JP6604529B2 - ヒドロキシエイコサペンタエン酸の取得方法 - Google Patents

Description

本発明は、天然資源からのヒドロキシエイコサペンタエン酸の取得方法に関する。

ヒドロキシエイコサペンタエン酸（ＨＥＰＥ）は、ω３脂肪酸の１つであるエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）の代謝物であり、水酸基の結合位置の違いによって位置異性体が存在する。ＥＰＡが、魚類に多く含まれ、動脈硬化症や高脂血症の予防薬や治療薬の有効成分の他、飲食品の原料などとして用いることができることは、当業者のみならず一般にもよく知られている。これに対し、ＨＥＰＥは、生化学的な研究については古くからなされているものの（例えば非特許文献１）、利用価値や利用方法についてはあまり知られていない。その理由の１つとして、ＨＥＰＥを安定供給する方法が確立されていないということが挙げられる。事実、ＨＥＰＥは、種々の位置異性体が市販されているが（例えばＣｙｍａｎＣｈｅｍｉｃａｌ社）、それらはＥＰＡを人工的に酸化させることで調製されており、１ｍｇに満たない少量でも１万円以上する非常に高価なものである。

Ｉ．Ｍｏｒｉｔａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８３，２５８：１０１９７−１０１９９

そこで本発明は、ＨＥＰＥを安定供給するための方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、これまで海洋生物であるオキアミ（Ｅｕｐｈａｕｓｉａｃｅａ）に含まれる成分が有する薬理作用について研究を行ってきているが、今般、オキアミやエビ（Ｄｅｃａｐｏｄａ）からＨＥＰＥを取得することができることを見出した。

上記の知見に基づいてなされた本発明の水酸基の結合位置が８位または９位であるＨＥＰＥの取得方法は、請求項１記載の通り、ツノナシオキアミ（Ｅｕｐｈａｕｓｉａ ｐａｃｉｆｉｃａ）からの抽出操作による。
また、請求項２記載の取得方法は、請求項１記載の取得方法において、抽出操作を水に可溶性の有機溶媒および／または水を用いて行う。
また、本発明は、請求項３記載の通り、ツノナシオキアミ（Ｅｕｐｈａｕｓｉａ ｐａｃｉｆｉｃａ）からの抽出操作を含んでなる、水酸基の結合位置が８位または９位であるＨＥＰＥを含む組成物の製造方法である。
また、本発明は、請求項４記載の通り、エビからの抽出操作によるＨＥＰＥの取得方法である。

本発明によれば、オキアミやエビを原料としたＨＥＰＥの取得方法を提供することができる。

実施例１における、ＨＰＬＣによるオキアミからの各種のＨＥＰＥの単離取得の結果を示すチャートである。 同、リサイクルＨＰＬＣの結果を示すチャートである。 参考例１における、オキアミから単離取得した、５−ＨＥＰＥ、８−ＨＥＰＥ、９−ＨＥＰＥ、１２−ＨＥＰＥ、１８−ＨＥＰＥのそれぞれのＰＰＡＲ活性化作用の評価結果を示すグラフである。 同、８−ＨＥＰＥ、９−ＨＥＰＥ、１８−ＨＥＰＥのそれぞれのＰＰＡＲ活性化作用の濃度依存性を示すグラフである。 同、各種のＨＥＰＥのそれぞれの低濃度でのＰＰＡＲ活性化作用の評価結果を示すグラフである。

本発明のＨＥＰＥの取得方法は、オキアミやエビからの抽出操作による。本発明の方法によって取得されるＨＥＰＥとしては、例えば下記の化学構造を有する８−ＨＥＰＥ（８−ｈｙｄｒｏｘｙ−５Ｚ，９Ｅ，１１Ｚ，１４Ｚ，１７Ｚ−ｅｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）の他、５−ＨＥＰＥ（５−ｈｙｄｒｏｘｙ−６Ｅ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ，１７Ｚ−ｅｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、９−ＨＥＰＥ（９−ｈｙｄｒｏｘｙ−５Ｚ，７Ｅ，１１Ｚ，１４Ｚ，１７Ｚ−ｅｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、１２−ＨＥＰＥ（１２-ｈｙｄｒｏｘｙ−５Ｚ，８Ｚ，１０Ｅ，１４Ｚ，１７Ｚ−ｅｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、１８−ＨＥＰＥ（１８−ｈｙｄｒｏｘｙ−５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ，１６Ｅ−ｅｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）などが挙げられる。ＨＥＰＥは、水酸基の結合位置の違いによって位置異性体が存在するとともに、不斉炭素を有するので光学異性体が存在し、また、複数の二重結合を有するので種々のシス−トランス異性体が存在するが、本発明はそのいずれをも権利範囲に包含するものである。

