JP6621065B2

JP6621065B2 - 菌体外多糖産生量の促進方法

Info

Publication number: JP6621065B2
Application number: JP2016113250A
Authority: JP
Inventors: 哲郎大羽; 邦彦植村; 浩志鍋谷
Original assignee: National Agriculture and Food Research Organization; Nissin Foods Holdings Co Ltd
Current assignee: National Agriculture and Food Research Organization; Nissin Foods Holdings Co Ltd
Priority date: 2016-06-07
Filing date: 2016-06-07
Publication date: 2019-12-18
Anticipated expiration: 2036-06-07
Also published as: JP2017216926A

Description

本発明は、菌体外多糖産生量の促進方法に関する。

近年、乳酸菌が菌体外に産生する多糖（exopolysaccharide;EPS）の生理活性作用に注目が集まっている。

EPSの有する生理活性としては、ビフィズス菌などの栄養源となるプレバイオティクス効果や、免疫系の賦活効果などが知られている。ここで、プレバイオティクスとは、イヌリンなどの多糖、フルクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖のことである。プレバイオティクスは有用なビフィズス菌の生育を促して短鎖脂肪酸の生成を増進させる効果を有する。

ところで、EPSは乳酸菌の発酵過程において産生される。EPSの産生量を増やすためには、適当な発酵条件を整えるか、特殊な発酵調整剤を用いるなどして、発酵を制御する必要がある。しかし、発酵物をそのまま製品として用いる場合、特殊な発酵調整剤を用いることはできない。また、適当な発酵条件とは言っても、発酵温度や発酵時間を制御する程度が限界であった。

特開２００９−２２５７２２号公報

本発明は上記問題点を鑑みてなされたものである。本発明者らは、EPSの産生量を増やすための新たな手法について、鋭意検討を行った。そして、発酵中の菌体外多糖産生微生物に対してパルス電界処理を与えることでEPSの産生量を増やすことができることを見出し、本発明を完成させるに至った。

前記した目的を達成するため、微生物における菌体外多糖産生量を促進させるための方法であって、前記菌体外多糖産生微生物にパルス電界処理を行うことを特徴とする。

かかる構成によれば、複雑な装置を必要としない一工程を追加するだけで、菌体外多糖産生量を増加させることができる。また、発酵調整剤を用いないため、発酵物をそのまま製品として用いることができる。

ここで、本発明でいう「発酵」とは、代謝過程のみならず、微生物の増殖過程も含みうる概念である。

前記した菌体外多糖産生量の促進方法においては、パルス電界処理の条件が、電界強度が１０ｋＶ／ｃｍ未満であり、培養液１ｌあたりのパルス幅とパルス回数との積算値が１４００〜１５００［μs・回］である。

かかる構成によれば、菌体外多糖産生微生物における電気穿孔を低く抑えながら、なおかつ菌体外多糖を増産させることができる。これは、菌体外多糖産生微生物にとって致命傷ではないが、静電気的な刺激となって菌体外多糖類の産生が促進されたものと考えられる。

前記した菌体外多糖産生量の促進方法は、パルス電界処理を前記菌体外多糖産生微生物の対数増殖期中期から後期にかけて行うことが望ましい。

かかる構成によれば、ある程度増殖が進行して多糖が活発に産生されている最中にパルス処理による静電気的な刺激を与えることで、その生合成のメカニズムを促進させることができるためと考えられる。

本発明によれば、新たに一工程増やすだけでEPSの産生量を増やすことができる。また、特殊な発酵調整剤を用いないので、発酵物をそのまま製品として用いることができる。

本発明で用いるパルス電界処理装置の概略説明図である。本発明で用いるパルス電界フローセルの分解斜視図である。実験１において、菌体数の変化を経時的に測定した結果である。実験１において、多糖産生量を経時的に測定した結果である。実験２において、菌体数の変化を経時的に測定した結果である。実験２において、多糖産生量を経時的に測定した結果である。実験３において、菌体数の変化を経時的に測定した結果である。実験３において、多糖産生量を経時的に測定した結果である。

以下、本発明を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものである。

本発明に用いることができる微生物としては、菌体外多糖を産生する能力を有する微生物であることが好ましく、さらに球菌であることが好ましい。菌体外多糖を産生する能力を有する微生物としては、Streptococcus属やLactococcus属が挙げられる。このうち、球菌であるLactococcus属が特に好ましい。

