることが好ましい。系列Ａ、系列Ｂ、系列Ｃ−１、及び系列Ｃ−２の例示化合物について、本明細書中以下の実施例２の表に、ＤＡＭＧＯが記載される濃度で存在する場合の代表的な結合パーセンテージを示す。
系列Ｄの１，４，８−トリアザスピロ［４，５］−デカン−２−オン化合物は、構造が以下の式又はそれらの生理学的に許容可能な塩に一致する：
Figure 0006630374
式中、Ｒ1は、水素；直鎖もしくは分岐鎖の、無置換もしくは少なくとも１置換のアルキル基、この基は連結部として少なくとも１個のヘテロ原子を有することができる；直鎖もしくは分岐鎖の、無置換もしくは少なくとも１置換のアルケニル基、この基は連結部として少なくとも１個のヘテロ原子を有することができる；直鎖もしくは分岐鎖の、無置換もしくは少なくとも１置換のアルキニル基、この基は連結部として少なくとも１個のヘテロ原子を有することができる；無置換もしくは少なくとも１置換のアリール基又は無置換もしくは少なくとも１置換のヘテロアリール基、このアリール基及びヘテロアリール基は、直鎖もしくは分岐鎖のアルキレン基を介して結合してもよく、アルキレン基は連結部として少なくとも１個のヘテロ原子を有することができる；あるいは、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ7基、この基は直鎖もしくは分岐鎖のアルキレン基を介して結合することができる、を表し；
Ｒ2は、水素；直鎖もしくは分岐鎖の、無置換もしくは少なくとも１置換のアルキル基、この基は連結部として少なくとも１個のヘテロ原子を有することができる；直鎖もしくは分岐鎖の、無置換もしくは少なくとも１置換のアルケニル基、この基は連結部として少なくとも１個のヘテロ原子を有することができる；直鎖もしくは分岐鎖の、無置換もしくは少なくとも１置換のアルキニル基、この基は連結部として少なくとも１個のヘテロ原子を有することができる；無置換もしくは少なくとも１置換のアリール基又は無置換もしくは少なくとも１置換のヘテロアリール基、このアリール基及びヘテロアリール基は、直鎖もしくは分岐鎖のアルキレン基を介して結合してもよく、アルキレン基は連結部として少なくとも１個のヘテロ原子を有することができる、を表し；
Ｒ3は、−Ｓ（＝Ｏ）2−Ｒ4基；−Ｃ（＝Ｓ）ＮＨ−Ｒ5基；又は−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−Ｒ6基；を表し；
Ｒ4は、−ＮＲ10Ｒ11基；直鎖もしくは分岐鎖の、無置換もしくは少なくとも１置換のアルキル基、この基は連結部として少なくとも１個のヘテロ原子を有することができる；直鎖もしくは分岐鎖の、無置換もしくは少なくとも１置換のアルケニル基、この基は連結部として少なくとも１個のヘテロ原子を有することができる；直鎖もしくは分岐鎖の、無置換もしくは少なくとも１置換のアルキニル基、この基は連結部として少なくとも１個のヘテロ原子を有することができる；無置換もしくは少なくとも１置換のアリール基又は無置換もしくは少なくとも１置換のヘテロアリール基、これらの基は直鎖もしくは分岐鎖の、無置換もしくは少なくとも１置換のアルキレン基を介して結合してもよく、アルキレン基は連結部として少なくとも１個のヘテロ原子を有することができ、更に無置換もしくは少なくとも１置換の単環式環系と縮合してもよい；無置換もしくは少なくとも１置換のシクロ脂肪族基、この基は環員として少なくとも１個のヘテロ原子を有することができ、かつこの基は直鎖もしくは分岐鎖の、無置換もしくは少なくとも１置換のアルキレン基を介して結合することができ、アルキレン基は連結部として少なくとも１個のヘテロ原子を有することができ、かつアルキレン基は直鎖もしくは分岐鎖の、無置換もしくは少なくとも１置換のアルキレン基により架橋されることができる、を表し；
Ｒ5は、直鎖もしくは分岐鎖の、無置換もしくは少なくとも１置換のアルキル基、この基は連結部として少なくとも１個のヘテロ原子を有することができる；直鎖もしくは分岐鎖の、無置換もしくは少なくとも１置換のアルケニル基、この基は連結部として少なくとも１個のヘテロ原子を有することができる；直鎖もしくは分岐鎖の、無置換もしくは少なくとも１置換のアルキニル基、この基は連結部として少なくとも１個のヘテロ原子を有することができる；無置換もしくは少なくとも１置換のアリール基又は無置換もしくは少なくとも１置換のヘテロアリール基、この基は直鎖もしくは分岐鎖の、無置換もしくは少なくとも１置換のアルキレン基を介して結合してもよく、アルキレン基は連結部として少なくとも１個のヘテロ原子を有することができる；無置換もしくは少なくとも１置換のシクロ脂肪族基、この基は環員として少なくとも１個のヘテロ原子を有することができるか、又はこの基は直鎖もしくは分岐鎖の、無置換もしくは少なくとも１置換のアルキレン基を介して結合することができ、アルキレン基は連結部として少なくとも１個のヘテロ原子を有することができる；−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ8基又は−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ9基、いずれの場合にしろ、この基は直鎖もしくは分岐鎖のアルキレン基を介して結合することができる、を表し；
Ｒ6は、無置換もしくは少なくとも１置換のアリール基又は無置換もしくは少なくとも１置換のヘテロアリール基、これらのアリール基及びヘテロアリール基は直鎖もしくは分岐鎖の、無置換もしくは少なくとも１置換のアルキレン基を介して結合してもよく、アルキレン基は連結部として少なくとも１個のヘテロ原子を有することができる；あるいは、無置換もしくは少なくとも１置換のシクロ脂肪族基、この基は環員として少なくとも１個のヘテロ原子を有することができるか、又はこの基は直鎖もしくは分岐鎖の、無置換もしくは少なくとも１置換のアルキレン基を介して結合することができ、アルキレン基は連結部として少なくとも１個のヘテロ原子を有することができる、を表し；
Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、及びＲ11は、それぞれ独立して、直鎖又は分岐鎖のアルキル基、直鎖又は分岐鎖のアルケニル基、あるいは直鎖又は分岐鎖のアルキニル基を表す。
上記の式と一致する１，４，８−トリアザスピロ［４，５］−デカン−２−オン化合物にとって好ましくは、Ｒ1は、水素；直鎖又は分岐鎖の、無置換又は少なくとも１置換のＣ1-10アルキル基、この基は連結部として少なくとも１個のヘテロ原子を有することができる；直鎖又は分岐鎖の、無置換又は少なくとも１置換のＣ2-10アルケニル基、この基は連結部として少なくとも１個のヘテロ原子を有することができる；直鎖又は分岐鎖の、無置換又は少なくとも１置換のＣ2-10アルキニル基、この基は連結部として少なくとも１個のヘテロ原子を有することができる；無置換又は少なくとも１置換の五員〜十四員のアリール基又はヘテロアリール基、この基は直鎖又は分岐鎖のＣ1-5アルキレン基を介して結合することができ、アルキレン基は連結部として少なくとも１個のヘテロ原子を有することができる；−Ｃ＝Ｏ）ＯＲ7基、この基は直鎖又は分岐鎖のＣ1-5アルキレン基を介して結合することができる、を表し；
Ｒ2は、水素；直鎖又は分岐鎖の、無置換又は少なくとも１置換のＣ1-10アルキル基、この基は連結部として少なくとも１個のヘテロ原子を有することができる；直鎖又は分岐鎖の、無置換又は少なくとも１置換のＣ2-10アルケニル基、この基は連結部として少なくとも１個のヘテロ原子を有することができる；直鎖又は分岐鎖の、無置換又は少なくとも１置換のＣ2-10アルキニル基、この基は連結部として少なくとも１個のヘテロ原子を有することができる；無置換又は少なくとも１置換の五員の〜十四員のアリール又はヘテロアリール基、この基は直鎖又は分岐鎖のＣ1-5アルキレン基を介して結合することができ、アルキレン基は連結部として少なくとも１個のヘテロ原子を有することができる、を表し；
Ｒ4は、ＮＲ10Ｒ11基；直鎖又は分岐鎖の、無置換又は少なくとも１置換のＣ1-10アルキル基、この基は連結部として少なくとも１個のヘテロ原子を有することができる；直鎖又は分岐鎖の、無置換又は少なくとも１置換のＣ2-10アルケニル基、この基は連結部として少なくとも１個のヘテロ原子を有することができる；直鎖又は分岐鎖の、無置換又は少なくとも１置換のＣ2-10アルキニル基、この基は連結部として少なくとも１個のヘテロ原子を有することができる；無置換又は少なくとも１置換の五員〜十四員のアリール基又はヘテロアリール基、この基は直鎖又は分岐鎖の、無置換又は少なくとも１置換のＣ1-5アルキレン基を介して結合することができ、アルキレン基は連結部として少なくとも１個のヘテロ原子を有することができ、更に五員〜六員の単環式環系と縮合してもよい；無置換又は少なくとも１置換のＣ3-8−シクロ脂肪族基、この基は環員として少なくとも１個のヘテロ原子を有することができるか、又は直鎖又は分岐鎖の、無置換又は少なくとも１置換のＣ1-5アルキレン基を介して結合することができ、アルキレン基は連結部として少なくとも１個のヘテロ原子を有することができ、かつアルキレン基は直鎖又は分岐鎖の、無置換又は少なくとも１置換のＣ1-5アルキレン基を介して結合することができる、を表し；
Ｒ5は、直鎖又は分岐鎖の、無置換又は少なくとも１置換のＣ1-10アルキル基、この基は連結部として少なくとも１個のヘテロ原子を有することができる；直鎖又は分岐鎖の、無置換又は少なくとも１置換のＣ2-10アルケニル基、この基は連結部として少なくとも１個のヘテロ原子を有することができる；直鎖又は分岐鎖の、無置換又は少なくとも１置換のＣ2-10アルキニル基、この基は連結部として少なくとも１個のヘテロ原子を有することができる；無置換又は少なくとも１置換の五員〜十四員のアリール又はヘテロアリール基、この基は直鎖又は分岐鎖の、無置換又は少なくとも１置換のＣ1-5アルキレン基を介して結合することができ、アルキレン基は連結部として少なくとも１個のヘテロ原子を有することができる；無置換又は少なくとも１置換のＣ3-8−シクロ脂肪族基、この基は環員として少なくとも１個のヘテロ原子を有することができ、かつ直鎖又は分岐鎖の、無置換又は少なくとも１置換のＣ1-5アルキレン基を介して結合することができ、アルキレン基は連結部として少なくとも１個のヘテロ原子を有することができる；−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ8基又は−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ9基、これらの基のいずれも、直鎖又は分岐鎖のＣ1-10アルキレン基を介して結合することができる、を表し；
Ｒ6は、無置換又は少なくとも１置換の五員〜十四員のアリール又はヘテロアリール基、このアリール又はヘテロアリール基は直鎖又は分岐鎖の、無置換又は少なくとも１置換のＣ1-5アルキレン基を介して結合していてもよく、アルキレン基は連結部として少なくとも１個のヘテロ原子を有することができる；無置換又は少なくとも１置換のＣ3-8−シクロ脂肪族基、この基は環員として少なくとも１個のヘテロ原子を有することができるか、又はこの基は直鎖又は分岐鎖の、無置換又は少なくとも１置換のＣ1-5アルキレン基を介して結合することができ、アルキレン基は連結部として少なくとも１個のヘテロ原子を有することができる、を表し；かつ
Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、及びＲ11は、それぞれ独立して、直鎖又は分岐鎖のＣ1-5アルキル基、直鎖又は分岐鎖のＣ2-5アルケニル基、あるいは直鎖又は分岐鎖のＣ2-5アルキニル基を表す。
以下に構造式を示す化合物Ａ、化合物Ｂ、及び化合物Ｃは、系列Ｄの好適な化合物の例である。
Figure 0006630374
系列Ｅの置換１−オキサ−３，８−ジアザスピロ［４．５］−デカン−２−オン化合物は、構造が、以下の式又はその薬学的に許容可能な塩又は溶媒和物に一致する：
Figure 0006630374
式中
ｎは、１、２、３、４、又は５であり；
Ｒ1は、以下を示し：
随意置換の六員又は十員のアリール基又は随意置換の五員〜十四員のヘテロアリール基、このアリール又はヘテロアリール基は、随意に、飽和もしくは不飽和の、随意置換の単環もしくは二環式環系と縮合することができる；
Ｒ2は、以下を示し：
−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−Ｒ3；−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ4；−Ｓ（＝Ｏ）2−Ｒ5；−（ＣＨ2）−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ6；−（ＣＨ2）−Ｄaa−（ＣＨ2）bb−Ｅcc−（ＣＨ2）dd−Ｒ7（式中
ａａ＝０又は１であり；
ｂｂ＝０、１、又は２であり；
ｃｃ＝０又は１であり；ｄｄ＝０又は１であり；かつ
ａａとｃｃの合計は０にはならず；かつ
Ｄ及びＥは、それぞれ独立して、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、Ｎ（ＣＨ3）、Ｎ（Ｃ2Ｈ5）、又はＮ［ＣＨ（ＣＨ3）2］を示す）；
−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ8；又は−Ｓ（＝Ｏ）2−ＮＲ9Ｒ10；
Ｒ3は、以下を示し：
−（ＣＨＲ11）−（ＣＨ2）w−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ12（式中、ｗ＝０又は１である）； −（ＣＨＲ13）−（ＣＨ2）a−Ｋb−（ＣＨ2）c−Ｌd−Ｒ14（式中、ａ＝０、１、又は２であり；ｂ＝０又は１であり；ｃ＝０、１、又は２であり；ｄ＝０又は１であり、かつＫ及びＬは、それぞれ独立して、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、Ｎ（ＣＨ3）、Ｎ（Ｃ2Ｈ5）、又はＮ［ＣＨ（ＣＨ3）2］を示す）；
直鎖又は分岐鎖の、飽和もしくは不飽和の、随意置換のＣ1-10脂肪族基；
不飽和もしくは飽和の、随意置換の、三員、四員、五員、六員、七員、八員、もしくは九員のシクロ脂肪族基、この基は、随意に、１つ又は２つの直鎖又は分岐鎖の、随意置換のＣ1-5アルキレン基で架橋されるか、又は飽和、不飽和、もしくは芳香族の、随意置換の、単環もしくは二環式環系と縮合するか、又はその両方を起こすことができる；あるいは随意置換の六員又は十員のアリール基；又は随意置換の五員〜十四員のヘテロアリール基、このアリール又はヘテロアリール基は、随意に、飽和もしくは不飽和の、随意置換の単環もしくは二環式環系と縮合することができる；
Ｒ4は、以下を示し：
−（ＣＨＲ15）−（ＣＨ2）e−Ｍf−（ＣＨ2）g−Ｐh−Ｒ16（式中、ｅ＝０、１、又は２であり；ｆ＝０又は１であり；ｇ＝０、１、又は２であり；ｈ＝０又は１であり；かつＭ及びＰは、それぞれ独立して、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、Ｎ（ＣＨ3）、Ｎ（Ｃ2Ｈ5）、又はＮ［ＣＨ（ＣＨ3）2］を示す）；
直鎖又は分岐鎖の、飽和もしくは不飽和の、随意置換のＣ1-10脂肪族基；
不飽和もしくは飽和の、随意置換の、三員、四員、五員、六員、七員、八員、もしくは九員のシクロ脂肪族基、この基は、随意に、１つ又は２つの直鎖又は分岐鎖の、随意置換のＣ1-5アルキレン基で架橋されるか、又は飽和、不飽和、もしくは芳香族の、随意置換の単環もしくは二環式環系と縮合するか、又はその両方を起こすことができる；
あるいは随意置換の六員又は十員のアリール基又は随意置換の五員〜十四員のヘテロアリール基、このアリール又はヘテロアリール基は、随意に、飽和もしくは不飽和の、随意置換の単環もしくは二環式環系と縮合することができる；
Ｒ5は、以下を示し：
−（ＣＨＲ17）−（ＣＨ2）k−Ｑl−（ＣＨ2）m−Ｔo−Ｒ18（式中、ｋ＝０、１、又は２であり；ｌ＝０又は１であり；ｍ＝０、１、又は２であり；ｏ＝０又は１であり；かつＱ及びＴは、それぞれ独立して、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、Ｎ（ＣＨ3）、Ｎ（Ｃ2Ｈ5）、又はＮ［ＣＨ（ＣＨ3）2］を示す）；
直鎖又は分岐鎖の、飽和もしくは不飽和の、随意置換のＣ1-10脂肪族基；
不飽和もしくは飽和の、随意置換の三員、四員、五員、六員、七員、八員、もしくは九員のシクロ脂肪族基、この基は、随意に、１つ又は２つの直鎖又は分岐鎖の、随意置換のＣ1-5アルキレン基で架橋されるか、又は飽和、不飽和、もしくは芳香族の、随意置換の単環もしくは二環式環系と縮合するか、又はその両方を起こすことができる；あるいは随意置換の六員又は十員のアリール基又は随意置換の五員〜十四員のヘテロアリール基、このアリール又はヘテロアリール基は、随意に、飽和もしくは不飽和の、随意置換の単環もしくは二環式環系と縮合することができる；
Ｒ6は、以下を示し：
直鎖又は分岐鎖の、飽和もしくは不飽和の、随意置換のＣ1-10脂肪族基；
不飽和もしくは飽和の、随意置換の三員、四員、五員、六員、七員、八員、もしくは九員のシクロ脂肪族基、この基は、随意に、１つ又は２つの直鎖又は分岐鎖の、随意置換のＣ1-5アルキレン基で架橋されるか、又は飽和、不飽和、もしくは芳香族の随意置換の単環もしくは二環式環系と縮合するか、又はその両方を起こすことができる；あるいは随意置換の六員又は十員のアリール基又は随意置換の五員〜十四員のヘテロアリール基、このアリール又はヘテロアリール基は、随意に、飽和もしくは不飽和の、随意置換の単環もしくは二環式環系と縮合することができる；
Ｒ7は、以下を示し：
シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル、イミダゾリジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフェニル、ピロリジニル、ピペリジニル、モルホリニル、ピペラジニル、チオモルホリニル、テトラヒドロピラニル、アゼパニル、ジアゼパニル、及びジチオラニルからなる群より選択される基、この基は、随意に、１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つの置換基で置換することができ、置換基はそれぞれ独立して、オキソ（＝Ｏ）、チオキソ（＝Ｓ）、−ＯＨ、−Ｏ−ＣＨ3、−Ｏ−Ｃ2Ｈ5、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ3）2、−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ3、−Ｏ−Ｃ（ＣＨ3）3、−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ3、−Ｏ−ＣＦ3、−Ｓ−ＣＦ3、−Ｓ−ＣＦ2Ｈ、−Ｓ−ＣＦＨ2、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ3、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ2Ｈ5、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ（ＣＨ3）3、−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＦ3、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ2Ｆ5、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ2、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ3、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｃ2Ｈ5、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｃ（ＣＨ3）3、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（ＣＨ3）2、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｃ2Ｈ5）2、−Ｓ（＝Ｏ）3−ＣＨ3、−Ｓ（＝Ｏ）2−Ｃ2Ｈ5、−ＮＨ−Ｓ（＝Ｏ）2−ＣＨ3、−Ｓ（＝Ｏ）2−ＮＨ−ＣＨ3、及び−Ｓ（＝Ｏ）2−ＮＨ2からなる群より選択される； 又は、フェニル、ナフチル、及び［１，２，３，４］−テトラヒドロナフチルからなる群より選択される基、この基は、随意に、１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つの置換基で置換することができ、置換基はそれぞれ独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＣＮ、−ＣＦ3、−ＳＦ5、−ＯＨ、−Ｏ−ＣＨ3、−Ｏ−Ｃ2Ｈ5、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ3）3、−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ3、−Ｏ−Ｃ（ＣＨ3）3、−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ3、−ＮＯ2、−Ｏ−ＣＦ3、−Ｓ−ＣＦ3、−Ｓ−ＣＦ2Ｈ、−Ｓ−ＣＦＨ2、ＳＨ、−Ｓ−ＣＨ3、−Ｓ−Ｃ2Ｈ5、−Ｓ−ＣＨ（ＣＨ3）2、−Ｓ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ3、−Ｓ−Ｃ（ＣＨ3）3、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、−Ｃ（ＣＨ3）2−Ｃ2Ｈ5、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−ＣＨ3、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｃ2Ｈ5、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｃ（ＣＨ3）3、−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ3−ＣＨ2−ＣＨ3、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ3、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ2Ｈ5、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ（ＣＨ3）3、−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＨ、−（ＣＨ2）−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＨ、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−ＣＨ3、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ3、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ3）2、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｃ（ＣＨ3）3、−ＮＨ−ＣＨ3、−ＮＨ−Ｃ2Ｈ5、−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ3）2、−ＮＨ−Ｃ（ＣＨ3）3、−Ｎ（ＣＨ3）2、−Ｎ（Ｃ2Ｈ5）2、−Ｎ（ＣＨ3）（Ｃ2Ｈ5）、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｈ、−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ3、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ2Ｈ5、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ（ＣＨ3）3、−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＦ3、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ2Ｆ5、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ3、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ3、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｃ2Ｈ5、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｃ（ＣＨ3）3、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（ＣＨ3）2、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｃ2Ｈ5）2、−Ｓ（＝Ｏ）2−ＣＨ3、−Ｓ（＝Ｏ）2−Ｃ2Ｈ5、−ＮＨ−Ｓ（＝Ｏ）2−ＣＨ3、−Ｓ（＝Ｏ）3−ＮＨ−ＣＨ3、−Ｓ（＝Ｏ）2−ＮＨ2、−Ｓ（＝Ｏ）2−ＮＨ−フェニル、フェニル、及びベンジルからなる群より選択され、群中、−Ｓ（＝Ｏ）2−ＮＨ−フェニル基、フェニル基、及びベンジル基の環状部分は、随意に、１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つの置換基で置換することができ、置換基はそれぞれ独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、−ＯＨ、−ＣＦ3、−ＳＦ5、−ＮＯ2、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、−Ｏ−ＣＨ3、−Ｏ−Ｃ2Ｈ5、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ3）3、−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ3−ＣＨ3、−Ｏ−Ｃ（ＣＨ3）3、−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ3、−Ｏ−ＣＦ3、−Ｓ−ＣＦ3、フェニル、及び−Ｏ−ベンジルからなる群より選択される；
Ｒ8は、以下を示し
−（ＣＨＲ19）−Ｖp−（ＣＨ2）q−（ＣＨ2）r−Ｗs−Ｒ20（式中
ｐ＝０又は１であり；
ｑ＝０、１、又は２であり；
ｒ＝０、１、又は２であり；
ｓ＝０又は１であり；かつ
Ｖ及びＷは、それぞれ独立して、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、−ＮＨ−ＣＨ3、−ＮＨ−Ｃ2Ｈ5、−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ3）2を示す）；
−（ＣＨ＝ＣＨ）−Ｒ21；