本発明の方法によってＨＥＰＥを取得するために原料として用いるオキアミは特に限定されるものではなく、三陸地方でイサダと呼ばれて食用に供されるツノナシオキアミ（Ｅｕｐｈａｕｓｉａ ｐａｃｉｆｉｃａ）の他、ナンキョクオキアミ（Ｅｕｐｈａｕｓｉａ ｓｕｐｅｒｂａ）などであってもよい。また、原料として用いるエビは、アカエビ（Ｍｅｔａｐｅｎａｅｏｐｓｉｓ ｂａｒｂａｔａ）の他、アマエビ（ホッコクアカエビ：Ｐａｎｄａｌｕｓ ｅｏｕｓ）などが挙げられる。これらは生のものを用いてもよいし、凍結したものを用いてもよい。また、乾物や塩蔵物を用いてもよい。抽出操作は例えばアルコール（メタノールやエタノールやイソプロパノールなど）やアセトンやアセトニトリルなどの水に可溶性の有機溶媒および／または水を用いて行うことができる。単離取得された化合物の精製度を高めるために、イオン交換樹脂、非イオン性吸着樹脂、ゲルろ過クロマトグラフィー、活性炭やアルミナやシリカゲルなどの吸着剤によるクロマトグラフィーおよび高速液体クロマトグラフィーを用いた分離操作の他、結晶化操作、減圧濃縮操作、凍結乾燥操作などの各種操作を単独または適宜組み合わせて行ってもよい。オキアミやエビからの抽出操作によって得られるＨＥＰＥを含む組成物は、通常、ＨＥＰＥを１ｍｇあたり１〜１００μｇ含むが、１ｍｇあたり２５μｇ以上含むことが望ましい。

本発明の方法によって取得されたＨＥＰＥは、オキアミやエビという食用としても用いられている天然資源由来であるので、安全性が高い。従って、医薬品の有効成分や飲食品の原料などとして用いることができる。本発明者らの検討によれば、水酸基の結合位置が８位〜１２位のいずれかであるＨＥＰＥは、脂肪酸代謝の活性化、体脂肪燃焼の促進、肥満の抑制、脂肪肝の抑制、糖尿病の予防や改善、インスリン抵抗性の予防や改善、持久力の向上といった効果をもたらすことが知られているＰＰＡＲ（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体）の優れた活性化作用を有する（ＰＰＡＲには、ペルオキシソームの増殖を通して血中トリグリセリド濃度の低下を導く作用を有するα型、脂肪組織に分布して脂肪細胞分化などに関与する他、インスリン抵抗性改善の標的分子であるγ型、骨格筋のエネルギー消費が増大することにより末梢組織中の脂肪蓄積を抑制する作用を有するδ型（β型）の３種類のサブタイプが存在することは周知の通りである）。従って、本発明の方法によって取得された８−ＨＥＰＥ、９−ＨＥＰＥ、１２−ＨＥＰＥなどは、現代社会における生活習慣病や内臓脂肪症候群（メタボリックシンドローム）などに対する予防剤や治療剤の有効成分として用いることができる他、ＰＰＡＲの活性化作用を有する研究試薬として用いることができる。しかしながら、本発明の方法によって取得されたＨＥＰＥの利用価値や利用方法は、ここに記載したものに限定されるものではない。

以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。

実施例１：オキアミからのＨＥＰＥの単離取得
（メタノール抽出）
三陸地方で漁獲されたイサダ（ツノナシオキアミ）を１００℃の温風で約１時間乾燥させた後、粉砕した。得られた粉末に１０倍量（ｗ／ｖ）のメタノールを加えて２時間以上抽出した後、ペーパーフィルタで濾過してメタノール抽出液を得た。