本発明で用いる微生物は、対数増殖期中期から後期かけて多糖を活発に生産しているものであることが好ましい。一例としてLactococcus lactisを例に挙げると、１４〜２４時間発酵させたものに対して行うことが好ましく、１６〜２２時間発酵させたものに対して行うことがより好ましい。１４時間未満の微生物では、菌体外多糖の産生量が少なくなってしまう。これは、菌体の代謝が多糖の生合成へとシフトしていないために効果が十分に得られないか、そもそもパルス電界処理によって効果を発揮する菌体数が少ないためと考えられる。

次に、本発明で用いるパルス電界処理装置について、図１および図２を参照しながら説明する。なお、図１は本発明にかかるパルス電界処理装置の概略説明図である。図２は、パルス発生装置の構成を示す分解斜視図である。

図１に示すように、本発明に用いるパルス電界処理装置１は、送液ポンプ１０と、パルス発生装置２０と、冷却コイル３０と、背圧バルブ４０と、各装置をつなぐホース５０と、で構成される。

また、本発明においては、パルス発生装置２０にＣＲ放電回路を用いた。この回路は、主に充電用抵抗、コンデンサ、スイッチ、パルス電界フローセル２００で構成される。

本発明で用いるパルス電界フローセル２００は、図２に示すように、７枚の板（金属板４枚と絶縁板３枚）から構成されている。具体的には、絶縁プレート２１０を中心に、電極プレート２２０、外側絶縁プレート２３０、ホールドプレート２４０の順に絶縁板と金属板が交互に配置されている。そして、電極プレート２２０に電圧が負荷される構造となっている。

ここで、金属板の組成としては、各種の金属を用いることができる。このうち、耐電食性や耐酸性、また金属が有する殺菌作用を考慮すると鉄やステンレスが好ましい。また、絶縁板は絶縁できて、耐腐食性を備えるものであれば特に制限されない。絶縁板はテフロン（登録商標）加工されていることが好ましい。

また、電極プレート２２０、外側絶縁プレート２３０、ホールドプレート２４０の厚みについては特に制限されず、電気の絶縁とスパークの防止ができる程度の厚みがあれば良い。一方、絶縁プレート２１０の厚みは電極間の距離を決めるものであり、菌体に付与する電界を決定する上で重要となる。本発明においては、１ｍｍあたり１．０ｋＶ未満の電圧を印加できるように、パルス発生装置１の電圧出力能力に応じて絶縁プレートの厚みを適宜決定することが好ましい。

図２に示すように、本発明にかかるパルス電界フローセル２００には、電極内に微生物を導くための切欠きが設けられている。すなわち、電極プレート２２０に挟まれた絶縁プレート２１０の切欠き構造が電界チャンバーの役割を果たす。本発明では、微生物が電極間を通過する際にパルス電界処理が行われる。

また、微生物を電極内へ注入する注入口は、板の中心よりもやや下に設けられている。一方、微生物を電極内から排出する排出口は、板の中心よりもやや上に設けられている。このような構成とすることで確実に微生物にパルス電界処理を施すことができる。なお、切欠きの上下方向における各末端は、注入口の下端および排出口の上端を超えない範囲にあることが好ましい。好ましくは切欠きの上下方向における各末端と、注入口の下端および排出口の上端が同じ位置にあることが好ましい。

ここで、微生物注入口の上端と微生物排出口の下端との高低差は、電極間通過中に印加するパルスの回数や、パルス周期により定めることができる。本発明においては１０ｍｍ〜１５ｍｍ程度あることが好ましい。

次に、図１を参照しながらパルス電界処理方法について説明する。まず、タンク内で微生物を発酵させる。このとき、微生物の対数増殖期中期から後期まで発酵させることが好ましい。次に、発酵した微生物を送液ポンプ１０で吸引し、パルス発送装置２０に移送する。このとき、送液ポンプ１０の速度としては、電界チャンバーの容量と電極間通過中に印加するパルスの回数に応じて速度をコントロールする。本発明では６０〜７０ｍｌ／ｍｉｎの範囲であることが好ましい。

次に、パルス発生装置２０に送られた微生物に対してパルス電界処理を行う。パルス電界処理条件の一例としては、印加電圧７〜９ｋＶ／ｃｍ、パルス幅１μｓ、１回のセル通過当たり２５回のパルス照射が挙げられる。なお、「１回のセル通過」とは、タンク内の培養液全てをパルス電界フローセル２００に通過させることを意味する。