−（ＣＲ22Ｒ23）−Ｙt−（ＣＲ24Ｒ25）u−（ＣＨ2）v−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＲ26（式中
ｔ＝０又は１であり、ｕ＝０又は１であり；
ｖ＝０又は１であり、かつＹは、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、−ＮＨ−ＣＨ3、−ＮＨ−Ｃ2Ｈ5、−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ3）2を示す）；
−（ＣＨＲ27）−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ28；
−ＣＨ［（ＣＨ2）Ｒ29］［ＮＨ−Ｓ（＝Ｏ）2−Ｒ30］；
−ＣＨ［（ＣＨ2）Ｒ31］［ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ32］；
メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｓｅｃ−ペンチル、３−ペンチル、−（ＣＨ2）−（ＣＨ2）−（Ｃ（ＣＨ3）3）、ｎ−ヘキシル、２−ヘキシル、３−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、２−ヘプチル、３−ヘプチル、４−ヘプチル、ｎ−オクチル、−（ＣＨ2）−（ＣＨ）（Ｃ2Ｈ5）−（ＣＨ2）−（ＣＨ2）−（ＣＨ2）−（ＣＨ3）、ビニル、１−プロペニル、２−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、及び３−ブテニルからなる群より選択される、直鎖又は分岐鎖の、飽和もしくは不飽和の、随意置換のＣ1-10脂肪族基； 不飽和もしくは飽和の、随意置換の三員、四員、五員、六員、七員、八員、もしくは九員のシクロ脂肪族基、この基は、随意に、１つ又は２つの直鎖又は分岐鎖の、随意置換のＣ1-5アルキレン基で架橋されるか、又は飽和、不飽和、もしくは芳香族の、随意置換の単環もしくは二環式環系と縮合するか、又はその両方を起こすことができる；あるいは随意置換の六員又は十員のアリール基又は随意置換の五員〜十四員のヘテロアリール基、このアリール又はヘテロアリール基は、随意に、飽和もしくは不飽和の、随意置換の単環もしくは二環式環系と縮合することができる；
Ｒ9及びＲ10は、それぞれ独立して、直鎖又は分岐鎖の、飽和もしくは不飽和の、随意置換のＣ1-10脂肪族基を示し；
Ｒ11、Ｒ13、Ｒ15、Ｒ17、Ｒ19、Ｒ22、Ｒ23、Ｒ24、Ｒ25、及びＲ26は、それぞれ独立して、水素、あるいは直鎖又は分岐鎖の、飽和もしくは不飽和の、随意置換のＣ1-10脂肪族基を示し；
Ｒ12、Ｒ28、及びＲ32は、それぞれ独立して、直鎖又は分岐鎖の、飽和もしくは不飽和の、随意置換のＣ1-10脂肪族基を示し；
Ｒ14、Ｒ16、Ｒ18、及びＲ20は、それぞれ独立して、直鎖又は分岐鎖の、飽和もしくは不飽和の、随意置換のＣ1-10脂肪族基；
不飽和もしくは飽和の、随意置換の三員、四員、五員、六員、七員、八員、もしくは九員のシクロ脂肪族基、この基は、随意に、１つ又は２つの直鎖又は分岐鎖の、随意置換のＣ1-5アルキレン基で架橋されるか、又は飽和、不飽和、もしくは芳香族の、随意置換の単環もしくは二環式環系と縮合するか、又はその両方を起こすことができる；あるいは
随意置換の六員又は十員のアリール基又は随意置換の五員〜十四員のヘテロアリール基、このアリール又はヘテロアリール基は、随意に、飽和もしくは不飽和の、随意置換の単環もしくは二環式環系と縮合することができる、を示し；かつ
Ｒ21、Ｒ27、Ｒ29、Ｒ30、及びＲ31は、それぞれ独立して、不飽和もしくは飽和の、随意置換の三員、四員、五員、六員、七員、八員、もしくは九員のシクロ脂肪族基、この基は、随意に、１つ又は２つの直鎖又は分岐鎖の、随意置換のＣ1-5アルキレン基と架橋するか、又は飽和、不飽和、もしくは芳香族の、随意置換の単環もしくは二環式環系と縮合するか、又はその両方を起こすことができる；あるいは、随意置換の六員又は十員のアリール基又は随意置換の五員〜十四員のヘテロアリール基、このアリール又はヘテロアリール基は、随意に、飽和もしくは不飽和の、随意置換の単環もしくは二環式環系と縮合することができる、を示し；式中、上記のＣ1-10脂肪族基は、それぞれ独立して、随意に、１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つの置換基で置換されてもよく、置換基は、それぞれ独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＣＮ、−ＮＯ2、−ＯＨ、−ＳＨ、及び−ＮＨ2からなる群より選択され；
上記のシクロ脂肪族基は、それぞれ独立して、随意に、１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つの置換基で置換することができ、置換基はそれぞれ独立して、オキソ（＝Ｏ）、チオキソ（＝Ｓ）、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＣＮ、−ＣＦ3、−ＳＦ5、−ＯＨ、−Ｏ−Ｃ1-5アルキル、−ＮＨ2、−ＮＯ2、−Ｏ−ＣＦ3、−Ｓ−ＣＦ3、−Ｓ−ＣＦ2Ｈ、−Ｓ−ＣＦＨ2、−ＳＨ、−Ｓ−Ｃ1-5アルキル、−Ｃ1-5アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＨ、−（ＣＨ2）−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＨ、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｃ1-5アルキル、−（ＣＨ2）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｃ1-5アルキル、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ1-5アルキル、−ＮＨ−Ｃ1-5アルキル、−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）2、−ＮＨ−フェニル、−ＮＨ−ピリジニル、−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）−フェニル、−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）−ピリジニル、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｃ1-5アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｈ、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ1-5アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ1-5−パーフルオロアルキル、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ2、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｃ1-5アルキル、Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ−（Ｃ1-5アルキル）2、−Ｓ（＝Ｏ）2−Ｃ1-5アルキル、−Ｓ（＝Ｏ）2−フェニル、−ＮＨ−Ｓ（＝Ｏ）2−Ｃ1-5アルキル、−Ｓ（＝Ｏ）2−ＮＨ−Ｃ1-5アルキル、−Ｓ（＝Ｏ）2−ＮＨ2、−Ｓ（＝Ｏ）2−ＮＨ−フェニル、シクロヘキシル、シクロペンチル、ピリジニル、［１，２，５］−チアジアゾリル、ピリダジニル、−（ＣＨ2）−ベンゾ［ｂ］フラニル、−Ｏ−フェニル、−Ｏ−ベンジル、フェニル、及びベンジルからなる群より選択され、群中、−Ｓ（＝Ｏ）2−ＮＨ−フェニル、−ＮＨ−フェニル、−ＮＨ−ピリジニル、−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）フェニル、−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）ピリジニル、ピリジニル、シクロペンチル、［１，２，５］−チアジアゾリル、シクロヘキシル、ピリダジニル、−Ｓ（＝Ｏ）2−フェニル、−Ｏ−フェニル、−Ｏ−ベンジル、フェニル、−（ＣＨ2）−ベンゾ［ｂ］フラニル、及びベンジル各基の環状部分は、随意に、１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つの置換基で置換することができ、置換基はそれぞれ独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、−ＯＨ、−ＣＦ3、−ＳＦ5、−ＣＮ、−ＮＯ2、−Ｃ1-5アルキル、−Ｏ−Ｃ1-5アルキル、−Ｏ−ＣＦ3、−Ｓ−ＣＦ3、フェニル、及び−Ｏ−ベンジルからなる群より選択され、かつシクロ脂肪族基は、１個、２個、３個、４個、又は５個のヘテロ原子を含むことができ、ヘテロ原子は相互に独立して、酸素、窒素、及び硫黄からなる群より選択され；
上記のＣ1-5−アルキレン基は、それぞれ独立して、随意に、１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つの置換基で置換されてもよく、置換基は、それぞれ独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＣＮ、−ＮＯ2、−ＯＨ、−ＳＨ、及び−ＮＨ2からなる群より選択され；
上記の単環式又は多環式環系に含まれる環は、それぞれ独立して、随意に、１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つの置換基で置換されてもよく、置換基は、それぞれ独立して、オキソ（＝Ｏ）、チオキソ（＝Ｓ）、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＣＮ、−ＣＦ3、−ＳＦ5、−ＯＨ、−Ｏ−Ｃ1-5アルキル−ＮＨ2、−ＮＯ2、−Ｏ−ＣＦ3、−Ｓ−ＣＦ3、−Ｓ−ＣＦ2Ｈ、−Ｓ−ＣＦＨ2、−ＳＨ、−Ｓ−Ｃ1-5アルキル、−Ｃ1-5アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＨ、−（ＣＨ2）−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＨ、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｃ1-5アルキル、−（ＣＨ2）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｃ1-5アルキル、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ1-5アルキル、−ＮＨ−Ｃ1-5アルキル、−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）2、−ＮＨ−フェニル、−ＮＨ−ピリジニル、−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）−フェニル、−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）−ピリジニル、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｃ1-5アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｈ、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ1-5アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ1-5−パーフルオロアルキル、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ2、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｃ1-5アルキル、Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ−（Ｃ1-5アルキル）2、−Ｓ（＝Ｏ）2−Ｃ1-5アルキル、−Ｓ（＝Ｏ）2−フェニル、−ＮＨ−Ｓ（＝Ｏ）2−Ｃ1-5アルキル、−Ｓ（＝Ｏ）2−ＮＨ−Ｃ1-5アルキル、−Ｓ（＝Ｏ）2−ＮＨ2、−Ｓ（＝Ｏ）2−ＮＨ−フェニル、シクロヘキシル、シクロペンチル、ピリジニル、［１，２，５］−チアジアゾリル、ピリダジニル、−（ＣＨ2）−ベンゾ［ｂ］フラニル、−Ｏ−フェニル、−Ｏ−ベンジル、フェニル、及びベンジルからなる群より選択され、
群中、−Ｓ（＝Ｏ）2−ＮＨ−フェニル、−ＮＨ−フェニル、−ＮＨ−ピリジニル、−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）フェニル、−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）ピリジニル、ピリジニル、シクロペンチル、［１，２，５］−チアジアゾリル、シクロヘキシル、ピリダジニル、−Ｓ（＝Ｏ）2−フェニル、−Ｏ−フェニル、−Ｏ−ベンジル、フェニル、−（ＣＨ2）−ベンゾ［ｂ］フラニル、及びベンジル各基の環状部分は、随意に、１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つの置換基で置換することができ、置換基はそれぞれ独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、−ＯＨ、−ＣＦ3、−ＳＦ5、−ＣＮ、−ＮＯ2、Ｃ1-5アルキル、−Ｏ−Ｃ1-5アルキル、−ＮＨ2、−Ｏ−ＣＦ3、−Ｓ−ＣＦ3、フェニル、及び−Ｏ−ベンジルからなる群より選択され；
上記の単環式又は多環式環系に含まれる環は、それぞれ独立して、五員、六員、又は七員環であり、かつそれぞれ独立して、随意に、環員として１個、２個、３個、４個、又は５個のヘテロ原子を含んでもよく、ヘテロ原子はそれぞれ独立して、酸素、窒素、及び硫黄からなる群より選択され；上記のアリール又はヘテロアリール基は、それぞれ独立して、随意に、１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つの置換基で置換されてもよく、置換基は、それぞれ独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＣＮ、−ＣＦ3、−ＳＦ5、−ＯＨ、−Ｏ−Ｃ1-5アルキル−ＮＨ2、−ＮＯ2、−Ｏ−ＣＦ3、−Ｓ−ＣＦ3、−Ｓ−ＣＦ2Ｈ、−Ｓ−ＣＦＨ2、−ＳＨ、−Ｓ−Ｃ1-5−アルキル、−Ｃ1-5アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＨ、−（ＣＨ2）−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＨ、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｃ1-5アルキル、−（ＣＨ2）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｃ1-5アルキル、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ1-5アルキル、−ＮＨ−Ｃ1-5アルキル、−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）2、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｃ1-5アルキル、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ1-5アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｈ、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ1-5アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ1-5−パーフルオロアルキル、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ2、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｃ1-5アルキル、Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ−（Ｃ1-5アルキル）2、−Ｓ（＝Ｏ）2−Ｃ1-5アルキル、−Ｓ（＝Ｏ）2−フェニル、−ＮＨ−Ｓ（＝Ｏ）2−Ｃ1-5アルキル、−Ｓ（＝Ｏ）2−ＮＨ−Ｃ1-5アルキル、−Ｓ（＝Ｏ）2−ＮＨ2、−Ｓ（＝Ｏ）2−ＮＨ−フェニル、シクロヘキシル、シクロペンチル、ピリジニル、−（ＣＨ2）−ベンゾ［ｂ］フラニル、−Ｏ−フェニル、−Ｏ−ベンジル、フェニル、及びベンジルからなる群より選択され、群中、ピリジニル、シクロペンチル、シクロヘキシル、ピリダジニル、−Ｓ（＝Ｏ）2−フェニル、−Ｓ（＝Ｏ）2−ＮＨ−フェニル、−Ｏ−フェニル、−Ｏ−ベンジル、フェニル、−（ＣＨ2）−ベンゾ［ｂ］フラニル各基の環状部分は、随意に、１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つの置換基で置換することができ、置換基はそれぞれ独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、−ＯＨ、−ＣＦ3、−ＳＦ5、−ＮＯ2、Ｃ1-5アルキル、−Ｏ−Ｃ1-5アルキル、−Ｏ−ＣＦ3、−Ｓ−ＣＦ3、フェニル、及び−Ｏ−ベンジルからなる群より選択され；
かつ上記のヘテロアリール基は、それぞれ独立して、随意に、環員として１個、２個、３個、４個、又は５個のヘテロ原子を含んでもよく、ヘテロ原子はそれぞれ独立して、酸素、窒素、及び硫黄からなる群より選択される。
好ましくは、企図する化合物において、Ｒ1は、以下からなる群より選択される基を示す：フェニル、ナフチル、（１，３）−ベンゾジオキソリル、（１，４）−ベンゾジオキサニル、２Ｈ−クロメニル、チオフェニル、フラニル、ピロリル、ピラゾリル、ピラジニル、ピラニル、トリアゾリル、ピリジニル、イミダゾリル、インドリル、イソインドリル、ベンゾ［ｂ］フラニル、ベンゾ［ｂ］チオフェニル、チアゾリル、［１，２，３］−チアジアゾリル、［１，２，４］−オキサジアゾリル、ベンゾ［２，１，３］チアジアゾリル、［１，２，３］−ベンゾチアジアゾリル、［２，１，３］−ベンゾオキサジアゾリル、［１，２，３］−ベンゾオキサジアゾリル、［１，２，３，４］−テトラヒドロナフチル、［１，２，３，４］−テトラヒドロキノリニル、［１，２，３，４］−テトラヒドロイソキノリニル、［１，２，３，４］−テトラヒドロキナゾリニル、［３，４］−ジヒドロ−２Ｈ−１，４−ベンゾオキサジニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、ピリダジニル、ピラジニル、ピリミジニル、インダゾリル、キナゾリニル、キノリニル、及びイソキノリニル。そのようなＲ1基は、随意に、１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つの置換基で置換することができ、置換基はそれぞれ独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＣＮ、−ＣＦ3、−ＳＦ5、−ＯＨ、−Ｏ−ＣＨ3、−Ｏ−Ｃ2Ｈ5、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ3）2、−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ3、−Ｏ−Ｃ（ＣＨ3）3、−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ3、−ＮＯ2、−Ｏ−ＣＦ3、−Ｓ−ＣＦ3、−Ｓ−ＣＦ2Ｈ、−Ｓ−ＣＦＨ2、−ＳＨ、−Ｓ−ＣＨ3、−Ｓ−Ｃ2Ｈ5、−Ｓ−ＣＨ（ＣＨ3）2、−Ｓ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ3、−Ｓ−Ｃ（ＣＨ3）3、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−ＣＨ3、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｃ2Ｈ5、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｃ（ＣＨ3）3、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ3、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ2Ｈ5、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ（ＣＨ3）3、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｈ、−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ3、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ2Ｈ5、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ（ＣＨ3）3、−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＦ3、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ2Ｆ5、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ2、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ3、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｃ2Ｈ5、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｃ（ＣＨ3）3、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（ＣＨ3）2、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｃ2Ｈ5）2、−Ｓ（＝Ｏ）3−ＣＨ3、−Ｓ（＝Ｏ）3−Ｃ2Ｈ5、−ＮＨ−Ｓ（＝Ｏ）2−ＣＨ3、−Ｓ（＝Ｏ）3−ＮＨ−ＣＨ3、−Ｓ（＝Ｏ）2−ＮＨ2、−Ｓ（＝Ｏ）2−ＮＨ−フェニル、及び−ベンジルからなる群より選択され、群中、フェニル又はベンジル各基の環状部分は、それぞれ独立して、随意に、１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つの置換基で置換することができ、置換基はそれぞれ独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、−ＣＦ3、−ＳＦ5、−ＮＯ2、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、−Ｏ−ＣＨ3、−Ｏ−Ｃ2Ｈ5、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ3）3、−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ3、−Ｏ−Ｃ（ＣＨ3）3、−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ3、−Ｏ−ＣＦ3、−Ｓ−ＣＦ3、フェニル、及び−Ｏ−ベンジルからなる群より選択される。
企図する化合物のＲ2基が、Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−Ｒ3；−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ4；−Ｓ（＝Ｏ）2Ｒ5；−（ＣＨ2）−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ6；−（ＣＨ2）−Ｏ−Ｒ7、−（ＣＨ2）−Ｓ−Ｒ7、−（ＣＨ2）−ＮＨ−Ｒ7、−（ＣＨ2）−Ｎ（ＣＨ3）−Ｒ7、−（ＣＨ2）−（ＣＨ2）−Ｏ−Ｒ7、−（ＣＨ2）−（ＣＨ2）−Ｓ−Ｒ7、−（ＣＨ2）−ＮＨ−Ｒ7、−（ＣＨ2）−Ｎ（ＣＨ3）−Ｒ7、−（ＣＨ2）−（ＣＨ2）−（ＣＨ2）−Ｏ−Ｒ7、−（ＣＨ2）−（ＣＨ2）−（ＣＨ2）−Ｓ−Ｒ7、−（ＣＨ2）−（ＣＨ2）−（ＣＨ2）−ＮＨ−Ｒ7、−（ＣＨ2）−（ＣＨ2）−（ＣＨ2）−Ｎ（ＣＨ3）−Ｒ7、−（ＣＨ2）−Ｏ−（ＣＨ2）−Ｒ7、−（ＣＨ2）−Ｓ−（ＣＨ2）−Ｒ7、−（ＣＨ2）−ＮＨ−（ＣＨ2）−Ｒ7、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ8、又は−Ｓ（＝Ｏ）2−ＮＲ9Ｒ10を示すことも好ましい。
薬学的組成物
本発明で有用な企図する化合物は、それ自身を使用する形で提供することもできるし、薬学的に許容可能な塩として提供することもできる。塩の形であるかどうかに関わらず、企図する組成物は、典型的には、薬学的組成物を形成する薬学的に許容可能な希釈剤に溶解又は分散しており、この薬学的組成物は、ＣＮＳ及び／又は他の細胞投与される。
企図する化合物は、哺乳類細胞及び哺乳類細胞調製物でのτタンパク質リン酸化を少なくとも阻害するのに有用である薬物（薬学的組成物）の製造に用いることができる。企図する化合物は、哺乳類細胞及び哺乳類細胞調製物でのＦＬＮＡとα７ｎＡＣｈＲ及びＴＬＲ４との相互作用、ならびにＡβ42とα７ｎＡＣｈＲとの相互作用を少なくとも阻害するのに有用である薬物の製造に用いることができる。
企図する薬学的組成物は、企図する化合物又はその薬学的に許容可能な塩を有効量で、生理的に許容できるキャリアに溶解又は分散させた状態で含有する。そのような組成物は、細胞培養物で行うなどｉｎ ｖｉｔｒｏで哺乳類細胞に投与することも、必要としている生きている宿主哺乳類で行うなどｉｎ ｖｉｖｏで投与することもできる。
企図する組成物は、典型的には、数日間にわたり複数回投与される。より一般的には、企図する組成物は、１日１回又は２回投与される。企図する化合物の投与がいったん開始されたら、その化合物は、研究が行われている期間中又は服用者の生涯の間中、慢性的に投与され続けることも企図する。
企図する化合物は、１００フェムトモル濃度でＦＬＮＡに結合することができ、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＬＰＳに刺激された星状細胞からのサイトカイン放出を有効に阻害することができる。企図する化合物は、より一般的には、ピコモル濃度〜マイクロモル濃度の量で利用される。すなわち、企図する薬学的組成物に含まれる企図する化合物の有効量は、本発明の企図する方法を実行する際に、宿主動物の血流に、又はｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞培地に、約１００フェムトモル〜約マイクロモル濃度をもたらす量である。より一般的な量は、約ピコモル濃度〜約マイクロモル濃度である。更により一般的な量は、約ピコモル濃度〜約ナノモル濃度である。当業者は、τタンパク質リン酸化を所望の量で阻害するのに適切な企図する化合物の投薬レベルを容易に決定できる。