（ＨＰ−２０による分画）
メタノール抽出液２００ｍＬに対して３０ｇの合成樹脂吸着剤ダイヤイオンＨＰ−２０（三菱化学社）を用いて行った。具体的には、まず、３０ｇのＨＰ−２０をクロマト管に充填し、１００％メタノール２００ｍＬで洗浄した後、３０％メタノール水溶液２００ｍＬで平衡化した。次に、メタノール抽出液２００ｍＬを蒸留水８００ｍＬで希釈してからアプライし、３０％メタノール水溶液２００ｍＬで洗浄した後、８０％メタノール水溶液２００ｍＬで溶出させてＨＰ−２０溶出液２００ｍＬを得た。

（ＩｎｅｒｔＳｅｐ Ｃ１８による分画）
ＨＰ−２０溶出液２００ｍＬあたり１本（１０ｇ）のカラム（ＧＬサイエンス社のオクタデシル基をシリカゲルに結合した固相）を用いて行った。具体的には、まず、カラムを１００％メタノール＋０．１％酢酸溶液４０ｍＬで洗浄した後、３０％メタノール水溶液＋０．１％酢酸溶液４０ｍＬで平衡化した。次に、ＨＰ−２０溶出液２００ｍＬを蒸留水６００ｍＬで希釈してからアプライし、３０％メタノール水溶液＋０．１％酢酸溶液４０ｍＬで洗浄した後、１００％メタノール＋０．１％酢酸溶液４０ｍＬで溶出させ、得られた溶出液をエバポレーションして黄色の油状物を得た。

（ＨＰＬＣによる精製）
黄色の油状物を１００ｍｇ／ｍＬでメタノールに溶解した後、以下の条件で行った。
カラム：ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ−Ｃ１８（ＧＬサイエンス社）φ２０．０ｍｍ×２５０ｍｍ（５μｍ）
サンプル：１０ｍｇ／ｍＬ（１００ｍｇ／ｍＬストックを蒸留水で１０倍に希釈し濾過）
Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ：１ｍＬ（１０ｍｇ）
移動層：１５ｍＬ／ｍｉｎ、Ａ：蒸留水＋０．２％ギ酸溶液、Ｂ：ＡｃＮ、（Ａ：Ｂ）４５：５５→４５ｍｉｎ、４５：５５ｔｏ１０：９０→２０ｍｉｎ、１０：９０→１０ｍｉｎ、４５：５５→１０ｍｉｎ
検出器：ＵＶ２３５ｎｍ
カラムオーブン：４０℃
結果を図１に示す。図１に示した５つのピークのうち、１、２、５のピークの成分を単離取得し、３と４のピークの成分をリサイクルＨＰＬＣで精製した。

（リサイクルＨＰＬＣによる精製）
カラム：ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ−Ｃ１８（ＧＬサイエンス社）φ２０．０ｍｍ×２５０ｍｍ（５μｍ）
サンプル：１ｍｇ／ｍＬ（１０％メタノール水溶液）（３と４のピークの成分のフラクションをエバポレーションしたものをメタノールに溶解することで調製した１０ｍｇ／ｍＬストックを蒸留水で１０倍に希釈）
Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ：５００μＬ（５００μｇ）
移動層：６０％ＡｃＮ＋０．１％ギ酸溶液（Ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）１５ｍＬ／ｍｉｎ
検出器：ＵＶ２３５ｎｍ
カラムオーブン：４０℃
リサイクル：１９ｍｉｎ ＯＮ，７１ｍｉｎ ＯＦＦ
分取：８５−９４ｍｉｎシグナル２５０以上で分取
結果：図２

以上の工程によってイサダから単離取得した５つの成分の物理化学的特性を、ＣｙｍａｎＣｈｅｍｉｃａｌ社より購入した各種のＨＥＰＥ（標準物質）の物理化学的特性と照合した結果、５つの成分が、５−ＨＥＰＥ（イサダの乾燥粉末からの収率：０．００３％、以下同じ）、８−ＨＥＰＥ（収率：０．００６％）、９−ＨＥＰＥ（収率：０．００２％）、１２−ＨＥＰＥ（収率：０．００３％）、１８−ＨＥＰＥ（収率：０．００８％）であることがわかった。５つの成分の同定結果を表１に示す。また、標準物質の保持時間を表２に示す。さらに、メタノールによる抽出物、ＨＰ−２０による分画物、ＩｎｅｒｔＳｅｐ Ｃ１８による分画物（それぞれ溶媒を除去したもの）に含まれるＨＥＰＥ含量を表３に示す。