ここで、パルス幅や処理回数は特に制限されず、パルス幅と総パルス処理回数との積算値が１４００〜１５００［μs・回］を満たす範囲で適宜変更可能である。また、パルス処理により菌体の細胞膜の透過性が１０％程度の上昇に留められるパルス幅とパルス処理回数であることが好ましい。例えば、１０μｓのパルス幅を用いる場合には、培養液１ｌあたりの総パルス回数を１４０〜１５０回とすればよい。一方、１ｐｓのパルス幅を用いる場合には、総パルス回数を１４×１０⁸〜１５×１０⁸回とすればよい。なお、パルス幅と総パルス回数との積算値が１４００〜１５００［μs・回］を超えない範囲において、パルス電界処理中にパルス電界処理条件を変更しても良い。

本発明で用いるパルス波形は特に制限されず、正弦波、矩形波、三角波、鋸歯状波の波形であってもよい。さらに、パルス電界処理は、単極処理でも双極処理で行ってもよい。

次に、パルス電界処理された微生物は冷却コイルへ３０と導かれ、冷却される。冷却温度は、最適培養条件と同じ温度であることが好ましい。冷却された微生物はタンク内に戻され、パルス発生装置２０へと再び送られる。これを繰り返し行い、培養液１ｌあたりのパルス幅と総パルス処理回数との積算値が１４００〜１５００［μs・回］になるまで繰り返し処理することが好ましい。なお、所定のパルス回数を処理するまでの時間（パルス電界処理時間）は送液ポンプ１０の速度で調整可能であり、微生物の対数増殖のスピードに応じて決めることができる。本発明においては、増殖が定常期に至るまでの２〜４時間にかけて行うことが好ましい。

以下、実施例に基づいて本発明を更に詳細に説明する。

（菌の同定）
本実施例では、まず用いる菌の同定を行った。市販のカスピ海ヨーグルト用スターターカルチャーから菌を単離した。次に、単離した菌から多糖類産生能の高い菌を選び、１６ＳｒＲＮＡとｇａｄＢｇｅｎｅの塩基配列を調べ、相同性から菌の同定を行った。次に、同定した菌（Lactococcus lactis ssp. cremoris株）が産生する多糖類を精製し、ＰＭＰ誘導体化法によるＨＰＬＣで多糖類の組成を調べ、リン酸化多糖類を産生する菌株であることを確認した。

（パルス電界処理条件の選定）
次に最適な印加電圧とパルス回数について検討を行った。Lactococcus lactis ssp. cremoris株を、完全合成培地（含乳糖１％）１０００ｍｌに対して１０⁴ＣＦＵ／ｍｌとなるように植菌を行い、２５℃で１８時間培養した。
次に、上述の電界処理装置を用いて、パルス電界処理を１回のみ行った。このとき、パルス電界処理の条件として、電界チャンバー容積２２．４μｌ、送液ポンプの速度を６０ｍｌ／ｍｉｎ、パルス幅１μｓに固定し、印加電圧（７〜１１ｋＶ/ｃｍ）とパルス回数（１００〜４００回／１回のセル通過）を変化させて多糖産生量の変化を調べた。なお、パルス電界処理による菌体への損傷を調べるために、プロピジウムヨウ素を用いて菌体の細胞透過性についても測定した。

その結果、印加電圧８ｋｖ／ｃｍ、パルス回数２００回／１回のセル通過の条件下において、多糖産生量が最も高くなった。また、菌体の細胞透過性は、８ｋｖ／ｃｍ未満で１０％以下であった。そこで、以下の実験においては、印加電圧８ｋｖ／ｃｍ、パルス回数２００回／１回のセル通過の条件下でパルス電界処理を行うこととした。

（実験１）
Lactococcus lactis ssp. cremoris株を、完全合成培地（含乳糖１％）１０００ｍｌに対して１０⁴ＣＦＵ／ｍｌとなるように植菌を行い、２５℃で１８時間培養した。
次に、半量の５００ｍｌに対して上述の電界処理装置を用いて、電界処理を行った。このとき、パルス電界処理の条件は、送液ポンプの速度は６０ｍｌ／ｍｉｎ、パルス幅１μｓ、印加電圧８ｋＶ/ｃｍ、パルス回数２５回/１回のセル通過、電界チャンバー容積２２．４μｌ、冷却温度２５℃とした。そして発酵１８時間から２０時間の２時間に亘ってパルス電界処理を行った。このとき、送液ポンプの移送スピードと培養液の量から、培養液は計２９回セルを循環し、７３０回のパルス処理を受けたこととなる。２０時間経過後は、２８時間まで２５℃で発酵させた。