企図する薬学的組成物は、従来の無毒性の薬学的に許容可能なキャリア、アジュバント、及びビヒクルを望みどおりに含有する配合で、口から（経口で）、非経口で、吸入スプレーにより投与することができる。非経口という用語は、本明細書中使用される場合、皮下注射、静脈内、筋肉内、胸骨内注射、又は輸液技法を含む。薬物の配合は、例えば、Ｈｏｏｖｅｒ， Ｊｏｈｎ Ｅ．， Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ； １９７５及びＬｉｂｅｒｍａｎ， Ｈ．Ａ． ａｎｄ Ｌａｃｈｍａｎ， Ｌ．， Ｅｄｓ．， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｃｋｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， １９８０で説明されている。
注射用製剤の場合、例えば、適切な分散又は湿潤剤及び懸濁剤を用いて、既知技術に従って、滅菌した注射用の水性又は油性懸濁液を配合することができる。滅菌注射用製剤は、無毒の非経口で許容可能な希釈剤又は溶媒に溶解又は懸濁した滅菌注射用溶液又は懸濁液である（例えば、１，３−ブタンジオールの溶液として）ことも可能である。許容可能なビヒクル及び溶媒のなかでも特に利用可能であるものは、水、リンゲル液、及び等張性塩化ナトリウム溶液、リン酸緩衝化生理食塩水である。液状薬学的組成物として、例えば、非経口投与に適した溶液が挙げられる。活性成分の滅菌水溶液又は、活性成分を、水、エタノール、もしくはプロピレングリコール含有溶媒に溶解させた滅菌溶液が、非経口投与に適した液状組成物の例である。
また、滅菌、不揮発性油も、溶媒又は懸濁媒体として、従来から使用されている。この目的の場合、任意のブランドの不揮発性油を用いることができ、そのような不揮発性油として、合成のモノグリセリド又はジグリセリドを挙げることができる。また、オレイン酸などの脂肪酸も、注射用製剤に使用することができる。ジメチルアセトアミド、イオン性及び非イオン性界面活性剤などの界面活性剤、ポリエチレングリコールも使用できる。上記に説明するものなどの溶媒及び湿潤剤を混合したものもの有用である。
滅菌溶液は、活性成分を所望の溶媒系に溶解させ、次いで得られる溶液を膜フィルターに通して滅菌することにより、又は、そうでなければ、滅菌条件下で、滅菌した化合物を予め滅菌した溶媒に溶解させることで、調製することができる。
経口投与用の固形剤形として、カプセル剤、錠剤、丸剤、粉剤、及び顆粒剤を挙げることができる。そのような固形剤形において、企図する化合物は、通常、予定される投与経路に適した１種又は複数の賦形剤と組み合わされている。経口で投与される場合、化合物を、ラクトース、スクロース、デンプン粉末、アルカン酸セルロースエステル、セルロースアルキルエステル、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸及び硫酸のナトリウム及びカルシウム塩、ゼラチン、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、及び／又はポリビニルアルコールと混合し、次いで、投与しやすいように、打錠するか被包することができる。そのようなカプセル剤又は錠剤は、活性化合物をヒドロキシプロピルメチルセルロースに分散させた分散液で提供することで可能になるとおり、放出制御配合にすることができる。カプセル剤、錠剤、及び丸剤の場合、これらの剤形は、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウムもしくはマグネシウム、又は重炭酸カルシウムもしくはマグネシウムなどの緩衝剤も含むことができる。錠剤、カプセル剤、及び丸剤は、追加で、腸溶コーティングを施すことができる。
治療を必要としており、企図する化合物を含有する薬学的組成物が投与される哺乳類は、霊長類（ヒトなど）、類人猿（チンパンジー又はゴリラなど）、サル（カニクイザル又はマカクなど）、実験動物（ラット、マウス、又はウサギなど）、ペット動物（イヌ、ネコ、ウマなど）、又は食用動物（ウシ又は去勢オスウシ、ヒツジ、子ヒツジ、ブタ、ヤギ、ラマなど）が可能である。ｉｎ ｖｉｔｒｏで哺乳類細胞に接触させることを企図する場合、本明細書中以下に示すとおり、例示哺乳類由来の細胞のＣＮＳ組織培養物を利用することが多い。
好ましくは、薬学的組成物は、単位剤形の形をしている。そのような形において、組成物は、活性作用剤を適切な量で含有する単位投薬量に分割される。単位剤形は、パッケージ化された製剤でもよく、このパッケージは、分離された量の製剤を、例えば、バイアル又はアンプルに入れた状態で含有する。
有用な企図する化合物のいくつかは、アミンであり、典型的には、無機酸又は有機酸由来の薬学的に許容可能な酸付加塩として使用することができる。塩の例として、以下を挙げることができるが、それらに限定されない：酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、クエン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、カンファー酸塩、カンファースルホン酸塩、ジグルコン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、フマル酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩（palmoate）、ペクチニン酸、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩、メシル酸塩、及びウンデカン酸塩。
本発明で有用な他の化合物で、酸官能基を有するものも、塩基により塩を形成することができる。塩基の例として、アミン塩基、例えば、モノ、ジ、及びトリ−Ｃ1−Ｃ4−アルキル又はヒドロキシアルキルアミン（トリエチルアミン、ジメチルアミン、２−ヒドロキシエチルアミン、及びジメチル−２−ヒドロキシエチルアミンなど）、及びアルカリ金属、アルカリ土類金属、第四級Ｃ1−Ｃ6−アルキル水酸化アンモニウムなどの塩基（ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、及び水酸化テトラメチルアンモニウムなど）が挙げられる。塩基性塩、例えば、アルカリ金属又はアルカリ土類金属及びアンモニウムの、炭酸塩及びリン酸塩も、考慮に入っている。
薬学的化合物と薬学的に許容可能な塩を形成する、一般的に使用される薬学的に許容可能な酸及び塩基の一覧については、Ｂｅｒｇｅ， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ． ６８（１）：１−１９ （１９７７）を参照のこと。
場合によっては、本発明の化合物の単離、精製、又は光学分割の助けとしても塩を使用することができる。そのような場合、使用される酸及び調製される塩は、薬学的に許容可能である必要はない。
考察
以下の考察では、足場タンパク質ＦＬＮＡ、及び特にＦＬＮＡタンパク質に存在するＶＡＫＧＬ（配列番号１）ペンタペプチドからなる結合部位に結合し、τタンパク質のリン酸化を阻害する化合物及びそのような化合物を１種又は複数含有する組成物について例示する。そのような組成物に含まれる化合物のいくつかは、アミロイドβ42（Ａβ42）の毒性シグナル伝達の妨害、ならびにＡβ42及び進行性神経変性の両方により引き起こされる炎症の減少ももたらす。これらの化合物は、受容体の正常機能の障害をはじめとする、ＡＤ様病理の多くの態様を減少させる。
最初の試験は、化合物Ａ００３３、Ａ００４０、Ａ００５３、Ａ００６８、Ｂ００５５、Ｃ０１０５、Ｃ０１１４、Ｃ０１３７、及びＣ０１３８を例示又は代表として用いて、４種の構造系列それぞれの化合物で行った。化合物Ｃ０１３４、化合物Ａ、化合物Ｂ、及び化合物Ｃを用いて、追加試験も行った。図に示し、本明細書中以下で説明する結果は、これらの構造的には非常に異なる化合物を用いて得られた結果の一般性を示すものである。最初の結果は、化合物が経口で利用可能であり、及び耐容性がよいと思われることを示した。なぜなら、ラットに２ｇ／ｋｇで経口投与すると、目立つ血漿レベル及びＣＮＳレベルがもたらされたが、副作用はほとんど無視できるものであったからである。これらの結果は、９種の化合物の間に同様な活性があったことも示し、化合物Ｃ０１０５及び化合物Ｃ０１１４については、それらの活性が高く、合成が容易で、溶解性があり、鏡像異性体が存在しないことから、さらなる試験に用いることにした。
Ａβ42結合が、α７ｎＡＣｈＲによるＣａ+2流入を遮断する［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ３５：１０９６１−１０９７３ （２００９）；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ６７：５２２−５３０ （２０１０）］という事実は、チャンネル開口／脱感作を支配する領域である、細胞外と膜貫通ドメインの間の界面において、α７ｎＡＣｈＲに１つの立体構造的変化が生じている可能性を示唆する［Ｂｏｕｚａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２８：７８０８−７８１９ （２００８）］。この立体構造変化は、Ａβ42結合部位に近い正電荷に富む膜貫通領域を露わにするようである。ＦＬＮＡは、この正電荷に結合して、結合したＡβ42及びさらなるＡβ42ペプチド結合を安定化し、Ａβ42−α７ｎＡＣｈＲ複合体の内在化を最終的にもたらす［（Ｎａｇｅｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １１０：１９９−２１１ （２００２）］。化合物Ｃ０１０５によるＦＬＮＡ−α７ｎＡＣｈＲ相互作用の妨害は、病的シグナル伝達を止め、受容体へのＡβ42高親和性固着を止める。
成熟ラットの器官型前頭前野切片培養物を用いると、α７ニコチン性アセチルコリン受容体（α７ｎＡＣｈＲ）を通じたＡβシグナル伝達は、ＦＬＮＡ補充を必要とすることが示される。これらの化合物は、ＦＬＮＡの決定的ペンタペプチドセグメントに結合することにより、ＦＬＮＡ−α７ｎＡＣｈＲ会合及びＡβ42のシグナル伝達カスケードを遮断する。Ａβ42処理した器官型前頭前野切片培養物の例において、例示化合物Ｃ０１０５及びＣ０１１４は、それぞれ別個に、神経原線維タングルで見られる３つのτリン酸化部位の全てにおいて、τリン酸化を劇的に減少させ（図４Ｄ、図６Ｂ、及び図６Ｃ）、学習及び記憶を決定的に左右するα７ｎＡＣｈＲ及び下流のＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体（ＮＭＤＡＲ）を、完全に正常機能に回復させる。
更に、ＡＤ患者に共通してインシュリン耐性が示される［Ｎｅｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ Ｒｅｓ ５：４３８−４４７ （２００８）］が、切片培養物例においてＡβ42により障害されたＩＲの機能も、例示化合物Ｃ０１０５及びＣ０１１４それぞれにより回復した（図５Ｂ）。これらの化合物は、Ａβ42の毒性シグナル伝達カスケードを遮断する新規機構を用いて、複数のＡβ42誘導型機能不全の回復をもたらす。その上、α７ｎＡＣｈＲに直接影響を及ぼすことなくＡβ誘導型α７ｎＡＣｈＲシグナル伝達を不可能にすることは、受容体アゴニスト又はアンタゴニストを慢性的に使用することに伴う潜行性の問題である、受容体の感受性又は細胞表面レベルの変化を回避する。
マウスにＡβ42をＩＣＶ輸液するアルツハイマー病モデルにおいて、化合物Ｃ０１０５は、τリン酸化、複数のＡβ42誘導型シグナル伝達障害、炎症性サイトカイン放出、ならびに神経原線維タングル及びＡβ42凝集物を、大きく減少させた。例示化合物Ｃ０１０５は、ＦＬＮＡに高親和性で結合することにより、これらの効果を全て達成した。Ａβ42は、ＦＬＮＡとα７ｎＡＣｈＲの会合を劇的に増加させて、Ａβ42自身の結合及びこの受容体を介した毒性シグナル伝達を可能にするが、例示化合物Ｃ０１０５は、このカスケードを防いだ。
化合物Ｃ０１０５の抗炎症効果は、Ａβ42が誘導するＦＬＮＡとＴＬＲ４との会合を同様に妨害することにより生じる。Ａβ42は、ＦＬＮＡとＴＬＲ４との会合を増加させ、この会合が、Ａβ42接触による炎症性サイトカイン産生にとって決定的に重要であるらしいと思われる。なぜなら、例示化合物Ｃ０１０５は、このサイトカイン産生をほぼ消失させるからである。Ａβ42は、それ自身はＴＬＲ４と相互作用しないものの、ＣＤ１４と結合し、次いでＣＤ１４がＴＬＲ４と結合して、ＡＤで見られる炎症を起こす。［Ｒｅｅｄ−Ｇｅａｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２９：１１９８２−１１９９２ （２００９）。］
α７ｎＡＣｈＲ、ＮＭＤＡＲ、及びＩＲの機能の正常化は、化合物Ｃ０１０５などの企図する化合物に幅広い利点があり、ＡＤ治療薬の可能性があることを更に示す。ＮＭＤＡＲはα７ｎＡＣｈＲの下流にあり、Ａβ42のα７ｎＡＣｈＲを介した毒性シグナル伝達の結果に直接曝されそうであるものの、ＩＲは、神経回路網において、α７ｎＡＣｈＲの直接の下流にはない。更に、ＦＬＮＡはＩＲと相互作用するものの、この相互作用は、Ａβ42又は化合物Ｃ０１０５によって変化しない。それにもかかわらず、Ａβ42はＩＲ信号伝達を障害し、化合物Ｃ０１０５などの企図する化合物は、その障害を回復させる。このことは、ＡＤのこの構成要素に対しても治療効果があることを示唆している。
現在の考え方は、ＡＤを治療するためには、同時に複数の異なるアプローチが必要であることを指摘する。化合物Ｃ０１０５などの企図する化合物には多数の治療効果及び新規標的があることから、この化合物は、ＡＤの疾患修飾治療薬として大いに可能性を秘めている。
ＡＤにおける、ならびに老人性認知症の軽度認知機能障害におけるＡβ42の毒性は、当該分野の大勢により、Ａβ42のα７ｎＡＣｈＲを通じたシグナル伝達能力によるものであると考えられている。この毒性シグナル伝達は、ＥＲＫ２を活性化し、ＮＦＴの決定的構成要素であるτをリン酸化する。本明細書で提示される新規ＦＬＮＡ結合化合物は、ナノモル（ｎＭ）又はサブｎＭ濃度で、Ａβ42のα７ｎＡＣｈＲを通じたシグナル伝達を強力に抑制する。これらの化合物は、Ａβ42により引き起こされるＦＬＮＡとα７ｎＡＣｈＲとの会合の増加を防ぐことにより、このシグナル伝達遮断を達成する。具体的には、化合物の結合がＦＬＮＡの立体構造を変化させ、そのためＦＬＮＡが受容体に補充されないと考えられる。
更に、企図する化合物（化合物Ｃ０１０５又はＣ０１１４など）の存在下でＦＩＴＣ−Ａβ42の結合が減少することにより示されるとおり、この相互作用が不可能になることは、α７ｎＡＣｈＲに対するＡβ42の結合親和性も低下させるらしい。その結果生じるシグナル伝達遮断は、ＥＲＫ２活性化が減少すること及びＡＤ脳のＮＦＴ中に見られるτの３つのリン酸化部位全てでのτリン酸化が減少することで裏付けられた。
例示化合物Ｃ０１０５及びＣ０１１４は、Ａβ42により増加するＦＬＮＡ−α７ｎＡＣｈＲ会合を妨害する他に、Ａβ42が誘導するＦＬＮＡとＴＬＲ４との会合を防ぐ（図５）。ＴＬＲ４は、サイトカイン放出に関与している免疫受容体である。この会合は、進行中の神経変性と一緒になって、ＡＤ脳に重度の炎症を起こしている可能性があり［Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ａｒｃｈ Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ ３３：１５３９−１５５６ （２０１０）］、その会合の妨害が、本発明者らのＦＬＮＡ結合化合物の抗炎症効果の作用機序である可能性がある［Ｂｕｒｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｃｅｎｔ Ｐａｔｅｎｔｓ ｏｎ ＣＮＳ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ５：２１０−２２０ （２０１０）］。
例示化合物Ｃ０１０５の抗炎症活性は、マウスにＡβ42をＩＣＶ輸液するＡＤモデルで実証された。ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、及びＩＬ−１βのレベルは、Ｃ０１０５を投与されたマウスにおいて、８０〜１００％低下した。また、先の研究結果から、ＦＬＮＡの同じペンタペプチド領域に結合する他の化合物が、ＬＰＳで刺激した初代ヒト星状細胞から放出される炎症性サイトカインを劇的に減少させることが、示された［Ｂｕｒｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｃｅｎｔ Ｐａｔｅｎｔｓ ｏｎ ＣＮＳ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ５：２１０−２２０ （２０１０）］。抗炎症性質は、ＡＤ治療薬において大きな利点に違いない。
企図する化合物（化合物Ｃ０１０５及びＣ０１１４など）が、下流のＮＭＤＡＲ（図８）及びＩＲの正常機能回復ももたらすという事実は、Ａβのα７ｎＡＣｈＲを介したシグナル伝達を防ぐことの利点が、α７ｎＡＣｈＲの健常性に限られることではなく、それよりもむしろＡＤの病理発生の臨界点となり得ることを示している。ＮＭＤＡＲシグナル伝達は、長期増強（ＬＴＰ）に、従って学習及び記憶に必須であるので、この神経伝達物質系の正常機能を維持することは、ＡＤにおいて記憶の保存に重大である。
これらの化合物がＩＲ機能を保存する理由は、依然として推測の域を出ない。なぜなら、ＦＬＮＡ−ＩＲ結合は、Ａβ42によっても、これらの化合物によっても影響を受けないからであり、そしてＩＲはα７ｎＡＣｈＲの直接の下流に存在しないからである。それにも関わらず、ＩＲのインシュリン感受性が保存されること（図１０）は、ＡＤ病理において、Ａβのα７ｎＡＣｈＲを通じた毒性シグナル伝達を防ぐことの、発散的利点を表す。その上、本明細書に提示するＦＬＮＡ結合化合物は、受容体を直接アンタゴナイズ又は脱感することなくこの毒性シグナル伝達を防ぐ新規かつ恐らく安全なアプローチを表す。
その上更に、化合物が持つ低ｎＭ濃度での有効性は、治療効果の範囲が広いことを示す。更に、Ａβの通常は高い受容体への親和性を低下させることにより、結合したＡβをα７ｎＡＣｈＲから取り除く能力［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７５：５６２６−５６３２ （２０００）］は、企図する化合物が、ＡＤを予防するのに有効となり得るだけでなく、なにかしらの認知回復を提供し、ＡＤ後期のさらなる変性を止める助けともなり得ることを示している。
Ｅ１２９マウスに例示化合物Ｃ０１０５を１０ｍｇ／ｋｇで１日２回腹腔内投与すると、ＦＬＮＡとα７ｎＡＣｈＲ及びＴＬＲ４との会合両方におけるＡβ42が誘導する増加を大幅に減少させ、神経原線維タングルで見られるτの３つのリン酸化部位全てでのτリン酸化を抑制し、Ａβ42−α７ｎＡＣｈＲ複合体レベルを低下させ、α７ｎＡＣｈＲ、ＮＭＤＡＲ、及びＩＲシグナル伝達におけるＡβ42誘導型機能障害を防ぎ、ならびに炎症性サイトカインレベルを抑制した（図１４〜図２４）。例示化合物Ｃ０１０５は、そのＦＬＮＡに対する高親和性結合を介して、これらの効果全てを達成した。Ａβ42は、ＦＬＮＡとα７ｎＡＣｈＲとの会合を劇的に増加させることで、Ａβ42の結合及びこの受容体を通じた毒性シグナル伝達を可能にしている。
具体的な結果
ＡＤ遺伝子導入マウス及びＡＤ患者の前頭皮質におけるα７ｎＡＣｈＲ−ＦＬＮＡ結合の増加
ｉｎ ｖｉｔｒｏで、シナプトソームをＡβ42とともにインキュベートすると、分子量が３００ＫＤａある足場タンパク質と結合するα７ｎＡＣｈＲが増加する。この足場タンパク質は、ＦＬＮＡではないかと思われる。ＦＬＮＡは多くの受容体タンパク質と結合することが知られているものの、このデータは、初めてα７ｎＡＣｈＲ−ＦＬＮＡの関連を明らかにしたものであり、ＡＤでは、Ａβ42負荷の増加とともに、α７ｎＡＣｈＲ−ＦＬＮＡ結合が増加している可能性を示唆する。この仮説を、６ヶ月齢のＡＤ遺伝子導入及び野生型マウス、ならびに年齢及び死後経過期間がよく一致したヒトＡＤ−対照対の前頭皮質から調製したシナプトソームで直接試験した。
図１に示すデータは、α７ｎＡＣｈＲ−ＦＬＮＡ複合対の存在量が、ＡＤ遺伝子導入マウス及びＡＤ患者両方の前頭皮質で、３倍増加することを示す。ＦＬＮＡは、それが会合した受容体のシグナル伝達を制御することが既知であるので、Ａβ42により誘導されたα７ｎＡＣｈＲ−ＦＬＮＡ会合の増加は、Ａβ42に誘起されたα７ｎＡＣｈＲシグナル伝達及びτリン酸化に関連している可能性がある。すなわち、Ａβ42に誘発されるα７ｎＡＣｈＲ−ＦＬＮＡ会合を減少させる化合物は、ＡＤにおける神経原線維病理を減少させる可能性がある。
シナプトソームでのｅｘ ｖｉｖｏ試験
高親和性ＦＬＮＡ結合化合物は、ｅｘ ｖｉｖｏで、シナプトソームにおいて、Ａβ42が誘導するα７ｎＡＣｈＲ−ＦＬＮＡ会合、ＥＲＫ２活性化及びτリン酸化を減少させる。
９種の高親和性ＦＬＮＡ結合化合物［Ａ００３３、Ａ００４０、Ａ００５３、Ａ００６８、Ｂ００５５、Ｃ０１０５、Ｃ０１１４、Ｃ０１３７、及びＣ０１３８］をアッセイして、成熟ラットの前頭皮質から調製したシナプトソームで、ＦＬＮＡとα７ｎＡＣｈＲとの会合を妨害できるかどうかを明らかにした。シナプトソームを、１００ｎＭのＡβ42と３０分間接触させ、それと同時に、又はそれより１０分早くのいずれかで、０．１μＭ又は１μＭの化合物を添加した。対照は、ビヒクル（Ａβ42なし）及びＡβ42のみの条件であった。
図２は、アッセイした９種の化合物全て、プラス（＋）ナロキソン（ＮＬＸ）で得られたウエスタンブロット、ならびに特に活性な化合物４種についてブロットを定量したものを示す。これらの化合物４種の全てが、１０分のプレインキュベーションでα７ｎＡＣｈＲ−ＦＬＮＡ会合を減少させ、化合物Ｃ０１０５も、同時投与でこの結合を顕著に減少させた。
化合物投与後のＡβ42のα７ｎＡＣｈＲを介したシグナル伝達を査定するため、Ａβ42及び化合物で処理した同じシナプトソーム調製物で、リン酸化ＥＲＫ２のレベルを測定した。ＥＲＫ２のリン酸化は、その活性化を示しており、活性化によりτリン酸化がもたらされる。対照条件と比較すると、Ａβ42はＥＲＫ２を強力に活性化するが、この活性化は、０．１ｎＭ及び１ｎＭで１０分前処理する場合の４種の化合物全てにより、また同時処理の場合の化合物Ｃ０１０５によっても大幅に抑制される（図３）。
次に査定したのは、ＦＬＮＡ結合化合物が、Ａβ42とα７ｎＡＣｈＲの結合及びＥＲＫ２活性化の下流効果であるτリン酸化も減少させるかどうかであった。τタンパク質の３つの主要リン酸化部位を、それらのリン酸化レベルについて、全τタンパク質含量と比べることで調べた。これら３つの部位でリン酸化されたτは、ＮＦＴの構成要素である。ＦＬＮＡ−α７ｎＡＣｈＲ会合及びＥＲＫ２活性化に対する効果と一致して、アッセイしたＦＬＮＡ結合化合物の全てが、１０分のプレインキュベーションで、３つのリン酸化部位全てでＡβ42が誘導するτリン酸化を減少させた（図４）。
化合物Ｃ０１０５及び化合物Ｃ０１１４は、α７ｎＡＣｈＲ及びＦＬＮＡを含有する膜フラクションに対するＦＩＴＣ−Ａβ42結合を減少させる
ビオチン化α７ｎＡＣｈＲ含有ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞フラグメントを用いて、化合物及びＦＩＴＣ−Ａβ42を同時に添加して、３０℃で３０分間インキュベートした。化合物Ｃ０１０５は、０．１ｎＭ、１ｎＭ、及び１０ｎＭの濃度で、ＦＩＴＣ−Ａβ42結合を、それぞれ５２．３±３．７％、５５．１±３．０％、及び５６．５±４．２％、阻害した。化合物Ｃ０１１４は、そこまで有効ではなかったが、これら３種の濃度で、ＦＩＴＣ−Ａβ42結合を、２７．８±３．３％、４０．０±２．１％、及び５３．４±３．６％減少させた。これらのデータは、例示化合物Ｃ０１０５、及びそれより効果の劣る化合物Ｃ０１１４が、ＦＬＮＡに結合し、おそらくはその立体構造を変化させることにより、Ａβ42のα７ｎＡＣｈＲに対する結合親和性に影響を及ぼすことができることを示唆する。
ＦＬＮＡ−α７ｎＡＣｈＲ／ＴＬＲ４及びＡβ42−α７ｎＡＣｈＲ会合は、ＡＤリンパ球で増加する
リンパ球はα７ｎＡＣｈＲ及びＴＬＲ４を含有しているため、これらの受容体とＦＬＮＡとの会合がＡＤ患者のリンパ球で増加するかどうか、及びｅｘ ｖｉｖｏでの化合物Ｃ０１０５による処理がこれらの会合を妨害できるかどうかを査定することができた。同じく査定したのは、ＡＤリンパ球及び同年齢の対照被験者由来のリンパ球をＡβ42処理したものにおける、Ａβ42−α７ｎＡＣｈＲ複合体に対する化合物Ｃ０１０５の効果であった。
ＦＬＮＡとα７ｎＡＣｈＲ及びＴＬＲ４との会合は、ビヒクル処理した対照リンパ球と比べて、ＡＤリンパ球及びＡβ42処理した対照リンパ球で劇的に増加した。更に、Ａβ42−α７ｎＡＣｈＲ複合体のレベルは、ＡＤリンパ球又はＡβ42処理した対照リンパ球で上昇した。１ｎＭの化合物Ｃ０１０５とともに３０分間インキュベートすると、ＦＬＮＡとの会合の増加及びＡβ42−α７ｎＡＣｈＲ複合体のレベルが有意に低下した。
成熟ラット由来の器官型前頭皮質脳切片培養物での試験
化合物Ｃ０１０５及び化合物Ｃ０１１４は、Ａβ42が誘導するＦＬＮＡとα７ｎＡＣｈＲ及びＴＬＲ４との会合両方を減少させる
成熟ラットの器官型前頭皮質脳切片を、１００ｎＭのＡβ42の添加と同時に例示化合物Ｃ０１０５又はＣ０１１４いずれかを添加して用いて、１６時間インキュベートした。組織を収穫して溶解させ、ＦＬＮＡ特異的抗体を用いて、ＦＬＮＡ及び会合したタンパク質を免疫沈降させた。ＦＬＮＡ免疫沈降物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いてサイズ分画し、移動させ、以下の受容体それぞれに対する特異的抗体で探索した：α７ｎＡＣｈＲ、ＴＬＲ４、ＩＲ、及びＭＯＲ。Ａβ42（１００ｎＭ）は、ＦＬＮＡとα７ｎＡＣｈＲ及びＴＬＲ４との会合両方の増加を引き起こしたが、ＩＲ又はＭＯＲとの会合は増加を引き起こさなかった（図５）。化合物Ｃ０１０５は、０．１ｎＭ、１ｎＭ、及び１０ｎＭで、Ａβ42が誘導するＦＬＮＡ−α７ｎＡＣｈＲ会合の増加を減少させ、１ｎＭ及び１０ｎＭで、ＦＬＮＡ−ＴＬＲ４の増加を減少させた。化合物Ｃ０１１４は、１ｎＭ及び１０ｎＭでのみ試験したが、両方の濃度でＦＬＮＡ−α７ＡｃｈＲ会合を減少させ、１０ｎＭでＦＬＮＡ−ＴＬＲ４会合を減少させた。
化合物Ｃ０１０５及び化合物Ｃ０１１４は、Ａβ42が誘導するτリン酸化を減少させる Ａβ42での処理と同時に化合物Ｃ０１０５又は化合物Ｃ０１１４いずれかで処理した器官型前頭皮質脳切片培養物において、化合物Ｃ０１０５は３種類の濃度全てにおいて、及び化合物Ｃ０１１４は両方の濃度で、神経原線維タングルで見られるτの３つのリン酸化部位全てにおいてτリン酸化を減少させた（図６）。
化合物Ｃ０１０５及び化合物Ｃ０１１４は、Ａβ42が誘導するα７ｎＡＣｈＲ機能障害を回復させる