参考例１：各種のＨＥＰＥのＰＰＡＲ活性化作用の評価
（実験方法）
ＰＰＡＲリガンド活性の測定をＰｒｏｍｅｇａ社の核内受容体解析用ルシフェラーザレポーターシステムを用いて行うことによって評価した。具体的には、ｐＦＮ２６Ａ（ＢＩＮＤ）ｈＲｌｕｃ−ｎｅｏ Ｆｌｅｘｉ Ｖｅｃｔｏｒの制限酵素サイト（Ｓｇｆ１、Ｐｍｅ１）に、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγ、ＰＰＡＲδのそれぞれのリガンド結合ドメインの塩基配列（α：２０１−４６８位のアミノ酸、γ：２３８−５０６位のアミノ酸、δ：１７１−４４１位のアミノ酸に対応）をクローニングし、酵母由来ＧＡＬ４タンパク質ＤＮＡ結合ドメインとＰＰＡＲリガンド結合ドメインの融合タンパク質の発現ベクター（以下ＧＡＬ４−ＰＰＡＲ発現ベクターと記載する）を作製した。次に、リポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、ＮＩＨ３Ｔ３細胞にＧＡＬ４−ＰＰＡＲ発現ベクターとｐＧＬ４．３５を１：１の割合で遺伝子導入した。遺伝子導入から３６〜４０時間後に、１０％ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と抗生物質−抗真菌剤溶液（シグマ−アルドリッチ社）を含むＤＭＥＭ培地にＨＥＰＥを各種の濃度で添加した培地に交換し、その２４時間後にＰａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて細胞溶解液を調製し、ルシフェラーゼ活性を測定した。ルシフェラーゼ活性の測定はＰｒｏｍｅｇａ社のＤｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍを用いて行った。

（実験結果その１）
実施例１でオキアミから取得した、５−ＨＥＰＥ、８−ＨＥＰＥ、９−ＨＥＰＥ、１２−ＨＥＰＥ、１８−ＨＥＰＥを、それぞれ１２８μＭの濃度で添加した培地（被験物質はメタノールに溶解して添加）で細胞を培養した際の、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγ、ＰＰＡＲδのそれぞれの活性化作用を図３に示す（コントロールとして被験物質を添加する際に用いたメタノールと同容量のメタノールのみを添加した培地で細胞を培養した際のルシフェラーゼ活性を１とした相対値）。また、図３には、ＥＰＡ（ＣｙｍａｎＣｈｅｍｉｃａｌ社、以下同じ）とそのエチルエステル（ＥＰＡ−Ｅｔ）（ＷＡＫＯ社）の作用をあわせて示す。図３から明らかなように、８−ＨＥＰＥと９−ＨＥＰＥは、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγ、ＰＰＡＲδの全ての優れた活性化作用を有していた。１２−ＨＥＰＥは、ＰＰＡＲδの活性化作用を有していた。５−ＨＥＰＥと１８−ＨＥＰＥは、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγ、ＰＰＡＲδのいずれの活性化作用も有していないか、有していてもごく僅かであった。

（実験結果その２）
実施例１でオキアミから取得した、８−ＨＥＰＥ、９−ＨＥＰＥ、１８−ＨＥＰＥを、それぞれ各種の濃度で添加した培地（被験物質はメタノールに溶解して添加）で細胞を培養した際の、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγ、ＰＰＡＲδのそれぞれの活性化作用を図４に示す（コントロールとして被験物質を添加する際に用いたメタノールと同容量のメタノールのみを添加した培地で細胞を培養した際のルシフェラーゼ活性を１とした相対値）。また、図４には、ＥＰＡの作用をあわせて示す。図４から明らかなように、８−ＨＥＰＥと９−ＨＥＰＥは、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγ、ＰＰＡＲδの全ての優れた活性化作用を濃度依存的に有していたが、１８−ＨＥＰＥは、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγ、ＰＰＡＲδのいずれの活性化作用も有していないか、有していてもごく僅かであった。