パルス電界処理を行った系と行っていない系の２時間ごとの菌数変化と多糖産生量の経時変化について調べた。結果を図３、４に示す。

図３から明らかなように、発酵１８時間以降の菌数変化はパルス処理の有無にかかわらず、ほぼ同じであった。一方、図４から明らかなように、多糖産生量の経時変化を見ると、パルス電界処理を行った系は、多糖産生量が高まっていることがわかる。具体的には、２０時間以降から多糖の産生効率が高まり、発酵終点である２８時間では６４％産生量が高まっていた。このことから、パルス電界処理が多糖産生能に有利に作用していることが確認された。

（実験２）
次に、パルス処理時間（平均パルス回数）の影響について検討を行った。実験１と同様の条件で１８時間培養を行なった。このとき、完全合成培地（含乳糖１％）は１５００ｍｌであった。次に、培養液をパルス電界未処理の系、パルス電界処理を２時間（平均パルス回数３６５回；１８〜２０時間）行った系およびパルス電界処理を４時間（平均パルス回数７３０回；１８〜２２時間）行った系の３つに分けて、菌数変化と多糖類産生量の経時変化について調べた。結果を図５，６に示す。

図５から明らかなように、菌数変化はパルス処理の有無にかかわらず、ほぼ同じであった。一方、多糖産生量の経時変化を見ると、図６から明らかなように、パルス処理時間が長いほど、未処理菌体と比べて多糖産生量が増加していた。具体的には、２時間処理の系では最大５２％、４時間処理の系では最大９４％産生量が高まっていた。このことから、パルス処理時間（平均パルス回数）が長いほど、多糖産生能に有利に作用していることが確認された。

（実験３）
次に、パルス処理開始時間の影響について検討を行った。実験２と同様、完全合成培地（含乳糖１％）は１５００ｍｌを３つに分け、培養液をパルス電界未処理の系、パルス電界処理を４時間（平均パルス回数７３０回；１６〜２０時間）行った系およびパルス電界処理を４時間（平均パルス回数７３０回；１８〜２２時間）行った系の３つに分けて、菌数変化と多糖類産生量の経時変化について調べた。結果を図７，８に示す。

図７から明らかなように、菌数変化はパルス処理の有無にかかわらず、ほぼ同じであった。多糖産生量の経時変化を見ると、図８から明らかなように、発酵１６時間からパルス電界処理を行ったものよりも、発酵１８時間を超えてからパルス電界処理を行ったものの方が、２０時間以降から多糖産生効率が高まっていることがわかる。これは、発酵１６時間から１８時間までは菌体の代謝が多糖の生合成へと十分にシフトしていないためと考えられる。

一方、発酵１８時間を経過した微生物は菌体の代謝が多糖の生合成へとシフトしており、また、多糖産生の生合成のメカニズムが電界パルス処理によって促進されたことも相まって、多糖産生量が高くなったものと考えられる。なお、パルス電界未処理の系と比較すると、２０時間以降から多糖産生効率が高まり、発酵終点である２８時間では９５％産生量が高まっていた。

１パルス電界処理装置
１０送液ポンプ
２０パルス発生装置
３０冷却コイル
４０背圧バルブ
５０ホース
２００パルス電界フローセル
２１０絶縁プレート
２２０電極プレート
２３０外側絶縁プレート
２４０ホールドプレート

Claims

微生物における菌体外多糖産生量を促進させるための方法であって、
Lactococcus属の菌体外多糖産生微生物にパルス電界処理を行い、該パルス電界処理の条件は、培養液１ｌあたりのパルス幅と総パルス回数との積算値を含む、菌体外多糖産生量の促進方法。
パルス電界処理の条件において、
電界強度が１０ｋＶ／ｃｍ未満であり、
前記培養液１ｌあたりのパルス幅と総パルス回数との積算値が１４００〜１５００［μs・回］である、請求項１記載の菌体外多糖産生量の促進方法。
パルス電界処理を前記菌体外多糖産生微生物の対数増殖期中期から後期にかけて行う、請求項１または２に記載の菌体外多糖産生量の促進方法。
パルス電界処理時間が２時間以上４時間以下である、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の菌体外多糖産生量の促進方法。
前記菌体外多糖産生微生物の菌体外多糖産生量が、パルス電界処理を行わない場合に比べて、１．５倍以上である、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の菌体外多糖産生量の促進方法。