α７ｎＡＣｈＲの正常機能は、全アゴニスト（ＰＮＵ２８２９８７；Ｎ−［（３Ｒ）−１−アザビシクロ［２．２．２］オクタ−３−イル］−４−クロロベンズアミド）で受容体を刺激した後のカルシウム流入が減少することで示されるとおり、Ａβ42により損なわれる。化合物Ｃ０１０５及び化合物Ｃ０１１４の両方が、この受容体の機能を回復させ、化合物Ｃ０１０５は１ｎＭ及び１０ｎＭで完全に機能を回復させた（図７）。
化合物Ｃ０１０５及び化合物Ｃ０１１４は、Ａβ42が誘導するＮＭＤＡＲ機能障害を回復させる
Ａβ42接触後のα７ｎＡＣｈＲ機能の査定と同様に、コアゴニスト、グリシン及びＮＭＤＡでの刺激後のカルシウム流入を測定することで、ＮＭＤＡＲ機能を査定した。Ａβ42が誘導する障害は、１ｎＭ及び１０ｎＭの化合物Ｃ０１０５により完全に防がれたが、０．１ｎＭの化合物Ｃ０１０５及び化合物Ｃ０１１４も、ＮＭＤＡＲ機能を有意に回復させた（図８）。
ＮＭＤＡＲ機能不全は、ＮＭＤＡ及びグリシンで刺激した後に、必須ＮＭＤＡＲサブユニットＮＲ１と会合している６種の異なるシグナル伝達分子（ｎＮＯＳ、ＰＬＣγ１、ＰＫＣγ、ｐＹ402ＰｙＫ２、ｐＹ416Ｓｒｃ、及びＰＳＤ−９５）のレベルを測定することでも査定した。ビヒクル対照条件において、ＮＭＤＡとグリシンの組み合わせは、ＮＭＤＡＲとＰＳＤ−９５の会合を増強し、ｎＮＯＳ、ＰＬＣγ１、及びＰＫＣγのＮＭＤＡＲ複合体への補充を増加させ、活性ＰｙＫ２（ｐＹ402ＰｙＫ２）及びＳｒｃ（ｐＹ416Ｓｒｃ）のレベルを上昇させた；これらの上昇全てが、Ａβ42により大きく損なわれた（図９）。化合物Ｃ０１０５及び化合物Ｃ０１１４は両方とも、受容体とともにあるこれらの分子のレベルを完全に回復させることで裏付けられるとおり、機能を完全に回復させた。
化合物Ｃ０１０５及び化合物Ｃ０１１４は、Ａβ42が誘導するＩＲ機能障害を回復させる
調べた３番目の受容体、ＩＲも、Ａβ42が誘導する機能不全を示した（図１０）。ビヒクル条件では、受容体をアゴニスト（インシュリン）刺激した後、下流シグナル伝達分子ＩＲＳ−１のアダプタータンパク質とＩＲとの会合は（ＩＲβに対する抗体を用いた免疫沈降で検出して）増加し、リン酸化ＩＲβ、ｐＹ1150/1151ＩＲβにより示されるとおり活性化ＩＲのレベル。Ａβ42と接触させると、ＩＲＳ−１会合及びｐＹ1150/1151ＩＲβの両方とも、レベルが劇的に減少し、受容体の脱感作又はインシュリン耐性を示した。ＩＲ−ＦＬＮＡ会合はＡβ42によっても今回試験した化合物によっても影響を受けないという観測にもかかわらず、化合物Ｃ０１０５及び化合物Ｃ０１１４のそれぞれが、Ａβ42接触により誘導されたシグナル伝達障害を正常化した。
化合物Ｃ０１０５及び化合物Ｃ０１１４は、Ｋ+誘発性カルシウム流入により示されるとおり、Ａβ42が誘導する細胞死を防ぐ
細胞の非機能化又は細胞死の１つの指標は、脱分極してカルシウムを流入させる能力を細胞が失うことである。そこで、切片培養物中の細胞死又は非機能性を測定するために、Ｋ+誘発性脱分極に反応して起こるカルシウム流入を測定した。カルシウム流入は、Ａβ42により大きく減少したが、この減少は、１ｎＭ及び１０ｎＭの化合物Ｃ０１０５により、及び１０ｎＭの化合物Ｃ０１１４により完全に元に戻った（図１１）。より低濃度の化合物Ｃ０１０５（０．１ｎＭ）及び化合物Ｃ０１１４（１ｎＭ）もまた、細胞死を防ぐのに非常に有効であった。
化合物Ｃ０１０５は、ＮＦＴ及びＡβ42沈着物の免疫染色を劇的に減少させる
ｐＴａｕ及びＡβ42に対する抗体を用いた免疫組織化学反応は、化合物Ｃ０１０５の投与が、Ａβ42とともにインキュベートした器官型前頭皮質脳切片培養物において、ＮＦＴ（図１２）及びＡβ42凝集物（図１３）の両方を劇的に減少させることを示す。
Ａβ 42 をＩＣＶ輸液するマウスモデル
マウスにＡβ42の脳室内（ＩＣＶ）輸液を行うアルツハイマー病モデルにおいて、Ａβ42は、ＦＬＮＡとα７ｎＡＣｈＲ及びＴＬＲ４との会合両方を劇的に増加させ、神経原線維タングルで見られるτの３つのリン酸化部位全てでτリン酸化を引き起こし、α７ｎＡＣｈＲ、ＮＭＤＡＲ、及びＩＲのシグナル伝達を障害した。化合物Ｃ０１０５を１０ｍｇ／ｋｇで１日２回投与する全身処置は、Ａβ42輸液によるこれらの効果を顕著に減少させた。化合物Ｃ０１０５は、Ａβ42が誘導するＦＬＮＡとα７ｎＡＣｈＲ及びＴＬＲ４との会合両方の増加を減少させ（図１４）、これら受容体両方のＡβ42媒介性シグナル伝達の減少を示唆した。
化合物Ｃ０１０５での処置は、３つのリン酸化部位全てでτリン酸化を抑制し（図１５）、またしてもα７ｎＡＣｈＲを介したＡβ42シグナル伝達が妨害されることを示した。ＦＬＮＡに対する化合物Ｃ０１０５の高親和性結合は、Ａβ42とα７ｎＡＣｈＲの結合を減少させることにより、α７ｎＡＣｈＲを介したＡβ42シグナル伝達を減少させるらしい：これらＡβ42−α７ｎＡＣｈＲ複合体のレベルは、Ｃ０１０５処置した動物で低下する（図１６）。
α７ｎＡＣｈＲをその全アゴニストＰＮＵ２８２９８７で刺激した後のカルシウム流入により、Ａβ42が誘導するα７ｎＡＣｈＲ機能不全が示された。Ａβ42が誘導するこのカルシウム流入の減少は、化合物Ｃ０１０５処置した動物で正常化された（図１７）。同様に、ＮＭＤＡ及びグリシンでの同時刺激後のカルシウム流入で示されるとおり、下流ＮＭＤＡＲ機能もＡβ42のＩＣＶ輸液により障害された（図１８）。またしても、化合物Ｃ０１０５処置が、Ａβ42が誘導するＮＭＤＡＲ機能不全を回復させた。Ｋ+による脱分極後のカルシウム流入を用いて、細胞全体の機能不全又は死亡細胞を査定した。Ａβ42のＩＣＶ輸液は、このＫ+誘発性カルシウム流入を大きく減少させたが、Ｃ０１０５処置は、これを回復させた（図１９）。
この化合物Ｃ０１０５での処置がＮＭＤＡＲ機能不全を元に戻すことは、ＮＭＤＡＲシグナル伝達を測定することによっても裏付けられる。Ａβ42を輸液されたマウスは、ＮＭＤＡ／グリシン誘導性活性化（リン酸化）及び６種のシグナル伝達構成要素のＮＭＤＡＲへの補充における減少を示した。Ａβ42のＩＣＶ輸液を受けたマウスを化合物Ｃ０１０５で処置すると、事実上同一の結果をもたらした。
ＮＭＤＡＲシグナル伝達障害を、ＮＭＤＡ及びグリシンで同時刺激した後、ＮＲ−１（ＮＭＤＡＲの必須サブユニット）との免疫共沈した６種のシグナル伝達構成要素（ＰＬＣγ、ｎＮＯＳ、ｐＹ402ＰｙＫ２、ＰＳＤ−９５、ＰＫＣγ、ｐＹ416Ｓｒｃ、及びＮＲ１）のレベルでも査定した。Ａβ42は、６種のシグナル伝達分子全てのレベルを低下させたが、それらは、Ｃ０１０５処置により正常化された（図２０）。同様に、ＩＲシグナル伝達を、インシュリン刺激後のＩＰβのリン酸化及びＩＰβとシグナル伝達分子ＩＲＳ−１との会合により査定した。ＮＭＤＡＲシグナル伝達と同様に、これらの程度は、Ａβ42により減少し、Ｃ０１０５処置により回復した（図２１）。
重要なことに、ＦＬＮＡとＴＬＲ４との会合はＡβ42によって増加し、化合物Ｃ０１０５によって正常化されるので、Ａβ42のＩＣＶ輸液後の炎症性サイトカイン放出が化合物Ｃ０１０５処置によって抑制されるのかどうかを査定した。Ａβ42のＩＣＶ輸液は、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、及びＩＬ−１β産生を増加させた。化合物Ｃ０１０５処置は、Ａβ42が誘導するＩＬ−６産生を完全に消失させ、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１βのレベルを、それぞれ８６％及び８０％抑制した（図２２）。最後に、前頭前皮質（ＦＣＸ）及び海馬（ＨＰ）の免疫組織化学反応（ＩＨＣ）は、化合物Ｃ０１０５処置がＮＦＴ形成を防ぐ（図２３）だけでなくアミロイド沈着も防ぐ（図２４）ことを示す。
死後ヒト脳組織研究
ＡＤ及びＡβ42処理した対照組織において、化合物Ｃ０１０５は、Ａβ42が誘導するＦＬＮＡとα７ｎＡＣｈＲ及びＴＬＲ４との会合を減少させる（図２５）。化合物Ｃ０１０５との接触は、Ａβ42−α７ｎＡＣｈＲ相互作用の親和性を約１，０００〜１０，０００倍に弱める（図２７）ことにより、Ａβ42−α７ｎＡＣｈＲ複合体を減少させる（図２６）。化合物Ｃ０１０５との接触は、受容体刺激後のカルシウム流入で示されるとおり、α７ｎＡＣｈＲの機能（図２８）及びＮＭＤＡＲの機能（図２９）を保存する。受容体機能の正常化も、ＮＭＤＡＲ（図３１）及びＩＲ（図３２）のシグナル伝達集合体（signalling assembly）のレベルにより示された。目立つのは、ＡＤ脳切片を１ｎＭの化合物Ｃ０１０５とともに１時間インキュベートすると、ＮＭＤＡＲサブユニットの集合に影響を及ぼすことなく、このＮＭＤＡＲシグナル伝達障害の６つの測定値全てを正常化したことである。マウスモデルでの知見と同様に、化合物Ｃ０１０５を用いたインキュベーションは、死後ＡＤ組織において、脱分極が誘導するカルシウム流入の欠陥も減弱した（図３０）。この欠陥は、非機能化又は死亡細胞を示す。
対照死後前頭皮質組織では、化合物Ｃ０１０５と結合するＦＬＮＡペンタペプチド結合部位（配列番号１のＶＡＫＧＬ）を、ＦＬＮＡとα７ｎＡＣｈＲ及びＴＬＲ４との会合の化合物Ｃ０１０５による減弱を遮断するデコイとして用いた（図３３）。τリン酸化を防ぐことの同様な遮断を、このデコイペンタペプチドで実証した（図３４）。これらの結果を合わせると、化合物Ｃ０１０５は、ＦＬＮＡに結合することで、τリン酸化を阻害し、複数の受容体機能を保存することが確実である。
対照死後前頭皮質組織を用いて、化合物Ｃ０１０５がＬＰＳ誘導性τリン酸化も減少させることも実証した（図４７）。
対照死後前頭皮質組織では、Ａβ４２が誘導するα７ｎＡＣｈＲへのＦＬＮＡ補充が、１０倍高い濃度でのＡβ４０により、又はα７ｎＡＣｈＲアゴニストであるニコチン及びＰＮＵ２８２９８７を用いて模倣されたが、ただし明らかに低下した度合いであった。α７ｎＡＣｈＲアンタゴニストであるα−ブンガロトキシン及びメチルリカコニチンならびにコリンエステラーゼ阻害剤／陽性アロステリックニコチン受容体修飾因子ガランタミンは、何も効果を示さなかった（以下の表）。興味深いことに、ＮＭＤＡＲ及びα７ｎＡＣｈＲ両方のアンタゴニストであるメマンチンは、α７ｎＡＣｈＲへのＦＬＮＡ補充を、Ａβ４０のものとあまり違わない度合いで誘起した。
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化合物
化合物は、Ｍｅｄｉｃｉｌｏｎ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）が合成し提供した。本明細書中記載される３つの合成の他に、より詳細な合成が、米国特許出願公開第２００９／０１９１５７９号、第２０１０／０２７９９９６号、第２０１０／０２７９９９７号、第２０１０／０２８００６１号、第２０１１／０１０５４８１号、第２０１１／０１０５４８４号、第２０１１／０１０５４８７号、及び第２０１１／０１０５５４７号の１つ又は複数に記載され、これらの開示は参照として援用される。
非対称（キラル）炭素を有する化合物又はその塩は、２つの鏡像異性体の形で存在し得る。本発明は、各鏡像異性体の両方に、及びそれらの混合物に関する；すなわち、両方の鏡像異性体形及びそれらの混合物に関する。更に、２つ以上のキラル中心が存在する場合、ジアステレオマーが形成され得る。
系列Ａ、Ｂ、Ｃ−１、Ｃ−２、Ｄ、又はＥ、又は本明細書中のその他の式のいずれかの化合物について、企図する化合物又はその化合物の薬学的に許容可能な塩が、立体異性体の混合物として、好ましくはラセミ体又は他の様々な鏡像異性体及び／又はジアステレオ異性体混合物として得られる場合、そのような混合物は、当業者に既知の従来方法により分離させ、随意に単離することが可能である。例として、例えば、クロマトグラフィーによる分離プロセスが有用であり、特に標準圧又は加圧下での液体クロマトグラフィープロセス、好ましくはＭＰＬＣ法及びＨＰＬＣ法が有用であり、ならびに分別再結晶を含む方法も有用である。分離は、特に個々の鏡像異性体の分離を含むことができ、例えば、ジアステレオ異性体塩を、キラルＨＰＬＣにより、又はキラル酸（例えば、（＋）−酒石酸、（−）−酒石酸、又は（＋）−１０−カンファースルホン酸）を用いた結晶化により分離するものである。キラル塩形成により分離した鏡像異性体は、使用時に光学不活性又はラセミの薬学的に許容可能な塩に容易に変換することができる。
系列Ａ、Ｂ、Ｃ−１、Ｃ−２、Ｄ、又はＥの化合物又はその薬学的に許容可能な塩は、本発明のプロセスにおいて、鏡像異性体として純粋な形、すなわち、（Ｓ）もしくは（Ｒ）配置又はｄ及びｌ型で、あるいは（Ｓ，Ｒ）又は（ｄ，ｌ）配置で示されるラセミ混合物の形で、あるいは１種又は複数のジアステレオマーとして、及びそれらの混合物の形で、随意に使用されるものとする。
すなわち、企図する化合物又はその薬学的に許容可能な塩は、随意に１種又は複数の形で存在することができる。例として、化合物又はその塩は、個々の鏡像異性体又はジアステレオ異性体であることが可能である。企図する化合物又はその塩は、立体異性体の混合物として存在することもできる。企図する化合物又は塩は、ラセミ混合物として存在することもできる。
企図する方法における活性成分として有用な化合物は、容易に合成できる。系列Ａの化合物について、合成スキームの例（スキーム１）を以下に示す。好適な種類の化合物について同様なスキームを、本明細書中以下に示す。
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スキーム１に示すＤ−メントールの代わりにフェノール又は置換フェノールを出発物質に用いることで、フェノール化合物で同様な合成を行うことができる。別のシクロヘキサノール又はシクロヘキセノールも、Ｄ−メントールの代わりに用いることができる。化合物１とアミンの反応で形成されるアルコールは、既知の方法により容易に酸化させることができる。
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系列Ｂの化合物は、以下のスキーム２に示す合成経路に従って調製することができる。以下に示す例示の合成スキームは、企図する化合物の第一の部分を調製するためのものであり、強塩基（ナトリウムエトキシドなど）の存在下で適切な置換メチルケトン化合物と反応させることにより、第二の部分を付加させる。得られるケトン体は、水素化ホウ素ナトリウムを用いるなどの穏やかな還元により、対応するアルコール体に変換することができる。ケトン体又はアルコール体は、アルキル化剤（ヨウ化メチルなど）を用いて、第四級窒素原子含有化合物に変換することができる。
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様々な置換基及び環原子を有する系列Ｃ（Ｃ−１及びＣ−２両方）の化合物を調製するための合成スキームの例を以下に示す。このスキームは、２つのカルボニル連結部を有する化合物の調製、及び示されているものとは反対の配置で１つのカルボニル連結部と１つのスルホニル連結部を有する化合物の調製にも容易に適合させることができる。エタノールアミン又はチオエタノールアミンをエチレンジアミン又はＮ−メチルエチレンジアミンに置き換えて、対応する二窒素化合物を調製することができる。２−アミノアセトアミド又はＮ−置換アセトアミド又はプロピオンアミドを用いた同様な置き換えにより、対応するアミノアミド含有環系が得られる。
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系列Ｃ−２の化合物４、９、及び１０の調製
これら３種の化合物は、本明細書中９−２と指定する共通の中間体から調製した。この中間体は、出願番号第１２／５６１０，０９１号（米国特許出願第２０１１０１０５４８７号、２０１１年５月５日提出；国際公開第２０１０／０５１４９７号）に記載の化合物Ｃ０１１６Ｍの合成中に調製されたもので、その明細書中では、化合物Ｃ０１１６Ｍ−１と示されている。
化合物９−２を調製してから、以下に示すとおり、最初にピリジン中で五員環の窒素にトシル基を付加し、続いてジクロロメタン中でトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いてｔ−ＢＯＣ基を外すことにより化合物９−４を形成することで、化合物９及び１０の合成を通常手順で進めた。合成の詳細を、本明細書中以下に提供する。
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化合物９−２は、化合物４を調製するための基礎ともなる。今回は、以下に示すとおり、ピリジン中で五員環のアミンに４−トリフルオロメトキシフェニルスルホニルクロリドを反応させ、上記のとおりＴＦＡ／ＤＣＭ中でｔ−ＢＯＣ基を外して、化合物４−１を形成した。次いで、化合物４−１の六員環のアミン窒素を（ブロモメチル）シクロプロパンと反応させて、Ｎ−アルキル化生成物を形成した。これが化合物４である。
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化合物９−２の調製
Ｎ−Ｂｏｃ−ピペリジン−４−オン（５０ｇ、２５１ｍｍｏｌ）のエタノール（５００ｍＬ）溶液に、２−アミノエタノール（４６ｇ）を加えた。混合物を、室温で一晩（約１８時間）撹拌した。次いで、溶媒を減圧除去した。残渣をＣＨ2Ｃｌ2（ＤＣＭ）で希釈して、飽和Ｎａ2ＣＯ3水溶液で洗った（１００ｍＬ×６）。有機相を無水Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ、濃縮して、生成物を黄色油状物として得た（６１ｇ、収率：１００％、ＴＬＣで確認）。
化合物９−３の調製
化合物９−２（３１．２ｇ、１３０ｍｍｏｌ）のピリジン（３２０ｍＬ）溶液に、トルエンスルホニルクロリド（ＴｓＣｌ；２４．７ｇ、１３０ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を、室温で一晩（約１８時間）撹拌した。反応混合物を減圧濃縮してピリジンを除去し、残渣をＤＣＭに溶解させて、飽和ＮａＨＣＯ3で洗った。有機層をＮａ2ＳＯ4で乾燥させ、濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して、生成物を白色個体として得た（４０ｇ、収率：７８％、１Ｈ ＮＭＲで確認）。
1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：７．７４（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ）；７．３１（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ）；４．１３〜４．０３（ｍ，４Ｈ）；３．５６〜３．５０（ｍ，２Ｈ）；２．８９（ｂｒｓ，２Ｈ）；２．４６（ｓ，３Ｈ）；２．４３〜２．３６（ｍ，２Ｈ）；１．６３（ｂｒｓ，２Ｈ）；１．４７（ｓ，９Ｈ）。
化合物９−４の調製
化合物９−３（３５．２ｇ、８８．７ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（３５０ｍＬ）溶液に、トリフルオロ酢酸（ＣＦ3ＣＯＯＨ；６０ｍＬ）を加えた。混合物を、氷／水浴で、５０分間撹拌した。反応混合物に、ＤＣＭを２００ｍＬ加え、得られる組成物を飽和Ｎａ2ＣＯ3で洗った。有機層をＮａ2ＳＯ4で乾燥させ、減圧濃縮して、粗生成物を得た。粗生成物をカラムクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物を淡黄色油状物として得た（１１．２ｇ、収率：４２％、1Ｈ ＮＭＲで確認）。
1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：７．７５（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ）；７．２９（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ）；３．９５（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ）；３．７５（ｂｒｓ，１Ｈ）；３．５１〜３．４８（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ）；３．１６〜３．１２（ｄｄ，Ｊ＝１２．４，４．０Ｈｚ，２Ｈ）；２．９２〜２．８６（ｔｄ，Ｊ＝１２．８，２．０Ｈｚ，２Ｈ）；２．４８〜２．４４（ｍ，２Ｈ）；２．４１（ｓ，３Ｈ）；１．６５（ｄ，Ｊ＝１２．８Ｈｚ，２Ｈ）。
化合物９の調製
化合物９−４（１．８５ｇ、６．２５ｍｍｏｌ）及びＫ2ＣＯ3（３．３９ｇ、１２．５ｍｍｏｌ）をアセトン（４０ｍＬ）に加え、この混合物に（ブロモメチル）シクロブタン（１．８６ｇ、１２．５ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を一晩（約１８時間）還流撹拌した。冷却してから、混合物を濾過して濃縮し、酢酸エチル（ＥＡ）を用いてクロマトグラフィーで精製して、粗生成物を淡黄色固体として得た（１．６ｇ、収率：７０％、ＬＣＭＳで確認、1Ｈ ＮＭＲは、生成物が純粋ではないことを示した）。粗生成物を、ＥＡを用いてクロマトグラフィーで更に精製して、所望の生成物を白色固体として得た（１．１５ｇ、収率：５０％、ＬＣＭＳ及び1Ｈ ＮＭＲで確認、ＨＰＬＣ：９９．３％＠２５４ｎｍ、９９．５＠２１４ｎｍ）。
1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：７．７７（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ）；７．３１（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ）；３．９５（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ）；３．５２（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ）；２．７６〜２．７３（ｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ，２Ｈ）；２．５４〜２．３９（ｍ，８Ｈ）；２．２１〜２．１５（ｔ，Ｊ＝１１．６Ｈｚ，２Ｈ）；２．０７〜２．０５（ｍ，２Ｈ）；１．９３〜１．８８（ｍ，２Ｈ）；１．７０〜１．６５（ｍ，２Ｈ）；１．５６〜１．５３（ｄ，Ｊ＝１２．４Ｈｚ，２Ｈ）。ＭＳ（ＥＳＩ）のＣ19Ｈ28Ｎ2Ｏ3Ｓ（ｍ／ｚ）計算値：３６４．１８，実測値：３６５．１［Ｍ＋１］+。
化合物１０の調製
化合物９−４（１．７２ｇ、５．８ｍｍｏｌ）及びＫ2ＣＯ3（１．６ｇ、１１．６ｍｍｏｌ）をアセトン（３０ｍＬ）に加え、この混合物に３−ブロモプロパ−１−エン（０．７ｇ、５．８ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を４０℃で２時間撹拌した。冷却してから、混合物を濾過して濃縮し、ＥＡを用いてクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物を白色固体として得た（１．１ｇ、収率５６％、ＬＣＭＳ及び1Ｈ ＮＭＲで確認、ＨＰＬＣ：９８．８％＠２５４ｎｍ、９８．９＠２１４ｎｍ）。
1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：７．７６〜７．７４（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ）；７．２９〜７．２７（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ）；５．９０〜５．８２（ｍ，１Ｈ）；５．１８〜５．１１（ｍ，２Ｈ）；３．９５〜３．９１（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ）；３．５２〜３．４９（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ）；３．０〜２．９８（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ）；２．８３〜２．８０（ｄｄ，Ｊ＝８．８，２．４Ｈｚ，２Ｈ）；２．５５〜２．４８（ｔｄ，Ｊ＝１３．２，４．４Ｈｚ，２Ｈ）；２．４１（ｓ，３Ｈ）；２．１９〜２．１４（ｔ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ，２Ｈ）；１．５８〜１．５５（ｄ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ，２Ｈ）。ＭＳ（ＥＳＩ）のＣ17Ｈ24Ｎ2Ｏ3Ｓ（ｍ／ｚ）計算値：３３６．４５，実測値：３３７．１［Ｍ＋１］+。
化合物１１の調製
化合物９−２（１４．６ｇ、６０ｍｍｏｌ）のピリジン（１５０ｍＬ）溶液に、４−（トリフルオロメトキシ）ベンゼン−１−スルホニルクロリド（１５．７ｇ、６０ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を、室温で一晩（約１８時間）撹拌した。反応混合物を減圧濃縮してピリジンを除去し、残渣をＤＣＭに溶解させ、飽和ＮａＨＣＯ3で洗った。有機層をＮａ2ＳＯ4で乾燥させ、濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して、生成物を白色固体として得た（２０ｇ、収率：７１％、１Ｈ ＮＭＲ及びＬＣＭＳで確認）。
1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：７．９２〜７．９０（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ）；７．３５〜７．３２（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ）；４．１３〜３．９７（ｍ，４Ｈ）；３．５１（ｂｒｓ，２Ｈ）；２．９０（ｂｒｓ，２Ｈ）；２．４５〜２．３５（ｍ，２Ｈ）；１．５８（ｂｒｓ，２Ｈ）；１．４７（ｓ，９Ｈ）。ＭＳ（ＥＳＩ）のＣ19Ｈ25Ｆ3Ｎ2Ｏ6Ｓ（ｍ／ｚ）計算値：４６６．１４，実測値：３６７．０［Ｍ＋１］+。
化合物４−１の調製
化合物１１（１５ｇ、３２ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１５０ｍＬ）溶液に、トリフルオロ酢酸（ＣＦ3ＣＯＯＨ；２０ｍＬ）を加えた。混合物を、氷／水浴中、５０分間撹拌した。ＤＣＭ２００ｍＬに反応混合物を加え、飽和Ｎａ2ＣＯ3で洗った。有機層をＮａ2ＳＯ4で乾燥させ、減圧濃縮して、粗生成物を得た。粗生成物を、カラムクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物を淡黄色固体として得た（５．９ｇ、収率：５０％、1Ｈ ＮＭＲで確認）。
1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：７．９３〜７．９１（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ）；７．３４〜７．３２（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ）；４．０〜３．９７（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ）；３．５１〜３．４８（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ）；３．０６〜３．０２（ｄｄ，Ｊ＝１２．４，４．０Ｈｚ，２Ｈ）；２．８６〜２．８０（ｔ，Ｊ＝１３．２Ｈｚ，２Ｈ）；２．３９〜２．３１（ｔｄ，Ｊ＝１２．８，４．８Ｈｚ，２Ｈ）；２．４８〜２．４４（ｍ，２Ｈ）；１．６４〜１．６２（ｄ，Ｊ＝１２．８Ｈｚ，２Ｈ）。