（実験結果その３）
ＣｙｍａｎＣｈｅｍｉｃａｌ社より購入した、５−ＨＥＰＥ、８−ＨＥＰＥ、９−ＨＥＰＥ、１１−ＨＥＰＥ（１１−ｈｙｄｒｏｘｙ−５Ｚ，８Ｚ，１２Ｅ，１４Ｚ，１７Ｚ−ｅｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、１２−ＨＥＰＥ、１５−ＨＥＰＥ（１５−ｈｙｄｒｏｘｙ−５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１３Ｅ，１７Ｚ−ｅｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、１８−ＨＥＰＥを、それぞれ５μＭの濃度で添加した培地（被験物質はメタノールに溶解して添加）で細胞を培養した際の、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγ、ＰＰＡＲδのそれぞれの活性化作用を図５に示す（コントロールとして被験物質を添加する際に用いたエタノールと同容量のエタノールのみを添加した培地で細胞を培養した際のルシフェラーゼ活性を１とした相対値）。また、図５には、パルミチン酸（ＰＡ）（ＷＡＫＯ社）、アラキドン酸（ＡＡ）（ＷＡＫＯ社）、ＥＰＡ、各種のヒドロキシエイコサテトラエン酸（ＨＥＴＥ）（ＣｙｍａｎＣｈｅｍｉｃａｌ社）の作用をあわせて示す。図５から明らかなように、１１−ＨＥＰＥは、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγ、ＰＰＡＲδの全ての優れた活性化作用を低濃度で有していた。

以上の実験結果より、ＰＰＡＲの優れた活性化作用を有するＨＥＰＥは、水酸基の結合位置が８位〜１２位という炭素鎖の中央寄りのＨＥＰＥであり、水酸基の結合位置が５位、１５位、１８位といった炭素鎖の末端寄りのＨＥＰＥは、ＰＰＡＲの活性化作用を有さないか、有していてもごく僅かであることがわかった。

実施例２：アカエビからのＨＥＰＥの単離取得
市販の冷凍アカエビの可食部の湿重量に対して１０倍量（ｗ／ｖ）のメタノールを加えて２時間以上抽出した後、ペーパーフィルタで濾過してメタノール抽出液を得た。得られたメタノール抽出液をＬＣ／ＴＯＦＭＳで分析したところ、各種のＨＥＰＥが含まれていることが判明したので、実施例１と同様にして単離取得した。

実施例３：アマエビからのＨＥＰＥの単離取得
市販の冷凍アマエビの可食部の湿重量に対して１０倍量（ｗ／ｖ）のメタノールを加えて２時間以上抽出した後、ペーパーフィルタで濾過してメタノール抽出液を得た。得られたメタノール抽出液をＬＣ／ＴＯＦＭＳで分析したところ、各種のＨＥＰＥが含まれていることが判明したので、実施例１と同様にして単離取得した。

製剤例１：カプセル剤
９−ＨＥＰＥ２００ｍｇ、精製大豆油８０ｍｇ、ミツロウ１５ｍｇ、ビタミンＥ５ｍｇを４０℃に加温しながら十分に混合して均質な液状物とした。これをカプセル充填機に供給して１粒の内容量が３００ｍｇのゼラチン被覆カプセル剤を製造した。

本発明は、オキアミやエビを原料としたＨＥＰＥの取得方法を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。

Claims (4)

1. ツノナシオキアミ（Ｅｕｐｈａｕｓｉａ ｐａｃｉｆｉｃａ）からの抽出操作による水酸基の結合位置が８位または９位であるヒドロキシエイコサペンタエン酸の取得方法。
2. 抽出操作を水に可溶性の有機溶媒および／または水を用いて行う請求項１記載の取得方法。
3. ツノナシオキアミ（Ｅｕｐｈａｕｓｉａ ｐａｃｉｆｉｃａ）からの抽出操作を含んでなる、水酸基の結合位置が８位または９位であるヒドロキシエイコサペンタエン酸を含む組成物の製造方法。
4. エビからの抽出操作によるヒドロキシエイコサペンタエン酸の取得方法。