化合物４の調製
化合物４−１（１．５ｇ、４．１ｍｍｏｌ）及びＫ2ＣＯ3（１．１３ｇ、８．２ｍｍｏｌ）をアセトン（１５ｍＬ）に加え、この混合物に（ブロモメチル）シクロブタン（１．５ｇ、４．１ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を４時間還流撹拌した。冷却してから、混合物を濾過して濃縮し、ＥＡを用いてクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物をオフホワイト色固体として得た（１．０５ｇ、収率：６１％、ＬＣＭＳ及び1Ｈ ＮＭＲで確認、ＨＰＬＣ：９６．９％＠２５４ｎｍ、９８．４＠２１４ｎｍ）。
1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：７．９１〜７．９４（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ）；７．３４〜７．３２（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ）；３．９８〜３．９５（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ）；３．５４〜３．５１（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ）；２．９９〜２．９６（ｄｄ，Ｊ＝８．８，２．０Ｈｚ，２Ｈ）；２．５６〜２．４９（ｔｄ，Ｊ＝１２．８，４．４Ｈｚ，２Ｈ）；２．２６〜２．１７（ｍ，４Ｈ）；１．６０〜１．５７（ｄ，Ｊ＝１２．４Ｈｚ，２Ｈ）；０．８７〜０．８４（ｍ，１Ｈ）；０．５２〜０．４８（ｍ，２Ｈ）；０．１０〜０．０７（ｍ，２Ｈ）。ＭＳ（ＥＳＩ）のＣ18Ｈ23Ｆ3Ｎ2Ｏ4Ｓ（ｍ／ｚ）計算値：４２０．１３，実測値：４２１．１［Ｍ＋１］+。
系列Ｄの化合物Ａ、Ｂ、及びＣの調製
化合物Ａ
Figure 0006630374
化合物４
化合物１（１０ｇ、５７ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１００ｍＬ）溶液に、室温で、１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）（１１．１ｇ、６８．５ｍｍｏｌ）を加え、混合物を３０分間撹拌した。次いで、化合物２（７．３４ｇ、６８．５ｍｍｏｌ）を加え、一晩（約１８時間）撹拌した。溶媒をエバポレートし、残渣を酢酸エチル（ＥＡ；４００ｍＬ）に溶解させ、これに４ＭのＨＣｌ／ＭｅＯＨ（５０ｍＬ）を加え、得られる混合物を一晩（約１８時間）撹拌した。得られる白色固体を濾過し、ＥＡに懸濁させ、ＮａＨＣＯ3水溶液で洗い、濃縮して、生成物を白色固体として得た（３．２ｇ、収率３４％、ＮＭＲでの確認による）。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：３．４１（ｓ，３Ｈ）；４．４８（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ）；７．２６〜７．３６（ｍ，５Ｈ）；７．５７（ｂｒ，ｓ，１Ｈ）。
化合物Ａ−３
化合物Ａ−１（３．７５ｇ、２４ｍｍｏｌ）、Ａ−２（１．５ｇ、１１ｍｍｏｌ）、及びトリエチルアミン（ＴＥＡ）（４．５ｇ、４４．３８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（ＤＣＭ）（５０ｍＬ）に加え、この混合物を室温で一晩（約１８時間）撹拌した。反応混合物を水で洗い、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ、濃縮して、生成物を白色固体として得た（２．５５ｇ、収率９８％、ＮＭＲでの確認による）。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：２．５３（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，４Ｈ）；４．０１（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，４Ｈ）；７．１０〜７．３０（ｍ，５Ｈ）。
化合物Ａ
化合物Ａ−３（４００ｍｇ、１．７ｍｍｏｌ）及び化合物４（２８０ｍｇ、１．７ｍｍｏｌ）をメタノール（６０ｍＬ）に加え、この混合物を、アルゴン下、一晩（約１８時間）加熱還流した。混合物を濃縮し、分取ＴＬＣで精製して、生成物を淡白色固体として得た（８４ｍｇ、収率１３％、ＮＭＲ及びＭＳで確認、ＨＰＬＣにより９８％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：１．４２（ｄ，Ｊ＝１２．４Ｈｚ，２Ｈ）；１．９２（ｄｔ，Ｊ＝４．４，１３．２Ｈｚ，２Ｈ）；３．３２（ｄｔ，Ｊ＝２．０，１２．８Ｈｚ，２Ｈ）；３．５２（ｓ，２Ｈ）；４．４２（ｓ，２Ｈ）；４．４７（ｓ，２Ｈ）；７．０６（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ）；７．１４（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ）；７．２４〜７．３３（ｍ，９Ｈ）。ＭＳ（ＥＳＩ）のＣ21Ｈ24Ｎ4ＯＳ（ｍ／ｚ）計算値：３８０．１７，実測値：３８１．２［Ｍ＋１］+。
化合物Ｂ
Figure 0006630374
化合物Ｂ−４
ピリジン−４−アミン（４００ｍｇ、４．２５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（３５ｍＬ）溶液を、氷浴に入れ、そこに６０％ＮａＨ（３４０ｍｇ、８．５ｍｍｏｌ）を加え、混合物を１時間撹拌した。化合物Ｂ−２（０．９９ｇ、４．２５ｍｍｏｌ）を加え、混合物を徐々に昇温させて室温に戻し、３時間撹拌した。化合物Ａ−１（０．７８ｇ、５．１ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ；１ｍＬ）を加え、混合物を室温で一晩（約１８時間）撹拌した。水を加え、得られる組成物をＥＡで抽出し、ブラインで洗い、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ、濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して、油状物を得た（０．２３ｇ、収率２３％、ＮＭＲは純物質のものではなかったが、主成分は表題化合物であった）。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：２．６６（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，４Ｈ）；４．１２（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，４Ｈ）；７．１１〜７．１２（ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ）；８．５０〜８．５２（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ）。
化合物Ｂ
化合物Ｂ−４（２３０ｍｇ、１．７ｍｍｏｌ）及び化合物４（２２５ｍｇ、１．３７ｍｍｏｌ）をメタノール（２５ｍＬ）に溶解させ、この溶液を、アルゴン下、一晩（約１８時間）加熱還流した。混合物を濃縮し、分取ＴＬＣで精製して、生成物を黄色固体として得た（４５ｍｇ、収率１２％、ＮＭＲ及びＭＳで確認、ＨＰＬＣにより９６％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：１．４７（ｄ，Ｊ＝１３．２Ｈｚ，２Ｈ）；１．９２〜１．９８（ｍ，２Ｈ）；３．４１（ｔ，Ｊ＝１３．２Ｈｚ，２Ｈ）；３．５４（ｓ，２Ｈ）；４．４４（ｓ，４Ｈ）；６．９５（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，２Ｈ）；７．２６〜７．３１（ｍ，５Ｈ）；８．４５（ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，２Ｈ）。ＭＳ（ＥＳＩ）のＣ20Ｈ23Ｎ5ＯＳ（ｍ／ｚ）計算値：３８１．１６，実測値：３８２．４［Ｍ＋１］+。
化合物Ｃ
Figure 0006630374
化合物Ｃ−２
化合物Ｃ−１（１．０ｇ、８．３９ｍｍｏｌ）、化合物Ａ−１（２．８３ｇ、１８．４５ｍｍｏｌ）、及び炭酸カリウム（４．６４ｇ、３３．６ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（５０ｍＬ）に加え、この混合物を周辺温度で１８時間撹拌した。混合物を水、１ＮのＨＣｌ（水溶液）で洗い、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ、濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィーで精製し（ＰＥ／ＥＡ＝３：１）、生成物を白色個体として得た（１．０ｇ、収率５５％、ＮＭＲで表題化合物を確認した）。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：２．５６（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，４Ｈ）；３．８１（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，４Ｈ）；６．５０（ｂｒｓ，１Ｈ）；７．０７（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，４Ｈ）；７．２８〜７．３７（ｍ，４Ｈ）。
化合物Ｃ
化合物Ｃ−２（４００ｍｇ、１．８４ｍｍｏｌ）及び化合物４（４００ｍｇ、２．４４ｍｍｏｌ）をメタノール（４０ｍＬ）に加え、この混合物を、アルゴン下、一晩（約１８時間）加熱還流した。混合物を濃縮し、分取ＴＬＣで精製して、生成物を白色個体として得た（９６ｍｇ、収率１４％、ＮＭＲ及びＭＳで確認、ＨＰＬＣにより９８％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：１．４５（ｄ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ，２Ｈ）；１．８５（ｄｔ，Ｊ＝４．４，１３．２Ｈｚ，２Ｈ）；３．１９（ｄｔ，Ｊ＝２．０，１３．２Ｈｚ，２Ｈ）；３．５５（ｓ，２Ｈ）；３．９６（ｄｔ，Ｊ＝１３．６，２．０Ｈｚ，２Ｈ）；４．４４（ｓ，２Ｈ）；６．２９（ｓ，１Ｈ）；７．０２〜７．０６（ｍ，１Ｈ）；７．２２〜７．３３（ｍ，１０Ｈ）。ＭＳ（ＥＳＩ）のＣ21Ｈ24Ｎ4Ｏ2（ｍ／ｚ）計算値：３６４．１９，実測値：３６５．２［Ｍ＋１］+。
ＦＩＴＣ−ＮＬＸを利用したＦＬＮＡスクリーニングアッセイ
Ａ．ストレプトアビジンで被覆した９６ウェルプレート
ストレプトアビジンで被覆した９６ウェルプレート（高結合キャパシティのＲｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ（登録商標）ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（登録商標）９６ウェルプレート、Ｐｉｅｒｃｅ−ＥＮＤＯＧＥＮ）を、メーカーの使用説明書に従い、５０ｍＭのトリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．４）２００μｌで３回洗浄する。
Ｂ．Ｎ−ビオチン化ＶＡＫＧＬペンタペプチド（Ｂｎ−ＶＡＫＧＬ）（配列番号１）
Ｂｎ−ＶＡＫＧＬペプチド（０．５ｍｇ／プレート）を５０μｌのＤＭＳＯに溶解させ、次いで５０ｍＭのトリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．４、１００ｍＭのＮａＣｌ及びプロテアーゼ阻害剤を含む）（結合媒体）４４５０μｌに加え、ならびに５００μｌのｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（Ｐｉｅｒｃｅ−ＥＮＤＯＧＥＮ）含有ＰＢＳを加える［ＤＭＳＯの最終濃度：１％］。
Ｃ．Ｂｎ−ＶＡＫＧＬペプチドとストレプトアビジンで被覆したプレートの結合
洗浄したストレプトアビジンで被覆したプレートを、５μｇ／ウェルのＢｎ−ＶＡＫＧＬ（１００μｌ）と１時間接触させ（インキュベートし）、その間２５℃で常に震盪撹拌する［Ｂで調製したＢｎ−ＶＡＫＧＬペプチド溶液５０μｌ＋結合媒体５０μｌ、ＤＭＳＯの最終濃度：０．５％］。インキュベーションの最後に、プレートを、氷冷した５０ｍＭのトリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．４）２００μｌで３回洗浄する。
Ｄ．ＦＩＴＣ標識化ナロキソン［ＦＩＴＣ−ＮＬＸ］とＶＡＫＧＬの結合
Ｂｎ−ＶＡＫＧＬで被覆されたストレプトアビジンプレートを、１０ｎＭのフルオレセインイソチオシアネート標識化ナロキソン（ＦＩＴＣ−ＮＬＸ；Ｉｎ ｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに、結合媒体（５０ｍＭのトリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭのＮａＣｌ及びプロテアーゼ阻害剤を含有）中、３０℃で３０分間、一定の震盪撹拌を行いながらインキュベートする。最終アッセイ体積は１００μｌである。インキュベーションの最後に、氷冷した５０ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）１００μｌで２回洗浄する。結合したＦＩＴＣ−ＮＬＸのシグナルを、ＤＴＸ−８８０マルチモードプレートリーダー（Ｂｅｃｋｍａｎ）で検出する。
Ｅ．医薬化学物質類似体のスクリーニング
化合物は、最初に、それぞれ個別に２５％ＤＭＳＯを含有する５０ｍＭのトリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に溶解させて最終濃度１ｍＭとし（必要であれば超音波処理で溶解を促進する）、次いで、９６ウェル化合物プレートに配置する。医薬化学物質類似体（新規化合物）をスクリーニングするため、各化合物溶液（１μｌ）を、Ｂｎ−ＶＡＫＧＬで被覆したストレプトアビジンプレート（結合媒体を５０μｌ／ウェル含有）に添加し、続いてすぐに５０μｌのＦＩＴＣ−ＮＬＸを添加する（合計アッセイ体積／ウェルは、１００μｌ）。各新規化合物の最終スクリーニング濃度は、初期値１０μＭである。
各スクリーニングプレートには、ビヒクル対照（全結合）ならびに陽性対照としてナロキソン（ＮＬＸ）及び／又はナルトレキソン（ＮＴＸ）が含まれている。化合物は、３つ組又は４つ組で試験する。各化合物の、ＦＩＴＣ−ＮＬＸ結合阻害パーセントを計算する［（ビヒクル中で結合した全ＦＩＴＣ−ＮＬＸ−化合物存在下で結合したＦＩＴＣ−ＮＬＸ）／ビヒクル中で結合した全ＦＩＴＣ−ＮＬＸ］×１００％］。選択した化合物の有効性及び力価を査定するため、１０μＭで約６０〜７０％の阻害をもたらした化合物を、１μＭ及び０．１μＭの濃度で更にスクリーニングする。
このスクリーニングアッセイの結果を以下の表に示す。
ＦＬＮＡペプチド結合アッセイ
Ａ−系列の化合物
Figure 0006630374
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ7及びＲ8、Ａ、Ｂ、及びＸの各基は、本明細書中何処かで定義される。
Figure 0006630374
Figure 0006630374
Ｂ−系列の化合物
Figure 0006630374
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4、Ｗ、Ｘ-、及びＺの各基、点線、ｎ、及びｍは、本明細書中何処かで定義される。
Figure 0006630374
Figure 0006630374
Ｃ−系列−１の化合物
Figure 0006630374
上記式中の各記号は、本明細書中何処かで定義される。
Figure 0006630374
Figure 0006630374
*ＮＤ＝試験せず。
Ｃ−系列−２の化合物
Figure 0006630374
上記式中の各記号は、本明細書中何処かで定義される。
Figure 0006630374
Figure 0006630374
*ＮＤ＝試験せず。
化合物４、９、及び１０、ならびに、１０ｎＭのＦＩＴＣ−ＮＬＸの代わりに１００ｎＭの凍結保存したＦＩＴＣ−ＮＬＸを用いて、予備試験を、この真上のものと同様に行った。この試験を２回行った結果の平均を以下に示す。
Figure 0006630374
ＧＴＰγＳ結合アッセイを用いたＭＯＲアゴニスト活性測定
ＦＬＮＡスクリーニングの結果が陽性であった化合物のμオピエート受容体（ＭＯＲ）アゴニスト活性を査定するため、化合物を、線条体膜を用いた［35Ｓ］ＧＴＰγＳ結合アッセイで試験した。先の研究から、線条体膜では、ＭＯＲの活性化が、［35Ｓ］ＧＴＰγＳとＧαｏの結合の増加を導くことがわかっている（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００５ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １３５：２４７−２６１）。このアッセイは、最初の受容体仲介事象の１つにおいて、受容体の占有により生じる機能上の結果を測定する。このアッセイは、力価、有効性、及びアンタゴニスト親和性という従来の薬理パラメーターの測定が可能であり、合わせて利点として、分析するパラメーターが受容体の更に下流にある場合に起こり得るアゴニストの測定値の増幅又は他の修飾が、このアッセイでは起こらない。
すなわち、線条体組織を、氷冷した１０倍体積の２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に加えてホモジナイズした。この緩衝液には、１ｍＭのＥＧＴＡ、１００ｍＭのスクロース、５０μｇ／ｍｌのロイペプチン、０．０４ｍＭのＰＭＳＦ、２μｇ／ｍｌの大豆トリプシン阻害剤、及び０．２％の２−メルカプトエタノールが含まれていた。ホモジナイズしたものを、８００×ｇで５分間遠心し、上清を、４９，０００×ｇで２０分間遠心した。得られるペレットを、１０倍体積の反応用緩衝液に懸濁させた。反応用緩衝液には、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、５０μｇ／ｍｌのロイペプチン、２μｇ／ｍｌの大豆トリプシン阻害剤、０．０４ｍＭのＰＭＳＦ、及び０．０２％の２−メルカプトメタノールが含まれていた。
得られる線条体膜調製物（２００μｇ）を、反応用緩衝液に混合し、３０℃で５分間その状態に維持した（インキュベートした）。反応用緩衝液は上記のとおりのものに、２５０μｌの合計体積中、追加で１ｍＭのＭｇＣｌ2及び０．５ｎＭの［35Ｓ］ＧＴＰγＳ（０．１μＣｉ／アッセイ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ ａｎｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）が含まれていた。注目しているアッセイ化合物を０．１〜１０μＭで添加して、又は添加せずに、混合物を更に５分間、維持した。氷冷した反応用緩衝液（２０ｍＭのＭｇＣｌ2及び１ｍＭのＥＧＴＡを含む）７５０μｌで希釈し、直ちに１６，０００×ｇで５分間遠心することで、反応を終了させた。
得られるペレットを、免疫沈降用緩衝液（０．５％ジギトニン、０．２％コール酸ナトリウム、及び０．５％ＮＰ−４０を含有）０．５ｍｌに入れて１０秒間超音波処理することで溶解させた。正常ウサギ血清（１μｌ）を溶解液１ｍｌに添加し、２５℃で３０分間インキュベートした。２５℃で３０分間、タンパク質Ａ／Ｇ結合アガロースビーズ２５μｌとともにインキュベートし、続いて４℃で５分間、５，０００×ｇで遠心分離することで、非特異的免疫複合体を除去した。上清を分割して、別々に、２５℃で３０分間、Ｇαｏタンパク質に対して産生された抗体とともにインキュベートした（１：１，０００の希釈）。
２５℃で３０分間、アガロース結合タンパク質Ａ／Ｇビーズ４０μｌとともにインキュベートし、４℃で５分間、５，０００×ｇで遠心分離することで、そのようにして形成された免疫複合体を収集した。ペレットを洗浄し、緩衝液（５０ｍＭのトリス・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）及び１％ＮＰ−４０を含有）に懸濁させた。液体シンチレーション分光測定により、懸濁液の放射能を測定した。選択化合物により誘導された、［35Ｓ］ＧＴＰγＳとＧαｏの結合によるＭＯＲ活性化の特異性は、１μＭのβ−フナルトレキサミン（β−ＦＮＡ；ナルトレキソンのアルキル化誘導体であり、選択的ＭＯＲアンタゴニストである）の包含により確定させた。陽性対照として、ＤＡＭＧＯ（１μＭ又は１０μＭ）を用いた。
この試験の結果を以下の表に示す。
Figure 0006630374
Figure 0006630374
Figure 0006630374
Figure 0006630374
Figure 0006630374
Figure 0006630374
*ＮＤ＝試験せず。
Figure 0006630374
Figure 0006630374
＊ＮＤ＝試験せず。
化合物４、９、及び１０、ならびに合成し直した化合物Ｃ０１３４Ｍ及びＤＡＭＧＯを用いて、予備試験を、この真上のものと同様に行った。この試験を２回行った結果の平均を以下に示す。
Figure 0006630374
上記の結果は、化合物９及び１０が、ＦＬＮＡによく結合するだけでなく、ＭＯＲアゴニストでもあるのに対して、化合物４は、ＦＬＮＡにはよく結合するものの、他の２種の化合物ほど強力なＭＯＲアゴニストではなかったことを示す。新たに合成した化合物Ｃ０１３４Ｍは、先に示されていたのと同様なＭＯＲアゴニスト活性を示した。
材料及び方法
ＣＵＮＹ医学専門学校（１３８ｔｈ Ｓｔｒｅｅｔ ａｎｄ Ｃｏｎｖｅｎｔ Ａｖｅｎｕｅ、ＮｅｗＹｏｒｋ、ＮＹ１００３１）の生理薬理神経科学科の博士であるＨｏａｕ−Ｙａｎ Ｗａｎｇの指揮の元、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験を行って、フィラミンＡ（ＦＬＮＡ）結合化合物のトップ２であるＣ０１０５及びＣ０１１４を、アミロイドβ42（Ａβ42）が誘導するＦＬＮＡ−α７ニコチン性アセチルコリン受容体（α７ｎＡＣｈＲ）会合及びτリン酸化を遮断する能力について査定した。その結果、アルツハイマー病を治療する可能性が示された。
動物
器官型前頭皮質切片培養物用に、成熟Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（２ヶ月齢）を用いた。ラットは、１２時間の明暗サイクルで食物及び水がある状態に維持した。動物を扱う手順は全て、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関する指針（Guide for Care Use of Laboratory Animals）に従うものであり、ニューヨーク市立大学シティカレッジ動物管理使用委員会により承認された。
器官型前頭皮質切片培養物
ラット脳切片の器官型培養法は、先に公表された方法を修飾して用いた。［Ａｄａｍｃｈｉｋ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｐｒｏｔｏｃ ５：１５３−１５８ （２０００）。］ＦＣＸ切片（２００μＭ厚さ）を、滅菌多孔質Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ−ＣＭインサート（０．４μｍ）に移した。各培養インサート単位に２枚ずつ脳切片を入れ、各培養インサート単位を１２ウェル培養トレイの個別ウェルに入れた。各ウェルには、２ｍｌの培地（アール（Earl's）塩類を含む５０％ＭＥＭ、２ｍＭのＬ−グルタミン、２５％アール（Earl's）均衡塩類溶液、６．５ｇ／ｌのＤ−グルコース、２０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、５％ウマ血清、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）、及び５０ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン及び５０ｍｇ／ｍｌのペニシリン）が入っていた。培養物をインキュベーターに入れて、２日間、３６℃、５％ＣＯ2中に維持し、切片調製による損傷の影響を最小限にした。
実験当日、培地を除去し、脳切片をすすいで、０．１％ＦＢＳ含有培地に入れ、４時間、３６℃、５％ＣＯ2中でインキュベートした。次いで、脳切片を、１００ｎＭのＡβ42及び／又は０．１ｎＭ、１ｎＭの化合物Ｃ０１０５又は化合物Ｃ０１１４とともに、新鮮な０．１％ＦＢＳ含有培地に入れて１６時間培養した。脳切片（各実験で６枚ずつの切片）を、氷冷したクレブス・リンゲル液で洗浄し、これらを用いてα７ｎＡＣｈＲ−ＦＬＮＡ複合体レベル及びリン酸化τ（ｐＳ202−、ｐＴ231−、及びｐＴ181−τ）を査定した。脳切片は、α７ｎＡＣｈＲ及びＮＭＤＡＲ２つのチャンネルそれぞれを通じたカルシウム流入レベルによるα７ｎＡＣｈＲ及びＮＭＤＡＲ活性の測定、及び電位開口型カルシウムチャンネルを介したカルシウム流入を用いた細胞死レベルの測定にも用いた。
免疫組織化学反応用に、追加の切片を取り出して、４℃で４％パラホルムアルデヒド含有ＰＢＳに入れ固定した。神経細胞内Ａβ42蓄積に対するＣ０１０５及びＣ０１１４の効果を、Ａβ42免疫染色レベルにより測定した。
脳シナプトソーム調製物
ＦＣＸ切片培養物から、脳シナプトソーム（Ｐ２画分）を調製した。既に記載されている方法［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８：３１５４７−３１５５３ （２００３）］に従って、ＦＣＸを培養物から取り出して直ちに溶解させ、シナプトソームとした。シナプトソームを２回洗浄して、氷冷したクレブス（Kreb's）・リンゲル（Ｋ−Ｒ）液（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４；１１８ｍＭのＮａＣｌ、４．８ｍＭのＫＣｌ、２５ｍＭのＮａＨＣＯ3、１．３ｍＭのＣａＣｌ2、１．２ｍＭのＭｇＳＯ4、１．２ｍＭのＫＨ2ＰＯ4、１０ｍＭのグルコース、１００μＭのアスコルビン酸、プロテアーゼ及びタンパク質ホスファターゼ阻害剤の混合物（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ））２ｍｌに懸濁させた。クレブス（Kreb's）・リンゲル（Ｋ−Ｒ）液は、先に９５％Ｏ2／５％ＣＯ2で１０分間曝気しておいた。Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて、タンパク質濃度を測定した。
器官型ＦＣＸ組織を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ試験
Ａβ42が誘導するα７ｎＡＣｈＲ−ＦＬＮＡ相互作用及びτリン酸化（ｐＳ202−、ｐＴ231−、及びｐＴ181−τ）レベルに対する化合物Ｃ０１０５及び化合物Ｃ０１１４の効果を査定するため、ラット前頭皮質の切片培養物系を用いた。Ｍｃｌｌｗａｉｎチョッパー（Ｂｒｉｎｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、ラット脳ＦＣＸを冠状に切断して２００μｍの切片にし、氷冷した酸素添加Ｋ−Ｒ液１０ｍｌに懸濁させた。
ラット脳切片の器官型培養は、既に記載されているとおりに行った。［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ６７， ５２２−５３０ （２０１０）。］ラットＦＣＸ切片を、０．４μｍの、滅菌多孔質Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ−ＣＭインサートに移した。移す際は、１つのインサートにつき切片を２枚入れ、インサートを１ウェルにつき１つ入れた。各ウェルには、２ｍｌの培地（アール（Earl's）塩類を含む５０％ＭＥＭ、２ｍＭのＬ−グルタミン、２５％アール（Earl's）均衡塩類溶液、６．５ｇ／ｌのＤ−グルコース、２０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、５％ウマ血清、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）、及び５０ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン及び５０ｍｇ／ｍｌのペニシリン）が入っていた。培養物をインキュベーターに入れて、２日間、３６℃、５％ＣＯ2中に維持した。
試験当日、培地を除去し、脳切片をすすいで、０．１％ＦＢＳ含有培地に入れ、４時間、３６℃、５％ＣＯ2中でインキュベートした。次いで、脳切片を、０．１μＭのＡβ42とともに、及びこれと一緒に０．１ｎＭ、１ｎＭ、又は１０ｎＭの化合物Ｃ０１０５あるいは１ｎＭ又は１０ｎＭのＣ０１１４を用いて、新鮮な０．１％ＦＢＳ含有培地に入れて１６時間培養した。次いで、脳切片を取り出し、氷冷したＰＢＳで３回洗浄し、以下に記載の機能アッセイ用に処理するか、免疫組織化学法による神経細胞内Ａβ42凝集物及びＮＦＴレベルの測定用に４℃で氷冷した４％パラホルムアルデヒドに入れ固定するかのいずれかを行った。
１）ＦＬＮＡとα７ｎＡＣｈＲ及び他の受容体との会合
既に記載されているとおりの免疫共沈／ウエスタンブロット法［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ６７：５２２−５３０ （２０１０）； Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ３：ｅ１５５４ （２００８）； Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ３５：１０９６１−１０９７３ （２００９）］を用いて、ＦＬＮＡと会合したα７ｎＡＣｈＲのレベルを測定した。簡単に述べると、脳切片抽出物（２００μｇ）を、１μｇのタンパク質Ａアガロースビーズに固定された抗ＦＬＮＡとともに、４℃で一晩（約１８時間）、常に上下左右を完全に回転させながら、インキュベートした。遠心し、次いで洗浄し、抗原溶出用緩衝液を用いて分離することにより、抗ＦＬＮＡ免疫複合体を得た。１．５ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．８）で中和してから、得られるＦＬＮＡ会合型タンパク質複合体を、ＳＤＳ含有標本調製用緩衝液に入れて５分間煮沸することにより、溶解させた。α７ｎＡＣｈＲ、ＴＬＲ４、ＩＲ、及びＭＯＲそれぞれのタンパク質に対して特異的な抗体を用いるウエスタンブロット法により、ＦＬＮＡと会合したα７ｎＡＣｈＲ、ＴＬＲ４、ＩＲ、及びＭＯＲのレベルを査定し、ブロットを剥離させて、免疫沈降物／添加対照に関してＦＬＮＡを再探索した。
２）τリン酸化
確立された方法［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８：３１５４７−３１５５３ （２００３）； Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ６７：５２２−５３０ （２０１０）］を用いて、τタンパク質を、固定化抗τ（ＳＣ−６５８６５）で免疫沈降させた。この抗τは、リン酸化状態の違いを区別しない。リン酸化τ（ｐＳｅｒ２０２τ、ｐＴｈｒ２３１τ、及びｐＴｈｒ１８１τ）のレベルならびに沈殿した全τ（添加対照）を、各ホスホエピトープ及び抗τのそれぞれに対して特異的な抗体を用いるウエスタンブロット法により査定する。
３）α７ｎＡＣｈＲ及びＮＭＤＡＲの機能査定
α７ｎＡＣｈＲ及びＮＭＤＡＲ機能に対する化合物Ｃ０１０５及び化合物Ｃ０１１４の効果を、ビヒクル、０．１μＭのＡβ42、又は０．１μＭのＡβ42＋０．１〜１０ｎＭのＣ０１０５又は１〜１０ｎＭのＣ０１１４で処理した器官型ＦＣＸ切片培養物で、査定した。ラットＦＣＸ切片（６枚の切片／アッセイ）から調製したシナプトソームを、氷冷したＫ−Ｒ液で２回洗浄し、遠心し、０．５ｍｌのＫ−Ｒ液に再懸濁させた。
ＮＭＤＡＲ及びα７ｎＡＣｈＲが介在する45Ｃａ2+流入を、既に記載されたとおりに測定した。［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ６７：５２２−５３０ （２０１０）。］シナプトソーム（５０μｇ）を、酸素添加した０．３ｍＭのＭｇ2+含有Ｋ−Ｒ液（５μＭの45Ｃａ2+（１０Ｃｉ／ｍｍｏｌ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を含有）に入れて、３７Ｃで５分間インキュベートし、続いてビヒクル、０．１〜１０μＭのＮＭＤＡ／１μＭのグリシン、又は０．１〜１０μＭのＰＮＵ２８２９８７（神経ニコチン性アセチルコリン受容体のα７サブタイプに対する強力な選択的アゴニスト）とともに５分間インキュベートした。氷冷した、０．５ｍＭのＥＧＴＡを含有しＣａ2+を含有しないＫ−Ｒ液１ｍｌに入れて遠心することにより、反応を停止させた。２回洗浄後、シンチレーション分光測定により、シナプトソームの45Ｃａ2+含有量を査定した。
バックグラウンド45Ｃａ2+は、低浸透圧で溶解させたシナプトソームを用いて見積もった。Ｃａ2+流入絶対量は、バックグラウンド45Ｃａ2+数値を差し引くことで計算した。Ｃａ2+流入の増加パーセントを、％［（薬物処理したもの−ビヒクル）／ビヒクル］で計算した。
４）Ｋ+誘発性Ｃａ+2流入により測定した細胞死
電位開口型Ｃａ2+チャンネルの活動レベルは、細胞の完全性の指標であるため、Ｋ+脱分極媒介型Ｃａ2+流入を用いて、Ａβ42が誘導する細胞死に対する化合物Ｃ０１０５及び化合物Ｃ０１１４の効果を、ビヒクル、０．１μＭのＡβ42、あるいは０．１μＭのＡβ42＋０．１〜１０ｎＭの化合物Ｃ０１０５又は１〜１０ｎＭの化合物Ｃ０１１４で処理した器官型ＦＳＸ切片培養物で査定した。ラットＦＣＸ切片（６枚の切片／アッセイ）から調製したシナプトソームを、氷冷したＫ−Ｒ液で２回洗浄し、遠心し、０．５ｍｌのＫ−Ｒ液に再懸濁させた。電位開口型Ｃａ2+チャンネルが媒介する45Ｃａ2+流入のレベルを、既に記載されたとおりに測定した。［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ６７：５２２−５３０ （２０１０）。］
シナプトソーム（５０μｇ）を、酸素添加した０．３ｍＭのＭｇ2+含有Ｋ−Ｒ液（５μＭの45Ｃａ2+（１０Ｃｉ／ｍｍｏｌ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を含有）に入れて、３７Ｃで５分間インキュベートし、続いてビヒクル又は６５ｍＭのＫ+（Ｎａ+の等モル置換で作成）とともに１分間インキュベートした。氷冷した、０．５ｍＭのＥＧＴＡを含有しＣａ2+を含有しないＫ−Ｒ液１ｍｌに入れて遠心することにより、反応を停止させた。２回洗浄後、シンチレーション分光測定により、シナプトソームの45Ｃａ2+含有量を査定した。バックグラウンド45Ｃａ2+は、低浸透圧で溶解させたシナプトソームを用いて見積もった。Ｃａ2+流入絶対量は、バックグラウンド45Ｃａ2+数値を差し引くことで計算した。Ｃａ2+流入の増加パーセントを、％［（薬物処理したもの−ビヒクル）／ビヒクル］で計算した。
５）受容体刺激後の、ＮＭＤＡＲ又はＩＲと会合したシグナル伝達分子のレベル測定
ＮＭＤＡＲシグナル伝達及びそれらのシナプスアンカー型タンパク質、ＰＳＤ−９５との相互作用を、ビヒクル、０．１μＭのＡβ42、及び０．１μＭのＡβ42＋０．１〜１０ｎＭの化合物Ｃ０１０５又は１ｎＭ及び１０ｎＭの化合物Ｃ０１１４で１６時間処理した器官型ＦＳＸ培養物由来の脳切片で比較した。６枚の切片を、０．３ｍＭのＭｇ2+含有ＫＲ（ＬＭＫＲ；基礎）又は１０μＭのＮＭＤＡ及び１μＭのグリシンを含有するＬＭＫＲいずれかとともに、３７℃で３０分間インキュベートすることで、ＮＭＤＡＲ活性化及びシグナル伝達を開始させた。
インキュベーション混合物は、刺激中、１０分ごとに１分間、９５％Ｏ2／５％ＣＯ2で曝気した。氷冷したＣａ2+を含まないＫ−Ｒ液（タンパク質ホスファターゼ阻害剤混合物、０．５ｍＭのＥＧＴＡ及び０．１ｍＭのＥＤＴＡを含有）１ｍｌを添加して、リガンド刺激を停止させた。手短かに遠心して脳切片を回収し、氷冷した免疫沈降用緩衝液０．２５ｍｌに入れてホモジナイズした。ホモジナイズしたものを、１０００×ｇで５分間（４℃）遠心し、上清（ミトコンドリアを除いた画分）を氷上で１０秒間超音波処理した。
タンパク質を、０．５％ジギトニン、０．２％コール酸ナトリウム及び０．５％ＮＰ−４０に入れて、６０分間４℃で上下左右を完全に回転させて、溶解させた。得られる溶解液を、５０，０００×ｇで５分間遠心することにより清澄させ、免疫沈降用緩衝液０．７５ｍｌで希釈した。タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で測定した。
ＮＭＤＡＲとＰＳＤ−９５の会合、ならびにＮＭＤＡＲシグナル伝達を測定するため、抗ＮＲ１免疫沈降物中のＮＭＤＡＲサブユニット、ＰＳＤ−９５、及びＮＭＤＡＲが会合したシグナル伝達分子のレベルを測定した。これらの試験では、脳切片溶解液（１００μｇ）を、タンパク質Ａ−アガロースビーズに共役結合で固定された抗ＮＲ１（Ｐｉｅｒｃｅ−ＥＮＤＯＧＥＮ）２μｇを用いて、４℃で一晩、免疫沈降させた。抗ＮＲ１免疫沈降物を、抗原溶出用緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ−ＥＮＤＯＧＥＮ）７５μｌ及び２％ＳＤＳとともに、氷上で２分間インキュベートし、遠心して抗体−タンパク質Ａ−アガロース複合体を除去し、直ちに１．５Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ８．８）１０μｌで中和してから、２×ＰＡＧＥ標本用緩衝液６５μｌを添加して、５分間煮沸した。
得られる溶出液のうち７５μｌ（５０％）を、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで、サイズ分画した。タンパク質をニトロセルロース膜に移し、各種ＮＭＤＡ受容体サブユニット、ＰＳＤ−９５、情報伝達タンパク質のレベルを、ＰＳＤ−９５、ｎＮＯＳ、ホスホリパーゼＣ−γ１、γＰＫＣ、ｐＹ402ＰｙＫ２、ｐＹ416Ｓｒｃ、又はホスホチロシンに対する抗体を用いてウエスタンブロット法により測定した。ブロットを剥離させ、抗ＮＲ１抗体を用いて再探索して免疫沈降効率及び添加を査定した。
更に水平に切断して１００μｍ（１００μｍ×２００μｍ×３ｍｍ）にした６枚の切片を、ＫＲ（基礎）又は１ｎＭのインシュリンを含有するＫＲいずれかとともに、３７℃で３０分間インキュベートすることで、ＩＲ活性化及びシグナル伝達を開始させた。インキュベーション混合物は、刺激中、１０分ごとに１分間、９５％Ｏ2／５％ＣＯ2で曝気した。氷冷したＣａ2+を含まないＫ−Ｒ液（タンパク質ホスファターゼ阻害剤混合物、０．５ｍＭのＥＧＴＡ及び０．１ｍＭのＥＤＴＡを含有）１ｍｌを添加して、リガンド刺激を停止させた。手短かに遠心して脳切片を回収し、氷冷した免疫沈降用緩衝液０．２５ｍｌに入れてホモジナイズした。ホモジナイズしたものを、１０００×ｇで５分間（４℃）遠心し、上清（ミトコンドリアを除いた画分）を氷上で１０秒間超音波処理した。タンパク質を、０．５％ジギトニン、０．２％コール酸ナトリウム及び０．５％ＮＰ−４０に入れて、６０分間４℃で上下左右を完全に回転させて、溶解させた。次いで、得られる溶解液を、５０，０００×ｇで５分間遠心することにより清澄させ、免疫沈降用緩衝液０．７５ｍｌで希釈した。タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で測定した。
ＩＲ活性化及びシグナル伝達を測定するため、抗ＩＲβ免疫沈降物中のｐＹ1150/1151ＩＲβのレベル及びＩＲシグナル伝達因子ＩＲＳ−１のレベルを測定した。これらの実験では、脳切片溶解液（１００μｇ）を、タンパク質Ａ−アガロースビーズに共役結合で固定さた抗ＮＲ１（Ｐｉｅｒｃｅ−ＥＮＤＯＧＥＮ）２μｇを用いて、４℃で一晩（約１８時間）、免疫沈降させた。
抗ＩＲβ免疫沈降物を、抗原溶出用緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ−ＥＮＤＯＧＥＮ）７５μｌ及び２％ＳＤＳとともに、氷上で２分間インキュベートし、遠心して抗体−タンパク質Ａ−アガロース複合体を除去し、直ちに１．５Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ８．８）１０μｌで中和してから、２×ＰＡＧＥ標本用緩衝液６５μｌを添加して、５分間煮沸した。得られる溶出液のうち７５μｌ（５０％）を、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで、サイズ分画した。タンパク質をニトロセルロース膜に移し、ｐＹ1150/1151ＩＲβ及びＩＲＳ−１タンパク質のレベルを、ｐＹ1150/1151ＩＲβ及びＩＲＳ−１に対する抗体を用いてウエスタンブロット法により測定した。ブロットを剥離させ、抗ＩＲβ抗体を用いて再探索して免疫沈降効率及び添加を査定した。
６）免疫組織化学試験
ＰＦＣＸ及び嗅内皮質／ＨＰを含有する連続した５μｍ切片で、定量的免疫組織化学反応を用いて、Ａβ42凝集物／プラーク及び神経原線維病理（ＮＦＴ及び対になったらせん状繊維［ＰＨＦ］の免疫反応性）のレベルを測定した。用いたのは、既に記載されたとおりの単一標識免疫組織化学反応である。［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ６７：５２２−５３０ （２０１０）； Ｄ'Ａｎｄｒｅａ ｅｔ ａｌ．， Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ３８：１２０−１３４ （２００１）； Ｎａｇｅｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １１０：１９９−２１１ （２００２）。］１枚の切片を、抗ＮＦＴ又は抗ＰＨＦで免疫染色した。その次の（連続した）切片（同一神経細胞を含有していることが多い）を、抗Ａβ42抗体で免疫染色して、神経細胞に蓄積したＡβ42ペプチドの相対レベルを測定した。相対Ａβ42蓄積率／度合いを、培養ＦＣＸ切片由来の切片及びＡβ42をＩＣＶ輸液したマウス脳由来の切片中にある異なる細胞型間で、既に記載されたとおりのコンピューターを利用した画像分析法を用いて比較した［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７５：５６２６−５６３２ （２０００）］。
既に記載されたとおりに、脳切片を、４℃で２週間、０．１５Ｍリン酸緩衝化１０％ホルマリン（ｐＨ７．４）に入れて固定し、パラフィン封入し、５μｍで順次切断し、明視野免疫組織化学反応用に処理した［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７５：５６２６−５６３２ （２０００）］。抗Ａβ42をＡβ42で予め吸収した場合は、Ａβ42免疫反応性は存在しなかったが、Ａβ42-1ではそうはならなかった。標本は、Ｎｉｋｏｎ ＦＸＡ顕微鏡にＰｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＣＣＤカメラを取り付けて検査し、デジタル記録した。
既に記載されたとおりに、ＮＦＴ／ＰＨＦ及びＡβ42免疫反応性の相対強度を測定し、Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ ａｎｄ Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェアを用いて同種細胞間及び異種細胞間で比較した［Ｄ’Ａｎｄｒｅａ ｅｔ ａｌ．， Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ３８：１２０−１３４ （２００１）］。ＮＦＴ／ＰＨＦ免疫反応性の大きさと成熟神経細胞内に蓄積されたＡβ42陽性物質との間の関係性も明らかにした。
Ｉｎ ｖｉｖｏ試験
ＣＵＮＹ医学専門学校（１３８ｔｈ Ｓｔｒｅｅｔ ａｎｄ Ｃｏｎｖｅｎｔ Ａｖｅｎｕｅ、ＮｅｗＹｏｒｋ、ＮＹ１００３１）の生理薬理神経科学科の博士であるＨｏａｕ−Ｙａｎ Ｗａｎｇの指揮の元、アミロイドβ42（Ａβ42）輸液によるアルツハイマー病モデルで、１）Ａβ42が誘導するＦＬＮＡとα７ニコチン性アセチルコリン受容体（α７ｎＡＣｈＲ）及びトール様受容体４（ＴＬＲ４）との会合を遮断すること、２）τリン酸化、及び３）Ａβ42−α７ｎＡＣｈＲ会合の能力について、ｉｎ ｖｉｖｏ試験を行った。その結果、アルツハイマー病を治療する可能性が示された。
Ａβ42のＩＣＶ輸液マウスモデル
マウス
Ｔａｃｏｎｉｃ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）から入手した繁殖対の子孫であるオス及びメスの８週齢Ｅ１２９マウス（３０〜３５ｇ）を、脳室内（ＩＣＶ）Ａβ42試験に用いた。マウスは、１２時間の明暗サイクルで食物及び水がある状態に維持した。動物を扱う手順は全て、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関する指針（Guide for Care Use of Laboratory Animals）に従うものであり、ニューヨーク市立大学シティカレッジ動物管理使用委員会により承認された。
脳室内Ａβ42投与及び化合物処置
Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ６７：５２２−５３０ （２０１０）に記載のとおり、３０ｍｇ／ｋｇのペントバルビタールナトリウムを腹腔内投与して麻酔したマウスを、マウス定位脳手術装置に設置した。マウスには、マウス用ミニポンプ（Ａｌｚｅｔ）を埋め込んで、７日間続けてＡβ42のＩＣＶ輸液を行った。このミニポンプは、以下の配置で左心室に手術のりで固定されたカニューレを通じて、０．１μｌ／時間で輸液を送達する：［十時縫合から前後３．０ｍｍ；左右方向、１．０ｍｍ；水平方向、３．０ｍｍ］。凝集を防ぐため、Ａβ42（０．２ｎｍｏｌ／μｌ）を、５０ｍＭのトリス（ｐＨ９．０）を含有する１０％ＤＭＳＯに溶解させた。各マウスに、７日間毎日Ａβ42を４．８ｎｍｏｌ与えた。対照マウスには、ビヒクルのＩＣＶ輸液を７日間行った。
Ａβ42に誘起される効果に対する化合物Ｃ０１０５のｉｎ ｖｉｖｏでの効果を査定するため、マウスに、手術の日から開始して２週間毎日１０ｍｇ／ｋｇのＣ０１０５を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射して与えた（１日目：手術から回復して２時間後、２〜１４日目は１日２回：１０〜１１ａ．ｍ．の間及び３〜４ｐ．ｍ．の間）。最後の注射から２４時間後、脳の半分から採取したＦＣＸ及び海馬を、発表済みの方法［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ６７：５２２−５３０ （２０１０）］を用いて、α７ｎＡＣｈＲ−ＦＬＮＡ複合体レベル及びリン酸化τ（ｐＳ202−、ｐＴ231−、及びｐＴ181−τ）を査定するために、溶解させた。
Ａβ42とα７ｎＡＣｈＲを解離させることは、ＡＤ病理を減少させるのに有益であることから、Ａβ42−α７ｎＡＣｈＲ結合レベルに対して化合物が効果を有するかどうかを査定した。［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ６７：５２２−５３０ （２０１０）； Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ３５：１０９６１−１０９７３ （２００９）。］また、前頭前皮質（ＰＦＣＸ）を用いて、α７ｎＡＣｈＲ及びＮＭＤＡＲ活性をガイドとして用いて、シナプス活動レベルを測定する。脳の残り半分は、冷０．１５Ｍリン酸緩衝化１０％ホルマリン（ｐＨ７．４）に浸漬して固定し、神経細胞内Ａβ42凝集物／プラーク及びＮＦＴならびに形態学的統合性の免疫組織化学測定用に処理した。
脳シナプトソーム調製物
処置したマウスを一気に断頭することでと殺し、そのマウスの前頭前皮質及び海馬から、脳シナプトソーム（Ｐ２画分）を調製した。既に記載されている方法（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８：３１５４７−３１５５３ （２００３））に従って、組織は、採取後直ちに溶解させて、シナプトソームを得た。シナプトソームを、２回洗浄して、氷冷したクレブス（Kreb's）・リンゲル（Ｋ−Ｒ）液（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４；１１８ｍＭのＮａＣｌ、４．８ｍＭのＫＣｌ、２５ｍＭのＮａＨＣＯ3、１．３ｍＭのＣａＣｌ2、１．２ｍＭのＭｇＳＯ4、１．２ｍＭのＫＨ2ＰＯ4、１０ｍＭのグルコース、１００μＭのアスコルビン酸、プロテアーゼ及びタンパク質ホスファターゼ阻害剤の混合物（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ））２ｍｌに懸濁させた。クレブス（Kreb's）・リンゲル（Ｋ−Ｒ）液は、先に９５％Ｏ2／５％ＣＯ2で１０分間曝気しておいた。Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて、タンパク質濃度を測定した。
処置したマウス由来の組織のｅｘ ｖｉｖｏ査定
これらの試験では、ビヒクル又はＡβ42の継続的ＩＣＶ輸液、及び化合物Ｃ０１０５又はビヒクルの１日２回のｉ．ｐ．注射を受けたマウスの前頭前皮質又は海馬から調製したシナプトソームを用いて、Ａβ42が誘導するα７ｎＡＣｈＲ−ＦＬＮＡ相互作用、τリン酸化（ｐＳ202−τ、ｐＴ231−τ、及びｐＴ181−τ）レベル、Ａβ42−α７ｎＡＣｈＲ相互作用、及びシグナル伝達障害に対する化合物Ｃ０１０５の効果を査定した。
１）α７ｎＡＣｈＲ−ＦＬＮＡ／ＴＬＲ４相互作用
既に記載されているとおりに、免疫共沈／ウエスタンブロット法［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ６７：５２２−５３０ （２０１０）； Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ３５：１０９６１−１０９７３ （２００９）；及びＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ３：ｅ１５５４ （２００８）］を用いて、ＦＬＮＡと会合したα７ｎＡＣｈＲ及びＴＬＲ４のレベルを測定した。簡単に述べると、処置したマウスの前頭前皮質又は海馬から調製したシナプトソーム抽出物（２００μｇ）を、１μｇタンパク質Ａアガロースビーズに固定された抗ＦＬＮＡとともに、４℃で一晩（約１８時間）、常に上下左右を完全に回転させながら、インキュベートした。遠心し、洗浄し、抗原溶出用緩衝液を用いて分離することにより、抗ＦＬＮＡ免疫複合体を得た。１．５Ｍのトリス（ｐＨ８．８）で中和してから、得られるＦＬＮＡ会合型タンパク質複合体を、ＳＤＳ含有標本調製用緩衝液に入れて５分間煮沸することにより、溶解させた。ＦＬＮＡと会合したα７ｎＡＣｈＲ及びＴＬＲ４のレベルを、ウエスタンブロット法により査定し、ブロットを剥離させて、免疫沈降物／添加対照に関してＦＬＮＡを再探索した。
ＦＬＮＡ及びα７ｎＡＣｈＲ発現に対するＡβ42上昇及び化合物Ｃ０１０５処置の効果を査定するため、組織抽出物中のＦＬＮＡレベル及びα７ｎＡＣｈＲレベルを、β−アクチンを添加対照として用いて、ウエスタンブロット法により測定した。
２）τリン酸化
確立された方法［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ６７：５２２−５３０ （２０１０）；及びＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８：３１５４７−３１５５３ （２００３）］を用いて、τタンパク質を、固定化抗τ（ＳＣ−６５８６５）で免疫沈降させた。この抗τは、リン酸化状態の違いを区別しない。リン酸化τのレベル（ｐＳｅｒ２０２τ、ｐＴｈｒ２３１τ、及びｐＴｈｒ１８１τ）ならびに沈殿した全τ（添加対照）を、各ホスホエピトープ及び抗τのそれぞれに対して特異的な抗体を用いるウエスタンブロット法により査定した。
３）Ａβ42−α７ｎＡＣｈＲ相互作用
確立された方法［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ６７：５２２−５３０ （２０１０）；及びＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８：３１５４７−３１５５３ （２００３）］を用いて、処置したマウスの前頭前皮質又は海馬から調製したシナプトソーム中の、Ａβ42−α７ｎＡＣｈＲ複合体レベルを測定した。簡単に述べると、Ａβ42−α７ｎＡＣｈＲ複合体を、固定化抗Ａβ42で免疫沈降させ、α７ｎＡＣｈＲ含有量を、ウエスタンブロット法により測定した。免疫沈降を行う際に抗アクチンを添加し、免疫沈降物中のβ−アクチンレベルを、免疫沈降／添加対照として用いた。
４）α７ｎＡＣｈＲ及びＮＭＤＡＲの機能査定
α７ｎＡＣｈＲ及びＮＭＤＡＲ機能に対する化合物Ｃ０１０５の効果を、Ａβ42又はビヒクル輸液を受けたマウスで査定した。前頭前皮質又は海馬から調製したシナプトソームを、氷冷したＫ−Ｒ液で２回洗浄し、遠心し、０．５ｍｌのＫ−Ｒ液に再懸濁させた。
ＮＭＤＡＲ及びα７ｎＡＣｈＲが介在する45Ｃａ2+流入を、既に記載されたとおりに測定した［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ６７：５２２−５３０ （２０１０）］。シナプトソーム（５０μｇ）を、酸素添加した０．３ｍＭのＭｇ2+含有Ｋ−Ｒ液（５μＭの45Ｃａ2+（１０Ｃｉ／ｍｍｏｌ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を含有）に入れて、３７Ｃで５分間インキュベートし、続いてビヒクル、０．１〜１０μＭのＮＭＤＡ／１μＭのグリシン、又は０．１〜１０μＭのＰＮＵ２８２９８７とともに５分間インキュベートした。氷冷した、０．５ｍＭのＥＧＴＡを含有しＣａ2+を含有しないＫ−Ｒ液１ｍｌに入れて遠心することにより、反応を停止させた。
２回洗浄後、シンチレーション分光測定により、シナプトソームの45Ｃａ2+含有量を査定した。バックグラウンド45Ｃａ2+は、低浸透圧で溶解させたシナプトソームを用いて見積もった。Ｃａ2+流入絶対量は、バックグラウンド45Ｃａ2+数値を差し引くことで計算した。Ｃａ2+流入の増加パーセントを、％［（薬物処理したもの−ビヒクル）／ビヒクル］で計算した。
５）Ｋ+誘発性Ｃａ+2流入により測定した細胞死
電位開口型Ｃａ2+チャンネルの活動レベルは、細胞の完全性の指標であるため、Ｋ+脱分極媒介型Ｃａ2+流入を利用して、Ａβ42が誘導する細胞死に対する化合物Ｃ０１０５の効果を、処置したマウスで査定した。前頭前皮質から調製したシナプトソームを、氷冷したＫ−Ｒ液で２回洗浄し、遠心し、０．５ｍｌのＫ−Ｒ液に再懸濁させた。
電位開口型Ｃａ2+チャンネルが媒介する45Ｃａ2+流入のレベルを、既に記載されたとおりに測定した［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ６７：５２２−５３０ （２０１０）］。シナプトソーム（５０μｇ）を、酸素添加した０．３ｍＭのＭｇ2+含有Ｋ−Ｒ液（５μＭの45Ｃａ2+（１０Ｃｉ／ｍｍｏｌ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を含有）に入れて、３７Ｃで５分間インキュベートし、続いてビヒクル又は６５ｍＭのＫ+（Ｎａ+の等モル置換で作成）とともに１分間インキュベートした。氷冷した、０．５ｍＭのＥＧＴＡを含有しＣａ2+を含有しないＫ−Ｒ液１ｍｌに入れて遠心することにより、反応を停止させた。
２回洗浄後、シンチレーション分光測定により、シナプトソームの45Ｃａ2+含有量を査定した。バックグラウンド45Ｃａ2+は、低浸透圧で溶解させたシナプトソームを用いて見積もった。Ｃａ2+流入絶対量は、バックグラウンド45Ｃａ2+数値を差し引くことで計算した。Ｃａ2+流入の増加パーセントを、％［（薬物処理したもの−ビヒクル）／ビヒクル］で計算した。
６）受容体刺激後の、ＮＭＤＡＲ又はＩＲと会合したシグナル伝達分子のレベル測定
ＮＭＤＡＲシグナル伝達及びそれらのシナプスアンカー型タンパク質、ＰＳＤ−９５との相互作用を、処置したマウス由来のシナプトソームで比較した。６枚の切片を、０．３ｍＭのＭｇ2+含有ＫＲ（ＬＭＫＲ；基礎）又は１０μＭのＮＭＤＡ及び１μＭのグリシンを含有するＬＭＫＲいずれかとともに、３７℃で３０分間インキュベートすることで、ＮＭＤＡＲ活性化及びシグナル伝達を開始させた。
インキュベーション混合物は、刺激中、１０分ごとに１分間、９５％Ｏ2／５％ＣＯ2で曝気した。氷冷した、Ｃａ2+を含まないＫ−Ｒ液（タンパク質ホスファターゼ阻害剤混合物、０．５ｍＭのＥＧＴＡ及び０．１ｍＭのＥＤＴＡを含有）１ｍｌを添加して、リガンド刺激を停止させた。収穫後、組織を手短かに遠心し、氷冷した免疫沈降用緩衝液０．２５ｍｌに入れてホモジナイズした。ホモジナイズしたものを、１０００×ｇで５分間（４℃）遠心し、上清（ミトコンドリアを除いた画分）を氷上で１０秒間超音波処理した。
タンパク質を、０．５％ジギトニン、０．２％コール酸ナトリウム及び０．５％ＮＰ−４０に入れて、６０分間４℃で上下左右を完全に回転させて、溶解させた。得られる溶解液を、５０，０００×ｇで５分間遠心することにより清澄させ、免疫沈降用緩衝液０．７５ｍｌで希釈した。タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で測定した。
ＮＭＤＡＲとＰＳＤ−９５の会合、ならびにＮＭＤＡＲシグナル伝達を測定するため、抗ＮＲ１免疫沈降物中のＮＭＤＡＲサブユニット、ＰＳＤ−９５、及びＮＭＤＡＲが会合したシグナル伝達分子のレベルを測定した。これらの試験では、脳切片溶解液（１００μｇ）を、タンパク質Ａ−アガロースビーズに共役結合で固定された抗ＮＲ１（Ｐｉｅｒｃｅ−ＥＮＤＯＧＥＮ）２μｇを用いて、４℃で一晩（約１８時間）、免疫沈降させた。抗ＮＲ１免疫沈降物を、抗原溶出用緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ−ＥＮＤＯＧＥＮ）７５μｌ及び２％ＳＤＳとともに、氷上で２分間インキュベートし、遠心して抗体−タンパク質Ａ−アガロース複合体を除去し、直ちに１．５Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ８．８）１０μｌで中和してから、２×ＰＡＧＥ標本用緩衝液６５μｌを添加して、５分間煮沸した。
得られる溶出液のうち７５μｌ（５０％）を、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで、サイズ分画した。タンパク質をニトロセルロース膜に移し、各種ＮＭＤＡ受容体サブユニット、ＰＳＤ−９５、情報伝達タンパク質のレベルを、ＰＳＤ−９５、ｎＮＯＳ、ホスホリパーゼＣ−γ１、γＰＫＣ、ｐＹ402ＰｙＫ２、ｐＹ416Ｓｒｃ、又はホスホチロシンに対する抗体を用いてウエスタンブロット法により測定した。ブロットを剥離させ、抗ＮＲ１抗体を用いて再探索して免疫沈降効率及び添加を査定した。
組織を、Ｋ−Ｒ液（基礎）又は１ｎＭのインシュリンを含有するＫ−Ｒ液いずれかとともに、３７℃で３０分間インキュベートすることで、ＩＲ活性化及びシグナル伝達を開始させた。インキュベーション混合物は、刺激中、１０分ごとに１分間、９５％Ｏ2／５％ＣＯ2で曝気した。氷冷したＣａ2+を含まないＫ−Ｒ液（タンパク質ホスファターゼ阻害剤混合物、０．５ｍＭのＥＧＴＡ及び０．１ｍＭのＥＤＴＡを含有）１ｍｌを添加して、リガンド刺激を停止させた。
組織を手短かに遠心して、氷冷した免疫沈降用緩衝液０．２５ｍｌに入れてホモジナイズした。ホモジナイズしたものを、１０００×ｇで５分間（４℃）遠心し、上清（ミトコンドリアを除いた画分）を氷上で１０秒間超音波処理した。タンパク質を、０．５％ジギトニン、０．２％コール酸ナトリウム及び０．５％ＮＰ−４０に入れて、６０分間４℃で上下左右を完全に回転させて、溶解させた。次いで、得られる溶解液を、５０，０００×ｇで５分間遠心することにより清澄させ、免疫沈降用緩衝液０．７５ｍｌで希釈した。タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で測定した。
ＩＲ活性化及びシグナル伝達を測定するため、抗ＩＲβ免疫沈降物中のｐＹ1150/1151ＩＲβのレベル及びＩＲシグナル伝達因子ＩＲＳ−１のレベルを測定した。これらの試験では、脳組織溶解液（１００μｇ）を、タンパク質Ａ−アガロースビーズに共役結合で固定されている抗ＩＲβ（Ｐｉｅｒｃｅ−ＥＮＤＯＧＥＮ）２μｇを用いて、４℃で一晩（約１８時間）、免疫沈降させた。
抗ＩＲβ免疫沈降物を、抗原溶出用緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ−ＥＮＤＯＧＥＮ）７５μｌ及び２％ＳＤＳとともに、氷上で２分間インキュベートし、遠心して抗体−タンパク質Ａ−アガロース複合体を除去し、直ちに１．５Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ８．８）１０μｌで中和してから、２×ＰＡＧＥ標本用緩衝液６５μｌを添加して、５分間煮沸した。
得られる溶出液のうち７５μｌ（５０％）を、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで、サイズ分画した。タンパク質をニトロセルロース膜に移し、ｐＹ1150/1151ＩＲβ及びＩＲＳ−１タンパク質のレベルを、ｐＹ1150/1151ＩＲβ及びＩＲＳ−１に対する抗体を用いてウエスタンブロット法により測定した。ブロットを剥離させ、抗ＩＲβ抗体を用いて再探索して免疫沈降効率及び添加を査定した。
７）サイトカインレベルの査定
（１）ビヒクル処置した偽マウス、（２）化合物Ｃ０１０５処置した偽マウス、（３）ビヒクル処置したＩＣＶのＡβ42マウス、及び（４）化合物Ｃ０１０５処置したＩＣＶのＡβ42マウス由来の頭頂葉皮質（約１０ｍｇ）を、最初にゆっくり解凍させ（−８０℃から−２０℃へ、それから−４℃へ）、氷冷した均質化用媒体（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５；５０ｍＭのＮａＣｌ、プロテアーゼ及びタンパク質ホスファターゼ阻害剤混合物）１００μｌに入れて超音波処理することでホモジナイズし、次いで０．５％ポリオキシエチレン（４０）ノニルフェニルエーテル（ＮＰ−４０）、０．２％コール酸Ｎａ、及び０．５％ジギトニンを加えて、４℃で１時間上下左右を完全に反転させて震盪撹拌することで、溶解させた。遠心分離してから、得られる溶解液を５００μｌで希釈し（合計体積６００μｌ）、サイトカイン源として用いた。
これら組織中のサイトカインレベルを測定するため、ビオチン化マウスモノクローナル抗ＴＮＦ−α、抗ＩＬ−６、及び抗ＩＬ−１βを０．５μｇ／ウェルで用いて、ストレプトアビジンで被覆したプレート（高結合キャパシティのＲｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ（商標）ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（商標）９６ウェルプレート、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ製品；Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を被覆した。プレートを、氷冷した５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）で３回洗浄し、上記の組織由来の溶解液１００μｌとともに３０℃で１時間インキュベートした。
プレートを、氷冷した５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）で３回洗浄し、０．５μｇ／ウェルの未結合ウサギ抗ＴＮＦ−α、抗ＩＬ−６、及び抗ＩＬ−１βとともに３０℃で１時間インキュベートした。５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）で２回洗浄した後、各ウェルに０．５μｇ／ウェルのＦＩＴＣ結合抗ウサギＩｇＧ（ヒト及びマウスが吸収される）を添加して、３０℃で１時間インキュベートした。プレートを、氷冷した５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）２００μｌで２回洗浄し、残留ＦＩＴＣシグナルを、マルチプレートリーダーＤＴＸ８８０（Ｂｅｃｋｍａｎ）で測定した。溶解液はそれぞれ２回ずつ調査した。
８）免疫組織化学試験
前頭前皮質及び嗅内皮質／海馬を含有する連続した５μｍ切片で、定量的免疫組織化学反応を用いて、Ａβ42凝集物／プラーク及び神経原線維病理（ＮＦＴ及び対になったらせん状繊維［ＰＨＦ］の免疫反応性）のレベルを測定した。用いたのは、既に記載されたとおりの単一標識免疫組織化学反応である［［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ６７：５２２−５３０ （２０１０）］； Ｄ’Ａｎｄｒｅａ ｅｔ ａｌ．， Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ３８：１２０−１３４ （２００１）；及びＮａｇｅｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １１０：１９９−２１１ （２００２）］。１枚の切片を、抗ＮＦＴ又は抗ＰＨＦで免疫染色した。その次の（連続した）切片（同一神経細胞を含有していることが多い）を、抗Ａβ42抗体で免疫染色して、神経細胞に蓄積したＡβ42ペプチドの相対レベルを測定した。既に記載されたとおり［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７５：５６２６−５６３２ （２０００）］、コンピューターを利用した画像分析法を用いて、相対Ａβ42蓄積度合いを、異なる細胞型間で比較した。
既に記載のとおりに、脳組織を、４℃で２週間、０．１５Ｍリン酸緩衝化１０％ホルマリン（ｐＨ７．４）に入れて固定し、パラフィン封入し、５μｍで順次切断し、明視野免疫組織化学反応用に処理した。抗Ａβ42をＡβ42で予め吸収した場合は、Ａβ42免疫反応性は存在しなかったが、Ａβ42-1ではそうはならなかった。標本は、Ｎｉｋｏｎ ＦＸＡ顕微鏡にＰｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＣＣＤカメラを取り付けて検査し、デジタル記録した。
既に記載されたとおり［Ｄ’Ａｎｄｒｅａ ｅｔ ａｌ．， Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ３８：１２０−１３４ （２００１）］に、ＮＦＴ／ＰＨＦ及びＡβ42免疫反応性の相対強度を測定し、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ（登録商標）Ｐｌｕｓ（ＭｅｄｉａＣｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）及びＭｅｔａｍｏｒｐｈ（登録商標）ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ．；Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用いて同型細胞間及び異型細胞間で比較した。ＮＦＴ／ＰＨＦ免疫反応性の大きさと、成熟神経細胞内に蓄積されたＡβ42陽性物質との間の関係性も明らかにした。
死後組織
この研究プロトコルは、ニューヨーク市立大学シティカレッジ及びニューヨーク市立大学医学専門学校ヒト研究委員会による事前承認に反映されているとおり、ヘルシンキ宣言：ヒトを対照とする医学研究の倫理的原則（第４修正案）に従うものであった。参加者たちは、一律の臨床評価を受けており、その臨床評価には、病歴、完全な神経学的検査、認知機能試験（ミニメンタルステート検査、ならびにエピソード記憶、意味記憶及び言語、作業記憶、知覚速度、及び視空間能力に対する他の認知機能試験を含む）、ならびに精神医学的評価が含まれていた。この情報に基づき、被験者には、ＮＩＮＣＤＳ−ＡＤＲＤＡ診断基準に基づくＡＤ診断が下された。［ＭｃＫｈａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ３４， ９３９−９４４ （１９８４）。］
孤発性ＡＤであると臨床上診断が確定している患者由来の死後脳組織（前頭皮質＝ＦＣＸ）及び正常な、同年齢の、神経学的に正常な個人由来の対照組織を、ハーバード脳組織リソースセンター（ＨＢＴＲＣ、Ｂｅｌｍｏｎｔ、ＭＡ）及びＵＣＬＡ脳組織リソースセンター（ＵＢＴＲＣ、ＬｏｓＡｎｇｅｌｅｓ、ＣＡ）から入手した。ＨＢＴＲＣ及びＵＢＴＲＣは、両方とも、国立衛生研究所により一部支援を受けている。死後、これらの脳を採取するまでの時間は、≦１３時間であった（ＡＤ脳標本及び対照脳標本を採取するまでの平均死後経過時間は、それぞれ、６．０±０．９時間及び５．８±０．８時間であった）。
固定化切片を、ヘマトキシリン及びエオシンで染色、ならびにビルショウスキー染色を修飾した銀染色法［Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ａｐｐｌ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ １２， ３−９ （１９８６）］で染色して神経病理学的診断検査を行い、ＡＤの神経病理学的評価の診断基準について国立老化研究所及びレーガン研究所の作業部会が定めた基準［Ｈｙｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ ５６， １０９５−１０９７ （１９９７）］に従って、何か疾患があれば診断を確立させ、同年齢の対照由来の脳組織を同様にスクリーニングした。老人斑（アミロイドプラーク）及び神経原線維タングル両方の存在を、ＡＤ脳の全てで、ニッスル・ビルショウスキー染色により確認するとともに、既に記載されるとおり（［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ ７５， １１５５−１１６１ （２０００）］に、前頭皮質及び嗅内皮質ならびに海馬において、抗Ａβ42及び抗ＮＦＴ染色で免疫組織化学的に特性決定した。
対照組織は、全体としてＡＤの神経病理を示さず、最小限の局所的な顕微鏡レベルでしか、ＡＤの神経病理を示さなかった（海馬中、０〜３の老人斑／１０倍の領域及び０〜６のＮＦＴ／１０倍の領域）。−８０℃に凍結保存していた新鮮な脳の冠状切断物を帯のこぎりで解剖して、ＦＣＸの１グラムの塊を切り出した。これらの塊は、ブロードマン野１０及び／又は４６に由来するものであった。死後組織は全て、匿名の同定番号で同定され、実験は、臨床情報を全く知らないまま最適の対を組ませることで行われた。
Ａβ42のα７ｎＡＣｈＲ親和性に対する試験化合物の効果の査定
Ａβ42のα７ｎＡＣｈＲ親和性に対する化合物の効果を査定するため、対照被験者から調製したシナプトソーム２００μｇをビオチン化した。ビオチン化シナプトソームを高張液に入れて手短かに超音波処理して溶解させ、組織源として用いて、化合物Ｃ０１０５の存在下及び不在下でのＡβ42のα７ｎＡＣｈＲ親和性を測定した。
α７ｎＡＣｈＲ−ＦＬＮＡ会合、ＴＬＲ４−ＦＬＮＡ会合、及びＡβ42−α７ｎＡＣｈＲ会合、Ｃａ2+流入、ＮＭＤＡＲ及びＩＲシグナル伝達について試験化合物を査定するための、脳切片のｉｎ ｖｉｔｒｏ処理
死後前頭皮質組織を徐々に解凍させ（−８０℃から−２０℃へ）、冷却したＭｃＩｌｗａｉｎ組織チョッパーでスライスした（２００μｍ×２００μｍ×３ｍｍ）。約２０ｍｇの脳切片を、氷冷した酸素添加クレブス（Kreb's）・リンゲル液（Ｋ−Ｒ）１ｍｌに懸濁させた。クレブス（Kreb's）・リンゲル液は、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１１８ｍＭのＮａＣｌ、４．８ｍＭのＫＣｌ、１．３ｍＭのＣａＣｌ2、１．２ｍＭのＫＨ2ＰＯ4、１．２ｍＭのＭｇＳＯ4、２５ｍＭのＮａＨＣＯ3、１０ｍＭのグルコース、１００μＭのアスコルビン酸、５０μｇ／ｍｌのロイペプチン、０．２ｍＭのＰＭＳＦ、２５μｇ／ｍｌのペプスタチンＡ、及び０．０１Ｕ／ｍｌの大豆トリプシン阻害剤を含有するものであった。そして手短かに遠心した。１ｍｌの氷冷したＫ−Ｒ液で更に２回洗浄してから、脳切片を１ｍｌのＫ−Ｒ液に懸濁させた。
外部からのＡβ42に接触させることで、α７ｎＡＣｈＲ−ＦＬＮＡ、ＴＬＲ４−ＦＬＮＡ、及びＡβ42−α７ｎＡＣｈＲ会合が増加し、Ａβ42が誘導するα７ｎＡＣｈＲ及びＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体（ＮＭＤＡＲ）の機能不全が引き起こされるかどうかを調べるため、対照被験者由来の前頭皮質切片約２０ｍｇを、３７℃で１時間、０．１μＭのＡβ42とともにインキュベートした。Ａβ42とともにインキュベートした対照組織及び本来のＡＤ組織における、化合物Ｃ０１０５の効果を試験するため、０．１μＭのＡβ42添加から１０分後、化合物Ｃ０１０５（０．１ｎＭ及び１ｎＭ）を添加した。インキュベーションは、暗中で１時間続けることで、試験作用剤の光破壊を最小限にした。合計インキュベーション体積０．５ｍｌのインキュベーション混合物を、インキュベーションの間、１５分ごとに１分間、９５％Ｏ2／５％ＣＯ2で曝気した。１．５ｍｌの氷冷したＣａ2+を含まないＫ−Ｒ液を添加して反応を停止させた。手短かに遠心して組織切片を回収し、様々なアッセイの組織源として用いた。
α７ｎＡＣｈＲ−ＦＬＮＡ結合に対する様々なα７ｎＡＣｈＲ作用剤の効果を査定するため、対照被験者由来のＦＣＸ約２０ｍｇを、０．１μＭのＡβ42と一緒に、１ｍＭのニコチン、ＰＮＵ２８２９８７、α−ブンガロトキシン、メチルリカコニチン、ガランタミン、メマンチン、及びＡβ40を用いてインキュベートした。インキュベーションは、暗中で１時間続けた。合計インキュベーション体積０．５ｍｌのインキュベーション混合物を、１５分ごとに１分間、９５％Ｏ2／５％ＣＯ2で曝気した。１．５ｍｌの氷冷したＣａ2+を含まないＫ−Ｒ液を添加して反応を停止させた。
これとは別に、α７ｎＡＣｈＲ−ＦＬＮＡ、ＴＬＲ４−ＦＬＮＡ、及びＡβ42−α７ｎＡＣｈＲ複合体レベルに対する化合物の効果を、条件一致のクレブス・リンゲル液及びＡβ42を用いてインキュベートした対照被験者由来のシナプトソームならびにクレブス・リンゲル液を用いてインキュベートしたアルツハイマー病患者のもので、０．１ｎＭ及び１ｎＭの化合物とともにインキュベートした後に測定した。得られたシナプトソーム中のα７ｎＡＣｈＲ−ＦＬＮＡ、ＴＬＲ４−ＦＬＮＡ、及びＡβ42−α７ｎＡＣｈＲ複合体のレベルを、以下に記載するとおりの免疫共沈法により測定した。この方法は発表済みである［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ３５， １０９６１−１０９７３ （２００９）］。
免疫共沈法によるα７ｎＡＣｈＲ−ＦＬＮＡ、ＴＬＲ４−ＦＬＮＡ、及びＡβ42−α７ｎＡＣｈＲ会合の査定
シナプトソーム２００μｇを、遠心分離によりペレットとし、次いで免疫沈降用緩衝液（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５；２００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、５０μｇ／ｍｌのロイペプチン、１０μｇ／ｍｌのアプロチニン、２μｇ／ｍｌの大豆トリプシン阻害剤、０．０４ｍＭのＰＭＳＦ、５ｍＭのＮａＦ、１ｍＭのバナジン酸ナトリウム、０．５ｍＭのβ−グリセロリン酸、及び０．１％２−メルカプトエタノールに、０．５％ジギトニン、０．２％コール酸ナトリウム、及び０．５％ＮＰ−４０を加えたもの）２５０μｌに入れて手短かに超音波処理することで溶解させ、４℃で１時間、上下左右を完全に回転させて震盪撹拌しながらインキュベートする。氷冷した免疫沈降用緩衝液７５０μｌで希釈して遠心分離（４℃）により不溶性デブリを除去した後、溶解液中のα７ｎＡＣｈＲ−／ＬＲ４−ＦＬＮＡ複合体及びＡβ42−α７ｎＡＣｈＲ複合体を、それぞれタンパク質Ａ結合アガロースビーズに固定されたウサギ抗ＦＬＮＡ抗体（１μｇ）及び抗Ａβ42抗体（１μｇ）とともに１６時間インキュベートする免疫沈降により、単離する。
得られる免疫複合体を、４℃で遠心分離することによりペレットとした。氷冷したリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．２）１ｍｌで３回洗浄し遠心した後、単離したα７ｎＡＣｈＲ−／ＴＬＲ４−ＦＬＮＡ複合体、及びＡβ42−α７ｎＡＣｈＲ複合体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ標本調製用緩衝液（６２．５ｍＭのトリス・ＨＣｌ、ｐＨ６．８；１０％グリセロール、２％ＳＤＳ；５％２−メルカプトエタノール、０．１％ブロモフェノールブルー）１００μｌに入れて５分間煮沸することにより、溶解させる。得られた抗Ａβ42免疫沈降物の５０％中のα７ｎＡＣｈＲ含有量を、モノクローナル抗α７ｎＡＣｈＲ抗体を用いてウエスタンブロット法により測定した。Ａβ42−α７ｎＡＣｈＲ複合体レベルを測定するアッセイでは，免疫共沈プロセスにおいて、固定化ウサギ抗アクチン（０．５μｇ）タンパク質Ａ結合アガロースを抗Ａβ42と一緒に添加した。
次いで、得られる免疫沈降物のβ−アクチン含有量を、モノクローナル抗β−アクチンを用いる免疫ブロット法により分析して、更に免疫沈降の効率及び添加を示す。α７ｎＡＣｈＲ−／ＴＬＲ４−ＦＬＮＡ複合体レベルを測定するアッセイでは、得られるブロットを剥離させて、モノクローナル抗ＦＬＮＡを用いて再探索することで免疫沈降の効率及び添加を査定する。
化合物の機能測定としての、シナプトソームにおけるＣａ2+流入の査定
ＮＭＤＡＲ介在型、α７ｎＡＣｈＲ介在型、及び電位開口型カルシウムチャンネル介在型の［45Ｃａ2+］流入を、対照被験者及びＡＤ被験者由来の死後前頭皮質切片から調製したシナプトソームを用いて試験した。簡単に述べると、脳シナプトソーム（死後試験用に１００μｇ）を、酸素添加した０．３ｍＭのＭｇ2+を含むＫ−Ｒ液（低Ｍｇ2+Ｋ−Ｒ、ＬＭＫＲ）に５μＭの45Ｃａ2+（１０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を添加した液中で、３７℃で５分間インキュベートし、続いて、ビヒクル、０．１〜１０μＭのＰＮＵ２８２９８７、特異的α７ｎＡＣｈＲアゴニスト、又は０．１〜１０μＭのＮＭＤＡ＋１μＭのグリシンとともに５分間、又は６５ｍＭのＫ+（Ｎａ+の等モル置換で作成）とともに１分間、合計インキュベーション体積０．５ｍｌにてインキュベートした。氷冷した、０．５ｍＭのＥＧＴＡを含有しＣａ2+を含有しないＫ−Ｒ液０．５ｍｌを添加し、４℃で遠心することにより、反応を停止させた。２回洗浄後、シンチレーション分光測定（Ｂｅｃｋｍａｎ）により、シナプトソームの45Ｃａ2+含有量を査定した。バックグラウンド45Ｃａ2+は、低浸透圧で溶解させたシナプトソームを用いて見積もった。Ｃａ2+流入絶対量は、バックグラウンド45Ｃａ2+数値を差し引くことで計算した。Ｃａ2+流入の増加パーセントを、％［（薬物処理したもの−ビヒクル）／ビヒクル］で計算した。
ＮＭＤＡＲのシグナル伝達及びＰＳＤ−９５との会合
ＮＭＤＡＲシグナル伝達及びそれらのシナプスアンカー型タンパク質、ＰＳＤ−９５との相互作用を、対照被験者及びＡＤ被験者由来の前頭皮質切片をＫ−Ｒ曝露したものと化合物Ｃ０１０５（１ｎＭ）曝露したもので比較した。約１０ｍｇのｉｎ ｖｉｔｒｏ処理した脳切片を、ＬＭＫＲ（基礎）又は１０μＭのＮＭＤＡ及び１μＭのグリシンを含有するＬＭＫＲいずれかとともに、３７℃で３０分間インキュベートすることで、ＮＭＤＡＲ活性化及びシグナル伝達を開始させた。インキュベーション混合物は、刺激中、１０分ごとに１分間、９５％Ｏ2／５％ＣＯ2で曝気した。氷冷したＣａ2+を含まないＫ−Ｒ液（０．５ｍＭのＥＧＴＡ及び０．１ｍＭのＥＤＴＡを含有）１ｍｌを添加して、リガンド刺激を停止させた。
脳切片を手短かに遠心して収穫し、氷冷した免疫沈降用緩衝液０．２５ｍｌに入れてホモジナイズした。ホモジナイズしたものを、１０００×ｇで５分間（４℃）遠心した。そして、上清（ミトコンドリアを除いた画分）を氷上で１０秒間超音波処理する。タンパク質を、０．５％ジギトニン、０．２％コール酸ナトリウム及び０．５％ＮＰ−４０に入れて、６０分間４℃で上下左右を完全に回転させて、溶解させる。得られる溶解液を、５０，０００×ｇで５分間遠心することにより清澄させ、免疫沈降用緩衝液０．７５ｍｌで希釈する。タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で測定する。
ＮＭＤＡＲシグナル伝達、及びＮＭＤＡＲとＰＳＤ−９５の会合複合体［ディスク巨大相同体Ｄｉｓｋｓ ｌａｒｇｅ ｈｏｍｏｌｏｇ ４（ＤＬＨ４）としても知られる］を測定するため、抗ＮＲ１免疫沈降物中のＮＭＤＡＲサブユニット、ＰＳＤ−９５、及びＮＭＤＡＲが会合したシグナル伝達分子のレベルを測定した。２つのＮＲ１タンパク質サブユニット及び２つのＮＲ２タンパク質サブユニットから、ヘテロ四量体ＮＭＤＡ受容体が形成される。
これらの試験では、脳切片溶解液（２００μｇ）を、タンパク質Ａ−アガロースビーズに共役結合で固定されている抗ＮＲ１（Ｐｉｅｒｃｅ−ＥＮＤＯＧＥＮ）２μｇを用いて、４℃で一晩（約１８時間）、免疫沈降させた。抗ＮＲ１免疫沈降物を、抗原溶出用緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ−ＥＮＤＯＧＥＮ）７５μｌ及び２％ＳＤＳとともに、氷上で２分間インキュベートし、遠心して抗体−タンパク質Ａ−アガロース複合体を除去し、直ちに１．５Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ８．８）１０μｌで中和してから、２×ＰＡＧＥ標本用緩衝液６５μｌを添加して、５分間煮沸した。得られる溶出液のうち７５μｌ（５０％）を、次いで、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで、サイズ分画した。タンパク質をニトロセルロース膜に移し、各種ＮＭＤＡ受容体サブユニット、ＰＳＤ−９５、情報伝達タンパク質のレベルを、ＮＲ１、ＰＳＤ−９５、ｎＮＯＳ、ホスホリパーゼＣ−γ１、γＰＫＣ、ｐＹ402ＰｙＫ２、ｐＹ416Ｓｒｃ、又はホスホチロシンに対する抗体を用いてウエスタンブロット法により測定した。ブロットを剥離させ、抗ＮＲ１又は抗ＮＲ２Ａ／抗ＮＲ２Ｂを用いて再探索して免疫沈降効率及び添加を査定した。
ＩＲ活性化及びシグナル伝達
ＩＲシグナル伝達を、対照被験者及びＡＤ被験者由来の前頭皮質切片をＫ−Ｒ曝露したものと化合物Ｃ０１０５曝露したもので比較した。約１０ｍｇのｉｎ ｖｉｔｒｏ処理した脳切片を、ＫＲ（基礎）又は１ｎＭのインシュリンを含有するＫＲいずれかとともに、３７℃で３０分間インキュベートすることで、ＩＲ活性化及びシグナル伝達を、開始させた。インキュベーション混合物は、刺激中、１０分ごとに１分間、９５％Ｏ2／５％ＣＯ2で曝気した。氷冷したＣａ2+を含まないＫ−Ｒ液（０．５ｍＭのＥＧＴＡ及び０．１ｍＭのＥＤＴＡを含有）１ｍｌを添加して、リガンド刺激を停止させた。脳切片を手短かに遠心して収穫し、氷冷した免疫沈降用緩衝液０．２５ｍｌに入れてホモジナイズした。ホモジナイズしたものを、１０００×ｇで５分間（４℃）遠心した。そして、上清（ミトコンドリアを除いた画分）を氷上で１０秒間超音波処理する。タンパク質を、０．５％ジギトニン、０．２％コール酸ナトリウム及び０．５％ＮＰ−４０に入れて、６０分間４℃で上下左右を完全に回転させて、溶解させる。得られる溶解液を、５０，０００×ｇで５分間遠心することにより清澄させ、免疫沈降用緩衝液０．７５ｍｌで希釈する。タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で測定する。
ＩＲシグナル伝達を測定するため、抗ＩＲβ免疫沈降物中のｐＹ1150/1151−ＩＲ及びｐＹ972−ＩＲのレベルならびにＩＲに補充されたインシュリン受容体基質（ＩＲＳ）−１のレベルを測定した。これらの試験では、脳切片溶解液（２００μｇ）を、タンパク質Ａ−アガロースビーズに共役結合で固定されている抗ＩＲβ（Ｐｉｅｒｃｅ−ＥＮＤＯＧＥＮ）２μｇを用いて、４℃で一晩（約１８時間）、免疫沈降させた。抗ＩＲβ免疫沈降物を、抗原溶出用緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ−ＥＮＤＯＧＥＮ）７５μｌ及び２％ＳＤＳとともに、氷上で２分間インキュベートし、遠心して抗体−タンパク質Ａ−アガロース複合体を除去し、直ちに１．５Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ８．８）１０μｌで中和してから、２×ＰＡＧＥ標本用緩衝液６５μｌを添加して、５分間煮沸した。得られる溶出液のうち７５μｌ（５０％）を、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで、サイズ分画した。タンパク質をニトロセルロース膜に移し、活性化ＩＲ（ｐＹ1150/1151及びｐＹ972）及び補充されたＩＲＳ−１のレベルを、ｐＹ1150/1151−ＩＲβ、ｐＹ972−ＩＲβ、又はＩＲＳ−１に対する抗体を用いてウエスタンブロット法により測定した。ブロットを剥離させ、抗ＩＲβ抗体を用いて再探索して添加が適切であることを査定した。
ウエスタンブロット分析
免疫共沈アッセイ由来の免疫沈降物を溶解させて、７．５％又は１０％いずれかのＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離させ、次いでニトロセルロース膜に電気泳動で移動させた。膜をＰＢＳで洗浄し、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）に１０％乳を添加したものを用いて、４℃で一晩（約１８時間）ブロッキングした。０．１％ＰＢＳＴでの５分間洗浄を３回行った後、膜を、１：５００〜１：１，０００希釈の最適な抗体とともに、室温で２時間インキュベートした。０．１％ＰＢＳＴでの２分間洗浄を３回行った後、抗動物種ＩｇＧ−ＨＲＰ（１：５，０００希釈）とともに１時間インキュベートし、０．１％ＰＢＳＴで３回（毎回２分）洗浄した。免疫反応性は、化学発光試薬（Ｐｉｅｒｃｅ−ＥＮＤＯＧＥＮ）と、正確に５分間反応させ、直ちにＸ線フィルムに焼き付けることで視覚化した。特定のバンドを、比重走査測定（ＧＳ−８００較正濃度計、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で定量した。
死後ヒト前頭皮質切片を用いた、ＬＰＳ誘導型τリン酸化の査定
既に記載されたとおりに、認知障害のない対照被験者由来の海馬を、Ｍｃｌｌｗａｉｎ組織チョッパー（Ｂｒｉｎｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で切断して冠状切片（厚さ１００μｍ）にした［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ， ２９：１０９６１−１０９７３ （２００９）］。切片を、酸素添加し氷冷した解体用媒体１０ｍｌ中で、細密鉗子２組を用いて、穏やかに震盪撹拌しながら、注意深く分離させた。
化合物Ｃ０１０５がＬＰＳ誘導型及びＡβ42誘導型τリン酸化を減少させることができるかどうか明らかにするため、約２０ｍｇのヒト海馬切片を、酸素添加クレブス（Kreb's）・リンゲル液（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４；１１８ｍＭのＮａＣｌ、４．８ｍＭのＫＣｌ、２５ｍＭのＮａＨＣＯ3、１．３ｍＭのＣａＣｌ2、１．２ｍＭのＭｇＳＯ4、１．２ｍＭのＫＨ2ＰＯ4、１０ｍＭのグルコース、１００μＭのアスコルビン酸、５０μｇ／ｍｌのロイペプチン、１０μｇ／ｍｌのアプロチニン、２μｇ／ｍｌの大豆トリプシン阻害剤、０．０４ｍＭのＰＭＳＦ、及びタンパク質ホスファターゼ阻害剤混合物）中、１ｎＭの化合物Ｃ０１０５の存在下又は不在下で、１μｇもしくは１０μｇのＬＰＳ又は０．１μＭのＡβ42とともに、３７℃で１時間インキュベートした（合計インキュベーション体積は５００μｌである）。反応混合物は、１０分ごとに１分間、９５％Ｏ2／５％ＣＯ2で曝気した。氷冷した１ｍＭのＥＤＴＡを含有しＣａ2+を含まないクレブス（Kreb's）・リンゲル液１．５ｍｌを添加して、反応を停止させ、１５，０００×ｇで１０分間（４℃）遠心した。
上清を除去してから、切片をホモジナイズして、ミトコンドリアを除いた（Ｐ２）画分を調製した。得られるＰ２画分を、０．５％ジギトニン、０．２％コール酸ナトリウム、及び０．５％ＮＰ−４０を含有する免疫沈降用緩衝液（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５；２００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２％２−メルカプトエタノール、５０μｇ／ｍｌのロイペプチン、１０μｇ／ｍｌのアプロチニン、２μｇ／ｍｌの大豆トリプシン阻害剤、０．０４ｍＭのＰＭＳＦ、及びタンパク質ホスファターゼ阻害剤混合物）５００μｌに溶解させた。氷冷した免疫沈降用緩衝液１．５ｍｌで希釈し、遠心（４℃）して不溶性デブリを除去した後、既に記載されたとおりに、固定化抗τ抗体（１μｇ）とともに４℃で１６時間インキュベートする免疫沈降法により、組織溶解液中の全τタンパク質を精製した［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ２７８：３１５４７−３１５５３ （２００３）； Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ， ６７：５２２−５３０ （２０１０）］。
抗τ免疫複合体を、タンパク質Ａ／Ｇ結合アガロースビーズ５０μｌともに４℃でインキュベートして遠心することにより濃縮した。精製したτタンパク質を、氷冷したリン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．２）で３回洗浄し、次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ標本調製用緩衝液（６２．５ｍＭのトリス・ＨＣｌ、ｐＨ６．８；１０％グリセロール、２％ＳＤＳ；５％２−メルカプトエタノール、０．１％ブロモフェノールブルー）１５０μｌに入れて５分間煮沸することにより溶解させた。溶解した抗τ免疫沈降物５０μｌに含有されるリン酸化セリン２０２−τ、トレオニン２３１−τ、及びトレオニン１８１−τを、８〜１６％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離させ、ニトロセルロース膜に電気泳動で移動させ、それぞれｐセリン２０２−τ（ＡＴ−８）、ｐトレオニン２３１−τ（ＡＴ−１８０）、及びｐトレオニン１８１−τ（ＡＴ２７０）に対する特異的抗体を用いるウエスタンブロットで測定した。
抗τ抗体により沈殿したτが、等量でＳＤＳ−ＰＡＧＥに添加されていることを確実にするため、抗τ免疫沈降物中の全τ含有量を、リン酸化τと非リン酸化τとを区別しない抗τ抗体（Ｔａｕ−５）を用いるウエスタンブロットで測定した。
これらの結果を、図４７Ａ、図４７Ｂ、及び図４７Ｃに示す。
Ａβ42及びＬＰＳとの接触により誘導される、初代ヒト星状細胞からの炎症促進性サイトカイン（ＩＬ−１β、ＩＬ−６、及びＴＮＦα）の放出における効果
ヒト星状細胞は、ＴＬＲ４及びＴＬＲ２細胞表面受容体の両方を発現する。Ａβ42及びＬＰＳは、それぞれが、ＴＬＲ４シグナル伝達経路に結合してこれを活性化し、炎症促進性サイトカイン（ＩＬ−１β、ＩＬ−６、及びＴＮＦαなど）の放出をもたらし、このことは、本明細書中説明される先の試験に、ならびに図４８Ａ及び図４８Ｂに示される試験に示されるとおりである。
実験計画：
初代星状細胞培養物を、提供元（Ｌｏｎｚａ）に従って調製した。付着星状細胞を０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡでトリプシン処理し、次いで回収し、１２ウェルプレートで継代培養した（１．２ｍｌ／ウェル）。細胞が８０〜８５％の集密状態になったら、細胞を、インキュベーター中５％ＣＯ2下で、１００ｆＭ、１０ｐＭ、又は１ｎＭの化合物Ｃ０１０５で処理し、続いて直ちにＡβ42（０．１μＭ）及びＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）を添加した；すなわち、侵襲リガンド及び化合物Ｃ０１０５を細胞に同時に添加した。ビヒクル群は、０．１％ＤＭＳＯのみで処理した。添加後２４時間インキュベーションを続けた。培養液をブランク（無処理）として用い、培養液２００μｌ中のサイトカイン、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、及びＩＬ−１βのレベルを測定した。各ウェルから１回試料採取した。
ヒト星状細胞からのサイトカイン放出に対する化合物Ｃ０１０５の効果を測定するため、ビオチン化マウスモノクローナル抗ＴＮＦ−α、抗ＩＬ−６、及び抗ＩＬ−１βを０．５μｇ／ウェルで用いて、ストレプトアビジンで被覆されたプレート（高結合キャパシティのＲｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ（商標）ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（商標）９６ウェルプレート）を被覆した。プレートを、氷冷した５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）で３回洗浄し、上記の条件に由来する培地２００μｌとともに３０℃でインキュベートした。プレートを、氷冷した５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）で３回洗浄し、０．５μｇ／ウェルの未結合ウサギ抗ＴＮＦ−α、抗ＩＬ−６、及び抗ＩＬ−１β抗体とともに、３０℃で１時間インキュベートした。５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）での１分間洗浄を３回行った後、各ウェルに０．２５μｇ／ウェルのＦＩＴＣ結合抗ウサギＩｇＧ（ヒト及びマウスを吸収）を添加して、３０℃で１時間インキュベートした。プレートを、氷冷したトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）２００μｌで２回洗浄し、残留ＦＩＴＣシグナルを、マルチプレートリーダーＤＴＸ８８０（Ｂｅｃｋｍａｎ）で測定した。
これらの試験の結果を、Ａβ42及びＬＰＳについて図４８に示す。見てわかるとおり、化合物Ｃ０１０５は、３種のサイトカイン及び４種のリガンドそれぞれについて、約７５％〜約９５％で、アッセイしたサイトカインそれぞれの放出を阻害した。一要因ＡＮＯＶＡによる統計分析：ｐ＜０．０１；ｐ*＜０．０１は、各侵襲リガンドについてビヒクル処理群と比較して。
ＦＬＮＡ親和性結合試験
リガンドとして多種の化合物及び受容体としてＦＬＮＡ又は配列番号１のＦＬＮＡ五量体を用いる一連の結合試験。これらの試験を、概して同様な様式で、リガンド存在下での［3Ｈ］ＮＬＸ結合の阻害に関する競合（置換）曲線を用いて行った。結果を図１６に示す。各試験の詳細を以下に記載する。
大部分の受容体、特にμ受容体を有さないＦＬＮＡ発現Ａ７細胞（ヒトメラニン細胞性；ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２５００）由来の膜に対する［3Ｈ］ＮＬＸ結合のナルトレキソンによる阻害についての競合（置換）曲線（図４８Ａ）は、３．９４ピコモル濃度のＩＣ50-H（高親和性）及び８３４ピコモル濃度のＩＣ50-L（低親和性）を示す２つの親和状態を示す。２つの飽和可能な部位を仮定する競合方程式を使って、０．１ｐＭ〜１ｍＭの範囲で１６段階の濃度から構成されるナルトレキソンの曲線について非線形カーブフィッティング分析を行った。データは、６回の試験それぞれで異なる組のＡ７細胞を用いて得られたものである。
ＦＬＮＡに対する化合物Ｃ０１０５の結合親和性を、同様に測定した（図１６Ｂ）。簡単に述べると、Ａ７細胞膜１００ｍｇを、結合培地（５０ｍＭのトリス・ＨＣｌ、ｐＨ７．５；１００ｍＭのＮａＣｌ；ならびにプロテアーゼ及びタンパク質ホスファターゼ阻害剤）２５０ｍｌ中、０．０１ｎＭ〜１ｍＭの化合物Ｃ０１０５の存在下、０．５ｎＭの［3Ｈ］ＮＬＸとともに、３０℃で６０分間インキュベートした。非特異的結合は、１ｍＭのＮＴＸで確定させた。３％ＢＳＡで処理したマイクログラスファイバー製の無結合剤グレードＢ（ＧＦ／Ｂ）膜を使い吸引して迅速に濾過することで、反応を停止した。フィルターを、氷冷した結合培地５ｍｌで２回洗浄し、フィルター上に残留する［3Ｈ］ＮＬＸを、液体シンチレーション分光測定により測定した。得られたデータを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）Ｐｒｉｓｍプログラムを用いて分析した。今回は、ＩＣ50-Hが０．４３ピコモル濃度及びＩＣ50-Lが２２６ピコモル濃度と求められた。Ｎ＝４。
ＦＬＮＡに対する化合物Ｃ０１０５の結合親和性を、同様に測定した（図１６Ｃ）。簡単に述べると、α７ｎＡＣｈＲ受容体及びμオピオイド受容体の両方を含有するＳＫ−Ｎ−ＭＣ（ヒト神経上皮腫；ＡＴＣＣ ＨＴＢ−１０）細胞膜２００ｍｇを、結合培地（５０ｍＭのトリス・ＨＣｌ、ｐＨ７．５；１００ｍＭのＮａＣｌ；ならびにプロテアーゼ及びタンパク質ホスファターゼ阻害剤）２５０ｍｌ中、１ｍＭのＤＡＭＧＯ及び０．０１ｎＭ〜１ｍＭの化合物Ｃ０１０５の存在下、０．５ｎＭの［3Ｈ］ＮＬＸとともに、３０℃で６０分間インキュベートした。非特異的結合は、１ｍＭのＮＴＸで確定させた。３％ＢＳＡで処理したＧＦ／Ｂ膜を使い吸引して迅速に濾過することで、反応を停止した。フィルターを、氷冷した結合培地５ｍｌで２回洗浄し、フィルター上に残留する［3Ｈ］ＮＬＸを、液体シンチレーション分光測定により測定した。得られたデータを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）Ｐｒｉｓｍプログラムを用いて分析した。今回は、ＩＣ50-Hが０．２０１ピコモル濃度及びＩＣ50-Lが１１１ピコモル濃度と求められた。Ｎ＝４。
ＶＡＫＧＬペプチドに対する化合物Ｃ０１０５の結合親和性も、置換アッセイで測定した（図１６Ｄ）。簡単に述べると、Ｎ末端ビオチン化ＶＡＫＧＬ（配列番号１）ペプチド（Ｂｎ−ＶＡＫＧＬ）１０ｍｇを、結合培地（５０ｍＭのトリス・ＨＣｌ、ｐＨ７．５；１００ｍＭのＮａＣｌ；ならびにプロテアーゼ及びタンパク質ホスファターゼ阻害剤）２５０ｍｌ中、０．０１ｎＭ〜１ｍＭの化合物Ｃ０１０５の存在下、０．５ｎＭの［3Ｈ］ＮＬＸとともに、３０℃で６０分間インキュベートした。非特異的結合は、１ｍＭのＮＴＸで確定させた。氷冷した結合培地１ｍｌを添加することで、反応を停止した。［3Ｈ］ＮＬＸが結合したＢｎ−ＶＡＫＧＬは、ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（登録商標）アガロース（Ｔｈｅｒｍｏ）２０ｍｌとともにインキュベートすることで捕獲し、続いて遠心分離した。ＰＢＳ１．５ｍｌで２回洗浄した後、結合した［3Ｈ］ＮＬＸを、液体シンチレーション分光測定により測定した。得られたデータを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）Ｐｒｉｓｍプログラムを用いて分析した。今回は、配列番号１の五量体ペプチドに予想されたとおり、単独のＩＣ50値が得られ、その値は２．７６ピコモル濃度であった。Ｎ＝４。
これらの試験で得られたデータから、ナロキソンと例示化合物Ｃ０１０５は、ＦＬＮＡに対して同様な親和性を示すことが示された。これらのデータは、無傷のＦＬＮＡ分子と配列番号１の五量体ＦＬＮＡペプチドが、受容体としての結合親和性において、類似していることも示し、これにより、本明細書中行われるアッセイにおいて完全分子の代替品として五量体ペプチドを使用することの正当性を立証する。
本明細書中に記載される特許、特許出願、及び文献は、それぞれが、参照として援用される。冠詞「ａ」又は「ａｎ」の使用は、１つ又は複数を含むものとする。
上記の説明及び実施例は、例示を意図するものであって、制限として受け取られることを意図しない。更に他の改変が、本発明の精神及び範囲内で可能であり、そのような改変も、当業者に容易に明らかとなるだろう。

Claims (9)

  1. 外傷性脳損傷（ＴＢＩ）又は慢性外傷性脳障害（ＣＴＥ）を治療するための医薬組成物であって、未標識のナロキソンと、配列番号１のフィラミンＡ（ＦＬＮＡ）のペンタペプチドとの結合を阻害する系列Ｃ−２の化合物又はその薬学的に許容可能な塩であって、該化合物又はその薬学的に許容可能な塩が、１０μＭ濃度で存在し、同濃度で対照阻害剤として未標識のナロキソンを用いた場合に、ＦＩＴＣ標識化ナロキソン結合を少なくとも約６０％阻害する系列Ｃ−２の化合物又はその薬学的に許容可能な塩を含み、
    該化合物又はその薬学的に許容可能な塩が、μオピオイド受容体（ＭＯＲ）結合有効量の別個のＭＯＲアゴニスト又はアンタゴニストが存在しない状態で投与されるものであり、かつ
    前記系列Ｃ−２の化合物が、以下の式Ａで示されることを特徴とする医薬組成物。
    Figure 0006630374
    式中、
    Ｑは、ＣＨＲ9又はＣ（Ｏ）であり、Ｚは、ＣＨＲ10又はＣ（Ｏ）であり、かつＱ及びＺのうち１つだけがＣ（Ｏ）であり；
    ｍ、ｎ、及びｐは、それぞれ、０又は１であり、かつｍ＋ｎ＋ｐの合計は、２又は３であり；
    Ｇ、Ｐ、及びＷは、それぞれ、ＮＲ20、ＮＲ2、ＮＲ7、Ｓ、及びＯからなる群より選択され、ここで、Ｒ7及びＲ2は、同じであるか異なっていて、Ｈ、Ｃ（Ｈ）v（Ｄ）h（式中、ｖ及びｈは、それぞれが、０、１、２、又は３であり、かつｖ＋ｈ＝３であり、Ｄは、重水素である）、Ｃ（Ｈ）q（Ｄ）r−脂肪族Ｃ1−Ｃ11ヒドロカルビル（式中、ｑ及びｒは、それぞれが、０、１、又は２であり、かつｑ＋ｒ＝０、１、又は２であり、Ｄは、重水素である）、脂肪族Ｃ1−Ｃ12ヒドロカルビルスルホニル、又は脂肪族Ｃ1−Ｃ12ヒドロカルボイルであり、かつＲ20は、以下で定義されるＸ−環Ａ−Ｒ1であり；
    ｄ、ｅ、ｆ、及びｋは、それぞれ、０又は１いずれかであり、かつ（ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｋ）の合計＝２であり；
    Ｊ及びＦは、同じであるか異なっていて、ＣＨ又はＣＤであり（式中、Ｄは、重水素である）；
    Ｅ及びＫは、同じであるか異なっていて、ＣＨ2、ＣＨＤ又はＣＤ2であり（式中、Ｄは、重水素である）；
    Ｘは、ＳＯ2、Ｃ（Ｏ）、ＣＨ2、ＣＤ2、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（ＮＨ）、ＮＨＣ（Ｓ）、又はＮＨＣ（Ｏ）（式中、Ｄは、重水素である）であり、
    環Ａは、芳香環系又はヘテロ芳香環系であり、この環系は、単環又は縮合した２つの環を含み；
    Ｒ1は、Ｈであるか、又は上限３個までの置換基、Ｒ1a、Ｒ1b、及びＲ1c、を表し、上限３個までの置換基自身は、同じであっても異なっていてもよく、これら３つの基、Ｒ1a-cは、それぞれ、個別に、Ｈ、Ｃ1−Ｃ6ヒドロカルビル、Ｃ1−Ｃ6ヒドロカルビルオキシ、Ｃ1−Ｃ6ヒドロカルビルオキシカルボニル、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、Ｃ1−Ｃ7ヒドロカルボイル、ヒドロキシ置換、トリフルオロメチル置換、もしくはハロゲン置換のＣ1−Ｃ7ヒドロカルボイル、Ｃ1−Ｃ6ヒドロカルビルスルホニル、Ｃ1−Ｃ6ヒドロカルビルオキシスルホニル、ハロゲン、ニトロ、フェニル、シアノ、カルボキシル、Ｃ1−Ｃ7ヒドロカルビルカルボキシラート、カルボキサミドもしくはスルホンアミド（いずれのアミド基中のアミド窒素は、式ＮＲ3Ｒ4を有し、ここで、Ｒ3及びＲ4は、同じであるか異なっていて、Ｈ、Ｃ1−Ｃ4ヒドロカルビルであるか、又はＲ3とＲ4は、該示されている窒素と一緒になって五員〜七員環を形成し、形成された環は随意に１又は２個の追加のヘテロ原子を含有し、追加のヘテロ原子はそれぞれ独立して窒素、酸素、又は硫黄である）、
    MAｒ（式中、Ｍは、−ＣＨ2−、−Ｏ−、又は−Ｎ＝Ｎ−であり、かつＡｒは、単環のアリール又はヘテロアリール基である）、及びＮＲ5Ｒ6（式中、Ｒ5及びＲ6は、同じであるか異なっていて、Ｈ、Ｃ1−Ｃ4ヒドロカルビル、Ｃ1−Ｃ4アシル、Ｃ1−Ｃ4ヒドロカルビルスルホニルであるか、又はＲ5とＲ6は、該示されている窒素と一緒になって五員〜七員環を形成し、形成された環は随意に１又は２個の追加のヘテロ原子を含有し、追加のヘテロ原子はそれぞれ独立して窒素、酸素、又は硫黄である）からなる群より選択され；
    Ｒ8、Ｒ9、及びＲ10は、それぞれＨであるか、又はＲ8、Ｒ9、及びＲ10のうち２つがＨであり、１つがＣ1−Ｃ8ヒドロカルビル基であって、このＣ1−Ｃ8ヒドロカルビル基は、無置換であるか、又は上限３個までの原子で置換され、該原子は、同じであるか異なっていて、酸素又は窒素原子であり；
    Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、及びＲ14は、全てＨであるか、あるいはＲ11及びＲ13はＨであり、かつＲ12及びＲ14はＨ又はＤ（式中、Ｄは、重水素である）であるか、あるいはＲ11とＲ12の対又はＲ13とＲ14の対のうち一方が、該示されている環と一緒になって飽和又は不飽和の六員環を形成し、他方の対がそれぞれＨであるか、あるいは他方の対は、Ｈ及びＤ（式中、Ｄは、重水素である）である。
  2. 前記化合物が示すＭＯＲ刺激は、同濃度でＤＡＭＧＯがもたらすＭＯＲ刺激の約８０％未満である、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 前記化合物は、以下の式Ｉの構造に一致する系列Ｃ−２の化合物である、請求項１に記載の医薬組成物。
    Figure 0006630374
    式中、Ｊ及びＦは、同じであるか異なっていて、ＣＨ2、ＣＨＤ、又はＣＤ2である（式中、Ｄは、重水素である）。
  4. 前記化合物は、以下の式ＩＩの構造に一致する系列Ｃ−２の化合物である、請求項１に記載の医薬組成物。
    Figure 0006630374
    式中、Ｊ及びＦは、同じであるか異なっていて、ＣＨ2、ＣＨＤ、又はＣＤ2である（式中、Ｄは、重水素である）。
  5. 前記化合物は、以下の式ＩＩＩの構造に一致する系列Ｃ−２の化合物である、請求項１に記載の医薬組成物。
    Figure 0006630374
    式中、Ｊ及びＦは、同じであるか異なっていて、ＣＨ2、ＣＨＤ、又はＣＤ2であり（式中、Ｄは、重水素である）；かつｍ及びｎはそれぞれ、１である。
  6. 前記化合物は、以下の化合物から選択される化合物の構造に一致する系列Ｃ−２の化合物である、請求項１に記載の医薬組成物。
    Figure 0006630374
  7. 液状である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  8. 固形である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  9. 前記化合物が、以下、
    Figure 0006630374

    Figure 0006630374

    Figure 0006630374

    Figure 0006630374
    からなる群から選択される化合物の構造に一致するC-2系列の化合物である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
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